Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 22 Osnovni koncept diagnostike okužbe s HPV HPV dokazujemo izključno z molekularnimi meto- dami. Okužbo s HPV je sicer mogoče dokazati tudi z opazovanjem značilnih citopatskih sprememb epitelnih celic s svetlobnim mikroskopom, z opa- zovanjem virusnih delcev s pomočjo elektronskega mikroskopa ali z dokazovanjem virusnih struktur- nih beljakovin z imunohistokemičnimi metodami, vendar se zaradi nizke občutljivosti in nezmožnosti določanja genotipa HPV te metode ne uporabljajo v rutinski diagnostiki okužb s HPV (1, 2). V nadalje- vanju bomo na kratko predstavili osnovni koncept HPV testiranja v primerjavi z drugimi mikrobiolo- škimi testi, ki jih uporabljamo v medicini. HPV-testiranje se po mednarodno sprejetih smer- nicah uporablja za tri ključne klinične indikacije: • kot triažni test za nadaljnjo obravnavo žensk z mejnim citološkim izvidom npr. ASC-US (angl. atypical squamous cells of undetermined signifi- cance) ali LSIL (angl. low grade squamous intrae- pithelial lesion); • za kontrolo uspešnosti zdravljenja cervikalnih intraepitelijskih neoplazij visoke stopnje (CIN 2+); • kot primarno presejalno testiranje za zgodnje odkrivanje raka materničnega vratu (3). Presejanje s testom HPV: kateri testi izpolnjujejo merila za uporabo v presejalnih programih Mario Poljak, Anja Oštrbenk Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, Ljubljana Povzetek HPV-testiranje se po mednarodno sprejetih smernicah uporablja za tri ključne klinične indikacije: (i) kot triažni test za nadaljnjo obravnavo žensk z mejnim citološkim izvidom; (ii) za kontrolo uspešnosti zdravljenja cervikalnih intraepitelijskih neoplazij visoke stopnje (CIN 2+); (iii) v primarnem presejal- nem testiranju za zgodnje odkrivanje raka materničnega vratu. Avgusta 2015 je bilo na svetovnem tržišču vsaj 193 različnih komercialno dostopnih testov HPV in vsaj 127 njihovih različic. Kljub tako velikemu številu le zelo omejen nabor testov HPV na tržišču (manj kot desetina) izpolnjuje mini- malne kriterije za varno uporabo v klinične namene za vsaj eno od dogovorjenih kliničnih indika- cij. Izmed vseh razpoložljivih testov HPV jih trenutno samo 13 izpolnjuje kriterije za varno uporabo v primarnih presejalnih programih. Testov HPV, ki niso bili ustrezno klinično preverjeni, v klinični praksi ne smemo uporabljati. V prihodnosti bi se morali proizvajalci testov namesto na izdelavo po- polnoma novih testov HPV osredotočiti predvsem na klinične validacije že obstoječih testov HPV in nadaljnje izboljšave, s katerimi bi dosegli optimalno ravnovesje med klinično občutljivostjo in klinično specifičnostjo. Ključne besede: človeški papilomavirusi, HPV, HPV testiranje, presejalni programi, HPV primarno presejanje Trenutno se HPV-testiranje v številnih državah, vključno s Slovenijo, rutinsko uporablja za boljše prepoznavanje žensk z večjim tveganjem za raka materničnega vratu. V Sloveniji se HPV testiranje rutinsko uporablja kot triažni test od leta 2011 kot pomoč pri odločitvi, ali ženska potrebuje kolpo- skopski pregled ali ne. Trenutne indikacije za upo- rabo triažnega testa HPV pri ženskah v Sloveniji so: • atipične ploščate celice, neopredeljene (APC- N); • ploščatocelična intraepitelijska neoplazija nizke stopnje (PIL-NS) pri ženskah, starih 35 let ali več; • atipične žlezne celice, neopredeljene (AŽC-N); • spremljanje žensk s CIN 1; • CIN - po zdravljenju. Klinični pomen izvida testa HPV v kolposkopski ambulanti, indikacije za uporabo testa HPV v Slo- veniji ter problemi, povezani z nekritično uporabo ali neuporabo testa HPV, so podrobno opisani v prispevku Ivanuš U. in Primic Žakelj M. z naslovom »Pomen izvida testa HPV v kolposkopski ambulan- ti«, objavljenem v Zborniku kolposkopskega tečaja 2013 (4). V preteklih letih je bilo objavljenih več raziskav, ki so dokazale učinkovitost HPV-testiranja v okviru primarnega presejalnega programa za raka ma- Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 23 terničnega vratu (5–8). Na vzorcu več kot milijon žensk, starih od 30 do 64 let, je bilo dokazano, da je kumulativno tveganje za CIN2+, CIN3+ in rak materničnega vratu (RMV) statistično značilno manjše v vseh skupinah v primarnem presejalnju s HPV-testiranjem v primerjavi s presejanjem s ci- tologijo. Dodatno so raziskave pokazale, da ni sta- tično pomembnih razlik med presejanjem samo s testom HPV in hkratnim presejanjem s citologijo in testom HPV. Velike, klinično randomizirane razi- skave so dokazale, da primarno HPV-testiranje nudi 60–70 % večjo varnost pred invazivnim RMV v pri- merjavi s primarnim presejanjem s citologijo (5–8). Tako so leta 2015 izšle dopolnitve Evropskih smer- nic za zagotavljanje kakovosti v presejanju za raka materničnega vratu iz leta 2008, v katerih se pripo- roča primarno testiranje s testom HPV za ženske, ki so starejše od 35 let. Pri ženskah, mlajših od 30 let, se presejanje s testom HPV odsvetuje. Ne glede na starost žensk se odsvetuje tudi hkratna uporaba obeh presejalnih testov (hkratno presejanje) (9). V naslednjih nekaj letih tudi v Sloveniji pričakujemo pomembne spremembe presejalne sheme, kot to priporočajo Evropske smernice iz leta 2015, ki te- meljijo na novih spoznanjih in razvoju tehnologije na področju HPV-testov in vstopu proti-HPV ceplje- nih generacij v presejalni program. Testi HPV na svetovnem tržišču Smernice, ki narekujejo uporabo testov HPV, te- meljijo izključno na uporabi klinično preverjenih testov. Po podatkih zadnjega preglednega članka je bilo na svetovnem tržišču avgusta 2015 vsaj 193 različnih komercialno dostopnih testov HPV in vsaj 127 njihovih različic. Kljub tako velikem številu le zelo omejen nabor testov HPV na tržišču (manj kot desetina) izpolnjuje minimalne kriterije za varno uporabo v klinične namene za vsaj eno od dogo- vorjenih kliničnih indikacij. Poleg tega več kot tri četrtine testov HPV, ki so trenutno komercialno dostopni, nima niti ene same objave v recenzi- ranih znanstvenih revijah. Enotni zaključek vseh strokovnjakov je, da tako komercialno dostopnih testov HPV kot tistih razvitih v laboratoriju (angl. in-house tests), ki niso bili ustrezno klinično prever- jeni, ne smemo uporabljati v klinični praksi. Zaradi pomanjkanja predpisov in šibke kontrole na tem področju se na žalost po vsem svetu (razen v ZDA) v vsakdanji praksi uporabljajo številni testi HPV, ki niso klinično preverjeni. To se na srečo v Sloveniji zaenkrat ne dogaja in močno upamo, da bo tako ostalo tudi v prihodnje (10, 11). HPV-testiranje za boljše prepoznavanje žensk z večjim tveganjem za raka materničnega vratu se bistveno razlikuje od molekularnega testiranja na druge medicinsko pomembne viruse, ker visoka analitična občutljivost testa ni glavni kriterij za nje- govo dobro klinično uporabnost. Kljub temu dej- stvu ima več kot tri četrtine komercialno dostopnih testov HPV, ki se trenutno uporabljajo po svetu, previsoko analitično občutljivost, ki vodi v preko- merno odkrivanje prehodnih, klinično nemih in produktivnih okužb s HPV, s čimer narašča število nepotrebnih kolposkopij in biopsij, slabo korelacijo testa HPV s histologijo, nepotrebno zdravljenje in posledično vodi v zdravnikovo nezaupanje pozitiv- nim rezultatom testa HPV (10, 11). Druga posebnost testov HPV v primerjavi z dru- gimi mikrobiološkimi testi, je ta, da je za boljše prepoznavanje žensk z večjim tveganjem za raka materničnega vratu potrebno uravnovesiti število tarčnih genotipov HPV v testu. Tako je pri načrto- vanju novega testa HPV, ki naj bi se uporabljal za dogovorjene klinične indikacije, potrebno zelo do- bro pretehtati, kako uskladiti klinično občutljivost s klinično specifičnostjo za odkrivanje predraka- vih sprememb. Z vključitvijo HPV genotipov, ki so pogosti pri nemih okužbah ali predrakavih spre- membah nizke stopnje in le redko ali izjemoma povezani z rakom materničnega vratu (npr. HPV- 53 ali HPV-66), tvegamo zelo velik padec klinične specifičnosti testa HPV ob zanemarljivi izboljšavi klinične občutljivosti. Prav tako je potrebno imeti v mislih, da ne glede na najvišjo možno analitično občutljivost testa HPV, s katerim izvedemo primar- no presejalno HPV-testiranje na raka materničnega vratu, negativni izvid ni nikoli popolno zagotovilo za odsotnost bolezni zaradi mnogih drugih, od te- sta HPV neodvisnih, dejavnikov, npr. nekvalitetno odvzet bris, za bris nedostopna sprememba, zame- njan vzorec, neprimeren transport vzorca, priso- tnost bioloških in nebioloških zaviralcev v vzorcu, napaka izvajalca testiranja, zamenjava izvida, ne- primerno razumevanje rezultata testa (10, 11). Naj- pomembnejša parametra, ki opredeljujeta namen uporabe testa HPV, sta torej nabor tarčnih genoti- pov HPV, ki so vključeni v test, in njegova analitična občutljivost. Glede na to lahko teste HPV razdelimo v tri glavne kategorije: (i) testi HPV, ki jih uporablja- mo v klinični praksi, (ii) testi HPV, ki jih uporabljamo v epidemioloških raziskavah in raziskavah, ki so po- vezane s cepljenjem, in (iii) testi HPV za različne raz- iskovalne namene. V nadaljevanju bomo predstavi- li le prvo skupino testov HPV, značilnosti preostalih dveh skupin testov HPV so podrobno opisane v ne- davno objavljenem preglednem članku (11). Testi HPV, ki izpolnjujejo kriterije za uporabo v klinični praksi Podobno kot drugi mikrobiološki testi, ki jih upo- rabljamo v medicini, mora vsak nov test HPV, ki naj bi ga uporabljali v klinični praksi, izpolnjevati Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 24 dogovorjene standarde za klinično specifičnost in občutljivost. Da bi olajšali evalvacijo in uvedbo novih komercialno dostopnih testov HPV, so leta 2009 objavili mednarodna strokovna priporočila o tem, kako ustrezno ovrednotiti novo razvite te- ste HPV predvsem za varno uporabo v primarnem presejalnem testiranju za zgodnje odkrivanje raka materničnega vratu ter za druge klinične indikaci- je (10, 11). Mednarodna priporočila (t. i. smernice po Meijer-ju) temeljijo na tem, da morajo testi HPV izpolnjevati vse dogovorjene standarde za klinič- no občutljivost, klinično specifičnost in znotraj- in med- laboratorijsko ponovljivost (12), medtem ko se lahko razlikujejo glede na tehnologijo testiranja, stopnjo avtomatizacije, materialne stroške testira- nja in sposobnost analize različno velikega števila vzorcev. Testi HPV, ki so bili do aprila 2017 klinično validirani za uporabo v primarnem presejalnem te- stiranju za zgodnje odkrivanje raka materničnega vratu po trenutno veljavnih mednarodnih smerni- cah, so: (I) Hybrid Capture 2 assay (hc2, Qiagen Inc., Gaithersburg, MD, ZDA), (II) EIA kit HPV GP GP5+/6+ HR, (III) cobas 4800 PCR (Roche Molecular Systems Inc., Alameda, CA, ZDA), (IV) APTIMA (Hologic, Ma- dison, WI, ZDA), (V) Cervista HPV HR Test (Hologic, Madison, WI, ZDA), (VI) RealTime High Risk HPV (Re- alTime, Abbott Molecular, Des Plaines, IL, ZDA), (VII) PapilloCheck HPV-screening test (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Nemčija), (VIII) Real-time quantitati- ve PCR (qPCR) assay targeting the E6 and E7 genes (test se uporablja le v enem laboratoriju v Belgiji), (IX) HPV-Risk assay (Self-Screen BV, Amsterdam, Nizozemska), (X) BD Onclarity HPV assay (BD Dia- gnostics, Sparks, MD, ZDA), (XI) LMNX Genotyping kit GP HR (Diassay, Ev Rijswijk, Nizozemska), (XII) Anyplex II HPV HR (Seegene, Seoul, Koreja) in (XIII) Xpert HPV (Cepheid, Sunnyvale, CA, ZDA) (13). Vsi navedeni testi so podrobneje predstavljeni v Tabeli 1. Med zgoraj omenjenimi testi so le za pet testov: hc2, GP5+/6+ PCR, cobas 4800 PCR, RealTime High Risk HPV in APTIMA v raziskavah z vsaj 3-letnim sle- denjem dokazali, da HPV negativen rezultat testa zagotavlja večjo varnost kot negativen citološki re- zultat v primarnem presejanju za RMV (13). Test HPV (proizvajalec) Tehnologija Tarčno genomsko področje HPV Tarčni genotipi Hybrid Capture II (Qiagen) hibridizacija / 13 hrHPV (opcijsko delna genotipizacija za HPV16/HPV18/HPV45) EIA kit HPV GP GP5+/6+ HR PCR in hibridizacija L1 14 hrHPV Cobas 4800 HPV Test (Roche) PCR v realnem času L1 14 hrHPV (delna genotipizacija za HPV16 in HPV18) APTIMA (Gen-Probe, Hologic) PCR z reverzno transkipcijo in hibridizacija E6/E7 mRNA 14 hrHPV (opcijsko delna genotipizacija za HPV16 in HPV18/45) Cervista HPV HR Test (Hologic) PCR v realnem času E6/E7 14 hrHPV (opcijsko delna genotipizacija za HPV16 in HPV 18) RealTime High Risk HPV Test (Abbott Molecular) PCR v realnem času L1 14 hrHPV (delna genotipizacija za HPV16 in HPV18) PapilloCheck HPV-screening Test (Greiner Bio-One) PCR in hibridizacija E1 24 HPV genotipov (kompletna genotipizacija) Real-time quantitative PCR assay (qPCR) Kvantitativen PCR v realnem času E6/E7 14 hrHPV (+ HPV6, HPV53, HPV67) HPV-Risk assay (Self-Screen BV) PCR v realnem času E7 14 hrHPV (+HPV67) BD Onclarity HPV Assay (BD Biosciences) PCR v realnem času E6/E7 14 hrHPV (delna genotipizacija za HPV16, HPV18, HPV45, HPV33/58, HPV31, HPV56/59/66, HPV51, HPV52, HPV35/39/68) LMNX Genotyping kit GP HR (Diassay) PCR in hibridizacija L1 14 hrHPV (kompletna genotipizacija) Anyplex II HPV HR Test (Seegene) PCR v realnem času L1 14 hrHPV (kompletna genotipizacija) Xpert HPV (Cepheid) PCR v realnem času E6/E7 14 hrHPV (delna genotipizacija HPV16 in HPV18/45) Tabela 1. Povzetek testov HPV, ki izpolnjujejo merila za uporabo v presejalnih programih za zgodnje od- krivanje raka materničnega vratu. Hr-HPV=bolj nevarni HPV. PCR=verižna reakcija s polimerazo. Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 25 Poleg smernic po Meijer-ju obstajata še dva večja akademska projekta, ki sta klinično ovrednotila raz- lične teste HPV za varno uporabo v primarnem pre- sejalnem testiranju za zgodnje odkrivanje raka ma- terničnega vratu: VALGENT in PREDICTORS-3 (14, 15). VALGENT (angl. clinical VALidation of human papillomavirus GENotyping Tests) je akademska ini- ciativa, ki omogoča preverjanje in primerjavo ve- čjega števila testov HPV na arhivskih vzorcih brisov materničnega vratu. VALGENT-1 in VALGENT-2, ki sta potekala na belgijskih in škotskih vzorcih, sta že zaključena, medtem ko VALGENT-3 na slovenskih vzorcih in VALGENT-4 na danskih vzorcih še pote- kata (14). Prihodnost HPV-testiranja V prihodnosti bi se morali proizvajalci testov na- mesto na izdelavo popolnoma novih testov HPV osredotočiti predvsem na klinične validacije in na- daljnje izboljšave že obstoječih testov HPV. Glavni cilji za nadaljnje izboljšave testov HPV so avtoma- tizacija, boljša klinična občutljivost in višja klinična specifičnost. Idealni test HPV naj bi imel optimalno ravnovesje med klinično občutljivostjo in klinično specifičnostjo, s katerim bi odkrili skoraj vse ženske s hudimi predrakavimi spremembami maternične- ga vratu oz. rakom in čim manj žensk, ki imajo le prehodno okužbo s HPV in ne potrebujejo zdravlje- nja ali pogostega sledenja. Temeljne raziskave ra- zumevanja mehanizmov patogeneze napredova- nja predrakavih sprememb do raka materničnega vratu tako ostajajo prednostna naloga, saj bi lahko rezultati takšnih raziskav privedli do odkritja novih bioloških označevalcev za CIN3/rak materničnega vratu, ki bi jih lahko uporabili kot nove diagnostič- ne tarče v presejalnih oz. triažnih testih (10, 11). Literatura 1. Kocjan BJ, Poljak M. Papilomavirusi. In: Poljak M, Pe- trovec M, eds. Medicinska virologija. Ljubljana: Medi- cinski razgledi; 2011. p.41-60. 2. Poljak M, Kocjan BJ, Seme K, Fujs K, Potočnik M, Lu- zar B. Humani virusi papiloma (HPV). Onkologija. 2005;2:60-72. 3. Cox JT. History of the use of HPV testing in cervical screening and in the management of abnormal cer- vical screening results. J Clin Virol. 2009;45(Suppl. 1):S3-12. 4. Ivanuš U, Primic Žakelj M. Pomen izvida testa HPV v kolposkopski ambulanti. In: Smrkolj Š, ed. Obnovi- tveni kolposkopski tečaj (zbornik); 2013 Mar 29-30; Ljubljana (Slovenia). Ljubljana: Združenje za gineko- loško onkologijo, kolposkopijo in cervikalno patolo- gijo SZD in Onkološki inštitut; 2013. p. 78-101. 5. Ronco G, Dillner J, Elfström KM, Tunesi S, Snijders PJ, Arbyn M, et al. Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer: follow-up of four European randomised controlled trials. Lancet. 2014;383(9916):524-32. 6. Dillner J, Rebolj M, Birembaut P , Petry KU, Szarewski A, Munk C, et al. Long term predictive values of cy- tology and human papillomavirus testing in cervical cancer screening: joint European cohort study. Br Med J. 2008;337:a1754. 7. Gage JC, Schiffman M, Katki HA, Castle PE, Fetterman B, Wentzensen N, et al. Reassurance against future risk of precancer and cancer conferred by a nega- tive human papillomavirus test. J Natl Cancer Inst. 2014;106(8):dju153. 8. Dillner J. Primary human papillomavirus testing in organized cervical screening. Curr Opin Obstet Gy- necol. 2013;25:11-6. 9. von Karsa L, Arbyn M, De Vuyst H, Dillner J, Dillner L, Franceschi S, et al. European guidelines for qual- ity assurance in cervical cancer screening. Summary of the supplements on HPV screening and vaccina- tion. Papillomavirus Research. 2015;doi:10.1016/j. pvr.2015.06.006. 10. Poljak M, Cuzick J, Kocjan BJ, et al. Nucleic acid tests for the detection of alpha human papillomaviruses. Vaccine. 2012;Suppl 30:F100-6. 11. Poljak M, Kocjan BJ, Oštrbenk A, Seme K. Commer- cially available molecular tests for human papillo- maviruses (HPV): 2015 update. J Clin Virol. 2016;76 Suppl 1:S3-13. 12. Meijer CJ, Berkhof J, Castle PE, Hesselink AT, Franco EL, Ronco G, et al. Guidelines for human papilloma- virus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 2009;124(3):516-20. 13. Arbyn M, Snijders PJ, Meijer CJ, Berkhof J, Cuschieri K, Kocjan BJ, et al. Which high-risk HPV assays fulfil criteria for use in primary cervical cancer screening? Clin Microbiol Infect. 2015;21(9):817-26. 14. Arbyn M, Depuydt C, Benoy I, Bogers J, Cuschieri K, Schmitt M, et al. VALGENT: A protocol for clinical vali- dation of human papillomavirus assays. J Clin Virol. 2016;76 Suppl 1:S14-21. 15. Cuzick J, Cadman L, Mesher D, Austin J, Ashdown- Barr L, Ho L, et al. Comparing the performance of six human papillomavirus tests in a screening popula- tion. Br J Cancer. 2013;108(4):908-13.