Proteaze in njihovi inhibitorji v telesnih tekoœinah kot diagnostiœni in prognostiœni tumorski kazalci Proteaze in njihovi inhibitorji v telesnih tekoœinah kot diagnostiœni in prognostiœni tumorski kazalci Proteases and their inhibitors in body fluids as diagnostic and prognostic tumour markers Suzana Vozelj, Nataša Obermajer, Janko Kos Povzetek: Odkrivanje novih tumorskih kazalcev je postalo pomemben del raziskav raka. Njihova uporabnost je v diagnozi, spremljanju napredovanja bolezni, pri napovedi ponovitve in izida bolezni ter spremljanju uœinkovitosti zdravljenja. Med mnogimi bioloĝkimi molekulami, ki so vpletene v procese razvoja in napredovanja raka, nam lahko prisotnost proteaz in njihovih inhibitorjev v tumorjih ali telesnih tekoœinah omogoœi nove diagnostiœne in prognostiœne informacije za bolnike z rakom. Rezultati kliniœnih raziskav telesnih tekoœin bolnikov z rakom dojke, jajœnikov, materniœnega vratu, maternice, mehurja, pljuœ, jeter, glave in vratu, prostate in œrevesja kaĉejo na moĉne prednosti pred metodami, ki se trenutno uporabljajo. Kljuœne besede: proteaze, rak, diagnostiœni kazalci, prognostiœni kazalci Abstract: In recent years the discovery of new cancer biomarkers has become an important part in cancer research. Biomarkers are useful for diagnosis, monitoring disease progression, and predicting disease recurrence and outcome and therapeutic treatment efficacy. Among various biomolecules involved in cancer development and progression, proteases and their inhibitors in tumors as well as in some body fluids may provide new diagnostic and prognostic information for cancer patients. The results of their clinical investigations in body fluids of human breast, ovarian, uterine cervix, uterus, bladder, lung, liver, head and neck, prostate and colorectal cancer show possible advantage over currently existing techniques. Key words: proteases, cancer, diagnostic markers, prognostic markers 1 Uvod Proteaze, lahko tudi proteinaze oz. peptidaze, so encimi, ki katalizirajo razgradnjo beljakovin v manjĝe peptide oz. popolno razgradnjo do aminokislinskih preostankov (1). Proteaze so selektivno delujoœe, kajti posamezna proteaza razgradi polipeptidno verigo glede na specifiœno zaporedje aminokislin in pod doloœenimi pogoji okolja. Poznamo 561 genov, ki kodirajo za razliœne proteaze pri œloveku, kar predstavlja pribliĉno 2% œloveĝkega genoma. Proteaze spadajo v razred hidrolaz, ki pri delovanju uporabljajo molekule vode za nukleofilni napad na karbonilno skupino v amidni vezi. Glede na mesto hidrolize peptidne vezi v polipeptidni verigi jih delimo na endopeptidaze in eksopeptidaze. Eksopeptidaze delimo glede na mesto delovanja (aminopeptidaze, karboksipeptidaze) ter glede na velikost odcepljenih fragmentov. (2). Proteaze omogoœajo znotrajceliœno in zunajceliœno razgradnjo proteinov, regulirajo aktivacijo pro-encimov in pro-hormonov, sodelujejo pri predstavitvi antigenov, preoblikovanju kostnega tkiva, razgradnji in preoblikovanju zunajceliœnega matriksa (ECM), sodelujejo pri procesu razvoja embria, pri ovulaciji, zdravljenju ran, migraciji monocitov, kaskadi strjevanja krvi, imunskem odzivu in pri procesu programirane celiœne smrti ali apoptoze. Poveœano delovanje proteaz so dokazali pri ĝtevilnih tumorjih, vkljuœno pri raku dojk, pljuœnem raku, moĉganskih tumorjih, raku œrevesja, raku glave in vratu ter melanomih. Poleg rakavih obolenj pa igrajo vlogo tudi pri vnetnih boleznih, revmatoidnem artritisu, periodontitisu, kardiovaskularnih boleznih, nevroloĝkih boleznih, ulkusu, emfizemu, pri motnjah v strjevanju krvi, malariji, ipd. V malignih procesih imajo proteaze vlogo pri invaziji, metastaziranju, angiogenezi in tudi pri rasti tumorjev, hkrati pa tudi v procesih, ki lahko povzroœijo remisijo maligne bolezni (apoptoza tumorskih celic, protitumorski imunski odziv) (3, 4, 5). V medicini predstavljajo proteaze zaradi njihove regulatorne vloge ter udeleĉenosti pri patoloĝkih procesih potencialne tarœe za terapijo. V kliniœni rabi in razliœnih fazah testiranj so ĝtevilni inhibitorji proteaz Suzana Vozelj, mag. farm., Krka d.d., Novo mesto, Dunajska 65, 1000 Ljubljana Nataša Obermajer, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Janko Kos, univ. dipl. kern., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana; Inštitut Jožef Stefan, Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo, Jamova 39, 1000 Ljubljana farm vestn 2007; 58 133 Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles (inhibitorji virusnih HIV proteaz, inhibitorji ACE (angiotenzin konvertaza encima) za zniĉevanje poveœanega krvnega tlaka, inhibitorji serinskih proteaz (trombina, faktorja X) za zdravljenje tromboze, inhibitorji renina za zdravljenje hipertenzije, inhibitorji dipeptidil peptidaze IV (DPPIV) za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2, inhibitorji katepsina K za zdravljenje osteoporoze, inhibitorji treoninske proteaze (inhibitorji proteosoma) v terapiji raka, inhibitorji metaloproteaz (MMP) za zdravljenje rozaceae, aken, periodontalnih bolezni in raka (6). Hkrati pa kaĉejo proteaze velik potencial kot diagnostiœni in/ali prognostiœni dejavniki pri ĝtevilnih boleznih, zlasti pa rakavih obolenjih. 2 Razdelitev Sodobna delitev proteaz temelji na evolucijski podobnosti in mehanizmu delovanja. Po encimski klasifikaciji sodijo proteaze v podrazred hidrolaz. Proteaze so razvrĝœene v posamezne razrede in klane. Klane sestavljajo druĉine, sestavljene iz proteaz, ki imajo skupnega prednika, vendar so se med evolucijo tako spremenile, da se veœ ne ujemajo v celotnem ali delnem aminokislinskem (AK) zaporedju, ki je odgovorno za katalitsko aktivnost. Druĉine, zdruĉene v klan, so si podobne predvsem v terciarni strukturi, vendar se podobnosti lahko kaĉejo tudi v poloĉaju AK, ki so pomembne za katalitsko aktivnost, polipeptidini verigi ter omejenem ujemanju AK zaporedja v bliĉini teh AK (7). Glede na katalitski mehanizem delimo proteaze na veœ razredov. Slika 1: Proteazno kolo: Filogenetsko drevo œloveĝkih in miĝjih proteaz. Proteaze so razdeljene v pet katalitskih razredov in 63 razliœnih druĉin. Kodna ĝtevilka vsake druĉine je napisana na zunanjem krogu (8). Picture 1: Protease wheel. Philogenetic tree of human and mouse proteases. Proteases are divided into five catalytic classes and 63 different families. Code number of every family is written on the outer circle (8). 2.1 Cisleinske proteaze Cisteinske proteaze so pogosto prisotne v telesu (od vseh 561 genov, ki kodirajo za proteaze, je 148 tistih, ki kodirajo za cisteinske proteaze). Najbolj poznane œloveĝke cisteinske proteaze so katepsini, ki se v aktivirani obliki najpogosteje nahajajo v lizosomih. Pri cisteinskih proteazah poznamo 16 razliœnih druĉin, cisteinski katepsini spadajo v klan CA in so 134 farm vestn 2007; 58 vkljuœeni v procese v celici kot so proteinsko procesiranje, reprodukcija, MHC-II antigenska predstavitev, resorpcija kosti, apoptoza, diferenciacija keratinocitov (8). Hkrati sodelujejo v patoloĝkih procesih kot so rak, vnetje, nevrodegeneracija, ateroskleroza, artritis, psoriaza, pankreatitis, itn. (9). V razred cisteinskih proteaz spadajo katepsini B, C, F, H, K, L,O, S,V, W in X. Njihovo aktivnost kontrolirajo njihovi endogeni proteinski inhibitorji, med njimi najbolj poznani cistatini, tiropini in inhibitor proteaz a2-makroglobulin (10). 2.2 Asportatile proteaze Aspartatne proteaze so relativno majhna, vendar zanimiva skupina, kajti imajo pomembno vlogo pri patoloĝkih stanjih, kot so poviĝan krvni tlak (renin), rak (katepsin D-metastaziranje raka dojke), Alzheimerjeva bolezen (ß sekretaza), malarija (plazemski pepsin), AIDS (HIV-1 peptidaza), infekcije s kandido (Candida Albicans), idr. (11). Aspartatne proteaze spadajo v pepsinsko druĉino in so pri katalitiœni aktivnosti neposredno odvisne od kislega aspartatnega preostanka. Delimo jih v tri druĉine: A1-pepsinska, A2-retropepsinska in A3-encimi pararetrovirusov. Pri œloveku dobro poznamo vloge treh sekretornih aspartatnih proteaz: pepsin, gastricisin, renin. Drugi dve manj poznani pa sta katepsin D, ki se nahaja v lizosomih (12) in katepsin E, ki se nahaja v endosomih med endoplazmatskim retikulom (ER) in Golgijevim aparatom (GA) (13). 2.3 Serinske proteaze Serinske proteaze, delimo jih v 14 razliœnih druĉin, so dobro raziskane na podroœju fibrinolize in koagulacije krvi (trombin), sodelujejo pa tudi pri prebavnih procesih (tripsin, kimotripsin in elastaze), razvojnih procesih in vnetju. V centralnem ĉivœnem sistemu imajo pomembno vlogo pri celiœni migraciji, preoblikovanju sinaps, celiœni vzdraĉnosti, pri glialnemu in celiœnemu preĉivetju celic (14, 15). Serinske proteaze aktivirajo prekurzorje rastnih faktorjev, razgrajujejo ECM ali pa se veĉejo na receptorje na celiœni povrĝini in s tem sproĉijo znotrajceliœne signalne kaskadne reakcije. Njihova aktivnost je moœno nadzorovana tudi z razliœnimi endogenimi serinskimi inhibitorji (serpini) (16). Poznamo dva glavna inhibitorja plazminogenskih aktivatorjev: PAI-1 in PAI-2 iz druĉine serpinov. Poznamo tudi dva tipa plazminogenskega aktivatorja: tkivni (t-PA) in urokinazni (uPA) tip. Oba sta sposobna katalizirati pretvorbo plazminogena v plazmin. Primarna vloga tPA je aktivacija plazmina pri trombolizi, medtem ko je vloga uPA pomembna pri aktivaciji plazmina v dogodkih, povezanih z razgradnjo ECM in poslediœno v procesu migracije in invazije tumorja. Receptor urokinaznega plazminogenskega aktivatorja (uPAR) je receptor na povrĝini celice in nanj se veĉe pro-uPA. 2.4 Metaloproteaze (MMP) MMP se skrajĝano imenujejo tudi matriksini, delimo jih v 26 razliœnih druĉin. Imajo pomembno vlogo v procesih razgradnje zunajceliœnega matriksa (ECM). Ta proces opazimo pri razvoju zarodka, morfogenezi, reprodukciji in resorpciji ter remodeliranju tkiv (17). MMP imajo pomembno vlogo tudi v patoloĝkih procesih: artritis, rak, kardiovaskularne bolezni, nevroloĝke bolezni, ulkus, jetrna fibroza, emfizem, idr. (18). Med MMP spadajo kolagenaze, gelatinaze, stromelizin, stromelizinu podobne MMP in membranski tip MMP (19). Proteaze in njihovi inhibitorji v telesnih tekoœinah kot diagnostiœni in prognostiœni tumorski kazalci Aktivne MMP inhibirajo specifiœni tkivni inhibitorji (TIMP). Poznamo 4 razliœne tipe, to je TIMP-1,-2,-3,-4. Sodelujejo pri razgradnji in preoblikovanju tkiv in se veĉejo tako na aktivno obliko, kot na proMMP in lahko inhibirajo avtokatalitsko aktivacijo. 3 Vloga proteaz v mehanizmih nastanka in napredovanja raka Proteaze so udeleĉene na ĝtevilnih stopnjah razvoja ter napredovanja raka, pri tem pa ne igrajo pomembne vloge le proteaze v tumorskih celicah, temveœ tudi v tumorski stromi, ki jo predstavlja tumorski ECM in tudi celiœne komponente, kot so fibroblasti, imunske ter vnetne celice ter celice krvnih ĉil. Sodelovanje transformiranega tkiva s svojim mikrookoljem ustvari pogoje, v katerih je mogoœa tumorska invazija, angiogeneza in metastaziranje. Ekspresija proteaz ali njihova aktivnost je v tumorjih spremenjena in proteaze so vkljuœene v ĝtevilne tumorske procese. V procesu invazije sodelujejo cisteinske proteaze (predvsem katepsina L in B), aspartatne proteaze (katepsin D), MMPs in v veliki meri serinske proteaze (uPA). Vse omenjene proteaze pripomorejo k razgradnji ECM in bazalne membrane bodisi preko direktne razgradnje (katepsina B in L) ali sodelujejo v proteolizi in aktiviranju drugih proteaz (MMP, elastaze). MMP niso pomembni le za razgradnjo ECM, ampak imajo tudi pomembno vlogo pri vzpostavljanju ugodnega okolja za rast in metastaziranje tumorja (20). Slika 2: Aktivacija proteaz v procesu razgradnje zunajceliœnega matriksa (21). Picture 2: Activation of proteases in the process of degradation of extracellular matrix (21). V zdravih celicah obstaja ravnovesje med proteazami in njihovimi inhibitorji (npr.: uPA in PAIi, MMP in TIMPi, katepsini in cistatini oz. stefini,), pri tumorskih celicah pa je to ravnoteĉje poruĝeno (22). Moĉne so tudi druge interakcije med molekulami proteolitske kaskade. Tako npr.: katepsin B lahko poleg ostalih funkcij razgradi in s tem inaktivira inhibitorja MMP TIMP-1 in TIMP-2 in se tudi v tej zadnji efektorski fazi vkljuœuje v razgradnjo ECM. Kompleksno vlogo pri tem ima katepsin D, saj poleg direktne razgradnje ECM proteinov razgrajuje tudi cistatine, inhibitorje cistenskih proteaz, hkrati lahko tudi stimulira angiogenezo, vpliva na apoptozo in je s tem vkljuœen pri rasti tumorja. Poleg tumorske invazije in metastaziranja pa so proteaze udeleĉene tudi v procesih angiogeneze, in sicer preko sproĝœanja rastnih faktorjev (bFGF, TGF-ß, EGF, IGF), vezanih na proteine zunajceliœnega matriksa in aktivacije citokinov, ki vplivajo na proces oĉiljanja (IL-1ß) in pospeĝujejo rast endotelijskih celic. Proteaze vplivajo tudi na apoptozo tumorskih celic in modulacijo imunskega odziva, pri œemer spremenjena aktivnost proteaz lahko povzroœi zmanjĝanje imunskega odziva ter imunsko toleranco. 4 Prisotnost proteaz v telesnih tekoœinah Proteaze se nahajajo znotraj tkiv (tumorskih in netumorskih), vendar so nekatere prisotne tudi v telesnih tekoœinah v izmerljivih koncentracijah, zlasti ob patoloĝkih stanjih, ko je poveœano njihovo sproĝœanje. Ovrednotenje proteaz v zunajceliœnih tekoœinah bolnikov z rakom lahko izvedemo bodisi z merjenjem encimske aktivnosti z uporabo raznih kromogenih ali fluorogenih substratov ali z direktnim doloœanjem njihove koncentracije s specifiœnimi imunskimi testi, kot je encimsko imunski test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ali s pomoœjo pretoœne citometrije. V spodnjih tabelah so podani podatki o spremljanju vrednosti proteaz v telesnih tekoœinah in njihovem vrednotenju kot diagnostiœnih ali prognostiœnih kazalcev oz. za spremljanje odziva na zdravljenje. Tabela 1: Spremenjene vrednosti cisteinskih proteaz pri rakavih boleznih (23, 24, 25). Table 1: Changed values of cystein proteases measured on people with cancer (23, 24, 25). Bolezen Katepsin Tel. tekoœina Razmerje: bolezen/normalno rak dojke H serum Î rak jajœnikov B, L serum î,î rak seœnice B serum Î rak mehurja B plazma, urin T,= L urin Î pljuœni rak H,S serum î,= rak maternice L serum = rak materniœnega vratu B serum î melanom B,H serum î rak prostate B serum î rak jeter B serum î kolorektalni rak B serum î Cisteinske proteaze so doloœali tudi pri drugih oblikah raka, vendar so merili vrednosti v tumorskem tkivu in ne v telesnih tekoœinah. Pri bolnikih s kolorektalnim rakom so bile vrednosti katepsina B odvisne od stopnje po Dukes-u, pri œemer je bila najviĝja vrednost pri stopnji D (25, 26). Podobno je bila serumska aktivnost katepsina B odvisna od kliniœne stopnje ter razĝirjenosti raka materniœnega vratu (26). Vrednosti katepsina H so bile znatno viĝje pri bolnikih z metastatkim melanomom, kot pri tistih brez metastaz (27). Za katepsin L so predlagali, da so serumske vrednosti katepsina L v kombinaciji s CA 125 ter CA 72-4 uporabnejĝe pri detekciji raka jajœnikov, kot trenutno uporabljene metode v kliniœni praksi (28). farm vestn 2007; 58 135 Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles Tabela 2: Inhibitorji cisteinskih proteaz (cistatin C, stefin A in B) kot tumorski kazalci pri rakavih obolenjih. Table 2: Inhibitors of cystein proteases (cystatin C, stefin A and B) as tumour markers. Inhibitor cisteinskih proteaz Telesna tekocina Uporaba cistatin C serum diagnoza in spremljanje raka glave in vratu (29) cistatin C serum prognoza kolorektalnega raka (30) cistatin C serum prognoza raka pljuœ (9, 24) cistatin C serum prognoza limfoma B-celic (9, 24) cistatin C serum prognoza melanoma (9, 24) stefin A serum prognoza kolorektalnega raka (31) stefin B serum prognoza kolorektalnega raka (31) stefin A serum prognoza raka glave in vratu (25) Serumske vrednosti stefina A so bile poveœane pri bolnikih s hepatocelularnim karcinomom in so sovpadale z velikostjo tumorja in ĝtevilom neoplastiœnih lezij (32). Vrednosti stefina A ter cistatina C pri kolorektalem raku so bile neodvisne od stopnje po Dukes-u, medtem ko so bile vrednosti stefina B znaœilno povezane s stopnjo in so bile najviĝje pri stopnji D. Podoben vzorec so doloœili tudi pri bolnikih s pljuœnim rakom (Kos s sod., neobjavljeni rezultati). Izmerili so tudi vrednosti kompleksa katepsin B/cistatin C v serumih bolnikov s pljuœnim in kolorektalnim rakom (33). Vrednosti so bile znaœilno niĉje pri bolnikih z malignim pljuœnim tumorjem kot pri benignih pljuœnih boleznih ali pri zdravih posameznikih. Pri kolorektalnem raku so bile vrednosti niĉje pri stopnjah C in D, kot pa pri zgodnjih stopnjah A in B. Inverzna korelacija med napredovanjem rakave bolezni ter stabilnostjo kompleksa potrjuje hipotezo o oslabljeni sposobnosti inhibicije med razvojem raka. Tabela 3: Aspartatne proteaze v telesnih tekoœinah in njihova kliniœna uporabnost. Table 3: Aspartic proteases in body fluids and its clinical value. Aspartatna proteaza Telesna tekocina Uporaba katepsin D serum spremljanje kolorektalnega raka katepsin D serum prognoza in spremljanje glioma raka katepsin D serum diagnoza in prognoza raka dojke Poveœana koncentracija in aktivnost katepsina D v serumu in drugih telesnih tekoœinah je bila opaĉena tudi pri raku jajœnikov, maternice in pljuœ (34, 35). Tabela 4: Inhibitorji serinskih proteaz kot tumorski kazalci. Table 4: Serine protease inhibitors as tumour markers. Serinska Telesna Razmerje: Uporaba proteaza tekocina bolezen/ normalno PAI-1 serum T diagnoza in prognoza raka jajœnikov (36) PAI-1 serum T prognoza hepatocelularnega raka (30) Poveœano izloœanje uPA je bilo izmerjeno v tkivih tumorja pri raku dojke, pljuœ, ledvic, ĉolœnika, ĉelodca, moĉganov, jajœnikov, maternice, kolorektalnem raku in melanomu (37). 136 farm vestn 2007; 58 Pri raku dojke so bili v tkivu izmerili zviĝane vrednosti uPA, PAI-1, uPA-PAI-1 kompleksa ter uPAR, ki so negativen napovedni dejavnik, medtem ko so visoke vrednosti tPA in PAI-2 pozitiven napovedni dejavnik (38). Tabela 5: Kalikreini, podskupina serinskih proteaz, kot tumorski kazalci (39). Table 5: Kalikreins, subgroup of serine proteases as tumour markers (39). Kalikerin Tel. Uporaba tekocina hK2 serum diagnoza, prognoza, spremljanje raka prostate in dojke hK3 serum diagnoza, prognoza, spremljanje raka prostate in dojke hK6 serum diagnoza, prognoza, spremljanje raka jajœnikov hK10 serum diagnoza in spremljanje raka jajœnikov hK11 serum diagnoza in prognoza raka prostate in jajœnikov Najbolj znani kalikrein je hK3, imenovan tudi PSA (prostatni specifiœni antigen), ki se ĉe rutinsko uporablja pri diagnozi raka prostate. Tudi nekatere MMP, ki se pojavljajo v plazmi in urinu, sluĉijo za diagnozo in prognozo bolezni. Tabela 6: MMP kot tumorski kazalci (40). Table 6: MMPs as tumour markers (40). MMP Tel. tekocina Razmerje bolezen/ normalno Uporaba MMP-3 serum T diagnoza raka glave in vratu MMP-8 serum T diagnoza, spremljanje raka glave in vratu MMP-9 serum T diagnoza raka glave in vratu Tabela 7: TIMP (tkivni inhibitorji MMP) kot tumorski kazalci. Table 7: TIMPs (tissue inhibitors of MMP) as tumour markers. TIMP Telesna Razmerje: Uporaba tekocina bolezen/ normalno TIMP-1 serum T diagnoza in spremljanje raka dojk (41) TIMP -1 serum T prognoza raka glave in vratu (42) TIMP-2 serum Î_______prognoza kolorektalnega raka (43) 5 Zunajceliœne proteaze kot kazalci diagnoze, prognoze in odziva na terapijo Tumorski kazalci so snovi, ki jih proizvajajo maligne celice ali snovi, ki so nastale v drugih celicah pod vplivom delovanja malignih celic. Spremljanje vrednosti tumorskih kazalcev v tkivu ni vedno primerno za rutinska testiranja. Ovrednotenje proteaz v serumu je veliko bolj enostavna metoda, predstavlja prijaznejĝi naœin vzorœenja, manjĝe tveganje in ima zato tudi veœjo uporabno vrednost. Omogoœa boljĝo zanesljivost meritev in spremljanje bolezni skozi daljĝe obdobje, œesar tkivni tumorski oznaœevalci ne omogoœajo. Ovrednotenje proteaz v zunajceliœnih tekoœinah ima pred merjenjem koncentracije v homogenatih tumorskega tkiva ĝtevilne prednosti, saj omogoœa: Proteaze in njihovi inhibitorji v telesnih tekoœinah kot diagnostiœni in prognostiœni tumorski kazalci • zgodnejĝo detekcijo v fazi bolezni, ko je tumorsko tkivo ĝe nedefinirano, kar daje tovrstnim meritvam znatno kliniœno vrednost, • pri serumskih vzorcih se izognemo problemom, ki nastopajo pri histoloĝkih pregledih heterogenih tkivnih vzorcev ter zahtevni izbiri ustreznega ekstracijskega pufra, • dosegljivost krvnih vzorcev omogoœa zaporedne meritve analitov, tudi po odstranitvi tumorskega tkiva in rutinsko analizo vzorcev osebkov s poveœanim tveganjem za razvoj raka. Slabosti merjenja v serumu pa so veliko niĉje vrednosti tumorskih kazalcev (npr. katepsinov), kot na samem mestu tumorja. Zato potrebujemo bolj obœutljivo metodo. Spremenjene vrednosti lizosomskih cisteinskih proteaz v tumorjih in izvenceliœnih tekoœinah pri razliœnih tipih raka sovpadajo s preĉivetjem in se uporabljajo kot diagnostiœni ali prognostiœni kazalci (40). Pri veœini rakavih obolenj (razen raka maternice) poveœane vrednosti katepsinov B, L ali S pomenijo slabo diagnozo in prognozo, medtem ko napovedujejo visoke vrednosti katepsina H pri bolnikih s kolorektalnim rakom dobro prognozo (45). Viĝje vrednosti inhibitorja cisteinskih proteaz cistatina C ter stefinov A in B, so pokazatelji dobre prognoze pri razliœnih vrstah raka, œe jih doloœamo v tumorskih tkivih. V telesnih tekoœinah pa njihove poviĝane vrednosti napovedujejo slabo prognozo. Œe pogledamo razmerje koncentracij cisteinskih proteaz in njihovih inhibitorjev, potrdimo hipotezo o oslabljeni sposobnosti inhibicije cisteinskih proteaz pri rakavih obolenjih. Pri aspartatnih proteazah se je izkazal katepsin D za kliniœno najbolj uporaben diagnostiœni, prognostiœni kazalec in parameter spremljanja poteka bolezni pri raku dojke, kolorektalnem raku in gliomu (34, 35). Slika 3: Relativna korist zgodnje diagnoze za preĉivetje (44). Relativna korist zgodnje diagnoze za preĉivetje je razmerje med 5-letno stopnjo preĉivetja pri diagnozi v zgodnji fazi bolezni in 5-letno stopnjo preĉivetja pri diagnozi v pozni fazi. Relativno korist zgodnje diagnoze za preĉivetje in deleĉ diagnoz v zgodnji fazi predstavlja srediĝœe kroga. Povrĝina vsakega kroga je sorazmerna ĝtevilu diagnoz v ZDA v letu 2002. Picture 3: Relative benefit of early diagnosis for survival (44). Relative benefit of early diagnosis for survival is the ratio between 5-years survival rate at diagnosis in the early phase and 5-years survival rate at diagnosis in the late phase. Relative benefit of early diagnosis for survival and degree of diagnosis in the early phase is represented by the center of the circle. The area of the circle is proportional to the overall number of diagnosis in USA in the year 2002. Serinske proteaze so se pokazale za napovedni kazalec pri veœ vrstah raka, vendar so bile po do sedaj objavljenih podatkih njihove koncentracije merjene v tumorskih tkivih in ne v serumu. V serumu pa so bile izmerjene vrednosti inhibitorjev uPA in njihove poveœane vrednosti kaĉejo na slabo prognozo in diagnozo pri raku jajœnikov in slabo prognozo hepatocelularnega raka (30, 36, 37). Kalikreini (hK) so podskupina serinskih proteaz. Njihove vrednosti, izmerjene v serumu, se uporabljajo za diagnozo, prognozo in spremljanje raka prostate, dojke in jajœnikov (39). MMP in njihovi inhibitorji sluĉijo predvsem pri diagnozi in spremljanju raka glave in vratu. Njihove poviĝane vrednosti v serumu nakazujejo slabo prognozo. Vrednosti TIMP-1 nam sluĉijo pri diagnostiki in spremljanju napredovanja raka dojke, vrednosti TIMP-2 pa pri prognozi kolorektalnega raka (40, 41, 42, 43). 6 Zakljuœek V luœi sedanjega vedenja o vlogi proteaz pri malignih boleznih lahko sklepamo, da so proteaze in njihovi inhibitorji uporabni kot tumorski kazalci. Pri ĝtevilnih tumorjih so zlasti vrednosti proteaz bistveno spremenjene in odraĉajo napredovanje bolezni, kar omogoœa uporabo teh encimov v kliniœni praksi. Z njihovo uporabo lahko poveœamo uœinkovitost terapije pri bolj ogroĉenih bolnikih, po drugi strani pa se lahko izognemo zdravljenju manj ogroĉenih bolnikov. Trenutno zlasti standardizacija in poenotenje eksperimentalnih rezultatov, dobljenih v razliœnih kliniœnih ĝtudijah pri razliœnih vrstah raka, predstavlja kljuœni problem, ki onemogoœa ĝiroko uporabo proteaz in inhibitorjev kot tumorskih kazalcev. Doloœanje proteaz v telesnih tekoœinah, zlasti serumu, je izredno primerno za tovrstne namene, vendar je vrednost proteaz v teh vzorcih veliko niĉja kot v samem tumorskem tkivu. Imunoloĝke metode z nizko mejo detekcije, ki temeljijo na uporabi monoklonskih protiteles, omogoœajo takĝno analizo. Da bi vpeljali doloœanje proteaz kot tumorskih kazalcev v telesnih tekoœinah v kliniœno prakso, bi bile potrebne dodatne ĝtudije na veœjih populacijah bolnikov, v katerih bi potrdili (ali ovrgli) njihovo uporabnost za napovedovanje diagnoze in prognoze ter doloœili prednosti pred ĉe uveljavljenimi dejavniki. 7 Literatura 1. Puente XS, Sanchez LM, Overall CM, Lopez-Otin C. Human and mouse proteases: a comparative genomic approach. Nat Rev Genet 2003; 4: 544-580. 2. Rawling ND, Rifkin E, Barrett AJ. MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res 2002; 30: 343-346. 3. Mignatti P, Rifkin DB. Biology and Biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 1993; 73: 161-195 . 4. Koblinski JE, Ahram M, Sloane BF. Unravelling the role of proteases in cancer. Clin Chim Acta 2000; 291: 113-135 . 5. Nagase H, Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem 1999; 274: 21491-21494. 6. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nature Rev 2006; 5: 785-799. 7. Rawlings ND, Barrett AJ. Evolutionary families of peptidases. Biochem J 1993; 290:205-218. 8. Turk V, Turk B. Lyzosomal cystein proteases: facts and oportumities. EMBO J 2001; 20: 4629-4633. 9. Kos J, Lah T. Cystein proteases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer. Oncol Rep 1998; 5: 1349-1361. farm vestn 2007; 58 1371 Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles 10. Premzl A. Vloga zunajceliœnega in znotrajceliœnega katepsina B pri invaziji in oĉiljanju tumorjev. Doktorsko delo 2003. 11. Dash C, Kulkarni A, Dunn B, Rao M. Aspartatic peptidase inhibitors: Inplication drug development. Crit Rev Bioch Mol Biol 2003; 38: 89-119. 12. Saftig P, Hetman M, Schmahl W, Weber K, Heine L, Mossmann H, Koster A, Hess B, Evers M, Von Figura K. Mice deficient for the lysosomal proteinase cathepsin D exhibit progressive atrophy of the intestinal mucosa and profound destruction of lymphoid cells. EMBO J 1995; 14: 3599-3608. 13. Kageyama T. Molecular cloning, expression and characterization of an Ascaris inhibitor for pepsin and cathepsin E. Eur J Biochem 1998; 253: 804-809. 14. Davies B, Kearns IR, Ure J, Davies CH, Lathe R. Loss of hippocampal serine protease BSP1/neuropsin predisposes to global seizure activity. J Neurosci 2001; 21: 6993-7000. 15. Scarisbrick IA, Blaber SI, Lucchinetti CF, Genanin CP, Blaber M, Rodriguez M. Activity of newly identified serine protease in CNS demyelination. Brain 2002; 125: 1283-1296. 16. Tsirka SE, Rogove AJ, Bugge TH, Degen JL, Stickland S. An extracellular proteolytic cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus. J Neurosci 1997; 17: 543-552. 17. Nagase H, Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem 1999; 274: 21491-21494. 18. Parks WC, Mecham RP. Matrix metalloproteinases, Academic Press, San Diego 1998. 19. Kuropakt C, Duenne AA, Herz U, Renz H, Werner JA. Significat correlation of matrix metalloproteinases and macrophage colony-stimulating factor serum concentrations in patients with head and nack cancer. Neoplasma 2004; 5: 375-379. 20. Chambers AF, Matrisian LM. J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89:1260-1270 21. Schmitt M, Jänicke F, Graeff H. Tumor-associated proteases. Fibrinolysis 1992; 6: 3-26 22. Mueler BM, Yu YB, Laug WE. Overxpression of plasminogen activator inhibitor 2 in human melanoma cells inhibits spontaneous metastasis in scid-/scid+ mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92:205-209 23. Berdowska I. Cysteine proteases as disease markers. Clinica Chimica Acta 2004; 342: 41-69 24. Kos J, Werle B, Lah T, Brunner N. Cystein proteaze and their inhibitors in extracelular fluids: markers for diagnosis and prognosis in cancer. Int. J. Biol. Markers 2000; 15: 84-89 25. Strojan P, Budihna M, Ĝmid L, Svetic B, Vrhovec I, Kos J, Ĝkrk J. Prognostic significance of cysteine proteinase cathepsins B and L and their endogenous inhibitors stefins A and B in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Clinical Cancer research 2000; 6: 1052.1062 26. Makarewicz R, Drewa G, Szymanski W, Skonieczna Makarewicz I. Cathepsin B, H and L in human breast carcinoma. Neoplasma 1995; 42: 21-24. 27. Kos J, Ĝtabuc B, Schweiger A, Kraœovec M, Cimerman N, Kopitar-Jerala N, Vrhovec I. Cathepsins B, H, L, and their inhibitors stefin A and cystatin C in sera of melanoma patients. Clin Cancer Res 1997; 3: 1815-1822. 28. Nishida Y, Kohno K, Kawamata T, Morimitsu K, Kuwano M, Miyaka I. Increased cathepsin L levels in serum in some patients with ovarian cancer: comparison with CA125 and CA74-2. Gynecol Oncol 1995; 56: 375-61. 29. Strojan P., Svetic B., Ĝmid L, Kos J. Serum Cystatin C in patients with head and neck carcinoma. Clinica Chimica Acta 2004; 344: 155-161 30. Zheng Q, Tang ZY, Yue Q, Shi DR, Song HY, Tang HB. Inavasion and metastasis of hepatocellular carcinoma in relation to urokinase-type plasminogen activator, its receptor and inhibitor. J Cancer Res Clin Oncol. 2000; 126(11): 641-646 31. Kos J, Kraœovec M, Cimerman N, Nielsen HJ, Christensen IJ, Brunner N. Cysteine proteinese inhibitors Stefin A, Stefin B and Cystatin C in sera from patients with colorectal canncer : relation to prognosis. Chlinical Cancer Research 2000; 6: 505-511 32. Leto G, Tuminelo FM, Pizzolanti G, Montallo G, Soresi M, Gebbia N. Lysosomal cathepsins B and L and stefin A blood levels in patients with hepatocellular carcinoma and/or liver cirrhosis: potential clinical implications. Oncol 1997; 54: 79-83. 33. Zore I, Kraĝovec M, Cimerman N, Kuhelj R, Werle B, Nielsen HJ, Brunner N, Kos J. Cathepsin B/cystatin C complex levels in sera from healthy donors and patients with benign and malignant lung and colorectal diseases. Biol Chem 2001; 382: 805-810. 34. Lah TT, Œerœek M, Blejec A, Kos J, Gorodetsky E, Somers R, Daskal I. Cathepsin B, a prognostic indicator in lymph node-negative breast carcinoma patients: comparison with cathepsin D, cathepsin L and other clinical indicators. Clinical cancer research 2000; 6: 578-584 35. Fukuda ME, Iwadate Y, Machida T, Hiwasa T, Nimura Y, Nagai Y, Takiguchi M, Tanzawa H, Yamaura A, Seki N. Cathepsin D is a potencial serum marker for poor prognosis in glioma patients. Cancer research 2005; 65(12): 5190-5194 36. Ho CH, Yuan CC, Liu SM. Diagnostic and prognostic values of plasma levels of fibrinolytic markers in ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 1999; 75(3): 397-400 37. Gandonfo GM, Conti L, Vercillo M. Fibrinolysis components as prognostic markers in brest cancer and colorectal carcinoma. Anticancer Res. 1996; 16: 2155-2159 38. Grebenchtchikov N, Maguire TM, Riisbro R, Geurts-Moespot A, ODonovan N, Schmitt M, McGreal G, McDermottt E, OHiggins N, Brunner N, Sweep CG, Duffy MJ. Measurment of plasminogen activator system components in plasma and tumor tissue extracts obtained from patients with brest cancer: an EORTC Receptor and Biomarker Group Collaboration. Oncol Rep. 2005; 14: 235-239 39. Diamandis EP, Jousef GM. Human tissue kallikreins: a family of new cancer biomarkers. Clinical Chemistry 2002; 48(8): 1189-1205 40. Kuropakt C, Duenne AA, Herz U, Renz H, Werner JA. Significat correlation of matrix metalloproteinases and macrophage colony-stimulating factor serum concentrations in patients with head and nack cancer. Neoplasna 2004; 5 (51): 375-379 41. Wurtz S, Schrohl AS, Sorensen NM, Lademann U, Christensen IJ, Mouridsen H Brunner N. Tissue inhibitor of Metalloproteinases-1 in breasat cancer. Endocrine-Related Cancer 2005; 12: 215-227 42. Ruokolainen H, Paakko P, Turpeenniemi-Hujanen T. Tissue inhibitor of MMP-1 is prognostic in head and neck squamous cell carcinoma: comparison of the circulating and tissue immunoreactive protein. Clinical cancer research 2005; 11(9): 3257-3264 43. Bing-Hui L, Peng Z, Shi-Zheng L, Yue-Ming Y, Mei H, Jin-Kun W. Matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in colorectal carcinoma invasion and metastasis. World jurnal of gastroenterology 2005; 11(20): 3046-3050 44. Ries LAG, Eisner MP, Kosary CI, et al.SEER Cancer Statistics Review. National Cancer Institute 2002; 1973-1999. 45. Schweiger A, Christensen IJ, Nielsen HJ, Sorensen S, Bruenner N, Kos J. Serum cathepsin H as a potentional prognostic marker in patients with colorectal cancer. The Int. J. of Biol. Markers 2004; 19: 289-294 138 farm vestn 2007; 58