Iskanje modulatorjev programirane smrti celic kronične limfocitne levkemije - Nabergoj, Sanja (visokošolska dela, 2021)
Kronična limfocitna levkemija (KLL) je najbolj pogosta podvrsta levkemije v zahodnem svetu, pri kateri pride do kopičenja malignih, nefunkcionalnih limfocitov B v periferni krvi. KLL je sprva počasi napredujoča bolezen, ki ima zelo heterogen klinični potek. Veliko bolnikov ob postavitvi diagnoze nima kliničnih težav in so lahko tudi več kot desetletje brez terapije. Pri nekaterih pa bolezen napreduje hitro in potrebujejo takojšnje zdravljenje. Danes so za zdravljenje KLL na voljo nova tarčna zdravila, kot so idelalisib, ibrutinib in venetoklaks, ki vse bolj nadomeščajo kemoimunoterapijo sestavljeno iz fludarabina, ciklofosfamida in rituksimaba (shema FCR). Kljub temu, da so nova tarčna zdravila zelo učinkovita in odobrena za zdravljenje bolnikov z neodzivno boleznijo ali pri ponovitvi bolezni, bolniki razvijajo odpornost nanje in imajo ponovitve bolezni. KLL tako še vedno ostaja neozdravljiva bolezen, za katero potrebujemo nove učinkovine in terapevtske pristope. V doktorski nalogi smo se zato usmerili v iskanje novih modulatorjev programirane celične smrti za zdravljenje KLL, kjer smo kot terapevtski tarči predpostavili receptor za prostaglandin E2, podtip 4 (EP4) in receptor nukleotid-vezoče oligomerizacijske domene 2 (NOD2). Receptor EP4 je s proteinom G sklopljen receptor in eden izmed štirih prostaglandinskih receptorjev tipa E. Njegov naravni ligand je prostaglandin E2 (PGE2), ki je pomemben regulator delovanja limfocitov B. Vezava PGE2 na receptor EP4 modulira od ciklični adenozin-monofosfat (cAMP)-odvisne in od cAMP-neodvisne signalne poti, med katerimi je najpomembnejša signalna pot NF-kB. Receptor EP4 je bil prepoznan kot tarča za zdravljenje B celičnih levkemij in limfomov. Agonist EP4, PGE1-OH je inhibiral signalno pot jedrnega dejavnika kappa B (NF-kB), kar je vodilo v povečano občutljivost malignih celic B na učinkovini bortezomib in doksorubicin. Prav tako je PGE1-OH sprožil celično smrt na modelih levkemij in limfomov kot tudi na primarnih celicah KLL. Danes so na voljo zelo specifični agonisti EP4, kot je na primer spojina L-902688, ki je 4000-krat bolj selektivna za receptor EP4 kot za ostale receptorje EP1-3. L-902688 je v raziskavah na podganah pokazala dobro biološko razpoložljivost ter dolgo razpolovno dobo. Večina raziskav s to spojino je bilo narejenih na gladkih mišičnih celicah, ni pa znano kako spojina deluje na malignih celicah B. Receptor NOD2 je citosolni receptor, udeležen v prepoznavanju znotrajceličnih patogenov v okviru prirojenega imunskega sistema. Njegov naravni ligand je muramil dipeptid (MDP), majhen strukturni motiv, ki se nahaja v celični steni bakterij. Aktivacija receptorja ii NOD2 vodi do protimikrobnega in vnetnega delovanja, prav tako pa sodeluje tudi pri procesu apoptoze. Agonisti NOD2 so dobre imunostimulatorne spojine in imajo s tem posredno tudi potencialno protivirusno, protibakterijsko in protitumorno delovanje. Sintetiziranih je bilo že več generacij agonistov receptorjev NOD2, ki so se v testih in vitro izkazale kot močne imunostimulatorne spojine. Kot najbolj perspektivna spojina se je izkazala spojina SG8; strukturno gledano gre za spojino, ki vsebuje trans-feruloil-glicinski mimetik N-acetilmuraminske kisline, ki je povezan z dipeptidom, sestavljenim iz L-valina (L-Val) in D-glutaminske kisline (D-Glu). Spojina SG8 je v testih in vitro izkazala zelo dobro imunostimulatorno delovanje, ki pa se žal ni ohranilo in vivo. Da bi se izboljšale njene farmakokinetične lastnosti, so sintetizirali novo generacijo agonistov NOD2. Ker lahko nekateri agonisti NOD2 povečajo protitumorno delovanje imunskih celic, smo v doktorski nalogi preverili ali lahko le-to povečajo tudi izbrani predstavniki nove generacijo agonistov NOD2. V prvem delu doktorske naloge smo ovrednotili sposobnost agonista receptorja EP4, L-902688, da povzroči celično smrt na celičnih linijah levkemij in limfomov, primarnih celicah KLL in mononuklearnih celicah periferne krvi (PBMC). Zbiranje krvnih vzorcev bolnikov s KLL je potekalo na Univerzitetnem kliničnem centru Ljubljana, Kliničnem oddelku za hematologijo Interne klinike (klinični študiji 93/12/10 in 0120-136/2019/4, odobreni s strani Komisije Republike Slovenije za medicinsko etiko). Ugotovili smo, da je spojina L-902688 zmanjšala metabolno aktivnost pri vseh malignih celicah, najnižja vrednost IC50 pa je bila določena na celičnih linijah B-celičnega izvora. Vrednosti IC50 smo določili tudi na 38 vzorcih bolnikov s KLL, ki so bili v različnem stadiju bolezni (stadij Binet A, B, C) in imeli različne citogenetske spremembe (del(13q), +12, del(17p)). L-902688 je deloval podobno citotoksično na celice iz vseh 3 skupin stadijev bolezni in citogenetskih sprememb. Spojina L-902688 je izkazovala dobro selektivno toksičnost, saj je imela 2-10 krat višjo IC50 vrednost na celicah PBMC (39,54 mikroM), kot na malignih celicah (3,26-18,42 mikroM). Z uporabo selektivnega antagonista receptorja EP4 (CJ-042794) smo potrdili, da spojina L-902688 posreduje svoje citotoksične učinke na celicah KLL preko receptorja EP4. Ugotovili smo tudi, da L-902688 na celicah KLL povzroča inhibicijo signalne poti NF-kB, inhibicijo celične proliferacije ter inducira apoptozo, ki je posredovana preko kaspaz. Nato smo na modelni celični liniji MEC-1 ovrednotili citotoksično delovanje L-902688 v kombinaciji z novimi tarčnimi zdravili za zdravljenje KLL (ibrutinib, idelalisib, iii venetoklaks) in monoklonskimi protitelesi usmerjenimi proti CD20 (rituksimab, ofatumumab in obinutuzumab). Ugotovili smo, da v testnih koncentracijah ibrutinib in idelalisib zmanjšata metabolno aktivnost celic MEC-1, medtem ko v teh koncentracijah nimata učinka na viabilnost. Sklepamo, da v teh koncentracijah spojini delujeta citostatično. Ko smo celicam dodali ibrutinib ali idelalisib v kombinaciji z L-902688, smo videli tako znižano metabolno aktivnost kot viabilnost celic MEC-1. Ko smo celice MEC-1 inkubirali z venetoklaksom, je le-ta zmanjšal njihovo metabolno aktivnost in viabilnost. Ko smo celice tretitali z venetoklaksom v kombinaciji z L-902688, se je njegova citotoksičnost povečala, kar smo izmerili kot znižano metabolno aktivnost in viabilnost celic MEC-1. Prav tako smo L-902688 v kombinaciji z ibrutinibom ali idelalisibom testirali tudi na primarnih celicah KLL. V obeh primerih je L-902688 povečal citotoksično delovanje ibrutiniba ali idelalisiba. Citotoksične učinke ibrutiniba, idelalisiba ali venetoklaksa v kombinaciji z L-902688 smo ovrednotili tudi s programom CompuSyn. Analiza podatkov je pokazala, da testirane kombinacije spojin delujejo sinergistično. Citotoksičnost spojine L-902688 smo na celicah KLL ovrednotili tudi v kombinaciji z monoklonskimi protitelesi. Ugotovili smo, da je L-902688 povečal citotoksičnost rituksimaba, ofatumumaba in obinutuzumaba, kar smo videli kot znižano metabolno aktivnost celic KLL, ko smo celice inkubirali s kombinacijo L-902688 in monoklonskega protitelesa. Citotoksične učinke testiranih kombinacij smo analizirali še v programu CompuSyn in ugotovili, da L-902688 deluje sinergistično z obinutuzumabom in rituksimabom, medtem ko z ofatumumabom deluje aditivno. Ugotovitev, da L-902688 povača citotoksičnost novih tarčnih zdravil kot tudi monoklonskih protiteles odpira nove terapevtske možnosti za zdravljenje bolnikov s KLL. V drugem delu doktorske naloge smo ovrednotili sposobnost novih agonistov receptorja NOD2, da povečajo protitumorno delovanje imunskih celic proti celicam KLL. Spojine so sintetizirali na Fakulteti za farmacijo in imajo izboljšane farmakokinetične lastnosti v primerjavi s prejšnjimi generacijami. Najprej smo njihovo sposobnost, da povečajo protitumorno delovanje imunskih celic ocenili na makrofagih, ki smo jih pridobili z diferenciacijo monocitne celične linije THP-1 s pomočjo forbol 12-miristat 13-acetata (PMA). Pri celicah THP-1, ki smo jih 3 dni gojili v prisotnosti PMA, smo videli povišanje izražanja celičnih označevalcev CD11b in CD68, kar dokazuje uspešnost diferenciacije in pridobitev makrofagov v kulturi. Makrofage smo nato izpostavili agonistom receptorja NOD2 in celicam MEC-1 za 24 ali 48 h. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili MDP, saj je iv znano, da lahko z deli bakterijske celične stene kot sta MDP ali lipopolisaharid (LPS) stimuliramo protitumorno delovanje makrofagov. Rezultati so pokazali, da ne MDP, ne katera izmed izbranih spojin v testni koncentraciji (10 mikroM) ni povečala citotoksičnega potenciala makrofagov proti celicam MEC-1. Da bi bolje ponazorili pogoje in vivo, smo namesto makrofagov, diferenciranih iz celic THP-1, uporabili PBMC. Slednje smo izpostavili izbranim agonistom NOD2 in celicam MEC-1 za 24 h. Izmed vseh izbranih spojin je spojina SG101 izrazito povečala citotoksičnost PBMC proti celicam MEC-1. Ugotovitev, da lahko spojina SG101 poveča protitumorno delovanje imunskih celic, predstavlja obetavno možnost za razvoj potencialne (ko)terapije za zdravljenje KLL. Poglaviten namen doktorskega dela je bil prispevati k izboljšanju terapije bolnikov s KLL. Čeprav so danes za zdravljenje KLL na voljo učinkovita zdravila, bolniki razvijajo odpornost nanje in imajo ponovitve bolezni. KLL tako še vedno ostaja neozdravljiva bolezen, za katero potrebujemo nove učinkovine in terapevtske pristope. Ugotovitvi, da L-902688 povača citotoksičnost novih tarčnih zdravil kot tudi monoklonskih protiteles ter da lahko agonisti NOD2 stimulirajo protitumorno delovanje imunskih celic, odpirata nove terapevtske možnosti za zdravljenje bolnikov s KLL.
Keywords: disertacije; Kronična limfocitna levkemija; modelna celična linija MEC-1; prostaglandinski receptorji; protitumorno delovanje; receptor EP4; receptor NOD2; Zdravljenje