57/2 · 2016 Folia biologica e t g e o l o g ic a Ex: Razprave razreda za naravoslovne vede Dissertationes classis IV (Historia naturalis) 57/2 2016 SLOVENSKA AKADEMIJA ZNANOSTI IN UMETNOSTI ACADEMIA SCIENTIARUM ET ARTIUM SLOVENICA Razred za naravoslovne vede – Classis IV: Historia naturalis Ob 85-letnici akademika Mitje Zupančiča LJUBLJANA 2016 Folia biologica et geologica iSSN 1855-7996 Uredniški odbor / Editorial Board Matjaž Gogala, Špela Goričan, Milan Herak (Hrvaška), Ivan Kreft, Ljudevit Ilijanič (Hrvaška), Mario Pleničar, Livio Poldini (Italija), Dragica Turenšek, Branko Vreš in Mitja Zupančič Glavni in odgovorni urednik / Editor Ivan Kreft Tehnični urednik / Technical Editor Janez Kikelj Oblikovanje / Design Milojka Žalik Huzjan Prelom / Layout Medija grafično oblikovanje Sprejeto na seji razreda za naravoslovne vede SAZU dne 21. decembra 2015 in na seji predsedstva dne 23. februarja 2016. Naslov Uredništva / Editorial Office Address FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA SAZU Novi trg 3, SI-1000 Ljubljana, Slovenia Faks / Fax: +386 (0)1 4253 423, E-pošta / E-mail: sazu@sazu.si; www.sazu.si Avtorji v celoti odgovarjajo za vsebino in jezik prispevkov. The autors are responsible for the content and for the language of their contributions. Revija izhaja dvakrat do štirikrat letno / The Journal is published two to four times annually Zamenjava / Exchange Biblioteka SAZU, Novi trg 3, SI-1000 Ljubljana, Slovenia Faks / Fax: +386 (0)1 4253 462, E-pošta / E-mail: sazu-biblioteka@zrc-sazu.si Folia biologica et geologica (ex Razprave IV. razreda SAZU) je vključena v / is included into: Index to Scientific & Technical Proceedings (ISTP, Philadelphia) / Index to Social Sciences & Humanities Proceedings (ISSHP, Philadelphia) / GeoRef Serials / BIOSIS Zoological Record / Internationale Bibliographie des Zeitschriften (IBZ) / Redakcion Homo / Colorado State University Libraries / CABI (Walling ford, Oxfordshire). Folia biologica et geologica (ex Razprave IV. razreda SAZU) izhaja s finančno pomočjo / is published with the financial support Javne agencije za raziskovalno dejavnost RS / Slovenian Research Agency. © 2016, Slovenska akademija znanosti in umetnosti Vse pravice pridržane. Noben del te izdaje ne sme biti reproduciran, shranjen ali prepisan v kateri koli obliki oz. na kateri koli način, bodisi elektronsko, mehansko, s fotokopiranjem, snemanjem ali kako drugače, brez predhodnega pisnega dovoljenja last­nikov avtorskih pravic. / All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system or transmit­ted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording or otherwise, without the prior permission of the publisher. Naslovnica: Geranium lucidum - cvet in listi. Foto: A. Trnkoczy. Cover photo: Geranium lucidum – flower and leaves. Photo: A. Trnkoczy. Fotografija na strani 6: Akademik dr. Mitja Zupančič, fotografiral Igor Dakskobler na Zatrniku 20. maja 2015. Photo on page 6: Academician Dr. Mitja Zupančič in Zatrnik, photo by Igor Dakskobler on May 20, 2015. Folia biologica et geologica · Volume / Letnik 57 ·Number / Številka 2 ·2016 VSEBINA CONTENTS Ivan Kreft 5 Ob 85-letnici akademika Mitje Zupančiča, dolgoletnega urednika (1996-2016) Razprav IV. razreda SAZU, oziroma FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA 5 Academician Mitja Zupančič, 85-years jubilee of former Editor-in-Chief of FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA R AZPR AVE / ESSAyS Mitja Zupančič 7 A new silver fir association on the Ljubljansko barje (Lamio orvalae-Abietetum ass. nova) 7 Nova jelova združba na Ljubljanskem barju (Lamio orvalae-Abietetum ass. nova) Amadej Trnkoczy & Igor Dakskobler 19 Blesteča krvomočnica (Geranium lucidum L.), novost v f lori slovenskega dela Julijskih Alp 19 Geranium lucidum L., a novelty in the f lora of Slovenian part of the Julian Alps Domen Finžgar, Marko Bajc, Jernej Brezovar, Andraž Kladnik, Rok Capuder In Hojka Kraigher 35 Razvoj patentiranega brezpilotnega sistema za vzorčenje iz drevesnih krošenj 35 Development of a patented unmanned aerial vehicle based system for tree canopy sampling Tanveer Bilal Pirzadah, Bisma Malik, Inayatullah Tahir & Reiaz ul Rehman 41 Vivipary in Fagopyrum esculentum 41 Živorodnost pri ajdi (Fagopyrum esculentum) Paula Pongrac, Peter Kump, Bojan Budič, Katarina Vogel-Mikuš 45 Magnesium and phosphorus distributions in developing Tartary buckwheat cotyledons 45 Razporeditev magnezija in fosforja v razvijajočih se kličnih listih tatarske ajde Vida Škrabanja 57 Selen v rastlinah in v okolju v Sloveniji 57 Selenium compounds in plants and in biosphere in Slovenia Ines Štraus, Marko Kreft & Hojka Kraigher 65 Uporaba dvo-fotonskega konfokalnega mikroskopa za raziskovanje encimske aktivnosti ektomikoriznih gliv in analiza slik s programom ImageJ 65 Use of two-confocal mycroscopy for research of enzymatic activity of ectomycorrhizal fungi and image analysis with ImageJ program OB 85-LETNICI AKADEMIKA MITJE ZUPANčIčA, DOLGOLETNEGA UREDNIKA (1996-2016) R AZPRAV IV. RAZREDA SAZU, OZIROMA FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA ACADEMICIAN MITJA ZUPANčIč, 85-yEARS JUBILEE OF FORMER EDITOR-IN-CHIEF OF FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA Mitja Zupančič, rojen 25. decembra 1931 v Ljubljani, dr. gozdarskih znanosti, znanstveni svetnik v pokoju (Biološki inštitut Jovana Hadžija ZRC SAZU, Ljublja­na). Diplomiral je leta 1962 na študiju gozdarstva na Biotehniški fakulteti v Ljubljani. Strokovno se je izpo­polnjeval na Dunaju (Hochschule für Bodenkultur, Avstrija) na Univerzi v Poznanju (Poljska) in 1977 dok­toriral na gozdarski fakulteti Univerze v Sarajevu. V letih 1972–1995 je bil vodja geobotanične skupi­ne Biološkega inštituta in vegetacijskega kartiranja Slovenije. V letih 1982 do 1992 je bil vršilec dolžnosti in direktor ZRC SAZU. V letih 1984–1989 je bil glavni redaktor in 1986–1989 tudi predsednik programskega sveta Vegetacijske karte Jugoslavije. Njegovo znanstve­no delo je usmerjeno v geobotanična – fitocenološka in fitogeografska raziskovanja Slovenije, Balkanskega po­lotoka in srednje Evrope. Pri fitocenoloških raziskavah je predvsem usmerjen v problematiko gozdne vegetaci­je. Na podlagi lastnih raziskav ugotavlja nove ali poja­vljanje drugih evropskih gozdnih fitocenoz različnih sinsistematskih rangov v Sloveniji in širšem vzhodno­alpsko-dinarskem prostoru. Pri njegovem raziskoval­nem delu zavzemajo posebno mesto raziskave smreko­vih in borovih fitocenoz. Preučuje teoretične vidike izredno heterogene problematike sinsistematskega in nomenklatoričnega značaja, dinamiko in razvojne poti ter sinekološke razmere fitocenoz. S primerjalnimi študijami opravlja kritične revizije smrekovih in neka­terih drugih fitocenoz v slovenskem in osrednjem bal­kanskem prostoru. Na osnovi pojavljanja in razširje­nosti fitocenoz in f lore proučuje fitogeografske proble­me in tovrstno delitev Slovenije. Druga smer njegovega preučevanja je problemati­ka vegetacijskega kartiranja in izvedba vegetacijskih kart. Gre za teoretična vprašanja površinskega prika­zovanja fitocenoz in aplikacijo vegetacijskih kart za Mitja Zupančič, born in Ljubljana, December 25, 1931, PhD in Forestry Sciences, retired scientific research adviser of Institute of Biology Jovan Hadži of Scientific Research Center of SASA, Ljubljana. Editor-in-Chief of Razprave 4. razr. SAZU respectively FOLIA BIOLOGI­CA ET GEOLOGICA in the period 1996-2016. Mitja Zupančič graduated in Forestry at Biotechnical faculty, University of Ljubljana in 1962 and continued his edu­cation in Vienna (Austria), Poznan (Poland), in 1977, he received his PhD at the Faculty of Forestry, Sarajevo University. From 1972 to 1995, Zupančič acted as Head of the Group of Geobotany Studies of the Institute of Biology. In the period 1972–1991, he served as Member of the Programme and Scientific Council, Editor in Chief 1984–89, and from 1986 to 1989 President of the Programme Council of the Vegetation Map of yugo­slavia. His scientific work is mainly devoted to geo-bo­tanical, phytocenologic and phytogeographical inves­tigations of Slovenia, the Balkan Peninsula and central Europe. In phyto-cenology research, he focuses his in­terest on issues associated with forest vegetation. Based on his own research findings, he notes the emergence of European forest phytocenoses of different synsys­tematic ranks in Slovenia and at the East-Alpine and Dinaric area. In his research work, Zupančič studies with special attention the fir and pine phytocenoses. He studies the theoretical aspects of the extremely het­erogeneous matters of synsystematic and nomenclato­ry character, the dynamics and developmental paths as well as the synecological circumstances of phyto­cenoses. With comparative studies, Zupančič critically revises fir and several other phytocenoses in the Slove­nian and the central Balkan area. His studies of phyto­geographic problems in Slovenia are based on the oc­currence and distribution of phytocenoses and f lora. operativne namene gospodarstva, naravovarstvenih problemov, prostorskega načrtovanja ipd. V zvezi s tem delom je soavtor preko 50 elaboratov in okoli 90 vegetacijskih kart v raznih merilih in izvedbah. Pose­bej omenjamo večletno sodelovanje pri Vegetacijski karti Jugoslavije (1972-1989) ter evropski vegetacijski karti (Karte der natürlichen Vegetation Europas, 2000–2003). Zupančičeva bibliografija obsega prek 300 naslovov v razponu od izvirnih znanstvenih člankov, monografij, knjig do strokovnih poročil. Je član Vzho­dnoalpsko-dinarskega društva za preučevanje vegeta­cije (podpredsednik 1992–2001) in International Asso­ciation for Vegetation Science. Bil je član redakcijskega odbora Evropske vegetacijske karte (1986–2000), Carta della vegetatione Problems associated with vegetation mapping and production of vegetation maps are another research area of Zupančič. It concerns theoretical dilemmas of surface displays of phytocenoses and the application of vegetation maps for operative economic purposes, na­ture preservation issues, spatial planning, etc. On these topics, Zupančič co-authored over 50 studies and about 90 vegetation maps, of varying scales. His cooperation in the compilation of a multicast Vegetation Map of yugoslavia (1972-1989) and the European Vegetation Map (Karte der Natürlichen Vegetation Europas, 2000/2003) deserves special mention. He is a member of the Eastern Alpine - Dinaric As­sociation for Vegetation Studies (vice-president 1992– 2001), and member of delle Alpi (1992– International Associ­2000), Znanstvenega ation for Vegetation sveta Alpen Forum Science. He was mem­ pri Švicarski naravo­ber of editorial board slovni akademiji of European Vegeta­ (1994–2000). V ob­tion Map (1986– dobju 2002 do 2006 2000), Carta della je bil tajnik IV. razre­vegetatione delle Alpi da SAZU za naravo­(1992–2000), and Sci­ slovne vede. entific Board of Alpen V času njegovega Forum at Swiss Acad­ uredništva je bila emy of Natural Sci­ akademijska revija ences (1994–2000). In FOLIA BIOLOGICA the period 2002-2006, ET GEOLOGICA or- he was Secretary of ganizacijsko, obli­ the SASA IV. Section kovno in vsebinsko of Natural Sciences. prenovljena; kot član In the time of his uredniškega odbora editorship, scientif ic pa še nadalje sodeluje journal FOLIA BIO-z recenzijami in na- LOGICA ET GEO­sveti. LOGICA was reno­vated in regard to or­ganization, layout and scientif ic content, his continued activity as the member of edi­torial board is greatly appreciated. I. Kreft A NEW SILVER FIR ASSOCIATION ON THE LJUBLJANSKO BARJE (LAMIO ORVALAE-ABIETETUM ASS. NOVA) NOVA JELOVA ZDRUŽBA NA LJUBLJANSKEM BARJU (LAMIO ORVALAE-ABIETETUM ASS. NOVA) Mitja Zupančič1 Received November 27, 2016; accepted December 31, 2016. Delo je prispelo 27. novembra 2016, sprejeto 31. decembra 2016. abStR act iZVleČeK a new silver fir association on the ljubljansko barje Nova jelova združba na ljubljanskem barju A new forest association Lamio orvalae-Abietetum ass. Opisana je nova gozdna združba Lamio orvalae-Abiete­ nova is described on isolated sites on Ljubljansko barje. tum ass. nova. na osamelcih Ljubljanskega barja. Njen obstoj Their existence is enabled by the ecological conditions, omogočajo ekološke razmere, predvsem geološka podlaga in above all the bedrock and soil and the air humidity. tla ter vlažna zračna klima. Key words: phytocenology, ecology, Ljubljansko barje, Ključne besede: fitocenologija, ekologija, Ljubljansko Lamio-Abietetum. barje, Lamio-Abietetum. 1 SAZU, Novi trg 5, SI-1000 Ljubljana, Slovenija. 1 INTRODUCTION Some time ago in May 1997, I phytocenologically in­ventoried an interesting silver fir phytocoenosis in two solitary sites on the Ljubljansko barje (Ig, 335 m; Kot 310 m). They were predominantly covered by silver fir (Abies alba) with individual European ash (Fraxinus excelsior), pedunculate oak (Quercus robur), sycamore (Acer pseudoplatanus) and wych elm (Ulmus glabra). These companion trees are characteristic species of fresh to damp soils, which also applies to fir. In addi­tion to the aforementioned tree species, sessile oak (Quercus petraea) and Norway spruce (Picea abies) are also present. Norway spruce is for the most part sec­ondarily included in fir stands. The presence of sessile oak is normal in the context of the aforementioned tree species; although it prefers dry to moist soils, it is not averse to fresh soils. In view of the quantitative pres­ence of fir, we are of the opinion that it is a fir associa­tion on fresh carbonate soils and damp atmospheric climate, especially in autumn and partially spring. For now, around twelve fir associations are recognised in Slovenia, of which seven are on acidic and five on car­bonate soils. They have been described by eight re­searchers: Belec, Horvat, Ž. Košir2, Marinček, Oberdor­fer, Vukelić & Baričević and Wraber (in Šilc & čarni 2012) and Tregubov (1962). The most widespread and covering larger areas are the acidophilus fir associa­tions Bazzanio-Abietetum M. Wraber 1958, Galio ro­tundifolii-Abietetum M. Wraber 1959 and Dryopterido affinis-Abietetum Ž. Košir nom. inval. All other fir as­sociations appear on smaller areas. In view of the afore­mentioned ecological conditions of solitary sites on the Ljubljansko barje and, consequently, also the special f loristic composition, we find that it is a new silver fir association Lamio orvalae-Abietetum ass. nova. 2 METHODS We inventoried both silver fir sites according to the nomenclature source for the names of ferns and seed Central European method (Braun-Blanquet 1964) plants. The nomenclature source for the names of and continued the research in the sense of this meth-mosses was Kleine Kryptogamenf lora (Gams 1957). od. Mala f lora Slovenije (Martinčič et al. 2007) is the 3 ECOLOGICAL CONDITIONS Ljubljansko barje is located in an area with a mean an­nual air temperature of 21 °C and mean annual pre­cipitation of 1500 mm (Atlas klime SFRJ 1969). The microclimate of the solitary sites is probably a little colder, with higher air humidity, caused by occasional more or less extensive f looding in the locality. In gen­eral, the area is classified into continental climate. The bedrock of the solitary sites is of tertiary age. It could be classified into light grey massiv limestone. In some parts there can be a colourful bedrock of sandstone and tuffite limestone, interspersed in places with chert (Grad & Ferjančič 1968). In our case we consider that massiv limestone predominates. We did not perform more detailed research of the soils. In view of the temporary review of the soils we classify them into carbonate brown soils on limestone (brown calcareous soil, Chromic Cambisols) or even into dystric brown soils on sandstone (Grčman et al. ed. 2015). The soils are interwoven mosaically but brown calcareous soils predominate, which is also in­dicated by the majority basophilous f lora. The sur­rounding for the most part eutric or dystric amphigley in the peat soils does not have an inf luence on the studied objects because both sites are raised a few me­tres above the mire (peat) ground. 2 Ž. Košir (1994, 2010) distinguishes a number of fir associations, which are supposed to be made from subassociations of fir-beech forest but this has not been scientifically proved. 4 RESULTS AND DISCUSSION Structure of the association Silver fir – Abies alba is dominant in both stands of the new association – Lamio orvalae-Abietetum ass. nova; other tree species, pedunculate oak – Quercus robur, sessile oak – Q. petraea, European ash – Fraxinus excelsior, sycamore – Acer pseudoplatanus, w ych elm – Ulmus glabra are associated with it. In the second site (as in the second relevé), planted spruce – Picea abies is present in a larger amount. In terms of f loristic com­position, the association is very uniform, diagnostic species of the order Fagetalia sylvatica, class Querco­-Fagetea absolutely predominate in it and for sinsys­tematic classification, southeast European-Illyrian species of the alliance Aremonio-Fagion are important. We additionally classify to southeast European-Illyri­an species the acidophilous species Aposeris foetida. Because of the extremely small number of species, we classified species from the alliances Carpinion (Vinca minor, Rosa arvensis, Prunus avium), Tilio-Acerion (Staphylea pinnata), Quercetalia pubescentis (Fraxinus ornus, Sorbus aria, Homalothecium lutescens) and Quercetalia roboris-petraeae (Quercus robur) into the class Querco-Fagetea, where they also belong in terms of hierarchical sinsystematic values. Species, diagnos­tic for the alliance of maple and elm are characteristic species of moist forests, which are joined by tall herb species in which could be classified also hygrophilous Illyrian species Lamium orvala, which with its cover­age characterizes the researched community. Of types of beech forest, the following are moisture loving: Ga­leobdolon f lavidum, Pulmunaria officinalis, Sambucus nigra and Arum maculatum. To hygrophilous species could be added the mesophilous species Aegopodium podagraria, which is very widespread in some places. The biological spectrum of the association Lamio orvalae-Abietetum shows that the living conditions of the phytocoenosis are more or less normal for survival or they correspond to the living conditions of the tem­perate zone. The stands of this association thrive in more or less favourable site conditions but not in opti­mal ones (Table 1). This is also confirmed by horologi­cal analysis of the geoelements, which indicates pre­vailing colder f loral elements (European, Euroasiatic, Eurosiberian, Circumboreal, Paleotemperate, Alpine-Carpathian, Arctic-Alpine species) (Table 2). Among them the most numerous are European and Euroasi­atic geoelements, which in terms of their distribution are also the commonest in the temperate zone. table 1: biological spectrum of the association Lamio orvalae-Abietetum table 2: Horological groups (Poldini 1991) in the association Lamio orvalae-Abietetum Life form number % PHANEROPHyTES 22 28.6 Stemmed (P. scap.) 10 13.0 Tufted (P. caesp.) 6 7.8 Nanophanerophy te 4 5.2 Climbing (P. lian.) 2 2.6 CHAMAEPHyTES 9 11.7 Mosses (B. Ch.) 8 10.4 Creepers (Ch. rept.) 1 1.3 HEMICRyPTOPHyTES 26 33.8 Stemmed (H. scap.) 16 20.8 Rosette (H. ros.) 4 5.2 Tufted (H. caesp.) 3 3.9 Creepers ( H. rept.) 2 2.6 Biennials (H. bien.) 1 1.3 GEOPHyTES 19 24.6 with rhizomes (G. rhiz.) 17 22.0 with bulbs (G. bulb.) 2 2.6 TEROPHyTES 1 1.3 Stemmed (T. scap.) 1 1.3 TOTAL 77 100.0 GEOELEMENTS number % European 21 27.3 Euroasiatic 11 14.2 Mediterranean-montane 7 9.1 Eurosiberian 7 9.1 Circumboreal 5 6.5 Paleotemperate 4 5.2 Pontic 4 5.2 Mediterranean-Atlantic 3 3.9 Northern Illyrian 2 2.6 Southern Illyrian 1 1.3 Mediterranean-Pontic 1 1.3 Alpine-Carpathian 1 1.3 Arctic-Alpine 1 1.3 Cosmopolitan 1 1.3 Unspecified mosses 8 10.4 TOTAL 77 100.00 characteristic and differential species In accordance with the ecological conditions of the phytocoenosis of the association Lamio orvala-Abiete­tum we decided on the following characteristic species of the association: Abies alba, Mill. a montane-Medi­terranean species that dominates other associated tree species. It is characteristic that it gives preference to habitats with greater soil and atmospheric moisture. It is similar with the Northern Illyrian species Laminum orvala L., which has abundant and optimal growth and dense settlement under the aforementioned ecological conditions, which is expressed by high median cover values. The species Lamium orvala with other South­east-European-Illyrian species (Hacquetia epipactis, Omphalodes verna, Cyclamen purpurascens, Cala­mintha grandif lora, Aremonia agrimonoides) places the association in the Illyrian phytogeographic province and Illyrian alliance Aremonio-Fagion. We also chose Vinca minor L. as a characteristic species of the asso­ciation, which is otherwise widespread from Galicia in Spain, southern England, Central Europe and through Pannonia to the east. Despite its wide distribution, Meusel et al. (1978) stress its primary distribution in the Northern Illyrian space. Sites of the association Lamio orvalae-Abietetum suit it because it is a fresh to moisture-loving species of the colline belt. As distinguishing species of the association Lamio orvalae-Abietetum we chose the European species Fraxinus excelisior and Quercus robur. Both species oc­cupy moist habitats or merely fresh soil more or less intermixed with silicate rocks, as is probable in our case. Both species are or were native to the Ljubljansko barje, where they construct or constructed independ­ent stands of peat forest phytocoenoses. They have a subordinate role in the association Lamio orvalae-Abi­etetum but indicate the wider ecological conditions of the area. The nomenclature definition of the association is: Lamio orvalae-Abietetum ass. nova. Holotype: relevé 1 in phytocenological table. Characteristic species of the association: Abies alba, Laminum orvala. Differential species of the association: Fraxinus excelsi­or, Quercus robur. We classify the association into the Illyrian alliance Aremonio-Fagion. 5 CONCLUSIONS Phytocoenoses of the association Lamio orvalae-Abie­tetum are governed by the ecological conditions that prevail on the Ljubljansko barje. In this area there is more atmospheric and slightly increased ground mois­ture. Ground moisture is mainly dependent on the bedrock parent material, which is mosaically interwo­ven between the predominant limestone and a minor part of sandstone. Various soils have developed on the different bedrock: from the majority carbonate brown to the minority moister dystric brown soils. The open­ness and non-forested nature of the Ljubljansko barje enable major oscillations of daily and annual tempera­ture, especially with a lack of wind. The damp cold and the soaked peat soils contribute to the low tempera­ture, especially in early spring, autumn and winter. These ecological conditions favour more mesophilous f lora of beech forests, which in this phytocenosis pre­vail over the expected f lora of plains. Phytocoenoses of the association Lamio orvalae­-Abietetum approximate f loristically and ecologically to lower mountain phytocoenoses of the association Abieti-Fagetum clematidetosum Tregubov 1958 nom. mscr. Košir (1994: 67) classified these phytocoenoses into an independent association Clematido vitalbae­-Abietetum (Tregubov 1958 n. inver.). Ž. Košir 1994 nom. prov. (Dakskobler & Marinček 2009: 50). Ž. Košir (1994: 67) finds that the phytocoenosis of the association Clematido vitalbae-Abietetum (= Abieti-Fa­getum clamatidetosum) grows on a mixed carbonate­noncarbonate geological basis, which is similar to the association Lamio orvalae-Abietum. The findings of Košir are to date general and it is necessary to restudy lowland stands of the sub-association Abieti-Fagetum clematidetosum: whether it is an extra zonal beech or an independent fir phytocoenosis, which would even be possible to classify into the association Lamio orva­lae-Abietetum. Kutnar et al. (2012: 205) favoured a sub-association, which is validly described as Ompha­lodo-Fagetum (Tregubov 1957) Marinček et al. 1993 var. geogr. Calamintha gradif lora Surina 2002 asareto­sum europaeae Puncer 1980 (= Omphaldo-Fagetum (Tregubov 1957) Marinček et. al. 1963 clematidetosum). In view of the incompleteness of Košir’s (1994, 2010) formation of the lowland fir-beech association Ompha­lodo (Abieti)-Fagetum clematidetosum in Clematido­-Abietotum, we include our association Lamio orvalae­-Abietetum, as it is now known, among the first in the Illyrian alliance of beech forests Aremonio-Fagion. The question arises of whether perhaps the asso­ciation Lamio orvalae-Abietetum is a different associa­tion in which there should be managed (cut) beech in a lowland form of fir-beech forest, i.e., in the subassocia­tion Omphalodo Fagetum clematidetosum. This is not very likely because we did not find beech in the census plots, nor a high cover value of the leading distinguish­ing species of the subassociation Clematis vitalba. Neutral and acidic fir forests thrive at lower altitudes, where there is enough atmospheric humidity and ade­quately acidic soil for our stands. ACKNOWLEDGMENTS The author is grateful to Dr. Igor Dakskobler for re-The author is grateful to Vinko Žagar for technical viewing the article and valuable advice. assistance in producing the phytocenological tables. PHYtocoeNological table (Fitocenološka tabela) LAMIO ORVALAE-ABIETETUM ass. nova Number of relevé (Zaporedna številka popisa) 1 2 Altitude in m (Nadmorska višina v m) 335 310 Aspect (Nebesna lega) Slope in degrees (Nagib v stopinjah) Bedrock (Geološka podlaga) Stoniness in % (Kamnitost v %) Cover (Pokrovnost) %: Tree layer (drevesna plast) Shrub layer (grmovna plast) Herb layer (zeliščna plast) Moss layer (mahovna plast) Relevé (Velikost popisne ploskve) m2 Location (Kraj popisov) LAMIO ORVALAE-ABIETETUM ass. nova I II III IV SE -5-10 0 limestone (apnenec) 10 80 70 60 10 400 0 603010010 400 Ljubljansko Presence barje (Prezenca) Ig Kot Sinsistematical characteristic (Sinsistematska pripadnost) CHARACTERISTIC SPECIES OF ASSOCIATION (Značilnice) 1 2 I 4.2 3.1 2 VPAbies alba 3 II 2.2 + 2 FLamium orvala III 2.2 4.4 2 1 DISTINGUISHING SPECIES OF ASSOCIATION (Razlikovalnici) 1 1.1 I AU Fraxinus excelsior II 3.2 I 1.1 RP2 Quercus robur II + 2 1.1 2 2 1.2 2 1.1 2 2 . 1 • FAREMONIO-FAGION (Ht. 1938) Török, Podani & Borhidi in Borhidi 1989 1 Lamium orvala Hacquetia epipactis Omphalodes verna Cyclamen purpurascens Calamintha grandiflora Aremonia agrimonoides FFAGETALIA SyLVATICAE Pawl. 1928 s. lat. 2 Acer pseudoplatanus Eurhynchium zetterstedtii Galeobdolon flavidum Pulmonaria officinalis Sambucus nigra Ulmus scabra Asarum europaeum Carex sylvatica III III IV III II I II III 1 2.2 + 1.1 + +.2 + 1 1.1 . 1.3 2.2 1.2 + 1.1 + +.2 + 2 4.4 2 1.2 2 + 2 + 2 . 1 . 1 2 2.1 2 22.2 1 2.4 2 1.1 2 1.2 2 1.2 2 . 1 2 + 2 +.2 2 +.2 2 Number of relevé (Zaporedna številka popisa) Actaea spicataLilium martagonPrimula vulgarisRanunculus lanuginosusViola reichenbachianaArum maculatum Galium laevigatumGalium odoratum Mercurialis perennisSymphytum tuberosumAdoxa moschatellina Brachypodium sylvaticum Campanula tracheliumDaphne mezereum Euphorbia dulcis Geranium robertianumHelleborus odorus Lathyrus vernusMycelis muralisNeottia nidus-avisParis quadrifolia Polygonatum multiflorumSalvia glutinosaSanicula europaeaScrophularia nodosa II III FQUERCO-FAGETEA Br.-Bl. & Vlieger in Vlieger 1937 3 Anemone nemorosa Vinca minor Fraxinus excelsior Quercus robur Corylus avellana Quercus petraea TA Staphylea pinnata QCamptothecium lutescens 2 Ctenidium molluscumIsothecium myusuroidesCarex digitata Clematis vitalba QEuonymus verrucosa 2 Q/OO Fraxinus ornus 2 Hedera helixLonicera xylosteumMoehringia trinervia C Prunus avium C Rosa arvensis Q2 Sorbus aria P Viburnum opulus III III III I IIIV III II III II 1 + + + + + . 1.1 . +.2 +.2 . . + + + + . + + + . + + + + 1 2.2 1.2 1.1 3.2 1.1 + 1.1 2.1 1.1 +.3 +.3 +.3 +.2 + + + + + + + + + + 2 + 2 + 2 + 2 + 2 + 2 1.2 1 . 1 1.1 1 . 1 . 1 + 1 + 1 . 1 . 1 . 1 . 1 + 1 . 1 . 1 . 1 + 1 . 1 . 1 . 1 . 1 2 1.1 2 1.1 2 1.1 2 21.1 2 1.1 2 2 . 1 1.1 2 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 . 1 Number of relevé (Zaporedna številka popisa) 1 ABETULO-ADENOSTyLETEA Br.-Bl. et R. Tx. 1943 s. lat. (=MULGEDIO-ACONITETEA Hadač & Klika in Klika & Hadač 1944 s. lat.) 1 Dryopteris filix-mas III 1.2 Senecio ovatus 1.1 Rubus idaeus II + 2 + 2 . 1 . 1 VPVACCINIO-PICEETEA Br.-Bl. in Br.-Bl. et al. 1939 em. Zupančič (1998) 2000 s. lat. Abies alba Picea excelsa Oxalis acetosella Rubus hirtus Hypnum cupressiforme Thuidium tamariscinum • Aposeris foetida O OTHER SPECIES (Ostale vrste) ART Aegopodium podagraria EPCarex alba 2 EP2 Fragaria vescaEP2 Myosotis sylvatica TG Veronica chamaedrys M MOSSES (Mahova) Mnium sp. Mnium sp. LEGEND (Legenda) C CARPINION Issl. 1931 em. Oberd. 1953 s. lat. AU ALNO-ULMION Br.-Bl. & R. Tx. 1943 TA TILIO-ACERION Klika 1955 I II I II III II IV III III IV 1 2 4.2 3.1 2 2 2.2 + 2 1.1 3.1 2 2 + . 1 1.1 2.2 2 3.3 . 1 +.3 . 1 +.2 . 1 + . 1 1 2 . 2.2 1 + . 1 + . 1 . + 1 + . 1 1 2 +.3 +.4 2 +.2 . 1 RPQUERCETALIA ROBORIS-PETRAEAE R. Tx. (1931) 1937 s. lat. 2 Q2 QUERCETALIA PUBESCENTIS-PETRAEAE Br.-Bl. 1931 OO FRAXINO ORNI-OSTRyION Tomažič 1940 P PRUNETALIA SPINOSAE R. Tx. 1952 s. lat. ART ARTEMISIETEA Lohm., Prsg. & R. Tx. in R. Tx. 1950 s. lat. E EPILOBIETEA ANGUSTIFOLII R. Tx. & Prsg. in R. Tx. 1950 s. lat. TG TRIFOLIO-GERANIETEA SANGUINEI Th. Müller 1961 s. lat. REFERENCES - LITER ATUR A Atlas klime SFRJ 1969. Hidrometeorološka služba SFRJ. Beograd. Braun - Blanquet, J., 1964: Pf lanzensoziologie. Wien-New york. Dakskobler, I. & L. Marinček, 2009: Pregled jelovih rastišč v Sloveniji. Zbornik gozdarstva in lesarstva (Lju­ bljana) 89: 43–54. Gams, H., 1957: Kleine Kryptogamenf lora. Stuttgart. Grad, K. & L. Ferjančič, 1968: Tolmač in karta Kranj L 33–65. Osnovna geološka karta 1 : 100.000 SFRJ. Beograd. Grčman, H., N. J. Vidic, M. Zupan, F. Lobnik, A. Jones & L. Montanarella (uredniki), 2015: Tla Slovenije s pedološko karto v merilu 1 : 250.000. European Commission Joint Research Centre. Institute for Environment and Sustainability. Ljubljana. Košir, Ž., 1994: Ekološke in fitocenološke razmere v gorskem in hribovskem jugozahodnem obdobju Panonije. Zveza gozdarskih društev Slovenije. Ljubljana. Košir, Ž., 2010: Lastnosti gozdnih združb kot osnova za gospodarjenje po meri narave. Zveza gozdarskih društev Slovenije. Gozdarska založba Ljubljana. Kutnar, L., Ž. Veselič, I. Dakskobler & D. Robič, 2012: Tipologija gozdnih rastišč Slovenije na podlagi ekoloških in vegetacijskih razmer za potrebe usmerjanja razvoja gozdov. Gozdarski vestnik (Ljubljana) 70 (4): 195–214. Martinčič, A., T. Wraber, N. Jogan, A. Podobnik, B. Turk & B. Vreš, 2007: Mala f lora Slovenije. Ljubljana. Meusel, H., E. Jäger, S. Rauscmert & E. Weinert, 1978: Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen. Flora. II. Jena. Poldini, L., 1991: Atlante corologico delle Piante Vascolari nel Friuli - Venezia Giulia. Udine. Šilc, U. & A. čarni, 2012: Conspectus of vegetation syntaxa in Slovenia. Hacquetia (Ljubljana) 11 (1): 112–164. Tregubov, V., 1962: Associations du groupe Abieti-Piceetum dela region karstique occidentale des alpes Dinariques. Mitt. Ostalpi-din. pfalnz. Arbietsgem. 2: 39–46. Wraber, M., 1946: Rastlinska biološka oblika – zrcalo življenjskih pogojev. Prirodoslovno društvo (Ljubljana): 1–11. POVZETEK Pred časom, maja 1997, sem fitocenološko popisal za­nimivi jelkini fitocenozi na dveh osamelcih Ljubljan­skega barja (Ig, 335 m; Kot, 310 m n.m.). Porasla sta bila s pretežnim delom jelke v družbi s posameznim velikim jesenom, dobom, belim javorjem in golim brestom. Omenjena sopotna drevesa so znanilci sve­žih do vlažnih tal, kar prija tudi jelki. Poleg omenjenih drevesnih vrst sta prisotna še graden in smreka. Smre­ka je večinoma sekundarno vnesena v jelove sestoje. Prisotnost gradna je normalna v sklopu prej omenje­nih drevesnih vrst, čeprav porašča prej sušna kot vla­žna tla, sicer pa se ne izogiba svežih tal. Glede na koli­činsko prisotnost jelke ugotavljamo, da gre za jelovo združbo na svežih karbonatnih tleh in vlažno zračno klimo, zlasti v jesenskem in deloma pomladanskem obdobju. Zdaj poznamo v Sloveniji okoli dvanajst jelo­vih združb, od teh sedem na kislih in pet na karbona­tnih tleh. Opisalo jih je osem raziskovalcev: Belec, Horvat, Ž. Košir3, Marinček, Oberdorfer, Vukelić & Baričević, Wraber (v Šilc & čarni 2012) in Tregu­bov (1962). Najbolj razširjene in na večjih površinah so kisloljubne jelove združbe Bazzanio-Abietetum M. Wraber 1958, Galio rotundifolii-Abietetum M. Wraber 1959 in Dryopterido af finis-Abietetum Ž. Košir nom. inval. Vse druge jelove združbe se pojavljajo na manj­ših površinah. Glede na prej omenjene ekološke raz­mere osamelcev Ljubljanskega barja in s tem posledič­no na posebno f loristično sestavo ugotavljamo, da gre za novo jelovo združbo Lamio orvalae-Abietetum ass. nova. 3 Ž. Košir (1994, 2010) loči več jelovih združb, ki naj bi bile izvedene iz subasociacij dinarskega jelovo-bukovega gozda, česar pa ni znanstveno dokazal. METODA Obe rastišči jelove združbe smo popisali po srednjee-tinčič et al. 2007) je bila nomenklaturni vir za imena vropski metodi (Braun-Blanquet 1964), in po tej me-praprotnic in semenk. Nomenklaturni vir za imena todi nadaljevali raziskave. Mala f lora Slovenije (Mar-mahov je bil Kleine Kryptogamenf lora (Gams 1957). EKOLOŠKE RAZMERE Ljubljansko barje se nahaja v območju s srednjo letno temperaturo zraka 21 °C in s srednjo letno količino pa­davin 1500 mm (Atlas klime SFRJ 1969). Verjetno pa je mikroklima osamelcev nekoliko hladnejša z večjo zračno vlago, ki jo povzroča občasno bolj ali manj ob­sežno poplavljanje v okolici. V splošnem uvrščamo ob­močje v kontinentalno klimo. Geološka podlaga osamelcev je terciarne starosti. Uvrstili bi jo v svetlosiv neplastovit apnenec. V nekate­rih predelih je lahko pisana podlaga peščenjaka in tu­fitnega apnenca, ki mu je ponekod primešan roženec (Grad & Ferjančič 1968). V našem primeru ocenjuje­mo, da prevladuje neplastovit apnenec. Podrobnejših raziskav tal nismo opravili. Glede na začasen pregled tal jih uvrščamo v rjava karbonatna tla na apnencu ali celo v distrična tla na peščenjakih (Gr­čman et al. ur. 2015). Tla se mozaično prepletajo, ven­dar prevladujejo rjava karbonatna tla, kar nakazuje tudi večinska bazifilna f lora. Okoliški večinsko ev­trični ali distrični amfiglej na barjanskih tleh nima vpliva na tla na raziskovanih objektih, ker sta oba objekta nekaj metrov dvignjena nad barjanskimi tlemi. REZULTATI IN R AZPRAVA Zgradba združbe V združbi jelke in velike mrtve koprive – Lamio orva­lae-Abietetum ass. nova je dominantna jelka – Abies alba, ostale drevesne vrste dob – Quercus robur, graden – Q. petraea, veliki jesen – Fraxinus excelsior, beli javor – Acer pseudoplatanus, goli brest – Ulmus glabra so ji pridružene. Na drugem rastišču (Kot, v drugem popi­su), je v večji količini prisotna zasajena smreka – Picea abies. Po f lorističnem sestavu je združba zelo enotna, v njej absolutno prevladujejo diagnostične vrste iz reda Fagetalia sylvaticne, razreda Querco-Fagetea, in za sin­sistematsko opredelitev pomembne jugovzhodnoe­vropsko-ilirske vrste ilirske zveze Aremonio-Fagion. K jugovzhodnoevropsko-ilirskim vrstam uvrščamo še kisloljubno vrsto Aposeris foetida. V razred Querco-Fa­getea smo zaradi izredno majhnega števila vrt uvrstili vrste iz zvez Carpinion (Vinca minor, Rosa arvensis, Prunus avium), Tilio-Acerion (Staphylea pinnata), Quercetalia pubescentis (Fraxinus ornus, Sorbus aria, Homalothecium lutescens) in Quercetalia roboris-petra­eae (Quercus robur), kamor po hierarhični sinsistemat­ski vrednosti tudi pripadajo. Vrste diagnostične za zvezo javorjev in brestov so znanilke vlažnih gozdov, ki se jim pridružujejo vrste visokih steblik (Dryopteris filix-mas, Senecio ovatus, Rubus idaeus) sem bi lahko uvrstili še vlagoljubno vrsto Lamium orvala, ki s svojo veliko pokrovnostjo označuje preučevano združbo. Od diagnostičnih vrst bukovih gozdov so vlagoljubne še naslednje: Galeobdolon f lavidum, Pulmunaria offici­nalis, Sambucus nigra in Arum maculatum. K vlago­ljubnim vrstam bi dodali še mezofilno vrsto Aegopodi­um podagraria, ki je na nekaterih mestih zelo razširje­na. Biološki spekter asociacije Lamio orvalae-Abiete­tum kaže, da so življenjske razmere fitocenoze bolj ali manj normalne za preživetje oziroma ustrezajo ži­vljenjskim razmeram zmernega pasu. Združba uspeva v bolj ali manj ugodnih rastiščnih razmerah, vendar ne v optimalnih (Tabela 1). To potrjuje tudi horološka analiza geoelementov, ki kaže na prevlado hladnejših f lornih elementov (evropske, evroazijatske, evrosibir­ske, cirkumborealne, paleotemperatne, alpsko-karpat­ske, artsko-alpske vrste) (Tabela 2.) Med temi sta naj­številčnejša evropski in evrazijski geoelement, ki sta glede na svojo razširjenost tudi najbolj pogosta v zmer­nem pasu. Značilnice in razlikovalnici Skladno z ekološkimi razmerami obeh preučenih fito­cenoz asociacije Lamio orvala-Abietetum smo se odloči­li za naslednje značilnice asociacije: Abies alba, Mill. montansko-mediteranska vrsta, ki dominira nad dru­gimi pridruženimi drevesnimi vrstami. Zanjo je značil­no, da daje prednost rastiščem z večjo talno in zračno vlago. Podobno je s severnoilirsko vrsto Laminum orva­la L., ki ima v prej omenjenih ekoloških razmerah bujno in optimalno rast ter gosto naseljenost, ki je izražena z veliko srednjo pokrovno vrednostjo. Vrsta Lamium or­vala z drugimi jugovzhodnoevropsko-ilirskimi vrstami (Hacquetia epipactis, Omphalodes verna, Cyclamen purpurascens, Calamintha grandif lora, Aremonia agri­monoides) kaže na pripadnost nove združbe k fitoge­grafski provinci in ilirski zvezi Aremonio-Fagion. Za razlikovalnice asociacije Lamio orvalae-Abiete­tum smo izbrali evropski vrsti Fraxinus excelisior L. in Quercus robur L. Obe vrsti naseljujeta vlažna rastišča ali le sveža tla, ki jim je bolj ali manj primešana silika­tna kamnina, kar je v našem primeru verjetno. Obe vrsti sta ali sta bili doma na Ljubljanskem barju, kjer gradita ali sta gradili samostojne sestoje barjanskih gozdnih fitocenoz. V asociaciji Lamio orvalae-Abiete­tum imata podrejeno vlogo, vendar nakazujeta širše ekološke razmere območja. Nomenklataturna opredelitev asociacije je: Lamio orvalae-Abietetum ass. nova. Holotip: popis 1 v fitocenološki tabeli. Značilnice asociacije: Abies alba, Laminum orvala. Razlikovalnici asociacije: Fraxinus excelsior, Quercus robur. Asociacijo uvrščamo v ilirsko zvezo Aremonio-Fagion. SKLEP Fitocenoze asociacije Lamio orvalae-Abietetum so po­gojene z ekološkimi razmerami, ki vladajo na Ljubljan­skem barju. Na tem območju je več zračne in nekoliko povečane talne vlažnosti. Vlažnost tal je predvsem od­visna od geološke podlage, ki se mozaično prepleta med pretežnim delom apnenca in manjšim delom peščenja­ka. Na različnih geoloških podlagah so razvita različna tla: od večinskih karbonatnih rjavih do manjšinskih vlažnejših dističnih rjavih tal. Odprtost in negozdna­tost Ljubljanskega barja omogočata velika nihanja dnevne in letne temperature, zlasti ob brezvetrju. Nižjo temperaturo povzročajo tudi vlažna hladna in namoče­na barjanska tla, zlasti v zgodnjepomladanskem, jesen­skem in zimskem času. Te ekološke razmere ugajajo bolj vlagoljubnemu rastlinstvu, ki v preučevani združbi prevladuje nad rastlinstvom v okoliških kolinskih belo­gabrovih in bukovih gozdovih. Od pogostih vrst v teh gozdovih so posamično zastopane Asarum europaeum, Helleborus odorus, Primula vulgaris, pogostejša je le vrsta Vinca minor. (Glej Fitocenološko tabelo). Fitocenoze asociacije Lamio orvalae-Abietetum se f loristično in ekološko približujejo spodnjegorski fito­cenozi asociacije Abieti-Fagetum clematidetosum Tre­gubov 1958 nom. mscr. Košir (1994: 67) je to fitoceno­zo uvrstil v samostojno asociacijo Clematido vitalbae­-Abietetum (Tregubov 1958 n. inver.) Ž. Košir 1994 nom. prov. (Dakskobler & Marinček 2009: 50). Ž. Košir (1994: 67, 2010) ugotavlja, da fitocenoza asocia­cije Clematido vitalbae-Abietetum (= Abieti-Fagetum clematidetosum) porašča mešano karbonatno-nekar­bonatno geološko podlago, kar je podobno kot pri aso­ciaciji Lamio orvalae-Abietum. Ugotovitve Koširja so do sedaj splošne in potrebno bi bilo ponovno preučiti nižinske sestoje subasociacije Abieti-Fagetum clemati­detosum: ali gre za ekstraconalno bukovo ali samostoj­no jelovo fitocenozo, ki bi jo bilo celo moč uvrstiti v asociacijo Lamio orvalae-Abietetum. Kutnar et al. (2012: 205) so se opredelili za subasociacijo, ki je ve­ljavno opisana kot Omphalodo-Fagetum (Tregubov 1957) Marinček et al. 1993 var. geogr. Calamintha gra­dif lora Surina 2002 asaretosum europaeae Puncer 1980 (= Omphaldo-Fagetum (Tregubov 1957) Marinček et al. 1963 clematidetosum). Glede na nedorečenost Koširjevega (1994, 2010) preoblikovanja nižinske jelovo-bukove združbe Omphalodo (Abieti)-Fagetum clematidetosum v Clema­tido-Abietetum našo asociacijo Lamio orvalae-Abiete­tum, kot je sedaj znano, med prvimi vključujemo v ilirsko zvezo bukovih gozdov Aremonio-Fagion. Pojavlja se vprašanje ali je morda asociacija Lamio orvalae-Abietetum drugotna združba, v kateri naj bi bila izgospodarjenja (izsekana) bukev v nižinski obliki jelovo-bukovega gozda, to je v subasociaciji Omphalo­do Fagetum clematidetosum. Ta domneva je malo ver­jetna, ker v popisnih ploskvah nismo izsledili bukve, kot tudi ne visoke pokrovnosti vodilne razlikovalnice subasociacije Clematis vitalba. Nevtralni in kisli jelovi gozdovi pa uspevajo v nižjih nadmorskih višinah, kjer je dovolj zračne vlage in primerno zakisana tla, podob­no velja za naša sestoja. BLESTEčA KRVOMOčNICA (GERANIUM LUCIDUM L.), NOVOST V FLORI SLOVENSKEGA DELA JULIJSKIH ALP GERANIUM LUCIDUM L., A NOVELTy IN THE FLORA OF SLOVENIAN PART OF THE JULIAN ALPS Amadej TRNKOCZy1 & Igor DAKSKOBLER2 Received August 27, 2016; accepted December 16, 2016. Delo je prispelo 27. avgusta 2016, sprejeto 16. decembra 2016. iZVleČeK blesteča krvomočnica (Geranium lucidum l .), novost v f lori slovenskega dela Julijskih alp Opisujemo nova nahajališča vrste Geranium lucidum v Trnovskem gozdu in njeno nenavadno pojavljanje v dolini zgornje Soče med vasema Soča in Trenta v Julijskih Alpah. V Trnovskem gozdu so njena nahajališča skalnati altimon­tanski bukovi gozdovi, ki jih uvrščamo v asociacijo Isopyro­-Fagetum, deloma tudi meliščne združbe, v spodnjem delu doline Trente pa ruderalizirana travišča in kamnite groblje v bližini človekovih bivališč oz. med prometnico in reko Sočo. Menimo, da so ta nahajališča najbrž sekundarna ali subs­pontana. Njena semena bi v Trento lahko prinesla divjad (jelenjad), lahko je bilo vsebovano v mešanicah zemlje okrasnih rastlin, manj verjetno tudi v krmi za konje v času prve svetovne vojne ali v materialu za vzdrževanje cest. Dru­god v Sloveniji podobnega subspontanega pojavljanja te vrste do zdaj niso opisali, v svetovnem merilu pa je zanjo znano invazivno širjenje zunaj naravnega areala. Ključne besede: Geranium lucidum, nitrofilne ruderalne združbe, Trenta, Julijske Alpe, Triglavski narodni park, Slovenija abStR act Geranium lucidum l., a novelty in the f lora of Slovenian part of the Julian alps New localities of Geranium lucidum in Slovenia are de­scribed. They are located in the Trnovski Gozd region and surprisingly in a rather dislocated locality in the Trenta Val­ley between villages Soča and Trenta (the Julian Alps). In the Trnovski Gozd Plateau the species grows in stony altimon­tane beech forests, classified into the associaton Isopyro-Fa­getum, partly also in scree communities. In the Trenta Valley we found it on partly ruderal grassland and on a stone and rock heap, both close to a human dwelling and a regional road. We assume these localities to be secundary or subs­pontaneous. Different potential ways (means) of introduc­tion of the plant are discussed. The most probable agent seems to be large mammal game (particularly red-dear, Cer­vus elaphus) and as less probable option we presume by seed infected soil of purchased horticultural plants. It appears quite improbable that the seeds have been introduced by ma­terials used in maintaining works of the road or during the First World War in large amounts of hay needed to feed nu­merous army horses and mules present on nearby front lines. Similar subspontaneous occurrences of this species in Slovenia are so far unknown, although in global scale the species is known as invasive and spreading. Key words: Geranium lucidum, nitrophilous ruderal communities, Trenta, Julian Alps, Triglav National Park, Slovenia 1 Dr. Amadej Trnkoczy, Trenta 2b, SI-5232 Bovec, amadej.trnkoczy@siol.net 2 Dr. Igor Dakskobler, the Jovan Hadži Institute of Biology of the Scientific Research Centre of the Slovenian Academy of Sci­ences and Arts, Regional research unit, Brunov drevored 13, SI-5220 Tolmin and Biotechnical Faculty of the University of Ljubljana, Department of Forestry and Renewable Forest Resources, Večna pot 83, SI-1000 Ljubljana, igor.dakskobler@zrc­sazu.si 1 UVOD Blesteča krvomočnica (Geranium lucidum L.) je medi­teranska (Aeschimann et al. 2004, Fisher et al. 2005, Lauber et al. 2012) oz. mediteransko-subatlantska vrsta (Anonimous 2016). Razširjena je v vseh medite­ranskih deželah (Schonfelder 2002) od Gibraltarja do vzhodnega Mediterana in naprej na vzhod do Krima (Blamey & Gray-Wilson 2004). Raste tudi drugod po Evropi od nižinskega do gorskega pasu. Atlas britanske in irske f lore (Anonimous 2016) navaja njeno prisotnost v skoraj celotni Veliki Britaniji. Drug spletni vir (Anonymous 2013) navaja njena nahajali­šča v Španiji, Franciji, Nemčiji, na Švedskem in Norve­škem. Raste tudi na Srednjem Vzhodu, na Kavkazu in v delih Himalaje z zmernim podnebjem (Aedo et al. 1998). Po celotni razširjenosti ta vrsta ni vezana iz­ključno na (sub)Mediteran in njegovo podnebje. Po ne­katerih virih (Anonymous 2013) uspeva tudi v dru­gačnih podnebnih razmerah (po Köpen-Geiger): v ste­pah (Geo-C3) v Maroku in Španiji, v subtropskem vlažnem podnebju (Geo-C6) v Pakistanu, Azarbejdža­nu in Turčiji, v atlantskem podnebju (Geo-C7) v Fran­ciji in Veliki Britaniji, v celinskem podnebju s toplimi poletji (Geo-C8) v Pakistanu in Armeniji, v celinskem podnebju z mrzlimi poletji (Geo-C9) na Švedskem in v subarktičnem podnebju (Geo-C10) in tundri (Geo­C11) na Švedskem in Norveškem (zadnje ni povsem zanesljiv podatek). V Alpah je blesteča krvomočnica razširjena pre­cej raztreseno (Aeschimann et al. 2004). Najbolj po­gosta je v zahodnih in jugozahodnih Alpah, deloma tudi v južnih in jugovzhodnih Alpah (province Vero­na, Brescia, Bergamo, Udine), v skrajno severovzho­dnem delu Alp pa uspeva v deželi Spodnji Avstriji (Niederösterreich), kjer je zelo redka in ji grozi izu­mrtje (Fisher & al. 2005). Tudi v Švici je razmeroma redka in z izjemo posameznih nahajališč večinoma uspeva zunaj Alp. Pogostejša je bolj severno v pogorju Jure (Lauber et al. 2012). Zunaj Alp so znana nahaja­lišča tudi v Schwarzwaldu in v skoraj vseh južnoe­vropskih gorovjih (Pireneji, Apenini, francoski Cen­tralni masiv, Balkansko gorovje, Karpati) – Aeschi­mann et al. (2004). Vrsta je vnesena v Avstralijo, Novo Zelandijo in v več delov ZDA (kjer so jo prvič opazili leta 1971) ter Kanade (prva navedba je iz leta 1982, Anonimous 2013). V ZDA se hitro širi in je ponekod že naturalizi­rana. Domnevajo, da je bil vnos nameren, kot (malo poznano) zdravilno zelišče (diuretik, ustavljanje krva­venja). V ZDA jo obravnavajo med nevarnejšimi inva­zivnimi rastlinami. V zvezni državi Washington ima status ‹Class A State Noxiums Weed› in so jo lastniki zemljišč po zakonu dolžni kontrolirati in iztrebljati. Ogroža naravne združbe, kjer mestoma tvori goste preproge in dosega tudi 100 % zastiranje tal. Ogroža predvsem spodnjo plast svetlih hrastovih gozdov (Dennehy et al. 2011) in obrežnih gozdov plemenitih listavcev (Anonimous 2013). Njena pogostnost nara­šča tudi v Veliki Britaniji, kjer je sicer avtohtona (Ano­nimous 2016). V Sloveniji je blesteča krvomočnica razširjena predvsem v njenem jugozahodnem delu, v submedite­ranskem in deloma dinarskem fitogeografskem obmo­čju (slika 1). V arealni karti smo upoštevali tudi naha­jališče v udornici Laška kukava na Logaški planoti ju­govzhodno od Logatca (0151/2): najditelja F. Batič in I. Jurjevčič, 12. 5. 2003 (Jurjevčič 2004: 57), na katerega nas je opozoril Batič (2016, in litt.). Poznamo tudi pre­cej oddaljeno nahajališče v preddinarskem fitogeo­grafskem območju na Sinjem vrhu v Beli krajini (Jogan & al. 2001, Martinčič 2007). Nahajališč v alp­skem fitogeografskem območju doslej ne navajajo (Jogan et al. 2001, Plazar 2001, Aeschimann et al. 2004, Martinčič 2007), pač pa so v novejšem času (Poldini 1991 jih še ne navaja) znana v jugozahodnem prigorju Julijskih Alp v sosednji Italiji (osnovni polji 9746 in 9846 – Beneška Slovenija, v okolici vasi čarni Varh/črni Vrh/Montefosca tik ob slovensko-italijanski meji) – Poldini (2002), Martini (2016, in litt.). V bazi Centra za kartografijo favne in f lore (CKFF) je okoli 150 let stara navedba nahajališča pri Vitanju (Rei­chardt), na meji med alpskim (Pohorje) in subpanon­skim fitogeografskim območjem, vendar je ta navedba nezanesljiva (Bačič 2016, in litt.), in je tudi Tone Wra­ber kot sodelavec projekta Flora Alpina ni upošteval. 2 METODE Floristične in fitocenološke popise blesteče -Blanquet 1964) in jih vnesli v bazo podatkov FloVeg­krvomočnice na nahajališčih v Trenti smo naredili po Si (T. Seliškar et al. 2003). To aplikacijo (in podatke, ustaljenih srednjeevropskih metodah (Ehrendorfer ki so hranjeni v njej) smo uporabili tudi pri pripravi & Hamann 1965, Jalas & Suominen 1967, Braun-arealne karte njene razširjenosti v Sloveniji (slika 1). Nomenklaturni vir za imena praprotnic in semenk je Mala f lora Slovenije (Martinčič et al. 2007) in za imena sintaksonov Theurillat (2004) in Šilc & čarni (2012). Fitocenološke popise združb, v katerih v Trenti uspeva obravnavana vrsta, smo med seboj pri­merjali s hierarhično klasifikacijo. Uporabili smo pro­gramski paket SyN-TAX (Podani 2001) in metodo kopičenja na podlagi povezovanja (netehtanih) sredn­jih razdalj (UPGMA) ter količnik različnosti 1– simi­larity ratio. 3 REZULTATI IN RAZPR AVA 3.1 Nova nahajališča blesteče krvomočnice (Ge­ranium lucidum) v Sloveniji 0149/2 (UTM 33TVL18) Slovenija: Primorska, Trnov­ski gozd, Gozd, Podrta gora in podorno območje pod njo, 800 m do 900 m nm. v., meliščne združbe in grmišče leske, rešeljike in čistilne krhlike na kamniti griži. Det. I. Dakskobler & J. Peljhan, 27. 9. 2006 in J. Peljhan, 29. 7. 2009, popis avtorjev. 0049/4 (UTM 33TVL18) Slovenija: Primorska, Pred­meja, vršni del Sorteža, skalnato ovršje gore, 1200 m do 1220 m nm. v., altimontanski bukov gozd (Is­opyro-Fagetum). Leg. & det. Igor Dakskobler, 8. 4. in 18. 6. 2014, herbarij LJS in avtorjeve fotografije. 0150/1 (UTM 33TVL28) Slovenija: Primorska, Pod­kraj, prisojno skalnato pobočje pod Sv. Duhom, 1200 m nm. v., bukov gozd (Isopyro-Fagetum s. lat. / Pseudofumario albae-Fagetum nom. prov.). Leg & det. I. Dakskobler, 21. 4. in 12. 6. 2015, hrebarij LJS in avtorjeve forografije. 9648/1 (UTM 33TUM93) Slovenija: Primorska, Juli­jske Alpe, dolina Spodnje Trente, (Zgornja) Soča, med cesto Bovec–Vršič in strugo Soče nasproti hiše Soča 46; na ruderalnem travišču obraslem z obrežnim grmovjem in drevjem, na površini okoli 3 m x 35 m, na cestnem robu; Lat.: 46,35133, Long.: 13,69344; 510 m nm. v., Leg. & det. A. Trnkoczy, 16. 5. 2016; conf. I. Dakskobler 19. 5. 2016; herbarij LJS; avtorjeve fotografije w ww.calphotos.com. 9648/1 (UTM 33TUM93) Slovenija: Primorska, Juli­jske Alpe, dolina spodnje Trente, (Zgornja) Soča, na dveh mestih: a) delno obrasli kamniti groblji (skale in kamenje zbrano pri čiščenju okoliških travnikov) na aluvialni terasi zahodno od hiše Soča 46, ruderalno in b) na strmo spuščajočem pobočju terase do reke, ruderalno travišče na površini okoli 12 m x 12 m, deloma pod krošnjo lipe; Lat.: 46,35111, Long.: 13,69237; 520 m do 525 m nm. v. Leg. & det. I. Dakskobler in A. Trnkoczy, 26. 5. 2016, Herbarij LJS, fotografije obeh avtorjev. 3.2 Rastiščna oznaka novih nahajališč v trnov­skem gozdu Nova nahajališča blesteče krvomočnice v Trnovs­kem gozdu so v težko prehodnem skalnatem ali kam­nitem svetu v montanskem in altimontanskem pasu. Na obsežnem podornem območju Griža pod Podrto goro prevladujejo groba melišča in pionirski svetli goz­dovi črnega gabra (Peljhan, mscr.), v vršnem delu Sorteža in Sv. Duha nad Podkrajem pa bukovi gozdovi, ki jih uvrščamo v asociacijo Isopyro-Fagetum (Daksko­bler 2014). Na zelo skalnatih rastiščih smo to vrsto popisali tudi v čičariji v sestojih subasociacije Lamio orvalae-Fagetum pseudofumarietosum albae (Daksko­bler & Reščič 2015). 3.3 Rastiščna oznaka novega nahajališča v Spodnji trenti Novo nahajališče smo obiskali dvakrat. Vrsto smo našli na treh krajih in v nekoliko različnih združbah. Vsa tri nahajališča so v krogu okoli 100 m. Celotna populacija je velika in vitalna, saj je štela ob obiskih več kot sto cvetočih primerkov. Prvič smo jo opazili na zatravljenem cestnem robu med regionalno cesto Bovec–Vršič in reko Sočo pod domačijo Soča 46, Martin (slika 2). Blesteča krvomočnica raste tik ob cesti in le nekaj metrov od reke. Rastišče je precej zasenčeno z obrežnim gr­movjem in drevjem, zanj je značilna visoka talna in zračna vlaga. Geološka podlaga je deloma prod, delo­ma nasuta cestna brežina, talni tip je rendzina. Vrstna sestava nekoliko ruderaliziranega travišča je v popisu 1 v preglednici 1. V njem imajo poleg te vrste največje srednje zastiranje vrste Arrhenatherum elatius, Ranun­culus acris, R. repens, Ajuga genevensis, Parietaria offi­cinalis, Petasites paradoxus, Fragaria vesca in Rubus caesius. Drugo in tretje nahajališče sta v neposredni okolici nenaseljene domačije Soča 46, ki stoji zunaj strnjenega naselja na precej ozki aluvialni terasi okoli 12 m nad nivojem ceste in reke. Tam blesteča krvomočnica porašča kamnito grobljo, veliko okoli 5 m x 5 m in vi­soko okoli 1.5 m (slika 3). To je odlagališče skal in ka­menja, ki je nastalo ob pripravi in vzdrževanju okoliških površin za kmetijsko rabo (čiščenje travnikov kamenja in skal). Takšne groblje so v Trenti pogoste in so poleg suhozidov okoli kmetijskih površin zanimiva kulturna dediščina doline. Rastišče je zelo kamnito, suho in delno sončno, kolikor ozka dolina to dopušča (osončenje približno uro in pol pozimi in pet ur poleti). Talni tip je litosol. Vrstna sestava te kamnite groblje je v popisu št. 3 v preglednici 1. Največje srednje zastiran­je na njej imajo poleg blesteče krvomočnice vrste Sedum sarmentosum (subspontano uspevanje), Helictotrichon pubescens, Asplenium ruta-muraria, Moehringia mus­cosa, Cardaminopsis arenosa, Geranium robertianum ter mahovi Climacium dendroides, Homalothecium lu­tescens in Rhytidiadelphus triquetrus. Tretje nahajališče je tik ob hiši, na strmi brežini rečne terase, ki se spušča k cesti in reki (slika 4). Prev­laduje travišče na plitvih peščenih tleh, ki je deloma v senci krošnje velike lipe. Skupna površina je približno 12 m x 12 m. Tu smo naredili dva fitocenološka popisa. Popis št. 2 v preglednici 1 ponazarja ruderalizirano travišče na brežini, kjer imajo poleg blesteče krvomočnice največje srednje zastiranje vrste Helicto­trichon pubescens, Dactylis glomerata, Galium mollugo, Arrhenatherum elatius, Veronica chamaedrys, Ranun­culus acris, Silene vulgaris, Geranium robertianum, Carex muricata in Myosotis sylvatica agg. Blesteča krvomočnica je rasla tudi v majhni opuščeni okrasni gredici na vrhu tega pobočja (površina okoli 2 m x 0.3 m) v družbi z nekaj vrtnimi vrstami in tudi priseljenkami iz okoliških združb (popis št. 4 v preglednici 1). Večje zastiranje v tej opuščeni gredici sta imeli še vrsti Sedum sarmentosum in Cardaminopsis arenosa. Po f loristični podobnosti sta si najbolj podobna popisa ruderaliziranega travišča pod cesto in nad cesto (preglednica 1). Združba na groblji je nekoliko poseb­na, v njej v zeliščni plasti prevladujeta dve vrsti, Gera­nium lucidum in Sedum sarmentosum. Slednja je okrasna rastlina, doma iz vzhodne Azije in v Sloveniji pogosto podivja po zidovih in skalovju (vir baza FloVegSi). Na groblji je tudi bujna mahovna plast z vrstami Climacium dendroides, Homalothecium lute­scens in Rhytidiadelphus triquetrus. Vsa tri opisana mikrorastišča v nekaterih last­nostih ustrezajo potrebam blesteče krvomočnice. Tla v okolici domačije so bogata s hranili oz. dušikom. Domačija je še do začetka osemdesetih let prejšnjega stoletja premogla do dve kravi in nekaj ovac in koz. Travnike so gnojili s hlevskim gnojem. Ustrezajo tudi bazična tla. Glede sestave tal (Ca/Si) in potrebe po vlagi obravnavana vrsta ni zahtevna (Aeschimann et al. 2004). Obilne padavine v Trenti (2500–3000 mm/ leto) močno presegajo mediteransko povprečje in povprečna letna temperatura 6°C – 8°C je precej nižja. Vendar ne eno ne drugo ni zunaj zanjo ugotovljenih rastiščnih parametrov (Anonimous 2013). Ko so pripravljali model invazivnosti te vrste (Weed risk as­sessment), so upoštevaje vsa znana nahajališča pred­postavili razpon povprečnih padavin od 400 mm/leto (Španija, Izrael) do več kot 2500 mm/leto (Velika Bri­tanija). Glede odpornosti proti mrazu vrsto postavljajo v 6. odpornostni pas (Plant cold hardiness zones), kar pomeni, da prenese ekstremno minimalno zimsko temperaturo do -23 °C. Naravna naselitev v Trenti bi bila glede na naštete okoljske dejavnike mogoča. Kljub temu uspevanje te vrste v okolici domačije Soča 46 v spodnjem delu doline Trente verjetno ni spontano, saj so za zdaj ugotovljena tamkajšnja rastišča vsa bolj ali manj ruderalna v primerjavi z naravnimi nahajališči, kjer smo to vrsto našli v Trnovskem gozdu (Podrta gora, Sortež in Sv. Duh nad Podkrajem). Najbližja nahajališčem v Trenti so sicer nahajališča pri vasi čarni Varh / črni Vrh / Montefosca v Slovenski Benečiji (severovzhodna Italija). 3.4 Možni načini vnosa blesteče krvomočnice v dolino zgornje Soče če predpostavimo, da je novo nahajališče drugotno, torej da se je blesteča krvomočnica na njem naselila v novejšem času, lahko razmišljamo o možnih načinih vnosa. Blesteča krvomočnica (slika 5) je enoletnica ali (zimska) dvoletnica in se razširja z aktivnim izmeta­vanjem svojih semen do razdalje okoli 6 m z eksploz­ivnim odvitjem enosemenskih merikarpov (Aedo 2000). Možne načine razširjanja na večje razdalje so preučili v ZDA (Anonimous 2013). Ugotavljajo, da razširjanje semen z vetrom, vodo in ptiči na večje razdalje ni mogoče. Na podlagi študije geografskega vzorca hitre širitve v ZDA so najbolj verjetni povzročitelji razširjanja te vrste na večje razdalje živali in ljudje. Domnevno prevladuje širjenje z divjadjo in domačimi živalmi. Ali gre za notranji ali zunanji prenos ni raziskano. Med verjetnejše načine razširjanja na večje razdalje štejejo še trgovanje z vrtnarskimi ras­tlinami in semeni kmetijskih rastlin (Salisbury 1961). Možen je tudi prenos preko prometa, z avtomobilskimi zračnicami. Uspešnost razširjanja povečuje večletna kaljivost semen. Verjetnost, da bi obravnavano vrsto v Trento prine­sla divjad, se zdi precejšna. Zračna razdalja od zdaj znanih najbližjih naravnih nahajališč v Beneški Sloven­iji do Spodnje Trente je približno 26 km. Ta razdalja po podatkih iz literature (Leskovic & Pičulin 2012), po informacijah dobljenih na Zvezi lovskih družin Zgorn­jega Posočje (Mozetič, in litt.) in v osebnem pogovoru (Ocvirk, in litt.) za jelene nikakor ne predstavlja večje ovire, še posebej ne v času ruka. V območju njenih najbližjih nahajališč in severno od njih, v Breginjskem kotu, je jelenjad pogosta. Lovci štejejo to območje za pomembno žarišče razširjanja jelenjadi, ki ga v Sloven­iji opažamo zadnja desetletja. V prid temu načinu vnosa semen govori tudi dejstvo, da je divjad v okolici domačije Martin, ki že dve desetletji ni več stalno naseljena in stoji na samem, zelo pogosta. Lastnika domačije (Kravanja, in litt.) sta imela pogosto težave z divjadjo, predvsem z jeleni. Ti so s strmega travišča med domačijo in cesto ob številnih prehodih prožili skale in kamenje na cesto. Zaradi varnosti cestnega prometa je lastnik pobočje pred nekaj leti prekril z žično mrežo. K številčnosti prehodov na lokaciji gotovo prispeva tudi topografija. Dolina Trente je na tem odseku zelo ozka, s strmimi pobočji na obeh straneh. Med antropogenimi načini vnosa namerna zasa­ditev ne pride v poštev, saj je rastlina vrtnarsko nezan­imiva in jo štejejo za plevel. Oba lastnika domačije prinesenih primerkov blesteče krvomočnice nista pre­poznala. Poimenovala sta jih ‹plevel› oziroma sta jih zamenjala s podobno smrdljičko (Geranium robertia­num), ki je v okolici domačije kot tudi v Bovcu pogosta. Zanesljivo blesteče krvomočnice nista nikoli sadila ali gojila kot lončnico (Kravanja, in litt.). Namerni vnos je torej izključen. Bolj verjeten je nenameren vnos semen v zemlji kupljenih hortikulturnih rastlin, s katerimi domačini krasijo svoje skromne vrtičke. O tem priča manjša gredica z nekaj vrtnarskimi rastlinami na vrhu pobočja med domačijo in cesto. V to gredico sta lastnika v ok­viru vzdrževanja domačije občasno sadila okrasne ras­tline tudi po odselitvi. V ZDA izrecno navajajo prim-ere lokalne kontaminacije parkovnih površin in vrt­narij s to vrsto (Anonimous 2013). Tudi v Veliki Bri­taniji navajajo njeno pojavljanje v vrtovih in na ruder­alnih površinah (Anonimous 2016). če je bila blesteča krvomočnica dejansko prinesena v Trento na ta način, mora biti priselitev mlajša, saj navada kupovanja vrt­nih okrasnih rastlin tukaj zagotovo ni stara. Nedavno priselitev pa ne podpira dejstvo, da je bilo vnašanje ku­pljenih rastlin v okolico domačije le občasno in v zelo majhnem obsegu. Vprašanje je, ali se v kratkem času ta vrsta lahko razširi na takšno površino, kot jo kaže stanje v letu 2016. Vnos vrste med prvo svetovno vojno je še ena od možnosti. Le okoli 20 m stran od nahajališča med cesto in Sočo je potekala vojaška žičnica Vršič–Lepe­na/Kršovec (Anonimus, 1918), ki je oskrbovala Avs­tro-Ogrske vojaške baze v Lepeni, pri Krnskih jezerih in na planini Golobar, ki so podpirale celotno frontno črto od Krna do Bovca. Po njej so morali prepeljati ve­like količine sena za številne tovorne živali, ki so bile v teh gorah ključno transportno sredstvo. Gotovo se ga je nekaj izgubilo med prevozom po žičnici, morda tudi pri zdajšnjem nahajališču blesteče krvomočnice. Težko pa si je razložiti prisotnost semen blesteče krvomočnice v senu, saj njena naravna nahajališča niso na travni­kih. Vnos semen z gradivom pri gradnji oziroma kas­neje pri obnovitvenih delih in vzdrževanju ceste Bovec–Vršič je še ena od možnosti. Kljub temu, da smo prvo mikrolokacijo našli tik ob cesti, pa se zdi, vsaj v zadnjih nekaj desetletjih, ta možnost zelo malo verjet­na. Kljub iskanju te vrste nizvodno in ob teku Soče navzgor proti Trenti je na drugih podobnih mestih ob cesti nismo opazili. Tudi nahajališči na pobočju in gro­blji pri domačiji sta precej nad ravnjo ceste, kar ne go­vori v prid tej možnosti. Še pomembnejši razlog, ki govori proti tej možnosti vnosa se zdi izvor gradiva (peska, gramoza, kamenja), ki ga Cestno podjetje Nova Gorica, ki že desetletja vzdržuje vršiško cesto, upora­blja pri vzdrževalnih in manjših investicijskih delih na tej cesti. Po podatkih, ki smo jih dobili pri njih (Me­linc, in litt.), izvira vse gradivo, ki ga uporabljajo pri teh delih iz dveh njihovih najbližjih cestnih baz v Bovcu in pri Tolminu, torej iz območij, kjer blesteča krvomočnica po zdaj znanih podatkih ne raste. Možnost vnosa gradiva iz območij, kjer je vrsta nara­vno prisotna obstaja le pri večjih investicijskih delih, ki jih lahko izvajajo tudi drugi izvajalci. Pri teh je izvor uporabljenih gradiv težje sledljiv. Vendar na odseku novega nahajališča takih del ni bilo. Ugotavljamo, da je za zdaj populacija blesteče krvomočnice v okolici domačije Martin, Soča 46, obil­na in vitalna in se bo najbrž ohranila, morda celo širila. Mogoča je tudi njena drugačna prihodnost v Trenti. Po drugi svetovni vojni (med letoma 1945 in 1960) so jo namreč nasadili tudi v Alpskem botaničnem vrtu Julijana, a se tam ni ohranila. V seznamu Cirila Jegliča, ki obsega rastline v vrtu iz leta 1963, in v kasnejših seznamih te vrste ni več (Praprotnik 2012). 4 ZAKLJUčKI Vrsto Geranium lucidum v Sloveniji poznamo predvs­em na zelo kamnitih ali skalnatih in razmeroma vlažnih rastiščih, na meliščih in v listnatih gozdovih, predvsem v submediteranskem in deloma dinarskem fitogeografskem območju. Na takšnih rastiščih smo jo našli tudi v Trnovskem gozdu (Podrta gora, Sortež, Sv. Duh nad Podkrajem). Precej drugačna so rastišča na novem nahajališču v Spodnji Trenti, ki je do zdaj prvo v slovenskem delu Julijskih Alp (v italijanskem delu jo poznajo v nji­hovem prigorju v Slovenski Benečiji). V Trenti (na robu vasi Soča) ta vrsta namreč raste na kamnitih travnikih in brežinah in na kamnitih grobljah, na rastiščih s plit­vimi tlemi, ki so ponekod bogata z dušikom, a jih je tako ali drugače (pre)oblikoval človek. Za zdaj ta nova nahajališča obravnavamo kot drugotna. Najverjetnejši način vnosa se zdi z divjadjo (jelenjadjo), manj verjeten je vnos blesteče krvomočnice z mešanicami zemlje okrasnih rastlin. Malo verjetna sta vnosa z gradivom (peskom, gramozom, kamenjem) pri vzdrževanju ceste, ob kateri smo jo najprej našli, ali s krmo za konje v prvi svetovni vojni. Nameren vnos izključujemo. Očitno pa ji rastiščne razmere ustrezajo in je populaci­ja vitalna in številčna. Možnosti, da ta krvomočnica v Trenti uspeva tudi v naravnih združbah, ne moremo izključiti. 5 SUMMARy In the paper we are describing new localities of Gerani­um lucidum L. in the Trnovski Gozd Plateau in Di­naric phytogeographical region and in the Trenta Val­ley, in the Julian Alps in Alpine phytogeographical re­gion of Slovenia. The latter is quite surprising find and most probably secondary (subspontaneous). Eventual ways (means) of introduction of the plant to this local­ity, which is quite distant to already known ones, are discussed. Geranium lucidum is usually considered as a Med­iterranean or Mediterranean-Sub-Atlantic species. However, it can be found also elsewhere in Europe, like in Great Britain, Germany, Sweden and Norway and also in Middle East, Caucasus and parts of the Hima­laya (Aedo et al. 1998). Also its valence to different habitat parameters is much wider than valid in the Mediterranean region (Anonymous 2013). The species is introduced to United States, Cana­da, Australia and New Zeeland. In United States it is considered an important invasive species. From 1971, when it was first observed, it has been spreading rap­idly. It endangers particularly natural communities of open and riparian forests of valuable broad-leaved tree species (Dennehy et al. 2011, Anonimous 2013). Much of research on spreading of this species has been done by United States Department of Agriculture (USDA) (Anonimous 2013). In the Alps, the species occurs rather scattered, mainly in their west most and southwest most parts, and partly also in some regions of Southern and South­eastern Alps in the provinces Verona, Brescia, Berga­mo and Udine in Italy (Aeschimann et al. 2004). In Slovenia it inhabits almost exclusively its southwestern part in sub-Mediterranean and only partly also Dinar­ic phytogeographical regions (Fig. 1). Localities in the Alpine phytogeographical region have not been known up to now (Jogan et al. 2001, Plazar 2001, Aeschi­mann et al. 2004, Martinčič 2007). The closest known, quite recent localities to Slovenian part of the Julian Alps are in the Julian Pre-Alps in the Natisone Valley in NE Italy (Montefosca/čarni Varh, Vogu), south from Robidišče, very close to Slovenian-Italian border (Poldini 2002, Martini, 2016, in litt.). Floristic records and relevés on the sites of Gerani­um lucidum in the Trenta Valley have been made using standard Central European methods (Ehrendorfer & Hamann 1965, Jalas & Suominen 1967, Braun­-Blanquet 1964). Data were entered into the FloVegSi database (Seliškar et al. 2003) and compared using hierarchical classification. Details of the new localities are given in the chapter 3.1 of Slovenian text and in Table 1. New localities of Geranium lucidum in the Trnovs­ki Gozd Plateau are situated in rocky and stony envi­ronment in montane and altimontane belt. Under Po­drta gora it thrives on coarse scree slopes and in pio­neer open forests, dominating by Ostrya carpinifolia; at Predmeja (Sortež) and at Podkraj (Sv. Duh) it grows on rocky sites in beech stands of the association Isopyro­-Fagetum. It was found in similar rocky sites also in čičarija (Lamio orvalae-Fagetum pseudofumarietosum albae). New locality in the Trenta Valley consists of three micro-localities all within a perimeter of about 100 m. The first micro-locality (Fig. 2) is a narrow band of partly ruderal land measuring about 3 m by 35 m be­ tween regional road Bovec–Vršič and Soča river bed. The parent material mostly consists of gravel. Soil type is rendzina. The grassland is mostly in shade with high ground and air humidity. Other more abundant spe­cies are Arrhenatherum elatius, Ranunculus acris, R. repens, Ajuga genevensis, Parietaria officinalis, Petasi­tes paradoxus, Fragaria vesca and Rubus caesius. De­tails are given in Relevé 1, Table 1. The second and the third micro-locality are about 12 m higher than the first one. They are situated on a narrow alluvial terrace very close to uninhabited farm house Martin, Soča 46. On the second micro-locality (Fig. 3) Geranium lucidum grows on a partly overgrown heap of rocks. The heap consists of rocks and stones collected by man during establishing and maintaining of nearby grassland. Such heaps are a common agricul­tural heritage in the Trenta Valley. The place is very stony, dry and only partly sunny because of very nar­row valley. Soil type is lithosol. More abundant species apart of Geranium lucidum are Sedum sarmentosum (subspontaneous), Helictotrichon pubescens, Asplenium ruta-muraria, Moehringia muscosa, Cardaminopsis are­nosa, Geranium robertianum and mosses: Climacium dendroides, Homalothecium lutescens and Rhytidiadelp­hus triquetrus. Details are in Relevé 3, Table 1. The third micro-locality (Fig. 4) is next to the farmhouse on a steep side slope of the alluvial terrace, which descends down to the road and the river. It rep­resents grassland on shallow, sandy soils, partly in shade of a large tree of Tilia platyphyllos. The piece of land measures about 12 m x 12 m. The Relevé 2, Table 1, illustrates semiruderal grassland on the steep slope. Most abundant species apart of Geranium lucidum are Helictotrichon pubescens, Dactylis glomerata, Galium mollugo, Arrhenatherum elatius, Veronica chamaedrys, Ranunculus acris, Silene vulgaris, Geranium robertia­num, Carex muricata and Myosotis sylvatica agg. Base- and nitrogen rich soils due to past stock farming and fertilization with stable manure, average temperatures 6 oC – 8 oC , lowest temperatures and an­nual precipitations 2500–3000 mm/year at the locality do not correspond to (sub)Mediterranean climate. However, if we consider environmental parameters of all known sites and localities where Geranium lucidum has been found neither temperatures nor precipita­tions at the site fall outside the range taken into ac­count in the weed risk assessment of this species made in US (Anonimous 2013). From the aspect of these habitat parameters a spontaneous growth of Geranium lucidum in the Trenta Valley seems possible. Neverthe­less, we still consider the locality as secondary or subs­pontaneous. All three known micro-localities are in more or less ruderal sites, close to a farmhouse. This apparently stands in a too sharp contrast to spontane­ous localities found in the Trnovski Gozd Plateau and elsewhere. Assuming secondary (subspontaneous) origin of the plant in the Trenta Valley a question arises: how the plant was introduced? We can’t give a definitive answer. But, taking into account the study of its spread­ing in US (Anonimous 2013, Dennehy et al. 2011) and local conditions, we can at least discuss the most prob­able options. USDA’s study Weed Risk Assessment for Geranium lucidum (Anonimous 2013) maintains spreading of the plant on long distances by large mammal game and domestic animals as the most probable. This seems true also at the Trenta Valley locality where red-deer (Cervus elaphus) represents the most important agent. The line of sight distance to the nearest known locali­ties of Geranium lucidum in the Julian Pre-Alps in Italy is about 26 km. Such distances do not pose a problem for migration of red-dear, particularly not during rut­ting period. The closest localities in NE Italy (Monte­fosca/čarni Varh) and in the region just north of them (Breginjski kot) are known for large populations of red-dear and considered by some hunters an impor­tant focal point of red deer spreading, which popula­tions are significantly increasing during last decades in Slovenia. The owners of the farmhouse Martin have had frequent problems with red-deer, which passes their property and set off rocks and stones, which land on the road. To prevent eventual traffic accidents the owner covered the steep slope next to his farmhouse with iron mesh a few years ago. Also topography of the Trenta Valley at the location certainly increases num­ber of passages of the game. The valley is very narrow here having steep mountain slopes on both sides. Among anthropogenic causes a direct intentional introduction seems highly improbable. The plant has no horticultural value and is rather considered a weed. The owners of the farmhouse did not recognized the plant shown to them and also considered it as a ‘weed’, actually confused it with Geranium robertianum, which is common at the new localities. They explicitly stated they have never planted it. Spreading of Geranium lucidum on long distances by seed contaminated soil of purchased horticultural plants is known from literature (Anonimous 2016) and considered quite probable. The owners of the farmhouse Martin have been also buying occasionally horticultural plants to modestly decorate their home, however very rarely. We found a small abandoned f lower bed near the farmhouse with a few horticultur­al plants where Geranium lucidum was also present. Nevertheless, the probability of introduction of it in this way still seems small. On one hand buying horti­cultural plants was almost unknown practice in the Trenta Valley a decade or two ago. Also, number of planted horticultural plants during last 20 years when the farmhouse has not been inhabited anymore (own­ers moved to town Bovec) was very small. Cases of introduction of non-autochthon plants by hay needed to feed army animals supporting (for long time periods unchanging) front lines during the First World War are known in Slovenia. Only 20 m away of the first new micro-locality of Geranium lucidum op­erated an Austro-Hungarian army cable car connect­ing Vršič pass with the front lines from Krn Mountains to Bovec. Tons and tons of hay had to be transported to feed numerous mules and horses for almost two years. They were the only transport mean in these high-mountain front lines. Some of it was certainly lost dur­ing transport. However, it is difficult to imagine how could Geranium lucidum seeds come into the hay. Moved grassland is not its site. Therefore we consider this option of introduction improbable. Since the first micro-locality of Geranium lucidum is located directly next to the road, maintaining of the road as a mean of plant introduction was also consid­ered. But we estimate also this probability low, mainly due to the following two facts. First, the find next to the road seems to be unique. We inspected the road up- and downstream of the river for quite a distance, but we didn’t find any other occurrences of it. Second, the company, which has been maintaining the road for decades uses road maintaining materials (gravel, clay, etc.), which origins from two places in the upper Soča River region, where Geranium lucidum doesn’t grow. The only possibility to introduce the seeds this way would exist during larger reconstruction works, which could be operated by other road maintaining compa­nies. In this case the origin of the materials used can be elsewhere including from regions where Geranium lu­cidum is presented. But there have been no such works at this section of the road. The population of Geranium lucidum in the Trenta Valley near the farmhouse Martin, Soča 46, is pres­ently vital and numerous. Well above 100 f lowering plants were found during our research. It appears sta­ble, so it will probably remain such in future, eventu­ally it may even spread. Also, we cannot exclude with certainty the possibility that new localities will be found in future, even on natural sites. But also oppo­site scenario cannot be excluded. The plant was inten­tionally introduced into Alpine Botanical Garden Juli­ana about 7 km upstream of river Soča in sixties of last century. However, the species disappeared from the lists of plants cultivated in the garden from 1963 on (Praprotnik 2012). ZAHVALA Lepo se zahvaljujeva dr. Branku Vrešu za možnost up­orabe podatkovne baze FloVegSi pri pripravi arealne karte blesteče krvomočnice in doc. dr. Tinki Bačič za podatke o razširjenosti te vrste v Sloveniji, ki se naha­jajo v bazi Centra za kartografijo favne in f lore (CKFF). Prof. dr. Fabrizio Martini (Trst/Trieste) nama je pri­jazno posredoval podatke o nahajališčih obravnavane vrste pri vasi čarni Varh/Montefosca v Beneški Slo­veniji. Akademik dr. Mitja Zupančič in prof. dr. Franc Batič ste opravila strokovni pregled besedila, pri čemer naju je slednji opozoril tudi na nahajališče obravna­vane vrste pri Logatcu. Zahvaljujeva se zakonskemu paru Francu in Jožici Kravanja (Bovec) za dovoljenje za botaniziranje na njuni posesti pri Martinu in za ostale podatke. Hvala tudi Jerneju Peljhanu za posredovanje fitocenoloških popisov združb, v katerih uspeva ta vrsta v Griži pod Podrto goro in Fedji Klavora, ki nam je posredoval vojaški zemljevid s traso tovorne žičnice iz prve svetovne vojne. Zahvaljujeva se tudi lovcema Mileni Ocvirk in Aljoši Mozetiču za oceno selitvenih lastnosti jelenjadi in Beti Melinc za podatke o načinu vzdrževanja ceste Bovec–Vršič. LITERATURA– REFERENCES Aedo, C., F. M. Garmendia & F. Pando, 1998: World checklist of Geranium L. (Geraniaceae). Anales del Jardin Botánico de Madrid (Madrid) 56 (2): 211–252. (citirano v Anonymous 2013). Aedo, C., 2000: The genus Geranium L. (Geraniaceae) in North America, I. Annual Species, Anales Jardin Botanico de Madrid (Madrid) 58 (1): 39–82. (dosegljivo na http://w w w.rjb.csic.es/jardinbotanico/ficheros/documentos/ pdf/anales/2000/Anales_58(1)_039_082.pdf – (13.06. 2016). Aeschimann, D. K., K. Lauber, D. M. Moser & J.-P. Theurillat, 2004: Flora alpina. Band 1., Haupt, 1159 pp. Anonymous, cca 1918: Vojaški zemljevid trase tovorne žičnice Vršič – Kršovec. Vojni muzej, Dunaj. Anonymous, 2013: Weed Risk Assesment for Geranimu lucidum L. (Geraniaceae). Shinig Cranesbill, United States Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Raleigh, NC, 17 pp. (dosegljivo na https://ww w.aphis.usda.gov/plant_health/plant_pest_info/weeds/downloads/wra/Geranium_lucidum_ WRA.pdf (13.6. 2016) Anonimous 2016: Online Atlas of the British & Irish Flora. http://ww w.brc.ac.uk/plantatlas/index.php?q=node/3394 (13.6.2016). Blamey, M. & C. Gray-Wilson, 2004: Wild Flowers of the Mediterranean. A & C Black, London. Braun-Blanquet, J., 1964: Pf lanzensoziologie. Grundzüge der Vegetationskunde. 3. Auf., Springer Verlag, Wien– New york. Dakskobler, I., 2014: Phytosociological description of altimontane beech forest on the southeastern edge of the Tr­novski gozd and Nanos plateaus (southwestern Slovenia). Folia biologica et geologica (Ljubljana) 55 (2): 5–59. Dakskobler, I. & M. Reščič, 2015: Fitocenološka in gozdnogospodarska analiza gorskega bukovega in javorovega gozda na skalnatih rastiščih na Krasu in v Čičariji (JZ Slovenija). Gozdarski vestnik (Ljubljana) 73 (2): 67–87. Dennehy, C., E. R. Alverson, H. E. Anderson, D. R. Clements, R. Gilbert & T. N. Kaye, 2011: Management Strategies for Invasive Plants in Pacific Northwest Prairies, Savannas, and Oak Woodlands. Northwest Science, 85 (2): 329–351. Ehrendorfer, F. & U. Hamann, 1965: Vorschläge zu einer f loristischen Kartierung von Mitteleuropa. Ber. Deutsch. Bot. Ges. (Berlin-Stuttgart) 78: 35–50. Fischer M. A., W. Adler & K. Oswald, 2005: Exkursionsf lora von Österreich, Liechtenstein und Südtirol. Land Oberösterreich, Biologiezentrum der OÖ Landesmuseen, Linz. Jalas, J. & J. Suominen, 1967: Mapping the distribution of Europaean vascular plants. Memoranda Soc. pro Fauna Flora Fennica (Helsinki) 43: 60–72. Jogan, N., T. Bačič, B. Frajman, I. Leskovar, D. Naglič, A. Podobnik, B. Rozman, S. Strgulc-Krajšek & B. Trčak, 2001: Gradivo za Atlas f lore Slovenije. Center za kartografijo favne in f lore, Miklavž na Dravskem polju. Jurjevčič, B., 2004: Naravovarstveni pomen udornic na območju Logatca. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij varstva naravne dediščine. (Magistrsko delo, 114 pp.). Lauber, K., G. Wagner & A. Gygax, 2012: Flora Helvetica.5. Auf lage, Bern - Stuttgart - Wien, Haupt. Leskovic, B. & I. Pičulin (ur.), 2012: Divjad in lovstvo. Lovska zveza Slovenije, Ljubljana. Martinčič, A., 2007: Geraniaceae – krvomočnikovke. In: A. Martinčič (ed.): Mala f lora Slovenije. Ključ za določa­nje praprotnic in semenk. Tehniška založba Slovenije, četrta, dopolnjena in spremenjena izdaja, Ljubljana. pp. 347-352. Martinčič, A., T. Wraber, N. Jogan, A. Podobnik, B. Turk, B. Vreš, V. Ravnik, B. Frajman, S. Strgulc Krajšek, B. Trčak, T. Bačič, M. A. Fischer, K. Eler & B. Surina, 2007: Mala f lora Slovenije. Ključ za dolo­čanje praprotnic in semenk. četrta, dopolnjena in spremenjena izdaja. Tehniška založba Slovenije, Ljubljana. Plazar, J., 2001: Rod krvomočnic (Geranium) v Sloveniji. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo (Diplomska naloga, 176 pp.) Podani, J., 2001: SyN-TAX 2000. Computer Programs for Data Analysis in Ecology and Systematics. User‘s Manual, Budapest. Poldini, L., 1991: Atlante corologico delle piante vascolari nel Friuli-Venezia Giulia. Inventario f loristico regionale. Regione Autonomo Friuli-Venezia Giulia & Universita degli studi di Trieste, Dipartimento di Biologia, Udine. Poldini, L. v sodelovanju z G. Oriolo & M. Vidali, 2002: Nuovo Atlante corologico delle piante vascolari nel Fri­uli Venezia Guilia. Regione Autonoma Friuli Venezia Guilia, Azienda Parchi e Foreste Regionali & Universita degli Studi di Trieste, Dipartimento di Biologia, Udine. Praprotnik, N., 2012: Alpski botanični vrt Juliana in seznam rastlin. Scopolia (Ljubljana) 75: 1–111. Salisbury, E., 1961: Weeds and Aliens. Collins, London. (citirano v Anonymous 2013). Schonfelder I. & P., 2002: Kosmos Atlas Mittelmeer- und Kanarenf lora. Kosmos, Stuttgart. Seliškar, T., B. Vreš & A. Seliškar, 2003: FloVegSi 2.0. Računalniški program za urejanje in analizo bioloških podatkov. Biološki inštitut ZRC SAZU, Ljubljana. Šilc, U. & A. čarni, 2012: Conspectus of vegetation syntaxa in Slovenia. Hacquetia (Ljubljana) 11 (1): 113–164. Theurillat J.-P., 2004: Pf lanzensoziologisches System. In: Aeschimann, D., K. Lauber, D. M. Moser & J. P. Theuri­llat: Flora Alpina 3: Register. Haupt Verlag, Bern, Stuttgart, Wien pp. 301–313. Slika 1: Razširjenost blesteče krvomočnice (Geranium lucidum) v Sloveniji (vir: podatkovna baza FloVegSi) Figure 1: Distribution of Geranium lucidum in Slovenia (source: the FloVegSi database) Slika 2: Pogled na prvo mikrorastišče, ruderalizirano travišče med cesto Bovec–Vršič in reko Sočo pri domačiji Martin, Soča 46 v približni izmeri 3 m x 35 m. Foto: A. Trnkoczy. Figure 2: A view on the first micro-locality, ruderalized grassland between the regional road Bovec–Vršič and the river Soča near farmhouse Martin, Soča 46, measuring about 3 m x 35 m. Photo: A. Trnkoczy Slika 3: Pogled na drugo mikrorastišče, obraslo grobljo iz skal in kamen­ja, ki je nastala s človekovim delovanjem, pri osnovanju in čiščenju travišč. Foto: A. Trnkoczy Figure 3: A view on the second micro-locality, a heap of stones and rocks collected by man during establishment and clean­ing of neighboring agri­cultural land. Photo: A. Trnkoczy Slika 4: Pogled na tretje mikrorastišče, strmo travnato pobočje med robom rečne terase in cesto oziroma reko. Foto: A. Trnkoczy Figure 4: A view on the third micro-locality consisting of a steep grassy slope descending from the edge of the alluvial terrace down to the road and the river bed. Photo: A. Trnkoczy Slika 5: Blesteča krvomočnica (Geranium lucidum) - cvet in listi. Foto: A. Trnkoczy Figure: 5: Geranium lucidum - a f lower and leaves. Photo: A. Trnkoczy Slika 6: Blesteča krvomočnica (Geranium lucidum) z značilnimi prečno rebrastimi plodovi (glavica s kljuncem). Foto: A. Trnkoczy Figure: 6: Geranium lucidum with characteristic transversally ribbed fruits (capsule with beak). Photo: A. Trnkoczy Preglednica 1: Združbe z vrsto Geranium lucidum v dolini trente table 1: communities with Geranium lucidum in the trenta Valley Zaporedna številka popisa (Number of relevé) 1 2 3 4 Delovna številka popisa (Database number of relevé) 261740 261762 261760 261761 Nadmorska višina v m (Elevation in m) 510 520 525 521 Lega (Aspect) SE SE SEE SE Nagib v stopinjah (Slope in degrees) 25 30 20 10 Matična podlaga (Parent material) Gr Gr Gr Gr Tla (Soil) Re Re Li Li Kamnitost v % (Stoniness in %) 5 5 100 5 Zastiranje v % (Cover in %): Zeliščna plast (Herb layer) E1 90 90 60 70 Mahovna plast (Moss layer) E0 . . 80 . Število vrst (Number of species) 54 32 34 14 2 Velikost popisne ploskve (Relevé area) m20 20 20 1 Datum popisa (Date of taking relevé) 5/26/2016 5/26/2016 5/26/2016 5/26/2016 Soča - Soča - Soča - Soča - Nahajališče (Locality) Martin Martin Martin Martin Kvadrant (Quadrant) 9648/1 9648/1 9648/1 9648/1 Koordinate (Coordinate) GK y (D-48) m 399806 399782 399739 399783 Koordinate (Coordinate) GK X (D-48) m 5134948 5134949 5134955 5134941 MA Molinio-Arrhenatheretea Pr. Fr. Galium mollugo E1 + 1 + . 3 75 Veronica chamaedrys E1 + 1 + . 3 75 Rumex acetosa E1 + + + . 3 75 Arrhenatherum elatius E1 2 1 . . 2 50 Ranunculus acris E1 1 1 . . 2 50 Dactylis glomerata E1 + 1 . . 2 50 Poa pratensis E1 + 1 . . 2 50 Cerastium holosteoides E1 + . . + 2 50 Helictotrichon pubescens E1 . 2 2 . 2 50 Ranunculus repens E1 1 . . . 1 25 Plantago lanceolata E1 + . . . 1 25 Plantago major E1 + . . . 1 25 Achillea millefolium E1 + . . . 1 25 Angelica sylvestris E1 + . . . 1 25 Taraxacum officinale agg. E1 + . . . 1 25 Trifolium pratense E1 + . . . 1 25 Vicia sepium E1 + . . . 1 25 Anthriscus sylvestris E1 . + . . 1 25 Daucus carota E1 . . + . 1 25 Lathyrus pratensis E1 . . + . 1 25 FB Festuco-Brometea Medicago lupulina E1 + + . + 3 75 Pimpinella saxifraga E1 . + + + 3 75 Silene vulgaris subsp. vulgaris E1 + 1 . . 2 50 Ajuga genevensis E1 1 . + . 2 50 Brachypodium rupestre E1 + . . . 1 25 Euphorbia cyparissias E1 + . . . 1 25 Galium lucidum E1 . . . . 1 25 Ranunculus bulbosus E1 . + . . 1 25 ES Elyno-Seslerietea Alchemilla glaucescens E1 + . . . 1 25 Cerastium strictum E1 + . + . 2 50 TG Trifolio-Geranietea Vincetoxicum hirundinaria E1 + . + . 2 50 Zaporedna številka popisa (Number of relevé) 1 2 3 4 Pr. Fr. Thalictrum minus E1 + . . . 1 25 Origanum vulgare E1 . + . . 1 25 Lilium bulbiferum E1 . . . + 1 25 GA Geo-Alliarion Geranium lucidum E1 2 1 3 2 3 75 Geranium robertianum E1 + 1 1 . 3 75 GU Galio-Urticetea Parietaria officinalis E1 1 + . . 2 50 Aegopodium podagraria E1 + . . . 1 25 Salvia verticillata E1 . + . . 1 25 Geum urbanum E1 . . + . 1 25 Urtica dioica E1 . . + . 1 25 Glechoma hederacea E1 . . . + 1 25 SM Stellarietea mediae Chelidonium majus E1 . + . . 1 25 Erigeron annuus E1 . + . . 1 25 Myosotis arvensis E1 . . . + 1 25 TR Thlaspietea rotundifolii Petasites paradoxus E1 2 . . . 1 25 Gymnocarpium robertianum E1 . . + . 1 25 KC Koelerio-Corynephoretea Cardaminopsis arenosa E1 + . 1 1 3 75 Sedum acre E1 . + + . 2 50 Arenaria serpyllifolia E1 + . . . 1 25 Sedum sexangulare E1 . + . . 1 25 Sedum album E1 . . + . 1 25 AT Asplenietea trichomanis Sedum hispanicum E1 + . + + 3 75 Cystopteris fragilis E1 + + . . 2 50 Moehringia muscosa E1 + . 1 . 2 50 Asplenium ruta-muraria E1 . + 1 . 2 50 Asplenium trichomanes E1 . . + . 1 25 Saxifraga hostii E1 . . . + 1 25 EA Epilobietea angustifolii Fragaria vesca E1 1 + + + 4 100 Carex muricata E1 + 1 . . 2 50 Myosotis sylvatica agg. E1 . 1 + . 2 50 MuAMulgedio-Aconitetea Aconitum lycoctonum E1 + . . . 1 25 Chaerophyllum hirsutum E1 + . . . 1 25 EP Erico-Pinetea Carex ornithopoda E1 r + . . 2 50 Epipactis atrorubens E1 + . + . 2 50 FS Fagetalia sylvaticae Salvia glutinosa E1 + + . . 2 50 Galeobdolon f lavidum E1 + . + . 2 50 Brachypodium sylvaticum E1 + . . . 1 25 Campanula trachelium E1 + . . . 1 25 Heracleum sphondylium E1 + . . . 1 25 Knautia drymeia E1 + . . . 1 25 Rhamnus fallax E2a . . + . 1 25 Asarum europaeum subsp. caucasicum E1 . . + . 1 25 QP Quercetalia pubescenti-petraeae Primula veris subsp. columnae E1 + + . . 2 50 QF Querco-Fagetea Rubus caesius E1 2 . . . 1 25 Zaporedna številka popisa (Number of relevé) 1 2 3 4 Pr. Fr. Cruciata glabra E1 + . + . 2 50 Dactylorhiza fuchsii E1 r . . . 1 25 Listera ovata E1 + . . . 1 25 O Druge vrste (other species) Sedum sarmentosum E1 . . 3 1 2 50 Forsythia viridissima E2a r . . . 1 25 Muscari neglectum E1 . + . . 1 25 Cerastium tomentosum E1 . + . . 1 25 Dianthus sp. E1 . . . + 1 25 Lupinus sp. E1 . . . + 1 25 M Ma hov i (Mosses) Plagiomnium undulatum E0 + . . . 1 25 Climacium dendroides E0 . . 2 . 1 25 Homalothecium lutescens E0 . . 3 . 1 25 Rhytidiadelphus triquetrus E0 . . 1 . 1 25 Hypnum cupressiforme E0 . . + . 1 25 legenda ­legend Gr Grušč - Gravel Re Rendzina - Rendzina Li Kamnišče - Lithosol R AZVOJ PATENTIR ANEGA BREZPILOTNEGA SISTEMA ZA VZORčENJE IZ DREVESNIH KROŠENJ DEVELOPMENT OF A PATENTED UNMANNED AERIAL VEHICLE BASED SySTEM FOR TREE CANOPy SAMPLING Domen FINŽGAR*1 , Marko BAJC1, Jernej BREZOVAR2, Andraž KLADNIK2, Rok CAPUDER2 in Hojka KRAIGHER1 Received December 28, 2016; accepted December 29, 2016. Delo je prispelo 28. decembra 2016, sprejeto 29. decembra 2016. iZVleČeK Razvoj patentiranega brezpilotnega sistema za vzorčenje iz drevesnih krošenj Potreba po vzorčenju v drevesnih krošnjah je prisotna v številnih panogah znotraj bioloških znanosti, npr. v gozdarstvu, botaniki, fitopatologiji idr. V tem prispevku smo pregledali značilnosti uveljavljenih načinov vzorčenja v drevesnih krošnjah in pregledali stanje tehnike na področju vzorčevalnikov nameščenih na brezpilotnih letalnikih. Predstavili smo patentiran sistem Lucanus za vzorčenje iz drevesnih krošenj z brezpilotnimi letalniki, ki je plod last­nega razvoja, in ga primerjali z uveljavljenimi načini vzorčenja in konkurenčnim sistemom vzorčenja z brezpilot­nimi letalniki. Na podlagi primerjave smo ugotovili, da sis­tem Lucanus in koncept vzorčenja z brezpilotnimi letalniki v veliki meri odpravljata pomanjkljivosti uveljavljenih načinov vzorčenja iz drevesnih krošenj saj je njegova uporaba varnejša za vzorčevalca, vzorčenje je natančno, selektivno in hkrati ne povzroča nepotrebnih poškodb vzorčenih dreves. Ključne pomanjkljivosti sistema Lucanus so zahteva po vi­soki izurjenosti upravljalca in relativno kratka avtonomija. Ključne besede: vzorčenje, drevesne krošnje, patent, drone, UAV, robotska roka, daljinsko upravljanje, EUFOR­INNO abStR act Development of a patented unmanned aerial vehicle based system for tree canopy sampling Collection of samples in tree canopies is a common re­quirement within a variety of disciplines e.g., forestry, bota­ny, phytopathology, etc. Established approaches to collecting samples in tree canopies and state of the art in the field of sampling in tree canopies with unmanned aerial vehicles (UAVs) were reviewed. A novel and patented UAV based sys­tem for sampling in tree canopies, Lucanus, was presented and its capabilities compared to the established sampling ap­proaches and a competitive UAV based system. Based on this comparison it was concluded that Lucanus, and UAV based approach to sampling in tree canopies in general, largely overcomes the shortcomings of the established sam­pling approaches as it offers greater safety for the operator, increased selectivity and accuracy, and reduces the level of unnecessary damage of the sampled tree. Key shortcomings of the Lucanus system include the requirement for a highly trained operator and a relatively short endurance. Key words: sampling, patent, tree canopy, drone, UAV, robotic arm, remotely controlled devices, EUFORINNO 1 Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI – 1000 Ljubljana, Slovenija, E-pošta: domen.finzgar@gozdis.si 2 Zavod 404, Jamova cesta 80, SI-1000 Ljubljana, Slovenija Vzorčenje v nivoju drevesnih krošenj je pogosto upora­bljena metoda znotraj področij gozdnega semenarstva, genetike, fiziologije, botanike, fitopatologije, in den­drologije. Takšno vzorčenje se navadno opravi s pleza­njem na drevo, posekom drevesa, s katerega želimo odvzeti vzorec, ali z odstrelom veje z drevesa s strelnim orožjem. Pomanjkljivosti takšnih metod je več. Pri ple­zanju predstavlja težavo predvsem sorazmerno visoka cena najema plezalca in visoka poraba časa, hkrati pa je plezalec neprestano izpostavljen nevarnosti padca. Od­strel pomeni invazivno in naključno vzorčenje, ki je za vzorčevalca in gozdno bioto potencialno nevaren, posek pa ne omogoča večkratnih ponovitev vzorčenj na istih osebkih in je tako v večini primerov nespreje­mljiv. Z razvojem tehnologije brezpilotnih letalnikov se je na Gozdarskem inštitutu Slovenije (GIS) osnovala ideja za razvoj daljinsko upravljane naprave za jemanje vzorcev iz drevesnih krošenj. Prvo napravo za vzorčenje v drevesnih koršnjah z brezpilotnimi letalniki so po našem vedenju skonstru­irali na Oddelku za gozdno mikologijo in patologijo Univerze v Berkelyu (UC BERKELEy, 2016). Njihov sistem obsega komercialno dostopen model brezpilo­tnega letalnika DJI Phantom 2 (DJI, 2015) z ravnim izvodilom na koncu katerega je ostro kljukasto rezilo. Upravljavčeva naloga je, da kljukasto rezilo pravilno zatakne za vejo, nato pa jo s fizično silo, s premikanjem letalnika vzvratno, poizkuša odrezati z drevesa. Ta­kšno Vzorčenje se še vedno izvaja relativno naključno, rezanje pa ni dovolj natančno za večino rutinskih vzorčenj. Poleg tega takšno vzorčenje ni primerno zno­traj strnjenega gozdnega sestoja, saj se v trenutku, ko rezilo prereže vejo, odrezana veja loči od krošnje in vlečna sila povzroči, da se brezpilotni letalnik nekon­trolirano premakne v smeri vlečenja, kar lahko pov­zroči trčenje v sosednjo krošnjo. Poleg tega letalnik Univerze v Berkely-u ni opremljen z nikakršnim varo­valnim mehanizmom, ki bi v primeru, da se rezilo za­takne znotraj krošnje, omogočil odklop rezila od brez­pilotnega letalnika. Z namenom odprave naštetih pomanjkljivosti in implementacije lastnih idej je Oddelek za gozdno fizi­ologijo in genetiko na GIS v sodelovanju z mladinskim tehnološko-razvojnim centrom Zavod 404 v okviru projekta EUFORINNO pripravil načrte za napravo vzorčenja drevesnih krošenj z brezpilotnim letalnikom z imenom Lucanus (GIS & Zavod 404, 2016; Slika 1; Slika 2). Slika 1: Prvi prototip sistema Lucanus nameščen na brezpilotnem letalniku Sky Hero Spyder X8. Figure 1: First Lucanus system prototype mounted on a Sky Hero Spyder X8 drone. Inovacije sistema Lucanus so zbrane na daljinsko upravljani mehanični roki, ki jo sestavljajo trije glavni moduli. Prvi modul je nastavek, s katerim je roka pri­trjena na letalnik in vsebuje daljinsko prožen varoval­ni mehanizem, ki ob kritičnih dogodkih, ki lahko ogrozijo letalno napravo (npr. če se roka zatakne v vejah), omogoča odklop robotske roke z naprave. V na­sprotju z letalnikom Univerze v Berkeley-u je rezalno orodje sistema Lucanus pritrjeno na letalnik neposre­dno pod njegovim težiščem, kar omogoča maksimalni izkoristek nosilnosti letalnika in hkrati ne ruši njegove stabilnosti. Drugi modul je sistem kamer, senzorjev in laserjev za daljinsko upravljanje in nadzor mehanske roke. Senzorji omogočajo natančno pozicioniranje v krošnji in lociranje reza na veji. Zadnji modulski del robotske roke predstavlja rezilo s prijemalom. Prijema­lo zagotovi, da veja po rezu ne zdrsne z roke. Sistem vzmeti zagotavlja silo, potrebno za rezanje in prijem veje. Upravljalec vodi letalnik in odvzame vzorec s po­močjo kamere na krovu letalnika, ki prikazuje sliko na zaslonu, nameščenem na daljinskem upravljalniku. S tem je omogočeno delovanje tudi na večjih razdaljah ali celo ko upravljalec izgubi vizualni stik z letalnikom. Sistem Lucanus je trenutno nameščen na brezpilo­tnem letalniku z osmimi rotorji na osnovi šasije Sky Hero Spyder X8 in z DJI-jevim avtopilotom. Brezpilotni letalnik je bil sestavljen iz komercialno dostopnih kom­ponent in ga odlikujejo visoka stabilnost in odzivnost ter velika nosilnost, ki znaša približno 7 kg. Takšna re­šitev omogoča nabiranje debelejših vej (tudi s plodovi) in v zahtevnih letalnih pogojih. Pregled prednosti in slabosti obeh sistemov je naveden v Preglednici 1. Slika 2: Podrobni prikaz vzorčevalnega orodja sistema Lucanus. 1 – škarje; 2 – prijemalo za vzorec; 3 – vodila za zajem vzorca; 4 – laser; 5 – kamera; 6 – vzmeti. Figure 2: Detailed view of the Lucanus sampling tool. 1 – cutter; 2 – sample grabbing tool; 3 – sample guide rods; 4 – laser; 5 – camera; 6 – operating springs. Rešitve, ki so bile vpeljane v prototip sistema Luca­nus je razvojna ekipa želela pravno zaščiti. Z dnem 30. 9. 2016 je Ministrstvo za gospodarski razvoj in tehno­logijo, Urad RS za intelektualno lastnino podelilo pa­tent, evidentiran pod številko SI 24941 (prijava št. P-201500288) z nazivom Daljinsko upravljana priprava za jemanje vzorcev iz drevesnih krošenj. Patent, ki za­objema sistem Lucanus je tako veljaven v Republiki Sloveniji do najmanj 02. 12. 2018. Leta 2015 je bila pri Evropskem patentnem uradu (prijava št. EP16150006.1) vložena patentna prijava. Na odločbo urada za slednji patent prijavitelji še čakajo. Prvi izdelan prototip Lucanusa je uspešno prestal javno predstavitev na EUFORINNO delavnici o gozdnem genetskem monitoringu in genskih bankah, ki je pote­kala 25. januarja 2016 v Ljubljani. Sistem Lucanus omogoča natančen, selektiven in za upravljalca varen odvzem vzorcev iz drevesnih krošenj, tudi samega vrha le-teh, pri tem pa je močno zmanjšana povzroči­tev poškodb vzorčenega drevesa, kar je ena izmed ključnih pomanjkljiovsti dosedanjih pristopov vzorče­nja v drevesnih krošnjah. Kljub temu, da Lucanus že omogoča vzorčenje v drevesnih krošnjah in ga na GIS že planiramo uporabiti v tekočih in bodočih projektih, je možnosti za izboljšavo prototipa še veliko. Ključno pomanjkljivost sistema Lucanus predstavlja zahteva po visoki izurjenosti upravljalca in relativno kratka avto­nomija (cca 30 min), ki pa je hiba trenutno vseh heli­kopterskih brezpilotnih letalnikov. Naslednje faze ra­zvoja bodo, ob pridobitvi novih razvojnih sredstev, zajemale artikulacijo orodja z rezilom in prijemalom v treh oseh, nastavitve naklona roke pod poljubnim kotom in razvoj sistema za napenjanje vzmeti v zraku. Ravno tako si razvojna ekipa želi čimprej integrirati RTK (real time kinematic) GPS sistem, ki bi omogočil izjemno natančnost pozicioniranja in izboljšano sta­bilnost letalnika, ter izboljšati zmogljivost senzorjev za zaznavo okolice. Zaradi privlačnosti takšnega sistema za širšo javnost pa bi sistem radi uporabili tudi pri vključevanju mladih v raziskovalnem delu in nadalj­njem tehnološkem razvoju. Z integracijo ustreznih senzorjev in uporabo izboljšanega avtopilota bi lahko v prihodnosti izboljšali antonomnost sistema tako da bi lahko zgolj s pritiskom gumba letalnik poslali globoko v gozdni sestoj nad točno določeno drevo, potem pre­vzeli nadzor nad njim in opravili rez. Preglednica 1: Primerjava dveh prototipov za vzorčenje drevesnih krošenj z brezpilotnimi letalniki. table 1: comparison of two systems for tree canopy sampling utilising unmanned aerial vehicles (UaVs) – drones. lucanus Uc berkeley »Sampler drone« Maksimalna nosilnost Maximum payload 7 kg 0,67 kg Uporabni tovor* Useful payload* 4,6 kg 0,3 kg** Pozicija rezanja Position of the cut Nenaključna Non random Naključna Random Debelina veje Branch diameter . 1,5 cm Tanjše veje Very thin branches Število vzorčenj na let N of samplings per f light 1 uspešen rez, 1 poizkus 1 attempt, 1 successful sampling 1 uspešen rez, poljubno število poizkusov multiple attempts, 1 successful sampling Vzorčenje v sestoju Sampling in stands Da Yes Ne No Varnostni mehanizem za odk lop rezalne roke Safety release mechanism Da Yes Ne No Način reza Method of cutting Škarje na vzmet Spring-actuated cutter S premikanjem letalnika v smeri reza By pulling with the UAV lokacija vzorčenja Sampled canopy parts Vrh krošnje ali stranske veje Top or side branches Stranske veje Side branches only Prijemalo za vejico Sample grabbing tool Da Yes Ne No Namestitev orodja Tool location Neposredno pod težiščem Directly under the center of gravity Odmaknjeno od težišča Offset from the center of gravity * Uporabni tovor je definiran kot masa, ki jo letalnik lahko nosi poleg baterij in ostalih komponent, ki so nujno potrebne za normalno delovanje letalnika. Useful payload is defined as the mass that a UAV can lift in addition to batteries and other components that are essential for normal operation. ** Dejanski varni uporabni tovor letalnika Univerze v Berkeley-u je bistveno nižji od navedenih 0,3 kg zaradi občutnega odmika rezalnika od točke težišča letalnika. Useful safe payload of the UC Berkeley Sampler drone is substantially lower than the specified 0,3 kg due to off­-setting of the cutting tool from the UAV‘s center of gravity. SUMMARy The need for collecting samples in tree canopies is common within a variety of different disciplines e.g., forest seed production, genetics, physiology, botany, phytopathology, dendrology. Currently, such sampling can be accomplished by either climbing a selected tree, cutting of the whole tree or shooting off the selected branch. However, all three above mentioned approach­es have several drawbacks. They are either too expen­sive, too random, too time consuming, they can be dangerous or too invasive. These drawbacks could be overcome with the developments in the area of un­manned aerial vehicles (UAVs). As a matter of fact, they were firstly addressed at the UC Berkeley, The Forest Mycology and Pathology Lab (UC Berkeley, 2016). Their solution for canopy sampling includes a commercially available UAV system DJI Phantom 2 with a hook-shaped blade attached rigidly to the drone via a straight pole. Since there are no external controls for the cutting tool, the operator must f ly the UAV in­side the canopy and randomly cut the sample out of it, risking impact. If the cutting tool stays lodged in the tree canopy, a lack of any safety mechanism prevents the operator to detach the cutting tool from the UAV in order to save it. The above mentioned drawbacks were addressed and solutions devised in cooperation between the De­partment of forest physiology and genetics of the Slo­venian Forestry Institute (SFI) and Institute 404 as a part of the EUFORINNO project. The result was UAV solution for tree canopy sampling – Lucanus (GIS & Zavod 404, 2016). Lucanus is a remotely controlled mechanical arm composed of several modules. These modules include: a) connecting module that connects the tool to the UAV and also serves as a safety release mechanism al­lowing a quick remotely actuated detachment of the tool in case of emergency, b) the system of cameras, sensors and lasers that allows efficient and precise po­sitioning of the UAV in the terminal approach phase and precise cutting of the sample with the mechanical arm, c) cutting/grabbing tool module composed of spring actuated cutters and sample gripping mecha­nism. Imagery captured by the on-board camera is dis­played on a separate LCD screen that is connected to the remote control station. This allows the operator to accomplish sampling at greater distances or even out­side the line-of-sight between the UAV and the opera­tor. Lucanus is currently installed on a custom eight-rotor UAV, based on the Sky Hero Spyder X8 airframe with a DJI autopilot. Such configuration was chosen for its high stability, responsiveness and high payload. Its maximum payload is 7 kg, which allows sampling of heavier branches or even branches bearing repro­ductive bodies (fruits). The implemented solutions were applied for patent by the inventors from both SFI and Institute 404. The national patent was granted on 30. 9. 2016 under patent nr. SI 24941 by The Slovenian Intellectual Property Of­fice (SIPO) which is an autonomous body within the Slovenian Ministry of Economic Development and Technology. Solution is currently also patent pending in European Patent Office (application no. EP16150006.1). Lucanus was successfully publicly demonstrated at EUFORINNO Forest genetic monitoring and gene banks workshop held on January 25th 2016. Although Lucanus prototype has proven the feasibility of tree canopy sampling by UAV, the development team is al­ready planning new improvements to make the Lu­canus more user friendly and efficient. Envisioned fu­ture upgrades include implementation of the Real time kinematic GPS system (RTK), full articulation of the sampling arm, improved spring-loaded cutting system with in-f light re-cocking capability and improved sen­sor package. LITERATURA - REFERENCES DJI, 2015: Phantom 2 User manual v1.4. DJI, Shenzhen, China. p 36. (http://dl.djicdn.com/downloads/phantom_2/ en/PHANTOM2_User_Manual_v1.4_en.pdf, 23.12.2016) UC Berkeley, 2016: Sampler drones for forestry reasearch. Forest Pathology and Mycology Laboratory, Berkeley University of California. (https://nature.berkeley.edu/garbelottowp/?p=1801, 23.12.2016) GIS & Zavod 404, 2016: Sistem Lucanus. Gozdarski inštitut Slovenije / Zavod 404. (http://lucanus.gozdis.si/, 23.12.2016). VIVIPARy IN FAGOPYRUM ESCULENTUM ŽIVORODNOST PRI AJDI (FAGOPYRUM ESCULENTUM) Tanveer Bilal PIRZADAH1, Bisma MALIK1, Inayatullah TAHIR1 & Reiaz ul REHMAN1 Received August 27, 2016; accepted December 16, 2016. Delo je prispelo 27. avgusta 2016, sprejeto 16. decembra 2016. abStR act Vivipary in Fagopyrum esculentum Common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) is an economically important crop, exhibiting a unique phe­nomenon of vivipary, which is usually a trait shown by plants growing in wet, arid and f lodded conditions. Vivipa­ry was observed in both ripe and un-ripe (green) seeds on the inf lorescence. The expression of this trait in buckwheat is detrimental for the crop yield. Key words: Fagopyrum, buckwheat, vivipary, germina­tion iZVleČeK Živorodnost pri ajdi (Fagopyrum esculentum) Navadna ajda (Fagopyrum esculentum Moench) je gosp­odarsko pomembna poljščina, pri kateri je opazen edinstven pojav živorodnosti (viviparija), ki je običajno lastnost rast­lin, ki rastejo na mokrih, suhih in poplavnih območjih. Živorodnost so opazili pri zrelih in nezrelih (zelenih) se­menih na socvetju. Izražanje te lastnosti pri ajdi zmanjša uporabno vrednost pridelka. Ključne besede: Fagopyrum, ajda, živorodnost, kalitev 1 Department of Bioresources, University of Kashmir, Srinagar, India-190006 * reiazrehman@yahoo.com, pztanveer@gmail.com 1 INTRODUCTION Buckwheats (Fagopyrum spp.) a dicot pseudocereal is a crop of short duration, grown in many places around the world. It’s economic and health promoting effects are due to its bioactive constituents. It has abundant rutin (f lavonoid) content and has a potential for be­coming main industrial source of rutin. These proper­ties have put it among the functional foods and thera­peutic medicines. 2 RESULTS AND DISCUSSION Here we report that Fagopyrum esculentum Moench exhibited seed germination within the inf lorescence, a well known phenomenon, known as vivipary. Predom­inantly vivipary is the trait of mangroves but there are reports of vivipary in some members of the family Polygonaceae, however buckwheat belonging to the same family usually does not show such characteristic. There has been an earlier report by Katoch et al. (1979), however, the illustrations are vague. Vivipary has been documented in alpine, arctic (Lee & Harmer 1980, Elmqvist & Cox 1996) and tropical (Farn­sworth & Farrant 2004) plants in arid and wet or f looded environments. Usually the phenomenon of vi­vipary is exhibited by ripe seeds but in our present in­vestigation, some unripe seeds, green in colour, also shows this unique feature (Figure 1 C). However, no such phenomenon could be observed in other species of buckwheat. Vivipary is also significant from an ag­ricultural perspective because it would cause loss in yield. The lack of seed dormancy is highly undesirable because the premature sprouting of grains creates a major challenge in maintaining food supplies (Tsian­tis 2006). There are few studies that have evaluated germination and vivipary in buckwheat. Cormack (1952) found that the removal of the pericarp and seed coat resulted in the germination of dormant seeds of Tartary buckwheat. Vanden Born & Corns (1958) re­ported that gibberellic acid (GA) improved partially the germination of after ripening seeds, but not of fully dormant seeds. It has been reported that in buckwheat the VP (viviparous) 1/ABI (Abscisic Acid-Insensitive) 3 gene is responsible for controlling seed development and germination (McCarty 1995, Jones 1997, Naka­mura & Toyama 2001) and the induced mutation in this gene have been shown to cause vivipary (Naka­mura & Toyama 2001). Figure 1: Panels A, B: F. esculentum Moench. showing vivipary, Panel C: green viviparous seed, Panel D: mature viviparous seed. Slika 1: Podokni A, B: prikaz živorodnosti pri navadni ajdi (F. esculentum Moench), Podokno C: zeleno živorodno seme, Podo­kno D: zrelo živorodno seme. 3 POVZETEK Ajda (Fagopyrum spp.) je dvokaličnica, ki se uvršča med neprava (psevdo) žita. Je poljščina, ki jo pridelu­jejo v številnih krajih po svetu. V tem članku bomo predstavili dobro znan pojav živorodnosti (viviparije) pri opazovani kalitvi semen navadne ajde (Fagopyrum esculentum Moench) na socvetju. Živorodnost je pretežno lastnost mangrove, obstajajo pa tudi poročila o živorodnosti nekaterih vrst družine Polygonaceae, vendar ajda, ki tudi pripada k tej družini, običajno ne kaže te lastnosti. O tem so v preteklosti že poročali Katoch et al. (1979), vendar slike niso bile primerno razločne. Živorodnost so do­kumentirali pri alpskih, arktičnih (Lee & Harmer 1980, Elmqvist & Cox 1996) in tropskih (Farn­sworth & Farrant, 2004) rastlinah v sušnih in mokrih ali poplavljenih okoljih. Običajno je pojav živorodnosti ugotovljen pri zrelih semenih, vendar v naši sedanji raziskavi tudi nekatera nezrela semena, ze­lene barve, kažejo ta edinstven pojav (slika 1 C). Ven­dar o tem pojavu še niso poročali pri drugih vrstah ajde. Živorodnost je s kmetijskega vidika neželjena zaradi izgube kakovosti pridelka. Pomanjkanje miro­vanja semen (dormanca) je zelo nezaželeno, ker se zaradi prezgodnje kalitve zrn nastaja problem skladiščenja in ohranjanja zalog hrane (Tsiantis 2006). Obstaja nekaj študij, ki so ugotavljale kalitev in živorodnost pri ajdi. Cormack (1952) je odkril, da je odstranitev perikarpa in luščin povzročila kalitev mirujočih semen tatarske ajde. Vanden Born & Corns (1958) sta poročala, da je giberelinska kislina (GA) delno izboljšala kalitev po zorenju semena, razen pri popolnoma mirujočih semenih. Ugotovljeno je bilo, da je pri ajdi gen VP (živorodna) 1 / ABI (Abscisic Acid-Insensitive) 3 odgovoren za razvoj semen ter ka­litev (McCarty 1995, Jones 1997, Nakamura & To­yama 2001) in da inducirane mutacije v tem genu povzročajo živorodnost (Nakamura & Toyama 2001). 4 REFERENCES - LITERATURA Cormack, R. G. H., 1952: A note of the dormancy of Tartary buckwheat seeds. Scient. Agr. (Rio de Janeiro) 32: 170­ 172. Cota-Sánchez, J. H., 2004: Vivipary in the Cactaceae: its taxonomic occurrence and biological significan­ ce. Flora (Jena) 199: 481-490. Elmqvist, T. & P. A. Cox, 1996: The evolution of vivipary in f lowering plants. Oikos (Copenhagen) 77: 3-9. Farnsworth, E. & J. M. Farrant, 1998: Reductions in abscisic acid are linked with viviparous reproduction in mangroves. Am. J.Bot. (Baltimore) 85: 760-769. Jones, R. D., N. C. Peters & M. J. Holdsworth, 1997: Genotype and environment interact to control dormancy and differential expression of the VIVIPAROUS I homologue in embryos of Avena fatua. Plant J. (Oxford) 12: 911-920. Katoch, P. C., S. Baksh, S. D. Bhardwaj & A. N. Kaushal, 1979: A report of Vivipary in buckwheat (Fagopyrum sp.). Curr. Sci. (Bengaluru) 48 (10): 446. Lee, J. A. & R. Harmer, 1980: Vivipary: a reproductive strategy in response to environmental stress? Oikos (Cope­nhagen) 35: 254-265. McCarty, D. R., 1995: Genetic control and integration of maturation and germination pathways in seed deve­lopment. Ann. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol. (Palo Alto) 46: 71-93. Nakamura, S. & T. Toyama, 2001: Isolation of a VPI homologue from wheat and analysis of its expression in emb­ryos of dormant and non-dormant cultivars. J. Exp. Bot. (Oxford) 52: 875-876. Toyama, T., S. Nakamura & M. yamamori, 2004: Isolation of a VIVIPAROUS l/ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 3 homologue from common buckwheat. Fagopyrum (Kyoto) 21: 27-34. Tsiantis, M., 2006: Plant development: multiple strategies for breaking seed dormancy. Curr. Biol. (Amsterdam) 16: R25-R27. Vanden Born, W. H. & W. G. Corns, 1958: Studies on seed dormancy, plant development, and chemical control of Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.). Can. J. Plant Sci. (Ottawa) 38: 357-366. MAGNESIUM AND PHOSPHORUS DISTRIBUTIONS IN DEVELOPING TARTARy BUCKWHEAT COTyLEDONS R AZPOREDITEV MAGNEZIJA IN FOSFORJA V R AZVIJAJOčIH SE KLIčNIH LISTIH TATARSKE AJDE Paula PONGRAC1,a,*, Peter KUMP2, Bojan BUDIč3, Katarina VOGEL-MIKUŠ1,2 abStR act Magnesium and phosphorus distributions in developing tartary buckwheat cotyledons Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) is a gluten-free pseudocereal with good mineral element composition of grain. In particular, Tartary buckwheat grains have greater magnesium (Mg) concentration than ce­real grains. In (pseudo)cereal grain, Mg is bound to phytic acid, a phosphorus (P)-rich compound responsible for poor availability of Mg in the diet. The aim of the study was to evaluate changes in cell-type specific distribution of Mg and P in cotyledons of Tartary buckwheat grain and in 5-day-old and 8-day-old sprouts. Low-energy-X-ray-f luorescence map­ping revealed considerable co-localisation of Mg and P in globoid-like structures in cotyledons. In the grain these globoid-like structures were numerous and appeared in mesophyll cells of the cotyledons. In 5-day-old sprouts less Mg-P co-localisation was seen in mesophyll cells. In 8-day­old sprouts co-localisation of Mg and P was less confined to globoid-like structures in the mesophyll cells indicating the degradation of these globoids and release of Mg, presumably for different metabolic processes that occur during seedling development. The extent to which Mg release from phytic acid in sprouts correlates with the bioavailability of Mg dur­ing digestion remains to be investigated. Keywords: Fagopyrum tataricum, X-ray f luorescence micro-spectroscopy, sprouts, phytic acid, germination iZVleČeK Razporeditev magnezija in fosforja v razvijajočih se kličnih listih tatarske ajde Tatarska ajda (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) je ne­pravo žito, ki ne vsebuje glutena in ima za prehrano ugodno mineralno sestavo. Zrnje tatarske ajde vsebuje na primer več magnezija (Mg) kot zrna pravih žit. V zrnju pravih, kot ne­pravih žit, je Mg močno vezan na fitinsko kislino, organsko spojino, ki je zgrajena iz velikega števila atomov fosforja (P). Omenjena vezava je odgovorna za slabo topnost Mg in slabo biodostopnost Mg v prehrani. Namen študije je bil ovredno­titi spremembe v razporeditvi Mg in P v razvijajočih se kličnih listih tatarske ajde. Preučevali smo klične liste v zrnu, v pet in osem dni starih kalicah tatarske ajde. S pomočjo nizko-energijske rentgensko f luorescenčne mikro­spektroskopije smo na celičnem nivoju v kličnih listih zrn potrdili močno kolokalizacijo Mg in P v globoidnih struktu­rah. V kličnih listih pet dni starih kalic se je stopnja koloka­lizacije zmanjšala in globoidne strukture so bile manj številne. Stopnja kolokalizacije v kličnih listih osem dni starih kalic se je še dodatno zmanjšala, kar je nakazovalo na razgradnjo kompleksov fitinske kisline in Mg, verjetno kot posledica metabolnih potreb kalice po Mg. Potrebne so na­daljnje raziskave, s katerimi bi ovrednotili povezavo med postopnim sproščanjem Mg s fitinske kisline v kalicah in biodostopnostjo Mg v prebavilih. Ključne besede: Fagopyrum tataricum, rentgensko f luorescenčna mikro-spektroskopija, kalice, fitinska kislina, kalitev 1 Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Večna pot 111, SI-1000 Ljubljana, Slovenia 2 Jožef Stefan Institute, Jamova 37, SI-1000 Ljubljana, Slovenia 3 National Institute of Chemistry, Hajdrihova 19, SI-1000 Ljubljana, Slovenia a Current address: * Corresponding author: Paula Pongrac, The James Hutton Institute, Invergowrie, Dundee, DD2 5DA, United Kingdom, Tele­phone: +44138258855, Email: paula.pongrac@gmail.com 1 INTRODUCTION Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) is a good source for secondary metabolites and min­eral elements (Bonafaccia et al. 2003a, b), particu­larly in people with coeliac disease, as it is a gluten-free pseudocereal. Tartary buckwheat grain and sprouts contain greater concentration of magnesium (Mg) than wheat (Triticum aestivum L.) grain and sprouts (Pongrac et al. 2016a), which is strongly linked to the phylogenetic origin of the two species. Tartary buck­wheat belongs to the family Polygonaceae within the order Caryophyllales, while wheat belongs to the Poa­ceae within the Poales. Species from the Caryophylla­les (and Oxalidales) generally have greater concentra­tions of Mg in shoots compared to other orders within Angiosperms, including Poales (White et al. 2015). Since Mg is highly phloem mobile (Hawkesford et al. 2012), greater shoot Mg concentration will result in greater Mg concentration of phloem-fed tissues, such as grains. Considering that Mg is one of the mineral elements often lacking in human diets (White & Broadley 2009), identification of crops and plant spe­cies that are likely to have greater shoot Mg concentra­tion could augment human and animal diets (White et al. 2015, Nielsen 2015), even though the final Mg concentrations in shoots will ultimately depend on available soil Mg concentrations. Grain is a major component of daily diets and, as such, a major source of essential mineral elements. In grain mineral elements are tightly bound to phospho­rus (P)-rich phytic acid (myo-inositol hexakisphos­phate) forming phytates. This enables appropriate storage environment for mineral elements in dormant grains. However, when grains are consumed mineral elements bound to phytic acids are poorly bioavailable to monogastric animals (Bohn 2008). Magnesium and potassium (K) are typical counter-ions in phytate salts (R aboy 1997). Using techniques for visualisation of mineral element distribution in plant material, co-lo­calisation of P, Mg and K in (pseudo)cereal grain has been demonstrated (Pongrac et al. 2013a, Wu & Becker 2012, R egvar et al. 2011). In addition, absorp­tion of Mg from white wheat bread was significantly impaired by the addition of phytic acid, in a dose-de­pendent manner, at amounts similar to those naturally present in whole-meal and brown bread (Bohn et al. 2004). These observations support strong interaction of Mg and P in (pseudo)cereal grain and in the diets. During grain soaking and germination, phytates are enzymatically broken down by the enzyme phytase leading to the release of mineral elements required by the growing embryo and the developing seedling. Consequently, soaked grains and seedlings (sprouts) are believed to be nutritionally advantageous (Holtz and Gibson 2007, Nelson et al. 2013). In addition, sprouting was shown to result in increased concentra­tions of mineral elements (Pongrac et al. 2016a, Lint­schinger et al. 1997) although the extent of the in­crease depended on plant species and the mineral-ele­ment composition of the water used for sprout cultiva­tion (Lintschinger et al. 1997, Liu et al. 2007, Pon­grac et al. 2016a). The observed increase in mineral element concentration is arguably a result of the con­version of the dry matter and the uptake of mineral elements by developing roots. Dry matter of the grain (mostly non-fibrous storage carbohydrates) is convert­ed to energy for growth of the embryo and seedling. With activation of metabolic processes requirements of mineral element change and this can be observed as a change in the distribution of mineral elements dur­ing sprouting, especially for sulphur (S), K, calcium (Ca) and Fe (Pongrac et al. 2016a, b). No redistribu­tion of P and Mg was seen in hydrothermally processed grains (groats) of Tartary buckwheat, but a slight re­distribution was seen in 8-day-old sprouts when com­pared to the grain (Pongrac et al. 2016b). Thus, it ap­pears that hydrothermal processing does not affect phytate-mineral-element complexes in cotyledons sig­nificantly, but germination does. The aim of the study was to resolve the distribu­tion of Mg and P in developing cotyledons of Tartary buckwheat. We hypothesised that it is possible to dem­onstrate degradation of P-Mg complexes in developing Tartary buckwheat cotyledons by visualising mineral element distributions. Since analysis of Mg distribu­tion using X-ray f luorescence (XRF)-based techniques is limited by low f luorescence yield of low-Z elements (e.g. sodium, Mg, aluminium, silicon and P; Vogel­-Mikuš et al. 2012) the use of specialised facilities pro­viding spatially resolved information for low-Z ele­ments was required. For this purpose, the low-energy XRF microscopy beamline (TwinMic) of the synchro­tron Elettra, Trieste, Italy, which enables simultaneous determination of Mg and P distribution in plant mate­rial (Kaulich et al. 2009) was utilised. 2 MATERIALS AND METHODS Grain of Tartary buckwheat was obtained from Mlin Rangus (Dolenje Vrhpolje at Šentjernej, Slovenia). Ma­ture, air-dried grain was kept in paper bags in the dark at room temperature. Sprouts were grown in an auto­matic sprouter (EasyGreen® MicroFarm System, Easy-Green Factory Inc., Nevada, USA) where they were watered by misting every 3 h during the day (five times), and twice during the night (with a 4-h and 5-h gap). Five-day-old and 8-day-old sprouts were removed from the sprouter. These two stages were selected, as on the fifth day sprouts were in a shedding stage in which cotyledons are not yet fully developed and are still enclosed in the husk. Prior to the analysis, husks were manually removed from the cotyledons. On the eight day, cotyledons were fully unfolded and sprouts at this stage could be directly consumed (the husk has fallen off the cotyledon). A schematic illustration of the material investigated is provided in Fig. 1. For bulk mineral element analyses, sprouts were washed in bidistilled water, roots were removed and cotyledons and hypocotyls were dried at 60 °C for three days. Mature whole grains and dried (root-less) sprouts were homogenised in liquid nitrogen, using a pestle and a mortar, and kept at -20 °C in air-tight con­tainers. Homogenised material was wet digested in a microwave oven (Ethos 1, Milestone, Sorisole, Italy) and concentrations of P and Mg were measured with inductively coupled plasma-mass spectrometry and in­ductively coupled plasma-optical emission spectros­copy as described previously (Pongrac et al. 2013b). For X-ray f luorescence (XRF) microscopy, mature grain, pre-soaked for 4 hours at 4 °C, and pieces of coty­ledons were frozen in propane cooled with liquid nitro­gen and 25 µm thick sections were cut using a cryotome at -25 °C. Sections were freeze-dried (Alpha Christ 2-4, Osterode am Harz, Germany) at -30 °C and 0.210 mbar for three days and mounted between two layers of pi­oloform (Vogel-Mikuš et al. 2009, 2014) stretched onto aluminium holders. Cross-sections were scanned in vacuum at the 2200 eV on TwinMic beamline, synchro­tron Elettra, Trieste, Italy. The beam was focused to 1.2 µm2 using a scanning X-ray microscope zone plate. X-rays were used to image structural make-up of Tartary buckwheat cotyledons and X-ray f luorescence was used to determine spatial distributions of Mg and P. X-ray f luorescence spectra were fitted with PyMCA (Solé et al. 2007) and quantified using a software for quantita­tive micro-XRF analysis developed by P. Kump (Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia). Sample thickness was calculated in each pixel on the basis of absorption measurements as measured using a CCD system posi­tioned behind the sample (Kaulich et al. 2009). Cellu­lose was taken as a matrix in the quantification proce­dure (Koren et al. 2013). Quantitative maps and two coloured co-localisation images were generated using PyMCA software (Solé et al. 2007). Concentrations of Mg and P in cotyledons were extracted from the quan­titative distribution maps using ImageJ software (Abramoff et al. 2004; Vogel-Mikuš et al. 2014). Sta­tistically significant differences in concentrations of Mg and P between developmental stages were determined by Student-Newman-Keuls post-hoc tests (at p<0.05) after analysis of variance using GenStat software (64-bit Release 17.1; VSN International Ltd, Oxford, UK). 3 RESULTS AND DISCUSSION Distributions of Mg and P were studied in developing cotyledons of Tartary buckwheat. Three stages in the development of Tartary buckwheat cotyledons were se­lected (Fig. 1). The first stage was mature grain, the second was shedding stage and the third was ready-to­eat stage. Bulk concentrations of Mg and P in dry mat­ter increased during cotyledon development (Fig. 2) in line with previous results (Pongrac et al. 2016a). This increase is due to the conversion of dry matter (storage compounds) to energy used in growth and seedling development, and of root uptake of mineral elements from the solution used for irrigation. Tartary buckwheat grain contained greater aver­age bulk concentration of Mg (2110 mg kg-1 dry weight) than reported for 125 Tartary buckwheat accessions from China (1523 mg kg-1 dry weight) but was within the minimum – maximum range, namely 729 - 3104 mg kg-1 (Huang et al. 2014). This indicates relative sta­bility of Mg concentrations in Tartary buckwheat grain, regardless of the environmental conditions. Phosphorus concentration in cotyledon was great­er than Mg concentrations at all stages of development; however the P to Mg (P/Mg) concentration ratio de­creased during the cotyledon development (Fig. 2). This is in line with our previous observations of Tar­tary buckwheat grains and 8-day-old sprouts (Table 1; Pongrac et al. 2016a). Considering that total grain P and P in phytic acid are highly and positively correlat­ed (R aboy 1997), total P can be used as proxy for esti­mating phytate concentration in plants. Hence a lower P/Mg ratio indicates lower phytate to Mg ratio, which might positively affect solubility and bioavailability of Mg. Indeed, at molar ratios of phytic acid to Mg below 0.16 an increased solubility of Mg was demonstrated at pH>6 (Cheryan et al. 1983). In grain and seed of dif­ferent crops P/Mg ratio is typically above 1 (Table 1). In potato (Solanum tuberosum L.) tubers, another phlo­em-fed tissue, P/Mg ratio was 1.3 (Kärenlampi & White 2009). In wheat sprouts irrigated with tap water the ratio was much greater than in grains, namely 5.1, and much greater than in Tartary buckwheat sprouts (Table 1) which was a consequence of unchanged Mg concentration and increased concentration of P in wheat sprouts (Pongrac et al. 2016a). When the same sprouts were irrigated with a solution containing 5.6­times greater Mg concentration, P/Mg ratio decreased in both species (Table 1; Pongrac et al. 2016a). In leaves, lower P/Mg ratios have been reported (Table 1). Among grains noticeably lower P/Mg ratios have been reported for both buckwheat species and quinoa (these are pseudocereals) compared to cereal grain and edible seeds from Fabales (pulses: e.g. bean, pea, lentil, chick­pea). Presumably this is a result of the phylogenetical­ly-dependent greater Mg concentrations in Caryophyl­lales species (buckwheat and quinoa) than cereal (Poa­les) species (White et al. 2015). As argued previously, this might positively affect availability of Mg from grains of plants from Caryophyllales (buckwheats and quiona) in comparison to cereal grains and edible seeds from Fabales (pulses). Furthermore, from a die­tary perspective, leaves that have lower P/Mg ratios might be advantageous for ensuring increased Mg in­takes. For further discussion on plant-sourced Mg and Mg requirements in human diets see Nielsen (2015). To study the distribution of Mg and P in developing Tartary buckwheat cotyledons the low-energy XRF beamline TwinMic, synchrotron Elettra, Trieste, Italy, was utilised. An excitation of 2200 eV provided infor­mation on the structure of cross-sectioned plant mate­rial and access to spatially resolved information on P and Mg distribution at the cell-type specific level. Moreover, presence of these two mineral elements was determined simultaneously (Fig. 3). Magnesium and P co-localised in globoid structures densely dispersed within the cells of cotyledon in the grain (Fig. 4 top pa­nels). These globoids have previously been reported to contain zinc (Zn), Fe, copper and also manganese (Pon­grac et al. 2013a). Similarly, in the aleurone layer of wheat grain such globoids were composed of P, Mg, Zn, Fe and sodium (Regvar et al. 2011) and of K (Lott & Spitzer 1980). These globoids are discrete, electron-dense globular inclusions in single-membrane storage micro-bodies, which can contain crystalline or amor­phous storage protein deposits with functions resem­bling those of the vacuole in non-storage cells (Raboy 1997). In 5-day-old Tartary buckwheat sprouts fewer globoids were seen (Fig. 4 middle panels) which is likely a result of the digestion of globoids and dilution as seed­lings grow. These cotyledons are still enclosed in the husk, which means the cotyledons have not yet been in direct contact with the light. The 8-day-old sprouts had fully developed cotyledons (Fig. 1), which were of darker green colour and had a more defined epidermal layer (Fig. 4 bottom left panels). Here the distribution of Mg and P was no longer confined to globoid structures but instead Mg and P were spread more evenly in mesophyll cells (Fig. 4 bottom panels) indicating degradation of phytate globoids. In co-localisation images Mg was in­dicated in green and P in red (Fig. 4 right panels). A mix­ture of these two colours, i.e. co-localisation in particu­lar pixel, yields a yellow colour. In grain yellow colour, hence the co-localisation of P and Mg appears through­out the cotyledons, while in the sprouting cotyledons, there are fewer co-localisations with less intensity. In cotyledons of grains and 5-day-old and 8-day­old sprouts little Mg was located in the epidermal layer (Fig. 4), which is in line with the function of Mg as an essential component of chlorophyll and protein syn­thesis and functioning (Hawkesford et al. 2012). Cot­yledons of 5-day-old sprouts do not photosynthesise yet since they have not been exposed to light, hence it can be argued that extensive remobilisation of Mg from phytate globoids was not required at this stage. By contrast, cotyledons of 8-day-old sprouts have been fully exposed to the light, thus location of Mg at this developmental stage might be a result of increased re­quirement for photosynthetic activity and protein syn­thesis (Hawkesford et al. 2012). Light-triggered reac­tions increase the concentration of Mg of the stroma and increase pH (Hawkesford et al. 2012). In combi­nation these changes are sufficient to increase the ac­tivity of ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) carboxylase and also of other stromal enzymes which depend on high Mg concentrations and have a pH optimum above 6 (Hawkesford et al. 2012). Concentrations of P and Mg in cotyledons were ex­tracted from P and Mg distribution maps using ImageJ software (Abramoff et al. 2004; Koren et al. 2013). These concentrations are referred to as cotyledon-spe­cific Mg and P concentrations, because only part of the cotyledons was mapped in this study. As seen in bulk data (Fig. 2) the P concentrations in cotyledons were greater than Mg at all stages of development, although P/Mg ratio decreased (Fig. 5). However, the greatest con­centrations of P were seen in grain cotyledon. This in contrast to bulk P concentrations (Fig. 2) and is a conse­quence of whole grain containing tissues which contain lower P concentrations (endosperm and husk; Pongrac et al. 2013a). In cotyledon-specific analyses reported in Fig. 5 only cotyledons were analysed. Cotyledons of 5-day-old sprouts contained smaller P and Mg concen­trations than cotyledons in the grain, presumably a re­sult of translocation of P and Mg for the growth of roots and hypocotyl, which represent sinks for P and Mg. The Mg concentration in 8-day-old sprouts was greater than in 5-day-old sprouts, which indicates increased needs for Mg in chlorophyll synthesis accompanied by mineral element uptake by newly developed roots. 4 CONCLUSIONS Tartary buckwheat grain (and other grain from plants belonging to Caryophyllales) was identified as having a more favourable P/Mg ratio than cereal grains or pulses. During cotyledon development a decrease in P/ Mg concentration ratios was observed. Using low-en­ergy XRF mapping for simultaneous determination of the distribution of Mg and P in developing cotyledons of Tartary buckwheat relocation of Mg and P was visu­alised. The observed changes in the distributions of Mg and P are likely a result of metabolic changes tak­ing place during development from dormant grains to growing seedlings. The extent to which potential re­lease of Mg from P groups in phytate globoids in the developing Tartary buckwheat cotyledons is linked to increased bioavailability of Mg in the diet remains to be investigated. 5 POVZETEK 5.1 Uvod Tatarska ajda (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) je nepravo žito, ki ne vsebuje glutena in ima za prehrano ugodno mineralno sestavo. Na primer, zrnje tatarske ajde ima večjo koncentracijo magnezija (Mg) kot zrnje žit. V zrnju pravih in nepravih žit je Mg močno vezan na fitinsko kislino, organsko spojino, ki je zgrajena iz velikega števila atomov fosforja (P). Zaradi omenjene vezave je Mg slabo topen in slabo biodostopen v preh­rani. Namen študije je bil določiti koncentracije Mg in P v zrnju in kličnih listih kalic tatarske ajde in ovred­notiti spremembe v razporeditvi Mg in P v razvijajoči se kličnih listih tatarske ajde. 5.2 Materiali in metode Preučevali smo klične liste v zrnu, v pet in osem dni starih kalicah tatarske ajde (Slika 1). Za določitev skup­nih koncentracij Mg in P smo zrna in kalice posušili in razklopili v mikrovalovki. Koncentracije Mg in P smo izmerili z masno spektrometrijo z induktivno skloplje­no plazmo. Razporeditev Mg in P na celičnem nivoju smo določili s pomočjo nizko-energijske rentgensko f luorescenčne mikroskopije na prečnih prerezih kličnih listov, ki so bili pripravljeni s hitrim zamrzo­vanjem in liofilizacijo. 5.3 Rezultati in razprava Koncentraciji Mg in P sta naraščali od zrnja do osem dni starih kalic, medtem ko je razmerje med koncen­tracijami P in Mg padalo (Slika 2). Manjše razmerje med P/Mg je zaželeno v naši prehrani, saj je koncen­tracija P dobro merilo za količino fitinske kisline, ki, kot je bilo že omenjeno, omejuje absorpcijo Mg v naši prebavi. Med zrni in semeni imajo zrna rastlin, ki sodi­jo v red klinčnikovcev (Caryophllales) bolj ugodno razmerje P/Mg kot zrna pravih žit in stročnic (Tabela 1). Najbolj ugodno razmerje med P in Mg je v listih rastlin. Tehnika nizko-energijske rentgensko f luores­cenčne mikroskopije omogoča analizo morfološke zgradbe analiziranega tkiva in hkratno določitev razporeditve Mg in P (Slika 3). V kličnih listih zrnja smo z omenjeno tehniko pokazali močno kolokalizaci­jo Mg in P, ki pa se je tekom razvoja kličnih listov post­opno manjšala (Slika 4). 5.4 Zak ljučk i Rezultati potrjujejo, da lahko s tehnikami vizualizacije razporeditve Mg in P orišemo kemijske spremembe v rastlinskem tkivu, v tem primeru razgradnjo kom­pleksov fitinske kisline in Mg. Potrebne so nadaljnje raziskave, s katerimi bi ovrednotili povezavo med postopnim sproščanjem Mg s fitinske kisline v razvijajočih se kličnih listih tatarske ajde in biodosto­pnostjo Mg v prebavi. ACKNOWLEDGEMENTS Authors would like to thank Prof. Marjana Regvar and Prof. Ivan Kreft for their steadfast support and scien­tific discussions. This study was supported by the Slo­venian Research Agency through P1-0212 Programme and by the Z4-4113 and L4-7552 Projects. Paula Pon­grac acknowledges Marie Curie IntraEuropean Fel­lowship (REA grant agreement n°623305), the Bilateral Exchange Grant between the Royal Society of Edin­burgh and the Slovenian Academy of Sciences and Arts, and Nutrition Institute, Ljubljana, Slovenia. Anton Rangus is acknowledged for providing Tartary buckwheat grain and synchrotron Elettra, Trieste, Italy for provision of synchrotron radiation facilities at beamline TwinMic (project 20135190). Authors are grateful to the beamline scientist Dr. Alessandra Gi­anoncelli for her assistance in using the beamline. We thank Prof. Philip J. White for reading original manu­script. ZAHVALA Zahvaljujemo se prof. dr. Marjani Regvar in akademi-ijo znanosti in umetnosti in Inštitutu za nutricionis­ku prof. dr. Ivanu Kreftu za njuno podporo in številne tiko v Ljubljani. Zahvaljujemo se Antonu Rangusu za znanstvene razprave. Študijo je podprla Javna agencija zrnje tatarske ajde in sinhrotronu Elettra v Trstu za čas za raziskovalno dejavnost republike Slovenije preko na žarkovni liniji TwinMic (številka projekta 20135190). programske skupine P1-0212 in projektov Z4-4113 in Posebej se zahvaljujemo znanstvenici na žarkovni lini­L4-7552. Paula Pongrac se zahvaljuje za finančno pod-ji TwinMic, Dr. Alessandri Gianoncelli za pomoč pri poro Evropske komisije v okviru Marie Curie analizah in prof. dr. Philipu J. White-u za komentarje štipendije, sredstva v okviru mednarodne izmenjave na prvo verzijo članka. med Royal Society of Edinburgh in Slovensko akadem- REFERENCES - LITER ATURA Abramoff, M. D., P. J. Magalhaes & S. J. Ram, 2004: Image processing with ImageJ. Biophotonics International 11 (Pittsfield), str. 36-42. Bonafaccia, G., L. Gambelli, N. Fabjan & I. Kreft, 2003a: Trace elements in f lour and bran from common and tartary buckwheat. Food Chemistry 83 (Amsterdam), str. 1–5. Bonafaccia, G., M. Marocchini & I. Kreft, 2003b: Composition and technological properties of the f lour and bran from common and tartary buckwheat. Food Chemistry 80 (Amsterdam), str. 9-15. Bashir, E. M. A, A. M. Ali, A. M. Ali, A. E. Mechinger, H. K. Parzies & B. I. G. Haussmann, 2014: Characte­rization of Sudanese pearl millet germplasm for agro-morphological traits and grain nutritional values. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization 12(1) (Cambridge), str. 35-47. Bohn, T., L. Davidsson, T. Walczyk & R. Hurrell, 2004: Phytic acid added to white-wheat bread inhibits fracti­onal apparent magnesium absorption in humans. The American Journal of Clinical Nutrition 79 (Rockville), 418-423. Bohn, T., 2008: Dietary factors inf luencing magnesium absorption in humans. Current Nutrition & Food Science 4(1) (Sharjah), str. 53-72. Broadley, M. R., J. P. Hammond, G. J. King, D. Astley, H. C. Bowen, M. C. Meacham, A. Mead, D. A. C. Pink, G. R. Teakle, R. M. Hayden, W. P. Spracklen & P. J. White, 2008: Shoot calcium and magnesium concen­trations differ between subtaxa, are highly heritable, and associate with potentially pleiotropic loci in Brassica oleracea. Plant Physiology 146 (Rockville), str. 1707-1720. Broadley, M. R., S. Ó. Lochlainn, J. P. Hammond, H. C. Bowen, I. Cakmak, S. Eker, H. Erdem, J. G. King & P. J. White, 2010: Shoot zinc (Zn) concentrations varies widely with Brassica oleracea L. and is af fected by soil Zn and phosphorus (P) levels. Journal of Horticultural Science and Biotechnology 85 (Didcot), str. 375-380. Cheryan, M., Anderson F. W., & F. Grynspan, 1983: Magnesium-phytate complexes: Effect of pH and molar ratio on solubility characteristics. Cereal Chemistry 60(3) (St. Paul), str. 235-237. Hawkesford, M., W. Horst, T. Kichey, H. Lambers, J. Schjoerring, I. S. Moller & P. J. White, 2012: Functi­ons of macronutrients. In: Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. Marschner, P. (Ed), Academic Press, Elsevier (Amsterdam), str. 135-190. Holtz, C. & R. S. Gibson, 2007: Traditional food-processing and preparation practices to enhance the bioavailabili­ty of micronutrients in plant-based diets. Journal of Nutrition 137 (Rockville), str. 1097-1100. Huang, X-y., F. J. Zeller, K-F. Huang, T-X. Shi, & Q-F. Chen, 2014: Variation of major minerals and trace ele­ments in seeds of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn.). Genetic Resources and Crop Evolution (Berlin) 61: str. 567-577. Karaköy, T., H. Erdem, F. S. Baloch, F. Toklu, S. Eker, B. Kilian & H. Özkan, 2012: Diversity of macro- and micronutrients in the seeds of lentil landraces. The Scientific World Journal Article ID 710412 (Cairo), str. 1-9. Kärenlampi, S. O. & P. J. White, 2009: Potato proteins, lipids and minerals. In: Advances in Potato Chemistry and Technology. Singh J. & L. Kaur, (Eds). Academic Press, Elsevier (Amsterdam), str. 99-126. Kaulich, B., A. Giannoncelli, A. Beran, D. Eichert, I. Kreft, P. Pongrac, M. Regvar, K. Vogel-Mikuš & M. P. Kiskinova, 2009: Low-energy X-ray f lourescence microscopy opening new opportunities for bio-related research. Journal of the Royal Society Interface 6 (London), str. S641-S647. Koren, Š., I. Arčon, P. Kump, M. Nečemer & K. Vogel-Mikuš, 2013: Inf luence of CdCl and CdSO supplemen­ 24 tation on Cd distribution and ligand environment in leaves of the Cd hyperaccumulator Noccaea (Thlaspi) pra­ecox. Plant and Soil 370 (Berlin), str. 125–148. Lintschinger, J., N. Fuchs, H. Moser, R. Jäger, T. Hlebeina, G. Markolin & W. Gössler, 1997: Uptake of various trace elements during germination of wheat, buckwheat and quinoa. Plant Foods for Human Nutrition 50 (Berlin), str. 223-237. Liu, C-L., y-S. Chen, J-H. yang, B-H., Chiang & C-K. Hsu, 2007: Trace element water improves the antioxidant activity of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) sprouts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (Washington), str. 8934–8940. Lott, J. N. A. & E. Spitzer, 1980: X-ray analysis studies of elements stored in protein body globoid crystals of triti­cum grains. Plant Physiology (Rockville) 66, str. 494-499. Nelson, K., L. Stojanovska, T. Vasiljevic & M. Mathai, 2013: Germinated grains: a superior whole grain func­tional food? Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 91 (Ottawa), str. 429-441. Nielsen, F. H., 2015: Importance of plant sources of magnesium for human health. Crop & Pasture Science 66(12) (Clayton), str. 1259-1264. Pinson, S. R. M., L. Tarpley, W. yan, K. yeater, B. Lahner, E. yakubova, X-y. Huang, M. Zhang, M. L. Gu­erinot & D. E. Salt, 2015: Worldwide genetic diversity for mineral element concentrations in rice grain. Crop Science 55 (Madison), str. 294-311. Pongrac, P., K. Vogel-Mikuš, L. Jeromel, P. Vavpetič, P. Pelicon, B. Kaulich, A. Gianoncelli, M. Regvar, D. Eichert & I. Kreft, 2013a: Spatial distribution of mineral elements in tartary buckwheat (Fagopyrum tatari­cum) grain as revealed by micro-imaging techniques. Food Research International 54 (Amsterdam), str. 125-131. Pongrac, P., I. Kreft, K. Vogel-Mikuš, M. Regvar, M. Germ, N. Grlj, L. Jeromel, D. Eichert, B. Budič & P. Pelicon, 2013b: Relevance for food sciences of quantitative spatially resolved element profile investigation in wheat (Triticum aestivum) grain. Journal of Royal Society Interface 10 (London), 20130296. Pongrac, P., M. Potisek, A. Fraś, M. Likar, B. Budič, K. Myszka, D. Boros, M. Nečemer, M. Kelemen, P. Vavpetič, P. Pelicon, K. Vogel-Mikuš, M. Regvar & I. Kreft, 2016a: Composition of mineral elements and bioactive compounds in Tartary buckwheat and wheat sprouts as affected by natural mineral-rich water. Journal of Cereal Science 69 (Amsterdam), str. 9-16. Pongrac, P., K. Vogel-Mikuš, M. Potisek, E. Kovačec, B. Budič, P. Kump, M. Regvar & I. Kreft, 2016b: Mi­neral and trace element composition and importance for nutritional value of buckwheat grain, groats and sprouts. In: Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. Zhou, M., I. Kreft, S-H. Woo, N. Chrungoo, & G. Wieslander, (Eds), Academic Press, Elsevier (Amsterdam), str. 261-272. Prado, F. E., Fernández-turiel, J. L., Psaras, G. K. & J. A. González, 2014: Variation of seed mineral concen­trations in seven quinoa cultivars grown in two agroecological sites. Cereal Chemistry 91(5) (St. Paul), str. 453­ 459. Raboy, V. 1997: Accumulation and storage of phosphate and minerals. In: Advances in Cellular and Molecular Biol­ogy of Plants, 4: Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Larkins B. A. & I. K. Vasil, (Eds), Springer (Berlin), str. 441-478. Regvar, M., D. Eichert, B. Kaulich, A. Gianoncelli, P. Pongrac, K. Vogel-Mikuš, & I. Kreft, 2011: New insights into globoids of protein storage vacuoles in wheat aleurone using synchrotron soft X-ray microscopy. Journal of Experimental Botany 62(11) (Oxford), str. 3929-3939. Solé, V. A., E. Papillon, M. Cotte, P. Walter & J. Susini, 2007: A multiplatform code for the analysis of energy­-dispersive X-ray f luorescence spectra. Spectrochimica Acta B 62 (Amsterdam), str. 63-68. Vogel-Mikuš, K., P. Kump, M. Nečemer, P. Pelicon, I. Arčon, P. Pongrac, B. Povh, H. Bothe & M. Regvar, 2009: Micro-PIXE analysis for localisation and quantification of elements in roots of mycorrhizal metal-tolerant plants. In: Symbiotic Fungi: Principles and Practice, Soil Biology, vol. 18. Varma, A. & A. C. Kharkwal (Eds.), Springer-Verlag (Berlin), str. 227–242. Vogel-Mikuš, K., P. Pongrac & P. Pelicon, 2014: Micro-PIXE elemental mapping for ionome studies of crop plants. International Journal of PIXE 24(3) (Singapore), str. 217-233. Vogel-Mikuš, K., I. Arčon, P. Kump, P. Pelicon, M. Nečemer, P. Vavpetič, Š. Koren & M. Regvar, 2012: Analytical tools for exploring metal accumulation and tolerance in plants. In: Phytotechnologies: Remediation of Environmental Contaminants. Anjum, N. A. (Ed), Taylor & Francis (Abingdon on Thames), str. 443–495. White, P. J. & M. R. Broadley, 2009: Biofortification of crops with seven mineral elements often lacking in human diets-iron, zinc, copper, calcium, magnesium, selenium and iodine. New Phytologist 182 (Hoboken), str. 49-84. White, P. J., H. C. Bowen, E. Farley, E. K. Shaw, J. A. Thompson, G. Wright & M. R. Broadley, 2015: Phylo­genetic effects on shoot magnesium concentration. Crop & Pasture Science 66(12) (Clayton), str. 1241-1248. Wu, B. & J. S. Becker, 2012: Imaging techniques for elements and element species in plant science. Metallomics 4 (London), str. 403–416. table 1. Phosphorus (P) and magnesium (Mg) concentration ratios in grain, seed, tubers, sprouts and leaves of some crop plant species. tabela 1. Razmerja med koncentracijami fosforja (P) in magnezija (Mg) v zrnju, semenih, gomoljih, kalčkih in listih nekaterih kmetijskih rastlin. Plant species Plant part P/Mg ratio Reference Rice Oryza sativa L. n=1755 genotypes [f looded]n=1729 genotypes [unf looded] Grain Flooded: 2.4 Unf looded: 2.5 Pinson et al. 2015 Pearl millet Pennisetum glaucum (L.) R. Br. n=225 genotypes Grain 3 Bashir et al. 2014 Wheat Triticum aestivum L. n=1 genotype Grain 2.8 Pongrac et al. 2016a Common buckwheat Fagopryrum esculentum Moench n=1 genotype Grain 1.4 Pongrac et al. 2016b Tartary buckwheatFagopyrum tataricum (L.) Gaertn n=1 genotype Grain 1.8 Pongrac et al. 2016a, b Quinoa Chenopodium quionoa Willd. n=7 genotypes Grain 1.1 – 2.2 Prado et al. 2014 Lentil Lens culinaris Medik. n=39 genotypes Seed 3.9 Karaköy et al. 2012 Pea Pisum sativum L. n=481 genotypes Seed 3.1 Grusak 2002* ChickpeaCicer arietinum L. n=239 genotypes Seed 2.6 Grusak 2006* Potato Solanum tuberosum L. n=21 genotypes Tubers 1.3 Kärenlampi & White 2009 Wheat Triticum aestivum L. n=1 genotype Sprouts Tap water: 5 High-Mg solution**: 3.5 Pongrac et al. 2016a Tartary buckwheatFagopyrum tataricum (L.) Gaertn. n=1 genotype Sprouts Tap water: 1.2 High-Mg solution**: 0.8 Pongrac et al. 2016a SpinachSpinacia oleracea L. n=327 genotypes Leaves 0.78 Grusak 2003* Cabbage, kale, broccoli, caulif lower, Brussels sproutsBrassica oleracea L. n=260 genotypes Leaves Low-P soil: 0.3 High-P soil: 0.5 Broadley et al. 2008, Broadley et al. 2010 Potato Solanum tuberosum L. n=21 genotypes Leaves 0.5 Kärenlampi & White 2009 *Data for chickpea, pea and spinach genotypes was obtained from the Germplasm Resources Information Net­work (GRIN) website (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/descriptors.aspx?). **High-Mg solution contained 5.6-times greater Mg concentration than tap water. Figure 1. Development of Tartary buckwheat from seed to sprouts. Slika 1. Razvojne faze tatarske ajde - od semena do kalice. Figure 2. Bulk concentrations (mg g-1 dry matter) of magnesium (Mg) and phosphorus (P) in grain and sprouts of Tartary buckwheat and P/Mg concentration ratio (in squares). Shown are means (n=3 for each developmental stage) and standard deviations. Different letters above columns indicate statistical differences for each mineral element separately (Student-New­man-Keuls post-hoc test at p<0.05). Slika 2. Skupne koncentracije (mg g-1 suhe snovi) magnezija (Mg) in fosforja (P) v zrnju in kalicah tatarske ajde in razmerje med koncentracijama P in Mg (podano v kvadratkih na stolpcih). Prikazana so povprečja (n=3 za vsako razvojno fazo) in standardne deviacije. Različne črke nad stolpci predstavljajo statistično značilne razlike za vsak posamezen mineralni element (Student-Newman-Keuls post-hoc test, p<0.05). Figure 3. X-ray f luorescence sum spectrum (66 x 66 pixels) of the cross-sectioned cotyledon of a 8-day-old sprout (Figure 5) recorded at the TwinMic beamline, synchrotron Elettra, Trieste, Italy. Excitation energy was 2200 eV. The spectrum was ex­tracted with PyMCA software (Solé et al. 2007). Characteristic K-lines are shown together with scattering peak. Slika 3. Skupni rentgensko f luorescenčni spekter (vsota intenzitet rentgenskih f luorescenčnih črt na matriki velikosti 66 x 66 slikovnih pik) posnet na prečnem prerezu kličnega lista osem dni stare kalice na žarkovni liniji TwinMic na sinhrotornu Elettra v Trstu, Italija. Vzbujevalna energija je bila 2200 eV. Spekter je bil izrisan s programsko opremo PyMCA (Solé et al. 2007). Prikazani so vrhovi karakterističnih K-črt in sipanje. Figure 4. X-ray imaging of structural make-up (left panels), quantitative distributions of magnesium (Mg) and phosphorus (P) (middle panels) and co-localisation images (right panels) of Tartary buckwheat cotyledons. Representative sample from n=3 for each developmental stage is shown. Structure of cotyledons is indicated with absorption (ABS) and differential phase contrast (DPC) images. In co-localisation images, co-localisation of Mg (shown in green) and P (shown in red) is indicated as yellow (a mix of red and green). Slika 4. Slika anatomskih lastnosti (levi del slike), kvantitativne razporeditve magnezija (Mg) in fosforja (P) (srednji del slike) in kolokalizacije Mg in P (desni del slike) v kličnih listih tatarske ajde. Za vsako razvojno stopnjo je prikazan izbran vzorec izmed treh analiziranih tkivnih rezin. Anatomske lastnosti kotiledona so prikazane na sliki posneti v načinu absorpcije rentgenskih žarkov (ABS) in diferencialnega faznega kontrasta rentgenskih žarkov (DPC). Na kolokalizacijskih slikah je Mg prikazan z zeleno, P pa z rdečo bravo. Njuno mešanje, torej prisotnost obeh mineralnih elementov na posamezni slikovni piki, je prikazano z rumeno barvo. Figure 5. Cotyledon-specific concentrations (mg g-1 dry matter) of magnesium (Mg) and phosphorus (P) in grain and sprouts of Tartary buckwheat and their P/Mg concentration ratio (in squares). Concentrations were extracted from quantitative distribu­tion maps (representative maps are shown in Figure 4) using ImageJ software (Abramoff et al. 2004; Vogel-Mikuš et al. 2014). Means (n=3 for each developmental stage) and standard deviations are shown. Different letters above columns indicate statisti­cal differences for each mineral element separately (Student-Newman-Keuls post-hoc test at p<0.05). Slika 5. Koncentracije (mg g-1 suhe snovi) magnezija (Mg) in fosforja (P) v kličnih listih v zrnu in kalicah tatarske ajde in razmerje koncentracij P in Mg (podano v kvadratkih na stolpcih). Koncentracije so bile pridobljene iz kvantitativnih map razporeditve P in Mg (ena izmed slik je prikazan na Sliki 4) s pomočjo programske opreme ImageJ (Abramoff et al. 2004; Vogel-Mikuš et al. 2014). Prikazana so povprečja (n=3 za vsako razvojno stopnjo) in standardni odkloni. Različne črke nad stolpci predstavljajo statistično značilne razlike za vsak posamezen mineralni element (Student-Newman-Keuls post-hoc test pri p<0.05). SELEN V R ASTLINAH IN V OKOLJU V SLOVENIJI SELENIUM COMPOUNDS IN PLANTS AND IN BIOSPHERE IN SLOVENIA Vida Škrabanja1 Delo je prispelo 27. novembra 2016, sprejeto 31. decembra 2016. Received November 27, 2016; accepted December 31, 2016. iZVleČeK Selen v rastlinah in v okolju v Sloveniji V Sloveniji so tla s selenom revna in je možnost pomanj­kanja selena v prehrani nekaterih skupin prebivalstva (starejši, vegetarijanci) visoka. Gojenje rastlin, obogatenih s selenom, je učinkovit način dodajanja selena v vsakdanjo prehrano tistih, ki tega esencialnega elementa ne prejmejo v zadostnih količinah. S prehranskega vidika so s selenom obogatena živila, predvsem rastlinskega izvora, potencialni vir selena, ki se vnaša v organizme živali in ljudi preko preh­ranske verige in se s kompleksnimi pretvorbami na molekul­skem nivoju pretvarja iz anorganskih v bolj razpoložljive organske oblike. V prispevku so zbrani rezultati raziskovan­ja vsebnosti selena v posameznih rastlinskih vrstah ter različnih načinov sistematičnega dodajanja selena za dosego višje koncentracije le-tega v pridelku. V delu je poudarek na­menjen pregledu objavljenih del domačih strokovnjakov, ki so v Sloveniji raziskovali vsebnost selena in sposobnost nje­gove akumulacije v rastlinah, pri čemer so fiziološke last­nosti in pridelek rastlin dodatno narekovali spremenljivi okoljski dejavniki. Ključne besede: Slovenija, selen, rastlinski viri, prehran­ski vnos, dodatek selena, okolje abStR act Selenium compounds in plants and in biosphere in Slove­nia Selenium occurs ubiquitously in the environment and actively circulates in the biosphere. In Slovenian soil, low concentrations of selenium were detected, and the possibili­ty of selenium deficiency in the diet of certain groups of the population (elder people, vegetarians) is high. From a nutri­tional point of view, the selenium-enriched foods, including foods of plant origin, is a potential source of selenium for humans. Selenium is introduced into the organism of ani­mals and humans via the food chain, and the complex trans­formations at the molecular level translates selenium into more available organic forms. An effective way of adding selenium to the daily diet for those who do not receive this essential element in sufficient quantities is through culti­vated plants enriched with selenium. The article summariz­es the results of a systematic survey of selenium content in various plant species, including different ways of adding se­lenium to achieve a higher concentration of the same in the crops. In part, published works of Slovenian scientists who have studied the selenium content in Slovenian plant sam­ples are reviewed. The impact of various environmental pa­rameters, including selenium fertilization on bioaccumula­tion of the same in plants, on their physiological character­istics and yield is also discussed. Keywords: Slovenia, selenium, plant sources, dietary in­take, selenium supplementation, environment 1 doc.dr., Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana; e-mail: vida.skrabanja@guest.arnes.si 1 UVOD Selen je eden izmed približno 60 esencialnih hranil, potrebnih za človekovo zdravje (Hatfield s sod. 2012). V zadnjih 200 letih od njegova odkritja so stro­kovnjaki temeljito proučevali vlogo selena z biokemij­skega, molekulskega in genetskega zornega kota. Šte­vilne študije obravnavajo vpliv pomanjkanja ali pre­sežka selena v dietah na živalskih modelih ali s klinič­nimi študijami pri ljudeh. Identifikacija in koncentracija določene kemijske oblike, v kateri je selen prisoten, sta ključni za opis mo­lekulskih mehanizmov biološke aktivnosti tega ele­menta in upodobitev/karakterizacijo specifičnih pre­snovnih poti v celicah in tkivih. Omenjeni procesi so predmet medicinskih, fizioloških in prehranskih razi­skav predvsem z vidika: -kroženja in akumulacije selena v okolju, -akumulacije selena v vodnih in gojenih rastlinah, -vloge selena v zdravju in bolezni, -presnove in aktivnosti terapevtskih molekul in na­nodelcev, ki vsebujejo selen, -živil in krmil, obogatenih s selenom in/ali pridoblje­ nih z biotehnološkimi postopki, -biološke uporabnosti in presnove selena v živilih, -onesnaženja okolja in zlasti vodotokov z ostanki pre­ snove selena pri živalih in ljudeh. Primeren prehranski status je nujno potreben za človekovo zdravje, predvsem zaradi njegove vključe­nosti v celično presnovo preko pomembnih fizioloških procesov, kot je sinteza selenocisteina, koencima Q, glutation peroksidaze in tioredoksin reduktaze (Na­varro-Alarcon & Cabrera-Vique 2008, Rahman­to & Davies 2012). Velike koncentracije selena v oko­lju so lahko problematične, selen v prehrani pa je v velikih odmerkih lahko strupen za ljudi. 2 POSLEDICE ODSTOPANJ OD PRIPOROčENIH VREDNOSTI DNEVNEGA VNOSA SELENA S HRANO Selen je esencialni element za mnogo živalskih vrst, tudi za človeka. Aktivnost je odvisna od kemijske obli­ke. Z vgradnjo v različne beljakovine vpliva na rast in razvoj organizma ter je vključen v zaščito tkiv pred oksidativnimi procesi in zaščito pred okužbami. Pre­malo zaužitega selena (manj kot 13 do 19 µg/dan) pri človeku sproži resne posledice in vodi v motnje in bo­lezni, kot so vrtoglavica, slabost, izguba apetita, srčno popuščanje, srčne aritmije in povečanje srca. Bolezen, ki prizadene predvsem otroke in nosečnice, so poime­novali Keshanova bolezen. Druga poznana bolezen, ki je povezana s premajhnim dnevnim vnosom selena, je Kashin Beckova bolezen. To je bolezen povečanih skle­pov oziroma vrsta revmatoidnega stanja-osteoartriti­sa. Posledice bolezni so šibkost udov, okornost, oteka­nje in bolečine v prstnih členkih, povečanje sklepov in atrofija nekaterih progastih mišic. Drugi znaki po­manjkanja selena pri ljudeh so poškodbe srčne mišice, trebušne slinavke, mišična distrofija, izguba lasnega in kožnega pigmenta (R eilly 2006, Hatfield s sod. 2012, Hatfield s sod. 2016). čeprav je v mikro količinah nujno potreben, lahko v visokih koncentracijah škoduje zdravju ljudi. Dolgo­trajna izpostavljenost visokim koncentracijam pri lju­deh (nad 1000 µg/dan) ima genotoksične in kanceroge­ne učinke, pri več kot 3200 µg/dan pa povzroča seleno­zo (R eilly 2006). Toksičnost se v hujših oblikah odra­ža v nenormalnem delovanju živčnega sistema in žlez z notranjim izločanjem (predvsem jetra), v moteni sinte­zi ščitničnih in rastnih hormonov kot tudi v porušeni presnovi inzulinu podobnega rastnega faktorja (Reil­ly 2006). 3 SELEN V OKOLJU V kemijskih lastnostih je selen podoben žveplu (Reil­ly 2006). V okolju je v anorganski obliki (elementarni selen: Se, selenid: Se-, selenit(IV): SeO2-, selenat(VI): 3 SeO2-) in v organski obliki: predvsem kot metilirane selenove spojine, seleno-aminokisline in selenobelja­kovine v bioloških sistemih (Pyrzyńska 2002, Uden s sod. 2004). Shrift (1964) je predstavil obstoj kroženja selena v naravi, Frost (1972) pa dinamično ravnotežje in pretvarjanje med anorganskimi in organskimi obli­kami selena. Količine anorganskih oblik selena so v zemeljski skorji geografsko zelo neenakomerno razporejene in so v koncentracijah od skoraj nič do 1250 mg/kg (Hat­field s sod. 2016). Z izjemo območij, kjer sežigajo fo­silna goriva, kjer je postavljena steklarska industrija ali obsežna proizvodnja kemikalij in elektronike, je vnos selena in s tem vpliv na človekovo zdravje preko inha­lacijskih poti neznaten (Wang & Gao 2001). Povprečna koncentracija selena v zemlji in v tleh je mnogo večja na območjih s sedimentnimi kamenina­mi v primerjavi s tistimi z vulkansko podlago. Podro­čja, kjer je koncentracija selena v tleh zelo visoka, so v delih Wyominga, Severne in Južne Dakote v Ameriki, v nekaterih predelih Kitajske, Rusije, Irske, Kolumbije in Venezuele. Johnson s sod. (2010) poroča o koncen­traciji preko 600 mg v kilogramu črnega skrilavca. Do­ločene rastline lahko iz s selenom zelo bogate podlage akumulirajo tudi do 3 mg tega elementa na gram ra­stline. Take rastline običajno niso okusne in so poten­cialno toksične za pašno živino (Combs 2001), v narav­nem okolju pa visoka koncentracija selena predstavlja zaščito rastlin pred herbivori (Mechora & Ugrino­vić 2015). Dodajanje natrijevega selenita mineralnim gnoji­lom ali živalski krmi je običajna praksa v državah, kjer so tla revna s selenom (Wang s sod. 1998, Watkinson 1983). To velja predvsem za severozahodni Oregon, Finsko, Novo Zelandijo, centralno Srbijo in velik del afriške celine (Ngo s sod. 1997). Pirc & Šajn (1997) navajata vsebnosti selena v tleh v Sloveniji. Po njunih podatkih le-ta znaša od manj kot 0,1 do 0,7 mg/kg, kar pomeni, da so tudi v Sloveniji tla revna s selenom. V isti državi, tak primer je npr. Kitajska ali Avstra­lija, pa se lahko koncentracije selena v tleh tudi regio­nalno zelo razlikujejo. Topne oblike selena v vodi so predvsem anorgan­ski selenat in selenitni ioni. Pitna voda z običajnimi količinami selena le malo doprinese k dnevnemu vnosu (Deveau 2010), pri čemer vrednosti variirajo od 0,12 do 0,44 µg/l (Cutter 1989). Izjeme so zabeležili v ruralnem okolju jugovzhodnega Kolorada zaradi izra­zite suše leta 1975 kot tudi v vodnih izvirih osrednje­-zahodnega dela Združenih držav Amerike, pri čemer so bile vrednosti med 50 in 300 µg/l (Hatfield s sod. 2012). Tudi Vincenti s sod. (2010) navaja, da so v se­verni Italiji leta 1990 ugotovili neobičajno visoke koli­čine selena v vodovodni vodi. V podtalnici ali površin­ski vodi so količine selena lahko zelo variabilne – geo­grafsko pogojene, in sicer od 0,06 do 400 µg/l, v neka­terih primerih celo do 6000 µg/l (Hatfield s sod. 2016). Ameriška regulativa oz. zvezni standardi v pitni vodi dopuščajo koncentracijo do 50 µg/l (Hatfield s sod. 2012, Hatfield s sod. 2016), ki je v primerjavi z Nemčijo (in drugimi evropskimi državami), kjer je zgornja meja v ustekleničeni vodi ali vodovodni vodi le do 10 µg/l, bistveno večja (Hatfield s sod. 2016). Sve­tovna zdravstvena organizacija (WHO) je za selen v pitni vodi določila priporočeno vrednost 10 µg/l, ki je izračunana na 10 % delež vnosa z vodo (NIJZ 2014). V slovenskem Pravilniku o pitni vodi je selen uvrščen v Prilogo I, del B, kjer je določena mejna vrednost v pitni vodi 10 µg/l (Anonymous 2004). Koncentracije v pitni vodi so različne in so geografsko pogojene; koncentra­cije so višje pri nizkem ali visokem pH zaradi večje topnosti v takem okolju (NIJZ 2014). Po objavljenih podatkih (Smrkolj s sod. 2006b) je selen v Ljubljani (odvzem na laboratorijskem polju Biotehniške fakulte­te) v vodovodni vodi pod mejo detekcije, ki je 0.5 µg/l. Posledica industrije in intenzivnega kmetijstva so odpadne vode, ki se stekajo neposredno ali posredno v močvirja, jezera in reke. Ker organizmi v vodnih siste­mih zlahka privzemajo selen, lahko koncentracije le­-tega hitro dosežejo vrednosti, ki so toksične za ribe ter prosto živeče živalske in rastlinske vrste. Pri ribah ve­like koncentracije selena povzročajo poškodbe tkiv, motnje pri razmnoževanju ali celo izumrtje celotne vrste (Lemly & Smith 1987). Zanimiva je študija Pen­glase s sod. (2014), ki so ugotovili, da lahko povečane količine selena v prehrani rib zmanjšajo škodljiv vpliv živega srebra na rast in preživetje odraslih rib, hkrati pa v kombinaciji z živim srebrom sinergistično nega­tivno vplivajo na njihovo razmnoževanje. Znanstveniki in regulatorne oblasti namenjajo ve­liko pozornost selenu kot enemu izmed onesnaževal­cev okolja. Stopnja mobilnosti oziroma hitrost krože­nja selena v ekosistemu v veliki meri določa, ali se bo toksičnost pojavila in koliko časa bo tveganje v okolju trajalo. Ko selen vstopi v ekosistem, ga organizmi zau­žijejo ali absorbirajo, lahko se veže ali kompleksira z drugimi snovmi ali pa ostane prosto raztopljen v vodi. Vodni organizmi so sposobni akumulirati selen v kon­centracijah, ki so bistveno večje kot v njihovem okolju ali hrani. Bioakumulacija v takem obsegu je možna predvsem zato, ker je selen kemijsko podoben žveplu in ker je esencialno mikrohranilo. Ta sposobnost je morda najpomembnejši dejavnik pri kroženju selena v vodnem okolju (Lemly 1997). Pomembnejše raziskave glede odziva različnih makrofitov oziroma vodnih or­ganizmov (navadni rogolist Ceratophyllum demersum, klasasti rmanec Myriophyllum spicatum, preraslolistni dristavec Potamogeton perfoliatus, vodni jetičnik Vero­nica anagallis-aquatica, vodni mah Fontinalis anti­pyretica, mala vodna leča Lemna minor L., ozkolistni koščec Berula erecta) so objavili v mnogih delih slo­venski avtorji (Mechora s sod. 2011, Mechora s sod. 2012b, Mechora & Vrhovšek 2012, Mechora s sod. 2013, Mechora s sod. 2014a, Mechora s sod. 2015, Mechora & Kanduč 2016, Mechora s sod. 2016). V morski vodi zasledimo selen v manjših količi­nah (od 0,09 do 0,11 µg/l). Živa bitja, vključno s proka­riontskimi celicami, z algami, morsko travo, nevreten-človek vnese v telo preko prehranske verige (Hatfield čarji in vretenčarji, so sposobni ta mineral akumulira-s sod. 2012). ti. Tako so tudi ti organizmi vir selena za človeka, ki ga 4 SELEN V GOJENIH R ASTLINAH Absolutne vrednosti koncentracij selena so v rastlinah lahko zelo variabilne. Wolf & Goldschmidt (2007) sta raziskovala vsebnost selena v vzorcih pšenic. Ugo­tovila sta, da je prevladujoča oblika selena v pšenici selenometionin (okrog 55%), v znatnih količinah (do 20%) pa je tudi selenocisteina in selenita/selenata. Po­memben zaključek iz analiz je, da je skupna vrednost selena zaradi geografskih razlik ali načina gnojenja va­riirala kar za faktor 500, delež selenometionina pa je v vseh primerih ostajal konstanten, t.j. okrog 55% glede na skupno vrednost selena. Avtorja nakazujeta, da so v rastlinah mehanizmi, ki regulirajo tip in količino do­ločene kemijske oblike selena. Biološka uporabnost ali biorazpoložljivost pove, kolikšen delež hranila pride v krvni obtok. Biorazpolo­žljivost selena je v korelaciji z virom in kemijsko obli­ko, v kateri je ta prisoten v živilu (Finley 2006, Ree­ves s sod. 2005). Razmere v okolju in kmetijska praksa zelo vplivajo na vsebnost selena pri mnogih rastlinah. Gojenje rastlin, obogatenih s selenom, je učinkovit način dodajanja selena v vsakdanjo prehrano tistih, ki tega esencialnega elementa ne prejmejo v zadostnih količinah. Wang s sod. (1995) ugotavljajo, da se je za­radi rednega dodajanja natrijevega selenata gnojilu v koncentraciji 16 mg/kg za pridelavo žit in 6 mg/kg za pridelavo krme dnevni vnos selena pri Fincih povečal z 39 na 110 µg na dan. Pregled elementov v sledovih (Se, Zn, Fe, Co, Ni, Rb, Sb, Ag, Hg, Cr, Sn) in njihovo razporeditev v rastli­nah in mlevskih frakcijah navadne (Fagopyrum escu­lentum Moench) in tatarske ajde (Fagopyrum tatari­cum Gaertn.) so objavili Bonafaccia s sod. (2003). Številne raziskave o količini selena pri navadni in ta­tarski ajdi kažejo na sposobnost teh rastlin za akumu­lacijo selena kot tudi vpliv le-tega v kombinaciji z neka­terimi drugimi okoljskimi dejavniki na biokemijske procese v rastlini. O povišani vsebnosti selena v rastli­nah ajde, zraslih na tleh, ki so bila pognojena z različ­nimi koncentracijami vodnih raztopin natrijevega se­lenata, poročajo Golob s sod. (2015). Večji vpliv do­datka selena in možnost vzgoje ajde v smislu varnega funkcionalnega živila se je izkazal pri tatarski ajdi. Tudi z listnim škropljenjem oz. dodajanjem selena v obliki natrijevega selenata različnih koncentracij v času cvetenja se je koncentracija selena v različnih delih ajde povečala, v največji meri v zrnju (Vogrinčič s sod. 2009, Stibilj s sod. 2004, Golob s sod. 2016c), glede na vrsto pa v tatarski ajdi (Golob s sod. 2015). O večji koncentraciji selena v potomkah rastlin tatarske ajde, ki je bila v prvi generaciji škropljena z natrijevim selenatom, poročajo Golob s sod. (2016a). Listno škropljenje v času cvetenja ajde v kombina­ciji s posnemanjem sprememb različnih okoljskih de­javnikov, kot je pomanjkanje vode, obsevanje rastlin z UV-B žarki ali sočasno listno škropljenje z natrijevim sulfatom, je vplivalo tako na vsebnost selena v rastli­nah kot tudi na presnovne procese v rastlinah (Smr­kolj s sod. 2006b, Kreft s sod. 2013) in posledično na biomaso (Breznik s sod. 2005, Tadina s sod. 2007, Golob s sod. 2016b). Tretji način za obogatitev rastlin ajde s selenom, opisan v literaturi, je z namakanjem semen pred setvi­jo v različnih koncentracijah natrijevega selenata­-Se(VI), natrijevega selenita-Se(IV) in selenometioni­na-SeMet. Privzem selena je odvisen od kemijske obli­ke selena in koncentracije v raztopini. Glede na obliko selena si rezultati za privzem selena sledijo v vrstnem redu: Se(VI) > SeMet > Se(IV) (Ožbolt s sod. 2008, Cuderman s sod. 2010). Vpliv dodanega selena na fiziološke lastnosti in pridelek z vidika spremenjenih presnovnih procesov, kot so fotokemična učinkovitost fotosistema II in re­spiratorni potencial, so Germ s sod. (2014) raziskovali pri fižolu, Smrkolj s sod. (2006a) pri grahu, Germ s sod. (2007) pri radiču, Germ & Osvald (2007) v ruko­li, Germ s sod. (2007) pri krompirju, Stibilj s sod. (2004), Smrkolj s sod. (2005b) ter Germ s sod. (2005) pri bučah, Mechora s sod. (2011), Mechora s sod. (2012a) ter Mechora s sod. (2014b) pri rdečem zelju. S prehranskega vidika so vsa ta živila potencialni vir se­lena, ki se vnaša v organizem preko prehranske verige in se s kompleksnimi pretvorbami na molekulskem ni­voju pretvarja iz anorganskih v organske oblike. Enako, kot v že omenjeni študiji Wolfa & Gold­schmidta (2007), ki sta pri pšenici ugotovila, da je prevladujoča oblika selena selenometionin, potrjujejo tudi raziskave v različno tretiranih vzorcih ajde (93% -Smrkolj s sod. 2006b), buč (81% - Smrkolj s sod., 2005b), ječmena in rži (70-83% - Stadlober s sod. 2001). Sadje in zelenjava, pridelana na podlagi z nizko vsebnostjo selena, vsebujeta le neznatne količine sele­na, npr. paradižnik vsebuje manj kot 0,1 µg/100 g tega elementa, šparglji 2,3 µg/100 g in limski fižol 7,2 µg/100 g. Nekatere rastline so sposobne akumulirati selen. Edmonds & Morita (2000) sta pri čebuli, divjem poru, česnu in brokoliju določila kar 50-kratno večjo vsebnost selena v rastlinah, gojenih na podlagi, oboga­teni s selenom. Fox s sod. (2005) poročajo o visokih koncentracijah selena v česnu, ki je po njihovih anali­zah znašala kar 1355 µg/100 g. Različni viri (Hatfield s sod. 2012) navajajo, da lahko prevladujočo obliko selena, ki je selenometionin, zamenja višja koncentracija selen-metilselenocisteina in .-glutamil-selen-metilselenocisteina. Več kot 40% selen-metilselenocisteina zasledimo v brokoliju. Med rastlinskimi viri, ki lahko akumulirajo večje količine selena, so še različne vrste alg, križnice (družina Bras­sica) in brazilski oreščki. Ti vsebujejo kar 1470-1917 µg/100 g, pri čemer je večina v obliki selenometionina. Glive, kot so gobe in kvasovke, lahko selen akumulira­jo v večjih količinah in v več kot 20 različnih seleno­-spojinah, anorganskih ali organskih, kot so npr. sele­nocistein, selenometionin, selen-metilselenocistein in selen-adenozilselenohomocistein. Vsebnost selena v krmi in travi je odvisna od koli­čine selena v zemlji, ta pa v nadaljevanju določa razlike v koncentracijah selena v mesu živali. Selen, ki ga preko rastlinske krme zaužije živina, v veliki meri vpliva na rast, prirejo in zdravje živali. Dostopnost se­lena v zadostnih količinah v prehrani živine zagotavlja normalno delovanje njihovega imunskega sistema in reprodukcije. Večje vsebnosti selena v krmi posredno vplivajo tudi na večje koncentracije le-tega v mleku in mesu, ki ga zaužije človek (Mehdi & Dufrasne 2016). Vpliv dodanega selena v krmo na vsebnost selena v mesu so proučevali Smrkolj s sod. (2003). Krmni obrok je vseboval različne količine selena (0,4 mg Se/ dan oz. 4,4 mg Se/dan). Ob manjšem dodatku selena h krmi so določili od 3,3 do 3,9 µg selena in od 13 do 15 µg selena (v obeh primerih merjeno na 100 g svežega vzorca), ko je bila krma bogatejša s selenom. Smrkolj s sod. (2005a) so ugotavljali tudi vsebnost selena v ribah, kjer ga je 15,3-68,6 µg/100 g, v piščan­čjem mesu 9,7-15,4 µg/100 g in v puranjem mesu 9,9­11,6 µg/100 g. Jajca v povprečju vsebujejo 26 µg selena v 100 g vzorca. Z dodatkom selena h krmni mešanici za koko­ši je možno vsebnost selenometionina in selenocisteina v jajcih močno povečati (Sun & Fen 2011). 5 POVZETEK Rezultati številnih raziskav potrjujejo, da je selen esen­cialni element v sledovih, ki je navzoč praktično pov­sod v okolju, vendar v različnih količinah glede na ge­ografsko območje. Znanstvene objave, vključene v tem pregledu, kažejo na velik napredek v znanju in razu­mevanju biološke vloge selena in njegove pomembno­sti v prehrani človeka. Selen vstopa v prehransko veri­go iz zemlje, posledično vpliva na rast rastlin ter s tem tudi na kakovost rastlinskih in živalskih pridelkov. Znanih je več načinov, kako učinkovito obogatiti pre­hranske vire s selenom, pri čemer je zaradi ozke meje med prenizkim in previsokim vnosom selena potrebna skrajna previdnost. 6 SUMMARy Selenium is considered as an essential trace element and has been found in different environmental com­partments. Geographically, it is unevenly distributed and concentrations of the selenium both within and between countries may vary significantly. Scientific publications reviewed in this paper indicate a conside­rable progress in the knowledge and understanding of the biological role of selenium in plants and its close relation with human health. Diet is the major source of selenium for humans and the intake of this essential element depends on its concentration in food and amount of food consumed. Selenium distribution and availability in plants, their growth and thereby also the quality of the crop and livestock products are directly affected by selenium levels in the soil. There are several ways how to enrich the nutritional sources of seleni­um, whereby due to the narrow concentration range between essentiality and toxicity of selenium extreme caution is needed. 7 LITER ATUR A - REFERENCES Anonymous, 2004: Pravilnik o pitni vodi. Uradni list RS 19/2004. Bonafaccia, G., L. Gambelli, N. Fabjan & I. Kreft, 2003: Trace elements in f lour and bran from common and tartary buckwheat. Food Chemistry (Amsterdam) 83 (1): 1-5. Breznik, B., M. Germ, A. Gaberščik & I. Kreft, 2005: Combined effects of elevated UV-B radiation and the ad­dition of selenium on common (Fagopyrum esculentum Moench) and tartary [Fagopyrum tataricum (L.) Gaer­tn.] buckwheat. Photosynthetica (Praga) 43 (4): 583-589. Combs, G. F., 2001: Selenium in global food systems. British Journal of Nutrition (Cambridge) 85 (5): 517-547. Cuderman, P., L. Ožbolt, I. Kreft & V. Stibilj, 2010: Extraction of Se species in buckwheat sprouts grown from seeds soaked in various Se solutions. Food Chemistry (Amsterdam) 123 (3): 941-948. Cutter, G. A., 1989: Freshwater systems. V: Ihnat, M. (ur.): Occurrence and Distribution of Selenium. FL: CRC Press Inc. (Boca Raton): 243-262. Deveau, M., 2010: Contribution of drinking water to dietary requirements of essential metals. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. (London) 73 (2): 235-241. Edmonds, J. S. & M. Morita, 2000: The identification of selenium species in biological samples. Applied Organo­metallic Chemistry (Berlin) 14 (3): 133-145. Finley, J. W., 2006: Bioavailability of selenium from foods. Nutrition Reviews (Oxford) 64 (3): 146-151. Fox, T. E., C. Atherton, J. R. Dainty, D. J. Lewis, N. J. Langford, M. J. Baxter, H. M. Crews & S. J. Fairwe­ather-Tait, 2005: Absorption of selenium from wheat, garlic, and cod intrinsically labeled with Se-77 and Se-82 stable isotopes. International Journal for Vitamin and Nutrition Research (Boston) 75 (3): 179-186. Frost, D. V., 1972: The two faces of selenium – can selenophobia be cured? CRC Critical Reviews in Toxicology (Berlin) 1 (4): 467-514. Germ, M., I. Kreft & J. Osvald, 2005: Inf luence of UV-B exclusion and selenium treatment on photochemical effi­ciency of photosystem II, yield and respiratory potential in pumpkins (Cucurbita pepo L.). Plant Physiology and Biochemistry (Amsterdam) 43: 445-448. Germ, M., I. Kreft, V. Stibilj & J. Osvald, 2014: The effect of selenium on yield and primary terminal electron transport system activity in two cultivars of bean plants Phaseolus vulgaris. Acta Biologica Slovenica (Ljubljana) 57 (2): 3-12. Germ, M., I. Kreft, V. Stibilj & O. Urbanc-Berčič, 2007: Combined effects of selenium and drought on photo­synthesis and mitochondrial respiration in potato. Plant Physiology and Biochemistry (Amsterdam) 45: 162­ 167. Germ, M. & J. Osvald, 2005: Selenium treatment affected respiratory potential in Eruca sativa. Acta Agriculturae Slovenica (Ljubljana) 85 (2): 329-335. Germ, M., V. Stibilj, J. Osvald & I. Kreft, 2007: Effect of selenium foliar application on chicory (Cichorium inty­bus L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry (München) 55 (3): 795-798. Golob, A., M. Germ, I. Kreft, I. Zelnik, U. Kristan & V. Stibilj, 2016a: Selenium uptake and Se compounds in Se-treated buckwheat. Acta Botanica Croatica (Zagreb) 75 (1): 17-24. Golob, A., D. Gadžo, V. Stibilj, M. Djikić, T. Gavrić & M. Germ, 2016b: Addition of Se affected concentration of Se in the second generation of tartary buckwheat plants. Folia Biologica et Geologica (Ljubljana) 57 (1): 87-92. Golob, A., D. Gadžo, V. Stibilj, M. Djikić, T. Gavrić, I. Kreft & M. Germ, 2016c: Sulphur interferes with sele­nium accumulation in tartary buckwheat plants. Plant Physiology and Biochemistry (Amsterdam) 108: 32-36. Golob, A., V. Stibilj, I. Kreft & M. Germ, 2015: The feasibility of using tartary buckwheat as Se-containing food material. Journal of Chemistry (Hindawi) (Online): 1-4. Hatfield, D. L. (ur.), M. J. Berry (ur.) & N. V. Gladyshev (ur.), 2012: Selenium: Its Molecular Biology and Role in Human Health. 3. izdaja. New york. Hatfield, D. L. (ur.), U. Schweizer (ur.), P. A. Tsuji (ur.) & N. V. Gladyshev (ur.), 2016: Selenium: Its Molecular Biology and Role in Human Health. 4. izdaja. New york. Johnson, C. C., F. M. Fordyce & M. P. Rayman, 2010: Symposium on »Geographical and geological inf luences on nutrition«: Factors controlling the distribution of selenium in the environment and their impact on health and nutrition. Proceedings of the Nutrition Society (Cambridge) 69 (1): 119-132. Kreft, I., Š. Mechora, M. Germ & V. Stibilj, 2013: Impact of selenium on mitochondrial activity in young tartary buckwheat plants. Plant Physiology and Biochemistry (Amsterdam) 63: 196-199. Kroflič, A., M. Germ, Š. Mechora & V. Stibilj, 2016a: Selenium and its compounds in aquatic plant Veronica anagallis-aquatica. Chemosphere (Oxford) 151: 296-302. Lemly, A. D., 1997: Environmental implications of excessive selenium: A review. Biomedical and Environmental Sciences (Duluth) 10: 415-435. Lemly, A. D. & G. J. Smith, 1987: Aquatic cycling of selenium: Implications for fish and wildlife. Fish and Wildlife Leaf let (Washington) 12: 1-10. Mechora, Š., P. Cuderman, V. Stibilj & M. Germ, 2011: Distribution of Se and its species in Myriophyllum spica­tum and Ceratophyllum demersum growing in water containing Se (VI). Chemosphere (Amsterdam) 84 (11) 1636-1641. Mechora, Š., M. Germ & V. Stibilj, 2012a: Selenium compounds in selenium-enriched cabbage. Pure and Applied Chemistry (Durham) 84 (2) 259-268. Mechora, Š., M. Germ & V. Stibilj, 2012b: Selenium and its species in the aquatic moss Fontinalis antipyreti­ca. Science of the Total Environment (Amsterdam) 438: 122-126. Mechora, Š., M. Germ & V. Stibilj, 2014a: Monitoring of selenium in macrophytes : the case of Slovenia. Chemo­sphere (Amsterdam) 111: 464-470. Mechora, Š. & T. Kanduč, 2016: Environmental assessment of freshwater ecosystems of the Sava River watershed and Cerkniško Lake, Slovenia, using the bioindicator species Fontinalis antipyretica : insights from stable isoto­pes and selected elements. Isotopes in Environmental and Health Studies (London) 52 (3) 239-257. Mechora, Š., M. Sotler, A. Urbanek Krajnc & J. Ambrožič-Dolinšek, 2016: How selenium affects Berula erecta. Water, Air and Soil pollution (Dunaj) 227 (12): 1-12. Mechora, Š., V. Stibilj & M. Germ, 2013: The uptake and distribution of selenium in three aquatic plants grown in Se(IV) solution. Aquatic Toxicology (Amsterdam) 128/129: 53-59. Mechora, Š., V. Stibilj & M. Germ, 2015: Response of duckweed to various concentrations of selenite. Environ­mental science and pollution research international (Dunaj) 22 (4): 2416-2422. Mechora, Š., V. Stibilj, I. Kreft & M. Germ, 2014b: The physiology and biochemical tolerance of cabbage to Se (VI) addition to the soil and by foliar spraying. Journal of Plant Nutrition (London) 37 (13) 2157-2169. Mechora, Š., V. Stibilj, T. Radešček, A. Gaberščik & M. Germ, 2011: Impact of Se (VI) fertilization on Se con­centration in different parts of red cabbage plants. International Journal of Food, Agriculture & Environment – JFAE (Helsinki) 9 (2) 357-361. Mechora, Š. & K. Ugrinović, 2015: Can plant – herbivore interaction be affected by selenium? Austin Journal of Environmnental Toxicology (Jersey City) 1 (1) 1-5. Mechora, Š. & M. Vrhovšek, 2012: Response of two submersed macrophytes Ceratophyllum demersum and Myri­ophyllum spicatum to selenium in water = Odziv dveh potopljenih vrst makrofitov Ceratophyllum demersum in Myriophyllum spicatum na selen v vodi. Acta Biologica Slovenica (Ljubljana) 55 (1) 9-14. Mehdi, y. & I. Dufrasne, 2016: Selenium in cattle: A review. Molecules (Basel) 21 (4): 1-14. Navarro-Alarcon, M. & C. Cabrera-Vique, 2008: Selenium in food and the human body: A review. Science of the Total Environment (Amsterdam) 400 (1-3): 115-141. Ngo, D. B., L. Dikassa, W. Okitolonda, T. D. Kashala, C. Gervy, J. Dumont, N. Vanovervelt, B. Contem­pré, A. T. Diplock, S. Peach & J. Vanderpas, 1997: Selenium status in relation to iodine deficiency. Tropical Medicine and International Health (Chichester) 2 (6): 572-581. NIJZ. Opisi kemijskih parametrov, ki jih najdemo v pitni vodi, 2014: Nacionalni inštitut za javno zdravje. Ljubljana. Ožbolt, L., S. Kreft, I. Kreft, M. Germ & V. Stibilj, 2008: Distribution of selenium and phenolics in buckwheat plants grown from seeds soaked in Se solution and under different levels of UV-B radiation. Food Chemistry (Amsterdam) 110 (3): 691-696. Penglase, S., K. Hamre & S. Ellingsen, 2014: Selenium and mercury have a synergistic negative effect on fish re­production. Aquatic Toxicology (Amsterdam) 149: 16-24. Pirc, S. & R. Šajn, 1997: Vloga geokemije v ugotavljanju kemične obremenitve okolja. V: A. Lah (ur.), Kemizacija okolja in življenja - do katere meje? Projekt evropskega leta varstva narave 1995. Slovensko ekološko društvo (Ljubljana): 165-186. Pyrzyńska, K., 2002: Determination of selenium species in environmental samples. Microchimica Acta (Dunaj) 140 (1): 55-62. Rahmanto, A. S. & M. J. Davies, 2012: Selenium-containing amino acids as direct and indirect antioxidants. IUBMB Life (Hoboken) 64 (11): 863-871. Reeves, P. G., P. D. Leary, B. R. Gregoire, J. W. Finley, J. E. Lindlauf & L. K. Johnson, 2005: Selenium bioa­vailability from buckwheat bran in rats fed a modified AIN-93G torula yeast-based diet. The Journal of Nutri­tion (Rockville) 135 (11): 2627-2633. R eilly, C., 2006: Selenium in food and health. 2. izdaja. New york. Shrift, A., 1964: A selenium cycle in nature. Nature (London) 201 (492): 1304-1305. Smrkolj, P., L. Pograjc, C. Hlastan-Ribič & V. Stibilj, 2005: Selenium content in selected Slovenian foodstuffs and estimated daily intakes of selenium. Food Chemistry (Amsterdam) 90 (4): 691-697. Smrkolj, P., V. Stibilj, I. Kreft & M. Germ, 2006a: Selenium species in buckwheat cultivated with foliar addition of Se(VI) and various levels of UV-B radiation. Food Chemistry (Amsterdam) 96 (4): 675-681. Smrkolj, P., M. Germ, I. Kreft & V. Stibilj, 2006b: Respiratory potential and Se compounds in pea (Pisum sativum L.) plants grown from Se-enriched seeds. Journal of Experimental Botany (Oxford) 57 (14): 3595-3600. Smrkolj, P., V. Stibilj, I. Kreft & E. Kapolna, 2005: Selenium species determination in selenium-enriched pump­kin (Cucurbita pepo L.) seeds by HPLC-UV-HG-AFS. Analytical Sciences (Tokio) 21 (12): 1501-1504. Smrkolj, P., S. Žgur & V. Stibilj, 2003: Selen v govejem mesu izbranih pasem. Meso in mesnine (Slovenj Gradec) 4: 5-8. Stadlober, M., M. Sager & K. J. Irgolic, 2001: Effects of selenate supplemented fertilisation on the selenium level of cereals - identification and quantification of selenium compounds by HPLC-ICP-MS. Food Chemistry (Am­sterdam) 73 (3): 357-366. Stibilj, V., I. Kreft, P. Smrkolj & J. Osvald, 2004: Enhanced selenium content in buckwheat (Fagopyrum esculen­tum Moench) and pumpkin (Cucurbita pepo L.) seeds by foliar fertilisation. European Food Research and Tech­nology (Heidelberg) 219 (2): 142-144. Sun, H. & B. Feng, 2011: Speciation of organic and inorganic selenium in selenium-enriched eggs by hydride genera­tion atomic f luorescence spectrometry. Food Analytical Methods (New york) 4 (2): 240-244. Tadina, N., M. Germ, I. Kreft, B. Breznik & A. Gaberščik, 2005: Effect of water deficit and selenium on common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) plants. Photosynthetica (Praga) 45 (3): 472-476. Uden, P. C., H. T. Boakye, C. Kahakachchi & J. F. Tyson, 2004: Selective detection and identification of Se con­taining compounds -review and recent developments. Journal of Chromatography (Amsterdam) 1050 (1): 85-93. Vincenti, M., F. Bonvicini, M. Bergomi & C. Malagoli, 2010: Possible involvement of overexposure to enviro­nmental selenium in the etiology of amyotrophic lateral sclerosis: a short review. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita (Rim) 46: 279-283. Vogrinčič, M., P. Cuderman, I. Kreft & V. Stibilj, 2009: Selenium and its species distribution in above-ground plant parts of selenium enriched buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). Analytical Sciences (Tokio) 25 (11): 1357-1363. Wang, Z. J. & y. X. Gao, 2001: Biogeochemical cycling of selenium in Chinese environments. Applied Geochemistry (Amsterdam) 16 (11-12): 1345-1351. Wang, W. C., A. L. Mäkelä, V. Näntö, P. Mäkelä & H. Lagström, 1998: The serum selenium concentrations in children and young adults: a long-term study during the Finnish selenium fertilization programme. European Jornal of Clinical Nutrition (London) 52 (7): 529-535. Wang, W. C., V. Näntö, A. L. Mäkelä & P. Mäkelä, 1995: Ef fect of nationwide selenium supplementation in Finland on selenium status in children with juvenile rheumatoid arthritis. A ten-year follow-up study. Analyst (London) 120 (3): 955-958. Watkinson, J. H., 1983: Prevention of selenium deficiency in grazing animals by annual topdressing of pasture with sodium selenate. The New Zealand Veterinary Journal (Wellington) 31 (5): 78-85. Wolf, W. R. & R. J. Goldschmidt, 2007: Updated estimates of the selenomethionine content of NIST wheat referen­ce materials by GC-IDMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry (Dunaj) 387 (7): 2449-2452. UPORABA DVO-FOTONSKEGA KONFOKALNEGA MIKROSKOPA ZA R AZISKOVANJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI EKTOMIKORIZNIH GLIV IN ANALIZA SLIK S PROGR AMOM ImageJ USE OF TWO-CONFOCAL MyCROSCOPy FOR R ESEARCH OF ENZyMATIC ACTIVITy OF ECTOMyCORRHIZAL FUNGI AND IMAGE ANALySIS WITH ImageJ PROGR AM Ines Štraus1*, Marko Kreft2 & Hojka Kraigher1 Delo je prispelo 27. decembra 2016, sprejeto 31. decembra 2016. Received December 27, 2016; accepted December 31, 2016. iZVleČeK Uporaba dvo­fotonskega konfokalnega mikroskopa za raziskovanje encimske aktivnosti ektomikoriznih gliv in analiza slik s programom imageJ Simbioza med ektomikoriznimi glivami in gozdnimi drevesi prispeva k rasti dreves in delovanju ekosistema. Ek­tomikorizne glive so razvile visoko diferencirane strukture, ki omogočajo različne načine privzemanja hranilnih snovi in transport le teh do korenin. Aktivnost fosfataz v mikoriznih glivah omogoča dostopnost fosfatnih spojin v tleh, do katerih rastline sicer nimajo dostopa. V raziskavi smo analizirali aktivnost na površino hif vezane fosfataze (SBP) mikoriznih gliv pri sadikah bukve (Fagus sylvatica L.) in predstavili metodo za zajemanje in analizo slik fosfatazne aktivnosti. Uporabili smo dvofotonski konfokalni laserski mikroskop LSM 7 MP, ki omogoča zajemanje slik od površine mikoriznega plašča skozi mikorizni plašč vse do površine koreninskih celic. Koreninske vršičke smo obar­vali s komercialnim barvilom ELF® 97. Slike smo analizirali s prosto dostopnim programom ImageJ. V članku smo pod­robno opisali postopek analize in predstavili prednosti in slabosti izbrane metode. Ključne besede: na površino vezana fosfataza, eksplo­racijski tipi, fosfat, ELF® 97, bukev abStR act Use of two­confocal mycroscopy for research of en­zymatic activity of ectomycorrhizal fungi and image analysis with imageJ program The ectomycorrhizal symbiosis of forest trees contrib­utes to the function of ecosystem and tree growth. The sym­biotic organs of ectomycorrhiza (ECM) are highly differenti­ated structures differing in nutrient uptake, transfer capaci­ties and ability to promote tree growth. In the present study surface-bound phosphatase activity (SBP) was analyzed on ectomycorrhiza of beech seedlings (Fagus sylvatica L.). The method for images acquisition and their analysis was dis­cussed. Two-photon confocal laser scanning microscope LSM 7 MP was used to study spatial distribution of SBP en­zymatic activity in various thicknesses of ECM mantle in intact (non-sectioned) ECM root tips. ELF® 97 was used for staining phosphatase enzymes. Images were analyzed using the freely available program ImageJ. In this article, we de­scribe in detail the analysis procedure and the advantages and disadvantages of the method. Key words: surface-bound phosphatase, exploration types, phosphate, ELF® 97, beech 1 Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, & Inštitut za patofiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenia; Celica Biomedical, Tehnološki park 24, 1000 Ljubljana, Slovenia * ines.straus@gozdis.si 1 UVOD Encimska aktivnost ektomikoriznih gliv (ECM) in nji­hovega zunaj koreninskega micelija ima pomembno vlogo pri prenosu hranil iz gozdnih tal in listnega opada do rastline. Encimi, ki jih glive sproščajo v oko­lico, omogočajo razgradnjo snovi, ki so vezane v tleh in rastlinam nedostopne (Kjoller & Struwe 2002). V gozdnih ekosistemih imajo glive ključno vlogo pri obratu, preperevanju in mineralizaciji ogljika, dušika, fosforja in drugih snovi, ki jih pretvorijo v obliko, ki je zopet dostopna rastlinam in drugi talni mikrof lori (Ekblad s sod. 2013, Wallander s sod. 2013). Za opazovanje encimske aktivnosti lahko izbira­mo med nedestruktivnimi in destruktivnimi metoda­mi. Nedestruktivne metode temeljijo na opazovanju encimske aktivnosti pri živih celicah. Navadno te me­tode ne vključujejo barvanja, za opazovanje pa izbere­mo svetlobni mikroskop (arbuskularna mikoriza), epi­f luorescenčni mikroskop (avtof luorescenca) (Vier­heilig, Schweiger & Brundrett 2005) ali konfokal­ni laserski mikroskop (Schweiger s sod. 2002). De­struktivne metode zajemajo dva tipa barvanj: vitalna barvanja, kjer opazovanje aktivnosti encimov temelji na metabolno aktivnem miceliju gliv in nevitalna bar­vanja, kjer tehnike barvanja obarvajo tako vitalen kot odmrl mikorizni micelij (Vierheilig, Schweiger & Brundrett 2005). Nedestruktivne metode so nava­dno bolj v uporabi pri arbuskularni mikorizi, kjer so korenine neobarvane in ni potrebno predhodno raz­barvanje, medtem ko je primarna skorja in plašč ekto­mikoriznih korenin naravno obarvan, kar zahteva predhodno razbarvanje korenin (Vierheilig, Schwe­iger & Brundrett 2005). Pritsch s sodelavci (2004) so razvili avtomatizirano metodo z mikrotitrskimi ploščami, ki omogoča merjenje encimske aktivnosti fosfataze, hitinaze in ß-glukozidaze s spektrofotome­trom (oz. čitalcem mikrotitrskih plošč). V članku bomo predstavili uporabo dvofotonskega konfokalnega laserskega mikroskopa LSM 7 MP, ki omogoča opazovanje debelih preparatov ektomikori­znih korenin, brez predhodne priprave rezin in analizo slik s programom ImageJ ter prednosti oziroma slabo­sti omenjene metode. Opazovali smo aktivnost na po­vršino vezane fosfomonoesteraze (angl. surface bound phosphatase – SBP) pri različnih morfotipih ektomiko­riznih gliv. Fosfomonoesteraze so encimi, ki razgraju­jejo različne substrate v tleh, kot so inozitol fosfat, po­lifosfati, mononukleotidi in fosforilirani sladkorji. Glede na optimum pH fosfomonoesteraz ločimo kisle in alkalne fosfataze (Criquet s sod. 2004). Aktivnost kisle fosfataze, ki smo jo preučevali, temelji na hidroli­zi p-nitrofenil fosfata (pNPP) v p-nitrofenol fosfat (pNP) in fosfat (P) (Alvarez s sod. 2004). 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Vzorčenje in priprava vzorca za mik­roskopiranje Za mikroskopiranje smo pripravili sveže vzorce miko­riznih kratkih korenin. Vzorčili smo iz rizotronov (Slika 1), lončnih poskusov ali iz narave. Mikorizne kratke korenine smo odrezali s škarjami in jih prenesli v petrijevke z vodo. S korenin smo s pomočjo čopiča odstranili substrat in jih pripravili za barvanje. Za vsak vzorec smo pripravili po tri mikorizne kratke ko­renine dolžine 3 do 4 mm. Protokol za pripravo mikoriznih preparatov smo prilagodili po Alvarez s sodelavci (2004). Za pripravo preparata smo uporabili fosfatazni substrat ELF® 97 (Molecular Probes, Inc., USA) za barvanje in citrat fos­fatni pufer za spiranje korenin po barvanju. Citrat fos­fatni pufer smo pripravili z mešanjem 3,025 g/l Tris­-(hidroksimetil)-aminometana, 2,9 g/l maleinske ki­sline, 3,5 g/l citronske kisline, 1,57 g/l borove kisline in 1 M NaOH. Pufer smo s pomočjo 1 M HCl umerili na pH 5. Raztopino ELF® 97 smo redčili s citrat fosfatnim pufrom v razmerju 10:2 v/v (pufer/ELF® 97) 2.2 barvanje mikoriznih korenin z raztopino elF® 97 Za vsak tip ektomikorize smo barvali po tri kratke ko­renine (Slika 1). Za analize encimske aktivnosti fosfa­taze pri glivah (Alvarez s sod. 2004) je v uporabi ko­mercialni kit ELF® 97 (Johnson & Spence 2010). Kit vsebuje topni substrat, ki ob prisotnosti delovanja fos­fataze f luorescira. Prednost ELF® 97 je ta, da je razlika med vrhovoma ekscitacijske in emisijske valovne dol­žine približno 200 nm, kar omogoča, da lahko signal, ki nastane kot posledica delovanja encimov, jasno loči­mo od signala, ki nastane kot posledica avtof luore­scence mikoriznega micelija (Johnson & Spence 2010). Očiščene mikorizne korenine smo prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirke in dodali 44 µl raztopine ELF® Slika 1: 1-vzorčenje ECM korenin iz rizotrona; 2-priprava ECM korenin za barvanje; 3-barvanje ECM korenin z ELF® 97 za 15 minut, spiranje s citrat fosfatnim pufrom, da zaustavimo encimatsko reakcijo in prenos obarvanih koreninskih vršičkov na objektno stekelce, kjer smo jih pokrili s krovnim stekelcem in zalepili z voskom Figure 1: 1-ECM roots tips were sampled from rhizotron; 2- ECM roots tips were prepared for staining; 3-ECM root tips were stained using ELF® 97 staining, after 15 minutes incubation they were rinsed with citrate-phosphate buffer solution in order to stop the enzymatic reaction and transferred to object slides and sealed with cover slides and wax 97 (pH=5), 5x redčitev. Korenine smo barvali 15 minut, nato smo jih previdno prenesli v nove 1,5 µl mikrocen­trifugirke, ter jih sprali s 100 µl citrat fosfatnega pufra (pH=5). Obarvane mikorizne korenine smo po spira­nju prenesli na objektna stekelca s pufrom, na katera smo v obliki kroga nakapljali stopljen vosek v debelini mikoriznih korenin. Na korenine smo položili krovna stekelca in jih dodatno zalepili s stopljenim voskom vzdolž robov. 2.3 Mikroskopiranje Mikroskopiranje smo izvajali na Inštitutu za patofizi­ologijo v Ljubljani, v Laboratoriju za neuroendokrino­logijo in molekularno celično fiziologijo (referenčni center za konfokalno mikroskopijo Carl Zeiss). Za mi­kroskopiranje smo uporabili dvofotonski konfokalni mikroskop LSM 7 MP (Zeiss, Nemčija), ki je bil name-ščen v zatemnjenem prostoru na protivibracijski mizi, saj lahko mehanski tresljaji in svetloba motijo meritve. Slike za analize (serija optičnih rezin po z-osi; ang.: Z­-stack) smo zajemali s programsko opremo ZEN 2012 (black edition, Release version 8.0, © Carl Zeiss Micro­scopy GmbH 1997-2013). Razmik med rezinami je bil 10 µm. Za vsak vzorec smo opravili tri ponovitve me­ritev na treh različnih lokacijah na korenini. 2.4 Dvofotonski konfokalni laserski mikroskop Za razliko od elektronske mikroskopije (Stempak & Ward 1964), ki je sicer tudi zelo razširjena metoda, omogoča f luorescenčna mikroskopija opazovanje živih celic in procesov, ki potekajo v njih (Heintz­mann & Ficz 2006, Lippincott-Schwartz & Pat­terson 2003). Fluorescenca je pojav, pri katerem lahko s svetlobo primerne valovne dolžine molekulo vzbudi­mo v višje energetsko stanje, nato pa vzbujena moleku­la izseva foton in preide nazaj v osnovno energetsko stanje (Hell & Wichmann 1994). Osnova konfokal­nega mikroskopa je f luorescenčni mikroskop (Hein­tzmann & Ficz 2006). Konfokalni mikroskop ne osvetljuje celotnega vzorca hkrati, temveč ga z laser­skim žarkom pregledujemo v določeni optični ravnini (Heintzmann & Ficz 2006). Vzbujeno f luorescentno svetlobo iz točk sprejme detektor, ki informacijo s po­močjo računalnika pretvori v sliko. Običajni enofoton­ski konfokalni mikroskop ima vgrajeno zaslonko, ki preprečuje pot svetlobe iz ozadja vzorca do detektorja (Földes-Papp, Demel & Tilz 2003, Wilhelm s sod. 2014). Dvofotonski konfokalni mikroskop vzbuja mo­lekule z dvema fotonoma daljše valovne dolžine (Denk s sod. 1990). Molekula mora sočasno absorbirati dva fotona, da preide v višje energetsko stanje, kar zagoto­vimo z veliko gostoto fotonov, oziroma z zelo veliko intenziteto svetlobe (Denk s sod. 1990, Helmchen & Denk 2005), kar dosežemo z zbiranjem žarkov v gori­šču in s pulznim delovanjem laserja. Posledično je in­tenziteta svetlobe dovolj velika, da pride do vzbujanja fotonov le v gorišču, hkrati pa se izognemo moteči sve­tlobi iz ozadja vzorca (Denk s sod. 1994). Ker pri dvo­fotonskem mikroskopu vzbujamo fotone z dvakrat daljšo valovno dolžino, je v primerjavi z navadnim konfokalnim mikroskopom tudi ločljivost slike posle­dično nekoliko manjša, medtem ko je sipanje fotonov manjše. Zato izbiro mikroskopa prilagodimo vzorcu: če je vzorec debel in se svetloba fotonov močno siplje, izberemo dvofotonski konfokalni mikroskop, v na­sprotnem primeru pa enofotonski konfokalni mikro­skop (Denk s sod. 1994). Za naše raziskave smo upora­bili dvofotonski laserski mikroskop. 3 ANALIZA SLIK S PROGR AMOM ImageJ 1.46R Slike smo analizirali s programom ImageJ 1.46r (Nati­onal Institutes of Health, USA). Za analizo smo slike najprej izvozili iz programa ZEN 2011 (Slika 2) in jih shranili v formatu .tif. Pri slikah smo pred izvažanjem izklopili kanal z belo svetlobo, ker je sicer le-ta motil nadaljnje analize. Slika 2: Izvoz slike iz programa ZEN 2011 v formatu .tif za nadaljnje analize Figure 2: Image export from ZEN 2011 in .tif format for further analysis Nato smo sliko odprli v programu ImageJ 1.46r, jo zelenega kanala (Slika 3). Iz originalne slike smo nare­razdelili na kanale (Split channels) in zaprli vse razen dili dvojnike, na katerih smo nadaljevali z analizami. Slika 3: Slika originala preden smo jo razdelili na kanale (levo) in slika z izbranim zelenim kanalom pripravljena za nadaljnje analize (desno) Figure 3: Original image before separating on channels (left) and selected gren channel image of the same picture ready for analyses (right) 3.1 analiza originala: S funkcijo Polygon Selections smo označili celotno površino mikorizne korenine oziroma hife, ki smo jo želeli analizirati (Slika 4). Slika 4: Označevanje površine, kjer se pojavljajo aktivni encimi SBP na mikoriznem plašču z orodjem Polygon selections Figure 4: Marking areas where active enzymes SBP were present on mycorrhizal mantle surface using tool Polygon Selections Nato smo nadaljevali z nastavitvami: Analyze › Set Scale…, kjer smo pri prvi postavki Distance in Pixels vpisali 1 in tako določili velikost točkovne enote. Pri nastavitvah (Set Measurements) smo za izbrana pa­rametra izbrali površino označene površine (Area) in povprečno intenziteto f luorescence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value). Podatek Mean gray value ima smisel le v sivi sliki preden določimo prag. Pri analizi originala odkljukamo opcijo omejitev na prag (Limit to Threshold) (Slika 5). Slika 5: Določevanje velikosti točkovne enote (piksel) (levo) in izbor želenih parametrov za analize, v našem primeru površina označene površine (Area) in povprečna intenziteta f luorescence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value) (desno). Pri nastavitvah za analize originala odkljukamo funkcijo omejitve na nadpražno vrednost. Figure 5: Determination of the size of the pixel unit (left) and selection of the parameters for the analysis in this case the area of the selected surface (Area) and the average intensity of f luorescence (Mean gray value) (right). In window Set Measurements for analyses of the original image tick off option Limit to threshold. Ko smo nastavili parametre, smo nadaljevali z me-Excel, ki smo jo pripravili sami. Prepisali smo podatke ritvami: Analyze › Measure. Pojavilo se je okno z me-za površino (Area) in povprečno intenziteto f luore­ritvami (Slika 6), ki smo jih prepisali v tabelo v MS scence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value). Slika 6: Okno z meritvami, ki jih prepišemo v tabelo MS Excel za nadaljnje analize. Figure 6: Window with results of measurements, that should be copied in MS Excel table for further analyses. Po analizi originala smo nadaljevali z analizo na dvojnikih, kjer smo merili vrednosti pri pragu 10 %. 3.2 analiza dvojnika Preden smo začeli z analizo, smo postavili prag: Image › Adjust › Threshold… (Slika 7). V odprtem oknu se pojavi graf in dva drsnika. Za analize premi­kamo le zgornji drsnik, ki na nastavimo na želeno nad­pražno vrednost vseh dimenzij, pri čemer upoštevamo da je slika 8-bitna. Za prag 10 % nastavimo drsnik na 25. Nastavitev potrdimo s klikom na gumb Apply. Slika 7: Nastavitev želene nadpražne vrednosti za analize. Figure 7: Setting of threshold value for analyses. Nato smo kopirali označeno površino iz original-ne slike na dvojnik: CTRL+C › Edit › Selection › Restore Selection Sledile so nastavitve za analize: Analyze › Set Scale… › Distance in Pixels = 1, Set Measurements…, kjer smo odkljukali Limit to Threshold Pri opravljenih meritvah smo prepisali le vrednost za površino (Area): Analyze › Measure… 4 RAZPRAVA Encimsko aktivnost lahko ugotavljamo s pomočjo bar­vil, ki temeljijo na f luorescenci. Za ta namen so v upo­rabi komercialno dostopni kiti (Johnson & Spence 2010). Za analize encimske aktivnosti fosfataze pri gli­vah (Alvarez s sod. 2004, 2012) je v uporabi komerci­alni kit ELF® 97 (Johnson & Spence 2010). Kit vsebuje topni substrat, ki ob prisotnosti delovanja fosfataze proizvede fotostabilen rumeno-zelen precipitat na strani aktivnega encima. Prednost ELF® 97 je ta, da je razlika med vrhovoma ekscitacijske in emisijske valov­ne dolžine približno 180 nm, kar omogoča, da lahko signal, ki nastane kot posledica delovanja encimov, jasno ločimo od signala, ki nastane kot posledica avto­f luorescence mikoriznega micelija (Johnson & Spence 2010). Substrat se lahko uporablja za opazovanje živih celic, vendar nima možnosti prehajanja skozi celično steno, zato lahko opazujemo le aktivnost na površino vezanih encimov. Avtorji (Johnson & Spence 2010) protokolov navajajo, da intenziteta f luorescentnega si­gnala fiksiranih preparatov ostaja bolj ali manj enaka več mesecev ali celo let, kar potrjujejo tudi naše izku­šnje. Vierheilig, Schweiger & Brundrett (2005) uvrščajo ELF® 97 med vitalna barvila, saj ni potrebno predhodno razbarvanje korenin. V naših raziskavah smo opazili, da barvilo prosto prehaja do mikoriznega plašča, kjer koreninski vršiček ni obdan z gostimi izha­jajočimi elementi, kot so hife, oziroma kadar je koreni­na svetlih barv. V primeru, ko je preplet hif okrog ko­reninskega vršička gost, smo opazili, da je preparat slabše obarvan ali je obarvan le na površini in barvilo ni prodrlo v notranjost. Za temno obarvane korenin­ske vršičke pa ne moremo zagotovo trditi, ali je nizek delež opaženih encimov posledica slabšega prodiranja barvila v notranjost, ali je to posledica temno obarva­nega preparata, ki onemogoča prehod emisijske svetlo­be. Pri uporabi ELF® 97 moramo biti pozorni na biot­ske (število bakterij in gliv, koncentracija proteinov) in abiotske dejavnike (pH, temperatura, vlaga), ki lahko vplivajo na aktivnost encima in s tem na rezultate. Vpliv pH na aktivnost fosfataze je vrstno specifičen (Alvarez s sod. 2004; Baghel, Sharma & Pandey 2009). Baghel, Sharma & Pandey (2009) so pri glivi Cantharelus tropicalis dokazali višjo aktivnost SBP pri 40 °C in značilno nižjo aktivnost pri 35 °C. Korelacijo med kislo fosfatazo in temperaturo ter vlago so opazili tudi Criquet s sodelavci (2004) v listnem opadu. Al­varez s sodelavci (2012) so preučevali vpliv morfoti­pov (Paxillus involutus, Pisolithus tinctorius, Cenoco­ccum geophilum, Descolea antartica) in vnos hranilnih snovi (angl. soil fertility) v tla na aktivnost kisle fosfa­taze. Ugotovili so, da na prostorsko razporeditev kisle fosfataze v mikoriznem miceliju vpliva morfotip (zunaj koreninski micelij, mikorizni plašč in Hartigova mreža), medtem ko vnos snovi v tla vpliva na encim­sko aktivnost zunaj koreninskega micelija in Hartigo­ve mreže. Dvofotonski konfokalni mikroskop omogoča opa­zovanje vitalnih preparatov, poleg tega pa z njim lahko opazujemo debelejše preparate oziroma kar cele kore­ninske vršičke, saj lahko optično prodremo skozi mi­korizni plašč vse do celic korenine in zato predhodna priprava rezin ni potrebna. Tako prihranimo na času, poleg tega pa opazujemo nepoškodovan koreninski vr­šiček v celoti, razen v že prej omenjenem primeru temno obarvanih mikoriznih gliv, kjer bi morali kore­nine predhodno očistiti oziroma razbarvati (Schwei­ger s sod. 2002, Vierheilig, Schweiger & Brun­drett 2005). Za encimske analize so v uporabi tudi encimski testi na filter ploščah (Pritsch s sod. 2011), ki omogočajo analize različnih encimov hkrati, vendar imamo v tem primeru le podatek o jakosti f luorescen­tnega signala, nimamo pa podatka o razporejanju en­cimov v mikoriznem miceliju. Za analize slik smo izbrali prosto dostopen pro­gram ImageJ 1.46j, ki je v znanosti uporabljen že več kot 25 let, še posebej se je razširil med uporabniki za analize slik s področja biologije (Schneider, Rasband & Eliceiri 2012). ImageJ 1.46r v našem primeru na sliki originala izmeri površino, ki jo zasede vzorec. Re­zultati analize predstavljajo povprečne intenzitete f luorescence teh površin za vsak vzorec. Pri tem je po­trebno opozoriti, da ima analiza intenzitete f luore­scence na originalni sliki smisel le, kadar so vsi pogoji med vzporedno posnetimi slikami enaki (enako bar­vanje, enaka moč laserja, fotopomnoževalke in drugo). Zagotavljanje enakih pogojev je skoraj nemogoče, zato smo za analize izbrali kontrastne slike, kar pomeni merjenje površine pri določenem pragu. To nam omo­goča tudi ponovljivost metode in primerjanje podat­kov. Preden se odločimo, kateri prag bomo izbrali, na­redimo vzporedne analize slik pri različnih nadpra­žnih vrednostih in izberemo tisto nadpražno vrednost, ki najbolj ustrezno odstrani vsa nespecifična barvanja. Pri delu s programom ImageJ 1.46r smo opazili, da je enostaven za uporabo, da preprosto označimo površi­no, ki jo želimo analizirati in da so meritve zelo na­tančne. Slabosti metode, ki smo jih med uporabo opa­zili, so, da (1) je v primeru, ko je odprtih več oken (ori­ginal in dvojnik), potrebno vedno znova označiti na katero okno se nanaša ukaz oziroma meritev, (2) funk­cija razveljavi (Undo) sicer deluje, ampak naslednja meritev ni več zanesljivo pravilna. 5 ZAKLJUčKI Metoda, ki smo jo predstavili, je nova in edinstvena predvsem zaradi uporabe dvofotonskega laserskega mikroskopa. Omogoča opazovanje encimske aktivno­sti fosfataze in njeno razporejanje v mikoriznem mice­liju brez uporabe rezin. Konfokalna mikroskopija je že bila uporabljena za opazovanje aktivnosti SBP pri ECM glivah (Alvarez s sod. 2004, 2012), vendar vedno na pripravljenih rezinah ECM korenin, ki omogoča ozek vpogled v zelo majhen del korenine. V prihodnje želimo metodo še razviti in raziskati, ali je razporeja­nje encimov pri različnih eksploracijskih tipih poveza­no z njihovo funkcijo v naravi. 6 SUMMARy Enzymatic activity could be detected by dyes based on f luorescence. For this purpose, the commercially avail­able kits are applicable (Johnson & Spence 2010). Al­varez et al. (2004, 2012) used commercial kit ELF® 97 for analyses of surface-bound phosphatase activity. ELF® 97 contains a soluble ELF substrate, which forms an intense yellow-green-f luorescent alcohol precipitate at the site of phosphatase activity. ELF® 97 alcohol pre­cipitate is separated from its excitation maximum by over 180 nm, so ELF 97 signal can be clearly distin­guished from most cell and mycorrhizal mycelium au­tof luorescence (Johnson & Spence 2010). Substrate can be used for observing life cells, but it can not pass the cell wall, so just surface bound enzymatic activity can be analyzed. The authors of protocols indicate, that ELF 97 phosphate-based staining of fixed samples can persist for a month to one year with little if any loss of signal, and this was noticed also in our experi­ments. Vierheilig, Schweiger & Brundrett (2005) classified ELF 97 into vital staining techniques, be­cause clearing of roots is not necessary. In our research, we noticed that the dye passes freely to the mycorrhi­zal sheath, if the root tips are not surrounded by dense emanating elements such as hyphae, or if the roots are of light colors. In the cases in which hyphae around the root tips are dense, we observed that the mycorrhizal structures are less colored or are colored only on the surface, indicating the dye has not penetrated in the interior. For dark colored root tips we cannot definite­ly claim whether a low percentage of the observed en­zyme results from lower dye penetration into the inte­rior of whether this is due to the dark-colored mycor­rhizal mantle that prevents the emission light passing through. When using ELF® 97 care must be taken on biotic (the number of bacteria and fungi, protein con­centration) and abiotic factors (pH, temperature, hu­midity), which can affect the enzyme activity and thus also the results. The inf luence of pH on the phospha­tase activity is species dependent (Alvarez et al. 2004, Baghel, Sharma & Pandey 2009). Baghel, Sharma & Pandey (2009), demonstrated higher activity of SBP at 40 ° C and typically a lower activity at 35 ° C for the fungus Cantharelus tropicalis. The correlation between the acid phosphatase, and the temperature and humid­ity were also observed by Criquet et al. (2004) in the leaf litter. Alvarez et al. (2012) studied the inf luence of morphotypes (Paxillus involutus, Pisolithus tinctori­us, Cenococcum geophilum, Descolea Antartica) and soil fertility on acid phosphatase activity. They found that spatial distribution of acid phosphatase in mycor­rhizal mycelium is affected by mycorrhizal morphot­ype (extraradical mycelium, mycorrhizal mantle and Hartig net), while soil fertility had a significant effect on the enzymatic activity in the extraradical mycelium and Hartig net. Two-photon confocal microscope allows observa­tion of vital mycorrhizal fungi, in addition prepared samples can be thick, or even whole root tips can be observed, because the laser beam can penetrate through mycorrhizal mycelium layers to the root cells, therefore, the prior preparation of the t mycelium slic­es is not necessary. The advantage of this microscope is in its time-efficiency and the possibility to observe in­tact root tips, except for the before mentioned case of dark colored mycorrhizal fungi, which should be cleared before staining (Schweiger et al. 2002, Vier­heilig, Schweiger & Brundrett 2005). For analysis of enzymatic activity enzyme assays on the filter plates are also in use (Pritsch et al. 2011), which enable the analysis of several enzymes at the same time, however, this tests give only information of the intensity of the f luorescent signal, but no information about the allo­cation of enzymes in mycorrhizal mycelium. For image analysis we have selected the freely available program ImageJ 1.46j, which is used in sci­ence for more than 25 years, particularly for image analysis in biology (Schneider, Rasband & Eliceiri 2012). In our case, ImageJ measures the area covered by the sample in the original image. Results of ana­lyzes represent the average intensity of the measured areas for each sample. It is important to notice, that analyzes of intensity on original images are suitable if all conditions between compared images are the same (the same staining, the same power of laser, photomul­tiplier…). More reproducible and also simpler is to analyze the copies representing contrasted images, measuring the area above the threshold value. It is im­portant to choose the threshold that most effectively cuts off all non-specific staining. When working with the program ImageJ 1.46r we noticed that it is a simple and intuitive program to use, that has high accuracy of selection and it is simple to select the measuring area. Disadvantages of ImageJ were (1) a click on every image, and for each step, is needed if more images are open (original and duplicates), (2) caution in the work order is necessary, since if the operator uses the Undo function it can result in wrong measurements. 7 CONCLUSIONS The method used in our study is novel because of use of two-photon confocal microscopy. It allows to study spatial distribution of SBP enzymatic activity in various thicknesses of ECM mantle in intact (non-sectioned) ECM root tips. Although confocal microscopy for ob­servation of SBP activity in ECM was already used be­fore (Alvarez et al. 2004, 2012), it was used only in sectioned ECM roots, that allowed an insight into a very small fraction of the ECM root. We suggest that two-photon confocal microscopy could prove useful in future to study distribution of enzymatic activity of dif­ferent exploration types and their function in nature. ZAHVALA - ACKNOWLEDGEMENTS Predstavljena metoda je bila razvita v okviru doktor-FORINNO (RegPot No. 315982). Zahvaljujemo se tudi ske naloge mlade raziskovalke (IŠ), in je bila financira-podjetju Celica d.o.o. in Inštitutu za patofiziologijo na iz ARRS v okviru programske skupine P4-0107, Mi-Medicinske univerze v Ljubljani, ki sta omogočila delo nistrstva za Kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano v na dvo-fotonskem konfokalnem mikroskopu. okviru projektov L4-2265 in L4-4318 in projektu EU­ 8 LITER ATUR A – REFERENCES Alvarez, M., R. Godoy, W. Heyser & S. Härtel, 2004: Surface-bound phosphatase activity in living hyphae of ectomycorrhizal fungi of Nothofagus obliqua. Mycologia (Lawrence) 96 (3): 479-487. Alvarez, M., D. Huygens, L. M. Díaz, C. A. Villanueva, W. Heyser & P. Boeckx, 2012: The spatial distributi­on of acid phosphatase activity in ectomycorrhizal tissues depends on soil fertility and morphotype, and relates to host plant phosphorus uptake. Plant, Cell & Environment (New Jersey) 35 (1): 126-135. Baghel, R. K., R. Sharma & A. K. Pandey, 2009: Activity of acid phosphatase in the ectomycorrhizal fungus Cantharellus tropicalis under controlled conditions. Journal of Tropical Forest Science (Ithaka) 21 (3): 218-222. Criquet, S., E. Ferre, A. M. Farnet & J. le Petit, 2004: Annual dynamics of phosphatase activities in an evergreen oak litter: inf luence of biotic and abiotic factors. Soil Biology and Biochemistry (Amsterdam) 36 (7): 1111-1118. Denk W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 1990. Two-photon laser scanning f luorescence microscopy. Science (New york), 248, 4951: 73-76. Denk, W., K. R. Delaney, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D.W. Tank & R. yuste, 1994: Ana­tomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods (Amsterdam) 54 (2): 151-162. Ekblad, A., H. Wallander, D. L. Godbold, C. Cruz, D. Johnson, P. Baldrijan, R. G. Björk, D. Epron, B. Kieliszewska-Rokicka, R. Kjoller, H. Kraigher, E. Matzner, J. Neumann & C. Plassard, 2013: The production and turnover of extramatrical mycelium of ectomycorrhizal fungi in forest soils: role in carbon cycling. Plant and Soil (Dordrecht) 366 (1-2): 1-27. Földes-Papp, Z., U. Demel & G. P. Tilz, 2003: Laser scanning confocal f luorescence microscopy: an overview. In­ternational Immunopharmacology (Amsterdam) 3 (13-14): 1715-1729. Heintzmann, R. & G. Ficz, 2006: Breaking the resolution limit in light microscopy. Briefings in Functional Ge­nomics & Proteomics (Oxford) 5 (4): 289-301. Hell, S. W. & J. Wichmann, 1994: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated­-emission-depletion f luorescence microscopy. Optics Letters (Washington) 19 (11): 780-782. Helmchen, F. & W. Denk, 2005: Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods (New york) 2 (12): 932-940. Johnson, J. & M. T. Z. Spence, 2010: Phosphatase-Based Signal Amplification Techniques. V: The Molecular Probes® Handbook. A guide ti f luorescence probes and labeling technologies. 11th edition. Life Technologies Corporation (Waltham): pp. 203-211. Kjoller, A. H. & S. Struwe, 2002: Fungal communities, succession, enzymes and decomposition. V: Bruns, R. G. & R. P. Dick R.P., (ur.): Enzymes in the environment: activity, ecology and applications. CRC Press (New york), pp. 267-285. Lippincott-Schwartz, J. & G. H. Patterson, 2003: Development and use of f luorescent protein markers in living cells. Science (Washington) 300 (5616): 87-91. Pritsch, K., S. Raidl, E. Marksteiner, H. Blascke, R. Agerer, M. Schloter & A. Hartmann, 2004: A rapid and highly sensitive method for measuring enzyme activities in single mycorrhizal tips using 4-methylumbellife­rone-labelled f luorogenic substrates in a microplate system. Journal of Microbiological Methods (Amsterdam) 58 (2): 233-241. Pritsch, K., P. Courty, J.-L. Churin, B. Cloutier-Hurteau, M. Ali, C. Damon, M. Duchemin, S. Egli, J. Ernst, T. Fraissinet-Tachet, F. Kuhar, E. Legname, R. Marmeisse, A. Müller, P. Nikolova, M. Peter, C. Plassard, F. Richard, M. Schloter, M.-A. Selosse, A. Franc & J. Garbaye, 2011: Optimized assay and storage conditions for enzyme activity profiling of ectomycorrhizae. Mycorrhiza (Berlin) 21 (7): 589-600. Schneider, C. A., W. S. Rasband & K. W. Eliceiri, 2012: NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods (New york) 9: 671-675. Schweiger, P. F., H. Rouhier & B. Söderström, 2002: Visualisation of ectomycorrhizal rhizomorph structure using laser scanning confocal microscopy. Mycological Research (Manchester) 106 (3): 349-354. Stempak, J. G. & R. T. Ward, 1964: An improved staining for electron microscopy. The Journal of Cell Biology (New york) 22 (3): 697-701. Vierheilig, H., P. Schweiger & M. Brundrett, 2005: An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum (Chichester) 125 (4): 393-404. Wallander, H., A. Ekblad, D. L. Godbold, D. Johnson, A. Bahr, P. Baldrijan, R. G. Björk, B. Kieliszewska­-Rokicka, R. Kjoller, H. Kraigher, C. Plassard && M. Rudawska, 2013: Evaluation of methods to estima­te production, biomass and turnover of ectomycorrhizal mycelium in forests soils – A review. Soil Biology and Biochemistry (Amsterdam) 57: 1034-1047. Wilhelm, S., B. Grobler, M. Gluch & H. Heinz, 2014: Confocal laser scanning microscopy principles. Micros­copy from Carl Zeiss. Zeiss. (Jena): 1-30. NAVODILA AVTORJEM Folia biologica et geologica so znanstvena revija IV. razreda SAZU za naravoslovne vede. Objavljajo naravoslovne znanstvene razprave in pregledne članke, ki se nanašajo predvsem na raziskave v našem etničnem območju Slovenije, pa tudi raziskave na območju Evrope in širše, ki so pomembne, potrebne ali primerljive za naša preučevanja. 1. ZNANSTVENA RAZPRAVA Znanstvena razprava zajema celovit opis izvirne raziskave, ki vključuje teoretični pregled tematike, po­drobno predstavlja rezultate z razpravo in zaključki ali sklepi in pregled citiranih avtorjev. V izjemnih primerih so namesto literaturnega pregleda dovoljeni viri, če to zahteva vsebina razprave. Razprava naj ima klasično razčlenitev (uvod, ma­terial in metode, rezultati, diskusija z zaključki, zahvale, literatura idr.). Dolžina razprave, vključno s tabelami, grafikoni, tablami, slikami ipd., praviloma ne sme presegati 2 avtor­skih pol oziroma 30 strani tipkopisa. Zaželene so razpra­ve v obsegu ene avtorske pole oziroma do dvajset strani tipkopisa. Razpravo ocenjujeta recenzenta, od katerih je eden praviloma član SAZU, drugi pa ustrezni tuji strokovnjak. Recenzente na predlog uredniškega odbora revije Folia biologica et geologica potrdi IV. razred SAZU. Razprava gre v tisk, ko jo na predlog uredniškega odbora na seji sprejmeta IV. razred in predsedstvo SAZU. 2. PREGLEDNI čLANEK Pregledni članek objavljamo po posvetu uredniške­ga odbora z avtorjem. Na predlog uredniškega odbora ga sprejmeta IV. razred in predsedstvo SAZU. članek naj praviloma obsega največ 3 avtorske pole (tj. do 50 tipka­nih strani). 3. NOVOSTI Revija objavlja krajše znanstveno zanimive in aktu­alne prispevke do 7000 znakov. 4. IZVIRNOST PRISPEVKA Razprava oziroma članek, objavljen v reviji Folia biologica et geologica, ne sme biti predhodno objavljen v drugih revijah ali knjigah. 5. JEZIK Razprava ali članek sta lahko pisana v slovenščini ali katerem od svetovnih jezikov. V slovenščini zlasti te­daj, če je tematika lokalnega značaja. Prevod iz svetovnih jezikov in jezikovno lektorira­nje oskrbi avtor prispevka, če ni v uredniškem odboru dogovorjeno drugače. 6. POVZETEK Za razprave ali članke, pisane v slovenščini, mora biti povzetek v angleščini, za razprave ali članke v tujem jeziku ustrezen slovenski povzetek. Povzetek mora biti do­volj obširen, da je tematika jasno prikazana in razumljiva domačemu in tujemu bralcu. Dati mora informacijo o na­menu, metodi, rezultatu in zaključkih. Okvirno naj pov­zetek zajema 10 do 20 % obsega razprave oziroma članka. 7. IZVLEčEK Izvleček mora podati jedrnato informacijo o na­menu in zaključkih razprave ali članka. Napisan mora biti v slovenskem in angleškem jeziku. 8. KLJUčNE BESEDE Število ključnih besed naj ne presega 10 besed. Pred­staviti morajo področje raziskave, podane v razpravi ali članku. Napisane morajo biti v slovenskem in angleškem jeziku. 9. NASLOV RAZPRAVE ALI čLANKA Naslov razprave ali članka naj bo kratek in razum­ljiv. Za naslovom sledi ime/imena avtorja/avtorjev (ime in priimek). 10. NASLOV AVTORJA/AVTORJEV Pod ključnimi besedami spodaj je naslov avtorja/ avtorjev, in sicer akademski naslov, ime, priimek, ustano­va, mesto z oznako države in poštno številko, država, ali elektronski poštni naslov. 11. UVOD Uvod se mora nanašati le na vsebino razprave ali članka. 12. ZAKLJUčKI ALI SKLEPI Zaključki ali sklepi morajo vsebovati sintezo glavnih ugotovitev glede na zastavljena vprašanja in razrešujejo ali nakazujejo problem raziskave. 13. TABELE, TABLE, GRAFIKONI, SLIKE IPD. Tabele, table, grafikoni, slike ipd. v razpravi ali član­ku naj bodo jasne, njihovo mesto mora biti nedvoumno označeno, njihovo število naj racionalno ustreza vsebini. Tabele, table, slike, ilustracije, grafikoni ipd. skupaj z na­slovi naj bodo priloženi na posebnih listih. če so slike v digitalni obliki, morajo biti pripravljene u zapisu .tiff v barvni skali cMYK in resoluciji vsaj 300 DPi/inch. Risa­ne slike pa v zapisu .eps. Pri fitocenoloških tabelah se tam, kjer ni zastopana rastlinska vrsta, natisne pika. 14. LITERATURA IN VIRI Uporabljeno literaturo citiramo med besedilom. Citirane avtorje pišemo v kapitelkah. Enega avtorja piše­mo » (Priimek leto)« ali »(Priimek leto: strani)« ali »Pri­imek leto« [npr. (Bukry 1974) ali (Oberdorfer 1979: 218) ali ... Poldini (1991) ...]. če citiramo več del istega avtorja, objavljenih v istem letu, posamezno delo ozna­čimo po abecednem redu »Priimek leto mala črka« [npr. ...Horvatić (1963 a)... ali (Horvatić 1963 b)]. Avtor­jem z enakim priimkom dodamo pred priimkom prvo črko imena (npr. R. Tuxen ali J. Tuxen). Več avtorjev istega dela citiramo po naslednjih načelih: delo do treh avtorjev »Priimek, Priimek & Priimek leto: strani« [npr. (Shearer, Papike & Simon 1984) ali Pearce & Cann (1973: 290-300)...]. če so več kot trije avtorji, citiramo »Priimek prvega avtorja et al. leto: strani« ali »Priimek prvega avtorja s sodelavci leto« [npr. Noll et al. 1996: 590 ali ...Meusel s sodelavci (1965)]. Literaturo uredimo po abecednem redu. Imena av­torjev pišemo v kapitelkah: – Razprava ali članek: Dakskobler, L, 1997: Geografske variante asoci­acije Seslerio autumnalis-Fagetum (Ht.) M. Wraber ex Borhidi 1963. Razprave IV razreda SAZU (Ljubljana) 38 (8): 165–255. Kajfež, L. & A. Hočevar, 1984: Klima. Tlatvorni činitelji. V D. Stepančič: Komentar k listu Murska Sobota. Osnovna pedološka karta SFRJ. Pedološka karta Slovenije 1:50.000 (Ljubljana): 7–9. Le Loeuff, J., E. Buffeaut, M. Martin & H. Tong, 1993: Decouverte d’Hadrosauridae (Dinosauria, Ornithischia) dans le Maastrichtien des Corbieres (Aude, France). C. R. Acad. Sci. Paris, t. 316, Ser. II: 1023–1029. – Knjiga: GORTANI, L. & M. GORTANI, 1905: Flora Friuliana. Udine. če sta različna kraja založbe in tiskarne, se navaja kraj založbe. – elaborat ali poročilo: PRUS, T., 1999: Tla severne Istre. Biotehniška fakulteta. Univerza v Ljubljani. Center za pedologijo in varstvo okolja. Oddelek za agronomijo. Ljubljana. (Elabo­rat, 10 str.). – atlasi, karte, načrti ipd.: KLIMATOGRAFIJA Slovenije 1988: Prvi zvezek: Temperatura zraka 1951–1980. Hidrometeorološki zavod SR Slovenije. Ljubljana. LETNO poročilo meteorološke službe za leto 1957. Hidrometeorološki zavod SR Slovenije. Ljubljana. Za vire veljajo enaka pravila kot za literaturo. 15. LATINSKA IMENA TAKSONOV Latinska imena rodov, vrst in infraspecifičnih tak­sonov se pišejo kurzivno. V fitocenoloških razpravah ali člankih se vsi sintaksoni pišejo kurzivno. 16. FORMAT IN OBLIKA RAZPRAVE ALI čLAN­KA članek naj bo pisan v formatu RTF z medvrstičnim razmikom 1,5 na A4 (DIN) formatu. Uredniku je treba oddati izvirnik in kopijo ter zapis na disketi 3,5 ali na CD-ROM-u. Tabele in slike so posebej priložene tekstu. Slike so lahko priložene kot datoteke na CD-ROM-u, za podrobnosti se vpraša uredništvo. INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Folia biologica et geologica is a scientific periodical of the Classis IV: Natural history that publishes natural sci­entific proceedings and review articles referring mainly to researches in ethnic region of ours, and also in Europe and elsewhere being of importance, necessity and comparison to our researches. 1. SCIENTIFIC TREATISE It is the entire description of novel research includ­ing the theoretical review of the subjects, presenting in detail the results, conclusions, and the survey of litera­ture of the authors cited. In exceptional cases the survey of literature may be replaced by sources, if the purport requires it. It should be composed in classic manner: introduc­tion, material and methods, results, discussion with con­clusions, acknowledgments, literature, etc. The treatise should not be longer than 30 pages, in­cluding tables, graphs, figures and others. Much desired are treatises of 20 pages. The treatises are reviewed by two reviewers, one of them being member of SASA as a rule, the other one a foreign expert. The reviewers are confirmed by the Classis IV SASA upon the proposal of the editorial board of Folia biologica et geologica. The treatise shall be printed when adopted upon the proposal of the editorial board by Classis IV and the Presidency SASA. 2. REVIEW ARTICLE On consultation with the editorial board and the author, the review article shall be published. Classis IV and the Presidency SASA upon the proposal of the edito­rial board adopt it. It should not be longer than 50 pages. 3. NEWS The periodical publishes short, scientificaly relevant and topical articles up to 7000 characters in lenght. 4. NOVELTy OF THE CONTRIBUTION The treatise or article ought not to be published previously in other periodicals or books. 5. LANGUAGE The treatise or article may be written in one of world language and in Slovenian language especially when the subjects are of local character. The author of the treatise or article provides the translation into slovenian language and corresponding editing, unless otherwise agreed by the editorial board. 6. SUMMARy When the treatise or article is written in Slovenian, the summary should be in English. When they are in foreign language, the summary should be in Slovenian. It should be so extensive that the subjects are clear and understandable to domestic and foreign reader. It should give the information about the intention, method, result, and conclusions of the treatise or article. It should not be longer than 10 to 20% of the treatise or article itself. 7. ABSTRACT It should give concise information about the inten­tion and conclusions of the treatise or article. It must be written in English and Slovenian. 8. KEy WORDS The number of key words should not exceed 10 words. They must present the topic of the research in the treatise or article and written in English and Slovenian. 9. TITLE OF TREATISE OR ARTICLE It should be short and understandable. It is fol­lowed by the name/names of the author/authors (name and surname). 10. ADDRESS OF AUTHOR/AUTHORS The address of author/authors should be at the bot­tom of the page: academic title, name, surname, institu­tion, town and state mark, post number, state, or e-mail of the author/authors. 11. INTRODUCTION Its contents should refer to the purports of the trea­tise or article only. 12. CONCLUSIONS Conclusions ought to include the synthesis of the main statements resolving or indicating the problems of the research. 13. TABLES, GRAPHS, FIGURES, ETC. They should be clear, their place should be marked unambiguously, and the number of them must ration­ally respond to the purport itself. Tables, figures, illus­trations, graphs, etc. should be added within separated sheets. In case that pictures in digital form, tiFF format and cMYK colour scale with 300 DPi/inch resolution should be used. For drawn pictures, ePS format should be used. In cases, when certan plant species are not represented, a dot should be always printed in phytocenologic tables. 14. LITERATURE AND SOURCES The literature used is to be cited within the text. The citation of the authors is to be marked in capitals. One writes the single author as follows: “(Surname year)” or “(Surname year: pages)” or “Surname year” [(Bukry 1974) or (Oberdorfer 1979: 218) or ... Poldini (1991)...]. The works of the same author are to be cited in alphabeti­cal order:“Surname year small letter” [...Horvatić (1963 a)... or (Horvatić (1963 b)]. The first letter of the au­thor’s name is to be added when the surname of several authors is the same (R. Tuxen or J. Tuxen). When there are two or three authors, the citation is to be as follows: “Surname, Surname & Surname year: pages” [(Shearer, Papike & Simon 1984) or Pearce & Cann (1973: 290­300)...]. When there are more than three authors, the ci­tation is to be as follows: “Surname of the first one et al. year: pages” or “Surname of the first one with collabora­tors year” [Noll et al. 1996: 590 or Meusel with collabo­rators (1965)]. The literature is to be cited in alphabetical order. The author’s name is written in capitals as follows: – treatise or article: Dakskobler, L, 1997: Geografske variante asoci­acije Seslerio autumnalis-Fagetum (Ht.) M. Wraber ex Borhidi 1963. Razprave IV. Razreda SAZU (Ljubljana) 38 (8): 165-255. Kajfež, L. & A. Hočevar, 1984: Klima. Tlatvorni činitelji. V D. Stepančič: Komentar k listu Murska Sobota. Osnovna pedološka karta SFRJ. Pedološka karta Slovenije 1:50.000 (Ljubljana): 7–9. Le Loeuff, J., E. Buffeaut, M. Martin & H. Tong, 1993:Déecouverte d’Hadrosauridae (Dinosauria, Ornithis­chia) dans le Maastrichtien des Corbieres (Aude, France). C. R. Acad. Sci. Paris, t. 316, Ser. II: 1023-1029. – book: GORTANI, L. & M. GORTANI, 1905: Flora Friuliana. Udine. In case that the location of publishing and printing are different, the location of publishing is quoted. – elaborate or report: PRUS, T., 1999: Tla severne Istre. Biotehniška fakulteta. Univerza v Ljubljani. Center za pedologijo in varstvo okolja. Oddelek za agronomijo. Ljubljana. (Elabo­rat, 10 str.). – atlases, maps, plans, etc.: KLIMATOGRAFIJA Slovenije 1988: Prvi zvezek: Temperatura zraka 1951-1980. Hidrometeorološki zavod SR Slovenije. Ljubljana. LETN0 poročilo meteorološke službe za leto 1957. Hidrometeorološki zavod SR Slovenije. Ljubljana. The same rules hold for sources. 15. LATIN NAMES OF TAXA Latin names for order, series, and infraspecific taxa are to be written in italics. All syntaxa written in phyto­coenological treatises or articles are to be in italics. 16. SIZE AND FORM OF THE TREATISE OR AR­TICLE The contribution should be written in RTF format, spacing lines 1.5 on A4 (DIN) size. The original and copy ought to be sent to the editor on diskette 3.5 or on CD-Rom. Tables and figures are to be added separately. Figures may be added as files on CD-Rom. The editorial board is to your disposal giving you detailed information. 17. THE TERM OF DELIVERy The latest term to deliver your contribution is May 31. FOLIA BIOLOGICA ET GEOLOGICA 57/2 - 2016 Slovenska akademija znanosti in umetnosti v Ljubljani Grafična priprava za tisk Medija grafično oblikovanje, d.o.o. Tisk Abo Grafika d.o.o. Ljubljana 2016