OBSEVANJE IN GENSKA TERAPIJA S KEMOKINOMA CCL5 ALI CCL17 NA MIŠJIH MODELIH KARCINOMA
Tim Božič1'2, Simona Kranjc Brezar1,2, Boštjan Markelc1, Maja Cemažar13
'Oddelek za eksperimentalno onkologijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana, Slovenija
2Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, ¡000 Ljubljana, Slovenija 9Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem, Polje 42, 6310 Izola, Slovenija
Elektronski naslov: tbozic@onko-i.si
Kemokini so majhni signalni proteini iz družine citokinov, ki inducirajo migracijo imunskih celic. Vrsta in stopnja iniiltracije imunskih celic v tumorskem mikrookolju lahko vpliva na potek bolezni in korelira z učinkovitostjo imunoterapij pri bolnikih z rakom. Poleg tega je znano, da z radioterapijo, kot enim od glavnih načinov zdravljenja raka, lahko sprožimo pozitivne imunomodulatorne učinke. Iz navedenih razlogov genski elektroprenos (GET) plazmidne DNA z zapisom za vnetna kemokina CCL5 ali CCL17 v kombinaciji s klasično radioterapijo tako predstavlja enega izmed potencialnih pristopov pri zdravljenju raka.
Vpliv plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 na viabilnost in izražanje vnetnih citokinov smo najprej določevali pri dveh mišjih celičnih linijah raka debelega črevesa CT26 in raka dojke 4T1 in vitro. Viabilnost smo določevali s testom PrestoBlue, izražanje pa s qRT-PCR. Kemotaktične lastnosti obeh kemokinov smo določili s testi kemotakse in vitro in z modelom dorzalnega okna in vivo. Pri tem smo spremljali migracijo imunskih celic proti mišjim tumorskim celicam in tumorjem CT26 in 4T1, transfeciranim s plazmidno DNA z zapisom za posamezni kemokin. Protitumorsko učinkovitost kombinirane terapije GET kemokinov in dveh obsevalnih režimov (enkratna doza 10 Gy ali frakcionirana doza 3x5 Gy) smo določevali z določevanjem zaostanka v rasti tumorjev in izražanjem vnesenih kemokinov, ter vnetnih citokinov. Sestavo tumorskega mikrookolja po kombinirani terapiji smo določevali z imunofluorescenčnim označevanjem imunskih celic in žil (CD4, CD8 in CD31).
Viabilnost celic po transfekciji s plazmidno DNA z zapisom za kemokina je bila > 75 %■ Poleg tega je trasfekcija vodila v povišano izražanje vnesenih kemokinov ter vnetnih citokinov CXCL9, CXCL10 in IL-6, ki sodelujejo pri usmerjanju imunskih celic. Testi kemotakse so pokazali, da kemokina CCL5 in CCL17 lahko inducirata migracijo mišjih makrofagov RAW264.7 in vitro in splenocitov v tumorje in vivo. Zaostanek v rasti tumorjev CT26 in 4T1 po samostojnem GET je bil zanemarljiv in primerljiv med aretiranimi skupinami. Primerjava stopnje iniiltracije posameznih imunskih celic v tumorsko mikrookolje je pokazala, da se število CD4+ celic T pomagalk in citotoksičnih CD8+ celic T ubijalk pri obeh tumorskih modelih poveča po GET kemokinov in zmanjša po samem obsevanju. Zmanjšanje števila imunskih celic je bilo opaženo tudi pri kombinirani terapiji in korelira z zmanjšanjem CD31+ endotelnih celic, ki predstavljajo žilje. Zaostanek v rasti tumorjev CT26 in 4T1 je bil statistično
60
značilno daljši po kombinirani terapiji tumorjev z GET kemokinov pri obeh obsevalnih režimih, pri čemer smo dosegli tudi popolne odgovore tumorjev na zdravljenje. Pri tumorskem modelu CT26 je bilo v primerjavi s tumorskim modelom 4T1 večje število popolnih odgovorov, vendar pa smo protitumorsko učinkovitost kemokinov dokazali le pri tumorjih 4T1. Rezultati kažejo na potencial kemokinov v imunoterapiji raka, vendar je za njihovo implementacijo potrebna nadaljnja optimizacija kombinirane terapije.
61