UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIˇ SKA FAKULTETA INTERDISCIPLINARNI PODIPLOMSKI ˇ STUDIJ BIOTEHNOLOGIJE Andrej RAZPET GENETSKA RAZNOLIKOST SALMONIDOV V POREˇ CJU NERETVE MAGISTRSKO DELO LJUBLJANA, 2004 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIˇ SKA FAKULTETA INTERDISCIPLINARNI PODIPLOMSKI ˇ STUDIJ BIOTEHNOLOGIJE Andrej RAZPET GENETSKA RAZNOLIKOST SALMONIDOV V POREˇ CJU NERETVE MAGISTRSKO DELO GENETIC DIVERSITY OF SALMONIDS OF THE RIVER NERETVA DRAINAGE M. Sc. THESIS LJUBLJANA, 2004 Magistrsko delo je bila opravljeno na Biotehniˇski fakulteti, Oddelek za zootehniko, Inˇstitut za ˇzivinorejo, genetski laboratorij v Domˇzalah. Senat biotehniˇske fakultete je za mentorja magistrskega dela imenoval prof. dr. Petra Dovˇca. Mentor: prof. dr. Peter DOVCˇ Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela: prof. dr. Jurij POHAR – predsednik Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Oddelek za zootehniko prof. dr. Peter DOVCˇ– ˇclan Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Oddelek za zootehniko doc. dr. Peter TRONTELJ – ˇclan Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Oddelek za biologijo dr. Aleˇs SNOJ – ˇclan Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Oddelek za zootehniko Datum zagovora: 24. 6. 2004 Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Andrej Razpet KLJUˇ CNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA Razpet A. Genetska raznolikost salmonidov v poreˇcju Neretve. Mag. delo. Lj., Univ. v Lj. , Biotehniˇska fakulteta, Interdisciplinarni podiplomski ˇstudij biotehnologije, 2004 ˇSD Md DK UDK 597.5:575.2:577.2.088(043)=863 KG rod Salmo/postrvi/Neretva/genetski markerji/mtDNA/mikrosateliti/ faktorielna korespondenˇcna analiza/bioloˇska raznolikost AV RAZPET, Andrej, univ. dipl. mikrobiol. SA DOVˇC, Peter (mentor) KZ SI–1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Interdisciplinarni podiplomski ˇstudij biotehnologije LI 2004 IN GENETSKA RAZNOLIKOST SALMONIDOV V POREˇCJU NERETVE TD Magistrsko delo OP XII, 69 str., 11 pregl., 19 sl., 4 pril. 104 vir. IJ sl JI sl/en AI Poreˇcje Neretve predstavlja najpomembnejˇse s salmonidi naseljeno obmoˇcje na ju­gozahodnem Balkanu. Raziskovalci so s pomoˇcjo zunanjih morfoloˇskih znakov tam naˇsli in opisali veˇc simpatriˇcnih vrst salmonidov: Salmo trutta, S. marmoratus, S. obtusirostris, S. farioides in S. dentex. Zaradi pomanjkljivih opisov in pomanjkanja tipskih primerkov je taksonomski status nekaterih vpraˇsljiv. Izvedli smo genotipi­zacijo 206–ih primerkov, veˇcinoma iz zgornjega dela poreˇcja Neretve, da bi doloˇcili obstojeˇce taksone v poreˇcju, odnose med njimi in odnose s salmonidnimi taksoni iz drugih poreˇcij. Ugotovili smo mtDNA haplotip posameznih primerkov in jih uvrstili v obstojeˇco razdelitev na .logeografske linije. Genetsko strukturiranost populacij in introgresijo smo ugotavljali na osnovi mikrosatelitov in SNP-jev. V skladu z mtDNA haplotipi je poreˇcje naseljujejo S. obtusirostris in tri linije S. trutta: avtohtona ja­dranska linija in dve neavtohtoni (donavska in atlantska). S. dentex in S. marmoratus imata mtDNA haplotip jadranske linije. Razultati analize jedrnih markerjev potr­jujejo kriˇzanje S. obtusirostris in avtohtone S. trutta. Povratno kriˇzanje poteka s S. trutta, kar pojasnjuje ohranitev simpatriˇcnosti S. obtusirostris. Zasledili smo tudi kriˇzanje med avtohtonimi in vloˇzenimi linijami S. trutta, ki lahko potencialno ogrozi simpatrijo avtohtonih linij. KEY WORDS DOCUMENTATION Razpet A. Genetska raznolikost salmonidov v poreˇcju Neretve. Mag. delo. Lj., Univ. v Lj. , Biotehniˇska fakulteta, Interdisciplinarni podiplomski ˇstudij biotehnologije, 2004 DN MD DC UDC 597.5:575.2:577.2.088(043)=863 CX genus Salmo/trout/Neretva/genetic markers/mtDNA/microsatellites factorial correspondence analysis/biodiversity AU RAZPET, Andrej AA DOVˇC, Peter (supervisor) PP SI–1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, BF, Interdisciplinary Postgraduate Study in Biotechnology PY 2004 TI GENETIC DIVERSITY OF SALMONIDES OF THE RIVER NERETVA DRAINAGE DT M. Sc. Thesis NO XII, 69 p., 11 tab., 19 .g., 4 app., 104 ref. LA sl AL sl/en AB The Neretva basin is the main salmonid habitat in the Adriatic part of the south­western Balkans. On the basis of external morphology, several sympatric salmonid species (i.e., Salmo trutta, S. marmoratus, S. obtusirostris, S. farioides and S. den­tex) were described, however, original descriptions were vague and some of the names are now questionably valid, which makes taxonomy unclear. In order to revise the existent taxonomy of salmonid taxa in the Neretva basin, to determine their mutual relationship and relationship to valid salmonid taxa, we conducted genetic screening of 206 specimens, randomly sampled in the upper part of the Neretva basin. On the basis of mtDNA, we determined the phylogeographic lineage of individuals, whereas population genetic structure and introgression were determined using microsatellite and SNP data. According to mtDNA haplotypes, Neretva basin is inhabited by S. obtusirostris and three lineages of S. trutta: native Adriatic lineage and two intro­duced lineages (the Danubian and Atlantic). S. dentex and it S. marmoratus exhibit the Adriatic lineage mtDNA haplotype. Using nuclear DNA markers, natural in­trogression between S. obtusirostris and native S. trutta was detected being biased toward S. trutta, which may explain the preservation of the S. obtusirostris integrity despite observed interspeci.c hybridisation. Hybridisation between the native and introduced lineages of S. trutta was detected as well, representing a potential threat to sympatric co-existence of all the native lineages. KAZALO VSEBINE Kljuˇcna dokumentacijska informacija III Key words documentation IV Kazalo vsebine V Kazalo slik IX Kazalo preglednic X Okrajˇsave in simboli XI 1 UVOD 1 2 PREGLED OBJAV 3 2.1 POREˇ3 CJENERETVE. ... . ... ... ... . ... ... . ... ... ... 2.2 BIOLOˇ.... SKI KONCEPT VRSTE IN TAKSONOMIJA SALMONIDOV 4 2.3 EVOLUCIJSKIKONCEPTVRSTE ....................... 5 2.4 FILOGENETSKIKONCEPTVRSTE ...................... 6 2.5 OPIS VRST V POREˇ8 CJUNERETVE.. ... . ... ... . ... ... ... 2.5.1 S. trutta Linnaeus,1758 ............................. 8 2.5.2 S. obtusirostris Heckel,1851........................... 9 2.5.3 S. marmoratus Cuvier,1817........................... 10 2.5.4 S. dentex Heckel,1851 .............................. 12 2.5.5 S. farioides Karaman,1937 ........................... 13 2.5.6 S. cf. montenigrinus ............................... 14 2.5.7 Kriˇzanci ...................................... 15 2.6 GENETSKIMARKERJI ............................. 16 2.6.1 MitohondrijskaDNA............................... 16 2.6.2 JedrnaDNA ................................... 18 2.6.2.1 Mikrosateliti .................................. 18 2.6.2.2 Toˇckovnemutacije(SNP) ........................... 19 2.7 OSNOVNIPRINCIPISTATISTIˇ................ CNIH ANALIZ 19 2.7.1 Faktorielnakorespondenˇcnaanaliza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.7.2 Matematiˇcno ozadje genetskega polimor.zma . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.8 PROBLEMATIKA KRIˇ22 ZANCEV. . ... ... . ... ... ... . ... ... 2.8.1 Razliˇcnitipikriˇzanj ............................... 23 2.8.2 Vlaganjaribinohranitevavtohtonihvrst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3 MATERIAL IN METODE 26 3.1 MATERIAL..................................... 26 3.1.1 Vzorˇcenje ..................................... 26 3.1.2 Kemikalije..................................... 28 3.1.3 Pripravljenisetikemikalij ............................ 28 3.1.4 Encimi....................................... 28 3.1.5 Oznaˇcevalcivelikosti ............................... 29 3.1.6 Raztopine ..................................... 29 3.1.7 Laboratorijskaoprema .............................. 29 3.1.8 Zaˇcetnioligonukleotidi.............................. 30 3.2 METODE ...................................... 30 3.2.1 IzolacijaDNA .................................. 30 3.2.1.1 Fenolnaekstrakcija .............................. 30 3.2.1.2 Wizard . GenomicDNAPuri.cationKit .................. 31 3.2.1.3 Hitrametoda .................................. 31 3.2.2 Agaroznagelskaelektroforeza .......................... 31 3.2.3 Veriˇznareakcijaspolimerazo .......................... 32 3.2.4 Izolacija fragmentov DNA iz gela z elektroelucijo . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2.5 PCR–RFLP.................................... 33 3.2.6 Doloˇcanjenukleotidnegazaporedja ....................... 35 3.2.7 Ugotavljanjedolˇzinemikrosatelitov. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.2.8 Analizapodatkov................................. 36 3.2.8.1 AnalizamtDNA ................................ 36 3.2.8.2 Analizajedrnihmarkerjev........................... 37 4 REZULTATI 38 4.1 TRENUTNO STANJE V POREˇ38 CJUNERETVE.. . ... ... . ... ... 4.2 KONTROLNAREGIJAmtDNA ......................... 38 4.2.1 HaplotipimtDNAvporeˇcjuNeretve ...................... 38 4.2.2 Distribucijahaplotipov ............................. 40 4.3 ANALIZAJEDRNIHMARKERJEV....................... 41 4.3.1 Mikrosateliti ................................... 41 4.3.2 LDHinGH2C .................................. 42 4.3.3 Statistiˇcnaobdelavapodatkov ......................... 43 4.3.3.1 Faktorielnakorespondenˇcnaanaliza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.3.3.2 Deleˇzi heterozigotnosti, F–statistika in vezava genetskih markerjev . . . . 45 5 RAZPRAVA 48 5.1 TRENUTNO STANJE V POREˇ48 CJUNERETVE.. . ... ... . ... ... 5.2 UVRSTITEV SALMONIDOV IZ POREˇ CJA NERETVE V FILOGEOGRAFSKE LINIJEPOBERNATCHEZU........................... 48 5.3 RAZˇ49 SIRJENOSTINIZVORLINIJmtDNA.. . ... ... . .. . ... ... 5.3.1 Jadranskalinija.................................. 49 5.3.2 Vneˇsenelinije................................... 49 5.3.3 HaplotipSoxy .................................. 50 5.4 VRSTE SALMONIDOV V POREˇ51 CJUNERETVEKOTESU. . . . . . . . . 5.4.1 S. obtusirostris, S. trutta innjunikriˇzanci ................... 51 5.4.2 VloˇzenepostrvivRakitnici ........................... 52 5.4.3 PosledicevlaganjvporeˇcjeNeretve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 5.4.4 S. marmoratus in S. dentex ........................... 53 5.5 OHRANITEVBIOTSKERAZNOLIKOSTI ................... 54 6 POVZETEK 56 7 SUMMARY 58 8 VIRI 60 9 ZAHVALA 69 KAZALO SLIK Slika 1: Zemljevid poreˇcja Neretve z okolico. 3 Slika 2: Filogenetsko drevo predstavnikov rodu Salmo na osnovi kon-7 trolne regije mtDNA, gena za citokrom b in regije ITS1 (Suˇsnik in sod., 2004). Slika 3: Razliˇcne barvne razliˇcice potoˇcne postrvi (S. trutta). 8 Slika 4: Mehkoustna postrv (S. obtusirostris). 10 Slika 5: S. marmoratus, zgoraj primerek iz Zadlaˇsˇcice, Slovenija, spodaj 11 primerek iz Neretve (foto: Aleˇs Snoj). Slika 6: S. dentex, zgoraj Hecklova skica (1852), spodaj primerek iz 12 Neretve. Slika 7: Primerjava S. dentex (zgoraj levo) in S. farioides (zgoraj desno) 13 (Karaman, 1937), spodaj S. cf. farioides (Delling, 2003). Slika 8: S. cf. montenigrinus iz Neretve (Delling, 2003). 14 Slika 9: Mehkoustna postrv ima znaˇcilno obliko ust (levo), pri kateri je 15 spodnja ˇceljust opazno krajˇsa od zgornje. Slika 10: Kriˇzanca S. marmoratus × S. trutta iz Posoˇcja (foto: Aleˇs Snoj). 16 Slika 11: Radzelitev razliˇcnih tipov kriˇzanj glede na nastanek (naravno ali 24 antropogeno) in obseg (stopnja introgresije) (Allendorf in sod., 2001). Slika 12: Zemljevid z lokacijami vzorˇcenj (levo) in vzorˇcenje v Rakitnici s 27 pomoˇcjo elektrike, ki zaˇcasno omami ribe (desno). Slika 13: Pro.li kontrolne regije mtDNA po restrikciji z endonukleazami 34 AluI (zgoraj levo), NdeI (zgoraj desno), SatI (spodaj levo) in SmaI (spodaj desno). Slika 14: Pro.l C introna gena za rastni hormon (GH2C) po restrikciji z 35 endonukleazo BseGI. Slika 15: Pro.l introna gena za laktat dehidrogenazo (LDH) po restrikciji 35 z endonukleazo RsaI. Slika 16: Filogenetsko drevo z novim haplotipom AdN na osnovi nekaterih 40 zaporedij 5’ dela kontrolne regije mtDNA. Slika 17: Polimor.zmi na posameznih mikrosatelitnih lokusih po 42 posameznih fenotipih. Slika 18: Faktorielna korespondenˇcna analiza po posameznih lokacijah. 44 Slika 19: Faktorielna korespondenˇcna analiza po posameznih fenotipih in 45 z vrstami, ki verjetno ustrezajo posameznem gruˇcam. KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Vzorˇcenje po lokacijah (navedena so imena rek oz. po-27 tokov) in fenotipih. Preglednica 2: Seznam uporabljenih zaˇcetnih oligonukleotidov in us-30 treznih temperaturnih programov. Preglednica 3: Opis temperaturnih programov mikroprocesorsko vodenih 33 termostatov. Preglednica 4: Mitohondrijski haplotipi v poreˇcju Neretve. 38 Preglednica 5: Primerjava zaporedja AdN (zadnja vrstica) z nekaterimi 39 zaporedji iz baze podatkov Genbank. Preglednica 6: Razporeditev mitohondrijskih haplotipov glede na mesto 40 izlova. Preglednica 7: Razporeditev mitohondrijskih haplotipov glede na fenotip. 41 Preglednica 8: Frekvenca alelov po fenotipih za gena, ki kodirata laktat 43 dehidrogenazo (LDH) in rastni hormon (GH2C). Preglednica 9: Najverjetnejˇsi za vrsto znaˇcilni jedrni markerji. 45 Preglednica 10: Primerjava deleˇzev heterozigotnosti (priˇcakovani, brez 46 vpliva in opazovani) in f^ glede na fenotip in lokacijo. ^ Preglednica 11: Vrednosti . po fenotipih (nad diagonalo) in % zaupanja 47 (pod diagonalo) glede na lokacijo (zgoraj) in fenotip (spo­daj). OKRAJˇ SAVE IN SIMBOLI A adenozin ang. angleˇsko bp bazni par C citidin cf. confer, primerjati z ddNTP 2’, 3’–dideoksinukleozid 5’–trifosfat DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP 2’–deoksinukleozid 5’–trifosfat EDTA etilen–diamino–tetraocetna kislina ESU evolucijsko pomembna enota (evolutionarily signi.cant unit) EtOH etanol, C2H5OH FAM karboksi.uorescin FCA faktorielna korespondenˇcna analiza (factorial correspondence analysis) G gvanin GH2C growth hormone, rastni hormon, C intron HEX 2’,4,4’,5’,7,7’–heksakloro.uorescin JOE 6–karboksi-4’,5’–dikloro–2’,7’–dimetoksi.uorescin kbp tisoˇc baznih parov lat. latinsko LDH laktat dehidrogenaza mtDNA mitohondrijska DNA N katerikoli nukleotid n.z. ni (statistiˇcno) znaˇcilno PCA analiza glavnih komponent (principal component analysis) PCR veriˇzna reakcija s polimerazo (polymerase chain reaction) pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov RFLP polimor.zem restrikcijskih fragmentov (restriction fragment lenght polymorphism) ROX karboksi–X–rodamin SDS natrijev dodecil sulfat (sodium dodecyl sulphate) SNP toˇckovna mutacija (single nucleotide polymorphism) T timidin TAE raztopina Trisa, acetata in EDTA TAMRA karboksitetrametilrodamin Taq DNA–polimeraza DNA–polimeraza, izolirana iz Thermus aquaticus TBE raztopina Trisa, borata in EDTA TEN raztopina Trisa, EDTA in NaCl TET 6–karboksi–2’,4,7,7’–tetrakloro.uorescin Tris 2–amino–2–(hidroksimetil)–1, 3–propandiol TSR template suppresion reagent ut% uteˇzni deleˇz 1 UVOD Opisovanje bioloˇske raznolikosti tradicionalno temelji na morfoloˇskih znakih ali mark­erjih. Vrsta kot osnovna enota bioloˇske raznolikosti je pogosto tudi najmanjˇsa tak­sonomska enota, ki je deleˇzna zakonske zaˇsˇcite posameznih drˇzav bodisi s statusom ogroˇzene vrste ali nacionalnega simbola. Morfoloˇske lastnosti so lahko podvrˇzene vplivom okolja, zaradi ˇcesar je njihova uporaba v klasi.kaciji vˇcasih nezadostna, zlasti v primerih kriˇzanja. Napaˇcna ocenitev bioloˇske raznolikosti ima torej lahko za posledico pomanjkljivo zakonsko zaˇsˇcito, ki tolerira ˇcloveˇske dejavnoti, ki vodijo v zmanjˇsanje raznolikosti znotraj vrst in ogroˇzajo njihov obstoj. Pri predstavnikih rodu Salmo so oˇcitne pomanjkljivosti morfoloˇskih markerjev, med katerimi je najpogosteje omenjena obarvanost ali pigmentacija. Predstavnike rodu so poimenovali z vsaj 1931 znanstvenimi imeni, veˇcinoma sinonimi, nekatere vrste naj bi ˇze izumrle, nekaj pa jih je opisanih le na osnovi izgubljenih tipskih primerkov. Taksoni severnega dela jadranskega povodja so dobro raziskani, predvsem v poreˇcjih Pada in Soˇce, kjer ˇzivi S. marmoratus, soˇska postrv. Preostanek jadranskega povodja pa je slabˇse raziskan, tako je zelo malo znanega, kakˇsen je odnos je med soˇsko postrvjo in glavatico, ki naseljuje juˇzni del jadranskega reˇcnega sistema. Obe sta poimenovani z istim znanstvenim imenom, S. marmoratus, vendar primerjava med njima, z izjemo obarvanosti, ˇse ni bila izvedena. Poloˇzaj salmonidov iz poreˇcja Neretve v obstojeˇci .logeografski razdelitvi S. trutta, je slabo raziskan. V poreˇcju Neretve je bilo opisanih vsaj ˇsest salmonidnih taksonov: S. marmoratus, S. trutta, S. dentex, S. obtusirostris, S. farioides in S. cf. montenegrinus. Njihovi opisi z morfoloˇskimi znaki pogosto ne omogoˇcajo nedvoumne identi.kacije posameznih primerkov. Dodatne teˇzave povzroˇca antropogeni vnos neavtohtonih linij postrvi (S. trutta), ki se uspeˇsno kriˇzajo z domaˇcimi linijami in tvorijo dodatne morfoloˇske variante, ki predstavljajo reprodukcijski most med simpatriˇcnimi avtohtonimi vrstami. Namen naˇse raziskave je: • ugotoviti trenutno stanje salmonidov v poreˇcju Neretve, • uvrstiti salmonide iz poreˇcja Neretve v obstojeˇce .logeografske linije (Bernatchez, 2001), • doloˇciti izvor in razˇsirjenost mtDNA linij na tem obmoˇcju, • ugotoviti njihovo genetsko raznolikost in jo primerjati z morfoloˇsko raznolikostjo ter • oblikovati predloge za ohranitev avtohtonih salmonidov. Filogenijo salmonidov smo doloˇcali na osnovi 5’ konca zaporedij kontrolne regije mito­hondrijske DNA (mtDNA), strukturiranost znotraj posameznih populacij in med njimi pa na osnovi rezultatov statistiˇcne analize jedrnih markerjev. 2 PREGLED OBJAV 2.1 POREˇCJE NERETVE Neretva izvira v jugovzhodnem delu Bosne in Hercegovine, blizu Zelengore na nad­morski viˇsini 1095 m in se po 218 km izliva v Jadransko morje pri mestu Ploˇce. Njeni veˇcji pritoki so Rakitnica, Rama, Bregava in Trebiˇzat, poreˇcje pokriva 5581 km2 , veˇcinoma v Bosni in Hercegovini (Slika 1). Neretva je gorska reka z velikimi nihanji vodostaja glede na letni ˇcas. Leta 1955 so na njej zgradili hidroelektrarno pri Jablanici, za 85 m visokim jezom je nastalo 27 km dolgo akumulacijsko jezero s pros­tornino 288000000 m3, ki sega vse do Konjica (Enciklopedija leksikografskog zavoda, 1968). Slika 1: Zemljevid poreˇcja Neretve z okolico. Figure 1: A map of the River Neretva drainage and its vicinity. Poreˇcje leˇzi blizu stiˇciˇsˇca jadranskega, ˇcrnomorskega in egejskega povodja in je najbolj vodnato na vzhodni obali Jadranskega morja. Na osnovi paleogeogra.je in razˇsirjenosti nekaterih sladkovodnih vrst lahko sklepamo na sladkovodno povezavo med jadranskim in panonskim povodjem v poznem mesinskem obdobju pred 5 milijoni leti. Med pleis­tocenskimi poledenitvami (v obdobju od pred 2,4 milijona let do pred 15-18 000 leti) je bilo poreˇcje Neretve zavetiˇsˇce sladkovodnih rib iz rek, ki se izlivajo v severni in zahodni Jadran. Zaradi veˇckratnega vzpostavljanja in prekinjanja vodnih povezav je priˇslo do zaporednih kolonizacij reke z novimi populacijami sladkovodnih vrst (Bianco, 1990). Veˇckratne kolonizacije so tudi najverjetnejˇsi razlog za raznolikost salmonidov (predstavniki rodu Salmo) v poreˇcju. Genetskih raziskav, ki bi to potrjevale, ni veliko. Kolonizacijo Neretve so preuˇcevali z doloˇcanjem zaporedij kontrolne regije mtDNA na samo dveh primerkih (Bernatchez, 2001), z alocimi pa so pojasnili ˇsirjenje potoˇcne postrvi v severno in zahodno Evropo iz vseh ledenodobnih zavetiˇsˇc, razen tistih iz mediteranske regije (Garcia–Marin in sod., 1999). 2.2 BIOLOˇ SKI KONCEPT VRSTE IN TAKSONOMIJA SALMONIDOV Vrsta je osnovna enota, s katero opisujemo bioloˇsko raznolikost. Veda, ki preuˇcuje raznolikost organizmov in odnose med njimi, se imenuje sistematika. Obstaja veˇc osnovnih konceptov, ki de.nirajo vrste kot dejanske naravne enote, na primer bioloˇski, evolucijski in .logenetski koncept vrste. Bioloˇski koncept, ki je od naˇstetih najbolj znan, de.nira vrsto kot skupino osebkov v naravnih populacijah, ki se parijo med seboj in so reproduktivno izolirani od drugih takih skupin (Mayr, 2000). Vrsta po tej de.niciji se obˇcasno imenuje tudi ”bioloˇska vrsta”, ˇceprav so tudi vse druge de.nicije vrste bioloˇske. Kljuˇcno pri opisu ”bioloˇske vrste” je torej doloˇciti reprodukcijsko izolacijo. V praksi raziskovalci vrsto opisujejo po morfoloˇskih, ekoloˇskih, biokemiˇcnih, etoloˇskih in molekularno genetskih kriterijih, ki pa so razliˇcni glede na obravnavane organizme. Tako se, denimo, uporablja razliˇcne kriterije pri doloˇcanju vrst ptic in rib, ˇse dosti drugaˇce je pri bakterijah in dinozavrih. Za rastline in ˇzivali, ki se razmnoˇzujejo spolno, raziskovalci izluˇsˇcijo reprodukcijsko bariero in de.nirajo vrste, dejanskih poskusnih kriˇzanj se obiˇcajno ne izvaja (Kottelat, 1997). Z boljˇsim razumevanjem prej omenjenih kriterijev se spreminjata tako razvrˇsˇcanje oseb­kov v hierarhiˇcni sistem (klasi.kacija) kot tudi njihovo poimenovanje (nomenklatura). Ribe (Pisces) so para.letski takson, opiˇsemo jih kot v vodi ˇziveˇce vretenˇcarje s ˇskrgami in izrastki, ˇce jih imajo, v obliki plavuti. Po eni od ocen ribe predstavljajo polovico vretenˇcarskih vrst (Nelson, 1994). Trenutno je klasi.kacija salmonidov po ITIS (ITIS, 2004) naslednja: • kraljestvo Animalia, ˇzivali • deblo Chordata, strunarji • poddeblo Vertebrata, vretenˇcarji • nadrazred Ochteichthyes, ribe kostnice • razred Actinopterygii, ˇzarkoplavutarice • podrazred Neopterygii • podpodrazred Teleostei • nadred Protacanthopterygii • red Salmoniformes • druˇzina Salmonidae s poddruˇzinami: – Coregoninae, ozimnice – Thymallinae, lipani – Salmoninae z rodovi: * Brachymystax, lenok * Hucho, sulci * Onchorhyncus, paci.ˇski lososi in paci.ˇske postrvi * Parahucho * Salmo, atlantski losos in postrvi * Salvelinus, zlatovˇcice * Salvethymus Predstavnike rodov Parahucho in Salvethymus se po nekaterih genetskih raziskavah uvrˇsˇca v rodova Hucho in Salvelinus (Phillips in Oakely, 1997), rod Salmo pa vkljuˇcuje tudi predstavnike, ki so bili prej vkljuˇceni v rodove Acantholingua, Platysalmo in Salmothymus (Snoj in sod., 2002a; Suˇsnik in sod., 2004). Salmonidne vrste so bile opisane skoraj izkljuˇcno na osnovi morfologije, saj molekularno genetskih tehnik ni bilo. Pristopa so zdruˇzili v raziskavi na fenotipsko zelo razliˇcnih salmonidih v Italiji, kjer so naˇsli nepriˇcakovano malo genetske variacije na zaporedjih mtDNA (Patarnello in sod., 1994). Od Linnejeve uvedbe nomenklaturnega sistema leta 1758 je bilo na osnovi morfologije poimensko opisanih vsaj 1931 vrst evropskih salmonidov (Kottelat, 1997). Ne glede na de.nicijo vrste je ˇstevilka pretirano visoka in predvsem posledica nepoznavanja pravil nomenklature (pri starejˇsih opisih vrst teh pravil ˇse ni bilo) in slabega poznavanja morfologije rib. V obseˇznem pregledu evropskih sladkovodnih rib je Kottelat (1997) naˇstel kar 57 znanstvenih imen za potoˇcno postrv S. trutta sensu stricto in zlobno pripomnil, da je ˇstevilo vrst na nekem obmoˇcju v obratnem sorazmerju z oddaljenostjo od laboratorija sistematika, ki se ukvarja z njimi. Zraˇcna razdalja med Ljubljano in Neretvo je 400 km. 2.3 EVOLUCIJSKI KONCEPT VRSTE V skladu z evolucijskim konceptom je vrsta linija prednikov in potomcev, ki ohranja svojo identiteto glede na druge linije in ki ima svoje evolucijske tendence in svojo zgodovinsko usodo (Wiley, 1978). Od vseh naˇstetih konceptov vrste je ta najbolj .eksibilna, zato jo nekateri avtorji priporoˇcajo kot osnovno enoto bioloˇske raznolikosti (Mayden, 1997). Doloˇcitev vrst po tem konceptu je v praksi teˇzavna, nagnjena je zlasti v smer precenitve bioloˇske raznolikosti, kar pa je (z naravovarstvenega staliˇsˇca) morda celo prednost (Kottelat, 1997). Namesto izraza vrsta se pri tem konceptu pogosto uporablja izraz evolucijsko pomembna enota (ang. ESU, evolutionarily signi.cant unit), ki ga je prvi uporabil Simpson (1961). Natanˇcna opredelitev evolucijskega kon­cepta se razlikuje med raznimi avtorji, vsekakor pa je glavni namen doloˇcitev osnovnih enot, ki bi bile deleˇzne zakonske zaˇsˇcite (Fraser in Bernatchez, 2001). Linije prednikov in potomcev se obiˇcajno doloˇca preko doloˇcanja haplotipov, zato je zaradi tehniˇcnih razlogov bolj vabljiv .logenetski koncept vrste. 2.4 FILOGENETSKI KONCEPT VRSTE Po Cracraftu (1989) je vrsta najosnovnejˇsa skupina organizmov, ki jih lahko loˇcimo od drugih skupin in znotraj katere imajo vsi osebki skupnega prednika. Filogenijo lahko rekonstruiramo na osnovi zaporedij DNA. Markerji jedrne DNA se ne uporabl­jajo pogosto zaradi rekombinacij in selekcijskega pritiska na ˇstevilna zaporedja jedrne DNA. Glavna tehniˇcna ovira pa je doloˇcitev posameznih haplotipov pri heterozigotnih organizmih. (Zhang in Hewitt, 2003). Pri salmonidih so .logenetske raziskave na jedrni DNA ˇse dodatno omejene zaradi primerov rekombinacij med paralognimi zaporedji, ki so posledica tetraploidizacije pred 25–100 milijoni leti (Angers in sod., 2002). Zaradi tega je tehniˇcno laˇzje doloˇciti .logenijo s primerjavami mitohondrijske DNA (mtDNA). Omejitev raziskave na mitohondrijske haplotipe ima lahko za posledico podcenitev genetske raznolikosti in pretirane poenostavitve evolucijskih procesov (Zhang in He­witt, 2003). Filogenija evropskih populacij postrvi temelji na nukleotidnih zaporedjih mtDNA in na nekaterih jedrnih zaporedjih, kot so zaporedja ITS med rRNA geni (Slika 2). Glede na zaporedja kontrolne regije mtDNA loˇcimo pet .logeografskih linij postrvi: at­lantsko (At), donavsko (Da), jadransko (Ad), sredozemsko (Me) in marmoratus (Ma) (Bernatchez in sod., 1992; Bernatchez, 2001). Seznam mitohondrijskih haplotipov je dopolnjen z vzorci iz Grˇcije (Apostolidis in sod., 1997) ter iz Slovenije, Hrvaˇske, Sr­bije, ˇ Crne Gore ter Bosne in Hercegovine (neobjavljeno). Filogenija kontrolne regije mtDNA se ujema s .logenijo kodirajoˇcih zaporedij mtDNA (Giu.ra in sod., 1994). Na osnovi razlik med mitohondrijskimi haplotipi in oceni molekularne ure so sklepali, da je zadnji skupni prednik danaˇsnjih postrvi ˇzivel pred 700000–450000 leti, daleˇc pred zadnjo poledenitvijo (pred 18000 leti). Zadnji skupni prednik haplotipov donavske lin­ije je ˇzivel pred 300000–150000 leti, zadnji skupni prednik haplotipov atlantske linije pa pred 20000–14000 leti (Bernatchez in sod, 1992; Bernatchez, 2001). Atlantska linija danes prevladuje v rekah zahodne in severne Evrope, ki se izlivajo v Belo, Baltiˇsko, Severno in Irsko morje ter v Biskajski zaliv. Tej liniji pripada tudi ”morska” postrv (Snoj in sod., 2002b) in veˇcina postrvi iz ribogojnic. Vlaganje postrvi povzroˇca ve­like teˇzave pri preuˇcevanju .logenije. Tako je Bernatchez (2001) v raziskavo vkljuˇcil tudi dva vzorca iz Neretve, oba s haplotipom donavske linije Da-s1. V reko ˇze dlje ˇcasa vlagajo postrvi (Bojˇci´c in sod., 1982), zato je priˇcakovano, da so v reki prisotne neavtohtone linije. Slika 2: Filogenetsko drevo predstavnikov rodu Salmo na osnovi kontrolne regije mtDNA, gena za citokrom b in regije ITS1 (Suˇsnik in sod., 2004). Ad–jadranska, At–atlantska, Da–donavska, Ma– marmoratus in Me–mediteranska linija, metoda najveˇcjega verjetja (maximum likelihood), 10 000 ponovitev, verjetnost razvejanja v (%). Figure 3: Maximum likelihood tree, based on combined data set of mtDNA control region, cytochrome b gene and ITS1 region (Suˇsnik et al., 2004). Abreviations Da, At, Me, Ad and Ma refer to main phylogenetic lineages. Con.dence statements (%) estimated from 10000 puzzling steps are shown between the nodes. Znana so mitohondrijska zaporedja kontrolne regije in gena, ki kodira citokrom b S. obtusirostris iz Neretve. Na osnovi mitohondrijskih zaporedij in jedrnega gena za lak­tat dehidrogenazo so predlagali spremembo klasi.kacije iz rodov Salmothymus, Acan­tholingua in Platysalmo v Salmo (Snoj in sod., 2002a). Velja omeniti, da sta glede na zaporedje mtDNA vrsti S. marmoratus in Salmo (Platysalmo) platycephalus sestavni del .logenetskega kompleksa S. trutta (Bernatchez in sod., 1992; Suˇsnik in sod., 2004). Genetski markerji (mtDNA in jedrne DNA) so zaradi svoje ˇstevilˇcnosti precej boljˇsi pri pojasnjevanju .logenije in strukturiranosti populacij kot morfoloˇski znaki. 2.5 OPIS VRST V POREˇCJU NERETVE Fenotipska raznolikost salmonidov oteˇzuje tradicionalno opisovanje vrst na osnovi mor­foloˇskih znakov. V sploˇsnem se sistematiki, ki so preuˇcevali ribe v Neretvi in njenih pritokih, strinjajo o prisotnosti potoˇcne postrvi (Salmo trutta), glavatice (Salmo mar­moratus) in mehkoustne postrvi (Salmo obtusirostris) (Karaman, 1926; Bojˇci´c in sod., 1982; Kosori´c in sod., 1983). 2.5.1 S. trutta Linnaeus, 1758 Potoˇcna postrv, kot jo je opisal Carl Linne (lat. oblika Linnaeus), je zelo razˇsirjena po Evropi, severni Afriki in Aziji do Aralskega morja (Bernatchez in Osinov, 1995). V zadnjih stoletjih so jo naselili tudi v preostanek Azije in Afrike, v Avstralijo, severno in juˇzno Ameriko (Laikre in sod., 1999). Ima vretenast, boˇcno rahlo stisnjen trup. Glava je srednje velika, gobec sega nazaj ˇcez zadnji oˇcesni rob, spolno zreli samci imajo spodnjo ˇceljust kavljasto zakrivljeno navzgor. Zobe imajo v ˇceljustih, na ralniku, jeziku in nebnicah (Povˇz in Sket, 1990). Zaradi razliˇcnega naˇcina ˇzivljenja so predstavniki te vrste lahko na videz dokaj razliˇcni, predvsem to velja za pigmentacijo (Slika 3). Barvna podlaga je sivkastozelena z olivnim, rjavkastim ali ˇcrnim odtenkom ali kombinacije teh. Po telesu imajo razliˇcno ˇstevilo razliˇcno razporejenih, razliˇcno velikih ˇcrnih, rdeˇcih in/ali oranˇznih peg (Povˇz in sod., 1996). Slika 3: Razliˇcne barvne razliˇcice potoˇcne postrvi (S. trutta). Zgoraj levo postrv iz ribogojnice (foto: Andreja Ramˇsak), zgoraj desno iz reke Otre, Norveˇska (foto: Bo Delling), spodaj levo iz donavskega poreˇcja (foto: Enver Melkiˇc), spodaj desno iz jadranskega povodja (foto: Aleˇs Snoj). Figure 3: Di.erent colour variants of brown trout (S. trutta). On top left brown trout from hatchery (foto: Andreja Ramˇsak), top right trout from the River Otre, Norway (foto: Bo Delling), bottom left trout from the Danubian basin (foto: Enver Melkiˇc), bottom right trout from the Adriatic basin (foto: Aleˇs Snoj). Linne je loˇcil morsko, jezersko in potoˇcno formo potoˇcne postrvi (trutta, lacustris in fario). Izrazi podvrsta, forma in morf se v literaturi uporabljajo zaradi nejasnih de.nicij od vrste niˇzjih taksonomskih enot. V skladu z Linnejevo razdelitvijo je v Neretvi prisotna potoˇcna forma potoˇcne postrvi (S. trutta forma fario). Razdelitev potoˇcne postrvi na te tri forme pa je sporna, ker verjetno ni skladna s .logenijo. ˇ Stevilna velika evropska jezera naseljujejo jezerske forme potoˇcne postrvi in malo verjetna je razlaga, da se je S. trutta forma lacustris razvila mono.letsko. Tej razlagi nasprotujejo tudi rezultati genetskih analiz (Bernatchez in sod., 1992). Treba je poudariti, da se izraza postrv in losos nanaˇsata na naˇcin ˇzivljenja rib. Postrvi veˇcinoma ˇzivijo v rekah in sladkovodnih jezerih, lososi pa migrirajo v morje. On­corhynchus mykiss iz severne Amerike zaseda povsem drugo ekoloˇsko niˇso kot S. trutta iz Evrope in Azije, vendar sta se zaradi podobnega naˇcina ˇzivljenja zanju uveljavili imeni kalifornijska in potoˇcna postrv. V Sloveniji uporabljamo izraz potoˇcna postrv za sploˇsno poimenovanje vrste S. trutta, kot tudi za S. trutta forma fario, ki pri nas prevladuje (Jug, 2002). 2.5.2 S. obtusirostris Heckel, 1851 Mehkoustna postrv (Slika 4) je bila sprva poimenovana Salar obtusirostris (Heckel, 1852), sinonima sta tudi Salmothymus obtusirostris in Salmo obtusirostris (Behnke, 1968). Pogoste so zamenjave S. obtusirostris z vrsto S. ohridanus, sinonim Acantolingua ohridana (Hadˇziˇce, 1960; ˇc, 1990; Phillips in sod., 2000). V skladu s prvim opisom s´Sori´ima mehkoustna postrv glavo krajˇso od viˇsine trupa, trup pa je petkrat daljˇsi od glave. Gobec in ustna reˇza sta kratka, mesnate in mehke ustnice zakrivajo zobe. So temnejˇse kot potoˇcne postrvi, vendar imajo intenzivne ˇcrne in rdeˇce pike po telesu, rdeˇce pike imajo vˇcasih ˇcrno obrobo (Heckel, 1852). Mehkoustne postrvi ˇzivijo v nekaterih rekah, ki se izlivajo v Jadransko morje. Primerki iz razliˇcnih rek se med seboj razlikujejo po zunanjem izgledu, zlasti po pigmentaciji in dolˇzini gobˇcka, zato je za vsako od teh rek opisana podvrsta: • S. obtusirostris zetensis Hadˇziˇce, 1960 v Zeti (ˇ s´ Crna Gora), • S. obtusirostris salonitana Karaman, 1927 v Jadru (Hrvaˇska), vloˇzena tudi v bliˇznjo ˇ Zrnovnico, • S. obtusirostris krkensis Karaman, 1927 v Krki (Hrvaˇska) in • S. obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882 v poreˇcju Neretve (Bosna in Hercegovina). Podvrsta S. obtusirostris oxyrhynchus ˇzivi v Neretvi in nekaterih pritokih. Osnovna barvna podlaga je olivna, po telesu ima veˇcinoma ˇcrne pege (le malo rdeˇcih), ki se prekrivajo z oranˇznimi pegami, na repu so samo oranˇzne pege. Slika 4: Mehkoustna postrv (S. obtusirostris). Zgoraj Hecklova skica (1852) primerka iz Krke ali iz Zrmanje (Hrvaˇska), spodaj primerek iz Neretve (foto: Aleˇs Snoj). Figure 4: Soft mouth trout. Heckel’s (1852) drawing of a specimen from the River Krka or from the River Zrmanja above, specimen from the River Neretva below (foto: Aleˇs Snoj). 2.5.3 S. marmoratus Cuvier, 1817 Pri nas znana kot soˇska postrv ˇzivi v reki Soˇci in njenih pritokih (Berrebi in sod., 2000), pa tudi v Riˇzani, v poreˇcju Pada in nekaterih drugih rekah v severni Italiji (Giu.ra in sod., 1994), v Neretvi s pritoki (Bosna in Hercegovina) in v poreˇcju Drima (Albanija, Srbija in Crna Gora). Genetsko ˇˇciste populacije S. marmoratus so do zdaj naˇsli v samo osmih potokih v soˇskem poreˇcju (Fumagalli in sod., 2002). Znanstveno ime marmoratus je dobila zaradi izrazitega marmoriranega vzorca (Slika 5), v nekaterih populacijah so prisotne tudi rdeˇce pike. Marmoriran vzorec so naˇsli tudi pri postrveh v reki Otri (Norveˇska), vendar so jih po temeljitih genetskih in morfoloˇskih raziskavah uvrstili v potoˇcne postrvi atlantske linije (opis linij v poglavju 2.4) (Delling, 2002). V primerjavi s potoˇcno postrvjo je soˇska veˇcja in teˇzja, razlikujeta se po ˇstevilu in razporeditvi zob na ralniku (Povˇz in sod., 1996). Slika 5: S. marmoratus, zgoraj primerek iz Zadlaˇsˇcice, Slovenija, spodaj primerek iz Neretve (foto: Aleˇs Snoj). Figure 5: S. marmoratus from the River Zadlaˇsˇcica, Slovenija above and from the River Neretva below (foto: Aleˇs Snoj). V Neretvi so S. marmoratus ali glavatico opazili Karaman (1926), Bojˇci´c in sod. (1982) in Kosori´c in sod. (1983). Raziskovalci ugotavljajo drastiˇcen upad populacije glavatic, v zadnjem ˇcasu celo njeno odsotnost v reki (Hamˇzi´c, 2002; Delling, 2003). Kot glavni razlog za ogroˇzenost in skorajˇsnje izumrtje navajajo zajezitev reke. Tako na primer hidroelektrarna pri Jablanici s 85 m visokim jezom prepreˇcuje migracije glavatic iz spodnjega dela Neretve v drstiˇsˇca v zgornjem delu blizu kraja Glavatiˇcevo. V literaturi nismo naˇsli primerjave primerkov S. marmoratus iz Soˇce in Neretve. Do­puˇsˇcamo moˇznost, da se enako znanstveno ime uporablja samo zaradi marmoriranega vzorca. V poimenovanju bomo glede na izvor uporabljali izraza soˇska postrv in glavat­ica. 2.5.4 S. dentex Heckel, 1851 Ribe iz Krke, Cetine in Neretve z izrazitim zobovjem so bile prvotno poimenovane Salar dentex, po danaˇsnji nomenklaturi Salmo dentex. V spodnjem delu Neretve je ta riba znana kot zubatak, v ˇcni Crni Gori isti vrsti pravijo strun. Zobje zubatkov so moˇin veliki, pokrivajo skoraj vse kosti v ustih (ˇceljusti, jezik in nebo), glava je majhna in koniˇcasta, petkrat krajˇsa od telesa (Slika 6). Starejˇsi primerki imajo temnejˇsi hrbet s kovinskim sijajem in skoraj bel trebuh, ob strani telesa so veˇcje ˇcrne pike in manjˇse krvavo rdeˇce pike. Postokularna razdalja znaˇsa od 3,2 do 4,5–kratnega premera oˇcesa, interokularna razdalja pa od 1,5 do 2–kratnega premera oˇcesa (Heckel, 1852). V literaturi pogosto zasledimo trditev Gridellija (1936), da je S. dentex kriˇzanec S. marmoratus × S. trutta. To moˇznost so zavrnili z argumentom, da zubatak ˇzivi tudi v rekah v bliˇzini mesta Livno (najverjetneje v Plovuˇci), kjer ni glavatice (Karaman, 1937). Dejansko gre za napaˇcno citiranje Gridellija (1936), ki je opozoril na pogosto zamenjavo med S. marmoratus in ’juˇzno’ S. trutta, torej S. trutta iz jadranskega povodja, ter kritiziral opis vrste S. dentex, ki pretirano poudarja zobe. Slika 6: S. dentex, zgoraj Hecklova skica (1852), spodaj primerek iz Neretve (foto: Andrej Razpet). Figure 6: Heckel’s drawing of S. dentex (1852) above and a specimen from the River Neretva below (foto: Andrej Razpet). 2.5.5 S. farioides Karaman, 1937 Ta vrsta je zelo skromno opisana in v novejˇsi literaturi ni omenjena. V primerjavi s S. dentex naj bi imeli primerki S. farioides krajˇse in viˇsje telo ter manj izrazite zobe (Slika 7). V prvem opisu vrste je poudarjeno tudi, da je gobec postavljen viˇsje, glava ni tako koniˇcasta, barvne pike (ˇcrne in rdeˇce) pa so veˇcje kot pri S. dentex. Samice S. farioides naj bi imele veˇc ˇcrnih pik kot samci (Karaman, 1937). To vrsto in ˇse 8 drugih vrst in podvrst s podroˇcja Kraljevine Jugoslavije je opisal makedonski sistematik Stanko Karaman. Kasnejˇsi raziskovalci so ga kritizirali zaradi pomanjkljivosti pri njegovem konceptu vrste in krˇsitvi naˇcel taksonomije (Behnke, 1968). V enem od zgodnejˇsih del je Karaman opisal tudi salmonide v Neretvi in naˇstel S. marmoratus, S. trutta fario in S. obtusirostris (Karaman, 1926). Kasneje pa je podvomil v prisotnost S. trutta fario in potoˇcno postrv jadranskega povodja (poreˇcja Krke, Neretve, Zrmanje in Drima) opisal kot novo vrsto S. farioides, v Zrmanji pa ˇse podvrsto S. farioides zrmanjaensis (Karaman, 1937). Slika 7: Primerjava S. dentex (zgoraj levo) in S. farioides (zgoraj desno) (Karaman, 1937), spodaj S. cf. farioides (Delling, 2003). Figure 7: A comparison of S. dentex (top left) and S. farioides (top right) (Karaman, 1937), S. cf. farioides below (Delling, 2003). V ˇcasih Karamanovega delovanja je bilo razˇsirjeno mnenje, da jadransko povodje naseljuje S. farioides, ˇcrnomorsko S. taleri, egejsko pa S. macedonicus. Z uporabo meristiˇcnih znaˇcilnosti so ugotovili, da v vseh teh povodjih ˇzivi S. trutta fario, takrat so S. farioides reklasi.cirali v podvrsto S. trutta farioides, ki se od S. trutta fario loˇci v manjˇsem ˇstevilu piloriˇcnih izrastkov in v veˇcjih oˇceh. Opazili so, da se razmerja med meristiˇcnimi znaˇcilnostmi spreminjajo s starostjo in da je pri obliki glave in velikosti oˇci znaˇSori´ cilen spolni dimor.zem (ˇc, 1990). 2.5.6 S. cf. montenigrinus Vrsta s prvotnim imenom Trutta montenigrina Karaman, 1933 je bila opisana v reki Moraˇci (ˇsiroko glavo, po telesu pa majhne ˇce pike Crna Gora), ima ˇcrne in vinsko rdeˇ(Karaman, 1933). Njen najditelj je v svojem naslednjem znanstvenem prispevku (Kara­man, 1937) opisal ˇse nekaj novih vrst in jih primerjal z ˇze prej znanimi, med slednjimi ni veˇc besede o Trutta montenigrina, prav tako ne v vseh kasnejˇsih ˇclankih. Moˇzno je, da je Karaman v kasnejˇsih ˇclankih ime Trutta montenigrina nadomestil s S. obtusirostris zetensis (Behnke, 1968). Slika 8: S. cf. montenigrinus iz Neretve (Delling, 2003). Figure 8: S. cf. montenigrinus from the River Neretva (Delling, 2003). V Neretvi pri Glavatiˇcevem so nedavno ujeli ribe, ki so se med seboj razlikovale po morfometriˇcnih znaˇcilnostih. Raziskovalcem vseh rib ni uspelo zanesljivo identi.cirati, zato so nekatere poimenovali po vrstah, ki so po opisu najbolj ustrezale, torej S. cf. montenigrinus (Slika 8) in S. cf. farioides (Slika 7) (Delling, 2003). Primerek ali primerki, na katerih je Karaman opisal vrsti S. farioides in S. montenigrinus in s katerimi bi bilo primerke iz Neretve potrebno primerjati (cf. = lat. confero, primerjati z), so izgubljeni ali neznano kje (Kottelat, 1997). 2.5.7 Kriˇzanci Za kriˇzance so vˇcasih uporabljali izraz bastard (Karaman, 1937). Slabˇsalen pomen te besede za ljudi se je razˇsiril tudi na ˇzivalske vrste, zato ni ˇcudno, da kriˇzanci pogosto niso deleˇzni veˇcje pozornosti raziskovalcev. V angleˇsˇcini naj bi bil tudi izraz hybrid slabˇsalen, zato je bila predlagana bolj nevtralna beseda intercross (Allendorf in sod., 2001). V 60–ih letih preteklega stoletja so se v ribogojnicah v Bosni in Hercegovini ukvarjali z nadzorovanim kriˇzanjem postrvi. Med drugimi so vzredili kriˇzance S. trutta × S. obtusirostris (Slika 9) in S. trutta × S. marmoratus. Zanimivo je, da so vsi kriˇzanci S. obtusirostris × S. marmoratus poginili 86 dni po oploditvi iker. V poskusu so uporabili starˇse iz reke Muˇsnice in Bune, ki sta del poreˇcja Neretve (Kosori´c in Vukovi´c, 1969). Ker so bili poskusi izvedeni na majhnem ˇstevilu starˇsev, obstaja moˇznost, da je vpliv doloˇcenega osebka lahko prevelik, da bi bila moˇzna posploˇsitev za celo vrsto. Kriˇzanci S. trutta × S. obtusirostris so bili prisotni v reki ˇze pred omenjenim poskusom (Bojˇci´c in sod., 1982). V nekaterih obseˇznejˇsih raziskavah ribje favne v Neretvi pa so bili kriˇzanci povsem prezrti (Kosori´c in sod., 1983; Karaman, 1937). Kriˇzanci S. trutta × S. obtusirostris naj bi bili po mnenju ˇclanov ribiˇskega druˇstva Konjic sterilni. Znanstvene raziskave, ki bi to potrdila ali ovrgla, ˇse ni bilo. Slika 9: Mehkoustna postrv ima znaˇcilno obliko ust (levo), pri kateri je spodnja ˇceljust opazno krajˇsa od zgornje. Desno fenotipski kriˇzanec S. trutta × S. obtusirostris z malo krajˇso spodnjo ˇceljustjo od zgornje (foto: Aleˇs Snoj). Figure 9: Soft mouth trout has a distinctive shape of mouth (left), the lower jaw is noticably shorter than the upper jaw. A S. trutta × S. obtusirostris hybrid has a slightly longer lower jaw (right) (foto: Aleˇs Snoj). Kriˇzanci S. marmoratus z vloˇzenimi S. trutta (Slika 10) iz donavskega poreˇcja in at­lantskega povodja so opisani tudi v soˇskem poreˇcju (Berrebi in sod., 2000; Snoj in sod., 2000). Njihova pigmentacija je kombinacija marmoriranega in temno obarvane podlage z rdeˇcimi pegami (Povˇz in sod., 1996). Kriˇzanje vloˇzenih in avtohtonih postrvi S. trutta je bilo opaˇzeno tudi v Neretvi (Bojci´c in sod., 1982). Figure 10: S. marmoratus × S. trutta hybrids from the River Soˇca drainage (foto: Aleˇs Snoj). 2.6 GENETSKI MARKERJI 2.6.1 Mitohondrijska DNA Glede na organizem, s katerim delamo, je mitohondrijska DNA (mtDNA) lahko vzrok za sreˇco, obˇzalovanje ali glavobol. Z redkimi izjemami ni uporabna za .logenijo rastlin zaradi prenizke stopnje mutacij in pogostih rekombinacij. Pri nekaterih ˇzivalih pris­otnost mitohondrijskih psevdogenov v jedru oteˇzuje raziskave ali pa mtDNA ni dovolj polimorfna znotraj posameznih vrst in rodov, kot na primer pri kobilicah. Veˇcinoma pa ima ˇzivalska mtDNA na visoko stopnjo mutacij, zlasti v nekodirajoˇcih regijah, zato ˇ je polimorfna tudi znotraj vrst. Cloveˇska mtDNA ima na primer v kontrolni regiji povpreˇcno stopnjo mutacije 0,14–2,7 × 102 % na milijardo let, ˇcloveˇska jedrna DNA v avtosomnih mikrosatelitih pa le 0,56–2,1 × 10-3 % na milijardo let (Zhang in Hewitt, 2003). Razlike med mitohondrijskimi haplotipi znotraj vrste so predvsem v posameznih baznih zamenjavah ali substitucijah. Molekule mtDNA so prisotne v somatskih in kliˇcnih celicah, dedujejo se praviloma maternalno, med molekulami mtDNA obiˇcajno ne prihaja do rekombinacij. Veˇcina osebkov ima v telesnih celicah isti mitohondri­jski haplotip, pojav imenujemo homoplazmija. Heteroplazmija ali prisotnost razliˇcnih mitohondrijskih haplotipov v enem organizmu je redka in obstojna le nekaj generacij (Avise, 2000). Pri nekaterih vrstah pa je heteroplazmija zelo pogosta. Med ribami so najbolj preuˇceni jesetri, pri vrsti Acipenser ruthenus ima 46,8 % primerkov veˇc kot en mtDNA haplotip (Ludwig in Jenneckens, 2000). Pri salmonidih hetroplazmije ˇse niso opisali. Zaradi svojih lastnosti se mtDNA pogosto uporablja v .logenetskih ˇstudijah. Njeno maternalno dedovanje raziskovalcem omogoˇca rekonstrukcijo evolucijskih dogodkov, kot so ˇsirjenje vrst, umetne naselitve, in efekt ozkih grl. Na osnovi mtDNA, izoli­rane iz fosilnih vzorcev, lahko primerjamo izumrle populacije z danaˇsnjimi. Razno­likost mtDNA znotraj rodu Salmo so preuˇcevali na vrstah S. trutta, S. marmoratus, S. obtusirostris, S. ohridanus, S. platysalmo in S. salar. Glede na mtDNA loˇcimo .logeografske linije, v katerih je veˇcje ˇstevilo mtDNA haplotipov in ki se ne ujemajo povsem s trenutno razdelitvijo rodu na vrste. S. trutta delimo na atlantsko, donavsko, jadransko in sredozemsko linijo (Bernatchez in sod., 1992), S. platysalmo sodi v jadran­sko linijo (Suˇsnik in sod., 2004) in S. marmoratus v linijo marmoratus. S. obtusirostris in S. ohridanus imata razliˇcna mtDNA haplotipa, ki ne sodita v prej omenjene linije in sta znaˇcilna samo za svojo vrsto (Phillips in sod., 2000; Snoj in sod., 2002a), S. salar ima dve glavni liniji, severnoameriˇsko in evropsko (Nilsson in sod., 2001). Za predstavnike druˇzine Salmonidae velja, da so priˇsli v Evropo iz Sibirije (Banarecsu, 1973). Filogeografske linije vrste S. trutta so imele zadnjega skupnega prednika pred 450000–700000 leti (Bernatchez in sod., 1992). Drugi rodovi druˇzine Salmonidae, kot so sulci (rod Hucho) in lipani (rod Thymallus) so priˇsli v Evropo po isti poti po koncu zadnje ledene dobe (Banarescu, 1973). Zadnje velike klimatske spremembe so bile pleistocenske poledenitve, ki so imele ve­lik vpliv na evropske salmonide. Ti so preˇziveli v nekaterih toplejˇsih predelih, tako imenovanih ledenodobnih pribeˇzaliˇsˇcih ali glacialnih refugijih, kjer je zaradi tega pri­hajalo do velikih sprememb v strukturi populacije. Na primeru atlantskih lososov (S. salar) so dokazali spremembe s primerjavo mtDNA, izolirano iz fosilnih in modernih vzorcev. Prevladujoˇci haplotipi izpred ledene dobe so se sicer ohranili, vendar jih je danes bistveno manj v primerjavi s haplotipi, ki so bili pred poledenitvijo prisotni samo v severni Evropi (Consuegra in sod., 2002). Vlogo ledenodobnega pribeˇzaliˇsˇca je imel tudi Balkanski polotok vkljuˇcno z Neretvo (Bianco, 1990). Vseeno pa samo mtDNA ni dovolj za natanˇcno rekonstrukcijo .logenije. Vlaganja gojenih postrvi v naravo so ˇse vedno obiˇcajna praksa gospodarjenja z rekami, hap­lotipi vloˇzenih postrvi atlantske in donavske linije oteˇzujejo doloˇcitev avtohtonih linij in njihovo razˇsirjenost. Tudi njihova razˇsirjenost, na primer jadranske linije, ˇse ni zadovoljivo pojasnjena. Postrvi te linije najdemo v Turˇciji, Grˇciji, rekah, ki se izlivajo v severni Jadran in na Korziki (Bernatchez in sod., 1992; Apostolidis in sod., 1997). Med temi podroˇcji v geoloˇski preteklosti ni bilo sladkovodnih povezav, postrvi jad­ranske linije ne gojijo v ribogojnicah in jih ne vlagajo v reke. Pogosto je tudi neskladje med .logenijo mitohondrijske in jedrne DNA (Avise, 2000). Primer je mehkoustna postrv iz Zrnovnice in Jadra (Hrvaˇˇska), ki ima jedrna zaporedja, znaˇcilna za vrsto S. obtusirostris in mtDNA, ki sodi v jadransko linijo S. trutta (Odak, 2004). Pretirano poenostavljanje .logenije je pogosto posledica uporabe mtDNA, zato je naj­boljˇsa reˇsitev vkljuˇcitev zaporedij jedrne DNA v raziskavo (Zhang in Hewitt, 2003). 2.6.2 Jedrna DNA 2.6.2.1 Mikrosateliti V populacijskih ˇstudijah uporabljamo mikrosatelite, ki imajo variabilno ˇstevilo za­porednih ponovitev (ang. VNTR, variable number of tandem repeats), zato jih lahko enostavno loˇcimo med seboj po dolˇzini (Nakamura in sod., 1987). Mikrosatelitni mark­erji so kratki segmenti DNA, ki vsebujejo ponovitve motivov iz 1–6 baznih parov. Raz­porejeni so po celotnem evkariontskem genomu, manj jih je le v kodogenih regijah in na telomerah. Ker jih je v genomu veliko, je njihovo odkrivanje dokaj enostavno, najpogosteje uporabljeni so mikrosateliti z dinukleotidno ponovitvijo CA in TG (Gold­stein in Schl¨otterer, 1999). Pri doloˇcanju ˇstevila ponovitev lahko prihaja do razlik med posameznimi metodami elektroforeze. Najenostavnejˇse reˇsitve so enaki pogoji in kri­teriji odˇcitavanja za vse vzorce, laˇzne signale pa lahko odstranimo s prilagajanji PCR (Fernando in sod., 2001). Za mikrosatelite ˇse ni univerzalnega evolucijskega modela, vendar pa le ta pri popu­lacijskih ˇstudijah ni pomemben. Tako na osnovi mikrosatelitov preuˇcujemo zgodovino in sedanjost populacije, na primer kriˇzanja, parjenja v sorodstvu, odkrivamo ozka grla, ocenjujemo spolno obnaˇsanje, socialne strukture in genetske strukture populacij. Opisani so primeri mikrosatelitnih zaporedij s funkcionalno vlogo kodirajoˇcih ali nad­zornih elementov (Goldstein in Schl¨otterer, 1999), vendar pri populacijskih ˇstudijah privzamemo, da mikrosateliti niso podvrˇzeni selekciji. Uporaba mikrosatelitov je razˇsirjena predvsem zaradi naslednjih lastnosti (Jug, 2002): • veˇcinoma enostavna izolacija DNA, • uporabljamo lahko veliko lokusov, • moˇzno je pomnoˇzevanje veˇcih lokusov hkrati v eni veriˇzni reakciji s polimerazo, s ˇcimer prihranimo ˇcas in zniˇzamo ceno, ter • uporabljamo lahko material, ki ni pridobljen na invaziven naˇcin (slina, dlaka, iztrebki), torej brez ˇzrtvovanja organizmov. Za posamezne vrste ali populacije postrvi so bili odkriti diagnostiˇcni aleli, torej taki, ki ne obstajajo pri nobeni drugi vrsti ali populaciji. Hibridne cone in odsotnost nein­trogresiranih (genetsko ˇcistih) vrst pa onemogoˇcajo doloˇcitev diagnostiˇcnih alelov, saj so v teh primerih posamezni aleli prisotni v veˇc kot eni populacji, obiˇcajno z drugaˇcno frekvenco. Raznolikost mikrosatelitov doloˇcamo praviloma na osnovi razlik v dolˇzinah pomnoˇzene DNA, kar je lahko zavajajoˇce. Homoplazija pri mikrosatelitih pomeni prisotnost vsaj dveh alelov enake dolˇzine na istem mikrosatelitnem lokusu, ki pa imata drugaˇcen izvor (Jarne in Lagoda, 1996). Lahko celo izvirata iz istega alela, vendar imata razliˇcni evolucijski poti in poslediˇcno razliˇcno nukleotidno zaporedje (Angers in Bernatchez, 1997). Homoplazija lahko vodi do podcenjevanja raznolikosti obravnavanih populacij. Problemu se izognemo z doloˇcitvijo nukleotidnega zaporedja mikrosatelita, bistveno ceneje pa je enostavno poveˇcati ˇstevilo mikrosatelitnih lokusov v raziskavi in s tem zmanjˇsati vpliv morebitne homoplazije na rezultate statistiˇcne analize. 2.6.2.2 Toˇckovne mutacije (SNP) Spremembe v posameznih nukleotidih v zaporedju imenujemo toˇckovne mutacije (SNP, ang. single nucleotide polymorphism), veˇcinoma gre za nukleotidne zamenjave (sub­stitucije), redkeje za insercije in delecije. Pri pregledovanju ˇcloveˇskega genoma se za uporabne SNP–je ˇsteje tiste, ki imajo frekvenco vsaj 1 % (Kruglyak in Nickerson, 2001). Alele se doloˇca z ugotavljanjem zaporedja ali pa s pomoˇcjo speci.ˇcnih endonuk­leaz, ki razliˇcne genotipe po PCR razreˇzejo v razliˇcne restrikcijske pro.le (RFLP, ang. restriction fragment lenght polymorphism). SNP–je odkrivajo pri doloˇcanju nukleotidnega zaporedja, pred mikrosateliti imajo nekatere prednosti. Predvsem zanimivi so tisti SNP–ji, ki se nahajajo v kodirajoˇcih regijah ali vsaj v intronih, ki se dedujejo vezano z doloˇceno kodirajoˇco regijo. Diag­nostiˇcni SNP–ji za izbrano populacijo, ki sami ne vplivajo na aminokislinsko zaporedje, se dedujejo vezano z drugimi SNP–ji, ki vplivajo na aminokislinsko zaporedje in na katere deluje selekcijski pritisk (Ferguson, 1994) ter so relevantni za adaptacijo pop­ulacije (Eanes, 1999). Pri postrveh so najbolj znani SNP–ji gena, ki kodira laktat dehidrogenazo (McMeel in sod., 2001). 2.7 OSNOVNI PRINCIPI STATISTIˇCNIH ANALIZ 2.7.1 Faktorielna korespondenˇcna analiza Multivariatne statistiˇcne metode so glavno orodje za preuˇcevanje genetske variabilnosti. Korespondenˇcna analiza (CA, ang. correspondence analysis) je ena od mnogih multi­variatnih metod, pri njej podatke razporedimo v matriko X oblike (n × p), v kateri je p frekvenc kvalitativnih spremenjivk za n osebkov. Kvalitativna spremenjivka je lahko os­ebkov spol in pigmentacija, v populacijski genetiki pa aleli na posameznih mikrosatelit-nih/SNP lokusih. CA ponuja interpretacije povezav med vrsticami in stolpci v matriki, torej asociacije kvalitativnih spremenjlivk (spola, pigmentacije, genotipa) z osebki. Posamezni stolpci matrike imajo lahko veˇcji pomen (uteˇz) na vrstice kot drugi, zato lahko zmanjˇsamo dimenzije matrike, torej jo poenostavimo, podobno kot pri analizi glavnih komponent (PCA, ang. principal component analysis). Pri CA razˇclenimo mero za asociacijo, obiˇcajno skupno .2, redkeje skupno varianco, na lastne vrednosti .k. Uravnoteˇzeno matriko predstavimo na koordinatnih oseh k =1, 2, ...R. Veˇcinoma je zadovoljiv ˇze dvodimenzionalen koordinatni sistem, ki zajema skupni deleˇz celotne vari­ance, ki ga pojasnjujeta prva dva po vrednosti najveˇcja faktorja. Zaradi interpretacije samo dela celotne CA metodo imenujemo tudi faktorielna CA ali FCA. ˇz Ce je ta deleˇdveh faktorjev .2 glede na celoto (1) zadovoljivo velik, lahko interpretiramo graf. .1 + .2 .2 = ...(1) .R k=1 .k V primeru populacijskih ˇstudij, kjer genotipiziramo posamezne osebke, je interpretacija naslednja: ˇ • Ce sta na grafu dve toˇcki (dva osebka) skupaj, sta si genotipa teh dveh osebkov podobna. ˇcna. Ce sta zelo narazen, sta genotipa zelo razliˇ • Nagnetenost toˇck v gruˇco pomeni, da obstaja vsaj en alel, ki je tem osebkom skupen (velika uteˇz nekega stolpca). • Izhodiˇsˇce koordinatnega sistema predstavlja ”povpreˇcni” genotip, toˇcke daleˇc od izhodiˇsˇca imajo alele, ki se pojavljajo z nizko frekvenco glede na vse obravnavane osebke. • Interpretacija ima tem veˇcjo teˇzo, ˇcim veˇcji deleˇz celotne variance je pojasnjen na grafu (H¨ardle in Simar, 2003). 2.7.2 Matematiˇcno ozadje genetskega polimor.zma Na osnovi zaporedij DNA lahko sklepamo na evolucijo v daljˇsem ˇcasovnem obdobju. Vendar so spremembe zaporedij DNA v davni preteklosti in genetski polimor.zem sedanjih populacij sestavni del istega evolucijskega procesa (Nei, 1987). Osnova ana­lize genetskega polimor.zma je frekvenca izbranega alela. Frekvenco genotipa AiAj oznaˇcimo z Xij. Frekvenca i–tega alela je torej: 1 . xi = Xii + Xij . . . (2) 2 j. =i ˇ Ce je populacija v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju, sta frekvenci homozigotov AiAi in heterozigotov AiAj: Xii = xi 2 ,Xij =2xixj . . . (3) Deleˇz heterozigotnosti izraˇcunamo na tri naˇcine, opaˇzeni deleˇz heterozigotnosti (Hobs.) priˇcakovani deleˇz heterozigotnosti (Hexp.) in priˇcakovani deleˇz heterozigotnosti brez vpliva majhne populacije (Hn.b.) (Nei, 1978). Naj bo xi frekvenca i–tega alela na lokusu k na vzorcu populacije. Analiziramo n organizmov na r lokusih. 1 - xi 2 Hexp. = ...(4) r 2 r 2n(1 - xi ) . hk h = ,Hn.b. = ...(5) 2n - 1 r k=1 Parametri F , F –statistika ali indeksi .ksacij opisujejo odstopanja od Hardy–Wein­bergovega ravnoteˇzja znotraj posameznih populacij (FIT ), med populacijami (FST ) in znotraj vseh populacij (FIS) (Wright, 1951). Socialna struktura populacij in migracije posameznih osebkov se odraˇza na genetski strukturi populacij, torej tudi na vrednostih parametrov F . Tako ima na primer notranja razdelitev populacije za posledico priman­jkljaj heterozigotov (Hexp. >Hobs.) in pozitiven FIS (de Jong in sod., 1994). Parametri F so med seboj povezani: FIT - FST FIS = ...(6) 1 - FST ˇ Ceprav se ti parametri na ˇsiroko uporabljajo pri analizi genetskih podatkov, so zanesljivi le pri bialelnih lokusih. Raziskovalci si niso enotni, kateri model je najboljˇsi za mul­tialelne lokuse (Guinand, 1996). Trenutno najbolj obetavni sta oceni za FST in FIS z oznakama . in ^f^ (Weir in Cockerham, 1984). Prilagojena sta za statistiˇcno obdelavo razliˇcno velikih populacij, sestavljena sta iz istih ˇclenov: 1 h — s2 - n-1 [—p(1 - p—) - r-1 s2 - ^—r 4 ] . = ...(7) —(r-1)—nC2 C2 h — nC2 [1 - r(—n-1) ]—p(1 - p—) + [1 + r(—n-1) ]sr 2 +[ r(—n-1) ]4 h— 1 - f^= ...(8) [ 2—n 2—n(r-1) 1 h — n-1 ]—p(1 - p—) - [2 - [ —r(—n-1) ]sn—-1]2 Pri ˇcemer so —p frekvenca alela A v populaciji, —n povpreˇcno ˇstevilo osebkov v populaciji, — h povpreˇcna frekvenca heterozigotov, v katerih je alel A, C koe.cient variacije velikosti populacij, s2 varianca frekvence alela A in r ˇstevilo populacij. Izraˇcuna sta narejena na modelu med seboj izoliranih populacij, vendar sta formuli (7) in (8) uporabni tudi za populacije, med katerimi je ravnovesje migracij in nakljuˇcnega genetskega drsa (Ra­ufaste in Bonhomme, 2000). Pri vseh zgoraj omenjenih izraˇcunih velja predpostavka, da je stopnja mutacij zanemarljivo majhna. Odstopanja od Hardy–Weinbergovega ravnoteˇzja so lahko tudi posledica prekriˇzanja homolognih kromosomov in rekombinacije vezanih markerjev pri mejozi. Vezani geni so tisti, ki so na istem kromosomu. Salmonidi imajo veliko ˇstevilo kromosomov, ocene raziskovalcev se sabo razlikujejo, S. obtusirostris in S. trutta imata na primer po 77 ˇ do 82 kromosomov (Allendorf in Thorgaard, 1984). Ce uporabimo majhno ˇstevilo markerjev glede na ˇstevilo kromosomov je manj verjetno, da so markerji vezani. Test za vezavno neravnoteˇzje je naslednji: Dij Di. N(^+^ .. .j)2 .^2 = , . . . (9) Di. .j [^pi(1 - p^i)+ ^i.][^qj(1 - q^j)+ D^.j ] pri ˇcemer je p^i ocena frekvence alela i na lokusu A, q^j ocena frekvence alela j na lokusu B, D^odstopanja od Hardy–Weinbergovega ravnoteˇzja (indeksi zgoraj in spodaj predstavljajo dve gameti, levi in desni indeks pa dva lokusa), ocene so dobljene na N organizmih (Weir, 1979). 2.8 PROBLEMATIKA KRIˇZANCEV Kriˇzanje nima veˇcjega pomena za sistematiko, vendar je pomemben indikator spre­memb v okolju, tako naravnih kot antropogenih (Kottelat, 1997). Najpogostejˇsi antro­pogeni spremembi sta prenos organizmov iz enega okolja v drugo in spreminjanje okolja, zaradi ˇcesar je primerov kriˇzanj vse veˇc. Pogosto so kriˇzanci fertilni, zato se ˇcez nekaj generacij pojavi introgresija, to je vnos posameznih fenotipskih in/ali genetskih znaˇcilnosti neavtohtonih primerkov v naravno populacijo. Zakonodaja v ZDA pred letom 1990 ni ˇsˇcitila kriˇzancev, ker to ne bi koristilo ohranitvi ogroˇzenih vrst. Vendar tudi kriˇzanci pripomorejo k veˇcji genetski raznolikosti, raziskave so potrdile genet­sko introgresijo pri velikem ˇstevilu (neogroˇzenih) vrst. Ker togi standardi ”genetske ˇcistosti” pri ohranjanju vrst lahko prej ˇskodijo kot koristijo, so zakon leta 1990 umaknili (O’Brien in Mayr, 1999). 2.8.1 Razliˇcni tipi kriˇzanj Allendorf in sod. (2001) so kategorizirali ˇsest tipov kriˇzanj (Slika 11). Vpeljali so tudi pojem ”hibridnega roja”. To so generacije potomcev generacije F1 in potomci njihovih ponovnih kriˇzanj s starˇsevskimi vrstami (t.i. povratna kriˇzanja ali ”backcrosses”). Z genetskimi markerji je posamezne stopnje kriˇzanj za predstavnike hibridnega roja skrajno teˇzko doloˇciti, saj je potrebnih do 70 markerjev (Boecklen in Howard, 1997). Tipi kriˇzanj so naslednji: • Naravni hibridni takson; Nastanek nove vrste kot rezultat kriˇzanja dveh vrst, tudi hibridna speciacija. Gila seminuda je kot kaˇze vrsta krapovca, nastala iz pleistocenskega kriˇzanja G. elegans in G. robusta (DeMarais in sod., 1992). Pri salmonidih sta podobna primera vrsti Salmo carpio, kriˇzanec S. trutta in S. marmoratus (Giu.ra in sod., 1996) in S. obtusirostris salonitana, kriˇzanec S. obtusirostris in S. trutta jadranske linije (Odak, 2004). • Naravna introgresija; Introgresija je vnos manjˇse koliˇcine genetskega materiala z eno vrsto v drugo s kriˇzanjem brez opazne spremembe fenotipa. Clarke in sod. (1998) so opisali ”molekularno puˇsˇcanje” (ang. molecular leakage) med vrstama otoˇskih kaˇc Partula tainiata in P. suturalis zaradi obˇcasnega kriˇzanja. • Naravna hibridna cona; Na stiˇciˇsu dveh vrst se pojavi populacija kriˇzancev, ki je lahko stabilna veˇc generacij, vendar ne povzroˇci zlitja starˇsevskih vrst. Rdeˇce in rumeno obarvana detla vrste Colaptes auratus imata ozko hibridno cono v smeri sever–jug ˇcez severnoameriˇske prerije. Starˇsevski obliki se ohranjata zaradi spolne selekcije (Moore in Price, 1993). • Kriˇzanje brez introgresije; Sterilni kriˇzanci, npr. mule in mezgi, kriˇzanci konjev (Equus caballus) in oslov (E. asinus). • Visoka stopnja introgresije; Vnos genetskega materiala v takem obsegu, da je opazen vpliv na fenotip, vendar je ˇse moˇzno doloˇciti ˇciste primerke starˇsevskih vrst. Pred zaˇcetkom programa za ponovno naselitev soˇske postrvi je bilo v poreˇcju malo ˇcistih soˇskih in potoˇcnih postrvi ter veliko njunih kriˇzancev (Berrebi in sod., 2000). • Popolno pomeˇsanje; Izginotje ˇcistih starˇsevskih populacij, primer kriˇzanja rac Anas superciliosa in A. platyrhynchos na Novi Zelandiji (Rhymer in sod., 1994). Ugotovitev tipa kriˇzanja je bistveno za naravovarstvene programe. Naravni hibridi so del normalnega evolucijskega procesa, s tega staliˇsˇca je zanimiva vloga kriˇzancev v eko­sistemu. Za kriˇzance, ki so posledica ˇcloveˇskega posega v naravo je potrebna odloˇcitev, ali je moˇzno reˇsiti starˇsevski vrsti ali vsaj zaˇsˇcititi novo hibridno vrsto (Allendorf in sod., 2001). kriˇzanje .. naravno ... . ... . . . TIP 1 TIP 2 TIP 3 antropogen naravna naravna . . . naravni hibridni takson introgresija hibridna cona . . . povratna kriˇzanja . F1 hibridni ro . .. F1 sterilna . . TIP 4 TIP 5 TIP 6 kriˇzanje visoka stopnja popolno brez introgresije introgresije pomeˇsanje Slika 11: Radzelitev razliˇcnih tipov kriˇzanj glede na nastanek (naravno ali antropogeno) in obseg (stopnja introgresije) (Allendorf in sod., 2001). Figure 11: Categorisation of hybridisation (Allendorf et al., 2001). Sterilni kriˇzanci so pogost pojav, ki ga lahko enostavno doloˇcimo tudi z genetskimi markerji. Sterilna F1 generacija bo heterozigorna na lokusih, ki so znaˇcilni za starˇsevske populacije. Sterilnost pa je lahko tudi drugaˇcna. Zlasti pri pticah je pogost pojav sterilnost heterogametnih kriˇzancev (pri pticah so to samice) in fertilnost homogamet­nih kriˇzancev (samcev), tako imenovano Haldaneovo pravilo. Na genetskem nivoju je to pravilo vzrok za na spol vezano introgresijo jedrnih genov in za niˇzjo stopnjo diver­gence mtDNA glede na jedrno DNA (Satre in sod., 2001). Veˇcinoma so pri ribah, tudi pri salmonidih, samice XX (samci so XY), torej homogametne. Pri nekaterih vrstah rib pa so samice ZW (samci ZZ), torej heterogametne. Fizioloˇska sprememba spola pri odraslih primerkih je tudi pogosta, lahko se sproˇzi umetno, npr. s steroidnimi hormoni ali naravno, npr. s spremembo temperature okolice (Baroiller in sod., 1999). 2.8.2 Vlaganja rib in ohranitev avtohtonih vrst V veliki meri je kriˇzanje posledica vlaganja rib, vplive posegov v okolje na kriˇzanje je teˇzje oceniti. V obmoˇcju severnega Sredozemlja je znanih 70 vloˇzenih ribjih vrst, iz drugih evropskih poreˇcij (translokacije) ali iz drugih kontinentov (eksotiˇcne vrste). Pribliˇzno 60% teh vrst je bilo vloˇzenih v zadnjih 40–ih letih. Razlogi za to so: • veˇcja uspeˇsnost ribolova, torej veˇc prodanih ribolovnih dovolilnic, • poveˇcanje donosa komercialnih ribogojnic, • nakljuˇcje (pobeg ˇzivih vab, akvarijskih rib in rib iz ribogojnic), • upravljanje mokriˇsˇc in • omejevanje razmnoˇzevanja komarjev (Crivelli, 1995). Zaˇsˇcita biotske raznolikosti je predmet ˇstevilnih mednarodnih konvencij pod okriljem Zdruˇzenih narodov in Evropske unije. Njihov glavni namen je ohranitev in trajno izkoriˇsˇcanje bioloˇske raznolikosti za dobrobit sedanjih in prihodnjih generacij (Biber– Klemm, 1995). Kratkoroˇcne reˇsitve ogroˇzenih vrst so najprej zaˇsˇcita same vrste, dol­goroˇcno pa zaˇsˇcita celotnega ekosistema. Predlagane reˇsitve so prenos ogroˇzenih vrst v druga, zaˇsˇcitena okolja (Minckley, 1995), razmnoˇzevanje ogroˇzenih vrst v ujetniˇstvu in vlaganje njihovih potomcev v njihova naravna okolja (Philippart, 1995). Seveda pa je nujna tudi zakonska zaˇsˇcita in vrnitev okolja v stanje, ki omogoˇca dolgoroˇcno ohranitev vrst (Crivelli in Maitland, 1995). Natanˇcna opredelitev ogorˇzenih vrst z morfoloˇskimi in genetskimi markerji je drugot­nega pomena, ker ne zavira izumiranja vrst. Samo takojˇsnja zaˇsˇcita ogroˇzenih vrst, tudi ˇce so slabo opredeljene, jih lahko reˇsi pred izumrtjem. Glavni faktor, ki vpliva na biotsko raznolikost, je ˇcas (Fraser in Bernatchez, 2001). In ˇcas nikjer na svetu ni na strani avtohtonih salmonidnih vrst. 3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL 3.1.1 Vzorˇcenje V letih 1999 in 2001 smo opravili veˇcino zbiranja vzorcev (Preglednica 1). Ribe smo omamili z elektriko (Slika 12), jim odvzeli koˇsˇcek repne plavuti in ga shranili v 96 % etanolu, ribe pa vrnili v reko. Vsak odvzeti vzorec ima pripisan fenotip in lokacijo izlova (Priloga A). Vzorˇcenje je potekalo nakljuˇcno, ne glede na fenotip, izjema so vzorci iz spodnjega dela Neretve (Jablanica–Metkovi´c), ki so bili izbrani na podlagi fenotipa (zubatak). Izbrali smo med seboj razliˇcne lokacije, tako so lokacije na Neretvi (-ci in Glavatiˇ Daji´cevo) habitati mehkoustne postrvi, saj je vode veˇc, reˇcno dno je prodnato. Neretva pri Glavatiˇcevem je drstiˇsˇce glavatice. Krupac se izliva v Neretvo blizu kraja Glavatiˇcevo, vendar predvidevamo, da v njem ni mehkoustnih postrvi. Neretva pri Ocrkavljah in potok Lad -anica sta najbolj odroˇcni lokaciji, izbrani zato, ker je tam vlaganje rib v preteklosti najmanj verjetno. V Bukovico so vlagali postrvi zadnjiˇc leta 2001, ob Ljuti pa stoji ribogojnica, s katere obˇcasno uhajajo postrvi. Rakitnica je od Neretve loˇcena s slapovi, zato migracija rib po toku navzgor ni mogoˇca. Za Rakitnico ni podatkov o vlaganju, ni habitat mehkoustnih postrvi in glavatic, predvidevamo, da jo naseljuje samo potoˇcna postrv. Oznake fenotipov so zaradi ˇcasovne omejitve (ribe smo vraˇcali v reko) zelo sploˇsne in nezadostne za toˇcno identi.kacijo vrste. Oznako zubatak so dobili primerki z izrazito majhno glavo glede na dolˇzino telesa in taki z ustrezno pigmentacijo (brez pik, obarvan samo zgornji del telesa). Oznako glavatica so dobili primerki z opazno marmorirano podlago ne glede na ˇstevilo in barvo peg po telesu. Mehkoustne postrvi smo doloˇcali po izrazito krajˇsi spodnji ˇceljusti, kriˇzance mehkoustne in potoˇcne postrvi ali kosorje, kot jim pravijo domaˇcini, pa po malo krajˇsi spodnji ˇceljusti (Slika 8). Vse ostale ribe, ne glede na raznoliko pigmentacijo, smo oznaˇcili kot fenotipske potoˇcne postrvi. V nadal­jevanju bomo izraze glavatica, kosor, mehkoustna postrv, potoˇcna postrv in zubatak uporabljali kot grob opis fenotipov, znanstvena imena pa za primerke, opredeljene z genetskimi markerji ali primerke, ki so jih opisali drugi raziskovalci. V raziskavi smo uporabili tudi dva vzorca genetsko ˇciste soˇske postrvi S. marmoratus iz Zadlaˇsˇcice (Slovenija) za primerjavo z glavatico S. marmoratus iz poreˇcja Neretve. Preglednica 1: Vzorˇcenje po lokacijah (navedena so imena rek oz. potokov) in fenotipih. Table 1: Sampling by locations (names of rivers or streams) and by phenotypes. Lokacija Fenotip ˇSt. osebkov Po lokaciji Bukovica potoˇcna postrv 9 9 Krupac kosor 1 potoˇcna postrv 10 11 Lad -anica potoˇcna postrv 5 5 Ljuta kosor 1 potoˇcna postrv 9 10 Neretva (-Daji´ci) mehkoustna postrv 1 1 Neretva (Glavatiˇcevo) glavatica kosor mehkoustna postrv potoˇcna postrv 8 10 21 22 61 Neretva (Jablanica–Metkovi´c) zubatak 4 4 Neretva (Ocrkavlje) glavatica kosor mehkoustna postrv potoˇcna postrv 1 1 1 57 60 Rakitnica potoˇcna postrv 45 54 Skupaj 206 3.1.2 Kemikalije agaroza FMC, ZDA amonijev acetat Sigma, ZDA borna kislina Sigma, ZDA EDTA Sigma, ZDA etidijev bromid Sigma, ZDA etanol 96–odstotni Merck, Nemˇcija fenol Fluka, Nemˇcija formamid Applied Biosystems, ZDA HCl Merck, Nemˇcija izoamil–alkohol Merck–Alkaloid, Makedonija kalijev acetat Kemika, Hrvaˇska kalijev klorid Kemika, Hrvaˇska kloroform Merck–Alkaloid, Makedonija ledocetna kislina Merck, Nemˇcija magnezijev sulfat Kemika, Hrvaˇska mineralno olje Sigma, ZDA Na–acetat Merck–Alkaloid, Makedonija NaCl Merck, Nemˇcija Na–dodecil sulfat (SDS) Merck, Nemˇcija NaOH Merck, Nemˇcija magnezijev klorid Merck–Alkaloid, Makedonija Tris–baza GATC, Nemˇcija TSR Applied Biosystems, ZDA voda za celiˇcne kulture Sigma, ZDA 3.1.3 Pripravljeni seti kemikalij DNA sequencing Kit, BigDyeTM Terminator Perkin Elmer, ZDA Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction Wizard. Genomic DNA Promega, ZDA Puri.cation Kit 3.1.4 Encimi endonukleaze AluI, BseGI in SatI Fermentas, Litva endonukleaze NdeI, RsaI in SmaI Promega, ZDA rekombinantna Taq DNA–polimeraza Fermentas, Litva proteinaza–K Life Technologies, ZDA RNAza Fermentas, Litva 3.1.5 Oznaˇcevalci velikosti Razpet A. Genetska raznolikost salmonidov v poreˇcju Neretve. Mag. delo. Lj., Univ. v Lj. , Biotehniˇska fakulteta, Interdisciplinarni podiplomski ˇstudij biotehnologije, 2004 100 bp Fermentas, Litva vsebuje fragmente DNA, ki so dolgi 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 in 1031 bp 1 kbp Fermentas, Litva vsebuje fragmente DNA, ki so dolgi 250, 500, 750 bp, 1, 1,5 2 2,5 3, 3,5, 4, 5, 6, 8 in 10 kbp TAMRA350 Applied Biosystems, ZDA vsebuje fragmente, oznaˇcene s .uorescentno skupino TAMRA, ki so dolgi 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340 in 350 bp ROX350 Applied Biosystems, ZDA vsebuje fragmente, oznaˇcene s .uorescentno skupino ROX, ki so dolgi 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340 in 350 bp 3.1.6 Raztopine aplikacijski pufer 0,25–odstotno bromfenol modro 0,25–odstoten ksilen cianol 30–odstoten glicerol 50×pufer TAE 2 M Tris acetat 0,1 M EDTA (pH 8,0) 10×pufer TBE 0,5 M Tris baza 0,5 M borna kislina 10 mM EDTA (pH 8,3) pufer TEN 1 M Tris–HCl 0,5 M EDTA 2 M NaCl 3.1.7 Laboratorijska oprema ABI PRISMTM 310 Perkin Elmer, ZDA avtomatske pipete (10–1000 µl) Gilson, Francija centrifuga 5417C Eppendorf, Nemˇcija vakuumski koncentrator Eppendorf, Nemˇcija Gel Doc 1000 BioRad, ZDA inkubatorji Tehtnica, Slovenija; Eppendorf, Nemˇcija kadiˇcke za elektroforezo Pharmacia, ˇSvedska koniˇcno meˇsalo (vortex) Retsch, ZDA magnetna meˇsala Tehtnica, Slovenija mikroprocesorsko vodeni termostati MJ Research, ZDA UV–transiluminator Camag, ˇSvica 3.1.8 Zaˇcetni oligonukleotidi Preglednica 2: Seznam uporabljenih zaˇcetnih oligonukleotidov in ustreznih temperaturnih programov. Opis temperaturnih programov v Preglednici 3. Table 2: A list of primers used in our survey with corresponding PCR programms. For detailed PCR programms see Table 3. Oznaka Nukleotidno zaporedje Program 28Riba cytR CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG GTGTTATGCTTTAGTTAAGC Snoj in sod., 2000 Bernatchez in Danzmann, 1993 1 LDH-F LDH-R GGCAGCCTCTTCCTCAAAACGCCCAA CAACCTGCTCTCTCCCTCCTGCTGACGAA McMeel in sod., 2001 2 GH2C-F GH2C-R ATCGTGAGCCCAATCGACAAGCAG GGGTACTCCCAGGATTCAATCAGG Oakely in Phillips, 1999 3 Ssa197-F Ssa197-R TET– GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG TGGCAGGGATTTGACATAAC O’Reilly in sod., 1996 4 Str24-F Str24-R FAM– CACGGGAATACACACACGTG GACAGGGTCATTGATGTCATC Poteaux 1995 4 Str591-F Str591-R JOE– ATTCTTCGGCTTTCTCTTGC ATCTGGTCAGTTTCTTTATG Poteaux 1995 4 BFRO002-F BFRO002-R HEX– ATGTTTTTGACTGCACTATGTATTG GGAGATAAGAGTCAACGAGGC Suˇsnik in sod., 1997 5 Zaˇcetne oligonukleotide smo uporabili za pomnoˇzevanje kontrolne regije mtDNA (28Riba in cytR), dela gena, ki kodira laktat dehidrogenazo (LDH–F in LDH–R), dela gena, ki kodira rastni hormon (GH2C–F in GH2C–R) in ˇstirih mikrosatelitnih lokusov (Ssa197– F in Ssa197–R, Str24–F in Str24–R, Str591–F in Str591–R ter BFRO002–F in BFRO002– R). 3.2 METODE 3.2.1 Izolacija DNA DNA, izolirano po treh razliˇcnih spodaj opisanih metodah, redˇcimo z vodo za celiˇcne kulture (Sigma) v razmerju 1:10 in uporabimo v veriˇzni reakciji s polimerazo kot vzorˇcno DNA. Izolati DNA po hitri metodi niso primerni za pomnoˇzevanje mtDNA. 3.2.1.1 Fenolna ekstrakcija Koˇsˇcek repne plavuti smo sprali z destilirano vodo in prenesli v 1,5 ml reagenˇcno posodico. Dodali smo 200 µl pufra TEN, 7 µl 10–odstotnega SDS in 5 µl proteinaze–K (Life Technologies), premeˇsali meˇsanico z obraˇcanjem reagenˇcne posodice in ˇcez noˇc inkubirali pri 37.C. Nastali lizat smo preˇcistili s fenolno ekstrakcijo, tako da smo mu dodali enak volumen meˇsanice fenola, kloroforma in izoamilnega alkohola (25:24:1), meˇsanico premeˇsali z obraˇcanjem, nato pa s 5 minutnim centrifugiranjem pri 10000 g loˇcili fazi. Zgornjo, vodno fazo, smo prenesli v novo reagenˇcno posodico in po enakem postopku ekstrahirali ˇse z meˇsanico kloroforma in izoamil–alkohola (24:1). Genomsko DNA v vodni fazi smo oborili z dodatkom 2,5–kratnega volumna ledeno hladnega absolutnega etanola in obraˇcali reagenˇcno posodico do nastanka oborine. Vzorce smo shranili za 1 uro pri -20.C, nato 10 min centrifugirali pri 10000 g. Odpipetirali smo supernatant in posuˇsili oborino na zraku. DNA smo raztopili v 25 µl vode za celiˇcne kulture (Sigma) in shranili v hladilniku pri 4.C. Upeˇsnost izolacije smo preverili v 1,5–odstotnem agaroznem gelu po barvanju z etidi­jevim bromidom. 3.2.1.2 Wizard . Genomic DNA Puri.cation Kit Sledili smo navodilom proizvajalca Wizard . Genomic DNA Puri.cation Kit, uporabili smo protokol za izolacijo DNA iz miˇsjih repov. 3.2.1.3 Hitra metoda Majhen koˇsˇcek repne plavuti speremo z destilirano vodo in prenesemo v 0,5 ml reagenˇcno posodico. Dodamo 50 µl NaOH (0,2 M) in inkubiramo ob stresanju pri 97.C. Nevtral­iziramo raztopino z dodatkom 50 µl HCl (0,2 M) in 2 µl Tris–base (1 M, pH 8,3). 3.2.2 Agarozna gelska elektroforeza Molekule DNA se v elektriˇcnem polju gibljejo s hitrostjo, ki je predvsem odvisna od njihove velikosti in zamreˇzenosti medija, v katerem potujejo. Zato lahko z gelsko elek­troforezo ocenimo velikost molekul DNA po PCR ali po restrikciji z endonukleazami, preverjamo uspeˇsnost izolacije DNA ter izoliramo fragmente DNA z doloˇcenim ˇstevilom baznih parov. Koncentracijo agaroze v gelu smo izbirali glede na priˇcakovano dolˇzino molekul DNA. Najpogosteje smo uporabljali 1,5–odstotni agarozni gel, ki je primeren za loˇcevanje fragmentov 200–4000 bp. Agarozni gel smo pripravili iz agaroze in 0,5×TBE pufra. Meˇsanico smo zavreli v mikrovalovni peˇcici in jo ohlajali na elektromagnetnem meˇsalu. Dodali smo 0,5 µl etidijevega bromida (0,5 µg/ml) in vlili ˇse vedno tekoˇci gel v pripravljene modelˇcke. Strjevanje pri sobni temperaturi je trajalo 10–20 min. Vzorcem DNA smo pred vnosom v gel dodali aplikacijski pufer (0,25–odstotno brom­fenol modro, 0,25–odstoten ksilen cianol, 30–odstoten glicerol v vodi) in jih previdno odpipetirali v luknjice v agaroznem gelu. V 0,5×TBE elektroforeznem pufru in pri napetosti 120 V je elektroforeza tekla 30–60 min. Etidijev bromid (EtBr) v tem ˇcasu interkalira med baze DNA in .uorescira pri vzbujevalni svetlobi valovne dolˇzine 302 nm, zato smo gele po elektroforezi fotogra.rali na UV–transiluminatorju. 3.2.3 Veriˇzna reakcija s polimerazo Veriˇzna reakcija s polimerazo ali PCR (ang. polimerase chain reaction) je metoda za in vitro pomnoˇzevanje DNA. DNA–polimeraza sintetizira komplementarno verigo od mesta na vzorˇcni DNA, kamor se je vezal zaˇcetni oligonukleotid. S ponavljanjem denaturacije dvojne verige DNA molekul, vezave zaˇcetnih oligonukleotidov in sinteze komplementarne verige v ciklih lahko DNA, ki se nahaja med dvema primerno izbran­ima zaˇcetnima oligonukleotidoma, eksponentno pomnoˇzujemo. Reakcijsko zmes smo pripravljali v loˇcenem prostoru, kjer ne uporabljamo vzorcev, ki vsebujejo DNA. Vzorˇcno DNA smo dodajali v drugem prostoru. Uporabili smo dve ra­zliˇcni meˇsanici, eno za pomnoˇzevanje kontrolne regije mtDNA in drugo za pomnoˇzevanje jedrne DNA. mtDNA jedrna DNA 13,75 6,1 µl vode (Sigma) 2 1 µl 10×pufra PCR (Fermentas) 1,2 0,9 µl 2 mM meˇsanice dNTP (dATP, dCTP, dGTP in dTTP) 1 0,5 µl 25 mM MgCl2 0,5 0,25 µl 10 pmol/µl zaˇcetnega oligonukleotida 1 0,5 0,25 µl 10 pmol/µl zaˇcetnega oligonukleotida 2 0,05 0,02 µl Taq DNA–polimeraze 5 U/µl 1 . 1 . µl vzorˇcne DNA 20 µl 10 µl Vzorce smo vstavili v mikroprocesorsko vodeni termostat in uporabili ustrezen tempe­raturni program, vsi programi se zaˇcnejo z denaturacijskim korakom (5 min pri 95.C) in konˇcajo s korakom sinteze komplementarne verige DNA (5 min pri 72.C). Ponavljajoˇci koraki so opisani v Preglednici 3. Program 6 omogoˇca reakcijo doloˇcanja nukleotidnega zaporedja (glej poglavje 3.2.6). Preglednica 3: Opis temperaturnih programov mikroprocesorsko vodenih termostatov. Table 3: A description of PCR programms. Ime programa Denaturacija Vezava zaˇcetnih oligonukleotidov Sinteza komple– mentarne verige ˇStevilo ciklov 1 2 3 4 5 6 95.C, 45 s 95.C, 1 min 94.C, 45 s 95.C, 30 s 94.C, 45 s 96.C, 30 s 52.C, 45 s 62.C, 1 min 58.C, 45 s 53.C, 20 s 60.C, 25 s 50.C, 15 s 72.C, 2 min 72.C, 1 min 72.C, 45 s 72.C, 10 s 60.C, 4 min 31 31 33 33 36 35 3.2.4 Izolacija fragmentov DNA iz gela z elektroelucijo Po konˇcani elektroforezi produktov PCR smo s skalpelom izrezali kvader agaroznega gela tik pred izbranim fragmentom DNA. Luknjico smo napolnili s pufrom 0,5×TAE in pri napetosti 200 V podaljˇsali ˇcas elektroforeze ˇse za 45 s oziroma dokler se ni izbrani fragment DNA eluiral v pufer v luknjici. Raztopino smo odpipetirali iz luknjice, DNA smo oborili z dodatkom nasiˇcene raztopine NaCl in 96–odstotnega ledeno hladnega etanola (8 µl NaCl/50 µl 0,5×TBE, 2,5–kratni volumen etanola). Obarjanje je trajalo 1 uro pri –70.C ali ˇcez noˇc pri –20.C. Vzorce smo 15 min centrifugirali pri 20 000 g, odpipetirali etanol, oborino DNA posuˇsili na zraku in jo raztopili v 24 µl vode (Sigma). Namen izolacije DNA iz gela je odstranitev zaˇcetnih oligonukleotidov, ki se niso vgradili v produkt PCR. Iz gela izolirane fragmente lahko uporabimo v reakciji doloˇcanja nuk­leotidnega zaporedja (glej poglavje 3.2.6). 3.2.5 PCR–RFLP Uporabljali smo ˇsest endonukleaz, ki so bile izbrane na osnovi nukleotidnega zaporedja tako, da razliˇcno reˇzejo razliˇcne mtDNA haplotipe in alele jedrnih lokusov. Vsakemu encimu ustreza restrikcijski pufer, kot ga priporoˇca proizvajalec encima. Pripravili smo restrikcijske meˇsanice s skupnim volumnom 20 µl: • do 2 µg DNA (produkt PCR) • 2 µl ustreznega 10–kratnega restrikcijskega pufra • vodo (Sigma) do volumna 20 µl • 1 U endonukleaze • reakcije so tekle pri temperaturi, ki jo priporoˇca proizvajalec preko noˇci. Z restrikcijskimi encimi AluI (37.C), NdeI (37.C), SatI (37.C) in SmaI (25.C) smo razrezali del kontrolne regije (po PCR z zaˇcetnima oligonukleotidoma 28R in CYTR) in glede na razliˇcne pro.le doloˇcili enega od ˇsestih mitohondrijskih haplotipov (Slika 13). Slika 13: Pro.li kontrolne regije mtDNA po restrikciji z endonukleazami AluI (zgoraj levo), NdeI (zgoraj desno), SatI (spodaj levo) in SmaI (spodaj desno). V posameznih stolpcih so v vedno enakem vrstnem redu od leve proti desni: oznaˇcevalec velikosti 1 kbp, haplotipi Ad-s3, AdN, Da-s1, Da-s2, At-s1, Soxy in Ma-s1. Figure 13: Pro.les of control region of mtDNA after restriction with AluI (above left), NdeI (above right), SatI (below left) and SmaI (below right). DNA samples in columns from left to right: 1 kbp size marker, haplotypes Ad-s3, AdN, Da-s1, Da-s2, At-s1, Soxy and Ma-s1. Z restrikcijskim encimom BseGI (55.C) smo loˇcili SNP (AF005912, 112. bp) v za­poredju C introna gena za rastni hormon (Slika 14). Alel C je toˇckovni polimor.zem, znaˇcilen za potoˇcno postrv v poreˇcju Neretve. Alel G je znaˇcilen za potoˇcne postrvi iz drugih poreˇcij in za mehkoustno postrv iz poreˇcja Neretve. Z restrikcijskim encimom RsaI (37.C) smo loˇcili SNP (AF488540, 259. bp) v zaporedju introna gena za laktat dehidrogenazo (Slika 15). Alel MP je znaˇcilen za mehkoustno postrv iz poreˇcja Neretve, alel NP pa za vse ostale salmonide v tem poreˇcju. Slika 14: Pro.l C introna gena za rastni hormon (GH2C) po restrikciji z endonukleazo BseGI. Od leve proti desni: oznaˇcevalec velikosti 100 bp, GH2C (nerezan), homozigot C, heterozigot, homozigot G, oznaˇcevalec velikosti 100 bp. Figure 14: Pro.le of intron C of the growth hormone gene (GH2C) after restriction with BseGI. In columns from left to right: 100 bp size marker, GH2C (uncut), C homozygote, heterozygote, G homozygote and 100 bp size marker. Slika 15: Pro.l introna gena za laktat dehidrogenazo (LDH) po restrikciji z endonukleazo RsaI. Od leve proti desni: oznaˇcevalec velikosti 100 bp, LDH (nerezan), homozigot MP, heterozigot, homozigot NP, LDH (nerezan), oznaˇcevalec velikosti 100 bp. Figure 15: Pro.le of the lactat dehydrogenase gene (LDH) after restriction with RsaI. In columns from left to right: 100 bp size marker, LDH (uncut), MP homozygote, heterozygote, NP homozygote LDH (uncut) and 100 bp size marker. 3.2.6 Doloˇcanje nukleotidnega zaporedja Reakcija doloˇcanja nukleotidnega zaporedja je razliˇcica veriˇzne reakcije s polimerazo, pri kateri uporabljamo samo en zaˇcetni oligonukleotid in meˇsanico nukleotidov, ki vsebujejo tudi dideoksiribonukleozid–trifosfate (ddNTP–je) s .uorescirajoˇco molekul­sko skupino. Polimeraza sintetizira vzorˇcni DNA komplementarno verigo dokler ne vstavi vanjo prve molekule ddNTP. Ko enoveriˇzne molekule DNA, ki se konˇcujejo z monomeri ddNTP, potujejo skozi elektriˇcno polje, se razporedijo po velikosti. Laser oddaja svetlobo doloˇcene valovne dolˇzine (vzbujevalna svetloba), detektorji pa zaznajo svetlobo spremenjene valovne dolˇzine, ki jo oddajajo .uorescirajoˇce skupine molekul DNA (sevalna svetloba), ki se med seboj razlikujejo za dolˇzino enega nukleotida. Ker uporabljamo ˇstiri razliˇcne .uorescirajoˇce skupine za vsako od ˇstirih molekul ddNTP, lahko na osnovi .uorescirajoˇce svetlobe doloˇcimo zaporedje vzorˇcne DNA. V reagenˇcno posodico smo odpipetirali 3–5 µl iz agaroznega gela izoliranega produkta PCR (glej poglavje 3.2.4), 1 pmol zaˇcetnega oligonukleotida, 4,5 µl redˇcene raztopine BigDye in dopolnili do 15 µl z vodo (Sigma). Reagenˇcno posodico smo vstavili v mikroprocesorsko vodeni termostat s temperaturnim programom 6 (Preglednica 3). Po konˇcanem programu smo oborili DNA z dodatkom 2 µl Na–acetata (3 M, pH 4,6) in 50 µl ledeno hladnega absolutnega etanola. Inkubirali smo 10 min v ledeni kopeli, 30 min centrifugirali pri 20000 g in sprali oborino DNA s 70–odstotnim etanolom. Oborino smo posuˇsili na zraku in jo raztopili v 12 µl raztopine ”Template Suppression Reagent”. Raztopljeno DNA smo 3 min denaturirali pri 95.C, jo ohladili v ledeni kopeli, prenesli v reagenˇcne posodice ABI Prism in vstavili v napravo ABI Prism 310 za doloˇcanje zaporedja nukleotidov vzorˇcne DNA (modul ”Seq POP6 Rapid (1 ml) E”). 3.2.7 Ugotavljanje dolˇzine mikrosatelitov Po 2 µl produkta PCR Ssa197 in BFRO 002 smo zdruˇzili, dodali 0,7 µl oznaˇcevalca velikosti TAMRA350 in 12 µl formamida. Meˇsanico smo prenesli v reagenˇcno posodico ABI, jo denaturirali 3 min pri 95.C, jo ohladili v ledeni kopeli in vstavili v napravo ABI Prism 310 za doloˇcanje dolˇzine oznaˇcenih fragmentov DNA (modul ”GS STR POP4 (1 ml) C”). Produkta PCR Str24 in Str591 smo pripravili enako, vendar smo uporabili oznaˇcevalec velikosti ROX350 in modul ”GS STR POP4 (1 ml) A”. Vzorce z manj pogostimi aleli smo ponovili in preverili, prav tako tudi nekaj nakljuˇcno izbranih vzorcev. 3.2.8 Analiza podatkov 3.2.8.1 Analiza mtDNA Nukleotidna zaporedja smo uredili s programom Chromas 2.23 .cTechnelysium Pty. Ltd.. S programom Clustal X (Thompson in sod., 1997) smo jih poravnali z znanimi zaporedji iz baze podatkov GenBank. Filogenetsko drevo smo narisali v programu MEGA (Kumar in sod., 2002). V skladu s predhodnimi raziskavami (Bernatchez, 2001) smo uporabili metodo najveˇcje varˇcnosti (maximum parsimony) s 1000 samovzorˇcenji. Metoda temelji na neposredni primer­javi nukleotidnih zaporedij in sledi naˇcelu, da je najbolj verjetna evolucija taka z na­jmanjˇsim ˇstevilom sprememb. Pogosto pridemo po tej metodi do veˇc kot ene reˇsitve, zato smo izvedli 1000 samovzorˇcenj in doloˇcili drevo, ki je bilo najveˇckrat izraˇcunano za konˇcno reˇsitev. Drevo konstruiramo na vsakem informativnem mestu, to je mesto, ki daje prednost doloˇcenemu neukoreninjenemu drevesu pred drugimi (Jerman in ˇ Stern, 1999). Metoda ni uporabna za rekonstrukcijo .logenije znotraj posameznih linij. 3.2.8.2 Analiza jedrnih markerjev Izraˇcun deleˇin Hn.b.), ocen .ksacijskih indeksov ( ^ zev heterozigotnosti (Hobs., Hexp. . in f^), vezavnega neravnovesja (^.2) in faktorielno korespondenˇcno analizo, kot so opisane v poglavju 2.7.1, smo izvedli s programom GENETIX 4.04 (Belkhir in sod., 2002). Za doloˇcanje stopnje zaupanja smo uporabili metodo samovzorˇcenja (ang. bootstrap). Za vsako psevdopopulacijo nakljuˇcno izbranih vzorcev program izraˇcuna .ksacijski indeks. Pri analizi jedrnih markerjev smo izbrali 2500 psevdopopulacij, statistiˇcna znaˇcilnost je visoka, kadar so vrednosti za posamezne psevdopopulacije v ozkem inter­valu v primerjavi s standardnim odklonom (Page in Holmes, 1998). 4 REZULTATI 4.1 TRENUTNO STANJE V POREˇCJU NERETVE Glede na naˇsa opaˇzanja pri vzorˇcenju je slab nadzor nad ribolovom po drˇzavljanski vojni v Bosni in Hercegovini oˇciten. Ribolov z elektriko, dinamitom in mreˇzami je zdesetkal tudi glavatice v Neretvi v bliˇzini mesta Konjic, naˇsli smo samo 9 primerkov (4,4 % vseh vzorcev), ki so glede na fenotip kriˇzanci s potoˇcno postrvjo. Ribiˇsko druˇstvo Konjic je zato ˇze sproˇzilo samostojno akcijo za zaˇsˇcito glavatice. V poreˇcju prevladuje potoˇcna postrv (76,2 %), manj je mehkoustne postrvi (11,2 %) in kosorjev (6,3 %). V poreˇcje so spet zaˇceli vlagati ribe, predvsem potoˇcne postrvi atlantske linije. Ribogojnice, kjer gojijo potoˇcne postrvi te linije, kot je tista na reki Ljuti, ˇse ne delujejo s polno zmogljivostjo. Zubatka v zgornjem delu poreˇcja Neretve ni. Alain Crivelli in Ivan Bogut sta nam prijazno priskrbela vsak po dva odrezka repne plavuti primerkov iz spodnjega dela Neretve (Jablanica–Metkovi´c). Tudi tam so najdbe zubatka redke, velja za trofejno ribo. 4.2 KONTROLNA REGIJA mtDNA 4.2.1 Haplotipi mtDNA v poreˇcju Neretve Od 206–ih vzorcev smo haplotipe 85–im (41 %) doloˇcili na osnovi nukleotidnega za­poredja, ostalim pa z metodo PCR–RFLP. Naˇsli smo 6 razliˇcnih mitohondrijskih hap­lotipov (Preglednica 4). Najbolj pogost je AdN, (55,8 %) ki ˇse ni bil objavljen v bazi podatkov Genbank (Priloga B). Preglednica 4: Mitohondrijski haplotipi v poreˇcju Neretve. V oklepajih ˇstevilo vzorcev, ki smo jim doloˇcili haplotip na osnovi nukleotidnega zaporedja. Table 4: Mitochondrial haplotypes in the River Neretva drainage. Number of sequenced samples in parentheses. Haplotip Genebank oznaka ˇSt. Ad-s3 AdN At-s1 Da-s1 Da-s2 Soxy M97967 M97969 M97973 M97974 AF488535 23 (20) 115 (38) 15 (4) 20 (2) 6 (3) 27 (21) Skupaj 206 (85) Uporabili smo oˇstevilˇcenje polimor.zmov kontrolne regije mtDNA po Bernatchezu (2001). Za haplotipe jadranske (Ad) linije sta znaˇcilna dva sinapomor.zma, nuk­leotida C41 in C278 (Bernatchez, 2001). Izjemi sta haplotipa Ad-s9 (delecija 41. nuk­leotida) in AdN (T278). Obiˇcajno se haplotipi znotraj linije med seboj razlikujejo v posameznih nukleotidnih zamenjavah (Preglednica 5). AdN se od haplotipov Ad linije in vseh drugih linij razlikuje v dveh nukleotidnih zamenjavah, in sicer na pozicijah 141 (C-›T) in 278 (C-›T). To sta tudi edini razliki v primerjavi z najbolj podobnim haplotipom, Ad-s2. Preglednica 5: Primerjava zaporedja AdN (zadnja vrstica) z nekaterimi zaporedji iz baze podatkov Genbank. Polimorfna mesta so oˇstevilˇcena po Bernatchezu (2001). Table 5: A comparison of AdN haplotype (last row) with some sequences from Genebank. Polymorphic sites are numbered in accordance with Bernatchez (2001). Polimorfna mesta Haplotip 7 16 22 41 59 69 86 95 128 141 162 194 212 250 251 252 259 278 279 280 At-s1 At-s2 At-s3 T -- T -- A -- T -- C -- A -- T -C T -- / -- C -- G -- T -- A -- G A - A G - T -- T -- G -- C -- T -- Da-s1 Da-s2 Da-s3 --- C C C --- A A A --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A -G - G G G --- --- --- --- Ma-s1 Ma-s2 Ma-s3 --- --- --- C C C --- --- --- --- A A A --- --- --C --- --- --- --- --- A A A -T T --- Me-s1 Me-s2 Me-s3 --C --- --- C T C --- --- --- --- --- --- A A A --- C C C --- --- --- --- --- --- --- Ad-s1 Ad-s2 Ad-s3 Ad-s4 Ad-s5 Ad-s6 Ad-s7 Ad-s8 Ad-s9 Ad-s10 AdN ----------- ----------- -----G ----- C C C C C C C C / C C --T -------- ---------G - ----------- ------C ---- ----------- ----------T -------A -A - ----C ------ ----------- ----------- ----------- ----------- -C --------C C C C C C C C C C C T ----------- ---C ------- Zamenjava 278. sinapomorfnega nukleotida, je verjetno ponovna nukleotidna zamen­java ali sekundarna mutacija. Pri donavski, atlantski in sredozemski liniji je na tej poziciji G, pri marmoratus pa A. Kljub tej zamenjavi smo s programom MEGA hap­lotip AdN uvrstili v jadransko .logeografsko linijo (Slika 16), zato smo ga poimenovali AdN (Ad–jadranska linija N-Neretva). Verjetnosti za razvejanje .logenetskega drevesa znotraj linij so nizke zaradi majhnih razlik med haplotipi. Dva haplotipa jadranske linije iz poreˇcja Neretve, Ad-s3 in AdN, se razlikujeta v ˇstirih nukleotidnih zamenjavah (pozicije 59, 141, 259 in 278). V poreˇcju sta prisotna dva haplotipa donavske linije, Da-s1 in Da-s2, ki se razlikujeta v enem nukleotidu (pozicija 251), haplotip atlantske linije At-s1 in haplotip Soxy, znaˇcilen za podvrsto mehkoustne postrvi, ki ˇzivi v poreˇcju Neretve (S. obtusirostris oxyrhynchus). 4.2.2 Distribucija haplotipov Vzorci iz razliˇcnih lokacij se zelo razlikujejo po frekvenci posameznih haplotipov (Pre­glednica 6). Na lokacijah z najveˇcjim ˇstevilom vzorcev, Neretva Ocrkavlje, Neretva Glavatiˇcevo in v Rakitnici, prevladuje haplotip AdN. Frekvenca haplotipa Soxy je niˇzja v zgornji lokaciji na Neretvi pri Ocrkavljah (5 %) kot na spodnji pri Glavatiˇcevem (32,8 %). Haplotipi atlantske in donavske linije prevladujejo v Bukovici (100 %) in Ljuti (80 %), haplotip donavske linije Da-s1 pa ima visoko frekvenco tudi v Rakitnici (42,2 %). Preglednica 6: Razporeditev mitohondrijskih haplotipov glede na mesto izlova. Table 6: Geographical distribution of mitochondrial haplotypes. Lokacija Ad3 AdN At1 Da1 Da2 Soxy Bukovica 8 1 Krupac 2 5 1 3 Lad -anica 4 1 Ljuta 1 1 6 2 Neretva (-Daji´ci) 1 Neretva (Glavatiˇcevo) 5 32 1 1 2 20 Neretva (Jablanica–Metkovi´c) 4 Neretva (Ocrkavlje) 14 43 3 Rakitnica 1 25 19 Haplotip AdN je prisoten pri vseh fenotipih (Preglednica 7). Haplotipi atlantske in donavske linije so z eno izjemo, prisotni le pri potoˇcnih postrveh. Mehkoustna postrv je edini fenotip, pri katerem najpogostejˇsi haplotip ni AdN temveˇc Soxy (73,9 %). Preglednica 7: Razporeditev mitohondrijskih haplotipov glede na fenotip. Table 7: Distribution of mitochondrial haplotypes for di.erent phenotypes. Fenotip Ad3 AdN At1 Da1 Da2 Soxy Glavatica 1 7 1 Kosor 1 7 1 3 Mehkoustna postrv 6 17 Potoˇcna postrv 21 91 15 19 6 6 Zubatak 4 4.3 ANALIZA JEDRNIH MARKERJEV 4.3.1 Mikrosateliti Na mikrosatelitnem lokusu BFRO 002 smo doloˇcili 8 razliˇcnih alelov (dolˇzin 116–137 bp), na lokusu Ssa197 20 (116–222 bp), na lokusu Str24 28 (161–237 bp) in na lokusu Str591 13 razliˇcnih alelov (148–188). Povpreˇcno ˇstevilo alelov na mikrosatelitni lokus je 17,3. Speci.ˇcnih alelov za posamezne lokacije ni (Priloga C), izjema je lokacije Neretva Jablanica–Metkovi´c, od koder imamo vse ˇstiri vzorce zubatka. Za fenotip speci.ˇcnih alelov tudi ni (Slika 17), izjema je zubatak z aleli 128 (BFRO 002), 154 (Str591) ter 202 in 222 (Str24). Kosor in veˇcina glavatic so glede na fenotip kriˇzanci, zato zanje ni znaˇcilnih markerjev. Ob pomanjkanju referenˇcnih neintrogresiranih populacij smo ostale znaˇcilne alele doloˇcili po FCA (glej poglavje 1.4.1, Preglednica 9). Razpet A. Genetska raznolikost salmonidov v poreˇcju Neretve. Mag. delo. Lj., Univ. v Lj. , Biotehniˇska fakulteta, Interdisciplinarni podiplomski ˇstudij biotehnologije, 2004 alel BFRO 002 alel Ssa197 137 . . 222 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 . . . . . . . . . . . . . . . . 116 . 1 2 3 4 5 pop. . . 1 2 3 4 pop.5 alel Str24 alel Str591 237 . . . . . . . . . . . 188 . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 . . 161 . . . . . . 1 2 3 4 pop.5 1 2 3 4 5 pop. Slika 17: Polimor.zmi na posameznih mikrosatelitnih lokusih po posameznih fenotipih. Ploˇsˇcina kroga oznaˇcuje frekvenco posameznega alela. 1–glavatica, 2–kosor, 3–mehkoustna postrv, 4–potoˇcna postrv in 5–zubatak. Natanˇcnejˇsi podatki so v Prilogi D. Figure 17: Microsatellite lenght polymorphisms, bubble size correspondes with allele frecquenciy. 1–glavatica, 2–kosor, 3–soft mouth trout, 4–brown trout and 5–zubatak. Full data in Appendix D. 4.3.2 LDH in GH2C Frekvenca za S. obtusirostris znaˇcilnega alela MP gena LDH se opazno razlikuje med fenotipsko mehkoustno postrvjo (84,8 %) in potoˇcno postrvjo (2,3 %). Kosor, kriˇzanec med mehkoustno in potoˇcno postrvjo, ima tudi visoko frekvenco tega alela, kot tudi zubatak, vendar pa ta dva podatka temeljita na manjˇsem ˇstevilu vzorcev (Preglednica 8). Alel C gena GH2C je znaˇcilen za S. trutta iz poreˇcja Neretve, alel G pa je znaˇcilen za S. obtusirostris in vloˇzene primerke S. trutta iz drugih poreˇcij. Frekvenca alela G pri fenotipskih mehkoustnih postrveh znaˇsa 89,1 %, pri ostalih fenotipih pa od 22,8–37,5 %. Preglednica 8: Frekvenca alelov po fenotipih za gena, ki kodirata laktat dehidrogenazo (LDH) in rastni hormon (GH2C). Table 8: Allele frequencies of lactat dehydrogenase (LDH) and growth hormone (GH2C) genes for di.erent phenotypes. Lokus Alel Glavatice (N=9) Kosorji (N=12) Mehkoustne (N=23) Potoˇcne (N=158) Zubatak (N=4) LDH MP NP 0,1111 0,8889 0,3333 0,6667 0,8478 0,1522 0,0285 0,9715 0,2500 0,7500 GH2C C G 0,6667 0,3333 0,6250 0,3750 0,1087 0,8913 0,7722 0,2278 0,6250 0,3750 4.3.3 Statistiˇcna obdelava podatkov V analizi s programom GENETIX smo uporabili jedrne markerje, torej mikrosatelite in SNP–je, povpreˇcno ˇstevilo alelov na lokus je 12,2. 4.3.3.1 Faktorielna korespondenˇcna analiza Faktorielna korespondenˇcna analiza vzorce razdeli v tri veˇcje gruˇce. Gruˇce se ne uje­majo z lokacijami vzorˇcenj (Slika 18), zato pa se bolje ujemajo s fenotipi (Slika 19). Mehkoustne postrvi so v eni gruˇci, potoˇcne postrvi pa v dveh. V manjˇsi od teh dveh gruˇc potoˇcnih postrvi prevladujejo vzorci iz Bukovice in Ljute, kjer so v preteklih letih vlagali potoˇcne postrvi iz atlantskega povodja, kar smo potrdili tudi na osnovi mtDNA (Preglednica 5). Po FCA lahko doloˇcimo vrste, ki so jih raziskovalci opisali v poreˇcju Neretve, ki ver­jetno ustrezajo posameznim gruˇcam (Slika 19). Vrst S. marmoratus in S. dentex na osnovi jedrnih markerjev ne moremo razlikovati, loˇcimo pa vloˇzene in avtohtone lin­ije S. trutta. Gruˇco med S. obtusirostris in avtohtnono S. trutta smo zaradi vmesnih genotipov opredelili kot kriˇzance teh vrst, ˇceprav veˇcina kriˇzancev, kot smo jih doloˇcili po fenotipu, sodi v gruˇco avtohtonih S. trutta. Dva vzorca neintrogresirane S. mar­moratus iz Zadlaˇsˇcice (Slovenija) tvorita povsem svojo gruˇco po FCA (ni vkljuˇceno v Slikah 18 in 19). Slika 18: Faktorielna korespondenˇcna analiza po posameznih lokacijah. Od povpreˇcnega genotipa (izhodiˇsˇce) izstopajo lokacije Bukovica (temno zelene), Ljuta (bele), Neretva Jablanica–Metkovi´c (svetlo zelene) in del vzorcev iz Neretve pri Glavatiˇcevem (temno modre). V oklepajih deleˇz skupne variance, ki jo pojasnjuje posamezna koordinatna os (skupaj 21,96 %). Figure 18: Factorial corresponcence analysis of individuals from di.erent sampling locations. Popula­tions from the River Bukovica (dark green), Ljuta (white), Neretva between Jablanica and Metkovi´c (light green) and some individuals from the River Neretva at Glavatiˇcevo (dark blue) are far away from average genotype (origin). Percentage of variance explained by axes in parentheses (total 21,96 %). Ob pomanjkanju referenˇcnih neintrogresiranih vrst smo najverjetnejˇse speci.ˇcne alele za posamezne vrste, opisane v poreˇcju Neretve, doloˇcili glede na fenotip in genotip posameznih primerkov (Priloga A) in njihovega poloˇzaja po FCA (Slika 16). Alel 116 (BFRO 002) je skupni alel, znaˇcilen za S. trutta Ad in At linije. Alela NP (LDH) in G (GH2C) sta prav tako skupna za veˇc linij (Preglednica 9). Ostali aleli imajo nizke frekvence ali pa so skupni vsem vrstam, predvsem aleli mikrosatelitnega lokusa Ssa197. Slika 19: Faktorielna korespondenˇcna analiza po posameznih fenotipih in z vrstami, ki verjetno us­trezajo posameznem gruˇcam. Od povpreˇcja (izhodiˇsˇce) izstopajo mehkoustne postrvi (bele), glavatice (rumene), zubatki (roˇznate) in nekatere potoˇcne postrvi (sive). V oklepajih deleˇz skupne variance, ki jo pojasnjuje posamezna koordinatna os (skupaj 21,96 %). Figure 19: Factorial corresponcence analysis of individuals with di.erent phenotypes. Soft mouth trout (white), glavatica (yellow), zubatak (pink) and some brown trout (grey) are far away from average genotype (origin). Percentage of variance explained by axes in parentheses (total 21,96 %). Preglednica 9: Najverjetnejˇsi za vrsto znaˇcilni jedrni markerji. Table 9: Most probable species–speci.c nuclear markers. Vrsta BFRO 002 Str24 Str591 LDH GH2C S. obtusirostris 131, 133, 137 171, 175, 177 158, 170 MP G S. trutta (Ad linija) S. trutta (At linija) S. trutta (Da linija) 116 116 120 176, 186 148, 150, 152 188 NP NP NP C G G S. marmoratus in S. dentex 128 202, 222 154 NP G 4.3.3.2 Deleˇzi heterozigotnosti, F–statistika in vezava genetskih markerjev Ravnoteˇzje populacij smo ovrednotili s primerjavo deleˇzev heterozigotnosti in parame­tra f^, ki je ocena za parameter FIS. Z izjemo Bukovice je v vseh populacijah preseˇzek heterozigotnosti. V Preglednici 9 so z zvezdicami oznaˇcene populacije, ki z veˇc kot 95–odstotno verjetnostjo niso v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju glede na parame­ter f^. Taki sta populaciji potoˇcnih postrvi in zubatkov, od lokacij pa so v Hardy– Weinbergovemu ravnoteˇzju le postrvi iz potokov Bukovica in Lad -anica z vloˇzenimi potoˇcnimi postrvmi atlantske linije in iz spodnjega dela Neretve med Jablanico in Metkovi´cem. Preglednica 10: Primerjava deleˇzev heterozigotnosti (priˇcakovani, brez vpliva in opazovani) in f^ glede na fenotip in lokacijo. % zaupanja izraˇcunan na osnovi 1000 permutacij, oznake: n.z. – ni statistiˇcno znaˇcilno, * – znaˇcilno 95–99 %, ** – znaˇcilno 99,0–99,99 %, *** – znaˇcilno >99,99 %. Statistiˇcno znaˇcilne vrednosti pomenijo, da populacija ni v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju, v oklepajih so statistiˇcno znaˇcilne vrednosti populacij z manj kot 10 vzorci. Table 10: A comparison of f^, expected, non biased and observed heterozygosity for salmonides from di.erent sampling locations and of di.erent phenotypes. Con.dence calculated on the basis of 1000 replications, n.z. – non signi.cant, * – 95–99 % con.dence, ** – 99,0–99,99 % con.dence, *** – >99,99 % con.dence. Statistically signi.cant values mark populations not in Hardy–Weinberg equilibrium, values for populations with less than 10 individuals in parentheses. Hexp. Hn.b. Hobs. f^ st. znaˇc. Fenotip Glavatica 0,5710 0,6046 0,4444 0,2768 (***) Kosor 0,6256 0,6528 0,6389 0,0222 n.z. Mehkoustna postrv 0,5462 0,5583 0,5507 0,0139 n.z. Potoˇcna postrv 0,4856 0,4872 0,3386 0,3056 *** Zubatak 0,2552 0,2917 0,2917 0,0000 (n.z.) Lokacija Bukovica 0,2767 0,2930 0,2963 –0,0119 (n.z.) Krupac 0,3409 0,3571 0,2727 0,2453 ** Lad-anica 0,3933 0,4370 0,4333 0,0095 (n.z.) Ljuta 0,4000 0,4211 0,3167 0,2581 ** Neretva (­Daji´ci) 0,3333 0,6667 0,6667 – (–) Neretva (Glavatiˇcevo) 0,6911 0,6968 0,5109 0,2684 *** Neretva (Jablanica–Metkovi´c) 0,2552 0,2917 0,2917 0,0000 (n.z.) Neretva (Ocrkavlje) 0,3775 0,3806 0,3028 0,2060 *** Rakitnica 0,4642 0,4695 0,3741 0,2050 *** Vrednosti ^ ., ki je ocena parametra FST , razkrivajo, da so si populacije glede na jedrne markerje med seboj veˇcinoma razliˇcne (Preglednica 11). Pari med seboj podobnih pop­ulacij pa praviloma vsebujejo majhno ˇstevilo vzorcev, npr. Neretva Daji´ci (1 vzorec), -Neretva Jablanica–Metkovi´c (4 vzorci) in Lad -anica (5). Osem vzorcev glavatica je po jedrnih markerjih podobnih kosorjem in potoˇcnim postrvem, vendar so glavatice glede na pigmentacijo veˇcinoma kriˇzanci. Od ostalih sta si po jedrnih markerjih podobni populaciji iz Ljute in Bukovice ter iz Krupaca in Lad -anice. Preglednica 11: Vrednosti ^ . po fenotipih (nad diagonalo) in % zaupanja (pod diagonalo) glede na lokacijo (zgoraj) in fenotip (spodaj). Izraˇcunano na osnovi 1000 permutacij, oznake: n.z. – ni statistiˇcno znaˇcilno, * – znaˇcilno 95–99 %, ** – znaˇcilno 99,0–99,99 %, *** – znaˇcilno >99,99 %. Statistiˇcno znaˇcilne vrednosti pomenijo, da sta si dve populaciji razliˇcni glede na jedrne markerje, v oklepajih so statistiˇcno znaˇcilne vrednosti za pare, v katerih ima ena od populacij manj kot 10 vzorcev. ^ Table 11: . values (above the diagonal) and con.dence level (below the diagonal) for sampling lo­cations and di.erent phenotypes. Con.dence calculated on the basis of 1000 replications, n.z. – non signi.cant, * – 95–99 % con.dence, ** – 99,0–99,99 % con.dence, *** – >99,99 % con.dence. Sta­tistically signi.cant values mark pair of nonidentical populations, values for pairs with at least one population with less than 10 individuals in parentheses. Lokacija Bukovica Krupac Lad -anica Ljuta -Daji´ci Glavatiˇcevo Jablanica Ocrkavlje Rakitnica Bukovica Krupac Lad -anica Ljuta -Daji´ci Glavatiˇcevo Jablanica Ocrkavlje Rakitnica (***) (**) (n.z.) (n.z.) (***) (*) (***) (***) 0,5191 (n.z.) *** (n.z.) *** (*) * *** 0,4695 0,0220 (*) (n.z.) (*) (n.z.) (n.z.) (** ) 0,0382 0,3533 0,2858 (n.z.) *** (***) *** *** 0,3996 0,1572 0,0758 0,1057 (n.z.) (n.z.) (n.z.) (n.z.) 0,2418 0,1446 0,4695 0,1600 -0,1307 (**) *** *** 0,6376 0,5472 0,5270 0,5256 0,5031 0,2805 (***) (***) 0,4822 0,0315 0,0311 0,3492 0,1317 0,4822 0,5252 *** 0,4012 0,0926 0,0960 0,2867 0,0739 0,1340 0,4250 0,1161 Fenotip Glavatica Kosor Mehkoust Potoˇcna Zubatak Glavatica Kosor Mehkoustna Potoˇcna Zubatak (n.z.) (***) (n.z.) (*) 0,0373 *** *** (*) 0,3202 0,1916 *** (**) 0,0235 0,0978 0,4158 (***) 0,2816 0,3447 0,4430 0,4203 Neravnoteˇzje zaradi vezave genetskih markerjev na kromosomih (linkage disequilib­rium) smo doloˇcali na vseh vzorcih. V analizi s 5000 permutacijami smo preverjali vezanost jedrnih markerjev v vseh moˇznih parih. V veˇcini kombinacij smo z manj kot 0,01 % tveganja sprejeli hipotezo, da markerji niso vezani. Vrednosti, ki niso bile enake 0 so bile: BFRO 002 – Ssa197 1,04 %, BFRO 002 – Str24 0,02 %, Ssa197 – Str24 0,48 % in Ssa197 – Str591 0,04 %. 5 RAZPRAVA 5.1 TRENUTNO STANJE V POREˇCJU NERETVE Naˇsa opaˇzanja in rezultati analiz kaˇzejo, da je v zgornjem delu poreˇcja (nad hidroelek­trarno pri Jablanici), kjer smo vzorˇcili v letih 1999 in 2001, vpliv vlaganj najmanjˇsi. V poreˇcje poteka vlaganje S. trutta, Salvelinus alpinus, Thymallus thymallus in On­corhynchus mykiss (Hamˇzi´c, 2002), vendar smo v zgornjem delu zasledili samo vlaganje atlantske in donavske linije S. trutta. Prisotnost teh postrvi je opazna na posameznih lokacijah, namreˇc v Bukovici, Ljuti in Rakitnici. V sami Neretvi (lokacija Glavatiˇcevo), zlasti na teˇzko dostopnih lokacijah (Ocrkavlje in Lad -anica), je takih primerkov zane­marljivo malo. Prevladujejo potoˇcne postrvi jadranske linije (Slika 2). V spodnjem toku Neretve poteka tudi projekt gojenja teh rib v ribogojnici ”NORFISH–Blagaj”, zato bo verjetno kmalu priˇslo do vlaganja teh rib v druge dele poreˇcja Neretve. Nedavno so v poreˇcju Neretve vzorˇcili tudi drugi raziskovalci, ki so priˇsli do sklepa, da glavatice v zgornjem delu ni veˇc (Delling, 2003), v spodnjem delu pa so samo ˇse posamezni primerki (Hamˇzi´c, 2002). Med naˇsimi vzorci smo naˇsli posamezne primerke z opaznim marmoriranim vzorcem, ki je veˇcinoma kombiniran s pigmentacijo, znaˇcilno za potoˇcno postrv. Predvidevamo, da je marmorirana postrv v poreˇcju Neretve na robu izumrtja zaradi nedovoljenih metod ribolova, zajezitve rek in hibridizacije z drugimi salmonidi. V bliˇzini Glavatiˇcevega so raziskovalci (Delling, 2003) naˇsli primerke, ki so jih opisali pod zaˇcasnimi imeni S. cf. montenigrinus in S. cf. farioides. Glede na kriterije, ki smo jih uporabili pri doloˇcanju fenotipov, so primerki S. cf. montenigrinus (Slika 6) in S. cf. farioides (Slika 7) kriˇzanci S. obtusirostris × S. trutta. Uspeˇsno kriˇzanje teh dveh vrst je bilo potrjeno v ribogojnici (Kosori´c in Vukovi´c, 1968). Kriˇzancem domaˇcini pravijo kosorji in so v reki prisotni ˇze vsaj zadnjih 50 let. 5.2 UVRSTITEV SALMONIDOV IZ POREˇ CJA NERETVE V FILOGEOGRAFSKE LINIJE PO BERNATCHEZU Na osnovi 5’ dela kontrolne regije mtDNA salmonidi iz poreˇcja Neretve sodijo v jadran­sko, donavsko in atlantsko .logeografsko linijo S. trutta po Bernatchezu (2001). Odkrili smo nov haplotip, ki glede na primerjavo z drugimi haplotipi sodi v jadransko linijo, zato smo ga poimenovali AdN. Haplotipov marmoratus linije v poreˇcju nismo naˇsli med 206 analiziranimi vzorci. V reki so prisotne posamezne glavatice (S. marmoratus), postrvi z marmoriranim vzorcem. Genetsko ˇciste populacije S. marmoratus iz poreˇcja Soˇce (Slovenija) imajo haplotipe marmoratus (Ma) linije (Snoj in sod., 2000). Haplotipi Ma so prisotni tudi v rekah, ki se izlivajo v morje severno od Neretve, namreˇc v Krki (Hrvaˇska) in v rekah Acheloos, Moronos in Nestos (Grˇcija), ki se izlivajo v morje juˇzno od Neretve (Bernatchez in sod., 2001; Apostolidis in sod., 1997). V teh rekah ni marmoriranih postrvi. Zaradi geografske lege med Krko in reko Acheloos dopuˇsˇcamo moˇznost, da je marmoratus linija kolonizirala tudi poreˇcje Neretve, vendar so zanjo znaˇcilni haplotipi prisotni z nizko frekvenco. Haplotip Soxy je znaˇcilen za S. obtusirostris (Snoj in sod., 2000a) in ne sodi v .logenijo po Bernatchezu (2001). 5.3 RAZˇSIRJENOST IN IZVOR LINIJ mtDNA 5.3.1 Jadranska linija V poreˇcju prevladujeta dva haplotipa jadranske linije S. trutta (67 % vseh vzorcev). Potoˇcnih postrvi te linije ne vzrejajo v ribogojnicah in jih ne vlagajo v reke, prisotne pa so tudi v bliˇznjih hrvaˇskih rekah Krki in Zrmanji, ki se izlivata v vzhodno Jadransko morje (Odak, 2004), zato sklepamo, da je jadranska linija S. trutta avtohton salmonid poreˇcja Neretve. To je v nasprotju s predhodno raziskavo, ki temelji na samo dveh vzorcih in po kateri v poreˇcju Neretve prevladuje donavska linija (Bernatchez, 2001). Haplotip AdN je bolj razˇsirjen od dveh haplotipov jadranske linije v poreˇcju (83,3 % vseh haplotipov jadranske linije) in po do zdaj znanih podatkih ni prisoten izven poreˇcja Neretve. Manj pogost je haplotip Ad-s3 (16,7 % haplotipov jadranske linije v poreˇcju Neretve), ki je prisoten tudi v rekah v Grˇciji in na Korziki (Bernatchez, 2001). V nukleotidnem zaporedju 5’ konca kontrolne regije se haplotipa razlikujeta v ˇstirih nukleotidnih zamenjavah. Obiˇcajno lahko razliˇcne haplotipe, ki so prisotni na nekem podroˇcju, razporedimo v vrstni red tako, da se sosednja haplotipa razlikujeta v enem nukleotidu (Melkiˇc, 2000). Ponujamo dve razlagi za odsotnost vmesnih haplotipov med AdN in Ad-s3 v poreˇcju Neretve: • haplotipa AdN in Ad-s3 sta v poreˇcje priˇsla z dvema loˇcenima naselitvenima valovoma jadranske linije S. trutta, • zaradi nakljuˇcnega genetskega drsa se vmesne stopnje niso ohranile oziroma so prisotne v poreˇcju v zelo majhnem deleˇzu. 5.3.2 Vneˇsene linije Prisotnost haplotipov atlantske (At) in donavske (Da) linije (19,9 % vseh vzorcev) S. trutta v poreˇcju je posledica vlaganja. Potoˇcne postrvi atlantske linije smo naˇsli v dveh pritokih Neretve, v Bukovici, kjer so jih vlagali zadnjiˇc leta 2001, in v Ljuti, kjer je ribogojnica, v kateri gojijo postrvi atlantske linije, ki obˇcasno uhajajo v reko. En sam primerek z atlantskim haplotipom v Neretvi pri kraju Glavatiˇcevo je verjetno posledica migracije iz teh dveh potokov. Naˇsli smo 26 primerkov s haplotipi donavske linije, vendar smo jih 19 od teh naˇsli v Rakitnici. Glede na jedrne markerje populacija v Rakitnici ni v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju, zato predvidevamo, da so v Rakitnico nedavno vlagali potoˇcne postrvi donavske linije, posamezni primerki pa so migrirali po toku navzdol v Neretvo. Ker ni podatkov o vnaˇsanju postrvi v Rakitnico, naselitev iz Neretve pa zaradi slapov ni mogoˇca, obstaja tudi moˇznost, da je priˇslo do sladkovodne povezave Rakitnice z donavskim poreˇcjem v obdobju po zadnji poledentvi (Durmi´c, 2004). Za zdaj ni trdnih podatkov o vzpostavitvi take povezave, raziskave o genetskih znaˇcilnostih postrvi na drugi strani razvodja ˇse ni bilo. Zaradi selekcije na razmere v ribogojnicah je stopnja preˇzivetja vloˇzenih rib nizka, zato je vpliv vlaganj na divje populacije majhen. Ob dolgotrajnem vlaganju pride do introgresije genov, pri ˇcemer je vpliv vloˇzenih samcev veˇcji kot vpliv vloˇzenih samic (Hansen in sod., 2000). Deleˇz jedrnih markerjev vloˇzenih potoˇcnih postrvi v primeru kriˇzanja z avtohtonimi postrvmi je zato lahko veˇcji od 19,8 %, kolikor znaˇsa deleˇz At in Da mtDNA haplotipov v poreˇcju Neretve. 5.3.3 Haplotip Soxy Haplotip Soxy je znaˇcilen za S. obtusirostris, vendar se ta vrsta kriˇza z S. trutta, zato je prisoten tudi pri fenotipskih kriˇzancih in pri potoˇcnih postrveh. Zaradi introgresije v S. trutta deleˇz haplotipa Soxy ni dober marker za oceno deleˇza S. obtusirostris v poreˇcju. Deleˇz mehkoustnih postrvi smo morda podcenili tudi zaradi ˇsibkega agregata, ki smo ga uporabljali pri vzorˇcenju (1,5 kW). Z moˇcnejˇsim agregatom bi dosegli globje vode, ki so naravni habitat teh postrvi. Naˇsli smo 27 rib s haplotipom Soxy (13,1 %). 17 od 23 primerkov, ki smo jih glede na fenotip oznaˇcili za mehkoustno postrv, ima ta haplotip. Predvidevamo, da smo zlasti majhnim primerkom pogosto pripisali napaˇcen fenotip. Glede na rezultate FCA imajo vsi vzorci gruˇce S. obtusirostris (18 primerkov) haplotip Soxy, en Soxy se nahaja v gruˇci S. obtusirostris × S. trutta, ostalih 8 pa v gruˇci avtohtonih S. trutta. Zanimivo je, da populacija mehkoustne postrvi iz ˇska) nima Zrnovnice in Jadra (HrvaˇmtDNA haplotipa, ki bi bil enak ali podoben haplotipu Soxy. Postrvi teh dveh potokov imajo haplotip, ki sodi v jadransko linijo (Odak, 2004). Populacije mehkoustne postrvi iz Krke (Hrvaˇska) in Zete (ˇse niso raziskane. Po do zdaj znanih genetskih Crna Gora) ˇin morfoloˇskih posebnostih mehkoustne postrvi iz poreˇZrnovnice cij Neretve, Jadra in ˇsklepamo, da je to endemiˇcna predglacialna vrsta, ki je verjetno kot prvi salmonid naselila podroˇcje zahodnega Balkana. 5.4 VRSTE SALMONIDOV V POREˇCJU NERETVE KOT ESU Ugotovili smo, da so salmonidi iz poreˇcja Neretve genetsko zelo strukturirani. Groba razdelitev na fenotipe, kot smo jo uporabili pri opisu vzorcev, se priˇcakovano ne pokriva povsem z rezultati FCA. ˇzimo, Ce pa rezultate FCA, fenotipe in mtDNA haplotipe zdruˇlahko doloˇcimo 4 osnovne gruˇce (Slika 19). Te gruˇce smo poimenovali z imeni, kot so jih uporabili sistematiki, ki so jih prvi opisali kot vrste. Ker njihovi kriteriji za opisovanje vrst med seboj niso skladni, bomo v nadaljevanju vrste obravnavali v najˇsirˇsem smislu, torej kot evolucijsko pomembne enote (ESU). Evolucijski koncept smo uporabili, ker v skladu z bioloˇskim poreˇcje naseljuje samo ena vrsta. Vsi ESU–ji se namreˇc kriˇzajo in imajo plodne potomce. Filogenetski koncept zgolj na osnovi mtDNA pa ni uporaben, ker ne pojasnjujejo dovolj dobro razliˇcnih fenotipov, ki smo jih naˇsli v poreˇcju. Simpatriˇcne vrste med seboj razlikujemo z znaˇcilnimi (diagnostiˇcnimi) markerji, pri alopatriˇcnih pa obstaja moˇznost, da imajo geografsko oddaljene populacije razliˇcnih vrst lahko iste znaˇcilne markerje (She in sod., 1987). Edini z jezovi in slapovi loˇceni pop­ulaciji, za kateri obstaja moˇznost alopatrije, sta populacija zubatkov (lokacija Neretva Jablanica–Metkovi´c) in populacija postrvi iz Rakitnice. Polimor.zma na genih za rastni hormon in laktat dehidrogenazo smo izbrali, da bi lahko ocenili ˇcistost jadranske linije (alel C gena za rastni hormon) in mehkoustne postrvi (alel MP gena za laktat dehidrogenazo). Skupaj z mikrosatelitnimi aleli, ki so speci.cni za posamezne ESU je oˇcitno, da vzorci, ki se po FCA analizi nahajajo med gruˇcami ali pa so v gruˇci kosorjev, praviloma niso heterozigoti znaˇcilnih alelov drugih gruˇc. To pomeni, da vsi kriˇzanci S. obtusirostris × S.trutta niso generacija F1 starˇsevskih ESU. Mitohondrijska zaporedja, s katerimi najlaˇzje de.niramo vrste po .logenetskem kon­ceptu, niso bila vkljuˇcena v PCA. Razloga za to sta dva: • razlike po spolu v uspeˇsnosti razmnoˇzevanja vloˇzenih postrvi (Hansen in sod., 2000) in • pretirana poenostavitev genetske raznolikosti (Zhang in Hewitt, 2003), v tem primeru bi bila analiza pristranska, ker bi morali haploidna zaporedja mtDNA obravnavati drugaˇce kot diploidne jedrne markerje v FCA. 5.4.1 S. obtusirostris, S. trutta in njuni kriˇzanci Kosorji so plodni kriˇzanci S. obtusirostris in S. trutta. Samo s pomoˇcjo mtDNA hap­lotipov ni moˇzno ugotoviti plodnosti ali neplodnosti kriˇzancev. Za mehkoustno postrv smo doloˇcili znaˇcilne genetske markerje (Preglednica 8). V primeru, da je F1 generacija kriˇzancev S. obtusirostris × S. trutta neplodna, bi morali biti vsi kriˇzanci heterozigotni na lokusih LDH, BFRO 002, str24 in str591. Ker niso, pomeni, da so kriˇzanci plodni, saj ne pripadajo samo F1 generaciji. Teˇzava pri natanˇcnejˇsi ˇstudiji kriˇzanja je pomanjkanje neintrogresiranih starˇsevskih populacij. V raziskavi nismo naˇsli lokacije, kjer bi bile avtohtone potoˇcne postrvi v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju, mehkoustna postrv pa ˇzivi simpatriˇcno s potoˇcno. Samo populaciji vloˇzenih potoˇcnih postrvi atlantske linije iz Bukovice in Ljute sta bili v Hardy–Weinbergovem ravnoteˇzju. Opazili smo, da so posamezni aleli, speci.ˇcni za mehkoustno postrv, prisotni tudi pri potoˇcni postrvi, medtem ko obratnih primerov ni. Tudi posamezni haplotipi Soxy so prisotni pri primerkih, ki so glede na jedrne markerje potoˇcne postrvi, obratnih primerov ni. Glede na razpoloˇzljive vzorce sklepamo, da introgresija poteka iz smeri mehkoustnih postrvi do potoˇcnih postrvi. Haldaneovo pravilo pri ribah bi pomenilo plodne samice in sterilne samce kriˇzancev. Ker se tudi mtDNA deduje maternalno, tega s to raziskavo ne moremo dokonˇcno potrditi. Vsekakor pa je veˇcina kosorjev kriˇzancev tipa >S. obtusirostris × +S. trutta. Kosori´c in Vukovi´c (1969) sta kosorje generacije F1 dobila enako uspeˇsno pri obeh kombinacijah starˇsev. Manj pogoste samice kosorjev tipa +S. obtusirostris × >S. trutta se kot kaˇze zelo uspeˇsno kriˇzajo dalje z vrsto S. trutta, zato introgresija haplotipa Soxy v potoˇcno postrv. Po Allendorfu in sod. (2001) ne moremo jasno opredeliti tipa kriˇzanja. Verjetno je pri­soten selekcijski pritisk, ki ohranja genetsko ˇcistost mehkoustne postrvi (tip 3, naravna hibridna cona), prihaja do introgresije genetskih markerje, znaˇcilnih za mehkoustno postrv, v potoˇcno postrv (tip 2, naravna introgresija). Glede na simpatrijo starˇsevskih vrst, ki se je zaˇcela ˇse pred poledenitvami (Bianco, 1990), ni verjetno, da grozi zlitje v nov naravni hibridni takson (tip 1). Glede na fotogra.je iz morfometriˇcne raziskave (Delling, 2003) sklepamo, da sta S. cf. montenigrinus in S. cf. farioides kosorja. Glede na lokacije, kjer smo naˇsli kosorje je oˇcitno, da jim ustreza okolje mehkoustnih postrvi, vendar se nahajajo tudi v manjˇsih potokih s hitrejˇso vodo, torej v okolju potoˇcnih postrvi. 5.4.2 Vloˇzene postrvi v Rakitnici V Rakitnici je edina populacija, v kateri je opazno kriˇzanje vloˇzene donavske in avto­htone jadranske linije S. trutta. Najverjetneje sta za donavsko linijo znaˇcilna markerja alela 120 (BFRO 002) in 188 (Str591). Ker nimamo referenˇcne neintrogresirane popu­lacije donavske linije, ki so jo vlagali v Rakitnico, smo ta dva markerja dobili po primer­javi s populacijo iz Neretve pri Ocrkavljah, kjer nismo opazili vlaganja potoˇcne postrvi donavske linije. Vpliv teh dveh markerjev ni tako moˇcan, da bi dobili gruˇco po FCA, ki bi ustrezala donavski liniji. Omenjena alela sta lahko tudi posledica nakljuˇcnega genetskega drsa v zaprtem okolju, v katerega slap prepreˇcuje migracijo rib iz Neretve. Kljub slapovom smo v Rakitnici naˇsli en alel 133 (BFRO 001), kar je bil edini za mehkoustne postrvi znaˇcilen genetski marker v tem potoku. Deleˇz obeh linij v Rakitnici smo ugotavljali s pomoˇcjo mtDNA in gena GH2C. V Rakitnici je deleˇz donavskega haplotipa Da-s1 42 %, deleˇz alela G na lokusu GH2C pa G 24,4 %. Vpliv mehkoustne postrvi na deleˇz alela G je glede na druge genetske markerje, znaˇcilne za mehkoustno postrv zelo majhen. Razliko med frekvenco alela G in frekvenco haplotipa Da-s1 lahko razloˇzimo na dva naˇcina: • V Rakitnici je bila prisotna postrv jadranske linije z majhnim deleˇzem meh­koustne postrvi. V reko so vlagali postrvi donavske linije, zato ima danaˇsnja populacija velik deleˇz haplotipa Da-s1 in velik deleˇz alela G. Vlaganje rib ni bilo dokumentirano. • V Rakitnici je v nedavni geoloˇski preteklosti po zadnji poledenitvi morda priˇslo do sladkovodne povezave z donavskim poreˇcjem. V tem primeru so danaˇsnje razlike v deleˇzih alelov gena za rastni hormon in mtDNA haplotipih posledica nakljuˇcnega genskega drsa. 5.4.3 Posledice vlaganj v poreˇcje Neretve Vlaganja so omejena na posamezne lokacije, njihova uspeˇsnost pri razmnoˇzevanju izven ribogojnic in stopnja kriˇzanja z avtohtonimi postrvmi je nizka. Vloˇzene postrvi smo naˇsli v Bukovici, v Ljuti pa postrvi, ki so verjetno pobegnile ali bile izpuˇsˇcene iz bliˇznje ribogojnice. V teh dveh potokih nismo naˇsli kriˇzancev vloˇzenih in avtohtonih postrvi. Edino populacijo kriˇzancev vloˇzene donavske in avtohtone jadranske linije smo naˇsli v Rakitnici. 5.4.4 S. marmoratus in S. dentex Po FCA smo dobili gruˇco s primerki zubatka in nekaterimi glavaticami. Kljub oˇcitni razliki v obarvanosti pa genetskih razlik med tema dvema fenotipoma nismo naˇsli, zato smo ju po FCA obravnavali skupaj. Skupno je v gruˇci 8 primerkov, nekateri imajo jedrne markerje, znaˇcilne za S. obtusirostris, torej so kriˇzanci. Haplotipov Ma in alela 124 (BFRO 002), ki sta znaˇcilna za S. marmoratus, ki ˇzivi v Posoˇcju in v rekah severne Italije, v Neretvi nismo naˇsli. Naˇsli smo en sam alel 124 (BFRO 002), vendar pri vloˇzeni postrvi v Bukovici. Marmorirane postrvi in zubatki iz Neretve imajo haplotip jadranske linije (AdN), ena glavatica pa haplotip Soxy. Moˇzne razlage za odsotnost mtDNA in jedrnih genetskih markerjev S. marmoratus, kot jih poznamo v Posoˇcju in severni Italiji, so: • S. marmoratus je v preteklosti naseljevala tudi Neretvo (tako kot reke severno in juˇzno od nje), vendar je v njej redka ali pa je veˇcina zanjo znaˇcilnih markerjev izginila zaradi kriˇzanja, ostal pa je marmoriran vzorec. • S. marmoratus je v preteklosti kolonizirala tudi Neretvo, zaradi nakljuˇcnega genskega toka ima druge znaˇcilne markerje kot S. marmoratus v Posoˇcju. • Glavatica iz Neretve ni S. marmoratus, ampak je postrv jadranske linije, ki je marmoriran vzorec razvila neodvisno od soˇske postrvi, na podoben naˇcin kot postrvi atlantske linije iz reke Otre na Norveˇskem (Delling, 2003). Treba je poudariti, da so bili zubatki ulovljeni na zelo oddaljenih lokacijah glede na vzorce glavatice, veˇcinoma v bliˇzini Mostarja, zato obstaja moˇznost homoplazije mikrosatelitnih markerjev, zaradi ˇcesar so zubatki in glavatice v isti gruˇci po FCA. Genetska podobnost postrvi v tej gruˇci se lepo sklada z opisanimi migracijami S. marmoratus iz spodnjega v zgornji del Neretve, zato obstaja tudi moˇznost, da je ra­zliˇcna obarvanost posledica razliˇcnega okolja v spodnjem in zgornjem delu poreˇcja. Za preuˇcevanje genetskih razlik med zubatkom, glavatico in soˇsko postrvijo, ˇce so to sploh samostojni taksoni, je nujno veˇcje ˇstevilo neintrogresiranih vzorcev. 5.5 OHRANITEV BIOTSKE RAZNOLIKOSTI Ugotovili smo, da vlaganje postrvi na naravno populacijo S. trutta jadranske linije v zgornjem delu poreˇcja (nad Konjicem) nima veˇcjega uˇcinka. Izjema je potok Rakitnica, v kateri je prisotna populacija kriˇzancev jadranske in donavske linije. Mehkoustna postrv se lahko kriˇza s potoˇcno postrvjo, vendar se ohranja neintrogresirana populacija. Primerki glavatice in zubatkov so redki in skriˇzani s potoˇcno in mehkoustno postrvjo. V skladu s trendom ohranjanja biotske raznovrstnosti in zmanjˇsevanju vnaˇsanja tujih vrst so najenostavnejˇsi in najcenejˇsi predlogi za dolgoroˇcno ohranitev biotske razno­likosti v poreˇcju Neretve naslednji: • zakonsko priznanje in zaˇsˇcita avtohtone jadranske linije S. trutta, • popolna prepoved vlaganja postrvi na podroˇcja, kjer do sedaj vlaganja ni bilo, torej zaˇsˇcita genetsko neintrogresiranih potoˇcnih postrvi, • gojenje in vlaganje avtohtone S. trutta v poreˇcje in • izboljˇsanje varoval, ki prepreˇcujejo pobeg neavtohtonih postrvi iz ribogojnic. Mehkoustna postrv in kosorji so ˇse dokaj neraziskani. Pozornosti sta vredni zlasti njuni ekoloˇski vlogi, genetska podobnost z drugimi populacijami mehkoustnih postrvi in sam mehanizem kriˇzanja in selekcije kriˇzancev. Za slednje je potrebno nadaljevanje poskusa kriˇzanja, ki sta ga zaˇcela Kosori´c in Vukovi´c (1969). Nujno je tudi spremljanje popu­lacije kosorjev skozi daljˇse ˇcasovno obdobje zaradi moˇznosti vpliva okolja in ˇcloveka na njihovo ˇstevilˇcnost in morebitne negativne posledice na ohranitev obeh starˇsevskih vrst. Glede na redkost glavatice in zubatka in na zajezitev reke je poloˇzaj kritiˇcen. Glede na stalno upadanje ˇstevila glavatic je verjetno edina reˇsitev izlov ˇcim veˇcjega ˇstevila glavatic in zubatkov in njihovo razmnoˇzevanje in gojenje v ribogojnici. Na osnovi malo veˇcjega ˇstevila vzorcev je moˇzno nadaljujevanje genetskih raziskav in pojasnitev sorodnosti ali identiˇcnosti obeh vrst in njihovo sorodnost s soˇsko postrvjo. Dolgoroˇcna reˇsitev glavatice in zubatka pa je precej draˇzja, nujna je obnovitev naravnega okolja in ponovne vzpostavitve poti, ki bi omogoˇcala migracije preko zajezitev med spodnjim in zgornjim delom Neretve. 6 POVZETEK Poreˇcje Neretve ima zaradi svoje geografske lege med jadranskim, egejskim in ˇcrnomor­skim povodjem in vzpostavljanja sladkovodnih povezav med njimi v geoloˇski preteklosti raznoliko ihtiofavno. Pozornost sistematikov so vzbudili predvsem morfoloˇsko razliˇcni salmonidi, v Neretvi so naˇsli kar pet vrst, S. dentex, S. farioides, S. marmoratus, S. cf. montenigrinus, S. obtusirostris in S. trutta. V poreˇcje so vlagali tudi druge linije S. trutta, ki se od avtohtonih razlikujejo predvsem po pigmentaciji. Kriˇzanci med vloˇzenimi in avtohtonimi S. trutta, kot tudi med drugimi salmonidi, so bili v preteklosti opaˇzeni, vendar veˇckrat prezrti. Zaradi nejasnega taksonomskega statusa S. dentex, S. farioides in S. cf. montenigrinus, kot tudi zaradi primerjave neretvanske s soˇsko S. marmoratus, smo v raziskavi poskuˇsali doloˇciti genetske razlike med salmonidnimi vrstami v poreˇcju Neretve. Primerke smo tipizirali na ˇstirih mikrosatelitnih lokusih, dveh nekodirajoˇcih delih jedrnih genov in na 5’ delu kontrolne regije mtDNA. Ugotovili smo, da v poreˇcju prevladuje jadranska .logeografska linija potoˇcne postrvi, najveˇcji deleˇz ima haplotip z oznako AdN. Vloˇzene in mehkoustne postrvi imajo znaˇcilne haplotipe, medtem ko zubatki in glavatice nimajo znaˇcilnega haplotipa. Raznolikost mtDNA haplotipov je posledica veˇckratne kolonizacije poreˇcja v obdobju do konca zad­nje poledenitve in vlaganj v preteklem stoletju preko sladkovodnih povezav s sosednjimi poreˇcji. Jedrne markerje smo vkluˇcili v faktorielno korespondenˇcno analizo (FCA), ki je vzorce grupirala na naˇcin, ki pojasni 22 % njihove variance. Rezultate FCA smo primerjali s haplotipi mtDNA in fenotipskimi oznakami posameznih primerkov. Odkrili smo, da se rezultati FCA ujemajo z vloˇzenimi in avtohtonimi linijami S. trutta, S. obtusirostris, kriˇzanci S. obtusirostris × S. trutta in s skupino vzorcev, ki po fenotipu ustrezata S. marmoratus in S. dentex. Ugotovili smo, da so primerki iz poreˇcja Neretve, zaˇcasno poimenovani S. cf. montenigrinus in S. cf. farioides plodni kriˇzanci S. obtusirostris × S. trutta. Njihov vpliv na simpatrijo starˇsevskih vrst ˇse ni raziskan. Vlaganje postrvi v zgornjem delu poreˇcja nima veˇcjega vpliva na avtohtono jadransko linijo, izjema je reka Rakitnica. V njej ˇzivi meˇsana populacija donavske in jadranske linije. Ni znano, ali je donavska linija v Rakitnico vloˇzena ali je priˇsla po sladkovodni povezavi z donavskim poreˇcjem. Redkost zubatkov S. dentex in glavatic S. marmoratus ter njihovo kriˇzanje z drugimi vrstami oteˇzuje njihovo natanˇcnejˇso opredelitev z genetskimi markerji. Glede na FCA obstaja moˇznost, da so zubatki in glavatice predstavniki iste evolucijsko pomembne enote, ki nima genetskih markerjev, znaˇcilnih za S. marmoratus iz Posoˇcja in severne Italije. Priporoˇcamo njihovo zaˇsˇcito in prenos v ribogojnice dokler se njihov taksonom­ski status ne pojasni oziroma dokler se ne vzpostavi nazaj njihovo naravno okolje. 7 SUMMARY The River Neretva drainage is located between the Adriatic, Black sea and Aegean river systems. There were connections between these systems in geological history, resulting in diverse and numerous .sh species in the region. Morphologicaly di.erent salmonides were found in the River Neretva: S. dentex (zubatak), S. farioides, S. marmoratus (glavatica), S. cf. montenigrinus, S. obtusirostris (soft mouth trout) and S. trutta (brown trout). Stocking of S. trutta of Danubian and Atlantic lineages has caused in hybridisation of native and stocked brown trout. Hybridisation of other salmonides was also observed, but often ignored. Taxonomic status of S. dentex, S. farioides and S. cf. montenigrinus is unclear, S. marmoratus from the River Soˇca was not compared with S. marmoratus from the River Neretva, yet. In this survey we tried to determine genetic di.erences between salmonid species in the River Neretva drainage. Sampled .sh were genotyped using four microsatellite loci, two noncoding sections of nuclear genes and 5’ end of control region of mtDNA. Adriatic phylogeogra.c lineage of brown trout dominates the drainage, especially AdN haplotype. Stocked and soft mouth trout have characteristic haplotypes, while zubatak and glavatica don’t. The diversity of mtDNA haplotypes is a result of repeated coloni­sation of the drainage in the last period of glaciations and of stocking in the recent history. Nuclear markers were included in factorial correspondence analysis (FCA) that clus­tered individuals and explained 22 % of their total variance. FCA results were com­pared with mtDNA haplotypes and phenotypes. Clusters obtained with FCA match stocked and native S. trutta, S. obtusirostris, S. obtusirostris × S. trutta hybrids and a small number of S. marmoratus and S. dentex. The last two cannot be distinguished one from another using molecular markers. Individuals temporarily named S. cf. mon­tenigrinus and S. cf. farioides were identi.ed as fertile S. obtusirostris × S. trutta hybrids. The apparent sympatry of parental taxa is not fully explained. Stocking of brown trout does not signi.cantly in.uence the native brown trout in the upper part of the River Neretva drainage. The River Rakitnica is an exception and is inhabited by mixed population of the Danubian and Adriatic lineages of brown trout. It is not clear whether this is the consequence of stocking or freshwater connection with the River Danube drainage. S. dentex and S. marmoratus can be found in the River Neretva only in small numbers. Their scarcity and hybridisation with other taxa make it almost impossible to charac­terise the two species with genetic markers. There is a possibility that S. dentex and S. marmoratus are one unique evolutionary signi.cant unit that does not share genetic markers with S. marmoratus from the River Soˇca drainage. We recommend protection of S. dentex and S. marmoratus in the River Neretva and their transfer into hatcheries until their taxonomic status is clari.ed and their natural habitat restored. 8 VIRI Allendorf F.W., Leary R.F., Spruell P., Wenburg J.K. 2001. The problems with hy­brids: setting conservation guidelines. Trends in Ecology & Evolution, 16, 11: 613–622 Allendorf F.W., Thorgaard G.H. 1984. Tetraploidy and the evolution of salmonid .shes. V: Evolutionary genetics of .shes. Turner B.J. (ed.). New York, Plenum Press: 1–53 Angers B., Bernatchez L. 1997. Complex evolution of a salmonid microsatellite locus and its consequences in inferring allelic divergence from size information. Molec­ular Biology and Evolution, 14, 3: 230–238 Angers B., Gharbi K., Estoup A. 2002. Evidence of gene conversion events between paralogous sequences produced by tetraploidization in Salmoniae .sh. Journal of Molecular Evolution, 54: 501–510 Apostolidis A.P., Triantaphyllidis C., Kouvatsi A., Economidis P.S. 1997. Mitochon­drial DNA sequence variation and phylogeography among Salmo trutta L. (Greek brown trout) populations. Molecular Ecology, 6: 531–542 Avise J.C. 2000. Phylogeography: the history and formation of species. Cambridge, Massachusetts, Harvard University Press: 447 str. Banarescu P. 1973. Origin and a.nities of the freshwater .sh fauna of Europe. Ichthy­ologia, 5, 1: 1–8 Baroiller J.–F., Guiguen Y., Fostier A. 1999. Endocrine and environmental aspects of sex di.erentiation in .sh. Cellular and Molecular Life Sciences, 55: 910–931 Behnke R.J. 1968. S¨ußwasser.sche der T¨urkei. 6. Teil. A new subgenus and species of trout, Salmo (Paltysalmo) platycephalus, from southcentral Turkey, with com­ments on the classi.cation of the subfamily Salmoninae. Mitteilungen des Ham­burgischen Zoologischen Museumsinstitutes, 66: 1-15 Belkhir K., Borsa P., Chikhi L., Raufaste N., Bonhomme F. 2002. GENETIX: version 4.04: logiciel sous Windows TM pour la genetique des populations. Montpellier, Universite de Montpellier II, Laboratoire Genome, Populations, Interactions. Bernatchez L., Guyomard R., Bonhomme F. 1992. DNA variation of the mitochon­drial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations. Molecular Ecology, 1: 161–173 Bernatchez L., Danzmann R.G. 1993. Congrugence in control–region sequence and restriction–site variation in mitochondrial DNA of brook charr (Salvelinus fonti­nalis Mitchill). Molecular biology and Evolution, 10: 1002–1014 Bernatchez L., Osinov A. 1995. Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most eastern native range based on mitochondrial DNA and nuclear gene variation. Molecular Ecology, 4: 285–297 Bernatchez L. 2001. The evolutionary history of brown trout (Salmo trutta L.) in­ferred from phylogeographic, nested clade, and mismatch analyses of mitochon­drial DNA variation. Evolution, 55, 2: 351–379 Berrebi P., Povˇz M., Jesenˇsek D., Cattaneo–Berrebi G., Crivelli A.J. 2000. The genetic diversity of native, stocked and hybrid populations of marble trout in the Soca river, Slovenia. Heredity, 85: 277–287 Bianco P.G. 1990. Potential role of the palaeohistory of the Mediterranean and Para­tethys basins on the early dispersal of Euro–Mediterranean freshwater .shes. Ichthyological Exploration of Freshwaters, 1, 2: 167–184 Bibber–Klemm S. 1995. Legal aspects of the conservation of endemic freshwater .sh in the northern Mediterranea region. Biological Conservation, 72, 2: 321–334 Bojˇci´c C., Debeljak L., Vukovi´c T., Jovanovi´c–Krˇsljanin B., Apostolski K., Rˇzaniˇca­nin B., Turk M., Volk S., Drecun -c D., Hristi´-zur D., Habekovi´c D., Fijan N., PaˇK., Bunjevac I., Maroˇsevi´-Slatkovodno ribarstvo. Zagreb, Poslovna c D. 1982. zajednica slatkovodnog ribarstva Jugoslavije, Ribozajednica, Jugoslavenska me­ dicinska naklada: 605 str. Boecklen W.J., Howard D.J. 1997. Genetic analysis of hybrid zones: numbers of mark­ers and power of resolution. Ecology, 78, 8: 2611–2616 Clarke B., Johnson M.S., Murray J. 1998. How ’molecular leakage’ can mislead us about island speciation. V: Evolution on islands. Grant P.R. (ed.). New York, Oxford University Press: 181–195 Consuegra S., Garcia de Leaniz C., Serdio A., Gonzales Morales M., Straus L.G., Knox D., Verspoor E. 2002. Mitochondrial DNA variation in pleistocene and modern atlantic salmon from the iberian glacial refugium. Molecular Ecology, 11: 2037– 2048 Cracraft J., 1989. Speciation and its ontology: the empirical consequences of alterna­tive species concepts for understanding patterns and processes of di.erentiation. V: Speciation and its consequences. Otte D., Endler J.A. (eds.). Sunderland, Massachusetts, Sinauer Associates: 28-59 Crivelli A.J. 1995. Are .sh introductions a threat to endemic freshwater .shes in the northern Mediterranean region? Biological Conservation, 72, 2: 311–320 Crivelli A.J., Maitland P.S. 1995. Future prospects for the freshwater .sh fauna of the north Mediterranean region. Biological Conservation, 72, 2: 335–337 Danzmann R.G., Ihssen P.E. 1995. A phylogeographic survey of brook charr (Salveli­nus fontinalis) in Algonquin Park, Ontario based upon mitochondrial DNA vari­ation. Molecular Ecology, 4, 6: 681–697 Delling B. 2002. Morphological distinction of the marble trout, Salmo marmoratus, in comparison to marbled Salmo trutta from river Otra, Norway. Cybium, 26, 4: 283–300 Delling B. 2003. Species diversity and phylogeny of Salmo with emphasis on southern trouts (Teleostei, Salmonidae). Doctoral dissertation. Stockholm, Department of zoology, Stockholm University: 142 str. DeMarais B.D., Dowling T.E., Douglas M.E., Minckley W.L., Marsh P.C. 1992. Ori­gin of Gila seminuda (Teleostei: Cyprinidae) trough introgressive hybridization: implications for evolution and conservation. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 89: 2747–2751 Durmi´c A. 2004. Populacija potoˇcne postrvi v Rakitnici je posledica sladkovodne povezave med jadranskim in ˇcrnomorskim povodjem. Sarajevo, Univerzitet u Sarajevu, Prirodno–matematiˇcki fakultet Sarajevo. adurmic@yahoo.com (osebni vir, feb. 2004) Eanes W.F. 1999. Analysis of selection on enzyme polymorphisms. Annual Review of Ecology and Systematics, 30: 301–326 Enciklopedija Leksikografskog zavoda. Zv. 4. 1968. 2. izdaja. Zagreb, Jugoslavenski leksikografski zavod: 506–506 . Ferguson A. 1994. Molecular genetics in .sheries: current and future perspectives. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 4: 379–383 Fernando P., Evans B.J., Morales J.C., Melnick D.J. 2001. Electrophoresis artefacts– a previously inrecognised cause of error in microsatellite analysis. Molecular Ecology Notes, 1: 325–328 Fraser D.J., Bernatchez L. 2001. Adaptive evolutionary conservation: towards a uni­.ed concept for de.ning conservation units. Molecular Ecology, 10: 274–2752 Fumagalli L., Snoj A., Jesenˇsek D., Balloux F., Jug T., Duron O., Brossier F., Crivelli A.J. 2002. Extreme genetic di.erenciation among the remnant populations of marble trout (Salmo marmoratus) in Slovenia. Molecular Ecology, 11, 12: 2711– 2716 Garcia–Marin J.–L., Utter F.M., Pla C. 1999. Postglacial colonization of brown trout in Europe based on distribution of allozyme variants. Heredity, 82: 46–56 GenBank. 2004. Maryland, Bethesda, NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html (30. apr. 2004) Giu.ra E., Bernatchez L., Guyomard R. 1994. Mitochondrial control region and pro­tein coding genes sequence variation among phenotypic forms of brown trout Salmo trutta from northern Italy. Molecular Ecology, 3: 161–171 Giu.ra E., Guyomard R., Forneris G. 1996. Phylogenetic relationships and introgres­sion patterns between incipient parapatric species of Italian brown trout (Salmo trutta L. complex). Molecular Ecology, 5: 207–220 Goldstein D.B., Schl¨otterer C. 1999. Microsatellites: evolution and applications. Ox­ford, Oxford University Press: 352 str. Gridelli E. 1936. I pesci d’aqua dolce della Venezia Giulia. Bollettino della Societa Adriatica di Scienze Naturali in Trieste, 35: 7–140 Guinand B. 1996. Use of a multivariate model using allele frequency distributions to analyse patterns of genetic di.erentiation among populations. Biological Journal of the Linnean Society 58, 2: 173–195 Hadˇziˇs´ce S. 1960. Zur Kenntnis der Gattung Salmothymus Berg. Publikacija Zavoda za ribarstvo na NRM – Skopje, 3: 39–50 Hamˇzi´c A. 2002. Protection of endangered salmonid species in B&H. V: Report of the symposium on inland .sheries and the aquatic environment. The e.ects of .sheries management on freshwater ecosystems. Windermere, Velika Britanija, 12–15 June 2002. Rim, Food and Agricultural Organization of the United Na­tions: 53–53 Hansen M.M., Ruzzante D.E., Nielsen E.E., Mensberg K.-L.D. 2000. Microsatellite and mitochondrial DNA poymorphism reveals life–history dependent interbreed­ing between hatchery and wild brown trout (Salmo trutta L.). Molecular Ecology, 9: 583–594 H¨ardle W., Simar L. 2003. Applied multivariate statistical analysis. Berlin, New York, Springer: 486 str. Heckel J. 1852. Fortsetzung des im Julihefte 1851 enthaltenen Berichtes ¨uber eine, auf Kosten der kaiserlichen Akademie der Wissenschaften unternommene, ichtyolo­gische Reise. Sitzungsberichte der Mathematisch–Naturwissenschaftlichen Classe der kaiserlichen Akademie der Wissenschaften, 8, I–V: 347–390 ITIS, Integrated taxonomic information system. 2004. Washington D.C., Smithsonian Institution. www.itis.usda.gov (30. apr. 2004) Jarne P., Lagoda P.J.L. 1996. Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology & Evolution, 11: 424–429 Jerman I., ˇSOU, ˇzba: Stern A. 1999. Molekulska evolucija. Ljubljana, ˇStudentska zaloˇ77–78 de Jong G., de Ruiter J.R., Haring R. 1994. Genetic structure of a population with social structure and migration. V: Conservation genetics. Loeschcke V., Tomiuk J., Jain S.K. (eds.). Basel, Birkh¨auser Verlag: 147–163 Jug T. 2002. Genetska raznolikost soˇske postrvi (Salmo marmoratus) v Sloveniji. Mag­istrsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta: 93 str. Karaman S. 1926. Salmonidi Balkana. Glasnik Skopskog nauˇcnog druˇstva, 2: 253–268 Karaman S. 1933. Prilozi ihtiologiji Crne Gore. Ribarski list, 8: 104–106 Karaman S. 1937. 11. Beitrag zur Kenntnis der S¨ußwasser.sche Jugoslaviens. Glasnik Skopskog nauˇcnog druˇstva, 6: 131–139 Kosori´c D., Vukovi´Ispitivanja moguˇcnosti hibridizacije salmonidnih vrsta -c T. 1969. sliva Neretva. Ichthyologia, 1, 1: 57–67 - Kosori´c D., Kapetanovi´c N., Guzina N., Mikavica D. 1983. Sastav naselja riba ri­jeke Neretve u Bosni i Hercegovini. Godiˇsnjak Bioloˇskog instituta Univerziteta Sarajevo, 36: 117–128 Kottelat M. 1997. European freshwater .shes. Biologia, 52, 5: 1–271 Kruglyak L., Nickerson D.A. 2001. Variation is the spice of life. Nature Genetics, 27: 234–236 Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. 2001. MEGA2: Molecular evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics, 17, 12: 1244–1245 Laikre L., Antunes A., Apostolidis A., Berrebi P., Duguid A., Ferguson A., Garcia– Marin J.L., Guyomard R., Hansen M.M., Hindar K., Koljonen M.-L., Largiader C., Martinez P., Nielsen E. E., Palm S., Ruzzante D. E., Ryman N., Triantaphyl­lidis C. 1999. Conservation genetic management of brown trout (Salmo trutta) in Europe. Report from the concerted action on identi.cation, management and exploitation of genetic resources in brown trout (Salmo trutta), ”TROUTCON­CERT”, EU-FAIR CT97 3882. Silkeborg, Danmarks .skeriundersrgelser: 91 str. Ludwig A., Jenneckens I. 2000. A PCR test for mitochondrial hetroplasmy in sturgeon. Animal Genetics, 31, 2: 153–154 Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 89: 583–590 Nei M. 1987. Molecular evolutionary genetics. New York, Columbia University Press: 512 str. Nelson J.S. 1994. Fishes of the world. 3rd ed. New York, John Wiley & Sons: 600 str. Mayden R.L. 1997. A hierarchy of species concepts: the denouement in the saga of the species problem. V: The units of biodiversity – species in practise. Claridge M.F., Dawah H.A., Wilson M.R. (eds.). London, Chapman & Hall: 381–424 Mayr E. 2000. The biological species concept. V: Species concepts and phylogenetic theory: a debate. Wheeler Q.D., Meier R. (eds.). New York, Columbia University Press: 30–43 Melkiˇc E. 2000. Variabilnost nukleotidnih zaporedij dela kontrolne regije mitohondrije DNA pri postrveh Salmo trutta. Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta, Oddelek za zootehniko: 68 str. McMeel O.M., Hoey E.M., Ferguson A. 2001. Partial nucleotide sequences, and rou­tine typing by polymerase chain reaction–restriction fragment length polymor­phism, of the brown trout (Salmo trutta) lactate dehydrogenase, LDH–C1*90 and *100 alleles. Molecular Ecology, 10: 29–34 Minckley W.L. 1995. Translocation as a tool for conserving imperiled .shes: experi­ences in western United States. Biological Conservation, 72, 2: 297–310 Moore W.S., Price J.T. 1993. Nature of selection in the northern .icker hybrid zone and its implications for speciation theory. V: Hybrid zones and the evolutionary process. Harrison R.G. (ed.). New York, Oxford University Press: 196–225 Nakamura Y., Leppert M., O’Connell P., Wol. R., Holm T., Culver M., Martin C., Fujimoto E., Ho. M., Kumlin E., White R. 1987. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping science. Science, 235: 1616– 1622 Nilsson J., Gross R., Asplund T., Dove O., Jansson H., Kelloniemi J., Kohlmann K., L¨oytynoja A., Nielsen E.E., Paaver T., Primmer C.R., Titov S., Vasem¨agi A., ¨ Veselov A., Ost T., Lumme J. 2001. Matrilinear phylogeography of atlantic salmon (Salmo salar L.) in Europe and postglacial colonization of Baltic sea area. Molecular Ecology, 10: 89–102 Oakley T.H., Phillips R.B. 1999. Phylogeny of Salmonine .shes based on growth hor­mone introns: Atlantic (Salmo) and Paci.c (Oncorhynchus) Salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 11: 381–393 O’Brien S.J., Mayr E. 1999. Bureaucratic mischief: recognizing endangered species and subspecies. Science, 251: 1187–1188 Odak T. 2004. Molekularno–bioloˇska obiljeˇzja endemske mekousne pastrve (Salmoth­ymus obtusirostris salonitana). Magistrsko delo. Zagreb, Agronomski fakultet Sveuˇciliˇsta u Zagrebu: 147 str. O’Reilly P.T., Hamilton L.C., McConnell S.K., Wright J.M. 1996. Rapid analysis of genetic variations in Atlantic salmon (Salmo salar) by PCR multiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53: 2292–2298 Page R.D.M., Holmes E.C. 1998. Molecular evolution, a phylogenetic approach. Ox­ford, Blackwell Science: 346 str. Patarnello T., Bargelloni L., Caldara F., Colombo L. 1994. Cytochrome b and 16S rRNA sequence variation in the Salmo trutta (Salmonidae, Teleostei) species complex. Molecular Phylogenetics and Evolution, 3, 1: 69–74 Philippart J.C. 1995. Is captive breeding an e.ective solution for the preservation of endemic species? Biological Conservation, 72, 2: 281–296 Phillips R.B., Oakely T.H. 1997. Phylogenetic relationships among the Salmoniae based on nuclear and mitochondrial DNA sequences. V: Molecular systematics of .shes. Kochner T.D., Stepien C.A. (eds.). San Diego, Academic Press: 145– 162 Phillips R.B., Matsuoka M.P., Konon I., Reed K.M. 2000. Phylogenetic analysis of mi­tochondrial and nuclear sequences supports inclusion of Acantholingua ohridana in the genus Salmo. Copeia, 2: 546–550 Poteaux C. 1995. Interactions genetiques entre formes sauvages et formes domestiques chez la truite commune (Salmo trutta fario L.). Doktorsko delo. Montpellier, University Montpellier II: 110 str. Povˇz M., Sket B. 1990. Naˇse sladkovodne ribe. Ljubljana, Mladinska knjiga: 369 str. Povˇz M., Jesenˇsek D., Berrebi P., Crivelli A.J. 1996. The marble trout, Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817 in the Soˇca river basin, Slovenia. Arles, Tour du Valat: 65 str. Raufaste N., Bonhomme F. 2000. Properties of bias and variance of two multiallelic estimators of FST . Theoretical Population Biology, 57, 3:285–296 Rymer J.M., Williams M.J., Braun M.J. 1994. Mitochondrial analysis of gene .ow between New Zealand mallards (Anas platyrhynchos) and grey ducks (A. super­ciliosa). The Auk, 111, 4: 970–978 Satre G.–P., Borge T., Lindell J., Moum T., Primmer C.R., Sheldon, B.C., Haavie, J., Johnsen, A., Ellegren, H. 2001. Speciation, introgressive hybridization and nonlinear rate of molecular evolution in .ycatchers. Molecular Evolution, 10: 737–749 She X.J., Autem M., Kotulas G., Pasteur N., Bonhomme F. 1987. Multivariate analy­sis of genetic exchanges between Solea aegyptiaca and Solea senegalensis (Teleosts, Soleidae). Biological Journal of the Linnean Society, 32: 357–371 Simpson G.G. 1961. Principles of animal taxonomy. New York, Columbia University Press: 247 str. Sokal R.R., Crovello J. 1970. The biological species concept: a critical evaluation. American Naturalist, 104: 127-153 Snoj A., Jug T., Melkiˇc E., Suˇsnik S., Pohar J., Dovˇc P., Jesenˇsek D., Budihna N. 2000. Mitochondrial and microsatellite DNA analysis of marble trout in Slovenia. Quaderni ETP, 29: 5–11 Snoj A., Melkiˇc E., Suˇsnik S., Muhamedagi´c S., Dovˇc P. 2002a. DNA phylogeny sup­ports revised classi.cation of Salmothymus obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399–411 Snoj A., Marˇceta B., Suˇsnik S., Melkiˇc E., Megliˇc V., Dovˇc P. 2002b. The taxonomic status of the ’sea trout’ from the north Adriatic Sea, as revealed by mitochondrial and nuclear DNA analysis. Journal of Biogeography, 29: 1179–1185 Suˇsnik S., Snoj A., Pohar J., Dovˇc P. 1997. The microsatellite marker (BFRO 002) characteristic for di.erent geographically remote brown trout, Salmo trutta L., populations. Animal Genetics, 28, 5: 372 Suˇsnik S., Snoj A., Dovˇc P. 2001. Evolutionary distinctness of grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as based on mtDNA variation. Biological Journal of Linnean Society, 74: 375–385 Suˇsnik S., Sch¨o.man J., Snoj A. 2004. Phylogenetic position of Salmo (Platysalmo) platisalmo Behnke 1968 from south–central Turkey, evidenced by genetic data. Journal of Fish Biology, 64: 947–960 ˇ Sori´c V. 1990. Salmonids in the Ohrid–Drim–Skadar system. Acta Societatis Zoolog­icae Bohemoslovacae, 54: 305–319 Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. 1997. The Clustal X windows interface: .exible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25, 24: 4876–4882 Weir B.S. 1979. Inferences about linkage disequilibrium. Biometrics, 35: 235–254 Weir B.S., Cockerham C.C. 1984. Estimating F –statistics for the analysis of popula­tion structure. Evolution, 38, 6: 1358–1370 Wiley E.O. 1978. The evolutionary species concept reconsidered. Systematic Zoology, 27: 17–26 Wright S. 1951. The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, 15: 323– 354 Zhang D.–X., Hewitt G.M. 2003. Nuclear DNA analyses in genetic studies of popula­tions: practice, problems and prospects. Molecular Ecology, 12: 563–584 9 ZAHVALA Zahvala gre mojemu delovnemu mentorju dr. Aleˇsu Snoju in drugim ˇclanom komisije, ki se niso ustraˇsili, da bi jih okuˇzil v zadnjih tednih. Vsem, ki so sodelovali pri nabiranju postrvi v poreˇcju Neretve, dr. Alainu Crivelliju in dr. Ivanu Bogutu za dragocene koˇsˇcke repnih plavuti zubatkov. Simoni za dodaten pregled magisterija. Vrlim knjiˇzniˇcarkam na Oddelku za Zootehniko za hitro dostavljanje ˇclankov in knjig, Petri iz Knjiˇznice Domˇzale za Harryja Potterja (dostava na dom). Prebivalcem naˇsih laboratorijev v nakljuˇcnem vrstnem redu: Tamari v.d. ˇse.ci, Brigiti, Poloni, Tomaˇzu, Tini F., Tini L., Vidi, Tanji, Enotu, Heleni, Matjaˇzu, Duˇsanu B., Duˇsanu T. in Ireni. Rozinam in drugim mikrobiologom s konca hodnika za moralno podporo, odbojko in bowling. Jani, ki je v kritiˇcnih trenutkih drˇzala primerno varnostno razdaljo, 320 milj. ˇ Se nekaj literature, ki je nisem vkljuˇcil v sam magisterij, je bila pa verjetno najbolj prelistana: Bartol T., Bradaˇc J., Hoˇcevar I., Koler–Povh T., Siard N., Stopar K. 2001. Navodila za oblikovanje pisnih diplomskih in podiplomskih izdelkov na Biotehniˇski fakulteti Univerze v Ljubljani. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniˇska fakulteta: 23 str. M.H. 2003. Kviz o ˇzenskah: kaj poveˇca vaˇso oˇcarljivost? Men’s Health, december: 128–128 Razpet M. 1991. Sedi in piˇsi z LATEX–om! Ljubljana, Druˇstvo matematikov, .zikov in astronomov Slovenije, Zavod Republike Slovenije za ˇsolstvo: 60 str. Jug T. 2001. Genetix za telebane. Montpellier, Delovni zapiski iz Francije: 35 str. Mislim, da je ˇcas za hribe. Priloga A: Opis vzorcev iz poreˇcja Neretve in Zadlaˇsˇcice. Dodatne kratice: pot (potoˇcna postrv), zub (zubatak), meh (mehkoustna postrv), gla (glavatica), sek (doloˇcitev nukleotidnega zaporedja), res (RFLP). Lokacija Oznaka mtDNA BFRO002 Ssa197 Str24 Str591 GH2C LDH Bukovica N2 pot At-s1 sek 116116 136140 161177 148148 G NP N3 pot At-s1 sek 116116 140154 161184 148148 G NP N4 pot At-s1 res 116116 132140 161161 148148 G NP N5 pot At-s1 res 116116 132140 175184 148148 G NP N6 pot At-s1 res 116116 132140 161184 148148 G NP N7 pot At-s1 res 116116 132140 161177 148148 G NP N8 pot At-s1 res 116116 140140 161161 148148 G NP N9 pot At-s1 res 116116 140154 184184 148148 G NP N10 pot Da-s2 res 120124 132149 175194 148152 G NP Neretva Dx1 zub AdN sek 120128 222222 186186 154154 G MP/NP (Jablanica– Dx2 zub AdN sek 120128 202222 186186 154154 G/C MP/NP Metkovi´c) Dx3 zub AdN sek 120128 222222 186186 154154 C NP Dx5 zub AdN sek 120120 222222 186186 154154 C NP -Daji´ci MP11 meh AdN sek 116116 175222 175202 158176 G/C NP Neretva 1/1 pot AdN res 116116 128215 171223 176186 G/C NP (Glavatiˇcevo) 1/2 pot AdN res 116120 144144 210219 176176 G/C NP 1/3 pot Ad-s3 sek 116131 128140 210221 176186 G/C NP 1/4 pot AdN res 116122 128144 208229 176176 C NP G1 gla AdN sek 116116 128132 221221 148176 G/C NP G2 gla AdN sek 116116 128149 190221 176176 C NP G3 gla AdN sek 116116 154175 175225 154170 G MP G4 gla AdN sek 116128 149222 186213 154154 G/C NP G5 gla AdN sek 116116 128144 206210 176180 C NP G6 gla Soxy sek 116116 128211 217217 176186 C NP G7 gla Ad-s3 sek 116116 128144 213223 176176 C NP GK gla AdN res 120128 206222 186186 154154 G NP MK1 kosor Soxy sek 116133 128179 186186 170176 G/C MP/NP MK2 kosor AdN sek 131133 163179 175225 158170 G/C MP/NP MK3 kosor AdN sek 116133 175215 175225 170176 G/C MP/NP MK4 kosor Ad-s3 sek 116131 128171 175217 170176 G/C MP/NP MK5 kosor Soxy sek 131131 171175 175202 172172 G MP MP1 meh Soxy sek 133133 171175 175206 170170 G MP MP2 meh Soxy sek 131131 175175 171175 158170 G MP MP3 meh Soxy sek 131131 154154 171175 170170 G MP MP4 meh Soxy sek 133133 175179 175204 170170 G MP MP5 meh Soxy sek 131133 144179 171175 158170 G MP MP6 meh Soxy sek 133133 175179 171186 170176 G MP MP7 meh Soxy sek 131133 128144 175175 158170 G MP MP8 meh Soxy sek 133137 159175 175196 170172 G MP MP9 meh Soxy sek 133137 175179 171175 158170 G MP MP10 meh AdN sek 116133 128179 171188 170176 G/C MP/NP MP12 meh Soxy sek 131133 175183 175177 158176 G MP MP13 meh Soxy sek 131133 179183 171177 170170 G MP MP14 meh Soxy sek 133137 144144 175175 158172 G MP MP15 meh Soxy sek 133133 144179 175179 170170 G MP MP16 meh Soxy sek 131131 179183 171175 170170 G MP MP17 meh Soxy sek 131131 171171 175177 170170 G MP MP18 meh AdN sek 116131 128179 171186 170176 G/C MP/NP MP19 meh AdN sek 133137 144175 206221 158186 G/C MP/NP se nadaljuje nadaljevanje Priloge A Lokacija Oznaka mtDNA BFRO002 Ssa197 Str24 Str591 GH2C LDH Neretva MP20 meh AdN res 120133 179222 175186 154158 G MP/NP (Glavatiˇcevo) MP21 meh AdN sek 116131 175179 175217 158176 G/C MP/NP N1 kosor Da-s1 res 116116 211215 225225 176176 C NP N11 kosor AdN res 116116 144179 175175 170176 G/C MP/NP N12A pot At-s1 res 116116 132144 177177 148148 G NP N12B pot Ad-s3 sek 116116 144144 215217 176186 C MP/NP N13 meh Soxy res 131133 144179 171175 170170 G MP N14 kosor Soxy res 116116 140179 175175 150176 G/C NP N15 pot Ad-s3 sek 116116 149183 210213 148176 C NP N16 kosor AdN res 116116 144144 217221 176180 C NP N17 pot AdN res 116116 149149 219223 176176 G/C NP N18 pot AdN res 116116 128215 217221 176176 C NP N19 pot Da-s2 res 116116 140159 177223 148176 C MP/NP N20 kosor AdN res 116120 144211 186217 176176 C NP NP1 pot AdN sek 116116 128128 196223 176176 C NP NP2 pot AdN sek 116116 128128 186223 176186 C NP NP3 pot AdN sek 116137 128128 186225 176176 C NP NP4 pot AdN sek 116116 128149 210219 170176 G MP/NP NP5 pot AdN sek 116120 128128 229229 176186 C NP NP6 pot AdN sek 116116 128179 217219 176176 C NP NP7 pot AdN sek 116116 144175 202221 170176 C NP NP8 pot AdN sek 116116 128149 190225 176188 C MP/NP NP9 pot AdN sek 116116 128144 217221 176176 C NP NP10 pot AdN sek 131131 128128 223225 186186 C NP NP11 pot AdN sek 116116 128175 206210 176176 G/C NP NP12 pot Da-s2 sek 116116 132140 177177 148148 G NP Krupac KP1 pot Ad-s3 sek 116116 128140 221221 154176 C NP KP2 pot Da-s2 sek 116116 211211 186217 176176 C NP KP3 pot AdN sek 116116 128140 219219 176186 C NP KP4 pot AdN sek 116116 144144 210219 176176 C NP KP5 pot AdN sek 116116 128128 219221 176176 C NP KP6 pot AdN sek 116116 140149 188221 176180 C NP KP7 pot AdN sek 116133 128149 179223 166176 C NP KP8 pot Soxy sek 116116 149149 217225 176176 C NP KP9 pot Soxy sek 116120 128128 217217 176176 C NP KP10 pot Ad-s3 sek 116116 128144 219219 176176 C NP KP11 pot Soxy sek 116116 128128 206225 176176 C NP Lad -anica 2/1 pot AdN res 116116 136215 221221 176176 C NP 2/2 pot AdN res 116116 140154 171202 176176 C NP 2/3 pot AdN res 116116 128149 210217 176180 C MP/NP 2/4 pot AdN res 116116 128215 210217 176180 C NP 2/5 pot Soxy res 116116 140215 217217 176186 G/C NP Ljuta 5/1 pot At-s1 sek 116116 132132 161161 148148 G NP 5/2 pot Da-s2 sek 116116 132132 161161 148148 G NP 5/3 pot Ad-s3 sek 116116 140149 190223 176176 C NP 5/4 pot At-s1 sek 116116 128132 161184 148148 G NP 5/5 pot At-s1 res 116116 116140 161184 148148 G NP 5/6 pot Da-s2 res 116116 136149 175177 148150 G NP 5/7 pot At-s1 res 116116 132140 184184 148148 G NP 5/8 pot At-s1 res 116116 132149 177184 148150 G NP 5/9 pot At-s1 res 116116 132136 161177 148150 G NP N26 kosor AdN res 116116 128144 221225 176186 C NP Neretva 3/1 pot Ad-s3 sek 116116 128128 194221 176176 C NP (Ocrkavlje) 3/2 pot Ad-s3 sek 116116 144149 221221 176176 C NP 3/3 pot Ad-s3 res 116120 149149 221221 176176 C NP 3/4 pot AdN res 116116 149154 217217 176176 G/C NP se nadaljuje nadaljevanje Priloge A Lokacija Oznaka mtDNA BFRO002 Ssa197 Str24 Str591 GH2C LDH Neretva 3/5 pot AdN res 116116 128149 221221 176176 C NP (Ocrkavlje) 3/6 pot Ad-s3 sek 116116 149183 217225 176186 C NP 3/7 pot Ad-s3 sek 116116 149149 217225 176176 C NP 3/8 pot Ad-s3 sek 116116 149154 217217 176176 C NP 3/9 pot AdN res 116116 149149 217217 176176 C NP 3/10 pot AdN res 116116 144144 215215 176176 C NP 3/11 pot AdN res 116116 144144 217217 176186 C NP 3/12 pot AdN res 116116 149149 217217 176176 C NP 3/13 pot AdN res 116116 149149 213221 176186 C NP 3/14 pot AdN res 116116 149154 194221 176176 C NP 3/15 pot Ad-s3 sek 116116 128154 225225 176176 C NP 3/16 pot AdN res 116116 144144 221225 176176 C NP 3/17 pot AdN res 116116 149154 194194 176176 G/C NP 3/18 pot AdN res 116116 149149 217225 176176 C NP 3/19 pot Ad-s3 sek 116116 128211 217225 176176 C NP 3/20 pot AdN res 120133 128163 194225 176176 C NP 3/21 pot Ad-s3 sek 116116 149154 217225 176176 C NP 3/22 pot AdN res 116116 140149 210217 176186 C NP 3/23 pot AdN res 116116 128149 215217 176176 C NP 3/24 pot AdN res 116128 128149 217217 176176 C NP 3/25 pot Ad-s3 sek 116116 144149 215217 176186 C NP 3/26 pot AdN res 116116 136163 215215 176176 C MP/NP 3/27 pot AdN res 116116 149154 194194 154176 C NP 3/28 pot AdN res 116116 144149 215217 176176 C NP 3/29 pot AdN res 116116 144144 202225 176176 C NP 3/30 pot AdN res 116116 149149 219219 176176 C NP 3/31 pot AdN res 116116 144149 219223 176176 C NP 4/1 pot AdN res 116116 149149 225225 176176 C NP 4/2 pot AdN res 116116 144154 210217 176176 C NP 4/3 pot AdN res 116116 144149 215219 176186 C MP/NP 4/4 pot AdN res 116116 128149 217219 176180 C NP 4/5 pot AdN res 116116 144149 215219 176176 C NP 4/6 pot AdN res 116116 128154 217223 176176 C NP 4/7 pot Soxy res 116116 149211 219219 176186 C NP 4/8 pot AdN res 116116 136144 217219 176186 C NP 4/9 pot Ad-s3 res 116116 128149 194202 176186 C MP/NP 4/10 pot Soxy res 116116 128149 210215 176176 G/C MP/NP 4/11 pot Ad-s3 res 116116 140154 229231 176176 C NP 4/12 pot AdN res 116116 144211 210217 176176 C NP 4/13 pot AdN res 116116 144149 210217 176176 C NP 4/14 pot AdN res 116116 128149 202215 176176 C NP 4/15 pot AdN res 116116 144149 217217 176176 C NP 4/16 pot AdN res 116120 144222 186186 154154 G/C NP 4/17 pot Ad-s3 sek 116116 144149 186223 176176 C NP 4/18 pot AdN res 116116 149154 219219 176176 C NP 4/19 pot AdN sek 116116 136154 210210 176176 C NP 4/20 pot Ad-s3 sek 116116 140149 217217 176186 C NP 4/21 pot AdN res 116116 149149 194227 176176 C NP 4/22 pot AdN res 116116 128149 215215 176176 C NP 4/23 pot AdN res 116116 149149 217217 176186 C NP 4/24 pot AdN res 116116 128149 210210 176176 C NP N21 pot AdN res 116116 136144 221225 176186 C NP N22 pot AdN res 116116 144149 217221 176176 C NP N23 gla AdN res 116128 149202 219219 154176 C NP N24 kosor AdN res 116133 154171 175175 170176 G/C MP/NP N25 meh Soxy res 133133 144179 175175 170170 G MP se nadaljuje nadaljevanje Priloge A Lokacija Oznaka mtDNA BFRO002 Ssa197 Str24 Str591 GH2C LDH Rakitnica 6/1 pot AdN sek 116120 144179 206225 176176 C NP 6/2 pot AdN sek 116120 128128 237237 176176 G/C NP 6/3 pot Da-s1 sek 116120 144144 217225 176188 G/C NP 6/4 pot Da-s1 res 116116 124144 233233 176176 G/C NP 6/5 pot AdN res 116120 149149 233233 176176 C NP 6/6 pot AdN res 116116 144144 210233 176176 G NP 6/7 pot Ad-s3 sek 116120 144159 213225 176182 C NP 6/8 pot Da-s1 sek 116120 140159 219219 176188 G/C NP 6/9 pot Da-s1 res 116120 124144 210210 176188 C NP 6/10 pot Da-s1 res 116116 149149 233233 176176 C NP 6/11 pot AdN res 116120 128144 186233 176176 C NP 6/12 pot Da-s1 res 120120 140149 233233 176176 C NP 6/13 pot Da-s1 res 116116 128140 221227 176188 C NP 6/14 pot Da-s1 res 116120 149149 188237 176188 C NP 6/15 pot AdN res 116116 144144 210210 176188 G/C NP 6/16 pot AdN res 116120 128211 210210 176176 C NP 6/17 pot AdN res 116116 144211 210210 176186 C NP 6/18 pot AdN res 116120 128144 225225 176188 G/C NP 6/19 pot AdN res 116120 128144 233233 176188 C NP 6/20 pot Da-s1 res 116120 144144 221221 176176 G/C NP 6/21 pot AdN res 116120 128144 210210 176180 C NP 6/22 pot Da-s1 res 116120 140140 210210 176176 C NP 6/23 pot Da-s1 res 116116 144144 213221 176188 C NP 6/24 pot AdN res 116116 128144 225225 176176 G/C NP 6/25 pot AdN res 116116 128144 186233 188188 G/C NP 6/26 pot AdN res 116116 144149 186217 176176 G/C NP 6/27 pot AdN res 116116 144149 229229 176176 C NP 6/28 pot AdN res 116116 144144 210210 176188 G/C NP 6/29 pot AdN res 116120 128211 210210 176188 C NP 6/30 pot Da-s1 res 116116 144144 210210 176176 G/C NP 6/31 pot Da-s1 res 116120 144144 231231 176176 C NP 6/32 pot AdN res 116120 144144 186223 176188 C NP 6/33 pot Da-s1 res 120120 128149 210210 176188 C NP 6/34 pot Da-s1 res 116116 128179 210210 176176 G/C NP 6/35 pot Da-s1 res 116116 140159 210210 176176 C NP 6/36 pot AdN res 116116 128144 210210 176188 G NP 6/37 pot AdN res 116133 128128 221223 176176 G NP 6/38 pot AdN res 116116 140159 196223 176176 C NP 6/39 pot Da-s1 res 116120 144144 186221 186188 C NP 6/40 pot AdN res 116116 144144 219210 176186 G/C NP 6/41 pot Da-s1 res 120120 128144 210210 176188 C NP 6/42 pot AdN res 116120 128128 221221 176176 C NP 6/43 pot AdN res 116120 144144 206219 176188 C NP 6/44 pot Da-s1 res 120120 140144 210210 176176 G/C NP 6/45 pot AdN res 120120 140144 210210 176176 G/C NP Zadlaˇsˇcica PS1 PS2 soˇska soˇska Ma-s1 Ma-s1 res res 124124 124124 154185 161185 163186 186186 156156 154154 G G NP NP Priloga B Haplotip AdN (format FASTA) >AdN CTAAATTAAACTATCCTCTGATTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGT ACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATCTATGTATAATATTACATATTATG TATTTACCCATATATATAATATAGCATGTGAGTAGTACATTATATGTATTAT CAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAAGGTTTACA TAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT GCTATATCAATAAAACTCCATCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT TTCAGCATCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGT AGGCATACTCTTATTGATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTC GTGAACTATTCCTGGCATTTGGTTCCTATATCAAGGGCTATCCTTAAGAAAC CACCCCCTGAAAGCCGAATGTAAAGCATCTGGTTAATGGTGTCAATCTTATT GCCCGTTACCCACCAAGCCGGGCGTTCTTTTATATGCATAGGGTTCCCTTTT TTTTTTTTTCCTTTCAGCTTGCATATACAAGTGCAAGCAAAGAAGTCTAACA AGGTCGAACTAGATCTTGAATTCCAGAGAACCCATGTATCATGGTGAAATGA TATTCTATAAAGAATCACATACTTGGATATCAAGTGCATAAGGTTAATATTT CACTTCATATATCTCTAAGATACCCCCGGCTTCTGCGCGGTAAACCCCCCTA CCCCCCTACGCTGAAGGATCCTTATATTCCTGTCAAACCCCTAAACCAGGAA GTCTCAAATCAGCGCCAATCTTTTTATATACATTAATGAACTTTTTTGCCAA TTTTATAGCATTTGGCACCGACTACACTATCATTGGCACCACTTTTATAATT AAAGTATACATTAATNAACTTTTTCGCTAAATTTTATAACATTTAGCACCGA CTCCACTGTCATTAGCACCCTGTCAATC Priloga C: Frekvence alelov mikrosatelitnih lokusov in SNP–jev po lokacijah. Oz­nake populacij: 1–Lad -anica, 2–Neretva Ocrkavlje, 3–Ljuta, 4–Rakitnica, 5–Krupac, 6–Bukovica, 7–Neretva Glavatiˇcevo, 8–-ci in 9–Neretva Jablanica–Metkovi´ Daji´c. Lokus Lokacija 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BFRO 002 (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 116 1,0000 0,9250 1,0000 0,6444 0,9091 0,8889 0,5328 1,0000 – 120 – 0,0250 – 0,3444 0,0455 0,0556 0,0410 – 0,6250 122 – – – – – – 0,0082 – – 124 – – – – – 0,0556 – – – 128 – 0,0167 – – – – 0,0164 – 0,3750 131 – – – – – – 0,1803 – – 133 – 0,0333 – 0,0111 0,0455 – 0,1803 – – 137 – – – – – – 0,0410 – – Hexp. – 0,1424 – 0,4659 0,1694 0,2037 0,6474 – 0,4688 Hn.b. – 0,1436 – 0,4712 0,1775 0,2157 0,6528 – 0,5357 Hobs. – 0,1000 – 0,4889 0,1818 0,1111 0,4098 – 0,7500 Ssa197 (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 116 – – 0,0500 – – – – – – 124 – – – 0,0222 – – – – – 128 0,2000 0,1250 0,1000 0,2111 0,4545 – 0,2377 – – 132 – – 0,4000 – – 0,2778 0,0246 – – 136 0,1000 0,0333 0,1000 – – 0,0556 – – – 140 0,2000 0,0250 0,1500 0,1000 0,1364 0,5000 0,0328 – – 144 – 0,2000 0,0500 0,4556 0,1364 – 0,1721 – – 149 0,1000 0,4250 0,1500 0,1111 0,1818 0,0556 0,0574 – – 154 0,1000 0,1083 – – – 0,1111 0,0246 – – 159 – – – 0,0444 – – 0,0164 – – 163 – 0,0167 – – – – 0,0082 – – 171 – 0,0083 – – – – 0,0410 – – 175 – – – – – – 0,1230 0,5000 – 179 – 0,0083 – 0,0222 – – 0,1393 – – 183 – 0,0083 – – – – 0,0328 – – 202 – 0,0083 – – – – – – 0,1250 206 – – – – – – 0,0082 – – 211 – 0,0250 – 0,0333 0,0909 – 0,0246 – – 215 0,3000 – – – – – 0,0328 – – 222 – 0,0083 – – – – 0,0246 0,5000 0,8750 Hexp. 0,8000 0,7490 0,7700 0,7215 0,7149 0,6543 0,8683 0,5000 0,2188 Hn.b. 0,8889 0,7553 0,8105 0,7296 0,7489 0,6928 0,8755 1,0000 0,2500 Hobs. 1,0000 0,7500 0,8000 0,5778 0,4545 0,8889 0,7869 1,0000 0,2500 LDH-G (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 100 0,1000 0,0583 – – – – 0,4098 – 0,2500 200 0,9000 0,9417 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,5902 1,0000 0,7500 Hexp. 0,1800 0,1099 – – – – 0,4837 – 0,3750 Hn.b. 0,2000 0,1108 – – – – 0,4877 – 0,4286 Hobs. 0,2000 0,0833 – – – – 0,2295 – 0,5000 se nadaljuje nadaljevanje Priloge C Lokus Lokacija 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Str24 (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 161 – – 0,3500 – – 0,4444 – – – 171 0,1000 – – – – – 0,0902 – – 175 – 0,0333 0,0500 – – 0,1111 0,2213 0,5000 – 177 – – 0,1500 – – 0,1111 0,0656 – – 179 – – – – 0,0455 – 0,0082 – – 184 – – 0,2500 – – 0,2778 – – – 186 – 0,0250 – 0,0556 0,0455 – 0,0902 – 1,0000 188 – – – 0,0111 0,0455 – 0,0082 – – 190 – – 0,0500 – – – 0,0164 – – 194 – 0,0750 – – – 0,0556 – – – 196 – – – 0,0111 – – 0,0164 – – 202 0,1000 0,0250 – – – – 0,0164 0,5000 – 204 – – – – – – 0,0082 – – 206 – – – 0,0222 0,0455 – 0,0328 – – 208 – – – – – – 0,0082 – – 210 0,2000 0,0750 – 0,3778 0,0455 – 0,0492 – – 213 – 0,0083 – 0,0222 – – 0,0246 – – 215 – 0,1083 – – – – 0,0082 – – 217 0,4000 0,2833 – 0,0222 0,1818 – 0,0820 – – 219 – 0,1083 – 0,0444 0,2727 – 0,0328 – – 221 0,2000 0,1000 0,0500 0,0889 0,1818 – 0,0738 – – 223 – 0,0250 0,0500 0,0333 0,0455 – 0,0574 – – 225 – 0,1083 0,0500 0,0778 0,0909 – 0,0656 – – 227 – 0,0083 – 0,0111 – – – – – 229 – 0,0083 – 0,0222 – – 0,0246 – – 231 – 0,0083 – 0,0222 – – – – – 233 – – – 0,1444 – – – – – 237 – – – 0,0333 – – – – – Hexp. 0,7400 0,8600 0,7800 0,8123 0,8388 0,6975 0,9038 0,5000 – Hn.b. 0,8222 0,8672 0,8211 0,8215 0,8788 0,7386 0,9113 1,0000 – Hobs. 0,6000 0,5333 0,7000 0,3556 0,6364 0,6667 0,8033 1,0000 – Str591 (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 148 – – 0,6500 – – 0,9444 0,0574 – – 150 – – 0,1500 – – – 0,0082 – – 152 – – – – – 0,0556 – – – 154 – 0,0333 – – 0,0455 – 0,0492 – 1,0000 158 – – – – – – 0,0820 0,5000 – 166 – – – – 0,0455 – – – – 170 – 0,0250 – – – – 0,2623 – – 172 – – – – – – 0,0328 – – 176 0,7000 0,8333 0,1500 0,7333 0,8182 – 0,4098 0,5000 – 180 0,2000 0,0083 – 0,0111 0,0455 – 0,0164 – – 182 – – – 0,0111 – – – – – 186 0,1000 0,1000 0,0500 0,0333 0,0455 – 0,0738 – – 188 – – – 0,2111 – – 0,0082 – – Hexp. 0,4600 0,2938 0,5300 0,4163 0,3223 0,1049 0,7439 0,5000 – Hn.b. 0,5111 0,2962 0,5579 0,4210 0,3377 0,1111 0,7500 1,0000 – Hobs. 0,6000 0,2667 0,4000 0,4667 0,3636 0,1111 0,5574 1,0000 – GH2C (N) 5 60 10 45 11 9 61 1 4 100 0,9000 0,9417 0,2000 0,7556 1,0000 – 0,4836 0,5000 0,6250 200 0,1000 0,0583 0,8000 0,2444 – 1,0000 0,5164 0,5000 0,3750 Hexp. 0,1800 0,1099 0,3200 0,3694 – – 0,4995 0,5000 0,4688 Hn.b. 0,2000 0,1108 0,3368 0,3735 – – 0,5036 1,0000 0,5357 Hobs. 0,2000 0,0833 – 0,3556 – – 0,2787 1,0000 0,2500 Priloga D: Frekvence alelov mikrosatelitnih lokusov in SNP–jev po fenotipih. Oznake populacij: 1–glavatica, 2–kosor, 3–mehkoustna, 4–potoˇcna postrv, 5–zubatak. Lokus Lokacija 1 2 3 4 BFRO 002 (N) 9 12 23 158 4 116 0,7778 0,6250 0,1087 0,8481 – 120 0,0556 0,0417 0,0217 0,1203 0,6250 122 – – – 0,0032 – 124 – – – 0,0032 – 128 0,1667 – – 0,0032 0,3750 131 – 0,1667 0,3261 0,0095 – 133 – 0,1667 0,4565 0,0095 – 137 – – 0,0870 0,0032 – Hexp. 0,3642 0,5521 0,6654 0,2660 0,4688 Hn.b. 0,3856 0,5761 0,6802 0,2669 0,5357 Hobs. 0,3333 0,5000 0,5652 0,2152 0,7500 Ssa197 (N) 9 12 23 158 4 116 – – – 0,0032 – 124 – – – 0,0063 – 128 0,2778 0,1250 0,0652 0,2089 – 132 0,0556 – – 0,0475 – 136 – – – 0,0253 – 140 – 0,0417 – 0,1013 – 144 0,1111 0,2083 0,1739 0,2373 – 149 0,1667 – – 0,2342 – 154 0,0556 0,0417 0,0435 0,0475 – 159 – – 0,0217 0,0158 – 163 – 0,0417 – 0,0063 – 171 – 0,1250 0,0652 – – 175 0,0556 0,0833 0,2391 0,0063 – 179 – 0,1667 0,2826 0,0095 – 183 – – 0,0652 0,0063 – 202 0,0556 – – – 0,1250 206 0,0556 – – – – 211 0,0556 0,0833 – 0,0253 – 215 – 0,0833 – 0,0158 – 222 0,1111 – 0,0435 0,0032 0,8750 Hexp. 0,8519 0,8715 0,8157 0,8284 0,2188 Hn.b. 0,9020 0,9094 0,8338 0,8310 0,2500 Hobs. 1,0000 0,9167 0,8261 0,6772 0,2500 LDH (N) 9 12 23 158 4 100 0,1111 0,3333 0,8478 0,0285 0,2500 200 0,8889 0,6667 0,1522 0,9715 0,7500 Hexp. 0,1975 0,4444 0,2580 0,0553 0,3750 Hn.b. 0,2092 0,4638 0,2638 0,0555 0,4286 Hobs. – 0,5000 0,2174 0,0570 0,5000 se nadaljuje nadaljevanje Priloge D Lokus Lokacija 1 2 3 4 Str24 (N) 9 12 23 158 4 161 – – – 0,0475 – 171 – – 0,2174 0,0063 – 175 0,0556 0,4167 0,4565 0,0095 – 177 – – 0,0652 0,0316 – 179 – – 0,0217 0,0032 – 184 – – – 0,0316 – 186 0,1667 0,1250 0,0652 0,0348 1,0000 188 – – 0,0217 0,0063 – 190 0,0556 – – 0,0063 – 194 – – – 0,0316 – 196 – – 0,0217 0,0063 – 202 – 0,0417 0,0217 0,0158 – 204 – – 0,0217 – – 206 0,0556 – 0,0435 0,0127 – 208 – – – 0,0032 – 210 0,0556 – – 0,1614 – 213 0,1111 – – 0,0127 – 215 – – – 0,0443 – 217 0,1111 0,1250 0,0217 0,1519 – 219 0,1111 – – 0,0791 – 221 0,1667 0,0833 0,0217 0,0949 – 223 0,0556 – – 0,0443 – 225 0,0556 0,2083 – 0,0791 – 227 – – – 0,0063 – 229 – – – 0,0190 – 231 – – – 0,0095 – 233 – – – 0,0411 – 237 – – – 0,0095 – Hexp. 0,8889 0,7431 0,7306 0,9158 – Hn.b. 0,9412 0,7754 0,7469 0,9187 – Hobs. 0,5556 0,5833 0,8696 0,5633 – Str591 (N) 9 12 23 158 4 148 0,0556 – – 0,1139 – 150 – 0,0417 – 0,0095 – 152 – – – 0,0032 – 154 0,3333 – 0,0217 0,0127 1,0000 158 – 0,0417 0,2174 – – 166 – – – 0,0032 – 170 0,0556 0,2500 0,5652 0,0063 – 172 – 0,0833 0,0435 – – 176 0,4444 0,5000 0,1304 0,6930 – 180 0,0556 0,0417 – 0,0158 – 182 – – – 0,0032 – 186 0,0556 0,0417 0,0217 0,0759 – 188 – – – 0,0633 – Hexp. 0,6790 0,6736 0,6134 0,4964 – Hn.b. 0,7190 0,7029 0,6271 0,4980 – Hobs. 0,5556 0,7500 0,6087 0,3544 – GH2C (N) 9 12 23 158 4 100 0,6667 0,6250 0,1087 0,7722 0,6250 200 0,3333 0,3750 0,8913 0,2278 0,3750 Hexp. 0,4444 0,4688 0,1938 0,3519 0,4688 Hn.b. 0,4706 0,4891 0,1981 0,3530 0,5357 Hobs. 0,2222 0,5833 0,2174 0,1646 0,2500