RAZISKAVE IN RAZVOJ 40 Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d., Sora press cream 80 g/m 2 Raziskujemo in razvijamo | Pomlad 2020 | 23 | XLVIII Monika HORVAT 1 , Janja ZULE 2 , Ema FABJAN 2 , Jernej ISKRA 1 1 UVOD V zadnjem času se zaradi okoljske pro- blematike veliko pozornosti usmerja na pridobivanje energetskih virov, goriv in številnih uporabnih kemikalij iz naravnih materialov. Pri pridobivanju spojin iz na- rave je treba upoštevati, da se pri tem ne vpliva negativno na ekosistem, da se ne izrabljajo materiali, ki so uporabni kot vir prehrane, ter da izkoriščen mate- rial kontinuirno zagotavlja vir rastlinske biomase v naravi [1–3]. Invazivne tujerodne rastline se raz- množujejo in razširjajo zunaj njihovega območja naravne razširjenosti, s čimer ogrožajo ekosisteme, habitate, gospo- darstvo ter biotsko raznovrstnost. Veli- kokrat postanejo tujerodne rastline tek- meci domorodnim vrstam za življenjski prostor, hrano ter druge vire. Na dolo- čeno območje so vnesene s človekovim posrednim ali neposrednim vplivom. Invazivne tujerodne vrste postajajo ved- no večji problem tudi v Sloveniji in jih je treba odstranjevati [4]. Vendar je lesna biomasa invazivnih tujerodnih rastlin- skih vrst zanimiva za predelavo v papir in druge materiale na osnovi celuloznih vlaken, prav tako pa se lahko uporablja- jo tudi stebla enoletnih rastlin. Lignocelulozna biomasa je v osnovi sestavljena iz celuloze, hemiceluloze in lignina (Slika 1). Delež posameznih komponent je odvisen od rastlinskega materiala, od rastlinske vrste, dela ra- stlinskega materiala in tudi od starosti rastline [5]. Pri izdelavi papirja se uporabi pred- vsem celulozni del biomase, medtem ko predstavljata preostali sestavini, in sicer del hemiceluloze in lignin, »odpadek«, ki pa je hkrati tudi dragocena surovina. Lignin se v procesu kemične obdelave biomase hidrolizira in raztopi ter izloči v obliki odpadne lužnice [6]. V okviru projekta Applause, »Od škodlji- vih do uporabnih tujerodnih rastlin z ak- tivnim vključevanjem prebivalcev«, ki ga financira Evropska skupnost preko pro- grama Urban Innovative Actions, skuša- mo pokazati, kako lahko invazivne tuje- rodne rastline uporabimo tudi v koristne namene. V raziskavo smo med drugim zaradi njihove invazivnosti in razširjenosti vključili tudi japonski dresnik, rudbeki- jo in octovec. Iz debla octovca ter stebel japonskega dresnika in rudbekije se lah- ko s pomočjo delignifikacije proizvede celuloza za proizvodnjo papirja. Hkrati nastaja ligninska lužnica, ki je potencial- na surovina za pridobivanje aromatskih spojin. Japonski dresnik (Fallopia Japonica) je invazivna tujerodna rastlina iz družine Polygonaceae (Slika 2), ki izvira iz vzhod- nega dela Azije (Japonska, Kitajska in Koreja). V Evropo se je razširila kot okra- sna rastlina leta 1823. Japonski dresnik je 3–4 m visoka rastlina, ki jo sestavljajo vo- tla, rdečkasto lisasta stebla. Listi so široki in ovalni, dolgi 7–14 cm in široki 5–12 cm. Rastlina cveti pozno poleti in zgodaj IZVLEČEK Ocenili smo možnost pridobivanja celuloze in lignina z delignifikacijo stebelne biomase invazivnih rastlin japonskega dresnika, rud- bekije in octovca. Pridobljene vzorce biomase, ki so vsebovali med 37 % in 41 % celuloze, smo delignificirali po sulfatnem postopku, določili izkoristek vlaken, nastalo ligninsko lužnico pa ekstrahirali z diklorometanom, s čimer smo ločili aromatsko frakcijo od preos- talega bolj polarnega dela in sladkorjev. Lignin je zanimiv, saj predstavlja edini vir aromatskih spojin v naravi in je osnova za kemijsko pretvorbo v vanilin in druge uporabne kemikalije. Prisotnost lignina v ekstraktih smo potrdili z UV-VIS absorpcijsko spektrometrijo. Rezultati so pokazali, da je možno biomaso omenjenih invazivk pretvoriti v uporabne produkte, in sicer celulozna vlakna, lignin in lig- ninske derivate. Ključne besede: invazivne rastline, delignifikacija, celulozna vlakna, lignin, vanilin ABSTRACT We evaluated the possibility of cellulose and lignin isolation from stem biomass of invasive plants Japanese knotweed, rudbeckia and rhus. The obtained samples, which contained from 37% to 41% of cellulose, were delignified according to the sulphate procedure. Fibre yield was determined, while the remaining lignin liquor was extracted with dichloromethane to separate aromatic fraction from other more polar components and sugars. Lignin is interesting as the only natural source of aromatic compounds and thus represents a starting material for chemical conversion to vanillin and other usable chemicals. Lignin presence in extracts was confirmed by the UV-VIS absorption spectrometry. The results indicated that the biomass of the examined invasive species could be converted to usable products, e.g. cellulose fibres, lignin and lignin derivatives. Keywords: invasive plants, delignification, cellulose fibres, lignin, vanillin INVAZIVNE RASTLINE – POTENCIALNO UPORABEN VIR CELULOZE IN LIGNINA INVASIVE PLANTS – POTENTIALLY APPLICABLE SOURCE OF CELLULOSE AND LIGNIN Slika 1: Struktura celuloze, hemiceluloze in lignina Figure 1: Cellulose, hemicellulose and lignin structures Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d., Sora press cream 80 g/m 2 41 RAZISKAVE IN RAZVOJ | Pomlad 2020 | 23 | XLVIII Raziskujemo in razvijamo Slika 2: Japonski dresnik Figure 2: Japanese knotweed Slika 3: Rudbekija Figure 3: Rudbeckia Slika 4: Octovec Figure 4. Rhus typhina Slika 5: Struktura polimerne molekule lignina Figure 5: Structure of polymeric lignin molecule Slika 6: Stukture monomernih enot lignina Figure 6: Structures of monomeric lignin units jeseni z majhnimi, belimi cvetovi. Pozimi nadzemni deli rastline odmrejo, korenike, ki segajo več metrov od osnovnega ste- bla pa prezimijo. Močne korenike pred- stavljajo v naravi velik ekološki problem, saj lahko prodrejo skozi asfalt in s tem poškodujejo ceste, nasipe in stavbe [7]. Rudbekija (Rudbeckia) je zelnata trajni- ca, ki izvira iz Severne Amerike ter izhaja iz družine Asteraceae (Slika 3). Rudbekija je 0,5 do 3,0 m visoka rastlina z goli- mi stebli. Njeni listi so pernato deljeni, trojnati do peternati. Rastlina cveti od julija do oktobra, cvetovi so zlato rumene barve [8]. Octovec (Rhus typhina) je lesnato cveto- če drevo iz družine Anacardiaceae (Slika 4), ki izvira iz vzhodnega dela Severne Amerike. Drevo lahko doseže 5 do 10 m višine, cveti od maja do julija, plodovi pa zorijo od junija do septembra. Njegovi plodovi so sestavljeni iz gruče majhnih rdečih skupkov, velikosti 3 do 5 mm. Plo- dovi so zaradi svojih protimikrobnih, anti- oksidativnih, protiglivičnih, citotoksičnih, protitumorskih in protivnetnih učinkov uporabni v številnih panogah [9]. Med najbolj znane postopke kemične predelave lignocelulozne biomase sodi delignifikacija, ki se lahko izvede z upora- bo kislin ali alkalij v ustrezno opremljenih reaktorjih pri povišani temperaturi in tla- ku. V industriji se najpogosteje uporablja sulfatni postopek, z dodatkom aktivnih kemikalij NaOH in Na 2 S. Postopek traja več ur, pri čemer pride do kemijske mo- difikacije in cepljenja ligninske molekule v manjše enote, ki se raztapljajo v lužnici [6]. Slednja vsebuje običajno poleg ligni- na tudi nekaj sladkornih enot iz hemi- celuloze. Lignin je pomembna sestavna komponenta olesenelih rastlin in pred- stavlja 20 do 30 % njihove celotne mase, njegova primarna funkcija pa je zago- tavljanje togosti in mehanske trdnosti olesenelih rastlinskih tkiv. Ima komple- ksno polimerno strukturo, ki je sestavlje- na tako iz aromatskih kot iz alifatskih enot (Slika 5). Predstavlja edini naravni trajnostni vir aromatskih spojin in organ- skega ogljika, s tem pa tudi odličen vir energije. Zaradi svoje strukture je zanimiv kot surovina za pretvorbo v biogoriva, v uporabne kemikalije ter tudi v številne bio-produkte. Polimerno molekulo ligni- na je mogoče izkoriščati trajnostno, ven- dar je zaradi zapletene strukture njegov tehnološki potencial še vedno premalo raziskan [10]. Osnovne monomerne enote lignina so 4-hidroksicinamil (p-kumaril), 3-metoksi- -4-hidroksicinamil (koniferil) in 3,5-dime- toksi-4-hidroksicinamil (sinapil) alkohol (Slika 6) [10]. Lignin je težko izolirati iz biomase v originalni obliki, saj se pri postopku delignifikacije začne njegova struktura spreminjati in je zato težko ugo- toviti, kakšna je pravzaprav njegova prvo- tna oblika oz. formula. RAZISKAVE IN RAZVOJ 42 Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d., Sora press cream 80 g/m 2 Raziskujemo in razvijamo | Pomlad 2020 | 23 | XLVIII Lignin je mogoče hidrolizirati do manj- ših podenot s cepitvijo močnih etrskih vezi. Sama pretvorba lignina v monomer- ne enote je zaradi kompleksne strukture zahtevna, mehanizem postopka pa zato še ni povsem znan. Z njegovo razgradnjo lahko pridobimo številne kemikalije, kot so vanilin, vanilinska kislina, 2-hidroksi- -1,3-dimetoksibenzen, o-dihidroksi- benzen, fenol. Zaradi vsebnosti ene od monomernih podenot lignina – koniferi- la, predstavlja lignin odlično surovino za proizvodnjo vanilina (Slika 7) [10]. Pri tem je najbolj zanimiv mehanizem pretvor- be preko ferulne kisline. Le-ta je namreč vezni člen med polisaharidi in ligninom v celičnih stenah. Slika 7: Pretvorba ferulne kisline v vanilin Figure 7: Conversion of ferulic acid to vanillin Večina raziskav pretvorbe lignina se za- radi njegove kompleksne strukture osre- dotoča na modelne substrate, medtem ko lahko polimerni lignin v bolj ali manj spremenjeni obliki pridobimo iz lužnice po delignifikaciji lignocelulozne biomase. Količina pridobljenega lignina in njegove lastnosti so odvisne od narave biomase in postopka delignifikacije. 2 Eksperimentalni del 2.1 Vzorci Vzorce stebel japonskega dresnika v obliki sekancev smo dobili v jesenskem času, stebla rudbekije in debelne sekan- ce octovca pa spomladi. Vzorce sta nam dobavili podjetji VO-KA Snaga in Tisa, in sicer z območja Mestne občine Ljubljana. Vsi vzorci predstavljajo odpadno bioma- so, ki je bila pridobljena pri urejanju ze- lenih površin. Sveže vzorce smo posušili na zraku. Komercialni alkalni lignin smo pridobili pri podjetju TCI (Tokyo chemical industry), CAS: 8068-05-1. 2.2 Metode preskušanja 2.2.1 Določitev vsebnosti celuloze Pred analizo smo vzorce (200 g) zmleli na velikost delcev 0,5 mm v laborato- rijskem mlinu Retsch ZM 200. Zmlete vzorce (5 g) smo ekstrahirali najprej s heksanom in nato z etanolom, s čimer smo odstranili ekstraktivne snovi, ki mo- tijo določitev celuloze. Ekstrahiranim vzorcem smo določili vsebnost celuloze (metoda Kürschner-Hoffer) [11]. V 250 ml bučko smo natehtali pribl. 1 g vzorca, ki smo mu dodali 25 ml nitracijske zmesi (20 ml 65 % HNO 3 in 80 ml 96 % eta- nola). Zmes smo segrevali 1 uro na vodni kopeli pod refluksom, nakar smo odstra- nili reagent in dodali svežega ter ponovili refluktiranje. Celotni postopek smo nato ponovili še enkrat, torej skupaj trikrat. Po odstranitvi reagenta smo dodali 150 ml vode in zmes segrevali 1 uro. Sledila je filtracija skozi predhodno stehtan steklen filtrni lonček. Ostanek na filtru (celuloza) smo večkrat sprali z vodo in etanolom, ga posušili pri 105°C in stehtali. Izraču- nali smo delež celuloze v suhi biomasi. Rezultati so podani kot srednja vrednost dveh ponovitev. 2.2.2 Laboratorijska delignifikacija 400 g suhe biomase smo v laboratorij- skem delignifikatorju zmešali z 2 litroma vodne raztopine NaOH in Na 2 S, pri čemer smo v primeru japonskega dresnika (op- timiranje postopka) spreminjali količine dodanih reagentov. Slednje so podane glede na suho maso vzorca (Preglednica 1). Delignifikacija je potekala pri 160°C in tlaku 7 bar 2 ali 3 ure. Uporabili smo delignifikator proizvajalca UECIN s pro- stornino 5 litrov. Po končani delignifikaciji smo odstranili nastalo ligninsko lužnico, preostalo vlaknino pa temeljito sprali z vodo, posušili in stehtali ter določili izko- ristek vlaken pri uporabi optimalnih po- gojev (18 % NaOH, 6 % Na 2 S, 3 ure) za vse tri vrste biomase. 2.2.3 Izolacija in analiza lignina (UV-VIS spektroskopija) 50 mL ligninske lužnice smo najprej trik- rat ekstrahirali z diklorometanom (3 × 50 mL). Združene organske faze smo povratno trikrat ekstrahirali z destilirano Vzorec Celuloza, % Vlakninski izkoristek, % Japonski dresnik 37 42 (a 1 ) Rudbekija 37 40 (a 5 ) Octovec 41 42 (a 6 ) Vzorec a 1 a 2 a 3 a 4 a 5 a 6 Masa 57 mg 24 mg 55 mg 47 mg 78 mg 70 mg Preglednica 1: Pogoji delignifikacije Table 1: Delignification conditions Preglednica 2: Vsebnost celuloze in izkoristek vlaken Table 2: Cellulose content and fiber yield Preglednica 3: Mase lignina po ekstrakciji ligninske lužnice Table 3: Weights of lignin extracts vodo (3 × 100 mL). Organsko fazo smo skoncentrirali pod znižanim tlakom na rotavaporju, posušene ekstrakte pa smo stehtali ter določili izkoristek ekstrakcij. V nadaljevanju smo na spektrofotometru Varian 50 Bio Cary posneli UV-VIS spek- tre ekstraktov, in sicer v območju med 200 in 500 nm. V ta namen smo posuše- ne ekstrakte raztopili v etanolu (20 mg/L). Za primerjavo smo posneli tudi etanolno raztopino komercialnega lignina enake koncentracije. 3 Rezultati V Preglednici 2 so predstavljeni rezultati določitve celuloze in vlakninskega izko- ristka pri optimalnih pogojih delignifika- cije. Po pričakovanju vsebujeta japonski dresnik in rudbekija, ki spadata v skupino nelesnih zelnatih trajnic, nekoliko manj celuloze (< 40 %) kot drevesna vrsta octovec (> 40 %), vendar pa so vlaknin- ski izkoristki podobni pri vseh treh vzor- cih biomase. Iz rezultatov lahko ugotovimo, da je iz odpadne biomase obravnavanih rastlin- skih vrst možno izolirati vlakna, vendar pa je postopek tehnološko smiseln le ob predpostavki, da koristno uporabimo tudi lužnico oz. ligninski del, ki predstavlja znaten del biomase. Preglednica 3 prika- zuje mase lignina, ki smo ga pridobili po ekstrakciji ligninske lužnice. Lignin smo z metodo ekstrakcije izolirali iz ligninske lužnice z uporabo organske- ga topila diklorometana, da bi pridobili čim bolj čist aromatski del lignina in se izognili raztapljanju sladkorjev. Pri ek- Vzorec Reagenti Reakcijski čas NaOH Na 2 S a 1 japonski dresnik 18% 6% 3 h a 2 japonski dresnik 18% 6% 2 h a 3 japonski dresnik 21% 3% 3 h a 4 japonski dresnik 0% 6% 3 h a 5 rudbekija 18% 6% 3 h a 6 octovec 18% 6% 3 h Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala papirnica Goričane, tovarna papirja Medvode, d.d., Sora press cream 80 g/m 2 43 RAZISKAVE IN RAZVOJ | Pomlad 2020 | 23 | XLVIII Slika 8: Ekstrakti lignina iz invazivnih tujerodnih rastlin: a 1 , a 2 , a 3 , a 4 , a 5 in a 6 Figure 8: Lignin extracts from invasive alien plats: a 1 , a 2 , a 3 , a 4 , a 5 and a 6 Slika 9: Absorpcijski spekter komericalnega lignina in ekstraktov ligninske lužnice a 1 –a 6 Figure 9: Absorption spectra of commercial lignin and lignin extracts (a 1 –a 6 ) Primerjava barve pridobljenih ekstraktov pokaže, da je barva ekstrakta po dalj- šem času izvajanja sulfatnega postop- ka svetlejša (Slika 8, a 1 in a 2 ). Ekstrakt lignina rudbekije je temno rumene bar- ve (Slika 8, a 5 ), medtem ko je ekstrakt octovca intenzivno rdeč (Slika 8, a 6 ). S snemanjem UV-VIS spektrov smo potrdili, da je v ekstraktih res prisoten aromatski lignin, saj zaznamo tipični absorpcijski maksimum pri 280 nm. Za primerjavo smo posneli tudi absorpcijski spekter komercialnega lignina (Slika 9). kazali, da lahko del lignina ekstrahiramo iz sulfatne lužnice, pri čemer odstrani- mo aromatsko frakcijo, ki je primerna za pretvorbo v vanilin in sorodne aldehi- de. Tovrstne raziskave postajajo vse bolj pomembne, saj pripomorejo k boljšemu gospodarjenju z razpoložljivo biomaso, kar sodi v koncept krožnega gospodar- stva. 5 Literatura [1] Demirbaş, A., Biomass resource facilities and biomass conversion processing for fuels and chemicals. Energy Conversion and Mana- gement 2001, 42 (11), 1357–1378. [2] Klass, D. L., Chapter 5 - Waste Biomass Resource Abundance, Energy Potential, and Availability. In Biomass for Renewable Energy, Fuels, and Chemicals, Klass, D. L., Ed. Acade- mic Press: San Diego, 1998; pp 137–158. [3] Zule, J., Frelih, M., Flajšman, L.. Rastlin- ska biomasa : možni alternativni vir papirnih vlaken = Plant biomass : potential alternative source of paper fibers. Papir 2017, 45 (18), 34–37 [4] Pyšek, P .; Richardson, D. M., Invasive Speci- es, Environmental Change and Management, and Health. Annual Review of Environment and Resources 2010, 35 (1), 25-55. [5] Tursi, A., A review on biomass: importan- ce, chemistry, classification, and conversi- on. Biofuel Research Journal 2019, 6 (2), 962–979. [6] Singh, R.; Shukla, A.; Tiwari, S.; Srivastava, M., A review on delignification of lignocellulo- sic biomass for enhancement of ethanol pro- duction potential. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2014, 32, 713–728. [7] Reynoutria japonica. https://en.wikipedia. org/wiki/Reynoutria_japonica. [8] Rudbeckia. https://en.wikipedia.org/wiki/ Rudbeckia. [9] Rhus typhina. https://en.wikipedia.org/ wiki/Rhus_typhina. [10] Klapiszewski, Ł.; Szalaty, T.; Jesionowski, T., Depolymerization and Activation of Lignin: Current State of Knowledge and Perspectives. 2018. [11] Kürschner, K., Hoffer, A. Eine neue quan- titative Cellulosebestimmung. Chemiker Zei- tung. 1931, 17, 161–168. Zahvala Projekt APPLAUSE sofinancira Evropski sklad za regionalni razvoj preko po- bude Urban Innovative Actions (UIA). Informacije in stališča odražajo izključ- no poglede avtorjev. Pobuda UIA zanje ne odgovarja, prav tako ne za njihovo uporabo. 1 Univerza v Ljubljani, Oddelek za kemijo in biokemijo, Večna pot 113, 1000 Ljubljana 2 Inštitut za celulozo in papir, Bogišićeva 8, 1000 Ljubljana strakciji v organsko topilo se vanj izloči le frakcija lignina, ki je v njem dobro topna, kar pomeni, da je ta izrazito aro- matski del lignina verjetno najprimer- nejši za pretvorbo v vanilin in podobne spojine. Ekstrakti lignina so glede na po- samezne rastlinske vrste in glede na po- stopek delignifikacije različno obarvani (Slika 8). Mase lignina, ekstrahiranega iz 50 mL posameznih lužnic znašajo od 24 do 78 mg, kar ustreza koncentracijam te frakcije v lužnicah od 0,5 do 1,5 g/L. 4 Zaključek Invazivne tujerodne rastline, ki predsta- vljajo ekološki problem zaradi nenad- zorovanega razraščanja in izpodriva- nja domačih vrst, so dejansko bogat vir celuloznih vlaken, lignina in drugih naravnih spojin. Ogromne količine bio- mase, ki ostajajo pri urejanju zelenih po- vršin, pristojne službe v večini primerov uničijo, s čimer uničijo tudi tehnološko pomembne in uporabne komponente. V okviru projekta Applause smo s po- skusi dokazali, da lahko nekatere zelo razširjene nelesne (japonski dresnik, ru- dbekija) in lesne (octovec) vrste uspešno delignificiramo in pridobimo celulozna vlakna, ki lahko delno nadomestijo kla- sična celulozna vlakna pridobljena iz lesa iglavcev in listavcev, ter reciklirana celulozna vlakna različnih vrst papirja, ki so primerna za recikliranje (SIST EN 643). Tehnološka uporaba alternativne biomase pa ima perspektivo le, če bomo koristno uporabili vse njene komponen- te, torej tudi lignin. Naši poskusi so po- Raziskujemo in razvijamo