Regulatorna vloga Ca2+ ionov pri sproščanju mediatorjev vnetja iz mastocitov
The regulatory role of Ca2+ ions in the secretion of inflammatory mediators from mast cells
Ilonka Ferjan
Povzetek: Mastociti so celice vezivnega tkiva, ki imajo ključno vlogo pri vnetju in alergijskih reakcijah. Po imunološki ali neimunološki stimulaciji sproščajo številne posrednike (mediatorje) vnetja. Sproščanje mediatorjev je v veliki meri odvisno od koncentracije prostih Ca2+ ionov v celici. Po aktivaciji mastocita se prosta koncentracija Ca2+ v celici močno zveča, kar vpliva na sproščanje vnetnih mediatorjev iz mastocitov. Spremembe proste koncentracije Ca2+ v celici so odvisne od aktivnosti nekaterih ionskih izmenjevalnih sistemov v mastocitu; Na+/Ca2+-izmen-jevalca, Na+/K+ - ATPaze ter Ca2+-ATPaze. Aktivnost teh izmenjevalcev je odvisna od koncentracije zunajceličnih in znotrajceličnih Ca2+ ionov. Številne zdravilne učinkovine in endogene spojine vplivajo na koncentracijo zunajceličnih in znotrajceličnih Ca2+ ionov ter na aktivnost ionskih izmenjevalnih mehanizmov mastocita. Kombinirano delovanje izmenjevalnih mehanizmov mastocita lahko pripomore pri spremenjenem sproščanju mediatorjev med vnetno ali alergijsko reakcijo.
Ključne besede: mastociti, Ca2+ ioni, ionski izmenjevalni mehanizmi mastocitov, sproščanje mediatorjev vnetja
Abstract: Mast cells play a central role in inflammatory and allergic reactions. In response to immunologic or non-immunologic stimuli they release a variety of inflammatory mediators. The secretion of the mediators is strongly dependent on the concentration of the cytosolic calcium. Immunologic or nonimmunologic stimmulation of mast cells increases intracellular concentration of free Ca2+ and thus influences on the mediators release from mast cells. The changes of intracellular free Ca2+ depend on the activity of Na+Ca2+- exanger, Na+/K+ - ATPase and Ca2+-ATPase of mast cell. Several drugs and endogenic compounds can modify the concentration of intracellular free Ca2+ ions by influencing the activity of the exchange mechanisms of mast cell. Combined actions of these exchange mechanisms serve to change mediators release from mast cells in inflammatory or allergic reactions.
Key words: mast cells, Ca2+ ions, ionic exchangers of mast cells, secretion of inflammatory mediators
1 Uvod
Mastociti (tkivni bazofilci) so celice vezivnega tkiva, ki imajo ključno vlogo pri procesu vnetja in pri alergičnih reakcijah (1,2). Plazmina membrana mastocitov vsebuje specifične membranske receptorje, ki imajo visoko afiniteto za vezavo imunoglobulina IgE (3,4). Povezava dveh molekul IgE z antigenom povzroči imunološko aktivacijo celice. Na membrani mastocita so pa poleg receptorjev za vezavo IgE protiteles prisotni tudi številni drugi receptorji za vezavo endogenih in eksogenih spojin, ki lahko povzročijo neimunološko sproščanje mediatorjev vnetja (5,6,7). Med neimunološke sproščevalce sodijo bazični sproščevalci; mono-, di- in poliamini (spojina 48/80) ter peptidi, kalcijeve ionofore, lektini (concanavalin A) in citokini (interlevkini) ter rastni dejavniki (živčni rastni dejavnik - NGF).
Po aktivaciji mastocitov z različnimi imunološkimi (kompleks antigena in dveh IgE protiteles) ali neimunološkimi (številne endogene ali eksogene spojine) stimulusi sproščajo mastociti številne kemijske posrednike (mediatorje) vnetja. Mediatorje vnetja delimo v dve skupini. V prvo skupino štejemo tiste spojine, ki so ves čas shranjene v zrncih celic (histamin, serotonin, eozinofilni kemotaktični faktor, nevtrofilni kemotaktični faktor, lizosomski encimi) in se iz njih sprostijo po aktivaciji celice z ustreznim stimulusom. Drugo skupino mediatorjev vnetja pa sestavljajo spojine, ki nastajajo v mastocitu med procesom vnetja in se nato tudi sproščajo iz mastocita. Mednje sodijo: arahidonska kislina, prostaglandini, prostaciklini, citokini (interlevkini), rastni dejavniki (živčni rastni dejavnik).
asist. dr. Ilonka Ferjan, mag.farm., Institut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska fakulteta, Korytkova 2, 1000 ljubljana
Pri procesu sproščanja mediatorjev vnetja imajo pomembno vlogo kalcijevi ioni. Sproščevalce mediatorjev vnetja lahko razdelimo na tiste, ki potrebujejo za svoje delovanje zunajcelične kalcijeve ione (3,8) in tiste, ki niso povsem odvisni od zunajceličnih kalcijevih ionov, njihovo delovanje pa zavisi od znotrajcelične koncentracije prostih kalcijevih ionov (8,9). V prvo skupino sproščevalcev prištevamo imunološke sproščevalce, lektine, ionofore, citokine (interlevkine) in rastne dejavnike (živčni rastni dejavnik). V drugo skupino sproščevalcev pa sodijo neimunološki polibazični sproščevalci - poliamini (spojina 48/80) in peptidi.
2 Mehanizem sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita
Vezava sproščevalca na membrano mastocita preko aktivacije proteina G aktivira encime (fosfolipazo C, proteinsko kinazo C) v membrani mastocita, ki imajo pomembno vlogo pri mehanizmu sekrecije vnetnih mediatorjev iz mastocita (4,10).
Aktivacija fosfolipaze C povzroči razgradnjo fosfatidilinizitola (8,11). Pri tem nastanejo naslednji metabolični produkti: diacilglicerol (DAG), fosfatidilna kislina in inozitol trifosfat.(IP3). IP3 sproži odprtje kalcijevih kanalov v plazemski membrani in s tem vdor Ca2+ v citoplazmo mastocita in dvig koncentracije prostih Ca2+ v citoplazmi. IP3 povzroči tudi sprostitev Ca2+ iz endoplazmatskega retikuluma (ER) v citoplazmo in tudi na ta način zveča koncentracijo prostih Ca2+ v mastocitu. DG aktivira proteinsko kinazo C, ki omogoča fosforilacijo proteinov. To ima pomemno vlogo pri delovanju mikrotubulov in mikrofilamentov in tako tudi pri premikanju granul z mediatorji vnetja k plazmini membrani, kar omogoča kasnejše zlitje membrane granul z plazmino membrano mastocita in proces eksocitoze.
Osnovni stimulus za sproščanje mediatorjev vnetja iz aktiviranih mastocitov je povečana koncentracija znotrajceličnih prostih Ca2+ (12). Kratkotrajnemu zvečanju znotrajceličnih prostih Ca2+ sledi odstranitev Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (membranske zaloge za Ca2+, endoplazmatski retikulum) ali v izvencelično tekočino (13,14). Pri uravnavanju proste koncentracije Ca2+ v celici imajo pomembno vlogo specifični na membrano vezani proteini (Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem, Ca2+ - ATPaza ter Na+/K+ - ATPaza), ki skrbijo za transport Na+, K+ in Ca2+ v citoplazmo celice in iz nje (15). Omenjeni transportni proteini uravnavajo znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ pri številnih evkariotskih celicah.
3 Transportni proteini, ki skrbijo za uravnavanje koncentracije Ca2+ v celicah.
Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem.
Na+/Ca2+ - izmenjevalec je reverzibilni transportni protein, ki omogoča izmenjavo treh Na+ skozi celično membrano za en Ca2+ (16,17). V fizioloških razmerah Na+/Ca2+ - izmenjevalec transportira Na+ iz zunajceličnega prostora, kjer je njihova koncentracija večja v citoplazmo, kjer je koncentracija Na+ manjša. Transport Na+ v smeri nižjih koncentracij daje izmenjevalcu gonilno moč za transport Ca2+ v
smeri proti koncentracijskemu gradientu, torej ven iz celice. Če se spremeni smer koncentracijskega gradienta za Na+, izmenjevalec deluje v obratni smeri in transportira Na+ iz celice in Ca2+ v celico. Smer delovanja izmenjevalnega sistema je torej odvisna od koncentracije Na+ in Ca2+ v celici in v mediju, kjer se celica nahaja.
Na+/K+ - ATPaza.
Na+/K+ - ATPaza je transmembranski encim, ki je odgovoren za aktivni transport Na+ iz celice in K+ v celico (18). Na ta način se vzdržuje membranski potencial celice. Transport Na+ in K+ pri tem poteka v nasprotni smeri koncentracijskega gradienta. Zato je za ta proces črpanja ionov potrebna energija, ki se tvori pri hidrolizi ATP molekul.
Če se aktivnost Na+/K+ - ATPaze zmanjša, se koncentracija Na+ v celici zveča. Zvečana koncentracija znotrajceličnih Na+ aktivira Na+/Ca2+ -izmenjevalec in povzroči zamenjavo znotrajceličnih Na+ za zunajcelične Ca2+. Kot posledica tega se zveča znotrajcelična koncentracija Ca2+, kar ima lahko za posledico aktivacijo številnih celičnih encimov in različnih celičnih procesov.
Ca2+ - ATPaza.
Ca2+ -ATPaza je encim, ki se nahaja na plazmini membrani celice, kot tudi v celici na membrani endoplazmatskega retikuluma. Ca2+-ATPaza skrbi za aktivni transport Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (celična membrana, endoplazmatski retikulum, mitohondriji), kot tudi iz celice v zunajcelično tekočino. Pri tem potujejo Ca2+ proti koncentracijskemu gradientu za Ca2+ . Ker Ca2+-ATPaza omogoča prehod Ca2+ v smeri od nižje koncentracije k višji koncentraciji, je zato potrebna energija, ki se sprošča pri hidrolizi ATP molekul (19). Gre torej za energetsko odvisen aktivni proces.
4 Pomen Ca2+ pri procesu sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita
V mastocitu je v stanju mirovanja koncentracija prostih Ca2+ zelo nizka (100 nmol/L) (21). Po aktivaciji mastocitov z imunološkim ali z neimunološkim sproščevalcem pride v mastocitu do kratkotrajnega zvečanja koncentracija prostih Ca2+ v celici (12,20), kar povzroči sproščanje številnih mediatorjev vnetja. Večja koncentracija znotrajceličnih Ca2+ vpliva na številne celične funkcije, kot so fosforilacija specifičnih proteinov, aktivacija celičnih encimov in aktivacija mikrofilamentov, ki potiskajo zrnca z mediatorji vnetja k celični membrani. Sledi proces zlitja membrane zrnc s plazmino membrano in sprostitev mediatorjev vnetja iz zrnc v zunajcelični prostor.
Večina kalcija v mastocitih (>99%) je vezanega na proteine v citoplazmi celice ali shranjenega v celičnih zalogah (13,14,22). Največja zaloga Ca2+ v mastocitih je endoplazmatski retikulum (ER). Na membrani ER se nahajajo receptorji za IP3, ki nastane po aktivaciji celice s sproščevalcem vnetja. Vezava IP3 na receptorje na plazmino membrano celice ali na ER v celici sproži odprtje kalcijevih kanalov v membrani ER ter plazemski membrani in s tem dvig koncentracije prostih Ca2+ v citoplazmi, kar vodi v sproščanje vnetnih mediatorjev.
5	Vzdrževanje nizke koncentracije prostih Ca2+ pri neaktiviranih mastocitih
Po vsaki aktivaciji mastocita s sproščevalcem, kateri sledi zvečanje intracelularne proste koncentracije Ca2+, se mora koncentracija prostih Ca2+ v celici hitro znižati. Pri tem je pomemben transport Ca2+ iz citoplazme celice v endoplazmatski retikulum oziroma v zunajcelično tekočino. Tako se vspostavi ponovno nizka koncentracija prostih Ca2+ v celici. Pri tem imajo podobno, kot pri številnih drugih celicah tudi pri mastocitu pomembno vlogo specifični na membrano vezani proteini (Ca2+-ATPaza, Na+/K+ - ATPaza in Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem), s pomočjo katerih se Ca2+ odstrani iz citoplazme (15).
Ca2+ - ATPaza.
Ca2+ -ATPaza omogoča aktivni transport Ca2+ iz citoplazme mastocita in tako znižuje koncentracijo prostih Ca2+ v celici (20). V mastocitih sta dve vrsti Ca2+ -ATPaze. Prva vrsta se nahaja na citoplazmatski membrani mastocita, druga vrsta pa na membrani endoplazmatskega retikuluma (12). Tako prehaja Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (celična membrana, endoplazmatski retikulum, mitohondriji), kot tudi iz celice v zunajcelično tekočino (19).
Na+/K+ - ATPaza in Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem
V stanju mirovanja mastocita ima pomembno vlogo koncentracija Na+ v mastocitu (15 mM) in v zunajcelični tekočini (134 mM) v kateri se mastocit nahaja. Na+/K+ - ATPaza omogoča aktivni transport Na+ iz celice in K+ v celico in tako vzdržuje visoko koncentracijo Na+ v izvencelični tekočini. Ca2+ iz citoplazme mastocita se zato lahko zamenjajo z Na+ iz medija s pomočjo Na+/Ca2+ - izmenjevalnim sistemom, ki se nahaja na plazmini membrani mastocita (18, 19). Na ta način se lahko koncentracija Ca2+ v citoplazmi močno zniža.
6	Mehanizmi, ki so vpleteni pri spremembi intracelularne koncentracije prostih kalcijevih ionov v mastocitu po delovanju različnih spojin.
Številne endogene spojine in zdravilne učinkovine lahko vplivajo na spremembe znotrajcelične proste koncentracije Ca2+.
Intracelularna koncentracija prostih Ca2+ se lahko zveča kot posledica:
1)	vstopa Ca2+ iz zunajcelične tekočine v celico (23,24).
Tako delujejo številni imunološki in neimunološki sproščevalci vnetnih mediatorjev (17,25).
2)	sprostitve Ca2+ iz znotrajceličnih vezavnih mest (9).
Številne bazične spojine (peptidi in spojina 48/80) lahko preko zanje specifičnih vezavnih mest aktivirajo encim fosfolipazo C. IP3, ki pri tem nastaja povzroči zvečanje znotrajcelične proste koncentracije Ca2+, kar sproži proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocitov.
3)	inhibicije privzema Ca2+ v intracelularne zaloge (22).l Privzem Ca2+ v zaloge poteka s pomočjo transportnih proteinov
Na+/Ca2+ - izmenjevalnega sistema in Ca2+-ATPaze. Lipofilne zdravilne učinkovine (antipsihotiki in antidepresivi) v večjih koncentracijah lahko inhibitorno vplivajo na omenjene transportne sisteme in na ta način zavro privzem Ca2+ v njihove zaloge. Tako se zveča koncentracija prostih Ca2+ v celici, posledica česar je lahko sproščanje vnetnih mediatorjev iz mastocitov (26,27). V eksperimentalne namene se za inhibicijo Ca2+-ATPaze uporablja tapsigargin (22).
4) inhibicije encima Na+/K+ - ATPaze.
Če se aktivnost Na+/K+ - ATPaze zmanjša, to povzroči kopičenje Na+ v mastocitu (18,19). S pomočjo Na+/Ca2+ - izmenjevalnega sistema se nato Na+ iz citoplazme izmenjuje s Ca2+ iz zunajcelične tekočine ali iz celičnih zalog, kar zveča znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ in to je stimulus za sproščanje vnetnih mediatorjev.
Med zdravili, ki se uporabljajo kot inhibitorji Na+/K+ - ATPaze so poznani kardiotonični glikozidi. Kardiotonični glikozidi preko inhibitornega učinka na Na+/K+ - ATPazo lahko potencirajo proces sproščanja mediatorjev vnetja, ki ga povzroči tako imunološka, kot neimunološka aktivacija mastocitov (19). Po drugi strani pa nekatere zdravilne učinkovine (antipsihotiki ali antidepresivi) lahko zaradi svoje velike lipofilnosti inhibirajo sproščanje Ca2+ iz znotrajceličnih vezavnih mest. Zato se koncentracija prostih Ca2+ v citoplazmi mastocita po imunološki ali neimunološki stimulaciji ne more ustrezno zvečati, da bi prišlo do sprostitve mediatorjev vnetja iz mastocita. Na ta način lahko zgoraj omenjene spojine zavrejo proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocitov (26,27).
7	Sklep
Sprememba proste koncentracije Ca2+ v mastocitu ima pomembno vlogo pri sproščanju mediatorjev vnetja. Številne endogene spojine kot tudi zdravilne učinkovine lahko na različne načine preko spremembe proste koncentracije Ca2+ v celici vplivajo na proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita in na ta način potencirajo ali inhibirajo vnetni odgovor organizma.
8	Literatura
1.	Falcone FH, Haas H, Gibbs BF. The human basophil: a new appreciation of
its role in immune responses. Blood 2000;96(13):4028-38.
2.	Kimata M, Inagaki N, Kato T, Miura T, Serizawa I, Nagai H. Roles of mitogen-
activated protein kinase pathways for mediator release from human cultured mast cells. Biochem Pharmacol 2000;60(4):589-94.
3.	Tedeschi A, Lorini M, Gibelli S, Miadonna A. Effects of protein kinase C and
phospholipase C inhibitors on IgE-dependent basophil histamine release. Inflammation Research 2000;49:480-5.
4.	Windmiller DA, BackerJM. Distinct Phosphoinositide 3-kinases mediated
mast cell degranulation in response to G-protein-coupled versus FcepsilonRI receptors. J Biol Chem 2003;«78(14):11874-8.
5.	Hanson DA, Ziegler SF. Regulation of ionomycin-mediated granul release from rat basophil leukemia cells. Mol Immunol 2002;38(16-18):1329-35.
6.	Shefler I, Taube Z, Medalia O, Sagi-Eisenberg R. Basic secretagogues activate protein tyrosine phosphorilation and release of arachidonic acid in mast cells via a novel protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. Eur J Immunol 1998;28:3468-78.
7.	Seebeck J, Westenberger K, Elgeti T, Ziegler A, Schitze S. The exocytotic signaling induced by nerve growth factor in the presence of lyso-
phosphatidylserine in rat peritoneal mast cells involves a type D phospholipase. Regulatory peptides 2001;102:93-99.
8.	Ferjan I, Carman-Krzan M, Erjavec F. Comparison of histamine and serotonin release from rat peritoneal mast cells induced
9.	Shefler I, Sagi-Eisenberg R. Gi-mediated activation of the syk kinase by the receptor mimetic basic secretagogues of mast cells: role in mediating arachidonic acid/metabolites release. J Immunol 2001;167(1):475-81.
10.	Ferjan I, Carman-Krzan M. Differential effect of interleukin-3, steam cell factor and nerve growth factor on histamine and serotonin release from rat mast cells. Inflamm Res 2000;49:S15-S16.
11.	Deane JA, Fruman DA. Phosphoinositide 3-kinase: diverse roles in immune cellactivation. Annu Rev Immunol 2004;22:563-98.
12.	Dorval V, Dufour M, Leclerc P. Role of protein tyrosine phosphorilation in the thapsigargin-induced intracellular Ca2+ store deplation during human sperm acrosome reaction. Molecular Human Reproduction 2003;9:125-31.
13.	Alfonso A, Botana MA, Vieytes MR, LouzaoMC, Botana LM. Effect of signal transduction pathways on the action of thapsigargin on rat mast cells. Biochemical Pharmacology 1994;47:1813-20.
14.	Inesi G, Wade R, Rogers T. The sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump: Inhibition by thapsigargin and enhancement by adenovirus-mediated gene transfer. Annals of the New York Academy of Sciences 1998;853:195-206.
15.	Rumpel E, Pilatus U, Mayer A, Pecht I. Na+and Ca2+ gradients across the membrane modulate the secretory response of mast cells. Int Arch Allergy Immunol 1995;107:351-3.
16.	Alfonso A, Lago J, Botana MA, Vietes MR, Botana LM. Characterization of Na+Ca2+exchanger on rat mast cells. Cellular Physiol Biochem1999;9:53-71.
17.	Praetorius HA, Friis UG, Praetorius J, Johansen T Evidence for a Na+Ca2+ exchange mechanism in rat peritoneal mast cells. Pflugers Arch 1998;437:86-93.
18.	Lago J, Alfonso A, Vieytes MR, Botana LM. Ouabain induced enhancement of rat mast cells response . Modulation by protein phosphorilation and intracellular pH. Cellular Signaling 2001;13:515-24.
19.	Knudsen T. The Na+K+-pump in rat peritoneal mast cells: some aspects of regulation of activity and cellular function. Danish Medical Bulletin 1995;42:441-53.
20.	Alfonso A, Cabado AG, Vietes MR, Botana LM.Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol 2000;130:1809-16.
21.	Inesi G, Wade R, Rogers T. The sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump:
Inhibition by thapsigargin and enhancement by adenovirus-mediated gene transfer. Annals of the New York Academy of Sciences 1998;853:195-206.
22.	Huber M, Huges MR, Krystal G. Thapsigargin-induced degranulation of
mast cells is dependent on transient activation of phosphatidylinositol-3 kinase. J Immunol 2000;165:124-33.
23.	Micera A,Puxeddu I, Aloe I, Levi-Schaffer F. New insights on the
involvement of Nerve Growth Factor in allergic inflammation and fibrosis. Cytokine Growth Factor Rev 2003;14:369-74.
24.	Stempelj M, Carman-Krzan M , Ferjan I. Regulatory role of extracellular Na+
and Ca2+ ions in nerve growth factor induced histamine secretion from rat mast cells. Inflamm Res 2003;52:74-8.
25.	Stempelj M and Ferjan I. Signaling pathway in nerve growth factor induced
histamine release from rat mast cells. Inflamm Res 2005;54:344-349
26.	Ferjan I and Erjavec F. Effect of Ca2+ ions on the inhibition of histamine and
serotonin secretion caused by phenothiazines. Fundamental and clinical pharmacology 1999;13 (Suppl 1):145.
27.	Ferjan I, Erjavec F. Changes in histamine and serotonin secretion from rat
mast cells caused by antidepressants. Inflamm Res 1996;45:141-4.