Irena Zupanic Pajnic1
Forenzicna genetika
Forensic Genetics
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: forenziCna genetika, kratke tandemske ponovitve, mitohondrijska DNA, genetska tipizacija
Prispevek na pregleden način predstavlja forenzične genetske preiskave, ki se opravljajo v Sloveniji in tujini. V laboratoriju za molekularno genetiko Inštituta za sodno medicino preverjamo bližnje in daljne sorodstvene odnose ter opravljamo identifikacijo bioloških sledi v krimina-listiki in identifikacijo neprepoznavnih in skeletiziranih človeških posmrtnih ostankov v rutinskih sodnomedicinskih preiskavah in tudi v grobiščih iz časa 2. svetovne vojne in povojnih pobojev ter arheoloških najdiščih. V medicinskih preiskavah opravljamo identifikacijo tkivnih vzorcev ob sumu na njihovo zamenjavo, spremljamo uspešnost transplantacije kostnega mozga in drugih krvotvornih matičnih celic ter določamo eno- oz. dvojajčne dvojčke. V prispevku opisujemo različne genetske označevalce, ki jih v forenzični genetiki zaradi njihove variabilnosti preiskujemo. Pri jedrni avtosomski DNA in kromosomu Y preiskujemo dolžinske polimorfizme področij kratkih tandemskih ponovitev, pri mitohondrijski DNA pa sekvenč-ne polimorfizme dveh variabilnih področij kontrolne regije mitohondrijske DNA. Opisanih je veliko genetskih preiskav, ki so bile opravljene z namenom identifikacije žrtev množičnih katastrof (tako naravnih kot tistih, ki so bile posledica človeškega nasilja), z namenom razkrivanja zgodovinskih dejstev in identifikacije znanih osebnosti človeške zgodovine.	325
ABSTRACT_
KEY WORDS: forensic genetics, short tandem repeat, mitochondrial DNA, DNA typing
This article describes forensic genetics investigations performed in Slovenia and abroad. At the Molecular Genetic Laboratory of the Institute of Forensic Medicine, close and distinct kinship analyses are performed, biological stains are analyzed in casework, and human ske -letal remains are identified from forensic investigations, World War II mass graves and archeo-logical sites. Identification of tissue samples is performed in clinical examinations whenever a suspicion of exchange appears. Furthermore, hematopoietic cell chimerism is monitored after bone marrow transplantations, and zygosity in twins is determined before transplantations. The paper describes variable genetic markers used in forensic genetics. Whenever nuclear autosomal and Y chromosome Short Tandem Repeat loci are used, length polymorp -hisms are traced. In the variable control region of the mitochondrial DNA, sequence polymorphisms are analyzed. In the paper, the most famous genetics investigations for the reconstruction of historical cases are presented, some mass disaster victimidentifications are listed, and some identifications of notabilities of our past are described.
1 Doc. dr. Irena Zupanič Pajnič, univ. dipl. biol., Laboratorij za molekularno genetiko, Inštitut za sodno medicino, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Korytkova ulica 2, 1000 Ljubljana; irena.zupanic@mf.uni-lj.si
326
UVOD
Na Inštitutu za sodno medicino Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani (ISM) že od leta 1996 opravljamo molekularnogenetske preiskave za identifikacijo oseb in bioloških sledi ter preverjamo sorodstvene povezave. Prvotne preiskave smo usmerili v raziskave polimorfizmov mikrosatelitskih področij avto-somske jedrne DNA, sledile so jim raziskave polimorfizmov mikrosatelitskih področij kro -mosoma Y in pred nekaj leti preiskave poli -morfizmov mitohondrijske DNA (mDNA), saj tipizacija jedrne DNA pri starih in slabo ohranjenih bioloških materialih zaradi močne razgradnje ni bila vedno uspešna (1-5).
Za preverjanje sorodstvenih povezav (zlasti spornih očetovstev) in identifikacijo oseb iz razmeroma dobro ohranjenih bioloških materialov izoliramo genomsko DNA iz naslednjih bioloških vzorcev: kri in krvni madeži, slina in sledovi sline v kriminalističnih primerih (cigaretni ogorki, poštne znamke, zobne ščetke), tkiva, odvzeta pri obdukciji, sperma in vaginalni brisi, odvzeti po posilstvu, lasje z lasno korenino, prhljaj, citološki in histološki preparati, tkiva, vpeta v parafinske bloke, epitelijske celice na prstnem odtisu (kontaktne sledi) itd. Iz starih bioloških materialov (skeletni ostanki, zobje), slabo ohranjenih bioloških vzorcev (v eksplozijah, požarih ali prometnih nesrečah zoglenela in močno poškodovana trupla), iz starega fece-sa ter mikrosledov v kriminalističnih prime -rih (izpadli lasje, ki so običajno brez korenin) pogosto ni mogoče izolirati dovolj kvalitetne jedrne DNA za uspešno tipizacijo mikrosa -telitskih področij, pričakujemo pa lahko uspešno tipizacijo mDNA.
Ob metodi genetskega profiliranja jedr -ne DNA nam tipizacija mDNA v rutinskih preiskavah omogoča celosten pristop k mo-lekularnogenetskim identifikacijam biološke -ga materiala v sodni medicini in kriminalistiki. Tako smo v zadnjih letih uspešno identifici -rali žrtve povojnih množičnih grobišč (6-10). Genetsko smo obdelali štiri grobišča, za katera so bili na razpolago poimenski seznami žrtev, na osnovi katerih smo lahko zbrali primerjalne vzorce ustnih sluznic še živečih sorodnikov. Največje grobišče, ki smo ga molekularnoge-netsko obdelali, je bilo grobišče Konfin I, iz
katerega so leta 2006 izkopali skeletne ostanke 88 žrtev, za katere smo uspeli pridobiti brise ustnih sluznic še živečih bližnjih in daljnih sorodnikov za 44 žrtev. Za preiskave smo upo -rabili stegnenice, katerih genetske profile smo primerjali s še živečimi sorodniki. Ob primerjavi genetskih profilov kosti s še živečimi sorodniki smo pri 32 kosteh zasledili ujemanje z referenčnimi osebami (sestrami, brati, hčerami, sinovi, bratranci in nečaki) in pri vseh izračunali verjetnost sorodstva, ki je presegala vrednost 99,9 %, kar po mednarodnih priporočilih zadostuje za pozitivno identifikacijo. Dokazali smo, da je ob preiskavi večjega števila genetskih označevalcev (avtosomski mikrosateliti, mikrosateliti kromosoma Y in kontrolna regija mDNA) in vključitvi bližnjih in daljnih sorodnikov žrtev v analizo mogoče pozitivno identificirati žrtve 2. svetovne vojne, za katere je zaradi časovne oddaljenosti težko pridobiti še živeče bližnje sorodnike. Molekularnogenetska identifikacija žrtev grobišča Konfin I je objavljena v najuglednejši svetovni forenzični reviji International Journal of Legal Medicine (10). Trenutno poteka v Laboratoriju za molekularno genetiko ISM molekularnogenetska identifikacija skeletnih ostankov domnevnih članov rodbine Auersperg iz 17. stoletja. Te kosti in zobe obdelujemo po postopkih, primernih za starodavne skeletne ostanke, pri katerih je zlasti pomembna popolna demine-ralizacija (11).
Na ISM opravljamo naslednje forenzično -genetske preiskave (6-10, 12-17):
•	preverjanje sorodstvenih odnosov (bližnji sorodstveni odnosi, kot so sporna očetovstva, in daljne sorodstvene povezave),
•	identifikacija bioloških sledi v kriminalistič -nih primerih (umori, posilstva, ropi, rekon -strukcije prometnih nesreč in iskanje sledi voznika itd.),
•	identifikacija skeletiziranih posmrtnih ostankov ter razpadlih in zoglenelih trupel (neznana trupla in masovne katastrofe),
•	identifikacija tkivnih vzorcev,
•	spremljanje uspešnosti transplantacije kost -nega mozga in drugih krvotvornih matičnih celic,
•	določanje, ali sta dvojčka eno- ali dvojajčna,
•	preverjanje identitete bioloških vzorcev, odvzetih za alkoholimetrične ali toksikološke preiskave,
•	identifikacija žrtev 2. svetovne vojne in povojnih pobojev in
•	identifikacija skeletnih ostankov iz arheoloških najdišč.
Molekularnogenetske metode za identifikacijo biološkega materiala in preverjanje sorodstvenih povezav se od začetka devetdesetih let uporabljajo v sodnomedicinskih, kriminalističnih, paleoantropoloških in gene -aloških študijah, pa tudi v študijah muzejskih živalskih in rastlinskih materialov (18, 19). Z metodo genetskega profiliranja določamo alelne vzorce oz. genetske profile jedrne DNA. Ta metoda nam prvič v zgodovini omogoča pozitivno identifikacijo in ne le izključitve. Vse predhodne metode so namreč uporabljale serološke in biokemične označevalce, ki so imeli prenizko variabilnost, da bi lahko natanč -no določili identiteto vzorca (20). Zelo uspe -šno uporabo polimorfizmov DNA je omogočilo odkritje verižne reakcije s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR), pri kateri polimorfne odseke DNA pomnožimo v milijon ali več kopijah. Tako je danes mogoča uspešna identifikacija las, sline iz cigaretnega ogorka, sline iz poštne znamke, prhljaja, epitelijskih celic na prstnem odtisu (kontaktne sledi) in paleoantropološkega biološkega materiala (21) .
Uspešnost genetskih identifikacijskih metod je odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA in torej od ohranjenosti bio -loškega materiala, ki ga želimo preučevati. Pri svežih tkivih in sorazmerno dobro ohranje -nih bioloških vzorcih z metodo genetskega profiliranja analiziramo dolžinske polimorfiz-me jedrne DNA (avtosomske kromosome in kromosom Y). Pri starih in problematičnih vzorcih pa se lahko zgodi, da zaradi močne razgradnje jedrne DNA ni mogoče pridobiti v zadostnih količinah. V takih primerih upo -rabimo sekvenčne polimorfizme mDNA. Problematične biološke vzorce predstavljajo stari skeletni ostanki in zobje, slabo ohranjeni ali močno poškodovani človeški posmrtni ostanki (v letalskih, železniških in prometnih nesrečah, eksplozijah in požarih zoglenela in močno poškodovana trupla, žrtve naravnih nesreč, terorističnih napadov ali vojn), stari
nohti, feces in urin ter mikrosledovi v kriminalističnih primerih (zlasti izpadli telogeni lasje, ki jih kriminalisti pogosto najdejo na kraju kaznivega dejanja) (5).
PREISKAVE JEDRNE DNA
Na jedrni DNA opravljamo dve vrsti preiskav. Prva je preiskava avtosomskih kromosomov, druga pa preiskava spolnih kromosomov, zla -sti moškega spolnega kromosoma Y. Oba tipa preiskav uporabljamo za reševanje različnih sodnomedicinskih primerov. Vzrok za to so razlike v načinu dedovanja avtosomov in kro -mosoma Y ter velike razlike v diskriminacij-skem potencialu (moči razlikovanja) obeh tipov preiskav (22).
Avtosomska DNA
Avtosomska DNA je najbolj polimorfna, zato jo najpogosteje preiskujemo tako pri preverjanju bližnjih sorodstvenih povezav kot pri identifikacijskih testih. Avtosomski genetski profil lahko določimo vsem biološkim vzorcem, ki vsebujejo celice s celičnim jedrom, v katerih se nahaja DNA. Analiziramo mikro-satelite ali kratke tandemske ponovitve (angl. short tandem repeat, STR). Področja STR pred -stavljajo individualno najbolj specifične odseke človeškega genoma. Njihova variabilnost znotraj populacije je tako visoka, da lahko z uporabo večjega števila področij STR med seboj razlikujemo kateri koli osebi razen enojajčnih dvojčkov, katerih dednina je identič -na. Pripadajo nekodirajoči DNA in ne kodirajo beljakovin ter so raztreseni po vsem genomu. So nevtralni, kar pomeni, da ne nosijo nobe -ne informacije o fenotipskih lastnostih posameznika in nam omogočajo le ugotavljanje identitete. Področja STR imajo obliko kratkih, tandemsko ponovljenih nukleotidnih zapore -dij, osnovnih motivov, ki se ponavljajo v številnih identičnih ali sorodnih kopijah. Dolžinski polimorfizem področij STR torej temelji na variacijah v številu ponovitev osnovnega moti -va. Ljudje se med seboj razlikujemo v številu ponovitev osnovnega motiva preiskovanih področij STR. Na vsakem avtosomskem področ -ju STR imamo dva alela. Enega smo podedo -vali po materi in drugega po očetu. Alele označujemo s številkami, ki predstavljajo šte -vilo ponovitev osnovnega motiva. Forenzič -
327
OSEBA 1 koomil<
očetov | | AATG | AATG | AATG | AATG | AATG | AATG |AATG |AATG | J 8 ponovitev (alel 8)
materin | | AATG | AATG | AATG | AATG | AATG
| 5 ponovitev (alel 5)
homologna / OSEBA 2 kromosoma \
očetom | | AATG | AATG | AATG | AATG |AATG |AATG
| 6 ponovitev (alel 6)
materin | | AATG | AATG | AATG | AATG | AATG | AATG |AATG |AATG |AATG || 9 ponovitev (alel 9)
Slika 1. Shematskiprikaz dolžinskega polimorfizma lokusa kratkih tandemskih ponovitev (STR).
328
na področja STR imajo v glavnem osnovni motiv dolžine 4 nukleotidov, njihova skupna dolžina pa ne presega 400 nukleotidov (22).
Na sliki 1 je shematsko prikazan dolžinski polimorfizem enega od področij oz. loku-sov STR. Osnovni motivi so obarvani rumeno, njihovo nukleotidno zaporedje je AATG, mejna področja lokusa pa so obarvana modro. Obe prikazani osebi imata zaradi različnega števila ponovitev osnovnega motiva na loku-su različno dolge alele. Tako ima oseba 1 na enem kromosomu 8 ponovitev osnovnega motiva in na homolognem kromosomu 5 po -novitev, oseba 2 pa ima 6 in 9 ponovitev osnovnega motiva.
Rodovniške analize so pokazale, da se področja STR razporejajo neodvisno s staršev na potomce, kažejo kodominantno naravo alelov in se dedujejo strogo po Mendlovih zakonih dedovanja, po katerih otrok vedno podeduje en alel od matere in enega od oče -ta. Na tej osnovi temeljijo preverjanja spor -nih očetovstev in druge preiskave, pri katerih ugotavljamo bližnje sorodstvene povezave med posamezniki. Identifikacijski testi, pri katerih iščemo popolno identičnost genetskih profilov analiziranih vzorcev in jih najpogo -steje uporabljamo v kriminalističnih prime -rih, pa temeljijo na predpostavki, da imajo vsa tkiva posameznika enak genotip. Po pomno -žitvi večjega števila področij STR v verižni reakciji s polimerazo in ločitvi produktov reak -cije s kapilarno elektroforezo, dobimo indi -vidualno specifičen alelni vzorec ali genetski profil (imenujemo ga tudi profil DNA ali pro -
fil STR) preiskovanih mikrosatelitov posameznika ali biološke sledi.
Genetski profil grafično prikažemo v obliki elektroferograma, na katerem vsak vrh ustreza enemu alelu področja STR. Os x nam podaja dolžino fragmentov DNA (aleli so označeni s številom ponovitev osnovnih motivov), os y pa intenziteto fluorescentnega signala v relativnih enotah fluorescence (RFU). Elektroferogram v obliki, kot je prikazan na sliki 2, oddamo kot končni rezultat genetske preiskave. Na sliki 2 je prikazan produkt reakcije AmpFlSTR Identifiler (Applied Biosystems), v kateri smo pomnožili 15 področij STR avto-somske jedrne DNA, ki smo jo pridobili iz leve stegnenice skeleta 3, najdenega v povojnem grobišču pod Storžičem.
Profile lahko med seboj primerjamo in ugotavljamo, ali imajo skupen izvor ali ne. Kadar se dva profila med seboj ne ujemata, biološka vzorca nimata skupnega izvora. Ob popolnem ujemanju genetskih profilov pa potrdimo skupen izvor vzorcev. S preiskavo 15 avtosomskih področij STR dosegamo pri identifikacijskih testih verjetnost ujemanja približno od 10-15 do 10-19 (to je verjetnost, da bosta imeli dve naključno izbrani in sorodstveno nepovezani osebi identičen genetski profil na preiskovanih 15 področjih STR). Pri preverjanju spornih očetovstev pa dosegamo verjetnost očetovstva, ki v glavnem presega vrednost 99,999%. Po mednarodnih priporo -čilih mora za potrditev sorodstvenega odnosa ta verjetnost presegati vrednost 99,9 %.
329
Slika 2. Elektroferogram genetskega profila, ki smo ga pridobili iz leve stegnenice skeleta 3, najdenega v povojnem grobišču pod Stor-žičem. Za pomnoievanje področij STR smo uporabili komplet AmpFlSTR IdentifilerTM PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), s ka -terim smo v posamezni reakciji sočasno pomnožili 15 področij STR in odsek amelogeninskega gena, ki omogoča določitev spola. Z modro barvo so označena 4 področja STR (od najkrajšega do najdaljšega si sledijo po velikosti v naslednjem vrstnem redu: D8S1179, D21S11, D7S820 in CSF1PO), z zeleno 5 področij STR (D3S1358, THO1, D13S317, D16S539 in D2S1338), s črno 4 področja STR (D19S433, vWA,, TPOX in D18S51) in z rdečo 2 področji STR (D5S818 in FGA) ter odsek amelogeninskega gena, homolognega kromosomoma X in Y, ki omogoča določitev spola. STR - kratke tandemske ponovitve.
Preverjanje sorodstvenih povezav
Najpogosteje uporabljamo teste ugotavlja -nja bližnjih sorodstvenih povezav za prever -janje starševstva oz. spornih očetovstev, saj običajno materinstva niso sporna (razen pri detomorih). Očetovstvo potrdimo, ko je potrditev prisotna na vseh 15 področjih STR, izključimo pa, ko so izključitve prisotne na vsaj treh analiziranih področjih STR. Izključitev na enem ali dveh področjih bi namreč lahko bila posledica naključne mutacije. Poleg pre -verjanja spornih očetovstev so testi dokazo-
vanja bližnjih sorodstvenih povezav uporab -ni tudi za reševanje imigracijskih primerov, s katerimi se je v preteklosti v Evropi najpo -gosteje srečevala Velika Britanija (23). Po bri -tanskem zakonu imajo imigranti s stalnim bivališčem pravico zahtevati stalno bivališče tudi za najbližje sorodnike, pri čemer morajo dokazati prvostopenjsko sorodstveno povezavo. Poleg tega te teste uporabljamo za prever -janje družinskih sorodstvenih odnosov v grobiščih (primer je identifikacija ruske vla -darske družine Romanov) in za identifikacijo posmrtnih ostankov z reverznimi testi star -
330
ševstva. Pri teh testih preverjamo, ali imajo posmrtni ostanki domnevnega sina ali hčere genetski profil, ki ustreza genetskemu profilu otroka še živečih analiziranih staršev. Uporabljamo jih pri masovnih katastrofah, kot so letalske nesreče in potresi, ter pri identifikacijah posmrtnih ostankov v množičnih grobiščih. Pri vseh masovnih katastrofah, pri katerih začnejo z identificiranjem pogrešanih oseb neposredno po nesreči (letalske nesreče, teroristični napad na Svetovni trgovinski center v New Yorku leta 2001 itd.), so za genetske preiskave najprimernejši referenčni oz. primerjalni vzorci osebni predmeti (zobne ščetke, glavniki, brivniki), ki jih najdemo v domovih pogrešanih oseb. Tovrstni vzorci nam namreč omogočajo neposredno primerjavo genetskih profilov v smislu iskanja identičnosti, kar je zaradi majhnega števila referenčnih vzorcev z ekonomskega vidika najracionalnejši pristop.
Pri zastarelih masovnih katastrofah (množična grobišča iz časa 2. svetovne vojne in povojnih pobojev v Sloveniji, množična grobišča v BiH itd.) pa osebnih predmetov pogrešanih po vrsti let ni več mogoče zbrati, zato nam kot referenčni vzorci služijo njihovi še živeči sorodniki. Identiteto pogrešanega oz. žrtve najlažje določimo, če imamo na voljo primerjalne vzorce bližnjih sorodnikov. Ce teh ni, moramo za uspešno genetsko identifikacijo (pri kateri poleg avtosomskih področij STR preiskujemo še področja STR, vezana na kromosom Y in mDNA) zbrati čim večje šte -vilo sorodnikov pogrešane osebe (za primer -javo kromosoma Y sorodnike po očetovi liniji, za primerjavo mDNA pa sorodnike po mate -rini liniji), kar močno poveča stroške tovrst -nih preiskav.
Velikokrat se uporablja jedrne polimorfiz -me za identifikacijo žrtev množičnih nesreč, kot so naravne katastrofe (potresi, poplave, požari, cunamiji), letalske in železniške nesre -če ter teroristični napadi (24-30). Tako so Olaisen in njegovi sodelavci identificirali 139 od skupno 141 ruskih in ukrajinskih žrtev letalske nesreče, ki se je zgodila avgusta 1996 v Spitsbergnu (25). Uspešnost identifikacije s pomočjo analize DNA je v celoti odvisna od razpoložljivosti referenčnih vzorcev. Le dve žrtvi nista imeli bližnjih sorodnikov, zato jih s tipizacijo DNA niso mogli identificirati, pri
drugih žrtvah pa je bila identifikacija uspešna. Genetske profile, ki so jih dobili iz močno poškodovanih delov teles, so primerjali z genetskimi profili bližnjih sorodnikov. Najprimernejši referenčni vzorci so matere, očetje ali otroci žrtev, saj imajo na posameznem področju STR vsaj en skupni alel. Ce so bile na razpolago le sestre ali bratje, so kot referenčne vzorce uporabili več bratov in/ali sester. Pri letalski nesreči v Spitsbergnu je bila tipizacija DNA primarna identifikacijska metoda. Zaradi izredno visokega odstotka uspešnih identifikacij (98,6%), hitrih analiz (identifikacijo žrtev so zaključili 20 dni po nesreči) in razmeroma nizke cene (110.000 USD oz. 3-5% cene celotne operacije) se je izkazala kot izredno primerna identifikacijska metoda pri množičnih katastrofah (25). S preiskavo jedrne DNA poteka identifikacija žrtev množičnih pobojev na ozemlju bivše Jugoslavije (31, 32). Prav tako je s tipizacijo jedrne DNA Jeffreys s sodelavci identificiral nacističnega zdravnika Josefa Mengeleja (referenčni osebi sta bila sin in žena) (33).
Identifikacija celične populacije po presaditvi kostnega mozga in drugih krvotvornih matičnih celic ter določanje eno- oziroma dvojajčnih dvojčkov
Določanje izvora celične populacije po transplantaciji kostnega mozga je pomembno za nadzorovanje uspešnosti presaditve. Bolnika in darovalca presadka tipiziramo pred transplantacijo (določimo genetske profile na področjih STR), po transplantaciji pa pri bolniku v določenih časovnih intervalih preverjamo razmerje med bolnikovimi in daro -valčevimi populacijami levkocitov. Uspešnost transplantacije potrdimo, ko se v bolnikovi krvi pojavi genetski profil darovalca. Z ugotavljanjem razmerja med genetskim profilom bolnika in darovalca lahko določimo stopnjo vcepitve presadka. Tovrstna informacija je zelo uporabna v zgodnji potransplantacijski fazi, saj omogoča odločitev za dodatno zdrav -ljenje, ki prepreči neuspešno transplantaci -jo oz. ponoven pojav bolezni (34).
Določanje eno- ali dvojajčnih dvojčkov je pomembno ob potrebi po transplantaciji določenega tkiva ali organa. Ce se dvojčka popol -noma ujemata v genetskih profilih, smo tipizirali enojajčna dvojčka.
Identifikacijski testi
Avtosomska področja STR so poleg preverjanja sorodstvenih odnosov izredno uporabna za identifikacijske teste, pri katerih ne spremljamo načina dedovanja, ampak nas zanima, ali se genetski profili analiziranih vzorcev med seboj ujemajo. Najpogosteje jih opravljamo v kriminalističnih primerih, kot so umori, posilstva, ropi, pretepi, rekonstrukcije prometnih nesreč, iskanje sledi voznika ipd. Osumljenčev genetski profil primerjamo z genetskimi profili bioloških sledi, najdenih na kraju kaz -nivega dejanja. Da lahko potrdimo vpletenost osumljenca v kaznivo dejanje, se mora njegov genetski profil popolnoma ujemati z genetskim profilom biološke sledi (35-37). Enako načelo velja za identifikacijo delov trupel po množičnih katastrofah. Deli trupla, ki imajo enak genetski profil, pripadajo isti osebi. Na podoben način opravimo tudi identifikacijo tkivnih vzorcev, odvzetih pri raznih biopsijah, kadar obstoja možnost zamenjave vzorcev (genetski profil biopsijskega vzorca primerjamo z genetskih profilom bolnika). Tipizacijo DNA uporabimo tudi za preverjanje identitete bioloških vzorcev, odvzetih za alkoholimetrič-ne ali toksikološke preiskave v primerih, ko se preiskovanci z rezultati preiskav ne strinjajo in izrazijo dvom o istovetnosti preiskovanega biološkega vzorca. Na osnovi ponovnega odvzema telesnih tekočin (krvi, sline) preiskovancu ter pridobitvi DNA iz preiskovančevih bioloških vzorcev in arhiviranega vzorca opra -vimo tipizacijo avtosomske jedrne DNA in pridobljene genetske profile med seboj pri -merjamo.
Opravljeni tipizaciji področij STR sledi interpretacija rezultatov oz. ocena moči genet -skega dokaza. Ce se genetski profil osumljen -ca (ali bolnika ali preiskovanca) in genetski profil biološke sledi (ali spornega tkivnega vzorca ali arhiviranega vzorca za alkoholime -trične oz. toksikološke preiskave) ujemata, nas zanima, kakšna je verjetnost, da imata oba genetska profila isti izvor, oz. kakšna je verjetnost, da ima naključno izbrana oseba iz slovenske populacije enak genetski profil kot biološka sled, ali kakšna je verjetnost, da je ujemanje osumljenčevega profila in profila biološke sledi naključno. Na ta vprašanja nam daje odgovore verjetnostna teorija.
Verjetnost izračunamo empirično in temelji na populacijskih podatkih. Za oceno moči genetskega dokaza potrebujemo za vsako področje STR opravljeno populacijsko študijo na slovenski populaciji z izračunanimi alel-nimi frekvencami ter preverjeno neodvisnostjo genetskih podatkov znotraj posameznega področja in med področji STR (1, 2, 12). Ce je populacijski vzorec velik, bo empirično določena verjetnost oz. frekvenca določenega genetskega profila zelo dober približek resnični frekvenci. Pri izračunavanju frekvence genetskega profila v populaciji uporabljamo »pravilo produkta«, ki ga podaja verjetnost kombiniranih dogodkov. Ce so dogodki neodvisni, je skupna verjetnost, da se vsi zgodijo skupaj, produkt verjetnosti posameznih dogodkov. V forenziki predstavljajo dogodke posamezna področja STR. Ker morajo biti dogodki naključni in med seboj neodvisni, se področja STR ne smejo dedovati vezano (ležati morajo na različnih kromosomih ali čim dlje narazen na istem kromosomu). Frekvenco genotipa na enem področju STR ocenimo kot produkt alel -nih frekvenc (za homozigota je ta frekvenca p2, za heterozigota pa 2pq). Skupno frekvenco genetskega profila na vseh analiziranih področjih STR pa ocenimo kot produkt frekvenc genotipov posameznih področij. Frekvenca genetskega profila predstavlja verjetnost, s katero pride v populaciji do naključnega ujemanja dveh profilov sorodstveno nepovezanih oseb. Frekvenca je majhna, če je v profil vključenih veliko področij STR (pri tipizaci -ji 15 področij STR približno od 10-15 do 10-19). Ujemanje dveh genetskih profilov statistično ovrednotimo z verjetnostnim razmerjem, ki ga označimo s kratico LR (angl. likelihood ratio) in je obratno sorazmerno frekvenci genetskega profila: LR = 1/frekvenca genetskega profi -la (2). Pri izračunu LR primerjamo verjetnost dogodka, da biološka sled pripada osumljen -cu (števec), in verjetnost dogodka, da biološ -ka sled pripada naključno izbrani osebi iz slovenske populacije (imenovalec). Verjetnost v števcu je 1, verjetnost v imenovalcu pa je enaka frekvenci genetskega profila. Verjet -nostno razmerje nam pove, kolikokrat bolj verjetno je, da biološka sled pripada osumljen -cu, kot da pripada naključno izbrani osebi iz slovenske populacije. Na našem inštitutu ga računamo s pomočjo statističnega programa
332
DNA VIEW v.29.48 (2011) avtorja C. H. Bren -nerja (38).
Avtosomska področja STR so zaradi rekom-binacije v molekularnogenetskih genealoških študijah pri primerjavi z daljnimi sorodniki manj uporabna. Za preučevanje rodovnikov z genetskimi metodami so uporabna področja STR, vezana na kromosom Y, ki nam omogočajo sledenje očetovi liniji, in preiskave mDNA, s katero lahko sledimo materini liniji. Ker biološko materinstvo v nasprotju z biološkim očetovstvom po navadi ni sporno, so vsekakor rezultati, ki jih dobimo s preiskavo mDNA, zanesljivejši od rezultatov preučevanja kromosoma Y. Verjetnost, da je nekje v predniški očetovi liniji prišlo do nebiološ-kega očetovstva zaradi nezvestobe, posilstev ali posvojitev, je v ZDA približno 5 %. Ni veli -ko, vendar bi lahko po 10 generacijah verjetnost, da bi v krvni liniji prišlo do dogodka, ki ga genetiki imenujemo nebiološko očetovstvo, presegla 50 %.
Kromosom Y
V sodnomedicinskih in kriminalističnih prei -skavah se je širša uporaba področij STR, veza -nih na kromosom Y (Y-STR), začela leta 1996. Kromosom Y je haploiden in se deduje po očetu, kar nam omogoča sledenje očetovi liniji. To pomeni, da lahko v preiskave vključimo le moške, saj ga ženske nimajo. Kromosom Y nima kromosomskega partnerja, s katerim bi se pri meiozi rekombiniral (izjema sta dve majhni psevdoavtosomski področji, ki se rekom -binirata s kromosomom X), zato se z očeta na sina prenaša v identični obliki. Edine spre -membe na kromosomu Y povzročajo redke mutacije. Ko pride do mutacije, se zaradi odsotnosti rekombinacije le-ta ohrani in pre -nese na naslednjo generacijo. Zato vsebuje vsak kromosom Y zapis vseh mutacijskih dogodkov, do katerih je prišlo na Y kromoso -mih prednikov mnogo let nazaj. Kadar preu -čujemo rodovnike znotraj 8-9 generacij, je mutacijska stopnja kromosoma Y zelo nizka (1,9-5,4 x 10-9 na nukleotid/leto) (39).
Kromosom Y nam omogoča reševanje t. i. pomanjkljivih spornih očetovstev, kjer biološki material domnevnega očeta ni na razpolago za analizo, namesto njega pa lahko testiramo njegove moške sorodnike, katerih kromo -som Y je identičen (očeta, dedka, brate, stri-
ce). Žal pa lahko na ta način preverjamo sporna očetovstva le, ko je otrok moškega spola. Ce se haplotipi kromosoma Y testiranih očetovih sorodnikov po očetovi strani razlikujejo od otrokovega haplotipa, govorimo o izključitvi. Pri tem je dobro preveriti, ali ni prišlo do izključitve očetovstva že v eni od prejšnjih generacij. Kromosom Y nam služi kot zelo koristen dodaten sistem pri identifikaciji žrtev množičnih pobojev ob koncu 2. svetovne vojne v Sloveniji, saj lahko v preiskavo vključimo tudi daljne sorodnike po očetovi liniji, hkrati pa lahko s pomočjo kromosoma Y pri bližnjih sorodnikih, npr. bratih, povečamo izračunano statistično verjetnost sorodstva med žrtvijo in še živečim sorodnikom (40).
Diskriminacijska moč za Y specifičen identifikacijski sistem je bistveno nižja od avtosom -skega sistema, ki nam daje edinstven genetski zapis. Sistem, specifičen za kromosom Y, nam da haplotip, ki je identičen vsem moškim sorodnikom po očetovi liniji (očetu, dedku, bratom, stricem). S tipizacijo mikrosatelitov kromosoma Y torej lahko identificiramo le paternal-no (očetovo ali moško) linijo, medtem ko nam mikrosateliti jedrne avtosomske DNA omogočajo individualizacijo posameznika. Ce primerjamo diskriminacijsko moč (moč razlikovanja med nesorodnimi osebami) sistema Y-STR z jedrno avtosomsko DNA, vidimo, da je stopnja identifikacije posameznika z jedrno avtosomsko DNA praktično 100% (običaj -no večja kot 99,9999 %), stopnja identifikaci -je paternalne linije s tipizacijo mikrosatelitov kromosoma Y pa je približno 99 %. Sistem, pri katerem analiziramo 17 Y-STR področij, nam namreč daje informativno vrednost haploti -pov, ki znaša 98,8 %, kar pomeni, da je v sloven -ski populaciji verjetnost naključnega ujemanja haplotipov kromosoma Y med sorodstveno nepovezanimi osebami 1,2% (3). Zato je sistem z Y specifičnimi označevalci, če ga upo -rabimo kot samostojni test, uporaben za izklju -čitve. V kombinaciji z avtosomskimi ozna -čevalci STR nam omogoča pri potrditvah očetovstva ali drugih sorodstvenih povezavah povečanje statistične verjetnosti sorodstva, pri čemer določimo frekvenco haplotipa kromosoma Y s pomočjo podatkovne zbirke YHRD (angl. Y chromosome haplotype reference data -base) (41).
Spolna kromosoma X in Y nam omogočata določanje spola forenzičnega vzorca tako v kriminalističnih kot v genealoških in sodnomedicinskih primerih, pri katerih imamo opravka s skeletiziranimi posmrtnimi ostanki ali neprepoznavnimi trupli. Test za določanje spola temelji na pomnoževanju kratkega odseka introna 1 amelogeninskega gena na kromosomih X in Y in ga je opisal Sullivan s sodelavci (42). Amelogenin je protein, ki sodeluje pri razvoju skleninskega matrik-sa zobne pulpe pri sesalcih. V nasprotju s področji STR amelogeninski gen ne predstavlja ponavljajočega se nukleotidnega zaporedja (43). Med homolognimi geni kromosoma X in Y je amelogeninski gen najprimernejši za določanje spola. Po PCR, pri kateri uporabimo en par začetnih oligonukleotidov, dobimo za kromosoma X in Y specifične produkte, ki se med seboj razlikujejo po dolžini. Na pomnoženem intronskem odseku je namreč med kromosomoma X in Y prisotna dolžinska razlika. Na kromosomu X je v evoluciji prišlo do delecije šestih baznih parov, zato dobimo krajši amplifikacijski produkt kot na kromosomu Y. Pri pomnoževanju ženske DNA (XX) dobimo produkta istih dolžin, pri pomnože-vanju moške DNA (XY) pa produkta dveh različnih dolžin, ki se med seboj razlikujeta za šest baznih parov. Ker so produkti pomnoževa-nja odseka amelogeninskega gena zelo kratki, lahko določamo spol tudi za močno razgrajene vzorce (44). Odsek amelogeninskega gena pomnožujemo v hkratni reakciji PCR skupaj s področji STR, kar nam omogoča poleg ugotavljanja identitete tudi določanje spola. Kombinacija obeh informacij je zelo uporabna pri analizi kriminalističnih vzorcev (42).
Ker se kromosom Y in priimki v zahod -ni civilizaciji dedujejo po moški liniji, lahko sledimo prednikom po pisnih virih (priimki in kraj izvora) in te izsledke primerjamo s pre -iskavami kromosoma Y še živečih domnevnih potomcev po paternalni liniji. Pri preučeva -nju paternalnih rodovnikov preko priimkov ljudi predvsem zanima, ali je nek moški, ki so ga odkrili v pisnih virih in je prišel npr. iz Evrope v ZDA sredi 18. stoletja, njihov pred -nik Kot primerjalni vzorci so uporabni moški, ki živijo v bližini kraja, od koder je priselje -nec pripotoval v Ameriko in imajo enak pri -imek. Genetska analiza vključuje približno
17 področij Y-STR. Če se moška, ki iščeta skupnega prednika, razlikujeta na treh ali več področjih STR, nista sorodna (s tem upoštevamo možnost mutacijskega dogodka), v nasprotnem primeru pa imata skupnega prednika in sta daljna sorodnika.
Kromosom Y so za razjasnitev očetovstva analizirali v nekaterih zelo znanih in polemič -nih genealoških študijah. Tako so dokazali, da je bil tretji ameriški predsednik Thomas Jefferson oče najmanj enega od sedmih sinov svoje sužnje Sally, o čemer se je v ameriški črnski skupnosti govorilo že od 19. stoletja, vendar so beli zgodovinarji v skrbi za Jeffersonov moralni lik to vztrajno zavračali. Kot primer -jalne vzorce za Thomasa Jeffersona in sinove sužnje Sally so uporabili njihove še živeče potomce po moški liniji. Po pregledovanju rodovnikov so za Thomasa Jeffersona našli še živeče potomce po njegovem stricu (po očetovi strani), še živeče potomce pa sta imela tudi prvi in zadnji sin sužnje Sally. Za zadnjega sina so dokazali identičnost haplotipov kromosoma Y s potomci Thomasa Jeffersona (45).
PREISKAVE MITOHONDRIJSKE DNA
Kadar analiza jedrne DNA (tako avtosomske kot DNA, vezane na kromosom Y) zaradi premajhne količine genetskega materiala ali njegove razgrajenosti ni uspešna, se poslužujemo polimorfizmov mDNA, ki jih od leta 1992 upo -rabljamo v forenzičnih preiskavah. Posamezna človeška celica vsebuje številne kopije mDNA, kar daje v primerjavi z le dvema kopijama avtosomskih kromosomov veliko večjo mož -nost izolacije mDNA iz slabo ohranjenih bioloških vzorcev, kot so telogeni lasje, stare kosti, zobje, feces, urin in nohti (46). V metabolno aktivnih celicah najdemo 1.000-10.000 mo -lekul mDNA. Krožna oblika in mitohondrij -ska ovojnica ščitita mDNA pred razgradnjo z eksonukleaznimi encimi, zato je mDNA manj podvržena razgradnji kot jedrna DNA (47). To še dodatno poveča možnost uspešne analize slabo ohranjenih vzorcev z mDNA. Mitohon-driji se nahajajo v citoplazmi, zato se mDNA deduje neodvisno od jedrnega genoma. Za gene, ki se nahajajo zunaj jedra, je značilno citoplazmatsko dedovanje, katerega skrajni primer je dedovanje po enem staršu, večino -
333
334
ma po materi. Mitohondrijska DNA se pri človeku deduje po materi in se v nasprotju s kromosomom Y prenese na vse njene potomce ne glede na spol, kar omogoča sledenje materini liniji. Zaradi maternalnega dedovanja obravnavamo nukleotidno zaporedje mDNA kot enolokusno ali haplotipsko (48). Zaradi odsotnosti rekombinacije in dedovanja po materi imajo osebe z enakimi zaporedji nukleotidov mDNA skupnega ženskega prednika. To je osnova za identifikacijo bioloških vzorcev s pomočjo analize mDNA. V nasprotju s kromosomom Y ima mDNA nekoliko višjo muta -cijsko stopnjo (3,5 x 10-8/ nukleotid / leto) (49).
Mitohondrijska DNA predstavlja pri človeku 0,3 % genomske DNA. Je majhna, dvo-verižna, kovalentno zaprta krožna molekula, ki jo sestavljata zunanja težka veriga (veriga H) in notranja lahka veriga (veriga L). Dolga je 16.569 baznih parov (bp) in ima v celoti določeno nukleotidno zaporedje (50). Z vidika forenzičnih molekularnogenetskih preiskav je zaradi izredne polimorfnosti zanimiva zlasti nekodirajoča kontrolna regija m-DNA. V kodirajočih področjih pa so zanimive točkovne mutacije, ki jih imenujemo enonu-kleotidni polimorfizmi (angl. single nucleoti-de polymorphism, SNP). Ti nam omogočajo povečanje diskriminacijske in izključitvene moči molekularnogenetskih identifikacij s tipizacijo mDNA (51 ). Variabilno kontrolno regijo mDNA imenujemo tudi zanka D. Znotraj te zanke sta najbolj variabilni hipervariabilni področji 1 in 2 (HVI in HVII), od katerih je vsako dolgo približno 400 bp. HVI ima večje število sekvenčno variabilnih mest in nižjo frekvenco posameznih polimorfizmov, HVII pa manjše število sekvenčnih polimorfizmov, ki imajo višjo frekvenco (52). Identifikacije s pomočjo mDNA temeljijo na sekvenčnem polimorfizmu teh dveh področij. Belci se med seboj razlikujejo na obeh področjih povprečno na osmih nukleotidnih mestih, kar predstavlja približno 1,5 % nukleotidno raz -nolikost, medtem ko se pripadniki črne rase med seboj razlikujejo na obeh področjih povprečno kar na 14 nukleotidnih pozicijah (53). Raznolikost mDNA je od 5- do 10-krat višja med rasami kot znotraj posameznih ras, ki so med seboj precej podobne (54). Raznolikost znotraj črne rase je veliko večja kot znotraj azijske, belske in hispanske rase, po variabil-
nosti pa črnski rasi sledi azijska rasa (55, 56). Zaradi velike variabilnosti mDNA znotraj in med populacijami lahko s polimorfizmi mDNA ugotavljamo genetsko strukturo populacij, filogenetske odnose med njimi ter migracije in poselitev sveta z modernim človekom.
Analizo sekvenčnega polimorfizma mDNA uporabljamo za identifikacijske teste in za določanje maternalnih rodovnikov, ni pa pri -merna za preverjanje spornih očetovstev, saj se deduje le po materi. Primerna je za reševanje detomorov, pri katerih se morata mDNA domnevne matere in najdenih posmrtnih ostankov novorojenca popolnoma ujemati. Mitohondrijska DNA nam služi kot zelo koristen dodaten sistem pri identifikaciji žrtev množičnih pobojev ob koncu 2. svetovne vojne v Sloveniji, saj lahko v preiskavo vključimo tudi daljne sorodnike po materini liniji, hkrati pa lahko s pomočjo mDNA pri bližnjih sorodnikih, npr. bratih in sestrah, povečamo izračunano statistično verjetnost sorodstva med žrtvijo in še živečim sorodnikom, pri čemer določimo frekvenco haplotipa mDNA s pomočjo podatkovne zbirke EMPOP (European mDNA database) (57, 58).
Mitohondrijski genom je zelo uporaben za določanje identitete starih posmrtnih ostankov in preučevanje genealoških odnosov, saj lahko kot referenčni vzorec uporabimo tudi nekaj generacij oddaljene sorodnike po materini liniji (59). Z genetskimi preiskavami so znanstveniki odgovorili na eno najvznemir-ljivejših ugank francoske zgodovine. S tipizacijo mDNA so identificirali francoskega pre -stolonaslednika Ludvika XVII., čigar srce je po usmrtitvi izrezal zdravnik in se je ohranilo vse do danes (slika 3). Iz preko 200 let stare -ga srca pridobljen haplotip mDNA so primerjali s haplotipom mDNA las Marije Antoinet -te in njenih še živečih potomcev po materini liniji. Z identičnostjo haplotipov so dokazali, da je bil desetletni deček, ki je leta 1795 umrl v ječi Temple, res sin Marije Antoinette (60, 61). Ta ugotovitev je ovrgla vse romantične zgod -be o tem, da so princa Ludvika z zamenjavo z drugim otrokom neznanci rešili iz ječe, in zgodbe vseh 43 avanturistov, ki so se v 19. stoletju razglašali za Ludvika XVII., med katerimi je bil najprepričljivejši pruski urar Naun-dorff. Tudi iz njegovih posmrtnih ostankov so izolirali mDNA in jo primerjali z mDNA
Slika 3. Identifikacija Ludvika XVII. Iz leve proti desni: Ludvik XVI., Ludvik XVII. in Marija Antoinetta.
las Marije Antoinette in mDNA dveh njenih še živečih sorodnikov po materini liniji. Ne -ujemanje mitohondrijskih sekvenc potrjuje, da Naundorff ni bil sin Marije Antoinette.
S pomočjo polimorfizmov mDNA in primerjavo s še živečimi sorodniki po materini liniji so identificirali tudi skeletne ostanke Martina Bormanna, enega najradikalnejših Hitlerjevih sodelavcev, in skeletne ostanke slovitega ameriškega gangsterja Jesseja Jamesa, stare več kot 115 let (62, 63). Molekular-nogenetske analize 400 let starih skeletnih ostankov princa Branciforte Barresija iz Sicilije, 5.000 let starega tirolskega ledenega človeka Oetzija, neandertalca, najdenega v zahodni Nemčiji, in mnoge druge molekularnogenet-ske analize starodavnih antropoloških bioloških materialov so pokazale, da je mogoče pridobiti mDNA iz zelo starih človeških ostankov (64-67). Mitohondrijsko DNA so izolirali iz človeških skeletov in mumificiranih mehkih tkiv različnih muzejskih in arheoloških zbirk, pri egipčanskih mumijah je bila uspešna tudi ekstrakcija jedrne DNA (68). Prav tako so uspešno izolirali mDNA 40.000let starega mamuta, najdenega v Sibiriji, in potrdi -li njegovo sekvenčno sorodnost z današnjim slonom. Najstarejšo uspešno izolacijo DNA pa predstavlja DNA iz kloroplastov 17-20 mili -jonov let starih fosiliziranih listov magnolije. Avtentičnost te DNA je potrdila natančna pri -merjava fragmentov DNA z moderno magnolijo (69).
Stopnja identifikacije, ki jo dosegamo s preiskavo mDNA, je zaradi odsotnosti rekom -binacije veliko nižja od stopnje identifikacije, ki jo dosegamo s preiskavo jedrne avtosom-ske DNA. S tipizacijo mDNA lahko identifi -ciramo le maternalno (materino ali žensko) linijo, medtem ko mikrosateliti jedrne avto -somske DNA omogočajo individualizacijo posameznika. Ce primerjamo diskriminacij -sko moč (moč razlikovanja med nesorodnimi
osebami) mDNA z jedrno avtosomsko DNA, vidimo, da je stopnja identifikacije posameznika z jedrno avtosomsko DNA praktično 100 % (običajno večja kot 99,9999 %), stopnja identifikacije maternalne linije s tipizacijo področij HVI in HVII mDNA pa je 98,8 %, kar pomeni, da je v slovenski populaciji verjetnost naključnega ujemanja haplotipov mDNA med sorodstveno nepovezanimi osebami 1,2% (5).
Veliko molekularnogenetskih identifikacij je opravljenih s preiskavo več različnih genetskih označevalcev (avtosomski mikro-sateliti, mikrosateliti, vezani na kromosom Y in mDNA). Tako so s tipizacijo jedrne in mito-hondrijske DNA identificirali zob nemškega cesarja Wilhelma II., brata Reinholda Mes-snerja in slavnega astronoma Nikolaja Kopernika ter preverjali sorodstveno povezanost skeletov, ki datirajo v 7. stoletje (70-73). Z jedrno in mitohondrijsko DNA so identificirali leta 1960 pokopane člane gverilske organizacije Che Guevara v Boliviji in 50 let stare skeletne ostanke pilota Jamesa B. McGoverna (74, 75). S preiskavo jedrne in mitohondrijske DNA poteka identifikacija skeletnih ostankov ameriških vojakov, padlih v vojnah v Vietnamu, Kambodži, Laosu in na Kitajskem, v korejski vojni, v I. in II. svetovni vojni ter identifikaci -ja domobranskih žrtev v Sloveniji (9,10, 76-79).
Ena najodmevnejših molekularnogenet-skih identifikacij skeletnih ostankov, pri kateri je bilo mogoče tipizirati več genetskih ozna -čevalcev, je bila prav gotovo identifikacija ruske vladarske družine Romanov, ki so jo pobili po februarski revoluciji leta 1917. Za pozitivno identifikacijo je bilo treba analizirati tako jedrno kot mitohondrijsko DNA (80-83). S pomočjo jedrne DNA so lahko preverili maternalno in paternalno povezanost družinskih članov v grobišču, niso pa mogli odgovoriti na vprašanje, ali gre dejansko za posmrtne ostanke družine Romanov. Jedrna DNA namreč omogoča le preverjanje bližnjih sorod -
335
336
stvenih odnosov, preverjanje sorodnosti med daljnimi sorodniki, ki so med seboj nekaj generacij oddaljeni, pa zaradi rekombinacije ni mogoče. Preverjanje daljnih sorodstvenih povezav je mogoče z analizo mDNA, saj se ta deduje po materi in se ne rekombinira, ter z analizo mikrosatelitov kromosoma Y, ki se prenaša z očeta na sina v nespremenjeni obliki. Pri družini Romanov so preverili identič-nost skeletnih ostankov tako, da so nukle -otidna zaporedja mDNA primerjali z nekaj generacij oddaljenimi, še živečimi potomci po materini liniji. Referenčna oseba za identifikacijo carice Aleksandre in njenih otrok je bil princ Filip, vojvoda Edinburški, pranečak cari -ce Aleksandre in mož angleške kraljice Elizabete II. Njegova mDNA je bila identična cari-čini in otroškim. Se živeči referenčni osebi za identifikacijo carja Nikolaja sta bila vnuk in vnukinja Luise Hesse Cassel. Pri carju Nikolaju se sekvenca haplotipa mDNA na eni nukle-otidni poziciji ni ujemala s še živečimi sorodniki po materini liniji, zato so opravili dodatne primerjave carja Nikolaja s posmrtnimi ostanki carjevega brata Georgija Romanova, ki je umrl za tuberkulozo leta 1899 in so ga za potrebe te analize ekshumirali iz katedrale svetega Petra in Pavla v Sankt Peterburgu ter potrdili popolno identičnost nukleotidnih zaporedij mDNA (81). Z analizo jedrne in mitohondrijske DNA so dokazali, da posmrtni ostanki v domnevnem grobišču družine Romanov dejansko pripadajo tej družini. V grobišču so našli posmrtne ostanke carja Nikolaja II, carice Aleksandre, treh njunih otrok, treh služabnikov in družinskega zdrav -nika. Car in carica sta imela štiri hčerke in sina. Vsi trije najdeni otroški skeleti so bili žen -skega spola. V grobišču sta torej manjkali tru -pli sina in ene od hčera (80). Identifikaciji Romanovih je sledila genetska preiskava biološkega materiala pokojne Ane Anderson Manahan, ki je vse do svoje smrti leta 1984 v ZDA trdila, da je Anastazija Romanov (biop -sijski vzorec črevesnega tkiva, ki so ga odvze -li Andersonovi leta 1979 in je bil shranjen v eni od bolnišnic v Virginiji). Genetska pove -zanost Andersonove z Romanovimi je bila ovržena (82). Pred približno dvema letoma pa je bila uganka Romanovih končno rešena, saj so našli manjkajoča otroška skeleta le 70 m proč od grobišča, kjer so leta 1991 izkopali
posmrtne ostanke večine članov družine Romanovih. Genetska analiza je potrdila, da najdena otroška skeleta pripadata manjkajočemu sinu in eni od hčera (83).
V slovenskem prostoru so z vidika mole-kularnogenetskih genealoških študij izredno zanimive lobanje celjskih grofov, ki so jih pred desetletjem analizirali v genetskem laboratoriju v Rimu, a neuspešno, in bi jih bilo vredno ponovno preučiti, saj je v zadnjem desetletju tehnologija v molekularni genetiki močno napredovala. Zaradi izredno velikega nacionalnega pomena teh lobanj je problem ponovne analize v tem, da bi zopet prišlo do popol -nega uničenja dela kostnega tkiva, pri čemer pa žal zaradi velike starosti lobanj uspešnosti genetske analize vnaprej ni mogoče zagotoviti. Del lobanje, ki bi jo potrebovali za genet -sko analizo, ne bi bil prav velik, saj smo pri preiskavah starih skeletnih ostankov na ISM Medicinske fakultete v Ljubljani razvili metodo ekstrakcije, ki omogoča pridobitev DNA že iz 0,5 g kostnega prahu (84). Grofje celjski so bili naša najpomembnejša plemiška rodbina. Vladali so od 13. do 15. stoletja, ko se je s smrtjo Ulrika II. Celjskega njihova vladavina zaključila. Vse družinske člane od Friderika I. naprej so pokopavali v družinsko grob -nico v minoritski cerkvi v Celju. Po požaru leta 1811 so le lobanje brez spodnjih čeljust-nic spravili v cerkvi za glavni oltar in jih po 2. svetovni vojni prenesli v Pokrajinski muzej Celje. Celjski grofje imajo po Barbari Celjski (ženska linija) še živeče potomce (ohranili so se od 15. stoletja v neprekinjeni liniji dvajse -tih generacij). Zato bi bila z analizo mDNA mogoča natančna identifikacija lobanj, študija pa bi bila podobna že omenjeni identifikaciji Romanovih, le da v primeru Celjskih najver -jetneje jedrne DNA ne bi bilo mogoče analizi -rati, saj so lobanje bistveno starejše od posmrt -nih ostankov ruske vladarske družine (500 let v primerjavi z 90 leti).
PRIHODNOST FORENZIČNIH GENETSKIH PREISKAV
Naj zaključimo s pregledom možnosti foren-zičnih genetskih preiskav v prihodnosti. Današnje preiskave jedrne DNA in mDNA, ki temeljijo na analizi nevtralnih odsekov, ne nosijo nobene informacije o vidnih karakte -
ristikah posameznika (barva oči, las, kože, telesna višina) in omogočajo le ugotavljanje identitete. Edina vidna karakteristika, ki jo lahko določimo, je spol. Prihodnost genetskih preiskav v forenziki pa je prav gotovo v tem, da bi lahko poleg individualizacije neke sledi iz nje z določeno zanesljivostjo razbrali tudi fizične karakteristike oz. vidne lastnosti posameznika. Najnovejše raziskave nam nakazujejo možnosti ugotavljanja vidnih znakov posameznika iz bioloških sledov v prihodnosti. Pri genu za receptor melanokortin 1 so nekatere mutacije povezane s fenotipom rdeče barve las, kar pomeni, da bi lahko bili določeni polimorfizmi indikatorji za rdečo barvo las (85). Znotraj genov, ki so povezani s pig-mentacijo pri človeku, so odkrili enonukleo-tidne polimorfizme, s pomočjo katerih lahko
z določeno zanesljivostjo (ki pa ni 100%) določimo barvo oči, las in kože (86-88). Enonu-kleotidne polimorfizme, s pomočjo katerih lahko napovemo etnično pripadnost, barvo oči, las in kože, so preiskovali pri starodavnih človeških skeletnih ostankih iz bronaste in železne dobe ter pri neandertalcih (89, 90). Le nekaj držav po svetu, npr. Nizozemska, ima zakonodajo, ki v pravosodju eksplicitno omogoča uporabo DNA za določanje fenotipskih lastnosti, pri čemer je dovoljeno le določanje zunanjih vidnih karakteristik posameznika, ne pa tudi nagnjenosti k boleznim ali določenim vedenjskim deviacijam. V nekaterih pravosodnih sistemih pa je trenutno še vedno dovoljeno preiskovati le nekodogena področja DNA.
LITERATURA	337
1.	Zupanič I, Balažic J, Komel R. Analysis of nine short tandem repeat (STR) loci in the Slovenian population. Int J Legal Med. 1998; 111 (5): 248-50.
2.	Zupanič I. Uvedba preiskave DNA za prepoznavanje oseb in preverjanje sorodstvenih povezav v slovenski populaciji [magistrska naloga]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 1999.
3.	Sterlinko H, Zupanič Pajnič I, Balažic J, et al. Human Y-specific STR haplotypes in a Slovenian population sample. Forensic Sci Int. 2001; 120 (3): 226-8.
4.	Zupanič Pajnič I, Balažic J, Komel R. Sequence polymorphism of the mitochondrial DNA control region in the Slove -nian population. Int J Legal Med. 2004; 118 (1): 1-4.
5.	Zupanič Pajnič I. Identifikacija oseb iz starih in slabo ohranjenih bioloških materialov s polimorfizmi mitohon-drijske DNA [doktorsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2007.
6.	Zupanič-Pajnič I. Molekularno genetska identifikacija žrtev medvojnih pobojev pod Storžičem. In: Dežman J, ed. Poročilo Komisije vlade Republike Slovenije za reševanje vprašanj prikritih grobišč 2005-2008. Ljubljana: Družina; 2008. p. 219-50.
7.	Zupanič-Pajnič I. Preliminarno poročilo molekularno genetske identifikacije okostij iz grobišča pri Konfinu 1. In: Dežman J, ed. Poročilo Komisije vlade Republike Slovenije za reševanje vprašanj prikritih grobišč 2005-2008. Ljubljana: Družina; 2008. p. 147-74.
8.	Zupanič-Pajnič I. Priporočila za molekularno genetsko identifikacijo žrtev povojnih pobojev v Sloveniji. In: Dežman J, ed. Poročilo Komisije vlade Republike Slovenije za reševanje vprašanj prikritih grobišč 2005-2008. Ljubljana: Družina; 2008. p. 133-46.
9.	Zupanič-Pajnič I. Molekularno genetska identifikacija domobranskih žrtev. Zdrav Vestn. 2008; 77 (11): 745-50.
10.	Zupanič-Pajnič I, Gornjak-Pogorelc B, Balažic J. Molecular genetic identification of skeletal remains from the Second world war Konfin I mass grave in Slovenia. Int J Legal Med. 2010; 124 (4): 307-17.
11.	Graham EAM. DNA reviews: Ancient DNA. Forensic Sci Med Pathol. 2007; 3 (3): 221-5.
12.	Zupanič Pajnič I, Sterlinko H, Balažic J, et al. Parentage testing with 14 STR loci and population data for 5 STRs in the Slovenian population. Int J Legal Med. 2001; 114 (3): 178-80.
13.	Zupanič I. Genetski detektivi: prepoznavanje oseb in preverjanje sorodstvenih povezav s pomočjo preiskave DNA. Proteus. 1998; 60 (9-10): 400-5.
14.	Zupanič-Pajnič I. Molekularno genetska (DNK) identifikacija bioloških sledi. In: Odvetniška zbornica Slovenije. Odvetniška šola; 2010 Apr 9; Bernardin: Odvetniška zbornica Slovenije; 2010. p. 71-3.
15.	Zupanič Pajnič I. Molekularno genetska identifikacija neznanih trupel iz skeletnih ostankov in zob. In: Luzar B, Poljak M, Glavač D, et al, eds. Molekularna diagnostika v medicini. 15. spominsko srečanje akademika Janeza Miličinskega in 36. memorialni sestanek profesorja Janeza Plečnika in 1. srečanje slovenskega društva za humano genetiko z mednarodno udeležbo; 2005 Nov 30-Dec 2; Ljubljana. Ljubljana: Medicinska fakulteta; 2005. p. 73-84.
16.	Zupanič-Pajnič I, Balažic J, Komel R, et al. Identifikacija tkivnih vzorcev z molekularno biološkimi metodami. Onkologija. 2002; 6 (1): 17-20.
17.	Gornjak-Pogorelc B, Jazbec J, Zupanič-Pajnič I, et al. Molekularno genetska analiza himerizma po alogenski trans-planatciji kostnega mozga. In: Luzar B, Poljak M, Glavač D, et al, eds. Molekularna diagnostika v medicini. 15. spominsko srečanje akademika Janeza Miličinskega in 36. memorialni sestanek profesorja Janeza Plečnika in 1. srečanje slovenskega društva za humano genetiko z mednarodno udeležbo; 2005 Nov 30-Dec 2; Ljubljana. Ljubljana: Medicinska fakulteta; 2005. p. 29-41.
18.	Herrmann B, Hummel S. Ancient DNA: recovery and analysis of genetic material from paleontological, archeo-logical, museum, medical, and forensic specimens. Berlin: Springer-Verlag; 1994.
19.	Hummel S. Ancient DNA typing: methods, strategies and applications. Berlin: Springer-Verlag; 2002.
20.	Jeffreys AJ. DNA typing: approaches and applications. J Forensic Sci Soc. 1993; 33 (4): 204-11.
21.	Morling N. Forensic genetics. Lancet. 2004; 364 Suppl 1: s10-1.
22.	Primorac D, Marjanovi} D. Analiza DNA u sudskoj medicine I pravosudu. Zagreb: Medicinska naklada; 2008.
23.	Jeffreys AJ, Brookfield JFY, Semeonoff R. Positive identification of an immigration test-case using human DNA fingerprints. Nature. 1985; 317 (6040): 818-9.
24.	Mukaida M, Kimura H, Takada Y, et al. The personal identification of many samples recovered from under the sea. Forensic Sci Int. 2000; 113 (1-3): 79-85.
25.	Olaisen B, Stenersen M, Mevag B. Identification by DNA analysis of the victims of the august 1996 Spitsbergen civil aircraft disaster. Nature Genet. 1997; 15 (4): 402-5.
26.	Sajantila A, Strom M, Budowle B, et al. The polymerase chain reaction and post-mortem forensic identity testing: application of amplified D1S80 and HLA-DQa loci to the identification of fire victims. Forensic Sci Int. 1991; 51 (1): 23-34.
27.	Graham EAM. Disaster victim identification. Forensic Sci Med Pathol. 2006; 2 (3): 203-7.
28.	Biesecker LG, Bailey-Wilson JE, Ballantyne J, et al. Epidemiology. DNA identification after the 9/11 World Trade _ Center attack. Science. 2005; 310 (5751): 1122-3.
338 29. Prinz M, Carracedo A, Mayr WR, et al. DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics (ISFG): Recommendations regarding the role of forensic genetics for disaster victims identification (DVI). Forensic Sci Int Genet. 2007; 1 (1): 3-12.
30.	Beauthier JP, De Valck E, Lefevre P, et al. Mass disaster victim identification: the tsunami experience. Open Forensic Sci J. 2009; 2: 54-62.
31.	Davoren J, Vanek D, Konjhodzi} R, et al. Highly effective DNA extraction method for nuclear short tandem repeat testing of skeletal remains from mass graves. Croat Med J. 2007; 48 (4): 478-85.
32.	Jakovski Z, Nikolova K, Jeneska B, et al. Forensic DNA analysis in the identification of human remains in mass graves. J Cli Path Forensic Med. 2010; 1 (1): 1-4.
33.	Jeffreys AJ, Allen MJ, Hagelberg E, et al. Identification of the skeletal remains of Josef Mengele by DNA analysis. Forensic Sci Int. 1992; 56 (1): 65-76.
34.	Scharf SJ, Smith AG, Hansen JA, et al. Quantitative determination of bone marrow transplant engraftment using fluorescent polymerase chain reaction primers for human identity markers. Blood. 1995; 85 (7): 1954-63.
35.	Jobling MA, Gill P. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nat Rev Genet. 2004; 5 (10): 739-51.
36.	Butler JM. Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing. J Forensic Sci. 2006; 51 (2): 253-65.
37.	Benecke M. DNA typing in forensic medicine and in criminal investigations: a current survey. Naturwissenschaften. 1997; 84 (5): 181-8.
38.	Brenner CH. DNA-VIEW 2007 User Guide. Oakland (CA); 2007.
39.	Gusmao L, Butler JM, Carracedo A, et al. DNA commission of the international society of forensic genetics (ISFG): an update of the recommendations on the use of Y STRs in the forensic analysis. Int J Legal Med. 2006; 120 (4): 191-200.
40.	Walsh B, Redd AJ, Hammer MF. Joint match probabilities for Y chromosomal and autosomal markers. Forensic Sci Int. 2008; 174 (2-3): 234-8.
41.	Willuweit S, Roewer L, International Forensic Y Chromosome User Group. Y chromosome haplotype reference database (YHRD): update. Forensic Sci Int Genet. 2007; 1 (2): 83-7.
42.	Sullivan KM, Mannucci A, Kimpton CP, et al. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenin. BioTechniques. 1993; 15 (4): 636-41.
43.	Buel E, Wang G, Schwartz M. PCR amplification of animal DNA with human X-Y amelogenin primers used in gender determination. J Forensic Sci. 1995; 40 (4): 641-4.
44.	LaFountain M, Schwartz M, Cormier J, et al. Validation of capillary electrophoresis for analysis of the X-Y homo -logous amelogenin gene. J Forensic Sci. 1998; 43 (6): 1188-94.
45.	Foster EA, Jobling MA, Taylor PG, et al. Jefferson fathered slave's last child. Nature. 1998; 396 (6706): 27-8.
46.	Alaeddini R, Walsh SJ, Abbas A. Forensic implications of genetic analyses from degraded DNA - A review. Forensic Sci Int Genet. 2010; 4 (3): 148-57.
47.	Hopwood AJ, Mannucci A, Sullivan KM. DNA typing from human faeces. Int J Legal Med. 1996; 108 (5): 237-43.
48.	Tully G, Bär W, Brinkmann B, et al. Considerations by the European DNA profiling (EDNAP) group on the working practices nomenclature and interpretation of mitochondrial DNA profiles. Forensic Sci Int. 2001; 124 (1): 83-91.
49.	Sigurdardottir S, Helgason A, Gulcher JR, et al. The mutation rate in the human mtDNA control region. Am J Hum Genet. 2000; 66 (5): 1599-609.
50.	Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981; 290 (5806): 457-65.
51.	Vallone PM, Just RS, Coble MD, et al. A multiplex allele-specific primer extension assay for forensically informative SNPs distributed throughout the mitochondrial genome. Int J Legal Med. 2004; 118 (3): 147-57.
52.	Piercy R, Sullivan KM, Benson N, et al. The application of mitochondrial DNA typing to the study of white Caucasian genetic identification. Int J Legal Med. 1993; 106 (2): 85-90.
53.	Bär W, Brinkmann B, Budowle B, et al. DNA commission of the International society for forensic genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing. Int J Legal Med. 2000; 113 (4): 193-6.
54.	Allen M, Engström AS, Meyers S, et al. Mitochondrial DNA sequencing of shed hairs and saliva on robbery caps: sensitivity and matching probabilities. J Forensic Sci. 1998; 43 (3): 453-64.
55.	Horai S, Hayasaka K. Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondrial DNA. Am J Hum Genet. 1990; 46 (4): 828-42.
56.	Cann RL, Stoneking M, Wilson AC. Mitochondrial DNA and human evolution. Nature. 1987; 325 (6099): 31-6.
57.	Castella V, Dimo-Simonin N, Brandt-Casadevall C, et al. Forensic identification of urine sample: a comparison between nuclear and mitochondrial DNA markers. Int J Legal Med. 2006; 120 (2): 67-72.
58.	Parson W, Dür A. EMPOP - A forensic mtDNA database. Forensic Sci Int Genet. 2007; 1 (2): 88-92.
59.	Fisher DL, Holland MM, Mitchell L, et al. Extraction evaluation and amplification of DNA from decalcified
and undecalcified United States civil war bone. J Forensic Sci. 1993; 38 (1): 60-8.	339
60.	Jehaes E, Decorte R, Peneau A, et al. Mitochondrial DNA analysis on remains of a putative son of Louis XVI, King of France and Marie-Antoinette. Europ J Hum Genet. 1998; 6 (4): 383-95.
61.	Jehaes E, Toprak K, Vanderheyden N, et al. Pitfalls in the analysis of mitochondrial DNA from ancient specimens and the consequences for forensic DNA analysis: the historical case of the putative heart of Louis XVII. Int J Legal Med. 2001; 115 (3): 135-41.
62.	Anslinger K, Weichhold G, Keil W, et al. Identification of the skeletal remains of Martin Bormann by mtDNA analysis. Int J Legal Med. 2001; 114 (3): 194-6.
63.	Stone AC, Starrs JE, Stoneking M. Mitochondrial DNA analysis of the presumptive remains of Jesse James. J Forensic Sci. 2001; 46 (1): 173-6.
64.	Rickards O, Martinez-Labarga C, Favaro M, et al. DNA analyses of the remains of the Prince Branciforte Barresi family. Int J Legal Med. 2001; 114 (3): 141-6.
65.	Handt O, Richards M, Trommsdorff M, et al. Molecular genetic analyses of the Tyrolean Ice Man. Science. 1994; 264 (5166): 1775-8.
66.	Ermini L, Olivieri C, Rizzi E, et al. Complete mitochondrial genome sequence of the Tyrolean Iceman. Curr Biol. 2008; 18 (21): 1687-93.
67.	Krings M, Stone A, Schmitz RW, et al. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell. 1997; 90 (1): 19-30.
68.	Paabo S. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. Nature. 1985; 314 (6012): 644-5.
69.	Golenberg EM, Giannasi DE, Clegg MT, et al. Chloroplast DNA sequence from a miocene Magnolia species. Nature. 1990; 344 (6267): 656-8.
70.	Pfeiffer H, Benthaus S, Rolf B, et al. The Kaiser's tooth. Int J Legal Med. 2003; 117 (2): 118-20.
71.	Parson W, Brandstätter A, Niederstätter H, et al. Unravelling the mystery of Nanga Parbat. Int J Legal Med. 2006; 121 (4): 309-10.
72.	Bogdanowicz W, Allen M, Branicki W, et al. Genetic identification of putative remains of the famous astronomer Nicolaus Copernicus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106 (30): 12279-82.
73.	Vanek D, Saskova L, Koch H. Kinship and Y-chromosome analysis of 7th century human remains: Novel DNA extraction and typing procedure for ancient material. Croat Med J. 2009; 50 (3): 286-95.
74.	Lleonart R, Rirgo E, Sainz de la Pena MV, et al. Forensic identification of skeletal remains from members of Ernesto Che Guevara's guerrillas in Bolivia based on DNA typing. Int J Legal Med. 2000; 113 (2): 98-101.
75.	Irwin JA, Edson SM, Loreille O, et al. DNA identification of »Earthquake McGoon« 50 years postmortem. J Forensic Sci. 2007; 52 (5): 1115-8.
76.	Irwin JA, Leney MD, Loreille O, et al. Application of low copy number STR typing to the identification of aged, degraded skeletal remains. J Forensic Sci. 2007; 52 (6): 1322-7.
77.	Lee HY, Kim NY, Park MJ, et al. DNA typing for the identification of old skeletal remains from Korean war victims. J Forensic Sci. 2010; 55 (6): 1422-9.
78.	Lee HY, Park MJ, Kim NY, et al. Simple and highly effective DNA extraction method from old skeletal remains using silica columns. Forensic Sci Int Genet. 2010; 4 (5): 275-80.
79.	Holland MM, Fisher DL, Mitchell LG, et al. Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remainss. Identification of remains from the Vietnam war. J Forensic Sci. 1993; 38 (3): 542-53.
80.	Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet. 1994; 6 (2): 130-5.
81.	Ivanov PI, Wadhams MJ, Roby RK, et al. Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov establishes the authenticity of the remains of Tsar Nicholas II. Nat Genet. 1996; 12 (4): 417-20.
82.	Gill P, Kimpton C, Aliston-Greiner R, et al. Establishing the identity of Anna Anderson Manahan. Nat Genet. 1995; 9 (1): 9-10.
83.	Coble MD, Loreille OM, Wadhams MJ, et al. Mystery Solved: The Identification of the Two Missing Romanov Children Using DNA Analysis. PLoS ONE [internet]. 2009 [citirano 2011 Jun 25]; 4: e4838. Dosegljivo na: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0004838
84.	Zupanič Pajnič I. Visoko učinkovita metoda ekstrakcije DNA iz skeletnih ostankov. Zdrav Vestn. 2011; 80 (3): 171-81.
85.	Grimes EA, Noake PJ, Dixon L, et al. Sequence polymorphisms in the human melanocortin 1 receptor gene as an indicator of the red hair phenotype. Forensic Sci Int. 2001; 122 (2-3): 124-9.
86.	Liu F, van Dujin K, Vingerling JR, et al. Eye color and the prediction of complex phenotypes from genotypes. Curr Biol. 2009; 19 (5): 192-3.
87.	Valenzuela R, Henderson M, Walsh M, et al. Predicting phenotype from genotype: normal pigmentation. J Forensic Sci. 2010; 55 (2): 315-22.
88.	Valverde P, Healy E, Jackson I, et al. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat Genet. 1995; 11 (3): 328-30.
340 89. Bouakaze C, Keyser C, Crubezy E, et al. Pigment phenotype and biogeographical ancestry from ancient skeletal remains: Inferences from multiplex autosomal SNP analysis. Int J Legal Med. 2009; 123 (4): 315-25.
90. Lalueza-Foc C, Rompler H, Caramelli D, et al. A melanocortin 1 receptor allele suggests varying pigmentation among Neanderthals. Science. 2007; 318 (5855): 1453-5.
Prispelo 15. 3. 2011