Zdrav Vestn 2008; 77: I-63–8 I-63 OCENA TROMBOCITNE FUNKCIJE Z MERJENJEM ADHEZIJE IN AGREGACIJE TROMBOCITOV NA POLISTIRENSKI MEMBRANI PRI BOLNIKIH Z ESENCIALNO TROMBOCITEMIJO EVALUATION OF PLATELET FUNCTION BY MEASURING PLATELET ADHESION AND AGGREGATION ON POLYSTYRENE SURFACE IN PATIENTS WITH ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA Katarina Trdina, Jana Kralj, Peter Černelč Klinični oddelek za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1525 Ljubljana Izvleček Izhodišča Bolniki z esencialno trombocitemijo (ET) imajo povečano število trombocitov v periferni krvi in pogosto tudi okvarjeno funkcijo trombocitov. Zapleti se pojavljajo v obliki tromboz ali krvavitev. Za preprečevanje tromboz bolniki pogosto profilaktično dobivajo acetilsali-cilno kislino (ASA). Danes je na voljo več načinov za oceno trombocitne funkcije, na primer agregometrija in zapiralni čas. Mnogi izmed njih imajo številne pomanjkljivosti. V okviru raziskave smo skušali ovrednotiti nov način adhezije in agregacije trombocitov na polistirenski membrani (AAPM). Metode V raziskavo smo vključili 69 bolnikov z ET. Od tega je bilo 49 bolnikov, ki so prejemali ASA, in 20 bolnikov, ki niso prejemali ASA. Bolnikom smo izmerili agregacijo trombocitov z agregometrom, zapiralni čas ter preskušali funkcijo trombocitov z načinom AAPM. Izmerjene vrednosti smo primerjali z vrednostmi zdravih oseb. Rezultati Pri bolnikih z ET v primerjavi z zdravimi osebami sta bila delež pokrite površine (1,7 % proti 3,3 %) in povprečna velikost trombocitov in trombocitnih agregatov (32 µm2 proti 45 µm2) prirejene preiskave AAPM statistično manjša (p < 0,05). Bolniki, ki so prejemali ASA, v primerjavi z bolniki, ki niso prejemali ASA, so imeli povečan delež pokrite površine (11 % proti 1,7 %), povprečno velikost trombocitov in trombocitnih agregatov (42 µm2 proti 32 µm2) in število trombocitov in trombocitnih agregatov (1421 proti 263) prirejene preiskave AAPM (p < 0,05). Zaključki Ugotovili smo, da je prirejena preiskava AAPM primerni način za določanja motenj funk- cije trombocitov pri bolnikih z ET. Poleg tega je prirejena preiskava AAPM primerna tudi za spremljanje učinka profilakse z ASA in za odkrivanje bolnikov z rezistenco na ASA. Ugotovili smo še, da številčna koncentracija trombocitov v krvi vpliva na število trombocitov in trombocitnih agregatov, izmerjenih s standardno preiskavo AAPM. Ključne besede agregometrija; zapiralni čas; acetilsalicilna kislina Abstract Background People with essential thrombocythemia (ET) have increased number of circulating platelets. The function of platelets is often impaired. Some people with ET can suffer from bleeding or clotting due to their disease. Acetylsalicylic acid (ASA) may be useful in treating patients with symptoms of microvascular occlusion. Numerous methods for evaluation of platelet function are available. Most of them have numerous disadvantages. In this research a new method adhesion and aggregation on polystyrene surface (AAPS) was assessed. Avtorica za dopisovanje / Corresponding author: Katarina Trdina, mag. farm., Klinični oddelek za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1525 Ljubljana, katarina_trdina@hotmail.com I-64 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I Methods The research comprised 69 patients with ET. The study group consisted of 49 patients that were treated with ASA and 20 patients that were not treated with ASA. We measured platelet aggregation using aggregometer and closure time. We were also testing platelet function using the new method AAPS. The measured values were compared to values of healthy subjects. Results Surface coverage (3.3 % vs. 1,7 %) and average size of platelets and platelet aggregates (45 µm2 vs. 32 µm2) of the modified test AAPS were decreased for patients that were not treated with ASA versus healthy subjects (p < 0.05). Surface coverage (1.7 % vs. 11 %), average size of platelets and platelet aggregates (32 µm2 vs. 42 µm2) and number of platelets and platelet aggregates (263 vs. 1421) of the modified test AAPS for patients that were treated with ASA versus patients that were not treated with ASA were increased (p < 0.05). Conclusions We found out that the AAPS modified test is useful for evaluation of platelet dysfunction in patients with ET. Furthermore the AAPS modified test is suitable for monitoring treatment with ASA and screening patients with »acetylsalicylic acid resistance«. We also found out that the number of platelets in blood exerts influence upon number of platelets and platelet aggregates measured by the standard test AAPS. Key words aggregometry; closure time; acetylsalicylic acid Uvod Esencialna trombocitemija je kronična mieloprolife-rativna bolezen, ki prizadene predvsem megakariocit-no vrsto. Značilno je razraščanje megakariocitov v kostnem mozgu in zato povečano število trombocitov v periferni krvi. Pogosto je okrnjena tudi njihova funkcija. Zapleti se pojavljajo v obliki tromboz in krvavitev. Za preprečevanja tromboz bolniki pogosto prejemajo majhne odmerke ASA.1–4 ASA inhibira encim ciklooksigenazo, ki sodeluje pri sintezi trombo-ksana A2 (TXA2) in prostaciklina. TXA2 agregacijo trombocitov pospešuje, medtem ko jo prostaciklin zavira. Encim ciklooksigenaza deluje zlasti na konstitutivni encim COX-1. Z inhibicijo encima se zmanjša sinteza TXA2 v trombocitih, prav tako pa se zmanjša tudi sinteza prostaciklina v endoteliju. Ker trombociti nimajo jedra, ciklooksigenaze ne morejo več sintetizirati. Njihova okvara je tako dokončna, žilne endotelijske celice pa sintetizirajo nov encim. Inhibicija endotelij-ske ciklooksigenaze zahteva večje količine ASA, predvsem v primeru peroralnega jemanja. Sistemsko ožilje je namreč zaščiteno pred delovanjem ASA, saj jo esteraze v jetrih v okviru predsistemske presnove pretvorijo v salicilat. Trombociti pa so ASA izpostavljeni že v portalni krvi. Za preprečevanje se tako uporabljajo majhni odmerki ASA, saj se na ta način zmanjša sinteza TXA2, brez znatnega zmanjšanja sinteze prostaciklina.5, 6 Med načini, ki preskušajo funkcijo trombocitov, se uporabljata tudi agregometrija in merjenje zapiralnega časa. Bolniki in metode Bolniki V raziskavo smo vključili 69 bolnikov, in sicer 22 moških in 47 žensk z ET, ki se zdravijo v hematološki ambulanti Kliničnega oddelka za hematologijo v Ljubljani. Povprečna starost bolnikov je bila 59 let. Bolnikom smo izmerili agregacijo trombocitov z agre-gometrom, zapiralni čas ter preskušali funkcijo trombocitov z načinom AAPM. Izmerjene vrednosti smo primerjali z vrednostmi zdravih oseb. V skupini bolnikov, ki so prejemali ASA, smo izključili 4 bolnike z ugotovljeno rezistenco na ASA. Izključeni bolniki predstavljajo 8,2 % bolnikov, ki so prejemali ASA. Metode Agregometer je prirejen spektrofotometer, katerega osnova za merjenje agregacije trombocitov temelji na spektrofotometričnem merjenju spremembe prepustnosti svetlobe skozi plazmo s trombociti. V primeru, da v plazmi poteka proces agregacije trombocitov, prepustnost svetlobe narašča. Agregometrija je osnovni preskus za oceno funkcije trombocitov. Agregome-ter ni občutljiv na majhne agregate trombocitov, ker ne zazna začetne faze agregacije trombocitov. Poleg tega na agregacijo vpliva tudi majhna številčna koncentracija trombocitov, zato se način ne smatra za zanesljivega, ko je številčna koncentracija trombocitov manjša od 100 × 109/L. Postopek je dolgotrajen in zahteva pripravo vzorca.11–14 Način zapiralnega časa temelji na merjenju časa, ki je potreben za nastanek trombocitnega čepa, ki zapre odprtino v membrani merilne celice in s tem prekine tok krvi. Membrana je v eni merilni celici prekrita s kolagenom in epinefri-nom, v drugi pa s kolagenom in ADP. Kot posledica izpostavitve trombocitov strižnim silam in aktivator-jem trombocitov, kot so kolagen in ADP/adrenalin, pride do aktivacije in aglutinacije trombocitov. Nastane strdek, ki zamaši odprtino v membrani merilne celice. Pomanjkljivost je maksimalni čas merjenja 300 s. Po izteku tega časa se merjenje prekine in aparat nam ne posreduje podatkov, v kolikšnem času bi dejansko prišlo do zaprtja odprtine. Poleg tega je aparat prirejen za merjenje zapiralnega časa pri številčni koncentraciji trombocitov 100–500 × 109/L in hematokri-tu od 0,350 do 0,500.10–12 Trdina K et al. Adhezija in agregacija trombocitov na polistirenski membrani I-65 AAPM je nov način za preskušanje funkcije trombocitov (adhezija in agregacija) pod skoraj fiziološkimi pogoji. V način AAPM je vpet princip posodice in konusa, ki ustvarja laminarni tok preko površine posodice. Z vrtenjem pri 720 obratih na minuto posnema arterijski tok krvi. Pri danih pogojih vrtenja se vzpostavijo močne strižne sile, ki so potrebne za aktiviranje adhezije. Na vsaki točki površine posodice so striž-ne sile obratno sorazmerne razdalji konusa in površine posodice ter premo sorazmerne s kotno hitrostjo. Površina posodice je obdana s polistirenom, na katero se takoj po dodatku krvi adherirajo plazemski pro-teini (fibrinogen, vWf) in postanejo privlačni za trombocite. Rezultat tega je adhezija in agregacija trombocitov na površini membrane. Po izpiranju ostanka krvi in barvanju adheriranih trombocitov sledi kvantifikacija reakcij s pomočjo slikovnega analizatorja. Rezultati adhezije in agregacije so izraženi v numerič-ni obliki, in sicer: delež pokrite površine (SC) s trombociti in trombocitnimi agregati, kar predstavlja ad-hezijo trombocitov; povprečna velikost trombocitov in trombocitnih agregatov, vezanih na površino membrane (ASTTA) v µm2, kar predstavlja agregacijo trombocitov; število trombocitov in trombocitnih agregatov (NTTA). SC nad 7,5 % in ASTTA nad 25 µm2 sta opredeljeni kot normalni vrednosti. a) Standardna preiskava AAPM preskuša funkcijo trombocitov pod skoraj fiziološkimi pogoji (posnemanje arterijskega toka, preskušanje poteka v polni krvi in na površini, ki je podobna žilni steni) in brez dodatka reagentov. ASA in druge antiagregacijske učinkovine (npr. klo-pidrogel) na standardno preiskavo AAPM nimajo vpliva, saj po večini predstavlja adhezijske lastnosti trombocitov. Tako sta SC in ASTTA pri bolnikih, ki prejemajo ASA, normalna. b) Prirejena preiskava AAPM se uporablja za preskušanje odziva na ASA. Od standardne preiskave se razlikuje v tem, da vzorcu krvi dodamo arahidon-sko kislino pred izvedbo standardne preiskave AAPM. Preinkubacija vzorca z arahidonsko kislino povzroči aktivacijo in aglutinacijo trombocitov, kar se kaže v močno zmanjšani adheziji. Nastanejo namreč majhni agregati trombocitov, ki začasno izgubijo adhezijske lastnosti, dokler se ne pojavi spontana deagregacija. V primeru bolnikov, ki prejemajo ASA, pride do večje adhezije trombocitov kot posledica inhibicije arahi-donske kisline z ASA.5, 8, 9, 11, 12 Statististični postopki Statistično vrednotenje rezultatov smo opravili s statističnim računalniškim programom SPSS 10,0. Primerjavo posameznih kazalcev med neodvisnimi vzorci smo izvedli z Mann-Whitneyjevim preskusom. Pri vseh statističnih postopkih smo izbrali 5-odstotno stopnjo tveganja. Razlike smo označili kot statistično značilne v primeru, ko je bila vrednost »p« manjša od 0,05. Izračunali smo tudi Spearmanov korelacijski koeficient za oceno povezave med posameznimi kazalci. Kore-lacija med kazalci je bila statistično značilna, ko je bila vrednost »p« manjša od 0,05. Rezultati V raziskavi smo želeli ugotoviti, ali je nov način AAPM primeren za določanje motenj funkcije trombocitov pri bolnikih z ET. V ta namen smo primerjali preiskovane kazalce za oceno trombocitne funkcije zdravih oseb in bolnikov, ki niso prejemali ASA (Razpr. 1). Razpr. 1. Primerjava preiskovanih kazalcev za oceno trombocitne funkcije zdravih oseb in bolnikov, ki niso prejemali ASA. Table 1. Comparison of the investigated parameters for the assessment of platelet function in healthy subjects and in patients that were not treated with ASA. Kazalec Nz Mez N Me s/ns Parameter Agregometrija Agregometry ADP (%), 10 µmol/L 62 82 20 98 s, p = 0,001 ADR (%), 10 µmol/L 62 43 20 12,5 s, p < 0,001 COL (%), 5 µg/mL 62 82 20 4 s, p < 0,001 AA (%), 1 mmol/L 62 80 20 82 ns Zapiralni čas Closure time CT-ADP (s) 30 82 20 103 s, p = 0,006 CT-EPI (s) 30 104 20 152 s, p = 0,003 Standardna preiskava AAPM AAPM standard examination SC (%) 30 12,5 20 12,5 ns ASTTA (µm2) 30 45 20 39 ns NTTA 30 1680 20 1862 s, p = 0,027 Prirejena preiskava AAPM Modified AAPM examination SC-AA (%) 10 3,3 20 1,7 s, p = 0,022 ASTTA-AA (µm2) 10 45 20 32 s, p = 0,020 NTTA-AA 10 473 20 263 ns Nz – število zdravih oseb; Mez – mediana zdravih oseb; N – število bolnikov, ki niso prejemali ASA; Me – mediana bolnikov, ki niso prejemali ASA; s – značilnost razlik; ns – ni značilnih razlik. Nz – number of healthy subjects; Mez – median of healthy subjects; N – number of patients that were not treated with ASA; Me – median of patients that were not treated with ASA; s – significant differences; ns – differences were not significant. ADP – adenozindifosfat; ADR/EPI – adrenalin; COL – kolagen; AA – ara-hidonska kislina; CT – zapiralni čas; SC – delež pokrite površine s trombociti in trombocitnimi agregati; ASTTA – povprečna velikost trombocitov in trombocitnih agregatov, vezanih na površino membrane; NTTA – število trombocitov in trombocitnih agregatov. ADP – adenosine diphosphate; ADR/EPI – adrenaline; COL – collagen; AA – arachidonic acid; CT – closure time; SC – surface coverage with platelets and platelet aggregates; ASTTA – average size of platelets and platelet aggregates; NTTA – number of platelets and platelet aggregates. V okviru raziskave smo želeli tudi ugotoviti, ali ASA vpliva na AAPM, zapiralni čas in na delež agregacije, izmerjen z agregometrom. Zato smo primerjali številčno koncentracijo trombocitov, številčno koncentracijo levkocitov, koncentracijo hemoglobina in preiskovane kazalce bolnikov, ki so prejemali ASA, in bolnikov, ki ASA niso prejemali (Razpr. 2). Želeli smo tudi ugotoviti, ali število trombocitov pri bolnikih z esencialno trombocitemijo vpliva na preiskovane kazalce za oceno trombocitne funkcije. V ta namen smo primerjali številčno koncentracijo levkocitov, koncentracije hemoglobina in preiskovane kazalce bolnikov, ki niso prejemali ASA in so imeli številčno koncentracijo trombocitov manjšo od 600 × 109/L, ter bolnikov, ki prav tako niso prejemali ASA in so imeli številčno koncentracijo trombocitov večjo od 600 × 109/L (Razpr. 3). I-66 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I Razpr. 2. Primerjava številčne koncentracij trombocitov, levkocitov, koncentracij hemoglobina in preiskovanih kazalcev za oceno trombocitne funkcije bolnikov, ki niso prejemali ASA, in bolnikov, ki so prejemali ASA. Table 2. Comparison of the concentration of platelets, leukocytes, haemoglobin values and the investigated parameters in patients that were not treated with ASA and patients that were treated with ASA. Kazalec Parameter N Me NASA Me ASA s/ns Krvna slika Blood picture Tr (× 109/L) 20 676 45 661 ns L (× 109/L) 20 8,1 45 8,4 ns Hb (g/L) 20 137 45 126 ns Agregometrija Agregometry ADP (%), 10 µmol/L 20 98 45 66 s, p < 0,001 ADR (%), 10 µmol/L 20 12,5 45 12 ns COL (%), 5 µg/mL 20 4 45 5 ns AA (%), 1 mmol/L 20 82 45 4 s, p < 0,001 Zapiralni čas Closure time CT-ADP (s) 20 103 45 105 ns CT-EPI (s) 20 152 45 248 s, p < 0,001 Standardna preiskava AAPM Standard AAPM examination SC (%) 20 12,5 45 14 ns ASTTA (µm2) 20 39 45 42 ns NTTA 20 1862 45 1925 ns Prirejena preiskava AAPM Modified AAPM examination SC-AA (%) 20 1,7 45 11 s, p < 0,001 ASTTA-AA (µm2) 20 32 45 42 s, p = 0,002 NTTA-AA 20 263 45 1421 s, p < 0,001 N – število bolnikov, ki ASA niso prejemali; Me – mediana bolnikov, ki ASA niso prejemali; NASA – število bolnikov, ki so prejemali ASA; MeASA – mediana bolnikov, ki so prejemali ASA; s – značilnost razlik; ns – ni značilnih razlik. N – number of patients that were not treated with ASA; Me – median of patients that were not treated with ASA; NASA – number of patients that were treated with ASA; MeASA – median of patients that were treated with ASA; s – significant differences; ns – differences were not significant. Tr – številčna koncentracija trombocitov; L – številčna koncentracija levkocitov; Hb – koncentracija hemoglobina; ADP – adenozindifosfat; ADR/ EPI – adrenalin; COL – kolagen; AA – arahidonska kislina; CT – zapiralni čas; SC – delež pokrite površine s trombociti in trombocitnimi agregati; ASTTA – povprečna velikost trombocitov in trombocitnih agregatov, vezanih na površino membrane; NTTA – število trombocitov in trombocit-nih agregatov. Tr – concentration of platelets; L – concentration of leucocytes; Hb – haemoglobin values; ADP – adenosine diphosphate; ADR/EPI – adrenaline; COL – collagen; AA – arachidonic acid; CT – closure time; SC – surface coverage with platelets and platelet aggregates; ASTTA – average size of platelets and platelet aggregates; NTTA – number of platelets and platelet aggregates. Razpravljanje Z raziskavo smo skušali ugotoviti, ali je nov način določanja AAPM primeren za določanje motenj funkcije trombocitov pri bolnikih z ET. V ta namen smo skupino bolnikov z ET, ki niso prejemali ASA, primerjali s skupino zdravih oseb. Pri preskušanju plazme s trombociti pri bolnikih z ET je bil delež agregacije, povzročen z ADP, značilno večji glede na zdrave ljudi. V literaturi15 zasledimo podatek, da se delež agregaci-je trombocitov, povzročen z adrenalinom pri bolnikih z ET glede na zdrave ljudi, značilno zmanjša. Razpr. 3. Primerjava številčne koncentracije levkocitov, koncentracij hemoglobina in preiskovanih kazalcev za oceno trombocitne funkcije bolnikov, ki niso prejemali acetilsalicilne kisline, in s številčno koncentracijo trombocitov, manjšo od 600 × 109/L, in bolnikov, ki prav tako niso prejemali acetilsalicilne kisline, in s številčno koncentracijo trombocitov, večjo od 600 × 109/L. Table 3. Comparison of the concentration of leucocytes, haemoglobin values and the investigated parameters in patients that were not treated with ASA and had concentration of platelets under 600 × 109/L and patients that were not treated with ASA and had concentration of platelets over 600 × 109/L. Kazalec Parameter N1 Me1 N2 Me2 s/ns Krvna slika Blood picture L (× 109/L) 9 6,1 11 10 s, p = 0,044 Hb (g/L) 9 126 11 143 s, p = 0,023 Zapiralni čas Closure time CT-ADP (s) 9 100 11 105 ns CT-EPI (s) 9 139 11 155 ns Standardna preiskava AAPM Standard AAPM examination SC (%) 9 12 11 13 ns ASTTA (µm2) 9 38 11 40 ns NTTA 9 1728 11 1963 s, p = 0,004 Prirejena preiskava AAPM Modified AAPM examinationSC-AA (%) 9 2,1 11 1,5 ns ASTTA-AA (µm2) 9 34 11 31 ns NTTA-AA 9 341 11 236 ns N1 – število bolnikov, ki niso prejemali ASA, in s številčno koncentracijo trombocitov, manjšo od 600 × 109/L, Me1 – mediana bolnikov, ki niso prejemali ASA, in s številčno koncentracijo trombocitov, manjšo od 600 × 109/L, N2 – število bolnikov, ki niso prejemali ASA, in s številčno koncentracijo trombocitov, večjo od 600 × 109/L, Me2 – mediana bolnikov, ki niso prejemali ASA in s številčno koncentracijo trombocitov, večjo od 600 × 109/L, s – značilnost razlik, ns – ni značilnih razlik. N1 – number of patients that were not treated with ASA and concentration of platelets under 600 × 109/L; Me1 – median of patients that were not treated with ASA and concentration of platelets under 600 × 109/L; N2 – number of patients that were not treated with ASA and concentration of platelets over 600 × 109/L; Me2 – median of patients that were not treated with ASA and concentration of platelets over 600 × 109/L; s – significant differences; ns – differences were not significant. L – številčna koncentracija levkocitov; Hb – koncentracija hemoglobina; ADP – adenozindifosfat; ADR/EPI – adrenalin; AA – arahidonska kislina; CT – zapiralni čas; SC – delež pokrite površine s trombociti in trombocit-nimi agregati; ASTTA – povprečna velikost trombocitov in trombocitnih agregatov, vezanih na površino membrane; NTTA – število trombocitov in trombocitnih agregatov. L – concentration of leucocytes; Hb – haemoglobin values; ADP – ade-nosine diphosphate; ADR/EPI – adrenaline; AA – arachidonic acid; CT – closure time; SC – surface coverage with platelets and platelet aggregates; ASTTA – average size of platelets and platelet aggregates; NTTA – number of platelets and platelet aggregates. Zmanjšan delež agregacije, povzročen z adrenalinom, pa smo ugotovili tudi v raziskavi. Ti rezultati potrjujejo, da imajo bolniki z ET okvarjeno funkcijo trombocitov. Sklepamo, da je dodani adrenalin primeren za oceno trombocitne funkcije pri bolnikih z ET. Prav tako v literaturi15 zasledimo podatek, da se delež agregacije povzročen s kolagenom pri bolnikih z ET glede na zdrave ljudi, značilno zmanjša. Slednje kažejo tudi rezultati naše raziskave. Ti rezultati potrjujejo, da imajo bolniki z ET okvarjeno funkcijo trombocitov. Sklepamo, da je reagent kolagen primeren za oceno trombocitne funkcije pri bolnikih z ET. Trdina K et al. Adhezija in agregacija trombocitov na polistirenski membrani I-67 Delež agregacije, povzročen z arahidonsko kislino, se pri bolnikih z ET ni statistično razlikoval glede na zdrave ljudi. Iz tega lahko sklepamo, da vzrok za moteno funkcijo trombocitov pri bolnikih z ET ni v encimih, ki pretvorijo arahidonsko kislino v TXA2. Zapiralni čas, izmerjen v merilnih celicah KOL/ADP in KOL/EPI, je bil statistično podaljšan pri bolnikih z ET. Slednji rezultati se skladajo s podatki iz literatu-re.15 Iz tega lahko sklepamo, da imajo bolniki z ET okvarjeno funkcijo trombocitov. Primerjava obeh skupin je pokazala značilno povečano NTTA standardne preiskave AAPM pri bolnikih z ET. Avtorji8 navajajo, da je stopnja adhezije in agrega-cije odvisna od števila trombocitov. Bolniki z ET imajo namreč povečano število trombocitov in na ta način lahko pride do večjega NTTA. Izsledki značilno povečanega NTTA in ne tudi drugih kazalcev standardne preiskave AAPM pri bolnikih z ET so pokazali, da ne moremo ločiti reaktivne trombocitoze (krvavitev) od bolezenskega povečanja števila trombocitov (ET). Značilno zmanjšan SC-AA in ASTTA-AA prirejene preiskave AAPM smo ugotovili pri bolnikih z ET. V litera-turi16 zasledimo podatek, da imajo bolniki z ET povečano aktivnost fosfolipaz. Po dodatku arahidonske kisline pride preko TXA2 do aktivacije trombocitov in sekrecije iz trombocitnih zrnc. Aktivirajo se tudi fos-folipaze, ki sprostijo arahidonsko kislino iz membrane trombocitov. Večja aktivnost fosfolipaz pri bolnikih z ET lahko na ta način povzroči sprostitev večjih količin endogene arahidonske kisline. Arahidonska kislina povzroči aktivacijo in aglutinacijo trombocitov, kar se kaže v močno zmanjšani adheziji. Nastanejo namreč majhni agregati trombocitov, ki začasno izgubijo adhezijske lastnosti, dokler se ne pojavi spontana deagregacija.8 Želeli smo ugotoviti, ali ASA vpliva na agregometrijo, zapiralni čas in AAPM. Bolnike z ET smo razdelili v skupino, ki je prejemala ASA, in skupino, ki ASA ni prejemala. Skupini bolnikov se v številčni koncentraciji trombocitov, levkocitov in koncentracijah hemoglobina nista razlikovale. ASA z acetiliranjem encima ciklooksi-genaza-1 vpliva na samo delovanje trombocitov in ne na njihovo nastajanje. Prav tako nima vpliva na nastajanje levkocitov in koncentracije hemoglobina.6, 7 Primerjava bolnikov, ki so prejemali ASA, z bolniki, ki ASA niso prejemali, je pokazala značilno zmanjšano agregacijo povzročeno z ADP in arahidonsko kislino v primeru bolnikov, ki so prejemali ASA. Rezultati raziskave se ujemajo s podatki iz literature.5, 7 ASA namreč inhibira nastanek TXA2 in s tem sekundarni val z ADP povzročene agregacije. Pri dodatku arahidonske kisline kot aktivatorja trombocitov se ta prav tako ne more pretvoriti v TXA2 zaradi inhibicije encima ciklooksige-naze z ASA. Posledica tega je zmanjšan delež agregaci-je. Delež agregacije, povzročen z adrenalinom in kolagenom, se med obema skupinama bolnikov ni značilno razlikoval. Vpliva ASA na agregacijo, povzročeno z adrenalinom in kolagenom, ne moremo ugotoviti, saj je bil delež agregacije z adrenalinom in kolagenom majhen že pri skupini bolnikov, ki ni prejemala ASA. Sklepamo lahko, da je vzrok v okvarjeni funkciji trombocitov ali pa v neustreznem reagentu. Literatura7, 10 navaja, da ASA podaljša zapiralni čas, izmerjen z merilno celico KOL/EPI, pri tem pa nima vpliva na zapiralni čas, izmerjen v merilni celici KOL/ADP. Slednje smo potrdili tudi z rezultati naše raziskave. Skupini bolnikov se nista razlikovali v kazalcih standardne preiskave AAPM. Slednji rezultati se skladajo z literaturo,8 ki navaja, da ASA na standardno preiskavo AAPM nima vpliva, saj le-ta večinoma predstavlja adhezijske lastnosti trombocitov. Primerjava obeh skupin bolnikov je pokazala pri bolnikih, ki so prejemali ASA, značilno povečan SC-AA, ASTTA-AA in NTTA-AA prirejene preiskave AAPM. Slednji rezultati prirejene preiskave AAPM so tudi v skladu z literaturo.8 Preinkubacija vzorca z arahidon-sko kislino povzroči aktivacijo in aglutinacijo trombocitov, kar se kaže v zelo zmanjšani adheziji. Nastanejo namreč majhni agregati trombocitov, ki začasno izgubijo adhezijske lastnosti, dokler se ne pojavi spontana deagregacija. V primeru bolnikov, ki se zdravijo z ASA, pa pride do večje adhezije trombocitov kot posledica inhibicije arahidonske kisline z ASA. V raziskavi smo tudi skušali ugotoviti, ali številčna koncentracija trombocitov pri bolnikih z esencialno trom-bocitemijo vpliva na zapiralni čas in AAPM. V ta namen smo bolnike, ki niso prejemali ASA, razdelili v skupino s številčno koncentracijo, manjšo od 600 × 109/L, in skupino s številčno koncentracijo, večjo od 600 × 109/L. Vpliva številčne koncentracije trombocitov na vrednosti deleža agregacije nismo preverjali, saj pri delu z agregometrom številčno koncentracijo trombocitov vedno uravnamo na 250 × 109/L. V zapiralnih časih nam primerjava obeh skupin bolnikov ni pokazala značilnih razlik. Ena od možnih razlag je, da je zaradi okvarjene funkcije trombocitov pri bolnikih z esencialno trombocitemijo zapiralni čas podaljšan v obeh merilnih celicah. Zaradi slabosti naprave, tj. maksimalnega časa merjenja 300 sekund, tako ne vemo, za koliko se čas podaljša in v kolikšnem času bi dejansko prišlo do zaprtja odprtine. S tem pa tudi ne moremo ugotoviti, ali število trombocitov vpliva na zapiralni čas. Primerjava teh dveh skupin bolnikov nam je kazala značilno povečano NTTA standardne preiskave AAPM pri bolnikih s številčno koncentracijo, večjo od 600 × 109/L. Ti rezultati so v skladu s podatki iz literature,8 saj je stopnja adhezije in agregacije odvisna od števila trombocitov. Primerjava teh dveh skupin je pokazala tudi značilno povečano številčno koncentracijo levkocitov in koncentracije hemoglobina pri bolnikih s številčno koncentracijo, večjo od 600 × 109/L. Vendar so te razlike med obema skupinama lahko posledica dejstva, da je bilo v skupini z večjo številčno koncentracijo trombocitov več moških, ki imajo večjo koncentracijo hemoglobina kot ženske. Večja številčna koncentracija levkocitov in koncentracije hemoglobina lahko prispevajo k večji viskoznosti krvi in s tem k večjemu NTTA. Skupini bolnikov se nista razlikovali v kazalcih prirejene preiskave AAPM, in sicer SC-AA, ASTTA-AA in NTTA-AA. Iz tega lahko sklepamo, da število trombocitov na prirejeno preiskavo AAPM ne vpliva. I-68 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I Ugotovili smo korelacijo (? = –0,446; p < 0,001) med kazalcem SC-AA prirejene preiskave AAPM in deležem agregacije, povzročene z arahidonsko kislino. Prav tako pa smo ugotovili tudi korelacijo (? = –0,462; p < 0,001) med kazalcem NTTA-AA prirejene preiskave AAPM in deležem agregacije, povzročene z arahi-donsko kislino. V skupini bolnikov, ki so prejemali ASA, smo izločili 4 bolnike z ugotovljeno rezistenco na ASA. Njihovi rezultati namreč napačno vplivajo na statistično vrednotenje rezultatov in s tem tudi na sklepe. Zaključki Prirejena preiskava AAPM se je izkazala kot primerni način za določanje motenj funkcije trombocitov pri bolnikih z ET. Prirejena preiskava AAPM se je izkazala kot primeren način za spremljanje učinka profila-kse z ASA. Poleg tega smo ugotovili, da omogoča odkrivanje bolnikov, ki so rezistentni na ASA. Ugotovili smo, da številčna koncentracija trombocitov v krvi pri bolnikih z ET vpliva na NTTA standardne preiskave AAPM. Literatura 1. Modic M. Kronične mieloproliferativne bolezni. In: Kocjančič A, Mravlje F, Štajer D. Interna medicina, 3. izd. Ljubljana: DZS: 2005. 1240–9. 2. http://www.emedicine.com/med/topic2266.htm 3. Harrison NC. Platelets and thrombosis in myeloproliferative diseases. Hematology 2005; 1: 409–15. 4. Hassan AA, Kroll HM. Acquired disorders of platelet function. Hematology 2005; 1: 403–8. 5. Spectre G, Brill A, Gural A, Shenkman B, Touretsky N, Mosseri E, Savion N, Varon D. A new point-of-care method for monitoring anti-platelet therapy: application of the cone and plate(let) analyzer. Platelets 2005; 16: 293–9. 6. Rang HP, Dale MM, Ritter JM. Pharmacology. 4th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 1999. 7. Slapnik S. Laboratorijsko spremljanje zdravljenja z acetilsalicil-no kislino pri bolnikih z esencialno trombocitemijo. Diplomska naloga, Ljubljana: Fakulteta za farmacijo; 2002. 8. Priložena navodila: Impact-R proizvajalca DiaHem AG. 9. Varon D, Savion N. Cone and plate(let) analyzer. V: Michelson AD. Platelets. Worcester: Academic Press; 2002. p 337–45. 10. Mlakar U, Preložnik Zupan I, Strauch R. Ocena primarne hemo-staze z analizatorjem trombocitne funkcije PFA-100. Zdrav Vestn 2004; 73: 485–8. 11. Rand LM, Leung R, Packham MA: Platelet function assays. Transfusion and Apheresis Science 2003; 28: 307–17. 12. Harrison P. Progress in the assessment of platelet function. Br J Haematol 2000; 111: 733–44. 13. Bohinjec J. Temelji klinične hematologije. Ljubljana: Dopisna delavska univerza UNIVERZUM; 1983. 14. http://www.nodia.nl/Hart_KI_docs/platelet_aggr_reagents.htm 15. Cesar JM, Miguel D, Garcia AA. Burgaleta C. Platelet dysfunction in primary thrombocythemia using the platelet function analyzer, PFA-100. Am J Clin Pathol 2005; 123: 772–7. 16. Mayordomo O, Carcamo C, Vecino AM, Navarro JL, Cesar JM. Arachidonic acid metabolism in platelets of patients with essential thrombocythaemia. Thromb Res 1995; 78: 315–21. Prispelo 2008-02-20, sprejeto 2008-03-03