UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA BIOLOŠKO TESTIRANJE VZORCEV JEČMENA Z RAZLIČNO VSEBNOSTJO DOSTOPNEGA LIZINA Doktorska disertacija Ivan KREFT mag.genetike,dipl.ing.agr. Ljubljana,junij 1971. - 2 - DK 633.16:636.o85:631.541 KREFT,Ivan: Biološko testiranje vzorcev ječmena z različno vsebnostjo dostopnega lizina,doktorska disertacija,Biotehniška fakulteta,Ljubljana 1971. Metodološka raziskava vrednotenja hranilne vrednosti beljakovin ječmena s pomočjo laboratorijskih miši.Pregled metod vrednotenja hranilne vrednosti beljakovin,zanesljivost teh metod in možnosti za uporabo v žlahtnjenju rastlin.Primerjava analitičnih in kompleksnih metod.Biološko testiranje vzorcev ječmena s pomočjo OBA miši od dvajsetega do Štiridesetega dne starosti,ugotavljanje teže živali vsakih pet dni poskusa. Analiza variance da zadovoljive rezultate,analiza kovarian-ce z upoštevanjem teže živali ob začetku poskusa ni možna zaradi nehomogenosti regresijskih kvocientov.Zaradi asimetričnih razporeditev prirastov živali v nekaterih skupinah daje avtor prednost uporabi neparametrične statistične metode. S pomočjo neparametrične metode se da ugotoviti značil-no različnost med vzorci ječmena z zadovoljivo možnostjo razločevanja. Poskus bi bilo možno skrajšati na petnajst dni,ne da bi se s tem zmanjšala zanesljivost razločevanja vzorcev. Uporaba funkcije biološke rasti daje možnost vpogleda v dinamiko rasti in razvoja živali v poskusnem obdobju. Studies on the methodology of mice trials to evaluate nutritional value in barley samples. The methodology of evaluation of barley protein nutritional value was investigated. Twenty days old CBA male mice were applied in a twenty days feeding trial,mice were v/eighted every fifth day.Due to the appearance of assimetry in distribution of weight gains in some groups of animals,author prefers the aplication of nonparametric statistics.The method of direct calculation of probability,that the observed differences in weight gain between the groups of animals has occu-red as a result of sampling was applied.The application of the functions of biological growth enables an insight in di-namics of growth and development of animals. - 3 - Študija se ukvarja z metodologijo biološkega testiranja hranilne vrednosti beljakovin ječmena,za uporabo teh metod v žlahtnjenju rastlin in pri poljedelskih raziskavah.• Eksperimentalni del študije je bil opravljen v prehranskem laboratoriju švedske ustanove za žlahtnjenje rastlin v Svalb'fu (UtfodringslaboratorietjSveriges Uts&desfo'rening, Svalo'f).Obdelava rezultatov je bila opravljena na agronomskem oddelku biotehniške fakultete v Ljubljani. Avtor se zahvaljuje predstojniku prehranskega laboratorija v Svalbfu dr. Larsu Muncku,da je to delo omogočil in ga spremljal s kritičnim zanimanjem,,Prav tako se avtor zahvaljuje za podatke,pripombe in kritične nasvete,ki so jih prispevali Roger Mossberg na Weibullsholm Plant Breeding Institute v landskroni na Švedskem, prof .Rudolf Turk, prof i" dr.Kari Salobir, profedr.Drago Lebez, asistentka Slava Doberšek-Urbanc in asistentka Marija Opara-Mftller na biotehniški fakulteti v Ljubljani, prof.dr.Marijan Blejc na ekonomski fakulteti v Ljubljani ter asistent Tone Tajnšek, Kmetijski inštitut Slovenije v Ljubljani. Elektronska obdelava podatkov je bila opravljena v računskem centru inštituta za matematiko,fiziko in mehaniko univerze v Ljubljani (programiral Zdene Breška)6Prof.Rudolf Turk je dovolil uporabo neobjavljenih zamisli o zakonitostih biološke rasti, asistentka Marija Opara-Müller pa uporabo neobjavljenega programa analize variance in kovariance pri skupinah z neenakim številom. - 4 KAZALO stran Sinopsis 2 Predgovor 3 Kazalo 4 Kazalo tabel 5 1. UVOD Vrednotenje rastlinskih beljakovin v. žlahtnjenju rastlin in v poljedelstvu 6 2. NALOGA ŠTUDIJE 11 3. MATERIAL IN METODIKA. 12 3.1« Vzorci ječmena 12 3.2. Živali 19 3.3. Metode vrednotenja hranilne vrednosti 21 4. REZULTATI IN DISKUSIJA 32 4.1. Teže živali in prirasti tež 32 4.2. Simetričnost distribucij 34 4.3. Analiza variance in kovariance 38 4.4* Neparametrično ugotavljanje razlik med skupinami živali 48 4.5. Punkcija biološke rasti 57 5. POVZETEK 68 .6. LITERATURA 70 Dodatna dokumentacija 80 5 - KAZALO TABEL stran Tabela 1 : Količina beljakovin in lizina v vzorcih ječmena 17 Tabela 2 : Poprečni prirasti teže živali 33 Tabela 3 : t vrednosti za odstopanja od sime tričnosti 37 Tabela 4 : Srednji kvadratni odkloni od sredine (S ) za priraste v dneh poskusa 4o Tabela 5 : Analize varianc 41 Tabele 6,7,8, in 9 i Razlike med aritmetičnimi sredinami prirastov skupin živali od prvega do petega, prvega do desetega, prvega do petnajstega in prvegaudo dvajsetega dne poskusa. Značilnost razlik po sekvenčni metodi 43-46 Tabeli'lo in 11 : Neparametrično ugotavljanje razlik 49 Tabele 12,13,14,15 in 16: Razlike med aritmetičnimi sredinami prirastov skupin živali od prvega do petega, prvega do desetega, prvega do petnajstega, prvega do dvajsetega in šestega do dvajsetega dne (neparametrična ocena) 52-56 Tabela 17 : Prirasti teže živali in pokazatelj "b" 65 Tabela 18 : Koeficienti korelacije 66 Tabela 19 : Hi-kvadrat vrednosti za oceno povezanosti činiteljev hranilne vrednosti ječmena z višino prirasta teže 67 Tabela 2o: Teža miši in prirasti tež miši v po sameznih obdobjih 8o - 6 - TJ V O D Vrednotenje rastlinskih beljakovin v žlahtnjenju rastlin in v poljedelstvu Pri Čim popolnejšem ugotavljanju uporabne vrednosti ' rastlin ne smemo zanemarjati dejavnikov,ki vplivajo na hranilno vrednost <> V kmetijstva opažamo velike-razlike pri nranilni vrednosti različnih vzorcev istega • ali podobnega biaga»]3rez ustrezne metodike ugotavljanja hranilne vrednosti teh razlik ne moremo upoštevati o S tem pa tudi ostanejo neizkoriščene zelo pomembne možnosti za usmerjanje proizvodnjea S pomočjo žlahtnjenja rastlin lahko izboljšamo hranil-, no vrednost rastlinskih beljakovin le»Se lahko natanč— -no spremljamo dedovanje genov?ki vplivajo na količino •. in kvaliteto beljakovini, Barbacki (1955}je ugo-tovilpda na količino beljakovin pri ječmenu vplivajo geni,ki se dedujejo po Mendlovih zakonih0Pri križanjih^ ki jih je opravil,je cesto nastala transgresijaePri sorti pšenice "Atlas 66 so ugotovili dedne činitelje?ki zagotavljajo visoko količino beljakovin v zrnu (Johnson et al01969)sS programi križanja skušajo to lastnostmi se deduje nepopolno dominantno0prenesti na sorte pšenice s ki imajo nižjo vsebnost beljakovini i 1 e y in E w a r t (197o)sta ugotovila^da lahko posamezen kromosom rži,vključen v. genotip pšenice,spremeni amino-kislinski sestav ter poveča'količino'lizina pri pšenici. S w a m i n a t h a n et al0'(l959)so pri pšenici dobili več mutantov e povečano količino beljakovin in lizinn0Znana sta mutanta pri koruzi opaque-2 ? .. (M G r t z et-al. 1964}in floury-2 (N e 1 s o n et al.1965)s spremenj onim razmerjem aminokielinspomemb no je slasti povečanje količine trlptofana' in. lizina« Možnostijki se obetajo pri slahtnjenju rastlin kaže uspeh pri koruzi lEPjpri kateri je med 65-letnim Žla- .htnjenjem uspelo dvigniti količino beljakovin na 25^? pri primerjalnem žlahtnjenju za nizko količino belja kovin pa znižati na 4% (k 1 e x a n d e r ' et ale1969)s Vee skupin raziskovalcev proučuje količino beljakovin • in aminokislin pri sortah in mutantih ječmena (S w a- •. m i n a t h a n et al019695 2" a v 2? e t et al. 1969* >• 1 o f -t V i u f et alol3S9j Sggua-et al.1969, .'??'. H a g b e r g in Z a r 1 s o. n- 1969 ter Mu n o k "?.'? et al.'197o) Najpomembnejši rezultat, dosežen do sedaj pri jeemenUjje bilo odkritje recesivnega gena(ali te-' eno vezanega recesivnega genskega kompleksa)•"hily^ki povzroča povečano količino lisina v zrnu ječmena '(M u n c k et ala197o)o Izboljšan aminokislinski sestav beljakovin ni posledica dedne spremembe vrstnega reda .-in razmerja posameznih'-aminokislin v določeni beljakovinski verigi0Spremenjen aminokislinski sestav je posledica spremenjenega razmerja' beljakovinskih frakcij?ki imajo različna razmerja aminokislin»Mutacija torej nastane v genskem regulator— nem sistemu0^a razmerje beljakovinskih frakcij v rastlini delujejo tudi razni ekološki in agrotehnični de- • w« Q saa javniki?kar daje možnostj da tudi s spremenjenim načinom pridelovanja vihamo količino' in kvaliteto rastlinskih beljakovin (C e n e e 1 j in Jelenih 1969? M u n c k 1969, !• e f e b v r e 1969? S w a-m- i n a t h a n et al01969)«,Pomembno je "tudi z Žlaht- - njenjera in ukrepi pridelovanja nižati količino toksično v in izločati drugs dejavnike,ki posredno nižajo ' . hranilno vrednost rastlinskih beljakovin (M u n c k • 1969)o Raziskave na področju fiziologije rastlin in moleku- larne genetike kažejo (S t o j 1969 y P a v. r o t et al01969? Dumanovič in D e n.i 6 1969)? . da lahko delo na področju rastlinske genetike in žlahtnjenja rastlin se nadalje prispeva k višanju hranilne vrednosti beIjakovin0Ugodne možnosti se ka-- žejo tudi na področju spravila in. predelave poljščin. (M u n c k 1969)p vse te vrste ukrepov bo treba pove zovati na ustrezen način za hitro- dosego'željenih rezultatov. Pri žlahtnjenju rastlin in pri poljedelskih raziska-? vah potrebujemo metode vrednotenja hranilne vrednosti-rastlinskih beljakovinski bi omogočile hitro in zanesljivo vrednotenje velikega števila majhnih vzoroeva Več kemijskih analitičnih metod se približuje tem zahtevam« Izkoriščanje beljakovin.hrane je dinamičen biokemijski in fiziološki procesov katerem ima aktivno vlogo tudi žival*Pri. ocenjevanju "hranilne vrednosties beljakovin 9 - na osnovi rezultatov analitičnih metod moramo to upoštevati.Biološki testi zajemajo kompleksno vse -dejavnike hranilne vrednosti s skupnim pokazateljem^ določenih pogojih lahko nastane zaradi spremenjenih količin posameznih snovi kvalitativna sprememba mehanizma iskorišcanja beljakovineeS tem so lahko porušene predpostavke, ki smo jih uporabljali pri upoštevanju podatkov o posameznih dejavnikih hranilne vrednostis Za vsestransko in zanesljivo vrednotenje rastlinskih beljakovinski bi kazalo na posamezne možnosti izbolj-Šav9je potrebno kompleksne metode dopolnjevati s analitskimi;, tolmačenje rezultatov analitskih metod pa preverjati z biološkimi testi na laboratorijskih in domačih živalih0 Da bi stimulirali pridelovanje kvalitetnih rastlin« skih beljakovin in smotrnejše gospodarjenje z beljakovinami, bi morala biti osna'poljedelskih proizvodov bolj neposredno odvisna od tistih lastnosti pride1-kovčki so pomembne za visoko hranilno vrednost krme* Ta študija raziskuje metodiko biološkega testa^,namenjenega za uporabo v .žlahtnjenju rastlin pa tudi pri • poljedelskih rasiskavaIisMiši .so izbrane za poskusne živali pri tej študijijker se jih uporablja za stan-'', dardno biološko testiranje rastlinskih beljakovin v ustanovi za žlahtnjenje rastlin v Sval5fu?v kateri je bil opravljen praktični del študije* Prav tako je bil izbran ječmen, ker je to najpomembnejša krmna - lo rastlina,ki 30 žlahtnijo v tej ustanovi.Ječmen.je tudi že zelo podrobno raziskan,,tako -s stališča genetike in citogenetike kot s stališča kemične sestave' in hranilne vrednosti. Prirast teže poskusnih miši v študiji primerjam s količino beljakovin in količino lizina?to je s'podatkoma'o posameznih dejavnikih, hranilne vrednostijki sta v sodobnem žlahtnjenju ječmena za višjo hranilno vrednost najbolj upoštevana* - 11 - NALOG A. ŠTUDIJE V ustanovi za žlahtnjenje rastlin v SvalSfu na Švedskem so v letih 1962-1966 razvili metodo biološkega testiranja rastlinskih beljakovin s pomočjo niši0Namen te študije je metodološko raziskati poskus izveden dosledno po standardnih.navodilih za izvedbo biološkega-testa rastlinskih beljakovin s pomočjo misiaPri tem pokazatelje prirasta tez miši primerjam s pokazateljema^! ju najobicajneje uporabljamo v žlahtnjenju rastlin za visoko količino in kvaliteto beljakovin ječmenaj s količino beljakovin (N x 6;,25) in z vsebnostjo lizina« Pri ugotavljanju možnosti izboljšav v pogledu zanesljivosti in hitrosti testa je trebac - ugotoviti, katere metode izvrednotenja rezultatov je možno uporabiti pri tem testu? - ugotovitij kateri prirasti živali najjasneje kažejo razlike v hranilni vrednosti vzorcev ječmena. Ječmen je bil izbran za modelno rastlino,ker so razmeroma dobro znane reakcije laboratorijskih živali na različne aminokislinske sestave pri ječmenu (S g g.u m 1967 a, H u n o k lQ7o b?c0)*!Da študija je hkrati tudi priprava na biološko testiranje drugih rastlin,predvsem koruze in rastlin'za zeleno moko« - 12 - MATERIAL IN METODIKA..' Vzorci ječmena Vzorci ječmena so označeni s številkami lo6 do 12o« Vzorci izvirajo iz južnega področja Švedske,Skupna količina "beljake.vin v vzorcih je bila ocenjena po Kjeldahlovi metodi (faktor 6,25) z rutinsko analizo v kemijskem laboratoriju ustanove,v kateri je potekal eksperimentalni del raziskave (tabela I)«Za analize in za pripravo krme so bili vzorci zmleti (mlin kladivar KnoteoIist/^/s)0Raziskani vzorci ječmena (tabela 1) so imeli 8,88 do 14,28% beIjakovin, srednja vrednost beljakovin je 11,11 ^Celokupnega lizina je bilo v vzorcih od 22,79 do 3o,25 (poprečno 26,37)mi~ limolov na kilogram suhe snovi vzorcae Lizina v beljakovinah je bilo od 0,200 do 0,277 (poprečno 0,239) mola na kilogram beljakovin,. Med količino beljakovin in količino lizina v vzorcu je pozitivna korelacija, korelacijski koeficient r = 0,89 je značilen (P>o?99)»-Med količino beljakovin v vzorcu in količino.lizina v beljakovinah je negativna korelacija,korelacijski koeficient r =~0587 je značilen (P>0,99)»Korelacija med količino lizina v vzorcu in količino lizina v beljakovinah vzorca ni značilna„ Pri ječmenu je lizin aminokislina,ki je cesto.v mini- . murnu (Munck 1964? Munek;197o).Munck (1964?1968) tudi poroča,da se dostopnost lizina ječmena lahko zmanjša pri določenih razmerah spravila, sušenja in skladišče- - 13 - nja. Eggum (1967>) pa poroča, da je pri ječmenu lahko prebavljivost lizina le 72,3 ^ tudi če je prebavljivost surovih beljakovin (celokupen N) 82,0 % in. prebavljivost drugih raziskanih aminokislin med 75,5 in 90,4%. Vsebnost lizina v vzorcih so analizirali .v laboratoriju instituta za biokemijo Univerze v Uppsali s pomočjo kolonske kromatografije, "Dostopnost" bazičnih aminokislin vzorcev je preveril R.Mossberg v kemijskem laboratoriju inštituta za žlahtnjenje rastlin v Landskroni»Drobno zmletim vzorcem je dodal raztopino-azosulfonskega barvila Acilane Orange G- (BAYER C.I, 1597o),ki se veže s prostimi imidazol,gvanidin in a-minoskupinami histidina? arginina,oziroma lizina ter s prostimi terminalnimi amino skupinami beljakovinske verige (Mossberg 1969?197o)0S kolorimetriranjem pri valovni dolžini 475 um je Mossberg ugotovil količino vezanega barvila«Vrednosti za vezavo barve (DBC, dye-binding capacity) so pri raziskanih vzorcih ječmena dobro ustrezale vsotam vsebnosti bazičnih aminokislin (histidinajarginina in lizina),tako da ni bilo možno ugotoviti kakega zmanjšanja fiziološke dostopnosti bazičnih aminokislin zaradi blokiranih imidazol,gva~ nidin oziroma aminoskupin»Vsa količina aminokislin histidina,arginina in lizina tudi v nepoškodovanem vzorcu ni dostopna živalim v celoti (Eggom 1967)?toda na podlagi Mossbergove raziskave lahko trdimo,da je količina dostopnih bazičnih aminokislin v vzorcih sorazmerna količini teh aminokislin. Dostopnost lizina torej ni značilno neenakomerno zmanjšana pod vplivom - 14 - ukrepov pridelovanja, spravila, sušenja in skladišče-nja. " • Carpenter in Ellin ger. (1955) ter Bruno in Carpenter (1957) so razvili •'.' kemijsko metodo ugotavljanja "dostopnega lizina",to je. liziiia,ki ima prosto epsilon amino skupino ?Metoda, znana pod imenom "Carpenterjeva metoda" je zasnovana na reakciji med l-fluoro-2,4-dinitrobenzenon (PDKB) in prostimi amihoNskupinami.Za žito in drago krmo,ki vsebuje veliko škroba,metoda ni primerna« Matheson (1968 a,b)je metodo izpopolnil in zmanjšal,vpliv škroba na rezultate« M a u r o n (1970) je dokazal,da se količine "dostopnega" lizina,ugotovljene s Carpenter-jevo metodo ujemajo z rezultati o "dostopnosti" lizina ugotovljenimi z encimatsko metodo ter z rezultati prirasta živali,Tako se na primer pri pripravi mleka v prahu zmanjša količina "dostopnega" lizina(po vseh treh metodah ugotavljanja dostopnosti) od 8,3-8,4- g lizina/16 g IT na 1,9 - 2,3 g/16 g N,'medtem ko se celokupna količina lizina v vzorcu zniža sa-. mo od 8,3 na 6,1 g/16 g LT0 Po M a u r o n u (l97o) predstavlja razliko med "dostopnim" lizinom in celokupnim lizinom v vzorcu lizin .z blokiranimi epsilon amino skupinami4Ko govorimo o "dostopnem" lizinu,mislimo s tem na lizin,ki je ugotovljen kot "dostopen" po Carpenterjevi metodi. 0 s e r (l97o) ugotavlja,da je.zaradi blokirane epsilon amino skupine lizina,ki .postane -fiziološko nedostopen,ovirano tudi proteoli-tično delovanje tripsina ter s tem znižana prebavljivost beljakovin. To pa ima le omejen vpliv zaradi de lova- .? nja ostalih proteolitičnih encimov v prebavilih. Podobno kot dostopnost lizina?je lahko znižana tudi dostopnost metionina (Horn et al.1968) in drugih' .aminokislin (Brttggemann in Erbers-d o b 1 e r 1968), Bender (l97o) ugotavljala so najpogostejši vzroki zmanjšanja dostopnosti aminokislin med predelavo beljakovinske krme in hrane temperaturafčas gretja,vlaga in prisotne reducirajoče snovi.Da prihaja v praksi do tako pogostega nižanja "hranilne vrednosti beljakovin zaradi nedostopno- ' sti posameznih aminokislin,je vzrok v pomanjkljivi kontroli predelave. M o us tafa (1966) je raziskoval,kako vpliva predelava ribje moke na hranilno vrednost in na količino dostopnega lizina.Ugotovil je zelo dobro korelaci-'jo (r=o,99o)med dostopnim lizinom in biološko vrednostjo beljakovin. Če je bila pred kemijsko analizo aminokislin narejena kisla hidroliza,ni možno ugotoviti zmanjšane dostopnosti aminokislin (Bender 197o).S pomočjo bioloških testov lahko ugotovimo le zmanjšanje dostopnosti omejujoče aminokisline(najbolj deficitarne esenciel-ne aminokisline)?razen če ni narejen poskus s suple-mentiranjem različnih aminokislin (Bender 197o). Nekatere skupine aminokislin imajo skupen mehanizem prehoda iz prebavil v kri.Ce je v hrani veliko ene od takih aminokislin,je s tem ovirana dostopnost druge. - 16 - (S a u be r 1 i c h 1961, T as a k i in Tak a has hi 1966? E g g u m 1967 a).Pri tem je treba razlikovati zmanjšano dostopnost določene aminokisline (dokazano s korekcijskim delovanjem suplementacije)od.škodljivega delovanja presežne aminokisline (E g g u m 1967b).Na absorbcijo lizina v črevesu vpliva tudi prisotnost sladkorjev (Mu n c k 33. G-. 1968) .Pri krmljenju živali z žiti nastanejo v prebavilih razmeroma velike količine sladkorjev« "Dostopnosti" posamezne aminokisline torej ne moremo gledati samo kot funkcijo lastnosti krme temveč je absorbcija aminokislin odvisna tudi od kemijskega ravnotežja snovi v prebavilih ter od aktivnega transporta aminokislin iz prebavil v kri (H a s s e t 1964, M u n c k B.G.1968, M e t t r i'c k 197o). 'Količine prostih aminokislin krvne plazme po obroku so v povezavi z relativnimi koncentracijami aminokislin v hrani.Na ta način lahko posredno tudi ocenjujemo kolikšna je dostopnost aminokislin hrane ali krme. (Longene.cke r 1963, str. 123--136). IT a s s e t (1964) ugotavlja slabo ujemanje razmerij aminokislin krvne plazme z razmerjem aminokislin sprejete hrane.'Raziskave E rb e r s- ' d-o bi e r-ja et al. (1968) in Kihlber g-a (l97o) potrjujejo ustreznost upoštevanja koncentracije prostih aminokislin krvne plazme kot ocene dostopnosti aminokislin. - 17 - Tabela 1. Količina beljakovin. (N x 6,25) in lizina v vzorcih ječmena Crude protein (N x 6,25)and lysine in barley samples - 18 - E g g u m (1967) je ugotovil,da prebavljivost (dostopnost)posameznih aminokislin odstopa navzgor in navzdol od prebavljivosti beljakovin tudi pri nepredelanih rastlinskih beljakovinah.Poškodbe pri predelavi (visoka temperatura in drugo) torej niso edini vzrok različne fiziološke dostopnosti posameznih aminokislin.Ti podatki tudi kažejo, da bi bilo nepravilno ugotavljati količine prebavljivih aminokislin tako,da bi podatke o količini aminokislin v krmi množili s faktorjem/prebavljivosti beljakovin. .. -19- ŽIVALI Za poskus so uporabljene, laboratorijske miši, samci inbridirane linije. CBA.To je linija sivih miši inbridiranih več kot trideset let.Sedaj je vzdrževana kot populacija(M U n c k 1964 b).Predhodni poskusi z živalmi iste linije v istem laboratoriju .(Mu a c k 1967)kažejo,da so živali genetsko razmeroma močno izenačene. Ekološke razmere poskusa so tudi zelo izenačene. / o Automatsko sta bili regulirani temperatura (25 C- o,5 )in relativna zračna vlaga(6o %),Urejena je bila zvočna in svetlobna izolacija ter osvetlitev (svetloba 12 ur dnevno, od 8 do 2o ure). Cas smo merili v laboratorijskih dnevih od 12,01 do 12,00 ure. Miši smo tehtali ob zaključku, laboratorijskega dne,to je od 10 do 12 ure.Isto časno smo dodali hrano in vodo ter odstranili iztrebke. Kot čas rojstva živali je bil zapisan čas zaključka laboratorijskega dne,v katerem je bila žival ro-jena.Po Štiri živali so bile v plastičnih kletkah odpornih pri- avtoklaviranju.Dva centimetra nad dnom kletke je bila nerjaveča kovinska mreža,ki.je prepuščala odpadke.Vsakih pet dni so bili odpadki od-. stranjeni,Kletke so bile nameščene na lesenem ogrodju; Prvih 2o dni po rojstvu so dobivale živali izenačeno hrano.Poskus se je začel v začetku 21.dne ter je tra- - 2o - 'jal do zaključka 4o.dne.Živali so bile hranjene ad libitum iz steklenih avtomatov za hranjenje (M'u nek 1964 b).Zmletim vzrocem ječmena so bile dodane mineralne snovi in vitamini»Ra 1 kg vzorca je bilo uporabljeno o,3 g naslednje mešanice vitaminov; o,l g biotina, o,25 g folne kisline, 2,5 g m&tilnaftokinonsulfata, 2,5 g.piridok-sina, 5jo g tiamina, 5,0 g' riboflavina, lo,o g ni-kotinamida? 2o,o g kalcijevega pantotenata, 1 mg kobalamina, 5o,o g inozitola in lo,65 g aerosila. Aerosil je inerten medij,ki absorbira vodo.Poleg 0,3 g/kg omenjene vitaminske mešanice je bil vzorcem dodan še holin klorid (1 g/kg),vitamin A (500 IE/kg) in vitamin D(225 IE/kg). 2\Ta 1 kg diete je bilo dodanih tudi 4o gramov naslednje mešanice mineralov : KJ (o,5g)j MnSO (l,o g), ZnC0^(o,3 g), .CuSO (o,3-g), CoCl2(o,3 g), PeS04(6,o g), MgSO4 . (36,o g), CaC03(l64,o g), Ca3(PC>4)2 (15.3,o g), . Ha2HP04(loo,o g), NaCl(96,o g), K2HP04(98,o g), . EOOCCH (269,0 g). - 21 - 3.3.. METODE VREDNOTENJA HRANILNE VREDNOSTI BELJAKOVIN Metode vrednotenja beljakovin delimo na kemijske in biološke»Biološke metode nam neposredno pokažejo hranilno vrednost beljakovin v konkretnih pogojih s pokazatelji,ki so zelo podobni pokazateljem rezultatov prireje' živali.V nasprotju z biološkimi metodami nam dajo kemijske metode posamezne podatke?na podlagi katerih lahko bolj ali manj točno napovedujemo rezultate,ki bi v določenih pogojih nastali pri prireji domačih živali.Razlika med kemijskimi in biološkimi metodami je z metodološkega stališča predvsem v tem7da bio-, loške metode same kompleksno zajemajo vse dejavnike hranilne vrednosti krmil,medtem ko kemijske metode a-nalizirajo posamezne dejavnike;na podlagi teh analiz ter ob uporabi modelov pa potem podatke sumiramo.Ustrezno je torej metode razdeliti na analitične in komplek-sne. :3.3.1 Kompleksne metode Ravnotežje dušika . Raziskovanje uravnovešenosti sprejemanja in oddaje dušika je zelo pomembno za proučevanje izkoriščanja in ' presnove beljakovin v telesu. Thomas (19O9) je definiral ravnotežje dušika (B = balance) kot razliko med sprejetim dušikom (I) in. dušikom oddanim iz telesa v urinu (U) in blatu (3?). B = I - (U+F) - 22 - Po.Ikomas-u (19O9) je bilo ravnotežje dušika uporabljeno za določanje "biološke vrednosti", definirane kot procent sprejetega dušika,ki je ostal v telesu. K izpopolnitvi metode so prispevale raziskave M i t -s c h e 1 1 a (1962).Izpopolnjena metoda ne upošteva kot uporabljen dušik le dušik,ki se vgradi vtelo,tem-Voo tudi' dušik pri "notranji" presnovi v tolesu. Ta del dušika,izločenega v urinu,ki izvira iz notranje presno-. ve, se imenuje "endogenous N\ Ugotovi se ga s primerjal-niiai biološkimi testi z dietami brez dušika (A 1 b a-nese in Orto 1963) ali z dietami,ki jim je dodana točno znana majhna količina popolnoma prebavljive beljakovine (E g g u m 1969)« Podobno je ugotovljen N presnove,to je del dušika v blatu.,ki ga v blato izločijo stene prebavil. Po T h o m a s- M i t s -c h e 1 1-ovi metodi je enačba ugotavljanja biološke vrednosti beljakovin naslednja (S g g u m 1969)2 N hrane-(H blata-H presnove)-(N urina-N' endog. )lo0 m=z —? ; ' N hrane-(K blata-lTpresnove) Uporaba te metode je zelo razširjena,kot eksperimentalne živali najpogosteje uporabljajo podgane (E g g u & in Mercer 1964). Slabost Thomas -M its che 11 -ove metode je v tem,da je ugotavljanje endogenega dušika in dušika presnove osnovano na predpostavki,da se metabolizem živali z izokalorično nebeljakovinsko hrano ne razlikuje bistveno od metabolizma Šivali,ki .so bile krmljene s te-stirano beljakovino»Še.širšo uporabo Thomas-,-M i t. s c h e 1 1 -ove metode ovira, da uporaba te me- - 23 - tode zahteva veliko dela ter da pri čim natančnejši izvedbi postopka nastajajo razne tehnične težave,kot na primer problem hitre in popolne ločitve urina in blata. Izkoristek dušika hrane se lahko ugotavlja tudi z razliko med količino dušika v telesu poskusnih in prime-rjalnih živali»Količina dušika je ugotovljena s kemijsko analizo (K j e 1 d a h l) cele živali.Primerjalno skupino živali, ki je popolnoma enakovredna poskusni skupini,se usmrti in analizira ob samem začetku poskuša.Pokazatelj zasnovan na tej metodi HPU (Net protein Utilization)sta razvila Bender in Doel (1957)« NPU je primeren za ocenjevanje hranilne vrednosti rastlinskih beljakovin,v katerih je omejujoča aminokislina lizin,ker je zelo 'dobra pozitivna korelacija med 1TPU in lizinom v krmi (E g g u m 1969). Na presnovo beljakovin lahko vplivajo tudi nekateri ne- beljakovinski dejavniki hrane oziroma krme.Pri prenizki kalorični vrednosti krme in visokem procentu beljakovin" se zniža beljakovinska "hranilna vrednost" beljakovin, ker se jih del uporabi kot vir energije.Da se temu izo gnemo, uporabljamo pri raziskovanju hranilne vrednosti beljakovin diete s približno lo% beljakovin.Za uspešen potek raziskav je treba zagotoviti v krmi tudi zadostne količine mineralov in vitaminov. ' Prirast živali 0 s b o r n e et.al. (1919) so ugotovili korelacijo med prirastom telesne teže mladih podgan in med hranilno - 24 -. vrednostjo krme0Uvedli so pokazatelj PEE (Protein Efficiency Ratio),ki je definiran kot v gramih izražen prirast telesne teže na, gram s hrano sprejetih beljakovin«,Čim boljša je kvaliteta beljakovin,tem nižji procent beljakovin mora biti v hrani,da se doseže optimalni PEE0Zaradi lažje in nepristranske primerjave je uveljavljeno merjenje PEE na nivoju lo $ beljakovin v krmi. Bender in D o e 1 i (1957) sta uvedla pokazatelj NPR (Net Protein Retention),ki primerja teže sku-.pine živali5hranjene z lo tfo testirane beljakovine ter skupine,hranjene z nebeljakovinsko krmo»Tako ni upoštevana le uporaba beljakovin za prirast,temveč tudi uporaba beljakovinski se v času poskusa uporabijo v procesih presnove. Metoda NPR je torej zasnovana na predpostavki,da se metabolizem živali obeh skupin bistveno ne razlikuje. H e g s t e d in Vorcester (194-7) ugotavljata, da je prirast teže živali lahko zadosten pokazatelj hranilne vrednosti beljakovin,brez upoštevanja količine konzumirane hrane,oziroma količine konzumi-ranih beljakovin, Metoda EPU že upošteva beljakovinski del prirasta živali. Le, da- ta prirast beljakovin (akumulacija dušika v telesu)ne moremo meriti individualno., saj bi z ugo-tavljanjem količine dušika v telesu živali 'ob začetku poskusa žival usmrtili. Pri miših istočasno kot dušik (za NPU) ugotavljamo tudi količino masti (M u n c k 1964 b),kar skupaj daje oceno razmerja med mesom in inastj o.Pri prašičih je razmerje meso/mast eden od pomembnih kriterijev kvalitete svinj za zakol ter je v pozitivni korelaciji z "biološko vrednostjo krme' (Clausen 1963, L a r s s o n et al.1966) .ITPU. ter razmerje meso/mast sta lahko preciznejša pokazatelja hranilne vrednosti kot celoten prirast teže živali, saj ta ne pomeni vedno povečane depozicije beljakovin^ sodobni živinoreji pa je cenjen predvsem beljakovinski prirast živali.Prirast teže živali kot pokazatelj ima prednost,da so taki poskusi hitrejši.Medtem, ko je nemogoče individualno upoštevati količino dušika v telesu ter razmerje meso/mast ob začetku poskušala, je. možno natančno individualno upoštevanje' startne teže živali pri ugotavljanju prirasta teže. Od laboratorijskih živali se najširše uporabljajo podgane, tako za vrednotenje hranilne vrednosti rastlinskih in drugih beljakovin ter mešanic,kot za ugotavljanje zakonitosti fiziologije prehrane (H e h r i n g et -al. 1959? E g g u m in M e r c e r 1964, B u n y a n _ . in -W oo d h a m 1964? E g g u m 1969? E g g u m 197o, K i h 1 b e r g 197o)* B o s s h a r d t et ak (1946) so ugotovili primernost miši za vrednotenje hranilne vrednosti beljakovin. 2 r oe 1 s e n in Beli (1961) ter E g g u m et al. (1969) so ugotovili dobro korelacijo med rezultati bioloških poskusov z mišmi in prašiči. Bell (1962) je ugotovil,da so za miši esencielne aminokisline metionin,fenilalanin,valin,leucin,izoleucin,lizin, treonin .in cistein. G a 1 i in K y 1 1 e (1968) - 26 - sta raziskala zakonitosti rasti laboratorijskih, mi-' si.Ugotovila sta -zelo hitro prirast živali med 2o.' in 4o. dnevom. Primernost OBA miši za vrednotenje hranilne vrednosti ječmena je raziskal M u n c k (1964 a,b,c, 1966). M u ti c k je raziskal tudi problem genetsko konsti-tucije poskusnih živali (l! u n e k 1967, IS. u n c k 197o a). Ugotovil je,da so lahko tudi heterotične živali (3?n .generacija) ustrezne za tovrstne te ste.Pomen dedne konstitucije za hitrost prirasta miši sta raziskovala-tudi I a n g in legates (1969), ki sta ugotovila značilne razlike med linijami selekcioniranimi za visoko, oziroma nizko težo živali ob zaključku šestega tedna starosti. Druge kompleksne metode Tetrahymena pyriformis,ki jo uporabljajo pri mikrobiološki, metodi kompleksnega oziroma sumarienega ocenjevanja hranilne vrednosti beljakovin ima zahteve po a-minokislinah zelo podobne zahtevam višjih živali.Metodo skušajo prilagoditi za cim širšo uporabo (E g g u m et al.l969j Helms in H o i 1 e 197o).V uporabi so še razne- druge mikrobiološke metode,ki pa se jih u-porablja za ocenjevanje posameznih dejavnikov hranilne vrednosti beljakovin in torej ne spadajo med kompleksne' temveč med analitične metode. Za kompleksno oziroma sumarično oceno hranilne vrednosti beljakovin skušajo uporabljati tudi koncentracijo uree v krvi,količino izločene uree, razmerje med koli- - 27 - čino kreatinina v urinu in med celotnim izločenim dušikom^ beljakovine krvne plazme ter razmerje med prostimi neeseneielnimi. in esencielnimi aminokislinami krvne plazme (A 1 b a n e s e in 0 r t o 1963, Holt et al. 1963, E g g u m 1969, W a t e r 1 o. w 197o7 1 u 1 s t a d 197o)aOmenjeni faktorji so odvisni pred-vsem od procesov presnove organizma in le posredno tudi od kvalitete s hrano sprejetih beljakovin,zato ne omogočajo dovolj nepristranske ocene vrednosti beljakovin hrane. 3.3.2.Analitične metode Vsebnost beljakovin Pri krmi z beljakovinami približno enake sestave in prebavljivosti je zelo dobra povezanost med količino beljakovin in med hranilno vrednostjo. Tako cesto upo- rabljamo podatek o količini beljakovin v krmi za' oceno hranilne vrednosti krme„navadno skupno s podatki o prebavljivosti ter o vsebnosti in prebavljivosti drugih snovi. Prebavljivost beljakovin lahko ugotavljamo in vivo ali in vitro«, Vsebnost beljakovin lahko določimo neposredno ali posredno.V agronomski praksi so uveljavljene razne metode posrednega ugotavljanja količine beljakovin,zlasti metoda ocene beljakovin s pomočjo ugotavljanja K po Ejeldahlovi metodi.Pri posrednih metodah je lahko sporen faktor,s katerim, pomnožimo rezultat meritev,da dobimo oceno vsebnosti beljakovin.Ki pomembno samo v - 28 - konkretnih primerih preverjati in kor^irati uporab-' Ijeni faktor,temveč tudi paziti na možnost grobih,ponavljajočih se napak pri nekritični uporabi posrednih metod. Često predpostavljamo, da vsebujejo beljakovine 16% dušika,oziroma da dobimo procent celokupnih a-li "surovih beljakovin",Se procent dušika v krmi' množimo s faktorjem 6,25 (loo/l6). Na osnovi kvantitativne analize aminokislin je S g g u m (1966) za vrsto beljakovin ugotovil, kakšen je ta faktor. Po tem viru so na primer faktorji. Faktor 6,71 je E g g u m dobil za ječmen z analizo štirih vzorcev,faktorji izračunani za posamezne vzorce varirajo od 6?67 do '6,;78„ Žal avtor ni navedel koliko se raziskani vzorci razlikujejo med seboj po dragih lastnostih,na primer po vsebnosti beljakovin»Znana je negativna korelacija med količino beljakovin v vzorcu in med vsebnostjo lizina v beljakovini (glej stran 12) Ker take korelacije (pozi- - 29 - 'tivne ali negativne)lahko pričakujemo tudi za ostale aminokisline smemo pričakovati,da se bo hkrati s procentom beljakovin v vzorcu spreminjal tudi pro-cent dušika v beljakovinah Nekatere aminokisline (arginin,histidin,lizin)vsebujejo relativno veliko dušika,nekatere.druge aminokisline (tirozin,fenila-lanin, metionin)pa imajo malo dušika„ Količine aminokislin Pri prehrani živali ni potrebe po beljakovinah kot takih,temveč le po aminokislinah,ki jih beljakovine vsebujejo4Ne moremo se več zadovoljevati s tem,da bi potrebe živali po beljakovinah' izražali s količino 'prebavljivih beljakovin,ker ta podatek ni odločilen za optimalno prirejo mesa (C 1 a u s e n 1963).Hranilno vrednost beljakovin ocenjujemo na osnovi rezultatov predhodnih kemijskih ali mikrobioloških'(3 o-1 i n d e r 1966,1968,197o) analiz aminokislin« M i t c h e 1 1 in Block (1946) ter Block in M i t c h e 1 1 (1946) sta predlagala,naj bo količina najbolj omejujoče aminokisline osnova za izračun hranilne vrednosti beljakovin«Hranilno vrednost beljakovine bi naj predstavljal procent omejujoče a-minokisline v raziskovani '. beljakovini v primerjavi z določeno referenčno beljakovino(kokošje jajce), 0 s e r (1951) je. predpostavljal,da je verjetnost,da so vse esencielne aminokisline na razpolago na mestu sinteze beljakovin v živali funkcija produkta koncentracij aminokislin.Pokazatelj,ki ga 0 s e r pred- - 3o - laga (EAAI - Essential Amino Acid Index)upošteva razmerja mod količinami posameznih esencielnih aminokislin v preiskovani beljakovini in v referenčni beljakovini. Za referenčno beljakovino je 0 s e r izbral količino aminokislin v beljakovinah kokošjega jajca. V nasprotju z metodo Mitchell-a in 31ook-a (1946) v določenih.primerili,ko večina aminokislin ustreza referenčni beljakovini,metoda po Oser-ju ne pokaže dovolj negativnega učinka pomanjkanja omejujoče aminokisline. Almquist (1954) in Kofranyi (1956) poudarjata pomen omejujoče aminokisline.Hranilna vrednost'.beljakovin je tem vis ja? čimbolj aminoki-slinski sestav ustreza potrebam živali po aminokislinah. Če je v beljakovini krme ene od esencielnih aminokislin na primer samo 5o% relativne potrebe živali po tej aminokislini,je beljakovina le polovično izkoriščena (Iro ngenecker 1963, str« 117). Harper in E u m t a (1959) sta ugotavljala pomen ravnotežja aminokislin v krmi ter poudarjatajda je treba razlikovati posledice nepravilnega razmerja ami-' nokislin od škodljivosti pri preveliki koncentraciji posamezne aminokisline„ Rama R a o et al. (1964-) so predlagali pokazatelj EI (Requirement Index),kjer bi bile zahteve živali po aminokislinah osnova izračuna hranilne vrednosti analizirane beljakovine in ne referenčna beljakovina. Hackler et al.(1967) so za frakcije soje ugotovili slabo korelacijo ocen hranilne vrednosti na osnovi analiz aminokislin (EAAI in EI) s hranilno vrednostjo -•31 - teh beljakovin ugotovljeno z biološkim testom. Ugotavljanje drugih dejavnikov Cesto so. v beljakovinski krmi prisotni tudi nekateri nebeljakovinski dejavniki,ki nizajo izko« riščanje beljakovin pri živalih. Podrobneje so doslej raziskovali vpliv gosipola v bombažu (B a -liga et al01959), Škodljive fenole v rži,pše-nici in Iriticaie (W i e r in g a 1967? H o 1 m-b e r g in 0 h i s s o n 1958),beta glukane in druge podobno delujoče snovi pri ječmenu,rži in pšenici (Burne t t ' 1965, M u n c k 1968), inhibitorje tripsina pri stročnicah,pšenici,rži in. ajdi (L a pN o r t e in T r e m o 1 i e r e s I962, Bender 197o) ter razne rastlinske toksine »Hranilno vrednost beljakovinske krme lahko znižajo tudi miko toksini .čudi .to je ,vzrok,da večkrat hranilna vrednost beljakovin,ocenjena na osnovi podatkov o vsebnosti in dostopnosti aminokislin, ne ustreza dejanski hranilni vrednosti,ugotovijeni s poskusi na živalih. - 32 - R E Z U L T A T I IN DISKUSIJA Teže živali in prirasti tež- V poskusu so bile živali naključno razporejene v 1% skupin po 8 ali 12 živali0Skupno je bilo vklju čenih v poskus 144 živali oHranjene so bile ad li bitum z vzorci ječmena označenimi s Številkami ?loS - 12o(labeIa i)c (Med poskusom je užla is klet- 'ke ena žival iz skupine.; krmi j ene s vzorcem Š"b/ioo, zato je bila ta skupina živali odstranjena iz poskusa) ; leža živali(izražena v gramih)je bila ugotavijana v začetku poskusa(oznaka A),po 5 dneh poskusa(oznaka B),po lo dneh poskusa (oznaka C), po 15 dneh pesku-sa(oznaka D)in po 2o dneh ob zaključku poskusa(ozna-ka E)0'!ekoči in trdni ekskrenenti izločeni med tehtanjem so bili upoštevani kot sestavni del teze živali'. Teža ušesne markiee je bila upoštevana pri tehtanju in njena teža odšteta. Prirasti v posameznih obdobjih so izraženi kot razlika rež v začetku in ob koncu določenega obdobja(na primer prirast v lo dneh od ugotovitve' tež A do ugotovitve tež G je označen s C-A). V tabeli štev.20 (dodatek)so v gramih označene teže živali in prirasti tež v posameznih obdobjih za posa mezne sku-oine živali krmljene s določenimi vsorci je- - 33 - - 34 - 4.2. Simetričnost distribucij] . Parametri so mere posameznih lastnosti statističnih, populacij. Ce s pomočjo lastnosti vzorca ocenjujemo parametre populacije, nato pa na podlagi domnev '. • o razporeditvi populacij izvajano oklepe,so to parametrične metode0Y primerih?ko omenjene domneve u-. stresajo dejanski razporeditvi popuiacijjje tako . sklepanje pravilno.Če dejanska razporeditev odstopa od domnevane razporeditve?lahko nastanejo neustrezni sklepi. Raziskovalec se mora pri uporabi parametričnih., me tod stalno zavedati, da so te metode zasnovane na določeni domnevi ter s kritičnim vrednotenjem uporabljene metodike in rezultatov zagotoviti, da to ne pripelje do napačnih sodb o raziskovanih populacijah. Da bi ugotovili, ce je razporeditev populacij iz katerih so vzeti raziskovani vzorci normalna in če smemo uporabiti nekatere običajne statistične metode, ki predpostavljajo normalnost razporeditve raziskovane populacije.moramo preveriti simetričnost razporeditev vzorceVokazumijivo, da nobena od razporeditev vzorcev ni popolnoma simetrična»Ugotoviti pa moramo, ali lahko domnevamo, da je opazovan odklon od simetrije nastal le kot posledica vzorčenja,to je po naključju, oziroma pod vplivom maksimalno konkretnih dogodkov pri vzorčenju. Uporabljena je bila metoda testiranja simetričnosti pri majhnih vzorcih(Sncdeeor 19S2,str«,I99-2ol)'Me-rilo asimetrionosti označujemo z g 7 izračunamo ga po enačbi t. . Merilo simetričnosti g., je lahko pozitivno,,negativno ..ali enako, nič o če je g,=0 je' vzorec .simetričen0Poziti--ven g., je znak^da je - prekomerno stavilo enot vzorca manjših oči poprečja,-negativen g- pa kazesda je večje število enot vzorca Večjih od poprečja Značilnost odstopanja vrednosti g1 ugotovimo, da vrednost g1 dolino s standardno napako te vrednosti ter dobljeno število primerjamo z ustrezno vrednostj o- t distribucije pri neskončnem'številu, stopinj prostosti.Vrednost t di-'. stribucijo pri neskončnem številu stopinj prostosti za P=o,o5 je 1,96o, za P=o,;ol pa je 2,57S. Dobljene t vrednosti sa posamezne vzorce so razvidne s tabele 3. Opisano pojavljanje aoimetricnosti pri nekaterih skupinah živali za nekatera obdobja poskusa nam še ne o-mogoča5da bi z določeno zanesljivostjo ugotavljali asimetrično razporeditev populacij,, iz katerih so vzeti opisani vzorci^Opozarja pa nas?da se vendar ne moremo popolnoma zanesti na simetričnost0Asimetričnost populacij je lahko taka, da bi se s večjo zanesljivostjo pokazala, če bi bili vzorci nekoliko večji. Če bi bili ~ 36 ~ vzorci večji, bi poleg natančnejšo raziskave simetričnosti lahko raziskali tudi eksces ter tako u-gotoviii. normalnost razporeditve populacij ali pa . potrdili upravičenost dvoma o nonaalnosti razporeditve populacijo Rezultate raziskavo normalnosti distribucij lahko razlagamo tako}da sicer ni formalnega razloga za o-vrženje upravičenosti uporabe parametričnih statistik, vendar da jih moramo uporabljati previdno ter rezultate tolmačiti z zadržkisče pa se pokaže kot. primerna katera od neparametrienih metod,jo lahko uporabljamo brez omenjenega zadržka. Tabela 3: t vrednosti za odstopanja od simetriSnosti t numbers for deviation from simmetry (Tabelarni t za P = o,o5 je 1,960 za P = o,ol pa je 2,576). - 38 - 4.3. -Analiza variance in kovariance Pri. računanju varianco in kovariance moramo upo števati, da je v to raziskavo pri različnih skupi- nali živali vključenih neenako število osebkov»Upo rabljen, je bil poseben program za obdelavo podat kov s pomočjo elektronskega računalnika,ki to upo števa (program je sestavila Ma0para-Müller). Kot variabla so upoštevani prirasti-živali v posameznih, obdobjih poskusa,, kovariabla pri. analizi kovariance pa je teža živali v začetku'poskusa« • • • Homogenost variance .Pomemben je podatek o homogenosti variance«Homogeno s t variance pri primerjanju večih skupin podatkov ugotavljamo s pomočjo Partlett-ovega testa homogenosti variance^ob upoštevanjusda imamo neenako število osebkov v skupinah(Snedecor 1962 ? str*287)'0Homogenost variance je bila raziskana za priraste od prvega do petega dne poskusa(izračunan korigiran hi-kvadrat 20,22)fod prvega do desetega dne poskusa(hi-kvadrat 3o,o3)od prvega do petnajstega dne poskusa (hi-kvadrat 11, 65), od prvega do dvaj- setega dne poskusa(hi-kvadrat 15,91).Pri 13 stopinjah prostosti je verjetnost hi-kva&rata večjega od 22,36 P=o?o5, večjega od 27,69 pa P=o,o1. -(S n e.d e e o r lS62,str028)0lTa osnovi teh podatkov še ne moremo zanesljivo sklepati o simetričnosti distribucij podatkovePotrebne bi bile dodatne - 39 - informacije in večje število poskusov.Nastanek velikih razlik med srednjimi kvadrati.odklonov od srednjih vrednosti je iahkp posledica vpliva vzorcev ječmena na živali5ali pa tudi posledica naključja oziroma maksimalno konkretnih dogodkov.Iz primerjav vrednosti S (tabela 4)s podatki o vzorcih ječ-mena(tabela l)ne moremo razbrati kakega določenega, vpliva vzorcev na varianco. - 4-0 - Tabela 4: Srednji kvadratni odkloni od sredine (S ) , za priraste (v gramih) v dneh poskusa 2 Mean squares (S ) for distributions of weight gains (in grams) in days of experiment - 41 - Tabela 5 : Analize varianc. Analyses of variance - 42 - Testiranje razlik med prirasti F-test (S n e d e e o r 1962,str4 244)kaze zna- čilen vpliv vzorcev ječmena na razlike med prirasti teže živalieZa obdobje poskusa od prvega do petega dne je F=3,4,?od prvega do desetega dne B=7,91, od. prvega do petnajstega dne F=9,O8 in od prvega do dvajsetega dne F=9,21. Pri P=o,05 je F==l,8o, pri P=o,o1 je F=2,28, SP 13 in 13o. Za testiranje razlik med prirasti skupin živali sem uporabil sekvenčno metodo testiranja (S n e-decor 1962, Str0 253). Ta metoda.je podobna Tu-keyevemu testu (S n e d e c o r 1962, str.251-253), s tem da upoštevamo število skupinski je po velikostnem vrstnem redu med primerjanima skupinama «Be~ .zultati izračuna so prikazani na tabelah 6, 7? 8 in 9. - 47- Analiza kovariance Ali nam lahko analiza kovariance prikaže razlike med poprečnimi prirasti skupin živali? Ali moremo uporabiti analizo kovariance v ta namen? Eden od pogojev za uporabo analize kovarianoe je homogenost regresijskih kvocientov (b).Ta pogoj v nekaterih primerih ni izpolnjen,saj je za priraste od prvega do petega dne poskusa za razmerje pojasnjene proti nepojasnjeni varianci F=4,00,za priraste od prvega do desetega dne poskusa je F=3,oo,za priraste od prvega do petnajstega dne poskusa je F=2,39.Pri stopinjah prostosti SP=13 za večji sred- nji kvadrat in SP=116 za manjši srednji kvadrat odklona od srednje vrednosti je pri upoštevanju obeh strani distribucije na nivoju P=o,o5 interpolirana vrednost F=2,5 (S n e d e c o r 1962,str.279).V o-menjenih primerih zaradi nehomogenosti regresijske-ga kvocienta ne moremo uporabiti analize kovariance. Hkrati pa nam to kaze tudi na to,da razlike v prehrani živali vplivajo na način odvisnosti prirasta živali od startne teže. Za prirast živali od prvega do dvajsetega dne poskusa so regresijski kvocienti homogeni,prav tako pa so homogeni srednji kvadrati odklonov od regresije.Tudi tu ne moremo izboljšati razlikovanja med sredinami prirastov skupin živali z uporabo analize kovariance - 48 - namesto analize variance,saj je pri analizi variance P=9,21, pri analizi kovariance pa F=9,17. '4.4. Neparametrično ugotavljanje razlik mod skupinami živali Neparametrične so metode,ki za razliko od parametričnih metod niso zasnovane na predpostavkah o distribuciji populacij. Od neparametričnih metod (T a t e in C 1 e 1 1 a n.d 1959)se je pokazala kot primerna metoda testiranja naključja pri razpredelnici 2 x 2.Da smo dobili tako razpredelnico, smo izbrali poljubno število m kot mejno vrednost pri odločitvah?ali smatramo določeni pri- rast posamezne živali za velik ali majhen.Vsi prirasti, ki so enaki m ali manjši od m so "nizki",vsi pri- rasti večji od m so "visoki'.Za mejno vrednost m u- porabimo aritmetično sredino sredin prirasta obeh u-poštevanih skupin živali ali drugo število,ki ni preveč oddaljeno od skupne aritmetične sredine.Tako dobimo razpredelnico 2 x 2 s štirimi vrednostmi G, H, I in J: - 49 ~ Tabela lo ' ........ Število živali ,. Skupina. manjših, od m ve5jih od m ali enakih . prva skupina G- H druga skupina I J V konkretnem primeru na primer za prirast od prvega do petnajstega dne in primerjavo skupin živali lo7 in 118 je srednji prirast skupine lo7 7,63 g?.sred~ nji prirast skupine 118 8,92 g (Glej tabelo 2) m = aritmetična sredina obeh sredin, torej je m=8, 28. Tabela 11 Število živali Kljub upoštevanju Yatesove korekcije (W a l s h 1962 f str0 46O; Goldstein 1964, str.lo8)je izračun hi-kvadrata ustrezen le, če v nobenem razredu ni pričakovano število manjše od 5.Distribucije prirastov so, kot smo pokazali (str0 35 )lahko asimetrične*Tako ne moremo ugotoviti pričakovanega števila v posameznem raz-reduaTudi pri veljavnosti ničelne hipoteze ne bi mogli zaradi asimetricnosti pričakovati razporeditve osebkov 5o : 5o v obeh razredih določene skupine živali;Še prav posebej pa to velja,če uporabimo vrednost m, ki ni iden- ~ 5o - tiena aritmetični .sredini obeh sredin skupin'živali. Uevarnostij,da izračunane vrednosti niso razporejene v skladu z razporeditvijo hi-kvadrat vrednosti,se ? izognemo tako,da namesto posrednega ugotavljanja verjetnosti konkretnih razporeditev preko tabel z verjetnostmi hi-kvadratov,ugotovimo verjetnost na- ' stopa konkretne in vseh ekstremnejših razporeditev • (ob predpostavki ničelne hipoteze)z neposrednim izračunom verjetnosti (Tate and Clelland,. 19597str. 73)posamezne razporeditve po formuli: V formuli (II)je P verjetnost določene razporeditve, N skupno število enot (G+K+I+J), G, H, I in J pa pomenijo isto kot v tabeli l0. Na ta način je izračunana verjetnost tako ekstremne razporeditve in vseh ekstremnejših razporeditev,kot je razporeditev v tabeli ll(ob hipotezi,da ni razlike med prirasti obeh skupin živali lo7 in 118) P = o?ooo3.Ker upoštevamo verjetnost dobljene in ekstremne jših razporeditev na obeh straneh,pomnožimo do- ' bljeno verjetnost z 2,To je verjetnost,da je ničelna hipoteza praviina0Če vzamemo kot mejo kriterij P=o,o5 ali P=o,ol lahko smatramo,da ničelna hipoteza v tem primeru ni potrjena. Ugotavljana vrednost P po navedeni formuli daje verjetnost nastopa obravnavane in vseh bolj ekstremnih raz- - 51 - poreditev vrednosti G, H, I, J v razpredelnici 2 x 2, s tem, da so robne vsote stalne.To pomeni, da lahko v konkretnem primera, primerjamo tudi skupine z neenakim številom živali,saj velja izračun verjetnosti nastopa take in ekstremnejših razporeditev 1© v odnosu do vseh možnih razporeditev z i-stimi robnimi vsotami.,to je med dragim z določenim številom živali v vsaki od obeh skupin,Z istega stališča lahko ocenjujemo tudi vrednost m,ki smo jo vzeli za mejo med "nizkim" in "visokim" prirastom v vsakem konkretnem primeru. Tako je načelno dopusten odmik vrednosti m od sredine sredin prirastov za dolo- . čeno vrednost.Tak odmik je dovoljen,,smiseln pa je le,če sta robni vsoti G+I in H+J kljub spremenjenemu m še vedno tako veliki števili,da je še možno dovolj veliko število različno ekstremnih razporeditev ob stalnih robnih vsotah ter s tem primerjava verjet- nosti nastopa posameznih razporeditev. Računanje verjetnosti veljavnosti ničelne hipoteze na opisan način je zelo zamudno.Nekoliko ga olajša uporaba dekadičnih logaritmov in N-log Ni tabel (Tate in C l e 1 1 a n d 1959,str. 73-74 in 144).S3 hitrejše pa je računanje verjetnosti s pomočjo posebnih tabeiypripravljenih v ta namen (Pearson in Hartley .1963,str.188 - 193). Rezultati ugotavljanja razlik med skupinami živali s pomočjo neparametričnih statistik so prikazani v tabelah 12, 13, 14, 15 in 16. - 57 - 4. 5. Funkcija biološke rasti B r o d y (1964) označuje s pojmom "rast" biološko sintezo organizma oziroma izgradnjo novih biokemičnih enot kot rezultanto anabolizma in katabolizma.Rast organizma je tak razvoj organizma, ki rezultira v povečanju žive snovi in je sestavljen iz enega ali več od naslednjih procesov: (a) večanje števila celic, (b) večanje velikosti celic, (c) vgrajevanje snovi vzetih iz okolja. Vse te'procese zajemamo, če merimo rast organizma . kot celote (G o s s 1964, str. 118-243, 3 r o d y 1964, str. 484-486). Po 3 r o d y -ju (1964, str.489-5o2) lahko težo živali v določeni starosti oziroma kumulativno rast organizma prikažemo z dvigajočo se S-krivuljo, pri tem je prvi del priraščanja pospešen, drugi del pa pojemajoč.Obračaj krivulje je v času pomembnih fizioloških sprememb. Splošna zakonitost biološke rasti v obliki dvigajoče se krivulje S je potrjena tudi s poskusi pri laboratorijskih miših (Gall in Kyle 1968). Pri primerjanju prirastov živali hranjenih z različnimi vzorci ječmena v določenem obdobju - 58 - poskusa so podatki obravnavani po običajnih metodah. Obravnavanje z različnih aspektov (upoštevanje različnih obdobij poskusa) lahko da nekoliko popolnejšo informacijo, kljub temu pa dinamična komponenta ni zajeta. Pri vrednotenju podatkov smo skušali tudi istočasno upoštevati teže posameznih živali pri vseh tehtanjih tekom poskusa.Z uporabo metode faktorialne analize (Snedecor 1962, str. 346-35o) smo vsoto kvadratnih odklonov podatkov petih tehtanj za posamezno žival razbili na ortogonalne primerjave s po eno stopinjo prostosti.Tako smo dobili vsote kvadratnih odklonov za linearno, kvadratno, kubično in kvartalno komponento regresi je. Za vsako od komponent regresije ( linearno,kvadratno, kubično in kvartalno) smo skušali ugotoviti, če se te komponente med skupinami živali, hranjenimi z različnimi vzorci ječmena, značilno razlikujejo. Posebej smo tako naredili analizo variance za linearno komponento, za kvadratno, za kubično in za kvartalno.Značilna je bila le linearna komponenta, ki se je tudi edina značilno razlikovala za skupine živali ( F = 6,08.Pri P = 0,99 je tabelarna vrednost F = 2,28 ). -59 - Nekatere skupine živali, hranjene z različnimi vzorci ječmena, se torej razlikujejo za intenziteto hitrosti priraščanja.Razlikovanje med skupinami živali, hranjenimi z različnimi vzorci ječmena pa na ta način vendar ni tako uspešno kot pri prirastih teže živali od prvega do desetega dne, od prvega do petnajstega dne in od prvega do dvajsetega dne poskusa (primerjaj strani 41 in 42).Linearna komponenta regresije značilno korelira z vsebnostjo beljakovin v vzorcih ječmena - ( r = 0,52 ; P> 0,99) in z'vsebnostjo lizina v ječmenu ( r = 0,51 ; P>0,99 ). Pri raziskovanju biološke rasti lahko upoštevamo, 'da predhodno stanje sovpliva na naslednje stanje, oziroma z drugimi besedami, da je naslednje stanje funkcija predhodnega stanja.Prof.R.Turk (1971) to izraža s splošno funkcijo: (III) yi+1= f (yi/K/) yi = predhodno stanje yi+1 = naslednje stanje /K/ so specifični konkretni vplivi okolja, v katerem raste raziskovan organizem. Postavlja se vprašanje, na kakšen način načelo, upoštevano v splošni funkciji (III), upoštevati - 6o - pri izračunu določene enačbe za posamezen konkreten primer. Pri razvrščanju podatkov o prirastu živali po načelu funkcije (III) se pojavlja nekaj posebnih problemov.V večajočih se vrednostih y je subsumirana tudi dimenzija časa, oziroma proces rasti-staranja živali.Tu nimamo časovno neodvisnega biološkega zaporedja, temveč posebno biološko-časovno zaporedje.Pojav upadanja tež živali se eventuelno lahko .pojavi v dobi staranja živali, kar pa je daleč izven obdobja razvoja miši, raziskovanega v tej studi ji.Namesto padanja teže živali pri visokih vrednostih y , se pojavi le padanje prirasta, kar pomeni, da se teža y.-, spreminja tako, da se pri visokih y temu približuje tudi vrednost yi+» Načelo enačbe (III) sem upošteval pri izravnavanju podatkov skupin živali z enačbo • (IV) y = bx + cx2 ? kjer je x začetna teža posamezne živali ob začetku določenega petdnevnega obdobja poskusa in.y teža živali ob zaključku tega petdnevnega obdobja. Enačba (IV) je eden od možnih načinov matematičnega izražanja odnosa funkcije (III).Vrednost b enačbe (IV) ob uporabi podatkov te študije dobro korelira z vsebnostjo beljakovin in lizina v vzorcih ječmena (tabeli 17 in 18). - 61 - Koeficient parcialne korelacije vrednosti b z vsebnostjo lizina pri konstantni količini beljakovin (r = 0,52) je značilen samo na nivoju verjetnosti P = 0,90.Je.pa pri istem številu stopinj prostosti vendar večji od ustreznih koeficientov parcialne korelacije med drugimi pokazatelji prirasta živali in med vsebnostjo lizina v vzorcu.(tabela 18). Vrednost c enačbe (IV) predstavlja zaviralni čini-telj biološke rasti.V raziskanem primeru je faktor c med vrednostima - 0,0193 in - 0,0321 in je v negativni korelaciji s faktorjem b ( r = - 0,96; P> 0,99 ). Da bi dobili jasnejšo sliko o pomenu vrednosti b enačbe (IV) bi bilo potrebno napraviti posebno študijo z večjim številom različnih vzorcev ječmena, ki pa bi bili izbrani tako, da ne bi bilo značilne korelacije med količino beljakovin v vzorcu in med količino lizina v vzorcu.Zamisel prof.Turka (1971) izražena v enačbi (III) bi pri taki študiji morala biti upoštevana tako, da bi bile živali tehtane vsak dan ali vsak drugi dan, namesto vsak peti dan, kot je bilo pri tej študiji. Upoštevanje poteka in zakonitosti biološke rasti nam prikaže prirast'živali v določenih konkretnih pogojih - 62 - v luči spreminjajočega se procesa.Tako se prav posebej pokaže, da pojem hranilne vrednosti ni enkratna in absolutna kategorija, temveč relativna vrednost, odvisna ne samo od lastnosti raziskovanega vzorca, temveč tudi od faze onto-genetskega (epigenetskega) razvoja in načina razvoja posamezne živali. Pri rutinskem določanju hranilne vrednosti vzorcev lahko uporabljamo le en dogovorjen in standardiziran kriterij določenega biološkega testa s poskusnimi živalmi, ob kritičnemu zavedanju omejitev pri tolmačenju rezultatov.Pri znanstvenem raziskovanju hranilne vrednosti in vrednotenja hranilne vrednosti, pa je treba upoštevati dinamiko rasti in spreminjanja živali in upoštevati več različnih pokazateljev. Pri raziskovanju biološkega testiranja ni pomembno samo, da ugotavljamo možnosti značilnega razlikovanja različnih vzorcev, temveč da skušamo tudi ugotoviti, kaj nam določeni pokazatelj biološkega testa sploh pove'. - 63 - Da bi bilo možno vzporejati posamezne dejavnike hranilne vrednosti ječmena z višino prirasta teže: živali, sem ob upoštevanju posameznega kriterija hranilne vrednosti ječmena razdelil vse analizirane vzorce ječmena na dve enaki skupini, skupino,v kateri nastopa določen dejavnik močno,in drugo,v kateri nastopa v manjši meri.To metodi hi-kvadrata sem primerjal števila živali z nadpovprečnim,oziroma podpovprečnim pri-rastom teže v obeh skupinah (tabela 19).Za prirasta od enajstega do dvajsetega dne in od šestnajstega do dvajsetega dne poskusa ne moremo dokazati nobene povezanosti med količino surovih beljakovin v vzorcu in med prirastom teže živali.Za priraste od enajstega do dvajsetega dne se po taki metodi kaže pomembna predvsem relativna količina lizina v beljakovinah vzorca ječmena, za prirast od šestnajstega do dvajsetega dne pa absolutna količina lizina v vzorcu.Za prirast od prvega do petega dne poskusa lahko dokazemo povezanost višine prirasta s količino surovin beljakovin,pa tudi s količino lizina.Ne moremo pa dokazati povezanosti količine lizina v beljakovinah z višino prirasta živali.Za vse ostale priraste lahko dokazemo povezavo z vsemi tremi kriteriji hranilne vrednosti vzorcev ječmena. To,da dokazemo povezanost posameznega kriterija hranilne vrednosti vzorca ječmena z višino prirasta teže . pri živalih še ne zadostuje,da bi lahko govorili o Vzročni povezavi.Raziskani činitelji hranilne vrednosti vzorcev ječmena so med seboj povezani,povezani pa so - 64 - tudi z drugimi bolj ali manj pomembnimi dejavniki^ ki vplivajo na hranilno vrednost. Ugotovljene povezanosti nas morejo samo usmerjati pri iskanju vzročnih povezav. - 66. - Tabela 18. Koeficienti korelacije Coefficients of correlation 1-level of significance 9o% 1-nivo značilnosti 2-level of significance 95% 2-nivo značilnosti 95% 3-level of significance 99% 3-nivo ' značilnosti 99% 1-5 prirast teže miši od prvega do petega dne poskusa 1-5 weight gain from 1st to 5th day of mice feeding trial -67 - Tabela 19 : Pli-kvadrat vrednosti za oceno povezanosti einiteljev hranilne vrednosti Ječmena 2 višino prirasta te2e miši. Chi-squares as estimation of. the relationship ? ??''•.' . ? ? • ? ? ? -between factors of nutritional value in, barley . and weight gains in certain periods of experiment. Pri SP = l je verjetnost hi-kvadrata večjega, od 3,84. enaka P - o,o5. A.t one degree of freedom 'the probability of chl-square greater as 3,84 is P" - o,o5„ - '68 - POVZETEK Štirinajst skupin po 8 ali 12 samcev inbridirahe linije miši OBA je bilo hranjenih ad libitum s štirinajstimi vzorci ječmena z znano količino beljakovin in lizina,katerega fiziološka dostopnost ni bila znižana.Poskus je trajal od dvajsetega do štiridesetega dne starosti živali,teža živali je bila ugotav-ljana na začetku poskusa,po petih dneh poskusa,po desetih dneh poskusa,po petnajstih dneh poskusa in ob zaključku poskusa. Pri posameznih skupinah živali se pojavlja značilno odstopanje od simetričnosti razporeditve prirastov, pri prirastih od prvega do desetega dne pa se je pojavila nehomogenost variance.Zato moramo biti previdni pri uporabi parametričnih statističnih metod in pri tolmačenju rezultatov dobljenih s temi metodami. Zakonitosti razporeditve populacij bi bilo treba raziskati z uporabo večjega števila živali,ki bi jih hranili z enako dieto.Uporabo analize kovariance z upoštevanjem startne teže živali kot kovarzole o-vira tudi nehomogenost regresijskih kvocientov. Zadržkov v zvezi z uporabo parametričnih metod ni treba upoštevati pri obdelavi podatkov z neparametričnimi metodami.Priraste živali dveh primerjalnih skupin je avtor študije z neko mejno vrednostjo razdelil v po dve kategoriji, nato pa z neposrednim izračunom verjetnosti naključne razporeditve števila živali v ~69: - omenjene kategorije ocenil verjetnost veljavnosti domneve, da med prirasti obeh. skupin živali ni razlike,oziroma da ni razlike med vplivi ocenjevanih vzorcev ječmena. V avtorju znani literaturi pri raziskovanju prirasta živali doslej taka neparametrična metoda še ni bila opisana.Ustreznost uporabe posameznih metod izvrednotenja rezultatov bi bilo možno podrobneje preveriti tako,da bi z enako dieto hranili veliko število živali ter primerjali dejanske razlike med sredinami enakovrednih vzorcev s pričakovanimi.Na ta način bi bila možna tudi kritična primerjava metod. Najjasneje se kažejo razlike med vzorci ječmena pri upoštevanju prirastov živali od prvega do petnajstega dne poskusa in od prvega do dvajsetega dne poskusa.Ker med obema trajanjima poskusa hi značilnih razlik v zanesljivosti razločevanja vzorcev ječmena,bi na podlagi te študije lahko skrajšali trajanje testa od dvajset na petnajst dni, ne da bi se s tem znižala zanesljivost testa, pridobili pa bi na hitrosti. Uporaba funkcije biološke rasti omogoča vpogled v dinamiko rasti in razvoja živali.Razvidno je,da obe raziskovani komponenti hranilne vrednosti vzorcev ječmena,količina beljakovin in količina lizina ne vplivata ves čas poskusa na enak način na-priraščanja živali.Pri podrobnejšem raziskovanju hranilne vrednosti vzorcev ječmena s pomočjo biološkega testiranja je zato treba upoštevati več različnih pokazateljev.Nakazuje se tudi možnost, da bi izbirali pokazatelje,ki bi bili v čim močnejši ko-relacijski povezavi s posameznimi pomembnejšimi dejavniki hranilne vrednosti.To je pomembno zlasti za uporabo biološkega testa hranilne vrednosti v žlahtnjenju rastlin. - 7o- 6 LITERATURA ALBANESE,A.A.and ORTO,L.A.(1963): Proteins and Amino Acids. In: Newer Methods of Nutritional Biochemistry, Ea.A.A.Albanese, Academic Press,New York ana London,1963, 1-112. ALEXANDER, D.E.,LAMBERT,R. J.,DUDLEY, J.?/. (1969): Breeding problems and potentials of modified protein maize, New approaches to breeding for improved plant protein,IAEA,Vienna,pp.55-65. ALMQUIST,H.J.(1954): Utilization of amino acids by chicks. Arch.Biochem.Biophys.52.197-2o2. AULSTAD,D.(197O): In vivo estimation of carcass composition in young boars.III.The use of urinary creatinine, total plasma protein and total plasma cholesterol, Acta Agriculturae Scandinavica,2o,65-69. BALIGA,B.P.,BAYLIS.S,M.E.,LYMM,C.M.(1959): Determination of free lysine amino groups in cottonseed meals and preliminary studies on relation to protein quality.Arch.Bioch.,84:1-6. BARBAOKI,S.(1955): Nowe drogi do poznanja dziedicznosci.Plenarne posiedzenie Eomitetu Nauk Rolniczych PAN, 1955.1-17 BELL,J.M.(1962).Nutrient requirements of the laboratory mouse .Nutrient Requirements of Domestic Animals, lo}39-49. BENDER,A.E.,DOELL,B.H. (1957).Biological evaluation of proteins: a new aspect.Brit.J.Nutr.,11: 14o-148 BENDER,A.E. (l97o): Factors affecting the nutritive value of protein foods,Evaluation of novel protein products, Ed. A. E. Bender, R.Kihlberg,B.Lb'fqvist,L.Munck, Pergamon Press,197o,319-33o. BLOCK,R.J.and MITCHELL,H.H.(1946): The correlation of the ami-no-acid composition of proteins with their nutritive value.-Nutr.Abstr.Rev.16: 249-278. -71- BO BINDER,A.E.(1966) : Plate assay methods for amino acids. 3.Usefulness of several lactio-acid bacteria for the assay of lysine.Acta Pharmaceutica Suecica 3: 363-375. BOUNDER,A.E. (1968): Plate assay methods for amino acids.-4. Usefulness of five strains of lactic-acid bacteria for the assay 0f s±x amino acids.Acta Pharmaceutica Suecica 5: 117-134. BOLIKDER,A.E.(1969): Microbiological plate ass*ay methods for free amino acid levels in blood,Analytical Biochemistry, 27: 37o-377. BOUNDER,A.E. (197o): Plate assay methods for amino acids. Acta Pharmaceutica Suecica 7: 2o9-238. BOSSHARDT,D.K.,YDSE,L.C., AYRES,M,M. and BARNES,R.H. (1946). The use of mice for the measurements of growth quality of proteins.J,Nutr. 31: 23-33. BOYNE,A.W.,CARPENTER,K.J.,WOODEAM,A.A« (1963): Progress report on an assessment of laboratory procedures suggested as indicators of protein quality in feedingstuffs,J.Sci,Pd.Agric. 1961:832-848. BRQDY SAMOEL,(1964): Bioenergetics and growth.Hafner Publishing company,INC,New York, 1964,pp.lo23. BRUGGEMAN,J. und ERBERSDOBESR,H. (1968): Untersuchungen zur analytischen und physiologischen Characterisie-rung der AminosSurenschitdigungen bei Hitzebe-handlung von Nahurngs - und Puttermitteln.Z.Tier-phisiol.Tierern&hrg. u.Euttermittelkunde,24: 1-68. BRUNO,D.,CARPENTER,K.J.(1957): A modified procedure for the estimation of "available lysine" in food proteins. Biochem.J.67313P. BUNYAN,J.,WOODHAM,A.A. (1964): Protein quality of feeding-stuffs.2. The comparative assessment of protein quality in three fish meals by microbiological and other laboratory tests,and by biological evaluation with chicks and rats.Brit.J.Nutr., 18,537-544. BURNETT,G-.S. (1966): Studies of viscosity as the probable' factor involved in the improvement of certain barleys for chickens by enzyme supplementation, Brit.Poultry Sci.7:55-75,1966. - 72 - CARPENTER,K.J.,ELLING3R,G-.M. (1955); The evaluation of '^available lysine" in protein concentrates. Bioehem.J.,61:11. CENCELJ,J.,JELENIČ,D;j. (1969): Effect of nitrogen fertili-. zers on the lysine synthesis in silo-maize.Isotope studies on the nitrogen chain.IAEA an PAO, Vienna,1968,pp.133-144. QLA,tJSEN,H# (1963).: Porsog med slagterisvin~Aminosyrer,Por- sb'gslaboratoriets arsbogjLan&Skonofflisls; lorsSgi-laboratorium,Kb*benhavn,1963,pp. 2o9-222. DAWSON,N.J.(l97o): Body composition of inbred mice ,(Mus mu-sculus).Comp,Bioehem.Physiol.,197o.Vol.37,PP. 589-593. DmiMOVIČ,J.,I)ENIČ,M, (1969): Variation and heritability of lysine content in maize.Hew approaches to breeding for improved plant protein.International Atomic Energy Agency«,Vienna, 1969, PP* lo9-116. EBERSDOBLERjH.und ZUCKER,H. (1968): Austausch tierischer Eiv/eissfuttermittel durch pflanzliche Proteine und AmihosSuren.Hoffman-La Roche A.G-.C-renzach/ Baden, 7-39« EGGUM,B.O. (1966): Paktoren 6.25, Ugeskrift for Landmaend, nr. 28/1966, 459-462. EG-GUM,B.O. (1967 a): Broteinkvalitet vuderet pa grundlag af aminosyreanalyse.Kontaktmode vedrb'rende auto-ma tisk aminosyreanalyse?pp. 1-22. EG-G-UM,B.O. (1967 b): Vekselviriming of antagonisme i amino-syrestofskiftet, Ugeskrift for agronomer,nr.3o, 1967, 575-579. EGGUM,B.O. (1969): Evaluation of protein quality and the development of screening techniques,New approaches to breeding for improved plant protein, IAEA, Vienna,pp. 125-135. EGGUM,B.O. (197O): Nutritional evaluation of proteins by laboratory animals.Evaluation of Novel Protein Products, Ed,A.E.Bender, R.Eihlberg,B.L5fqvist, L.Munckj Pergamon Press,197o, 117-128. EGGUM,B.O.,MERGER,N.H. (1964): En biologisk proteinvurdering ved hjaelp af rotter,Ugeskrift for Landmaend,5o: 1-3, 1964. - 73 - EGGUM, 33.0., MAD SEN, A., PETERSEN, V. E., KUNCE, L., MODE YffiG-HANSEN, L.(1969): Faellesforsb'g vedr'drende bygkvalitet, Udgived af Statens Husdyrbrugsudvalg,Kobenhavn, 1969, 1-96, ENOS,H.L. and M0RENG,R.E.(1965) : Evidence of genetic variability for lysine utilization, Poultry Science, ? 44, 964-971« MVRET,E.A.,S01ARI,RMMANGHERS,L, and AVILA, A. (1969) s Genetic control of the qualitative and quantitative production of endosperm proteins in wheat and barley,New approaches to breeding for improved plant protein, IAEA, Vienna, 1969, 87-lo7. EISHER,R.A. and YATES,P. (1963): Statistical-tables for biological, agricultural and medical research,Oliver and Boyd, Edinburgh,1963, pp.146, GALL,G.A.E.,KYLE,V/.He (1968)s Growth of the laboratory mouse. Theoretical and Applied Genetics 38: 3o4-3o8, GOIDSTEIN,A. (1964): Biostatistics, an introductory text, The Macmillan Company,New York, 1-272. GOSS,R.J. (1964) : Adaptive growth, Logos Press,Academic Press,London 1964, pp. 36o GUGGENHEIM, K. (197o): Protein evaluation by microorganisms. Evaluation of Novel Protein Products, Ed.A.E. -^enderjR.Eihlberg, B.L6*fqvist, L.Munck,Pergamon Press,197o, 235-245. HACKLER,L.R.,STILLINGS5B.R. and POLIMSNI,R.J.Jr.(1967): Correlation of amino acid indexes with nutritional quality of several soybean fractions,Cereal Chemistry, 44, 638-644. HAGBERG,A.,KARLSSON,K.E. (1969) : Breeding for high protein content and quality in barley,^ew approaches to breeding for improved plant protein,IAEA,Vienna, pp. 17-21. RARPER,A.E. and EDMTA,U.S.(1959): Amino acid balance and protein requirement.Federation Proc. 18, 1136. HEGSTED,D.H. and WORCESTER,J. (1947), J.Nutrition 33, 685. Cit.po Longenecker (1963). HEIMS,P.,R6LLE,C.-(197O): Nutritive evaluation of protein quality with Tetrahymena pyriformis W,Evaluation - 74 - 'of Novel Protein Products, Ed.A.E.Bender,R. Eihlberg,B.L5fqvist,I.Munck,Pergamon Press, 197o, 259-264. HOIMBERG,E. och Ohlson,Ee (1968)% NSringsvSrdet av rag., ragvete och vete i relation till haIten av 5-alkylresorcinoler.G-enetiska Institutet,Lund, 1-53. HOLT, l.E., SNZDERMAN, S #E., NORTON? P ,M., ROITIvlAN, E . and PUT OH, J,' (1963)ž The plasma aminogram in kwashiorkor, lancet 11, 1343-3148. HORN M.J. IICHTENSTEIN,H« and WOMACE,M. . (1968): Availability of amino acids.A.methioninefructose compound and its availability to microorganisms and rats,J. Agr.Pood Chem. 16,741. IIOVAR,Z,(1968) 5 O problemih prehrane haloških- otrok, Zbornik I.simpozija o prehrani v Sloveniji, Društvo živilskih in prehranskih strokovnih • delavcev Slovenije,Ljubljana, 1968,str.63-65. JANSEN,G-.R, (l97o): Amino acid supplementation and the world food problem.Evaluation of Novel Protein products, Ed, A „E e Bender, R.Eihlbe rg, B . Lb*f qvist, L.Munck,Pergamon Press, 197o, lo5-H4. JOHNSON,V.A.,MATTERN,PaJ., WELTED, D. A., SCHMIDT, J. Yf. (1969): Breeding for high protein content and quality in wheat, Nev\r approaches to breeding for improved plant protein, IAEA, Vienna, pp,29~4o« HEIBERG,R, (197O)J Changes in growth and plasma free amino acids in short growth studies with rats.Evaluation of Novel Protein Products, Ed.A.E.Bender, R.Eihlberg. B9l5fqvist,I.Munck.Pergamon Press, 197o, 149-157. EING-,C.G-. (197o) : Strategy in the evaluation of novel_protein products.Evaluation.of Novel Protein Products,Ed A.E.Bender, R.Eihlberg, B»Iofqvist,L. MunckjPergamon Press, 197o, 33-38. EOPRANYI,E. (1956)J Zur Bestimmung der biologischen Vertig-keit von Nahrungsproteinen.Hope-Seyler's Ztschr. physiol.Chem. 3o5, 61-69. EREPT,I. (1969): Vrednotenje hranilne vrednosti beljakovin žitnega zrnja.Sodobno kmetijstvo, 2: 456-458,69. - 75 - KREFT,I, (l97o)(Discussion).Evaluation of Novel Protein Products.Ed.by A.Elender,R.Eihlberg5B.IGfq.vist and L.Munck.Pergamoh Press-Oxford and New York, 197o,page 3ol. LANG,B.J., LEGATES,J.E. (1969):Hate,composition and efficiency of growth in mice selected for large and small body weight,Theoretical and Applied Genetics 39«. 3o6-314, 1969. LAPOBTE,J. and TEEMOUEKES,J.(1962): Inhibiting action of rice, maize, barley, wheat, rye and buckwheat, meals on some proteolytic enzymes of the pancreas. C.R. Soc.Biol. 156, 1261-1263. LARSS0N,S.,NILSS0N,T6and 0LSS0N,Ba (1966): Some aspects on the metabolic effect of amino acid supplementation of pig diets,Acta vet.scand.7, 47-65. LEEEBVRE,J.H. (1969)* Influence de la fertilisation azotes . • sur les variations de la composition en composes proteiques et non proteiques des parties aeriennes de Dactylis glomerata L.New approaches to breeding for improved plant protein, IAEA,Vienna,1969, .99-107. LIPOVEO,J.ml. (1968): O prehrani prebivalcev vasi v okolici Ljutomera,Zbornik I.simpozija o prehrani v Sloveniji.Društvo živilskih in prehranskih strokovnih delavcev Slovenije, Ljubljana, 1968, str. 67-69. LONGENECKEE,J.B. (1963): Utilization of Dietary Proteins, In: Newer Methods of Nutritional Biochemistry, Academic Press,New York and London, 1963, pp. 113-144» MATHESON,N.A. (1968 a): Available lysine. I.-Determination of non-N-terminal lysine in protein.J.Sci.Fd, Agric.Vol. 19: 492-495. MATBESON,N.A. (1968 b): Available lysine.II.-Determination of available lysine in feedingstuffs by dinitro-phenylation.J.Sci.Ed.Agric.Vol.19: 496-5o2. MERTZ,E.T.,Bates,L.S. NELSON,O.E. (1964) :Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm,Science 145:279-28o. METTEICK,D,P. (l97o): Protein nitrogen,amino acid and carbohydrate gradients in the rat intestine.Comp.Biochem, Physiol., 37, pp.517-541. - 76 - MILLER,B.S.,PAYNE,P.R.(1961): Problems in the prediction 'of protein values of diets:caloric restriction. J.Nutr.,75: 225-23o. MITCHELL,H.H. (1962): Comparative nutrition of man and do-, mestic animals,Academic Press,New York,1962,pp. 7ol. MITCHELL,H.H. and BLOCK,E.d. (1946): Some relationships between the amino acid contents of proteins and their nutritive values for the rat.J.Biol.Chem.163, 599-62o. MOSSBERG,R.(1969): Evaluation of protein quality and quantity by dye-binding capacity: a tool in' plant breeding .New approaches to breeding for improved plant protein,Symposium,International Atomic Energy A-gency, Vienna, 1969, pp. 151-16o. MOSSBERG-,R. (l97o): Estimation of protein content and quality by dye-binding« Evaluation- of Novel Protein Products, Ed.A.E.Bender,R.Kihlberg,B.Lofqvist,L.Munck, Pergamon Press,197o, 2o3-2o7. MOUSTAPAjE.K.(1966):Beitrag zur Qualitatsbaurteilung von Pisch-protein unter besondere Bertteksichtigung der Quali-t&tsverSnderung durch die Trocknungstemperatur, Aug.1966.Bisert.zur Erlangung des Boktorgrades der ^andwirtschaftlichen Pakultat der Justus Liebig-Universitat C-iessen,pp,2o2. MUNCEjB.G-.(1968): Amino acid transport by the small intestine of the rat.Evidence against interactions between sugars and amino acids at the carrier level. Biochim.Biopliys« Acta, 156, 192-194« -MUNCE,L.(1964 a): The variation of nutritional value in barley. I.Variety and nitrogen fertilizer effect on chemical composition and laboratory feeding experiment, Hereditas 52: 1-35,1964. MTTNCK,L. (1964 b): The variation of nutritional value in barley.II.The CBA-mouse as a test organism for large-scale evaluations of nutritional characteristics in programs of plant breeding,Hereditas 52: 49-58, 1964. MONCK,L.(1964 c): The variation of nutritional value in barley. III.Favourable and unfavourable effects of damaging and processing to the nutritional value considered in relation to plant breeding,Hereditas 52: 59-76,1964. -, 77 - . MUNCK, L. (1966): Physiological trials with laboratory animals to evaluate nutritional values of plant material in programs for plant breeding and technical research,Qualitas Plantarum et Materiae Vegetables, 13: I06-II8, 1966, MUNCK,L.(1967): Heterosisproblems in mice nutrition,Heredi-tas 57: 443, 1967» MHTCK,L. (1968): PodersSd-kvalitet och utnyttjande, Sveri-ges UtsSdesf.Tidskrift, 78: 137~2ol. 1968. MUNCIC,L. (1969): Genotype-environment interaction in protein production and utilization,New approaches to breeding for improved plant protein,IAEA, Vienna,pp. 173-184. MUNCE,L. (l97o a): Mice as test animals for evaluation of the nutritional quality of protein.Evaluation of Novel Protein Products?Ed,A.E.Bender,R.Eihlberg, B.Lofq.vist, L,Munck,Pergamon Press?197o, 143-147. MUNCK, 1.(l97o b): Basic research for development of the nutritional value in cereal protein examplified by studies of the Hily character, IAEA, Vienna, 1-19. MUNCK,L. (197O c) : Aspects on the physiology of protein formation in cereal grains and its importance as breeding objective,, Rencontre des Section Ce're'ales et Physiologie de i'Eucarpia,Dijon,Erance, 1-16, MUNCK,L. KARLSSON,K#-E.,HAGEERG,A.,- EGGTM,B.O. (l97o): Gene for improved nutritional value in barley seed protein.Science 168: 985-987» NAHRING, E., PLATIKANOW,N., TANGE, H., SEUIMOWSEC, J., IOMME, M.E. (1959)s Pas Problem der Eutterbewertung und Eutter-werteinheit III,Deutsche Akademie der Landwirt-schaftswissenschaften zu Berlin, NASSET,E.S. ^1964): The role of the digestive tract in pro-' tein metabolism,The American journal of digestive diseases,New Series Vol, 9, 175-19o. NELSON,O.E.,MERIZ,E.Ta,BATES,L.S. (1955): Second mutant gene affecting the amino acid pattern of maize endosperm proteins, Science 15o, 1469-7o. 0SBORNE.'T.B.,MENDEL, L.B. and PERRY,E.L.(1919) : A method of expressing numerically the growth-promoting value of proteins.J.biol.Chem.,37: 223-229. - 73 - OSER,B.L. (1951): Method for integrating essential amino acid content in the nutritional evaluation of protein.J.Am.diet.Assoc«, 27: 396~4o2. OSER,B.L. (197O): Analytical criteria for the effects of processing and storage on proteins,Evaluation of Novel Protein Products,Ed.A.E.Bender,R. I&hlberg,B.Lb'fqvist,L.Munck,Pergamon Press 197o, 315-317. PEARSON,E.S. and HARTLEY,H.O. (1956): Bioraetrika tables for statisticans,Cambridge,Published for the Biome-trika Trustees.Vol.I.,University Press,1956, pp. 238. RAMA RAO,P.B., NORTON, H.W. and JOHNSON,B.C. (1964): The amino acid composition and nutritive value of proteins,V.Amino acid requirements as a pattern for protein evaluation.J»Nutrition 82, 88-92. RIIEY,R.and EWART,J.A,D. (l97o):The effect of individual rye chromosomes on the amino acid content of wheat grains,G-enet.Res. 15, 2o9-219. SAUBERIIOHjH.E. (1961): Growth of rats fed proteinfree diets supplemented with purified amino acid mixtures. J.Nutr. 74: 298. SNEDECORjG.W. (1962): Statistical methods applied to experiments in agriculture and biology, The Iowa State University Press,Ames, Iowa. 1-535. STOY,V. (1969): Nagra synpunkter pa proteinbildningens bio- kemi och fysiology, Sveriges Uts&desf, Tidskrift, .79: 192-195, 1969. SWAMINATHAN,M. S., AUSTIN, A., EAU1, A.K., NAIK,M. S. (1969): Genetic and agronomic enrichment of the quality of proteins in cereals and pulses.New approaches to breeding for improved plant protein, Symposium, International Atomic Energy Agency, Vienna,1969, pp. 71-86. TASAEE,I. and TAKAHASHI,N. (1966)? Absorption of amino acids from the small intestine of domestic fowl.Journal of nutrition,Vol*88, 359-364. TAIE,M.W. and CIELLANI),R.O. (1959): Nonparametric and shortcut statistics, Interstate printers and publishers, Inc.,Denville. 1-171. - 79 - THOMAS,K, (19O9) *. Uber die biologische Wertigkeit der Stickstoffsubstanzen in verschiedenen Nahrungs-mitteln.BeitrSge zur Prage dem physiologischen S ti ckstoffminimums. Arch. Anat.u. Physiol« Physiol. Abt. 19o9, 219-302. TIMON,V.M.,EISEN,E.J. (1969): Comparison of growth curves of mice selected and unselected for postweaning gain.Theoretical and Applied Genetics 39 ? 345-351» 1969. TOFT VTOF.B. (1969): Breeding of barle^r varieties with high protein content with respect to quality.New approaches to breeding for improved plant protein, Symposium,International Atomic Energy Agency,Vienna, 1969, pp. 23-28. TEOELSEN.J.E.and BELL,J.M. (1961): Performance and carcass response in swine and mice to similar rations. Can.Soc.Anim.^rod.Proc.ann.meet.General Soc. 27-29. TURK,E.(1971) t Prispevek k metodiki določanja proizvodnih . funkcij z vidika sestave optimalnih proizvodnih programov (Poročilo o raziskavi - v pripravi). WALSH, J.E. (1962) J Handbook of nonparametric statistics. D.van Nostrand Company,Inc.Princeton, 1-549« WATEEL07/, J. C. (l97o): Human protein requirements and malnutrition .Evaluation of novel protein products,Ed. A,E.Bender,R.Hhlberg,BeLb'fqvist, L.Munck,Pergamon Press,197o, 15-21. WIEEINGAjG.W. (1967)? On the occurence of growth inhibiting substances in rye? Institute for storage and processing of agricultural produce,Wageningen,Publication 156, 1-68. ZUCEEE,H., EEBEESDOBLER,Ke,GROPP,J. (1968): Analitische Un-tersuchungen und Putterungsversuche an Eatten und Y/achteln, Z.Tierphys., TierernShrung u.Eut-termittelkunde, 23'193-256. - 80 - tab.2o str. 1 DODATEK Teža miši (A;v začetku poskusa, B po 5 dneh poskusa, C po lo dneh, B po 15 dneh, E po 2o dash) ia prirasti tea mlSi v posameznih ob- ' dobjih (B-A Je na pf.iaer raslika v teži miši me d. meritvijo A ia meritvijo B) v gramih. Weights of mice;(A at beginning of tho expsrissat, B after 5 days, C after Xo days, B after 15 days,, E after 2o days) and v/sight gaifis (B-A is for instance difference batween v/sighis A and B) in grans. -'81 Tab. 2o sir. 2 -84 - tab.2° str. 5 - 85- Tab. 2ostr. 6 2. Prirasti tež Weight gains -86:- Tab. 2o str. 7 -87 - Tab. 2o str. 8 - 83 - Tab.So str. 9 E-B' D-C E-C E-D u " 89? " Tali.20 str. lo -9o - Tab. 2o str. 11 - 91-? Tab. 2o str. 12