ZAKLJUČNO POROČILO O REZULTATIH OPRAVLJENEGA RAZISKOVALNEGA DELA NA PROJEKTU V OKVIRU CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROGRAMA (CRP) »KONKURENČNOST SLOVENIJE 2006 - 2013«
I. Predstavitev osnovnih podatkov raziskovalnega projekta
1. Naziv težišča v okviru CRP:	F
Povezovanje ukrepov za doseganje trajnostnega razvoja 2. Šifra projekta:_
V4-0530
3. Naslov projekta:
Razvoj metod za sledenje virom kontaminacije kmetijskih in živilskih proizvodov
3. Naslov projekta
3.1. Naslov projekta v slovenskem jeziku:
RAZVOJ METOD ZA SLEDENJE VIROM KONTAMINACIJE KMETIJSKIH IN ŽIVILSKIH PROIZVODOV
3.2. Naslov projekta v angleškem jeziku:
DEVELOPMENT OF METHODS FOR TRACING THE SOURCES OF CONTAMINATION OF FOOD PRODUCTS
4. Ključne besede projekta
4.1. Ključne besede projekta v slovenskem jeziku:
patogeni mikroorganizmi, molekulama detekcija, molekulama tipizacija, sledenje kontaminaciji
4.2. Ključne besede projekta v angleškem jeziku:
pathogens, molecular detection, molecular typing, tracing of contamination
5.
^aziv nosilne raziskovalne organizacije:
Inštitut za fizikalno biologijo d.o.o. (šifra RO: 1821)
5.1. Seznam sodelujočih raziskovalnih organizacij (R0):
/
6. Sofmancer/sofmancerj i:
/
7. Šifra ter ime in priimek vodje projekta:
21408
Aleš Lapanje
Datum: 15.09.2011
Podpis vodje projekta:

Podpis in^ži
II. Vsebinska struktura zaključnega poročila o rezultatih raziskovalnega projekta v okviru CRP
1. Cilji projekta:
1.1. Ali so bili cilji projekta doseženi?
a)	v celoti
b)	delno
c)	ne
Če b) in c), ie potrebna utemeljitev.
1.2. Ali so se cilji projekta med raziskavo spremenili? a) da
^ b) ne
Če so se, je potrebna utemeljitev:
2. Vsebinsko poročilo o realizaciji predloženega programa dela':
1.	Uvod
Mikrobna kontaminacija kmetijskih pridelkov in posledično živil je v svetu pereč problem. Izmed številnih patogenih mikrobov se Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella sp. in Campylobacter sp. pogosto pojavljajo kot povzročitelji bolezni in z živili povezanih okužb. Posebej v zadnjem času so sevi rodu Campylobacter, odporni na povišane temperature, porajajoči vir nevarnosti kontaminacije in okužb (Mackiw et al., 2008). Povzročajo vročino, drisko in črevesne krče. Listeria monocytogenes je pogost povzročitelj listerioz, spontanih abortusov in hudih okvar centralnega živčnega sistema pri človeku. Listeria izloča toksin, ki zastrupi epitelne celice, saj jim ustavi celični cikel in celice propadejo (Rogers et al., 1996). Zelo podoben učinek ima eden od toksinov enteropatogenega seva bakterije Salmonella typhi - celični distenzijski toksin (Haghjoo in Galan, 2004). Ostale enteropatogene vrste rodu Salmonella izločajo enterotoksin, ki je kodiran znotraj spv operona na patogenem otoku, delu bakteriofaga (Lesnick et al., 2001). Najbolj zloglasni sev £ coli 0157:H7 lahko izloča shiga toksin, ki je kodiran na profagu (Besser et al, 2007). Večina toksinov patogenih bakterij je ali na plazmidih ali na profagih, kar pomeni, da so na izredno mobilnem delu genoma in to ne samo znotraj vrste, ampak tudi med vrstami (Johansen et al., 2001).
Določene bolezni, ki se ponavadi pojavljajo samo pri živalih, se pogosto pojavi tudi določena manifestacija pri ljudeh. Takšne vrste infekcija je npr. infekcija z Mycobacterium avium paratuberculosis, ki je verjetno eden od trigerjev za nastanek Chronove bolezni pri človeku. Slednji bakteriji smo zaradi vse večje povezanosti Johnsove bolezni pri govedu in Chronove bolezni pri človeku, in vse večje aktualnosti problematike, tudi največ namenili v okviru tega raziskovalnega projekta.
Za bistveno izboljšanje meje detekcije mikroorganizmov v kontaminiranih vzorcih smo predhodno morali izboljšati načine vzorčenja, izolacije nukleinskih kislin, molekularnega bogatenja tarč s pomočjo modernih tehnologij manipulacije DNK (magnetna separacija, hibridizacijske kromatografske tehnologije ali predhodno imunološko bogatenje celic). Ta prvi metodološki pristop predstavlja pomemben razvojno-tehnološki prispevek k zaznavi. Tipizacija oz. natančna determinacija sevov predstavlja na novo pripravljeno direktno metodo sledenja virom kontaminacije kmetijskih in živilskih proizvodov.
Raziskave v projektu so imele skupen cilj in sicer določiti najhitrejšo metodo detekcije sevov direktno v okoljskih vzorcih s pomočjo molekularnih tehnik in metodologij. S tem smo določili prototipne metode, ki predvsem pohitrijo in v določenih primerih lahko tudi pocenijo v primerjavi s klasičnim mikrobiološkim pristopom.
2.	Namen in cilji raziskave
Namen raziskave je razvoj izboljšanih metod direktne molekularne zaznave in sledljivosti virom
kontaminacije kmetijskih in živilskih proizvodov.
Za doseganje namena smo si zastavili specifične raziskovalne cilje:
• Izboljšanje direktne molekularne detekcije f. coli, Salmonella sp.. Listeria sp., Compy/obocter v kompleksnem vzorcu: o osredotočenje na vzorčenje,
o osredotočenje na najbolj optimalno metodo destrukcije celic, o osredotočenje na bogatitev molekularnih tarč brez gojenja za lažjo kasnejšo _detekcijo._
^ Potrebno je napisati vsebinsko raziskovalno poročilo, kjer mora biti na kratko predstavljen program dela z raziskovalno hipotezo in metodološko-teoretičen opis raziskovanja pri njenem preverjanju ali zavračanju vključno s pridobljenimi rezultati projekta.
•	Analiza genov, ki l<odirajo toksine na izoiatih:
o osredotočenje na operone,
o osredotočenje na okolico in razmerja med ORF v operonu za toksine, o osredotočenje na okolico operonov oz. genov za toksine, o indukcija profagov in identifikacija razlik, o opredelitev možne tipizacijske sheme.
•	Toksinotipizacija izbranih sevov.
•	Direktna toksinotipizacija in kvantifikacija tarčnih sekvenc s pomočjo qPCR.
•
3. Metodologija projekta
Celoten projekt je zasnovan fazno:
I.	faza je bila namenjena izboljšanju vzorčenja in izkoristka izolacije nukleinskih kislin iz vzorcev kmetijskih in živilskih produktov z namenom direktne zaznave kontaminacije z uporabo učinkovitih metod destrukcije celic in ekstrakcije dednine. V drugi
II.	faza je bila usmerjena predvsem v razvoj in uporabo moiekulanih metod. V tej fazi smo razvili postopke za ugotavljanje sekvenčne variabilnosti in diverzitete genov za toksine
lil. faza je na podlagi prvotni dveh faz omogočila intergracijo rezultatov v eni smeri za namene razvoja sistema za direktno tipizacijo izbranih patogenih mikroorganizmov na osnovi multipleksne RFLP-PCR reakcije in talilnega profila na qPCR in direktne uporabe na terenu.
4. Rezultati projekta
I. Faza - Izboljšava vzorčenja in izkoristka izolacije nukleinskih kislin
a)	Organizacija
Na začetku smo pregledali obstoječe stanje na trgu glede kompletov za izolacijo nukleinskih kislin, ki se uporabljajo za tovrstne namene. Določili smo zaenkrat samo dva proizvajalca: BioEnteric (Irska) in Eiken Chemical (Japonska), ki bi prišla v poštev. Preučili smo še nekatere druge splošne komercialne kite in preverili uspešnost detekcije (MoBio, Qiagen, Promega). Iz testov smo zaključili, da bomo sloneli na nadaljnjem razvoju kompleta za izolacijo nukleinskih kislin, ki temelji na zidelku lastne izdelave (SmartHelix DNA isolation kit).
Poleg tega smo se tudi dogovorili z Inštitutom za varovanje zdravja Republike Slovenije, da nam bo dobavljal kontaminirana živila z bakterijami in referenčne seve, ki so predmet raziskave tega projekta.
b)	Razvoj kompletov za izolacijo nukleinskih kislin
❖ Razvoj učinkovitega načina lize celic iz kompleksnih vzorcev
V prvem delu tega projekta smo se osredotočili na razvoj metodologij za najbolj uspešen način razbijanja celic iz kulture. Za ta namen smo uporabili kulturo bakterij Escherichia coli in Staphylococcus aureus. Ti dve bakterijski vrsti smo izbrali zato, ker je eno izredno lahko lizirati in drugo izredno težko. Za meritve koncentracije DNK smo morali pripraviti rutinske postopke na osnovi fluorometričnih meritev. Za te potrebe smo uporabili meritve s pomočjo barvil Syto82 in SybrGreen I. Fluorometrične meritve smo umerili s pomočjo standardnega kita ter fluorometra Qubit (Invitrogen). Izkazalo se je, da je SybrGreen I meritev bolj ustrezna, saj ni interferirala tako močno z določenimi detergenti in hkrati je inkubacija lahko kratka (krajša od 25 min, ki je potrebna za barvilo Syto82).
Po vzpostavitvi merilnih metod, smo določili kritične točke lize bakterijskih celic:
1. Izbira mehanskega razbijanja (kakšna velikost kroglic se uporabi)_
2.	Izbira detergentov
3.	Čas razbijanja
Ugotovili smo, da je izredno ugodno razbijanje v času 120 minut ter pri najmanjših kroglicah (slika 1, slika 2).
6.00
5.00
I 4.00 S
C
S
s 3.00
i <106 um i 150-212 um
Os	30 s	60s	90s 120 s SH 120 s
Slika 1. Primerjava časov ter velikosti kroglic pri bakteriji E. coli
	8.00
	7.00
X o	6.00
rH	
C	5.00
S	
S o	4.00
	
H-	
ra C	3.00
.a	
S	
v	2.00
	1.00
	0.00
«<106 um ä 150-212 um
Os
30 s
60 s 90 s čas
120 s SH120S
Slika 2. Primerjava časov ter velikosti kroglic pri bakteriji S. aureus
Za primerjavo smo imeli SmartHelix kit (IFB d.o.o., označeno kot SH), ki je nespecifičen in lizira večino bakterijskih celic.
Različne pufre smo primerjali tako, da smo kombinirali detergente Triton X100 in SDS. Preliminarno smo uporabili tudi CTAB, ki pa se z DNK kompleksira in ga je izredno težko potem uporabiti za namene ekeltroforezne ločitve. Najbolj ustrezen je bil pufer, ki je vseboval Triton XlOOterGuanidin HCl (slika 3). _
180.00 160.00
a 140.00 o
£ 120.00 C
g 100.00
i brez lizocima i z lizocimom
B*
Slika 3. Primerjava različnih kombinacij pufrov za potrebe liziranja celic (S. aureus)
Poleg tega smo preverjali amplifikacije s pomočjo PCR. V vseh primerih je PCR reakcija uspešna, vendar rahlo inhibirana. Zaradi tega smo pričeli z implementacijo čiščenja s pomočjo kolonic. Izbrali smo kolonice Econospin kolonice. Te vrste kolonic temeljijo na silikatni osnovi in se aktivirajo s pomočjo guanidinijevega HCl ali pa guanidinijevega izotiocianata. Pri sami lizi smo opazili, da ima lahko vpliv tudi viskoznost lizirajočega medija. To je za pričakovati, saj fizikalna liza temelji na vibraciji zelo malih delcev in s tem irigacijo celične stene/membrane. Viskoznejši kot je medij več sile je potrebno za enako vibracijo kroglic. Pri tem je mogoče optimizirati metodo, da pridobimo na koncu več bolj kvalitetne DNK, to je DNK z višjo molekularno maso. Da smo preverili in tudi optimizirali viskoznost medija za povečanje uspešnosti lize smo uporabili metodo lize z enakim pufrom kot smo ga predhodno razvili in mu dodali giicerol. Ugotovili smo, da je viskoznost vplivala tako na količino izlužene DNK (manj v bolj viskoznem mediju), kot tudi na kvaliteto (manj nizkomolekularne DNK v bolj viskoznem mediju) (Slika 4).

I
-4
Slika 4. Prikaz vpliva količine glicerola na kvaliteto in količino izlužene DNK iz bakterije S. aureus. Od leve proti desni je naraščajoča količina glicerola v enakem pufru in pri enaki količini celic
❖ razvoj postopka liziranja in ekstrakcije nukleinskih kislin iz čistih kultur
Da predhodno lahko predvidimo postopke tipizacije, moramo pridobiti prvo informacijo o znanih tipih bakterij. To pomeni, da je potrebno izdelati metodo hitre in učinkovite ekstrakcije nukelinskih kislin iz čistih kultur. Za ta namen smo pripravili številne protokole izbolšane izolacije nukleinskih kislin iz točno določenih mikroorganizmov. Ti mikroorganizmi so:_
Escherichia coli. Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Salmonella enterica, Legionella pneumophila in Listeria monocytogenes. Bakterije IVI. avium paratuberculosis nismo lizirali na ta način, l<er imajo izredno odporno celično steno in smo za te uporabili metodo lize, ki smo jo razvili za kompleksne vzorce.
Metodološko smo izhajali iz klasičnih protokolov, ki smo jih sami razvili in so se predhodno izkazale za hitre in z visokim izkoristkom: fenolna ekstrakcija z mehansko lizo in metoda s prekuhavanjem. V tem času smo natančno ocenili predvsem metodo s prekuhavanjem in dodajanjem ionskih izmenjevalcev. Hipotetično naj bi ionski izmenjevalci na podlagi vezave dvovalentnih kationov, vplivali na aktivnosti encimov, predvsem restriktaz, in s tem posledično daljšo obstojnost tako izoliranih nukieinskih kislin.
V raziskavi smo uporabili 6 patogenih mikroorganizmov, ki so pogosto škodljivi človeku: Escherichia coli. Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni. Salmonella enterica, Legionella pneumophila in Listeria monocytogenes. Kulture E. coli in S.aureus smo vzgojili sami, ostale patogene pa smo prejeli od IVZ-U. Testirali smo izolacijo s posebnim kationskim izmenjevalcem (Chelex) z enostavnim segrevanjem. Sprva smo vzorce kuhali v vroči kopeli, nato smo sistem aplicirali na stripe in mikrotitrsko ploščo. Za ta namen smo:
1.	Določili čas segrevanja na 100°C potreben, da se izolira veliko DNA in RNA.
2.	Preverili smo potreben čas centrifugiranja stripov/plošč, da se pelet popokanih celic in chelexa dobro zalepi na dno posodice in ne moti naknadnih postopkov (PCR).
3.	Preverili smo, če prihaja do inhibicije, pri raznih količinah začetnega števila celic.
4.	Preverili smo, če prihaja do navzkrižne kontaminacije.
5.	Preverili smo, če so tako pridobljeni izolati uporabni vsaj 1 mesec pri -20°C.
6.	Preverili smo še možnost uporabe multiplex PCR tako izolirane DNK za določanje E. coli in Samonelle sp.
1. Test časa segrevanja
DNA v izoiatu v odvisnosti od časa l<utianja
i -
J,
i DE. coli; i @ S.aureus: i
J
J
Konc. RNA v izoiatu v odvisnosti od časa i<uiianja
s	5	s	10
120000
100000 :
¥ 80000 .
i 60000 Q
I 40000 ■ 20000 . O
iOE.COli:
i a S.aureus: i
ČBs kuhanj 3
5 5 5 10 10 10 15 16 15 Čas iculianja
OCampiyiobacteri! Legionella
5	5	tO	10	10	15	15	15
Čas kuhanja
Konc. DNA v izolatu v odvisnosti od časa kuhanja
Konc. RNA v izolatu v odvisnosti od časa kuhanja
: O Salmonella^ : E Listena
:Q Salmonella i :@LiStena
.0 10 10 15 15 15 2D ro Čas kuhanja
Lil LB Lte .,
5 10 10 10 15 15 15 » 20 ai Čas kuhanj a
Slika 5a, b, c, d, e,f. Grafičen prikaz rezultatov koncentracij DNA in RNA v odvisnosti od časa kuhanja za vsako vrsto patogena.
Rezultati segrevanja in variacije časa prikazujejo, daje potrebno predvsem za bakteriji Listeria monocytogenes kot tudi za S. aureus daljši čas segrevanja (več kot 15 min) in za bakterije E. coli, Campylobacter jejuni in Legionella pneumphila le kratek čas (5 min). Pri tem pa je potrebno bakterijo Salmonella entherica segrevati natančno 15 min (Slike 5a-f).
2. Test časa centrifugiranja
Ponavadi se uporablja metode segrevanja v 1,5 ml epruvetah. Za namene vzporedne manipulacije velikega števila celic, smo razvili metodo segrevanja v stripih in mikrotiterskih ploščicah (8 ali 96 vzorcev hkrati). Pri tem je manipulacija po centrifugiranju lahko daljša, kar posledično vpliva na odlepljanje centrifugiranega peleta. Zaradi tega smo morali preveriti potreben čas centrifugiranja stripov/plošč, da se pelet popokanih celic in chelexa dobro zalepi na dno posodice. Po ustreznem času kuhanja smo izolate centrifugirali in sproti preverjali, kako je z lepljenjem in čvrstostjo peleta.
Izolate smo centrifugirali 5,10 in 15 min ter tako ovrednotili potreben čas centrifugiranja (3000 RPM, 22X) (Tabela 1).
Tabela 1. Čvrstost in prilepljenost peleta ostankov liziranih celic v odvisnosti od časa centrifugiranja
Čas	Čvrstost	Pelet prilepljen na
	peleta	dno epice
5	/	/
10	ok	ok
15	ok	ok
Ugotovili smo, da zadošča 10 minutno centrifugiranje stripov/ plošč, da se ustvari lep pelet in se lahko zanesljivo odpipetira le supernatant brez Chelexa. Dodatno bi bilo potrebno razviti matrix, ki bi še bolj utrdil pelet in omogočal manipulacijo supernatanta kar z multikanalno pipeto.
3. Test inhibicije
Z izolati, kjer smo izmerili najboljši izkoristek s fluorimetrom (določen čas kuhanja) smo naredili PCR, s katerim smo ovrednotili količino izolata, ki nam bo dala objektivne, ne-inhibirane rezultate. Poleg tega smo tudi določili temperaturo priieganja (Tan) za pare oligonukleotidnih začetnikov invA in fem (Slika 6).
invA Salmonella; Tan=61°C
1, 2, 4, 8ul nk template DNAja (chelex ekstrakt)
■m:
S.auerus - vec template DNA; Tan=55''C
SA primerja 6 3 1ul nk
chelex izolat Baitjanmemplaie
fem primerja 6 3 1 ul
chelex izolat Barbann template
Slika 6. Test inhibicije PCR. Sklepi:
•	temperatura priieganja za invA primerje za določanje Salmonelle = 61°C
•	uporabili 1, 2, 4 ali 8 [i\ Chelex izolata - vse se je lepo pomnoževalo, kar pomeni, da ni bilo inhibicije; ja pa pri 4 in 8 ^il že malo nečistoč zaradi preveč DNA template-a
4. Test navzkrižne kontaminacije s PCR
Ker je pogosto pričakovati, da pri večjem številu paralelnih vzorcev pride do navzkrižne kontaminacije, smo to preverjali s pomočjo PCR tarčnega gena na vzorcih izolirane DNK s pomočjo segrevanja. £ coli ali Salmonella sp. (EC ali SAL) smo nacepili v naslednje luknje, in naredili chelex izolacijo:
Tabela 2. Shema prostorske raz
poreditve vzorcev za test navzkrižne kontaminacije
Luknja	1	2	3	4	5	6	7	8
Strip A	EC	SAL		EC				SAL
Strip B		EC		SAL		EC	SAL	
Strip 00	SAL		EC			SAL		EC
20.7.09. PCR za preverjanje crosskontaminacije Chelex stripi
lamB primeija (309 bp, Tan=55°C)	>
nk A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B1 B2 B3 B4 EC SAL EC	SAL EC SAL
-•"•I •
85 B6 B7 B8 C1 C2 C3 C4 C5 C5 C7 C8 ' EC SAL SAL EC	SAL EC

m ^ m m
K
Slika 7. Pod oznakami vzorcev so oznake katera bakterija je bila izolirana v tej jamici. Sklepi:
• Rezultati so deloma v redu, saj smo v 7ih od skupno 25ih vzorcih dobili pozitiven signal PCRja, kjer ne bi smelo biti amplikona. Prav tako smo pri 5ih od 6ih vzorcih Salmonelle dobili nespecifične PCR produkte (Slika 7).
5.	Test časovne uporabnosti chelex izolatov
Naredili smo svežo izolacijo E. coli in Salmonella sp. Te izolate in pa izolate, ki so bili 1 mesec na -20°C smo preverili s PCR (Slika 8).
6.	Implementacija multiplex PCR za E. coli in Salmonella sp. na DNK izolirani s segrevanjem.
Za namene hkratnega preverjanja prisotnosti E. coli in Salmonella sp. smo uporabili oligonukleotidna začetnika invA in lamB. Oba skupaj sta uspešno pomnožila izbrani tarči. Pri tem bi bilo potrebno dodatno še optimizirati v smislu zmanjšanja nastajanje dodtanih fragmentov v multipleksni reakciji (Slika 8)._
17.7.09^ PCR za preverjanje multiplex PCRja
Multiplex PCR - primerja invA+lamB Obicni PCR-lnvA Obicni PCRJamB
E.C. 17.6. E.C. 16.7. Sal. Sal. nk	Sal. Sal. E.c. 17.6. E.c.16.7.
16.7. 17.6.	17.6. 16.7.
Slika 8. Preverjanje obstojnosti DNK na multipleks PCR reakcijo. Sklepi:
•	Chelex izolati so obstojni več kot 1 mesec na -20°C.
•	IVIultiplex PCR uspel, z lamB primerji se da detektirati tako £ coli kot Salmonella sp.
Na koncu I. faze smo ugotavljali in optimizirali protokole, ki bi povečali izplen DNK. Za ta namen smo predvsem preverjali metode obdelave površine plastične stene mikroepruvet za čim manjše lepljenje DNK na stene mikroepruvet.
V prvih poskusih smo poskusili izboljšati izkoristke reakcije s pomočjo uporabe koloidnih delcev, ki bi inaktiviraie površinske interakcije. V primeru, da se DNA prileplja stene posode, jo je manj v reakcijski mešanici. Hkrati pa lahko tudi encima manj zaradi enakih dogodkov. Zaradi tega smo naredili le nekaj preliminarnih poskusov. Testirali smo vplive koloidnih delcev na PCR brez kvantifikacije. Potrebno bi bilo testirati še večje število različno nabitih koloidov in različno kvaliteto vezave na stene posodic.
II. Faza tipizacija in toksinotipizacija izbranih bakterij.
S pomočjo literature in nukleotidnih baz, predvsem NCBI, smo določili metode, ki bi bile enostavne in hitre za PCR pomnoževanje, možne za kvantifikacijo in predvsem nižjega cenovnega ranga. Tako smo pregledali možne variante tipizacije ali na podlagi toksinov, drugih virulenčnih genov ali določenih tipskih genov (insercijske sekvence). V tej fazi smo se potem začeli praktično osredotočati na mikobakterije. Testirali smo tudi možnost tipizacije na primeru M. tuberculosis in nadaljevali na kmetijsko in živinorejsko, v zadnjem času pa tudi zaradi pojava Chronove bolezni, neposredno pomebne tudi za človeka, bakteriji M. avium paratuberculosis.
1. Camovlobacter spp. in Escherichia coli
Za bakterijo E. coli\e bila pregledana literatura za že znane toksine in razpoložljive oligonukleotidnih začetnike za detekcijo le-teh toksinov (Tabela 3)._
Tabela 3. Oligonukleotidni začetniki znani iz literature, ki so usmerjeni v detekcijo toksinov
TOKSIN	VEZAVNO MESTO	IME PRIMERJA	ZAPOREDJE (forward)	IME PRIMERJA	ZAPOREDJE (reverse)
Shiga toksin (stx) 1	STX 1	STXI-F	5-ATAAATCOCCATTCGTrGACTAC-3	STXI-R	5-GAACGCCCACTGAQATCATC-3
Shiea toksin fstx> 2	STX2	STX2-F	5-TCGCCAGTTATCTGACATTCTG-3	STX2-R	5-GGCACTGTCTOAAACTGCTCC-3
Toplotno labilni toksin (LT) 1	LT 1	LTI-F	5-TTACGGCOTTACTATCCTCTCTA-3	LTl-R	5-GGTCTCGGTCAOATATOTGATTC-9
Verotoksin t	SLTl	LP 30	5- CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG - 3	LP 31	5 -CACCAGACAATGTAACCGCTG- 3
Vcrotoksin 2	SLT2	LP 43	5 - ATCCTATTCCCGGGAG1 1 l ACG - 3	LP 44	5 - GCGTCATCGTATACACAGGAGC - 3
Toplotno stabilni toksin (ST) 2	ST2 ,	STII-FP	5-GCAATAAGGTTGAGOTGAT-3	STII-RT	5-GCCTGCAGTOAAATGGAC-3
V	nadaljevanju smo razvili lastne oligonukleotidne začetnike za obe skupini sevov.
Sprva smo in silico analizirali vse do sedaj znane toksine, ki jih izločajo različni sevi bakterij Campylobacter jejuni in Escherichia coli, določitev njihovih nukleotidnih zaporedij in primerjava med njimi.
Metode dela:
V	bazi podatkov NCBI smo poiskali nukleotidna zaporedja genov, ki zapisujejo izbrane toksine, za vse seva preiskovanih bakterijskih vrst. Nukleotidna zaporedja smo med seboj primerjali s programom BioEdit. Sledilo je iskanje že znanih oligonukleotidnih začetnikov za izbrane toksine preko literature in konstruiranje oligonukleotidnih začetnikov s programi PrimerExpress 3.0.
Toksinotipizaciia bakterije Campylobacter jejuni
Rod Campylobacter je bil prvič odkrit leta 1963. Gre za po Gramu nagativne, spiralne, mikroaerofiine bakterije, ki se prosto gibljejo z bički. Glavni kvarljivec hrane in humani patogen je Campylobacter jejuni (95% obolelosti). Pogosta je tudi C. coli (4% obolelosti). Ostale vrste iz rodu Campylobacter povzročijo le 1% primerov obolelosti. C. fetus je povzročitelj spontanih splavov pri govedi in ovcah in je hkrati oportuni patogen pri ljudeh (Wilson et al., 2008). Okužba s kampilobaktri povzroča hude gastrointestinaine težave, ki lahko privedejo celo do krvave driske. Drisko spremlja vročina, bolečine v trebuhu, slabost, glavobol in mišične bolečine. Bolezen nastopi 2-5 dni po okužbi in traja med 7 in 10 dni. Infektivna doza se začne pri 400-500 bakterij, pri nekaterih posameznikih pa več (Bad Bug Book: Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook: Campylobacter jejuni; FDA, ZDA; http://www.fda.Rov/Food/FoodSafetv/Foodbornelllness/FoodbornelllnessFoodbornePathogens NaturaIToxins/BadBuRBook/ucm070024.htm, 24.3.10;)
Bakterij Campylobacter sp. aktivno penetrirajo črevesni mukozni epitel in izloča proteine s pomočjo flagelarnega aparata. Celice črevesnega epitela jo pogoltnejo, kar povzroči razpad integritete epitela. Že 500 celic lahko predstavlja infektivno dozo. Kampilobakter sorazmeroma rad privzema tujo DNA in si jo izmenjuje v obliki horizontalnega prenosa genov. Tako je kar 20% genoma variabilnega med izolati. Genom C. jejuni je velik cca. 1,6-1,7 Mb. Raste v mikroaerofilnih razmerah med 30 in 44°C. C. jejuni v okoWco izloča različne virulenčne dejavnike. Večinoma, kot že prej omenjeno, skozi flagelarni izločevalni aparat. Glavni izločeni proteini so FlaC, FspA, Cia (C. jejuni invasion antigens) in citolitični distendni toksin (CdtA, CdtB in CdtC). FiaC je protein, ki veže HEp-2 celice. FspA (18kb) je v dveh oblikah: FspAl in FspA2. Le FspA2 veže eukariontske celice in inducira apoptozo v epitelnih celicah. Citolitični distendni toksin je sestavljen iz treh podenot CdtA, CdtB in CdtC, ki so vse nujne za toksični efekt. Privzetje CdtB v celice je nujno za toksičnost za eukariontske celice. CdtB ima aktivnost podobno DNazi I. Transiociran je do jedra, kjer povzroči ustavitev celičnega cikla v fazi G2 (van Putten et al., 2009).
Glavni virulenčni geni in geni, ki kodirajo toksine v Campylobacter sp. so: cadF, flaA, cdtA -cytolethal distending toxin subunit A, cdtB - cytolethal distending toxin subunit B, cdtC -
cytolethal distending toxin subunit C, cdtABC, virBll. Še drugi virulenčni ali toi<sinski geni so: cadF, ceuE, virBll, flaA, cdtA, cdtB, cdtC. Kot potencialen gen za molekularno tipizacijo se je izkazal tudi hip (hipuraza), ker ima ta gen le C. Jejuni (Linton et al., 1997; Persson et al., 2005;).
Med najbolj diskriminatornimi se omenja kombinacija cdtA, cdtB in cdtC genov, kot se to uporablja v kitu RR134A Campylobacter (cdt gene) PCR Detection and Typing Kit (Takara Bio., Inc.)
(http://catalog.takara-bio.co.ip/en/product/basic info.asp?unitid-U100006078).
Potencialna uporabnost fiaA gena, ki kodira bičkasti protein FlaA, izhaja iz dejstva, da je le-ta močno variabilen (Dingle et al., 2002).
Diskriminacija med vrstami Campylobacter jejuni, coli m fetus
Najprej je potrebno določiti katero od treh najbolj razširjenih patogenih vrst iz rodu Campylobacter smo izolirali. Za ta namen smo s programom Primrose razvili set treh parov primerjev, optimiziranih za RTqPCR:
Primerja za C. jejuni:
Sekvenca (5'->3')	Tm GC%
Forward primerTGCCAACAACAACTTCAGCTGTGC 59.08 50.00% Reverse primer GCAAGGGGCTATTCCAAAGCGT 57.81 54.55% Dolžina produkta 119 bp
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. jejuni, precej slabše ujemanje s C. coli ali C. fetus.
Primerja za C. coli:
Sekvenca (5'->3')	Tm GC%
Forward primer ACAACCCGTGGGCGTGGGTA	60.39 65.00%
Reverse primer TCCGCTTGCACTCTGCTAACGA 58.60 54.55% Dolžina produkta 150 bp
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C coli, precej slabše s C. jejuni ali C. fetus. Primerja za C. fetus:
Sekvenca (5'->3')	Tm GC%
Forward primerTGGAATTTGCAAGGCAGTTCGGCT 59.88 50.00% Reverse primer AGGTAAATTTCCTGCTTCTTGAACGGC 58.18 44.44% Dolžina produkta 120 bp
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C fetus, slabše ujemanje s C. jejuni ali C. coli. Na podlagi izbranih primerjev lahko ločimo med tremi najpogostejšimi patogenimi vrstami iz rodu Campylobacter.
Disl<riminacija med sevi Campylobacter jejuni
Glede na to, da je C. jejuni najbolj razširjena izmed humanih patogenov iz rodu Campylobacter, smo se osredotočili na toksinotipizacijo v tej vrsti. Po pozitivnem testu za C. jejuni (glej gor), je potrebno določiti sev. Mi smo izbrali tipizacijo sevov, glede na variabilnost zapisov štirih genov. Proučili smo genetsko variabilnost zapisa genov za citoletalni distendni toksin {cdt) podenote A, B in C (cdtA, cdtB, cdtC). Prav tako smo naredili toksinotipizacijo na podlagi sekvenc gena fspA2, ki z vezavo na celice črevesnega epitela povzroči njihovo apoptozo, gena hipO, ki kodira hipurikazo in je specifičen za C. jejuni, ter gena hlaA, ki kodira bičkasti aparat in je izjemno variabilen.
cdtgen
a)	Diskriminacija s Taqman sondami
Forward primer 1: 5'-CCTATACTCCACCrCyTTTAGCTG-3~ 24 bp, 50% GC, Tm basic = 57°C
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. fetus, nič ujemanja s C. jejuni a\\ C. coli.
Reverse primer 1: 5'-TCTCCAGTAGGAGyTGCAAAGGy-3^
23	bp, 52% GC, Tm basic = 57°C
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C fetus, nič ujemanja s C jejuni ali C. coli. Velikost pomnožka zgornjih oligonukleotidnih začetnikov je 183 baznih parov.
Taqman sonde:
•	5'-GTTTAAGATCTCATATAGTTTCGGATCATnTCCAG-3' 33 bp, 36% GC, Tm basic = 60°C
•	5'GTTTAAGATCTCATATAGTTTCAGATCATTTTCCAG-3' 36 bp, 31% GC, Tm basic = 59°C
•	5~-GATGCTTGCAAGTTTAAGATCATTTTCCAG-3^ 30 bp, 37% GC, Tm basic = 58°C
•	5'-ATGCTTGCAAGTTTAAGATCATTTTCAG-3' 28 bp, 32% GC, Tm basic = 54°C
b)	Diskriminacija z melting profili
Za diskriminacijo z melting profili smo izbrali regijo, kjer sta v genih cdtABC dve obsežni deieciji. Tako dobimo, če pomnožujemo skrajne regije teh delecij, tri skupine amplikonov, ki se, bolj kot po bazni sestavi, ločijo po dolžini. Zaradi treh različnih skupin amplikonov lahko ločimo med tremi skupinami sevov C. jejuni.
Forward primer 1: 5'-ACCTATACTCCACCGCTTTTAGCT-3'
24	bp, 56°C, 46% GC
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. fetus, nič ujemanja s C. jejuni ali C. coli.
Reverse primer 1: 5^-TCCAGTAGGAGTTGCAAAGGCTAAAGT-3' 27 bp, SS-C, 44% GC
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. fetus, nič ujemanja s C. jejuni ali C. coli.
Na podlagi izbranih primerjev dobimo tri skupine amplikonov genov cdtABC C. jejuni v približni dolžini 144, 165 in 172 bp, z meltingi cca. 72 in 73°C. Problem predstavlja, da sta si dva amplikona podobna po nukleotidni sestavi in imamo zato le 2 melting vrhova.
Forward primer 2: 5'-ATGCTTGCAAGTTTAAGATC-3~ 20 bp, 46°C, 35% GC
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. fetus, nič ujemanja s C. jejuni ali C. coli.
Reverse primer 2 (5'->3'): 5'-ATTRTTRCTTTR I I I I I IATGTTTAT-3' 26 bp, 44°C, 12% GC
Test v NCBI Nucleotide blast: 100 % ujemanje s C. fetus, nič ujemanja s C. jejuni ali C. coli.
Na podlagi izbranih oligonukleotidnih začetnikov dobimo tri skupine amplikonov genov cdtABC C. jejuni v približni dolžini 80, 103 in 110 bp, z meltingi cca. 59, 63 in 65°C (OligoCalc) oz. 74, 77 in 78°C (VectorNTI). Problem predstavlja nizka melting temperatura oligonukleotidnih začetnikov.
fspAZ gen
Na podlagi poravnave šestnajstih zaporedij sekvec gena fspA2 iz baze NCBI Nucleotide smo se odločili, da ne bi bil pravšnji za genotipizacijo, saj je bilo vseh 16 sekvenc precej podobnih si med seboj. Prav tako ni bilo nobenih obsežnejših delecij/ insercij, ki bi bile uporabne za ločevanje na podlagi melting profilov.
hipO gen
Na podlagi poravnave 36 zaporedij sekvec gena hipO v bazi NCBI Nucleotide, smo se odločili, da bi bilo lahko zaporedje na lokacijah od 122 do 126 baze, glede na sekvence v Campylobacter jejuni, uporabno za tipizacijo, saj je tu prisotna močno variabilna regija.
hlaA gen
Sekvence gena hlaA, ki kodira bičkasti aparat in smo jih uspeli dobiti v bazi NCBI Nucleotide, so se
izkazale za izjemno variabilne. Kot take bi bile uporabne za ločevanje z uporabo tehnike
denaturacijske gradientne gelske elektroforeze (DGGE). Visoko variabilni segment//oA gena bi
lahko ločili na DGGE gelih, ker se močno razlikujejo po svojem baznem zaporedju.
Z namenom pomnožiti//o^ gen smo razvili set primerjev FlaA:
Forward primer FlaAf: 5^-GGTCTTAGAGTTTAGAAATTATGGAGGG-3^
28 bp, 39% GC, Tm basic = 57°C
Test v NCBI Nucleotide blast: 100% ujemanje s C. jejuni.
Reverse primer FlaAr: 5^-TCATCATCTTTTACCCACTCATCCCATC-3^
28 bp, 43% GC, Tm basic = 58°C
Test v NCBI Nucleotide blast: 100% ujemanje s C. jejuni.
Z omenjenima primerjema bi pomnožili približno 686 bp dolge segmente, ki bi jih nato ločili z uporabo DGGE. Tako dobljene fragmente različnih sevov bi izrezali in DNA ponovno pomnožili s PCR. Po sekveniranju bi dobili točne podatke o sekvencah raznih sevov.
Literatura:
Linton D., Law/son A.J., Owen R.J., Stanley J.1997. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol, 35(10): 2568-2572
Persson S., Olsen K.E.P.2005. Multiplex PCR for identification of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni from pure cultures and directly on stool samples. J Med Microbiol, 54(11): 1043-1047
Dingle K.E. s sod. 2002. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: A basis for epidemiologic investigation. Emerging Infect Dis, 8(9): 949-955
Toksinotipizaciia bakterije Escherichia coll
E. coli \e ena izmed najbolj preučevanih prokariontskih mikroorganizmov. Uvrščamo jo v družino Enterobacteriaceae in je po Gramu negativna bakterija. Rod obsega pet vrst: E. coli, E. hermannii,
f. fergusonii, E. vulneris in f. blattae.
E. coli, ki povzročajo črevesne okužbe delimo na sledeče seve:
•	Enteropatogene E. coli (EPEC) - ne izločajo verotoksina. V to skupino uvrščamo naslednje 0-serološke supine: 026, 055, 086, 088, 0103, Olli, 0114, 0119, 0125ac, 0126, 0127, 0128ab, 0142, 0145, 0157, 0158.
•	Enterotoksigene E. coli (ETEC) - izločajo toplotno labilne (LT) in/ ali toplotno stabilne (ST) enterotoksine. Toplotno labilni enterotoksini so funkcionalno in strukturno zelo podobni enterotoksinu Vibrio cholerae. V to skupino uvrščamo naslednje 0-serološke skupine: 06, 08, 025, 078, 0153, 0128, 086.
•	Enteroinvazivne £ coli (EIEC) so sorodne šigelam.
•	Enteroagregativne £ coli (EAggEC) - izdelujejo nekatere enterotoksine in citotoksine. Njihova značilnost je, da se na celice črevesne sluznice pritrjujejo v značilnem vzorcu in, da se bakterije povezujejo med seboj.
•	Difuzno adherentne £ coli (DAEC)
•	Verotoksigene £ coli (VTEC) - izdelujejo verotoksine VTl in/ali VT2, ki so podobni šigovim toksinom, ki jih izdeluje Shigella dysenteriae tipa 1. Najpogostejše 0-serološke skupine VTEC so 0157, 06, 026, 091, 0103, Olli, 0113, 0117, 0118, 0121, 0128, 0145. Med VTEC sodijo tudi enterohemoragične £ coli (EHEC).
Določili smo naslednje oligonukleotidne začetnike za izbrane toksine:
•	Shiga toksin 1 (Paton A.W., 1998):
o Forw/ard primer: STX1-F: 5'-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3' o Reverse primer: STX1-R: 5^-GAACGCCCACTGAGATCATC-3' o Dolžina pomnožka: 180 bp
•	Shiga toksin 2 (Paton AW, 1998):
o Forw/ard primer: STX2-F: 5^-TCGCCAGTTATCTGACATTCTG-3' o Reverse primer: STX2-R: 5~-GGCACTGTCTGAAACTGCTCC-3~ o Dolžina pomnožka: 255 bp
•	Shiga like toxin 1 (Tsen in Jian, 1998):
o Forward primer: SLT1-5: 5~-AGCTGAAGCTTTACGTTTTCGG-3~ o Reverse primer: SLT 1-3: 5^-TTTGCGCACTGAGAAGAAGAGA-3' o Dolžina pomnožka: 590 bp
•	Shiga like toxin 2 (Tsen in Jian, 1998):
o Forward primer: SLTII-5: 5'-TTTCCATGACAACGGACAGCAGTT-3' o Reverse primer: SLTII-3: 5'-ATCCTCATTATACTTGGAAAACTCA-3^ o Dolžina pomnožka: 694 bp
•	Toplotno labilni toksin 1 (Yano s sod. 2007):
o Forward primer: LTl-F: 5^-TTACGGCGTTACTATCCTCTCTA-3~ o Reverse primer: LTl-R: 5'-GGTCTCGGTCAGATATGTGATTC-3~ o Dolžina pomnožka: 275 bp
•	Toplotno labilni toksin 1 (Victor s sod., 1991)
o Forward primer: LT 51: 5~-CCGTATTACAGAAATCTGA-3~ o Reverse primer: LT 31: 5^-GTGCATGATGAATCCAGGGT-3^ _o Dolžina pomnožka: 110 bp_
•	Toplotno stabilni toksin 2 (Lortie s sod., 1991):
o Forward primer: STII-FP: 5'-GCAATAAGGTTGAGGTGAT-3^ o Reverse primer: STII-RT: 5'-GCCTGCAGTGAAATGGAC-3~ o Dolžina pomnožka: 368 bp
•	Verotoksin 1 (Čebula s sod., 1995):
o Forward primer: LP 30: 5~-CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG-3^ o Reverse primer: LP 31: 5'-CACCAGACAATGTAACCGCTG -3~ o Dolžina pomnožka: 348 bp
•	Verotoksin 2 (Čebula s sod., 1995):
o Forward primer: LP 43: 5~-ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG-3~ o Reverse primer: LP 44: 5'-GCGTCATCGTATACACAGGAGC-3~ o Dolžina pomnožka: 584 bp
2. Tipizacija bakterij Salmonella sp.
S pomočjo literature in javno dostopnih baz podatkov (NCBI, UniProt) poiskati genske zapise toksinskih in virulenčnih genov za bakterijo rodu Salmonella in ugotoviti na podlagi kakšnih razlik v nukleotidnem zapisu zgoraj omenjenih genov lahko ločimo med seboj čim večje število različnih patogenih sevov bakterije rodu Salmonella.
Iz literature in baze podatkov UniProt smo sprva poiskali gene, ki zapisujejo toksine ali pa virulenčne faktorje in preverili njihovo delovanje, ki ga imajo na gostiteljsko celico. Sledilo je iskanje zaporedja nukleinskih baz v bazi podatkov NCBI Blast ter preverjanje prisotnosti posameznega gena pri posameznih bakterijskih sevih, za katere je v bazi podatkov objavljen celoten genom. Nato smo zaporedja nukleinskih kislin posameznega gena primerjali med različnimi sevi bakterije rodu Salmonella s programom BioEdit Sequence Alignment Editor. V bazi podatkov smo poiskali tudi informacijo o lokaciji izbranega gena pri posameznem sevu: ali se gen nahaja na plazmidu ali na kromosomu. Med bakterijskimi sevi smo poleg primerjave nukleotidnega zapisa gena primerjali tudi nukleotidni zapis njegove okolice ter iskali palindromska zaporedja.
Rezultati
Izbor toksinskih in virulenčnih genov:
cdtB:
1. protein z endonukleazno aktivnostjo, povzroči poškodbe DNA, fragmentacijo kromatina, ustavitev G2/IV1 celičnega cikla in povečanje jedra v gostiteljski celici,
2.	gen je zapisan na kromosomu,
3.	gen se nahaja pri treh bakterijskih sevih: Salmonella enterica subsp. enterlca serovar Typhi str. CT18, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. Ty2 in Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150.
spvB (Salmonella plasmid virulence):
1.	delovanje produkta gena ni znano,
2.	gen je zapisan na plazmidu,
3.	gen se nahaja pri sledečih bakterijskih sevih: Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Choleraesuis plasmid pOU7519, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium plasmid pSLT-BT, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C strain RKS4594 plasmid pSPCV, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67 plasmid pSCVSO, Salmonella enterica OU7025 plasmid pOU1113, Salmonella typhimurium LT2 plasmid pSLT, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis RF-1 plasmid pKDSCSO, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin plasmid pOUlllS.
hlvE:
1.	gen zapisuje protein hemolizin E s hemolitično al<tivnostjo do sesalčjih celic, na ceiičnili membranah l<ateriii tvori pore,
2.	gen je zapisan na kromosomu,
3.	gen se nahaja pri sledečih bakterijskih sevih: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. AKU_12601, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund str. CVM19633, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. Ty2, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18.
ccdB:
1.	gen zapisuje citotoksični protein, ki preprečuje delovanje encima DNA-giraze, ki je odgovoren za razvitje dvovijačne DNA ob njenem pomnoževanju,
2.	gen je lahko zapisan na:
a.	kromosomu: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. P125109, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str. 287/91, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_02021853, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Schvi/arzengrund str. CVM19633.
b.	plazmidu: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis plasmid pOU7519, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67 plasmid pSCVSO, Salmonella enterica OU7025 plasmid pOU1113, Salmonella typhimurium LT2 plasmid pSLT, Salmonella enterica enterica si/ Choleraesuis RF-1 plasmid pKDSCSO, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky str. CVM29188 plasmid pCVM29188_46, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky str. CVM29188 plasmid pCVM29188_101, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium plasmid pU302L, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_02021853 plasmid pCT02021853_74, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin plasmid pOUlllS.
Ob pregledu prisotnosti zgoraj omenjenih genov različnih bakterijskih sevov, se je izkazalo, da imajo lahko določeni bakterijski sevi več različnih toksinskih in virulenčnih genov hkrati. Takšni primeri so:
• sevi, ki imajo zapis za gena cdtB in hlyE so: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. Ty2, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150,
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18,
•	sev, ki ima zapis za gena hlyE in ccdB je Salmonella enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund Str. CVM19633,
•	sevi; ki imajo zapis za gena spvB in ccdB so: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis plasmid pOU7519, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67 plasmid pSCVSO, Salmonella enterica OU7025 plasmid pOUlllS, Salmonella typhimurium LT2 plasmid pSLT, Salmonella enterica enterica sv Choleraesuis RF-1 plasmid pKDSCSO, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin plasmid pOUlllB.
Ob pregledu zapisa gena ccdB pri raziičnili sevih smo našli sev pri katerem je imenovani gen zapisan tako na kromosomu kot tudi na plazmidu: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_02021853 plasmid pCT02021853_74.
Ločevanje posamenih sevov Salmonella na podlagi pregleda različnih nukleotidnih zapisov
toksinskih in/ali virulenčnih genov in njihove prisotnosti/odsotnosti v posameznem genomu
Toksinski geni zapisani na kromosomih:
Na podlagi nukleotidnega zapisa za gen hlyE lahko ločimo tri skupine sevov:
1.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. AKU_12601 in Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC9150: se ne ločita med seboj; drugi sev lahko ločimo od prvega s pomnožitvijo še dodatnega gena cdtB,
2.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. Ty2 in Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18: se ne ločita med seboj,
3.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund str. CVM19633: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa za gen hlyE.
Na podlagi nukleotidnega zaporedja za gen ccdB lahko ločimo dve skupini sevov:
1.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. P125109, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str. 287/91 in Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_02021853: se ne iočljo med seboj; zadnji sev lahko ločimo od prvih dveh še z dodatno pomnožitvijo istega gena (le drug zapis) na plazmidu,
2.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa za gen ccdB.
Toksinski geni zapisani na plazmidih:
Na podlagi nukleotidnega zaporedja za gen ccdB lahko ločimo šest skupin sevov:
1.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky str. CVM29188 plasmid pCVM29188_46: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa za gen ccdB,
2.	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky str. CVM29188 plasmid pCVM29188_101: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa
za gen ccdB,
3.	Salmonella typhimurium plasmid pU302L: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa za gen ccdB,
4.	Salmonella enterlca strain OU7025 plasmid pOUlllS: se samostojno loči na podlagi razlik v nukleotidnem zaporedju zapisa za gen ccdB,
5.	Salmonella enterlca subsp. enterlca serovar Dublin str. CT_02021853 plasmid pCT02021853_74, Salmonella enterlca subsp. enterlca serovar Dublin plasmid pOUlllS InjSalmonella enterlca subsp. enterlca serovar Typhimurium str. LT2 plasmid pSLT: se ne ločijo med seboj; prvi sev lahko ločimo od drugega na podlagi znanja, da sev vsebuje zapis za ta isti toksinski gen tudi na kromosomu; drugi sev lahko ločimo od preostalih dveh na podlagi znanja, da ta sev vsebuje tudi gen spvB,
6.	Salmonella enterlca subsp. enterlca serovar Choleraesuis strain OU7519 plasmid pOU7519,Salmonella enterica subsp. enterlca serovar Choleraesuis str. SC-B67 plasmid pSCVSO \n_Salmonella enterica enterica sv Choleraesuis RF-1 plasmid pKDSCSO: se jih ne da ločiti med seboj.
Na podlagi nukleotidnega zaporedja spvB lahko ločimo sev:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C strain RKS4594 plasmid pSPC.
Literatura:
Zore A., Zabukovnik P., Andlovic A. 2007. Enterohemoragični sevi Escherichia coli in onesnaženost hrane od polja do mize. Posvetovanje: Varna in zdrava hrana na mizi potrošnika, 7. december 2007
Tsen H.-Y., Jian L.-Z. 1998. Development and use of a multiplex PCR system for the rapid screening of heat labile toxin I, heat stable toxin II and shiga-like toxin I and II genes of Escherichia coll in water. Journal of Applied Microbiology: 84, 585-592
Victor T., Toit R.O., van Zyl J., Bester A.J., van Helden P.D. 1991. Improved method for the routine identification of toxigenic Escherichia coll by DNA amplification of a conserved region of the heat labile toxin A subunit. Journal of Clinical Microbiology: 29,158-161
Lortie LA., Dubreuil J.D., Harel J. 1991. Characterization of Escherichia coll strains producing heat stable enterotoxin b (STb) isolated from humans w/ith diarrhoea. Journal of Clinical Microbiology 29, 656-659
Paton A. W., Paton J. C. 1998. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coll by using multiplex PCR assays for stxl, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coll hlyA, rfbOlll, and rfbOlSl. Journal of Clinical Microbiology 36:598-602
Cebula T. A., Payne W. L., Feng P. 1995. Simultaneous Identification of Strains of Escherichia coll Serotype 0157:H7 and Their Shiga-Like Toxin Type by Mismatch Amplification Mutation Assay-Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology: 33,1, 248-250
Yano A., Ishimaru R., Hujikata R. 2007. Rapid and sensitive detection of heat-labile I and heat-
stable I enterotoxin genes of enterotoxigenic Escherichia coli by Loop-Mediated Isothermal Amplification. Microbiology Methods: 68, 414-420
3. Razvoj metode in situ tipizacije bakterij na primeru M. tuberculosis
Izvedli smo preliminarne poskuse za tipizacijo sevov Mycobacterium tuberculosis na podlagi lokalizacije insercijskih sekvenc tipa IS6110. Klasične metode uporabljajo RFLP tipizacijo, ki traja več dni, zaradi česar je potreben razvoj hitrejših molekularnih metod. Razviti princip metode se da prenesti tudi na druge človeku nevarne bakterije, kot je Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, ki je povzročitelj Johne-jeve bolezni pri govedu in drugih prežvekovalcih, pri človeku pa je domnevno vpletena v razvoj Crohn-ove bolezni. Glavna pot prenosa bolezni na človeka je kontakt z okuženo živaljo, še bolj pomembno pa preko kontaminiranega kravjega mleka.
Insercijske sekvence so mobilni genetski elementi, ki se nahajajo v več kopijah v genomu bakterij. Število in pa lokacija teh insercijskih sekvenc v genomu nam omogoča ločiti med posameznimi sevi M. tuberculosis. Karakterizacija okolic insercijskih sekvenc pri različnih sevih nam bo omogočila načrtovanje multiplex PCR sistema, na podlagi katerega bomo lahko identificirali prisotnost različnih sevov v vzorcu ali karakterizirali posamezne seve, izolirane s klasičnimi mikrobiološkimi tehnikami.
Metode
Za določitev lokacij IS6110 smo iz agaroznega gela klasične RFLP tipizacije izrezali IS6110 pozitivne odseke DNK petih sevov M. tuberculosis. Nato smo izvedli čiščenje DNK iz gela čez silica kolone (Promega, ZDA) in preverili prisotnost !S6110 v posameznem odseku DNK s PCR. Uporabili smo začetne oligonukleotide:
IS6110_60F 5' TCTGGCGTTGAGCGTAGTAG IS6110_418r 5' CGAGCAAGCCATCTGGAC
Uporabili smo PCR program:
Temp.	čas
95°C	2 min
BB'C	45 s
55°C	45 s h35x
72°C	45 s
72°C	5 min
Očiščene odseke smo nato razrezali z restrikcijskimi encimi. Izbrali smo encime, ki režejo znotraj insercijske sekvence in v okolici 3' konca IS6110, glede na genom M. tuberculosis H37Rv. V preliminarnih poskusih smo preizkusili tri restrikcijske encime:
Encim	Čas inkubacije z DNK/temp.	Čas za inaktivacijo encima/temp.
BamHI	1 h/37°C	20 min/80°C
Ncol	1 h/37°C	20 min/65°C
Eco52l	1 h/37°C	20 min/65°C
Pomembni parametri pri restrikcijskih encimih so predvsem izkoristek rezanja in ponovne
ligacije, možnost inaktivacije in rezidualna aktivnost ter velikost odsekov, ki jih generira. Optimalna dolžina, ki jo še lahko učinkovito pomnožimo s PCR je do 4000 bp. To je odvisno od oddaljenosti prepoznavnega mesta za encim od 3' konca insercijske sekvence, ki se razlikuje za vsako insercijsko sekvenco. Minimalna dolžina je pomembna za uspešno iigacijo v krožno DNK in se giblje med 150 in 200 bp.
Razrezano DNK smo nato llgirali s T4 ligazo, 16 ur na 16°C, inaktivirali encim 20 min pri 65°C in mešanico uporabili direktno v inverzni PCR reakciji. V primeru uspešne avtoligacije smo dobili krožne DNK produkte, ki so vsebovali 3' okolico IS6110 (Slika 9). Krožne produkte smo pomnožili z inverznimi začetnimi oligonukleotidi:
ISOF 5' TACAAGACCGAGCTGATCAAAC ISOR 5'AGATCCCCTATCCGTATGGTG
Uporabili smo PCR program:
Temp.	čas
94°C	2 min
95°C	45 s
56°C	45 s h 35x
yz-c	3,5 min
72°C	5 min
Za pozitivno kontrolo smo skonstruirali plazmid na osnovi pCR 2.1 (Invitrogen), kije vseboval 800 bp 3' konca IS6110.
Rezanje DNK
Ligacija
Sekveniranje
Inverzna PCR
Slika 9. Princip določevanja okolic insercijske sekvence IS6110. Rdeče označeno - IS6110, črno označeno - okolica IS6110
Amplikone smo preverili z agarozno gelsko elektroforezo, jih izrezali iz gela ter očistili čez silica kolone (Promega, ZDA). Očiščene amplikone smo sklonirali v vektor pCR 2.1 (Invitorgen, ZDA) in transformirali v eiektrokompetentne E. coli. Po inkubaciji na LB ploščah s seiekcijskim antibiotikom (ampicilin) in X-gal smo bele kolonije precepili, izolirali plazmidno DNK in sekvenirali inserte z M13 univerzalnimi začetnimi oligonukleotidi.
Zaporedja smo poravnali v programu Bioedit, lokacijo IS6110 pa določili s preverjanjem naleganja zaporedij na objavljene genome M. tuberculosis z uporabo orodja Blastn.
Izrez IS6110 pozitivnih odsekov
Uspešno smo izrezali IS6110 pozitivne odseke iz agaroznega geia RFLP tipizacije. Z začetnimi oligonukieotidi IS6110_60F/IS6110_R smo uspešno pomnožili specifičen odsek iz vseh izrezanih vzorcev (Slika 10).
^^ ^ ^ fi <? jj^« -fMf iT« ^^ M
—-'S-
'«M •^♦-t«
»te
ft«

M
- ff tt^m


Slika 10. Levo - slika agaroznega gela klasične RFLP tipizacije (Bolnišnica Golnik). Vidni so odseki, pozitivni za prisotnost IS6110. Izrezali smo vse odseke vzorcev 1, 9,14,15 in 19. Desno -PCR za povratno preverjanje prisotnosti IS6110 v izrezanih in čiščenih DNK odsekih; 1 -označevalec velikosti, 2 - vzorec 19A, 3 - vzorec 19B.
Rezanje odsekov z restrikcijskimi encimi, inverzna PCR in analiza zaporedij
Z rezanjem in ponovno ligacijo smo dobili ustrezne krožne DNK produkte, ki smo jih uspeli pomnožiti z inverzno PCR (Slika 11). S tem smo potrdili delovanje zasnovanega koncepta.
1.5% Agarose
ligaciji dobili 19F, 3
Slika 11. Primer agarozne gelske elekroforeze produktov po rezanju z Ncol, in inverzni PCR. V primeru prisotnosti krožne, pravilno ligirane DNK, smo viden produkt. 1 - označevalec velikosti (legenda skrajno desno), 2 - vzorec -vzorec 19F, 4, 5 - pozitivna kontrola, 6 - negativna kontrola.
Preizkušeni encimi niso bili ustrezni glede na izbrane parametre.
Encim BamHI je kazal rezidualno aktivnost, kljub temperaturni inaktivaciji, zaradi česar je bil izkoristek pomnoževanja krožnih ligacijskih produktov z inverzno PCR slab. Analiza zaporedij je pokazala, da v večini zaporedij manjkajo 3' okolice IS6110. Razlog je bilo nespecifično rezanje encima BamHI, t.i. star aktivnost, ki se je kljub redčenju encima v restrikcijski reakciji nismo uspeli znebiti.
Pri encimu Ncol nismo zaznali rezidualne aktivnosti ali nespecifičnega rezanja. Z inverzno PCR smo uspešno pomnožili avtoligirane krožne DNK le pri 4 vzorcih. Razlog je v preveliki oddaljenosti prepoznavnega mesta za Ncol od 3' konca nekaterih IS6110, zaradi česar je bil ligacija v krožne produkte slaba, zaradi prevelikih konstruktov (nad 4000 bp) pa z inverzno PCR nismo dobili produkta.
Na podobne težave smo naleteli tudi pri uporabi encima Eco52l. Sklep
Zasnova koncepta lokalizacije IS6110 v M. tuberculosis je ustrezna in jo bomo uporabljali v prihodnjih poskusih. V preliminarnih raziskavah smo preverili delovanje treh restrikcijskih encimov, ki pa so se izkazali za neustrezne glede na izbrane parametre. Z in silico analizo objavljenih genomov IVI. tuberculosis smo izbrali nove restrikcijske encime, ki jih bomo preizkusili. Preverili smo predvsem oddaljenost med restrikcijskimi mesti znotraj IS6110 in v okolici 3' konca. Po primerjavi je med najbolj primeren kandidati encim Bfal (Tabela 4).
Tabela 4. Primerjava razdalj med dvema prepoznavnima mestoma za različne restrikcijske encime v IS6110 in okolici 3' konca IS6110. Primerjava je bila izvedena na genomu M. tuberculosis H37Rv (Genebank ID: NC_000962)
Restrikcijski encimi/razdalje med dvema prepoznavnima mestoma v bp
zap. št. IS61100	BpuEl	Bfal	BssHII	Xhol	Zrai/Aati 1
1	2333	2021	388	459	4248
2	3338	882	444	249	489
3	4633	568	2675	966	1865
4	3295	1972	2398	1162	416
5	>5000	654	1391	3927	1746
6	1200	820	247	246	247
7	2618	773	996	3542	1541
8	4205	376	290	680	1177
9	1848	1238	799	569	2284
10	3553	874	446	4384	206
11	>5000	770	1565	1082	393
12	935	1136	231	1026	1471
13	2480	1071	860	>5000	2965
14	>5000	371	3640	3019	416
15	>5000	882	444	250	488
16	>5000	806	1085	2845	988
17	2716	1297	619	1330	1584
Ob uspešnem testiranju encima Bfal bomo pripravili klonsko knjižnico produktov inverzne PCR za posamezne seve ter pridobili zaporedja vseh okolic 3' koncev IS6110. Glede na ta zaporedja bomo zasnovali multiplex PCR sistem za hitro tipizacijo sevov. Preizkusili bomo tudi neposredno tipizacijo s primerjavo dolžin produktov inverzne PCR in jo primerjali s klasično RFLP tipizacijo.
In silico analiza lokacij insercijskih zaporedij tipa 6110 na objavljenih genomih Mycobacterium tuberculosis
Za namene in situ genotipizacije sevov Mycobacterium tuberculosis {Mtb) direktno iz vzorcev, smo z bioinformatskimi orodji izvedli analizo lokacij oziroma okolic insercijskih zaporedij tipa 6110 (156110). Zaporedja okolic nam bodo omogočila konstrukcijo oligonukieotidov, ki bodo temelj za genotipizacijo sevov Mtb, bodisi z multipleks PCR reakcijo na izbranih ustrezno diskriminatornih lokacijah IS6110, bodisi s pripravo mikročipa za tarčno resekveniranje z metodami sekveniranja naslednje generacije.
Metode
Zaporedja objavljenih genomov smo dobili v javni bazi podatkov NCBI (National Centre for Biotechnology Information) in jih analizirali v programu VectorNTI (Invitrogen). Vse prisotne IS6110 vključno z okolico 1000 baznih parov gor- in dolvodno smo poravnali v programu Bioedit. Zaporedja 5' in 3' okolic smo primerjali z NCBI bazo nukleotidnih zaporedij z uporabo algotima
	Sev	H37RV	H37Ra	CDC 1551	KZN 1435	Fll
	št. IS6110	14	9	4	14	17
BLAST (NCBI) in poiskali pripadajoče genomsi<e regije oziroma gene, identiteto predvidenih prepisov v proteine smo preverili v bazi proteinskih zaporedij UNIPROT (wv^/w.uniprot.orR), fizično lokacijo genov pa v aplikaciji za vizualizacijo anotiranih genomov Sequence Viewer (NCBI). Lokacije vseh IS6110 smo normirali na sev H37Rv s primerjavo nukleotidnih zaporedij okolic IS6110 z zaporedjem genoma H37Rv z algoritmom BLAST (NCBI). Vsako specifično lokacijo smo označili s svoj številko in določili diskriminatorno moč genotipizacije z lokacijami IS6110.
Rezultati
Analizirali smo 5 objavljenih genomov Mtb:
1.	Sev H37RV (NCBI ref. št.: NC_000962.2),
2.	Sev H37Ra (NCBI ref. št.: NC_009525.1),
3.	Sev CDC 1551 (NCBI ref. št.: NC_002755),
4.	Sev KZN 1435 (NCBI ref. št.: NC_012943.1) in
5.	Sev Fll (NCBI ref. št.: NC_009565.1).
Sevi so se razlikovali v številu IS6110 v genomu (Tabela 5) kot tudi po lokacijah/insercijskih mestih, kar kaže na veliko raznolikost sevov glede omenjene insercijske sekvence. IS6110 so bile vstavljene v nekodirajočih regijah med dvema odprtima bralnima okvirjema, kar lahko vpliva na regulacijo prepisovanja genov, ki sledijo. Nekatere so bile locirane tudi znotraj kodirajočih genov, kar lahko povzroči izgubo funkcionalnosti ali pa pridobitev nove. Iz tega vidika so lokacije IS6110 pomembne tudi za fenotip seva, poznavanje teh lokacij z ustreznimi genotipizacijskimi postopki pa bi nam omogočilo sklepati tudi na fenotip (npr. virulenčnost, odpornost na antiobiotike, itd.).
Tabela 5. Število IS6110 pri analiziranih sevih
V Tabeli 6 so prikazane lokacije IS6110 v analiziranih genomih, podane so 5' in 3' okolice insercijskih mest. Opazili smo povečano frekvenco insercij v okolici genov, ki kodirajo za PPE, PE in PE-PGRS proteinov, ki naj bi imeli vlogo pri antigeniski variabilnosti Mtb. Določene IS6110 so bile locirane v okolici insercijskih sekcvenc drugih tipov (npr. IS1573 in IS 1603) ali na mestih z več zaporednimi tandemskimi ponovitvami oligonukleotidnih motivov. Za mnogo genov v 5' in 3' okolicah do sedaj še ni znanih funkcij ali celo homologov v proteinskih bazah podatkov (UNIPROT).
iö il
ti Ii
mrapL r«msD2
MT2SS0
PPČ4.S MTEiOl MTMli
MfA.&DiO
S.prr MRi_13-S tmipu MR4_17S50
4
MRAIT-S MRi^ilSi
RVÜ7S7
>,0,n-- RV13SB
UtO R-/1-5S-C
RiCTSSC
Rv210"
Ri.'ilS5i:
PPčiD R-V1356C RvlSSO;
R-vSiSS R%'2327
.tJcP R.V24-SC
MmpLfä!n;%tr3asmsmb'äi5s	i+i	- MTiSOS trirspsa proti®
tti*m( JtoteoB ptOmett pioicte A-	i-^;	-	mtzsbs
rsiätss pfctsin
PPEf5R-:Syprats!n	(-1	-	■ MTS09E
MmpLfäR^üy n-en-br=f3spP3te:n	i-r|	- MT04iS
PLtšt .'S pprss'-vec'^■sp'c^rs •	rv'!RA_ö013 P-P15«
p:p';t5 Lp'F -	MRA_i3Sl
pLT=t-jet'i'-5rsr-D'3rsr=rsport ruti	MRA_1771 prctši- N'rrpLU
triincslssissiiotfšfisps-šis	IT) -	MRA_1775
hVpothäfeSsprPtSiR	i-F) -	MRi_ilS4
RFČ-5"	!-! -	MRA_1J77
CO'-ZS" •- ccf-'t :=! protEirs	l^J -	MRA_2S40
iSl54-t'=r:pp:5:s	l-i msscs	MRA_3366
EÄsrtoxyÄscöt'ansport^ntEgrs!	i-! apoA	WiftA_3S13 msrAb'ära prstsin
prpb=b!Stršiup:(S.asafLS!Sn pnptsir	i-i	-	Rva7S4c (ISiMT rMsrm;
p^bHbiSCSßiEfVESäipopfOtalRLprF	i^l	-	RtfI371
pisssi»;-::': siitC4IfrjgnstmJ	H	WK	Rvl758 Pico
co'iS'-.'S:'-.'pptretici: prcteir	i-j	-	R%<1762i
PtHir VCW	H	-	R»I104£
rvpct-st;csipr«e:r	[t!	-	Rv21SSc
p-:.:EDSC-=ct5tp:sR¥Profär.:=se	-	Rv2277t i-pytccr' p'ecLTC
PPE'sn- ,• c'Ptsr	i-i	PPČ39	RV2352-C
pcssitls FhiRi/2 p.-ophags	i-i	-	R-a2S47
3S bp sirsct rspsat rsf'On, CCS ISSO	i^i bp ypstresrr.
p«obiWteiBfpofMtfwis«iio	H	-	ftvJSiš
csKSfiiaBnvpotteticsiprotiin	i->	-	RvilBS
151547 traniposčss	i-S	mosc	R«3'324C
aicarboxyäcadptrar-sportiritefra;	[-j	opo.4	Ru347Jc n-sn-brar!= protsin
ssrire estsrais, cctirvaia famSy
CRiSPR-associatSäS prstssn C2Š.2
PPEfamify protsm C0ri=rvs-C! hyppthsticsi prots'in
bypitbstisl msR-brans prptsin pratein
pijtatri/scytinassCuitl. :n,TenupTs£
hypothäticai pfst&n
pttatrve coričfusc wsimtmlwiRf
C CtE'
i-.ppfetpa proteir " c .cce'i.^icofa.ctorbiosyr.th.ess f'ct= r C2
f ^tat e p s'ssisasä 6poA
P'Cbaoa s c> ccsci-ctajs, p f y c •'P PC s T c & c sr V c 'pgerass ; PCB , n-e-CL-csci-ctaie P'coab 5 cc-se'i'rc n-s"-brar.= prcteif;
p-ccšDscufassCi-tl
Iryppthsticii protein cpiBervsD hypothsticai prptein prob3bisc.sr££srvsStranim«rn;&ran-s prptsin
Pss=;bis g!ycsroiphBsphop!6£tsra£=
PPEfamayprstäin ftypothstJcai protsib iš bp čirsct rspsat rsffpfi, isoo bp Pov.T^^t^sam
possible transcriptional rsgulate-fy prctsin P'obabis «tMpMt» fer iseiiO
nisiybSsr^tm csfaotor bteyWhssSs protsinc
piitatliiS psroxaasi E.poA
Tabela 7. Lokacije IS6110 v analiziranih genomih - nadaljevanje
WfTB
IS»	5'end	oriait.	S'emf
fconwiagy/aiiaotaligR
KZN 1435
S S 10 Ii II IJ
14
Fii
S
9
10 11 12 13-
Ii 15
15
TBMa_0'3E50 T5MS_01i50 TBMG_0il5B TBM5_0i47S T6MG_01SZ1 TBM<:_€il7CI2
TBrv!S_01S7? TBM-3_01=S4 TBM-£_0il5I TBrv«C_0Z24i T5M.Gj03i57 TBM£_Ci3574
TBMS 03575
TBFG_10B51 TBF£_11245
TBFG_1175S
TBFG_117-2 TBFS_11779 T&F£_li7BS TBF.S_11733 T5FS_115:i;
TBFS_12j4-
TBFG_i:il5 TBF.S_1237; TSF£_123B2 TBF£_i24i5
TBF.G_12B27 TBFS_i313ß
TBFS_13205 TBFG 13356

'/Dctrstca c^ts"-	(-)
Z> CCSCi-CtSSS	H
srttc-'	H
PfEfS^- i'D'Cts-	i-) trars:''pt';r= -rgt stor. rs'SR-fsmi-y (-s
trariE-posäS» ISSllO	H
zc-Bs-isfi tof =t :=	p.':tg r i-1
zzrss'vitrifzfitzi	t/'zli"- S-rS
r:'is'<.'s: "-yKtrstrs	ti'zxsf i-i
ccris'.>s:-,!::rst:5 eels'-	H
r,r-:=;e	H ptS' '■-4-B D'S^i'C I-J ŠT '■s r^-.-r-štšss r-:sB3
tnnspn««	M
■"vcctrstK p':t= r	i-r!
rts'vpte: srsry äts ry: =is |f-.-	i-;-«rms
rts"i.ptec rypstret:a p'stsi",	iri D£SLc:|sr=
rirss'ii=:fvp3tl-st:= p'Ctsr	[+1
CLt i- sss 1 CLtl, rt£"Lpts:	i-i-j
rvp:tr=tcs p'Ptsr	(-j
trarspossss	i-;
•"ts-'LOts: cyt;c":r-s p45£i	(r) CTF144, p;sL::f6r5
rtS"Lpte:	'•ywthtfeii	H
O'CtS r TBF£_17SD
'/cctratca p':tstn	i-}
FFEfarr ./p':tsr	w
FFE^so- ,, c'StS'-	H
ppi-ie-.'s: rvcitketca!
osstssn
ecrse'vsp'•,'Ci^^st:= P'ct=Y	i-^} rts'vpts: 'v:': ==5, '■a cat r zi'-B :=='=;=- !' = •='■
hypothstical transc'iption.3l	i+i 'egblatcy p'ctsir
cts"-4-a ca-caT re amiw	(-!■:
TdMS_OS:iB53	I-AD s^DS'far!' v rycsase
TEIvfG_01iS7	CD!-i£n.,s;l-yp5trstC= p':ts'
TBMS_0i2Cii	ryDPtratPS p-Mar
TEMa_014Sl	ppraai^ä^rypptrstpä p'Ptar
TBrviS_CiiS23	porisa'szi-ypctrstcä p'Ptsr
T6M«J>t«9	sitsrass UpM
TBMG_01S73	PE famiry protsin
TBMG_Ci4M2	trar-äoosaie ISSIIO
TBMGJ3i957	coMertfe^irypithetcsipriasm
TBM.G_021S9	Rvpsthstica! proteir.
cva TBMG_0223S	Pürtinase CiJtl
TBMöjai54	nypötüsticai protešrs
TBMGj03377	štematvs EUA potymerasesfma factor s^fJ
TdMG_0367B	conssrvee tsypptrsstfcai protem
TEFG_10S54 ■"/pptrgtca C'CtS' TBFG_1134S 'ts^uiJtarspsr, atsr.pasfilC-
tgrnts
TBFG_1173-B ••«".ptsc /pptrst:a P'otein, p-SLCPga's pfco TBFG_11775 p^::p'■p pi=£ C F :D PLTJ TBFG_1177a pa-siS-C^tl "-ts-'LCtSB TBFG_li7S3 FE-PGC.B'3'v vfPtS-TBFG_ii7&D cp'is'.is:r,'cprst:a p'steir TBFG_11S>0S '•tS'^uptSP pytppi-'sn-s P45CI
Ci'F144, p:e^::|£ra TBFG_12M7 rts".ptac::'--6"'sc-ypsttet«ai
p'pta - TBFG_1-=D TBFG_12112 ::'PS'.>a:t a-'-T^-S'-farspr^pteir TEFG_1237S FFE'a'^- y P'Pta r TBFG_12373 FFE-ar- y P'Pta' TBFG_12415 '«"^ptsp CC-ie^'fiP i" .'pothsfeaS protein
TEFG_12S30 cp'ps-.'g: i-ipcfstpa c'Ptslr: T5FG_13135 'ts"uptsz Cvc'c a:a -aosoP
:fi>-3 jja'-ais- ka-'S'^-TBFG_1320S cprssi/sa ^ypcth6tll:Hl protein
TBFG_13359 traKptPJaJS IS1S47
Za vse gene v okolici IS6110 pri različnih sevih smo poiskali homologe v genomu seva H37Rv, da bi lahko preverili ohranjenost insercijskih mest in s tem določili IS6110 insercijske genotipe za vsak posamezen sev. Homologi in njihove anotacije v H37Rv so prikazani v Tabeli 8, genotipi glede na vse analizirane lokacije IS6110 pa v Tabeli 9.
Tabela 8. H37Rv homologi in anotacije genov v okolicah IS6110 pri različnih sevih.						
		H37RV			miRv	
	Stran M37RV	hoimstog	H37RKgaieaBfiBtä)jiffi		fcomdsg	H37ftvg6B6anjiMati»(!
				yasi		
1	RV0797	-	pn5b5b«tršnipss5E5ftstoti proain !i£i547 ti-tsT«!	RVÖ794C	-	p-pcaoa e:. c:'ecuaa:e,pran- be
						:5',:-:ge'a=e i p:B , me'CL'i'eb^rta'e
2	Rvl3.5S	-		RV1371		c':ca: e "-en-p-:^; ^
3	Rul7S=.:		: :4 -'=2'-=': PicD	Rvl-SS		prpbabie ittinase Cutl
4	Rvi755c			RV1762C	-	hypothetica; prptesn
5	Ru2107		PE Tšn-«!.,' o'ot=;n	R»2104C	-	bonse-veb feypstnetipai prptein
S	Rv21S£.C	-	ri^-sä-jär-ysctrstci o':t5<-	R^.2169c	-	
7	RU22SD	•	CSU- =a=te ,0(t0cbr.5 prtcar-c	RV227-.C	-	ppjsibie f fvcers!pfajph.ss;srteraie
S			PPE fam:»:; prstsm		-	PPE fan-»y protein
S	R1J2S5.K	-	psssib" ph;Rv2 prophšgs prstei^	Ri'2S47	-	hvpotfceticaS protein
10	R«^2B13	-	35 bp Sii^rt rspsst fsgior,, cc= IBOO bp i>pstr=sn-;	Ri'2Si&:	-	3S bp pSrspt repeat region, oca ISM bp tspstrssnr
11	ft./31S5	-	orobäbSs trarsppjije for ISSllO	R'vBBlJ	-	possibi^e trsRscriptisnai fssiisätory protein
12	R«31SS		osr-erfes hypothstssi prms'm	R-v31g5	-	probabie traniposäiä for isölio
13	RV3S27	-	151547	RV3324C	-	n-,3'iybseriisrn cofaaor ba5vT>tn!e5.ss prote.r, C
14	R«3475:	-	sCcHrbaxyEc 5öctr=fi;psft Intsgrai merKbrsr.e protein	RV3473;:	■	piitatVe DSKSciSase BpoA
						
	Strär.	tfilRv		StrÄ	HMR¥	
S	CDCiSSi	tanK^og	Hiimis&eesBumSm	COCiSSi	hsmsäof	Hj7Rvga!ea®c0tati!»
	5'#l»l			ä'eirf		
1	MT1B02		-	tvITlKiS	F;ul75B	CboaoecLfspeCi-tl
2	MT28S.D	R«2S13	rfc:t'5tc= p-:t6'- 35bpbirs-ct'speatresior,,pca	MT2gB3	RV281S:	nytpt'etca b-pten 35bpsirsarepeat'egi'Sn, 13-03
			iSDOcpLpa'ea"			op :pA':t'S2n-
3	MT3i01	RvBOlS:	PP6-ar ,C':tsr FFE4S	MT3Ö9S		PPE •a'" ,c-bl6' PFE4S
4	MT0412	RVM03C	r-cn-ca'ep'Pts^ t—PSi	rirTC>4i5	RVÖ403C	n-so-c'51-g c^te ^ f/ni-p51
		H37SV			Ha7RV	
	HräEH37Ra	feömctos	HWRvierearrotättor	Strain H37Ra	liomcäo?	
	S'«Bi			yerf		
1	MR4JM10	R»Onrnr	ProCäfaSe corsšf rves msnrbrar;« p-stein	MRA_0ai3	PvOslllc	'teg'a mer-t'ane C'Stein in-sstved in inhibition of
						Esptatipn
2	MSi 127S	RV13SS	üpsp'iitsiri LP'F	MRA_13B1	ft» 1371	nycct'etca cote'
3	MRA_175SD	-	-	MRA_17-1	RV175S	nycptnetca p'ote-
4		Rvl755	•"vccfaips p'Pie^ farspssajsSlio	MRi_i775	R-IJ17B2:	n/opt^et:s coter
:	MRA		p V = zr P'Ptr •• r-Z'sZ	MRi_21S4	RvZlSS:	t'3n:men':-anep-:ten
S	MRt_23S0	RV2355C	FPE'ar vp'btsr	MRA_2377	R'1'2353:	PPEfam ,<p':ter PFE39
7	MS.A_2S37	Rv2Si3	CvfPt'SiPä 3Sbp:5r&rtrspsat'=r>sn.	MRA_2S4£i	R¥2Bli;	»•/Pbtnetos cots'- 35bpcSrsctrepeatrefipn,
			lElDsp-prt'ean-			be OOv'^rot
B	MRA_33S9	RV0797	P'cbac efa'-pcsase-^jtsr. protein 1151547 ft-tern-;.	MRA_336S	ft./33 24 :	"-0 vtbS'^" oc'acto' biosyntheiis protein MoaC
9	Iv;Rt_3515	RV3-47S:	::='&Pv - a: :t-='£:prTir.tefr3i membrane protein	t.,<RS,_3513	RV3473C	ce'b. oaseBpoA
			K2tP			
						
	StrÄKZW	H37RV		5tr*KZM	nnm	
	14ä5	tomcäo»	H37R«|6r.eär.r.otaöor	1455	homdof	«37B«ä»fiasiota6si!


:	TBM-G_ä>08»	RiOS2: o:c'rts r Lp::;
ž	TDMSJJIISO	Ri)i~"=	i-ypifstca C'Its'
3	Tör.,i€_0il3B	R'.'ZSiH	r./citratcs ccte'
4	T5M-S_0l4-g	R.j24S;	'viCrStCS f'Ctir
5	TBM«_01SI1	R1J1352:	FPE'ä""
Š	TBM€_01"0Z	R1/Z2S2C	Li'SS-äT y tl'SC'ft ;rš! rsf
7	TBh'.-Sjmil	RäilDS
S	TBWS_0iS77	SrsiljS	IS51'.Dt'är.'p:Si==
S	TBMG_0196-1	Rsiji; /ZZV^tC' C'Ztir
10	TBt.,<'S_0Z152	RrvlS::^:	'-;c;tr5t:= c-:t6r
11	TBl.,''S_0224i	f.,c-:ts r. p'rüne riefe protein -J	T6MG_03iB" =
iä	TBMG_03S-4	-
14	TBMgl03575	Rv3S3S	trsn^psiaiž 151334_
TBM«_i50E53	RV3115	pftssphätcss
T6lvW_Oil57	-
TBWG_01201	Rv2775
TBM«_014S1	R^'2492	r?, o:t' :3 f ';tä ■■
TBM-5_01S23	R-i'2353.C	RFE'a" ,C':te<-
TBMG_01S99	Rx«22S3	ra, fCfetPä p'Stsr
TBrvfC_Ol873	R-V2107	K'i'- vC'CK' f622
TBrv«S_04042	Ru2107	PE'S" , C'.t6 r fE:2
TBtv!S_019S7	Ru2019	hycM'etiS
T5Me_S21SS	RvlEOSi	l-.vC:t'etCB f-Iter
TBM-S_0223g	R\.173.S	p'iCit 6 ii.:Cuti
TBMC-_03i;4	RvOSSSC	h-.CIt'stcS ^'itf
TBM<;_03377	R(,332ec	RNicp
TBMg 03678	R.3636;	feu:trst:5 _
H578V					H37RV	
StrÄFil IsBreds»	mjrnigmemmt	aSor,		StraiisFil tomoJoH		HSTSvsenesRootstjoi!
SeKS				SasS		
1 7BFG_10B5: KvOSSS	tztttž' Lc:C			TDFG_	10S54 R-vOSJfc	'.■ccfetcs citsr
1 T5rS.il349 RV1315C				TBFG_	11346 RvlSlSC	SIS'- / StiZ/ZS's
2 T5FG_ll-äS RV1725C				TBFG_	tl73S Ri.'1725<	•-.fZfstzB t ster
4 TDF5_il772 R-s'1754:	'/p:t'=t:= c-cte	r		TBFG_	11775 R%.17£4-C	'jLZfitzs c';ts'
5 TBFS_1I-7S -				TBFS_	11779 R-»175B	O'lcaoeafsreCi.ti
S TBF-S_117S5 !;vl75S;	FE-PSRS I'" , C'CtS' I'.Sgii			TBFS_	117S3 RvlTSO	' p:trst:= C':tfr
7 TDF5_li7S3 S-ai755c	•■/cirstrš fTTte	r,		TBFG_	117» KVl7SSi	Vi'-ZZZZZii
8 TöFa_115:i5 RV1777	^.tci'-'cr-s f45D 144 C,'R144			TBFG_	11205 Ri)1777	0,-ZZ'"Zr'i £450 144 CYPi44
= TBF5 -.7Ci47 RviiOSc	',ccTt-et:= p'Its			TBFG_	12047 RviiOJC	i'.fcretcä Z'zti'
10 TBFG RvZ077A	■-.cif-ttrs f'Ms	' i čfisrž rich		TBF5_	12112 R»20-B	I-v C If st c'cts'
il TBF<;_ii3-S -	-			TBFG_	1237S RV2352!:	ff
ii TDFS_li3B2 R..'13£-5:	PRE •a"- , c'cte'	PPE40		TBFG_	12379 Ri;235SC	PPč'š'~ irztir PR-E40
15 TBF-5_12415 RbESSOC		r.		TBFG_	12415 Rv23»C	'r itzVitzB f'Zti'
14 TBF-S_U327 R»2S13	•■ii:ti-st:= cits			T5FG_	1253-0 -	-
15 TBF€_1S1J0 R..<5113	Z'-ZZCStiSi			TBFG_	13130 RV3113	ptoEphstäss
15 TBFS_i52SiS »./5183		protišn		TSFG.	i320S R-»31S4	tršrisposšjs IS5110
17 TBF6 1325S -				TBFG	13359 -	
Tabela 9. Relativne lokacije IS6110			V vseh analiziranih genomih glede na genom seva H37Rv			
pripadajoči genotipi. Vsaki unikatni lokaciji je bila dodeljena zaporedna numerično vrednost,						
skupek vseh pa predstavlja IS6110genotipizacijski profil, kije specifičen za sev.						
	Genotype					Genotype
Insertion site relative assignment				Insertion site relative		assignmeni
Strain to strain H37Bv		number	strain	to strain H37Ry		number
5'end	3' end			5' end	3' end	
H37RV Rv0797	Rv0794c	1	KZN 1435	RvC835	Rv3113	20
R-/1368	Rvl371	2		Rv2775	-	21
Rvl755c	Rvi758	3		Rv2Si3	Rv2775	22
Rvi765c	RvJ.7e2c	4		Rv2492	Rv2492	23
Rv2107	Rv2i04c	5		Rv2352c	R..'2353c.	24
Rv2166c	Rv2169c	6		Rv2282c	Rv2283	25
Rv22SO	Rv2277c	7		Rv2106	Rv2i07	26
Rv2356c	Rv2353c	8		RV2106	RV2107	27
RvzSSGc	Rv2647	9		Rv20i9	Rv20i9	28
Rv2Si3	Rv2S16c	10		Rvl804c	RviSCSc	29
RvSiSS	Rv3S13	11		Rvi754c	Rvi758	30
Rv3i88	Rv3i85	12		Rv3113	RvOS36c	31
Rv3327	Rv3324c	13		-	Rv332Sc	32
Rv3476c	Rv3473c	14		RV3638	Rv3539c	33
CDC 1551	Rvi75S	15	F 11	Rv0835	RvOSSSc	34
Rv2Si3	Rv2816c	10		Rvl319c	Rvl319c	35
RvSOlSc	RvSOlSc	16		Rvl725c	Rvi725c	36
Rv0403c	Rv0403c	17		Rvi754c	RV1754C	37
H37Ra RvOOiOc	RvOOlic	18		-	Rvl758	15
RviSSa	Rvl37i	1		Rvl759c	Rvi760	38
-	RV175S	15		Rvl76Sc	Rvl765A	39
Rvi765	Rvl762c	4		Rvi777	Rvi777	40
Rv2166c	Rv2iS9c	6		Rv2105c	Rv21G5c	41
Rv2356c	Rv2353c	8		RV2077A	Rv2078	42
Rv2813	Rv2Si6c	10		-	Rv2352c	43
Rv0797	Rv3324c	19		Rv2356c	Rv2356c	44
RV34-76C	Rv3473c	14		Rv2390c	Rv2390c	45
				RV2813	-	46
				Rv3113	Rv31i3	47
				Rv31S3	Rv3iS4	48
				■		49
Iz Tabele 9 je razvidno, da so lokacije večine IS6110 unikatne za sev. Od 58 identificiranih lokacij je bilo kar 49 unikatnih, kar kaže na močno diskriminatorno moč določevanja sevov glede na število in lokacije IS6110 pri Mtb. Velika raznolikost insercijskih mest nakazuje na nestabilnost genomov Mtb v kontekstu insercijskih sekvenc in da obstaja možnost diverzifikacije ter fenotipske variabilnosti med sevi kot posledica premeščanj mobilnih genomskih elementov. Intenzivna premeščanja so lahko posledica prilagajanja stresnim razmeram v okolju, kakršno je v gostitelju, zaradi česar je fenotip gostitelja prav tako pomemben za uspešno infekcijo z določenim fenotipom/genotipom Mtb.
V nadaljevanju projekta bomo pregledali možne rešitve in platforme za in situ genotipizacijo Mtb na podlagi števila in lokacij IS6110. Dosedanje raziskave so pokazale veliko diskriminatorno moč teoretičnega modela, zaradi česar bo potrebno izmed vseh izbrati le reprezentativne lokacije. Podoben model bomo preizkusili tudi na primeru bakterije Mycobacterium avium podvrste paratubercuiosis, kjer bomo pregledali število in lokacije IS900 na objavljenih in nekaterih še neobjavljenih 'draft' genomih.
4. Razvoj metode tipizacije podvrst bakterij Mycobacterium avium
Delo smo nadaljevali na področju detekcije različnih sevov mikobakterij. Cilj je bil detekcija in diskriminacija sevov direktno v vzorcih iz kmetije (feces krav, zemljina, voda iz napajalnika). Tovrstnih metod do sedaj ni bilo še nikjer opisanih in smo na tem naredili en korak naprej. Do zdaj se je namreč vedno zaznavalo samo prisotnost mikobakterij in šele po izolaciji bakterij se je lahko določilo tudi sev. Detekcija sevov pa je izredno pomembna predvsem zaradi epidemioloških slik (npr. kje je izvor okužbe) in poteka bolezni (npr. določen sev povzroča le določen potek bolezni). Ključni pomen teh metod je, da so hitre in vsaj toliko ali bolj informativne kot klasične. Zaradi dobro znanih kriterijev določitve določenih sevov na podlagi insercijskih sekvenc, smo to metodologijo razvili do aplikativne faze. Kot prvo pa smo morali razviti oligonukleotidne začetnike in določiti parametre kvantifikacije M. avium paratubercuiosis
4a. Razvoj metodologije detekcije podvrst bakterij Mycobacterium avium
Detekcijo MAP smo izvedli z Real-time PCR System 7500 (ABI). Za ta namen smo razvili metodo na podlagi TaqMan sonde in z začetnimi oligonukieotidi:
DH2F	5' GCCTTCGACTACAACAAGA6C
DH2R	5' GCGTCGGGAGTTTGGTAG
DH2P	5' FÄM - GCCGCGCTGATCCTGCTTACT - TAMRA
Za pripravo umeritvene krivulje in kvantifikacijo smo v vektor pCR2.1 (Invitrogen) sklonirali insert IS900, ki je vseboval tarčo pomnoževanja z navedenimi začetnimi oligonukieotidi. Nastali konstrukt smo transformirali v E. coli JOPlO in iz prekonočne kulture izolirali plazmidno DNK, ki je služila kot standard za umeritveno krivuljo v RT-qPCR. Nadalje bi morali še določiti parametre kot so spodnja meja detekcije, dinamično območje, volumsko območje in učinkovitosti pomnoževanja (Slika 12).
	............
/ -f—7—	
	
/ // J	
	
	
19 20 2122 232425 26 2723233031 32 333435363738394041 <2^344« 4647 4S 43 50
Cvcie Mumbsf
Slika 12. Primer detekcije M. avium paratuberculosis DNK (odsek na IS900) z Real-time PCR. Prikazane so krivulje pomnoževanja za vzorec 19 pri treh različnih redčitvah (v duplikatih).
4.b Razločevanje podvrst M. avium {IVI. avium paratuberculosis, M. avium hominisuis, M. avium avium, M. avium silvaticum)
Podvrste Mycobacterium avium so zelo sorodne in imajo skupnega tudi do 99% genoma, zato jih je zelo težko ločiti z molekularnimi metodami. Pri infekcijah z bakterijami te vrste pogosto najdemo prisotnost dveh ali več podvrst. Te bakterije imajo zelo širok spekter gostiteljev, od perutnine, divjih in udomačenih prežvekovalcev do človeka, še zlasti nevarne so infekcije pri ljudeh z oslabljenim imunskim sistemom (bolniki s HIV). Sposobne so preživeti tudi dalj časa v okolju. Identifikacija prisotnosti posameznih podvrst je ključna za pravilno diagnostiko in načrtovanje zdravljenja. Zaenkrat se jih ločuje glede na prisotnost insercijskih sekvenc različnih tipov, kar zahteva več PCR reakcij za natančno identifikacijo prisotne podvrste (Tabela 10). Poleg tega ni čisto za izključiti možnost, da določenih insercijskih sekvenc določena podvrsta nima in s tem se lahko narobe identificira določen tip.
Tabela 10. Tipi insercijskih sekvenc, ki so značilni za posamezno podvrsto in so podlaga za dosedanje molekularne metode diskriminacije med podvrstami.
	Prisotnost tipa IS, ki omogoča ločevanje med podvrstami
M. avium podvrsta	IS900 IS901 IS902 IS1245
avium (MAA) paratuberculosis (MAP) hominissuis (MAH) silvaticum (MAS)	+ - -+ _ + - + +
Naš namen je bil razviti 'one step' molekularno metodo za zaznavanje posameznih podvrst v okoljskih in kliničnih vzorcih, na podlagi natančne analize variabilnih genomskih regij med podvrstami.
Z in silico analizo objavljenih genomov Mycobacterium avium podvrste paratuberculosis K-10, Mycobacterium avium podvrste avium ATCC 25291 in Mycobacterium avium podvrste hominissuis MAC 104 smo identificirali regijo, ki bi omogočala ločitev med posameznimi podvrstami v enem koraku. Genom Mycobacterium avium podvrste silvaticum še ni na voljo, zato ga bomo vključili v analizo v kasnejši fazi.
Gre za regijo gena za sintezo mikobaktina J, ki služi m i ko bakterija m kot siderofor v okolju s pomanjkanjem železa.
Metode
Za osnovno metodo ločevanja smo izbrali RT-qPCR z metodiko Sybrgreen detekcije in profiliranja z disociacijskimi krivuljami.
Skonstruirali smo dva para začetnih nukleotidov (Tabela 11), ki specifično pomnožujeta tri različno dolge odseke z genomov podvrst. Vsaka podvrsta da v PCR reakciji produkt specifične dolžine, ki se loči od ostalih po temperaturi disociacije. Analiza disociacijskih krivulj nam tako omogoča identifikacijo prisotnih podvrst v vzorcu (Slika 13)
Tabela 11. Uporabljeni začetni oligonukleotidi za tipizacijo podvrst M. avium.
Oznaka
Zaporedje
Tarča
Dolžina	Temp,
produkta disociacije
mbtAP_R	CCTGCGTGGCCGAGCTG	MAP
mbtAPH_F	CGACGACGCCCGTGTGATC	MAP, MAH
mbtAHAl_R	GCCATCCCGAACACCTGCT	MAA, MAH
mbtAAl F	GCCTGCGAGTGGGAACC	MAA
74 bp	86,8°C
63 bp	84,4°C
134 bp	87,4°C
Poskuse smo izvajali na Real-Time PCR System 7500 (ABI). Mešanica je vsebovala 400 nM vsakega začetnega oligonukleotida in Power SybrGreen Master Mix (ABI). Temperatura pritrjanja začetnih oligonukleotidov je bila 61°C, v skupno 45 ciklih pomnoževanja. Vsakič smo izvedli še korak disociacije PCR produktov po tovarniških nastavitvah.
Rezultati
Ois$Qcižtion Cur.-e
Slika 13. Disociacijske krivulje specifičnih PCR produktov. Od leve proti desni: M. avium ssp. hominissuis = 84,4''C, IVI. avium ssp. paratuberculosis = 86,8°C, _
M. avium ssp. avium = 87,4°C.
niäsaci^linn Cui-vs
Slika 14. Primer detekcije dveh vrst hkrati v enem vzorcu. Prisotna je DNK /W. avium ssp. hominissuis (levi vrh) in M. avium ssp. avium (desni vrh).
III. Faza - detekcija bakterij in diskriminacija sevov v okoljskih vzorcih brez predhodne gojitve
1. Detekcija Mycobacterium avium podvrste paratuberculosis v fecesu okuženih krav in okoljskih vzorcih
Mycobacterium avium podvrste paratuberculosis je bakterija, ki povzroča paratuberkulozo (Johne-jeva bolezen) pri prežvekovalcih, omenja pa se tudi njena vpletenost v razvoj kroničnega vnetja prebavnega trakta pri človeku (Crohn-ova bolezen). Paratuberkuloza povzroča velike ekonomske izgube v govedoreji in ovčjereji, saj učinkovitih zdravil zaenkrat še ni na voljo, bolezen pa se običajno konča s poginom živali zaradi shiranosti in dehidracije. Infektivnost je visoka, bolezen pa se hitro širi predvsem med mladimi živalmi in v obdobju laktacije, če je krava okužena.
Hitra detekcija in tipizacija je zato nujna za iskanje virov okužb in izvajanje ustreznih varnostnih ukrepov proti širitvi okužbe.
Metode
Izvedli smo vzorčenje okolja kmetije, kjer je bila s klasičnimi mikrobiološkimi tehnikami (serološke in gojitvene metode) predhodno potrjena prisotnost MAP pri govedu.
Vzorčili smo feces krav, silažo, vodo v napajalnikih v neposredni bližini goveda, steljo, odvodne kanale blata, zbiralnike gnojnice, gnojišča, pašnike, vodotoke na pašnikih in v bližnji okolici (slike 15-18).



Slika 15. Vzorčenje fecesa krave s simptomi paratuberl<uloze (levo) in odvodnega l<anaia blata (desno).
Slika 16. Vzorčenje gnojišča (levo) in napajalnikov v staležu (desno)
Siika 17. Vzorčenje skladišča silaže in stoječe vode v okolici (levo) ter odprti rezervoar odpadne vode iz hleva.


Slika 18. Vzorčenje iztoka odpadne vode (levo) in bližnjega vodotoka (desno).
Tekoče vzorce smo filtrirali čez filtre (0,22 |am) in izolirali DNK s Smarthelix Complex samples DNA Isolation Kit (IFB d.o.o.). Trdne vzorce smo zatehtali (okoli 500 mg) in izolirali DNK s Smarthelix DNAid Kit (IFB d.o.o.).
Za vsak vzorec smo pripravili tri redčitve izolirane DNK (korak redčenja 1/10), redčitve pa nanašali v duplikatih na mikrotitrsko ploščico. Plazmidnim standardom smo pomerili DNK in posamezno redčitev nanesli v triplikatih.
Rezultati
MAP DNK smo zaznali v 32 od 40 vzorcih, večina okoljskih vzorcev je bila pozitivna, kar kaže na obseg kontaminacije. Koncentracije MAP v okolju so se gibale od 3 do 10^ MAP/g oz. ml (Tabela 12). V fecesu smo zaznali 10^ MAP/g (Tabela 13).
Tabela 12. Popis vzorcev in koncentracije MAP, določene z Real-time PCR (RT-qPCR)
Oznaka vzorca	Tip vzorca	Količina	Opis	koncentracija MAP	
1	feces	20 g	Krava s simptomi Johne-jeve bolezni, imela krvavo drisko	9.98E+08	MAP/g
2	gnojnica	20 ml	stranski odvodni kanal	1.77E+05	MAP/ml
3	feces	30 g	skupni odvodni kanal, zunaj in znotraj hleva 1	1.64E+04	MAP/g
4	voda	20 ml	luža pri staji pred hlevom 1	7.98E+05	MAP/ml
5	blato	20 ml	znotraj staje pred hlevom 1	3.12E+05	MAP/ml
6	gnojnica	20 ml	novo gnojišče	3.14E+03	MAP/ml
7	blato	20 g	staro gnojišče	1.02E+05	MAP/g
8	gnojnica	20 ml	odvodni kanal v staležu v hlevu 2	6.86E+05	MAP/ml
9	voda	41	napajalnik v hlevu 2	n.a.^	
9A	biofiim	50 m!	usedlina in biofilm iz sten napajalnika v hlevu 2	4.61E+05	MAP/ml
10	voda	50 ml	voda z usedlino iz napajalnika v hlevu 2,	7.46E+05	MAP/ml
11	silaža	20 g	razprostrta silaža za hranjenje pred staiežem	O.OOE+00	MAP/g
12	gnojnica	50 ml	iztok iz hleva 2 na JZ strani	l.lOE+05	MAP/ml
13	voda	50 ml	luža pred JZ vhodom v hlev 2	pmd^	
14	voda	50 ml	luža pri nepokritem skladišču kompresirane silaže	2.55E+02	MAP/ml
15	silaža	30 g	kompresirana silaža	pmd	
16	voda	20 ml	luža pred drugim nepokritim skladiščem kompresirane silaže	pmd	
17	gnojnica	50 ml +	bazen odvajane gnojnice iz		
		0,51	hleva 2 na SV strani	1.16E+07	MAP/g
18	silaža	10 g	balirana silaža pod streho	n.a.	
19	voda	50 ml	skupni odvodni kanal odpadne vode s kmetije, v jašku na JZ strani, malo naprej od novega gnojišča	4.65E+05	MAP/ml
20	voda	20 g	biofilm v levi in desni cevi, ki se stekata v skupni odvodni kanal v jašku	1.60E+06	MAP/g
21	voda	50 ml	luža poleg jaška	pmd	
22	voda	0,5 1	direktno za iztokom v potok	6.17E+04	MAP/ml
23	biofilm	40 g	biofilm iz lesenega vodila, preko katerega teč odpadna voda v potok	2.45E+05	MAP/g
24	sediment	50 g	breg potoka 50 nižje od iztoka odpadne vode	pmd	
IP	voda	51	napajalnik na levi strani hleva	3.94E+00	MAP/ml
2P	voda	51	napajalnik na desni strani	6.56E+00	MAP/ml
3P	stelja	20 g	v staležu	1.07E+05	MAP/g
4P	biofilm	20 g	biofilm, ki se je nabral ob robu ventilatorja za prezračevanje hleva	1.08E+04	MAP/g
5P	gnojnica	50 ml	zbiralni odvodni vod v hlevu	1.37E+07	MAP/ml
6P	silaža	20 g	razprostrta silaža za hranjenje v hlevu	4.00E+02	MAP/g
7P	voda	30 ml	luža pred hlevom, na V strani hleva	2.01E+05	MAP/ml
8P	blato	50 g	pot goveda na pašnik na V strani hleva	7.88E+04	MAP/g
9P	silaža	20 g	balirano seno, pod streho	pmd	
lOP	voda	30 ml	luža poleg poti goveda na pašnik na V strani hleva	2.19E+06	MAP/ml
IIP	gnojnica	30 ml	gnojišče na J strani hleva	6.61E+05	MAP/ml
12P	voda	50 ml	prešiščena voda v dveh zbiralnikih, poleg črpalnega stolpa gnojnice iz hleva	2.52E+03	MAP/ml
13P	blato	40 g	pot goveda na pašnik na J strani hleva	2.25E+06	MAP/g
14P	gnojnica	30 ml	iz druge strani gnojišča na J strani hleva	2.67E+05	MAP/ml
15P	voda	30 ml	kanal z vodo, ki vodi od pokrite kompresirane silaže, JZ od hleva	2.83E+02	MAP/ml
16P	voda	20 ml	stoječa voda v pri cevi cisterne za prevoz gnojnice	1.48E+06	MAP/ml
■ vzorec ni bil analiziran ' pod mejo detekcije
Tabela 13. Koncentracije MAP v vzorcih kravjega fecesa, določenih z Real-time PCR.
Vzorec	Koncentracija MAP
	[MAP/gj
Fl	3.91E+06
F2	2.21E+08
F3	1.67E+07
F4	1.66E+06
F5	1.51E+04
F6	1.42 E+03
F7	6.89E+04
F8	4.00E+08
F9	1.18E+04
FlO	3.21E+04
Rezultati kažejo na visoko stopnjo kontaminacije v znotraj živinskih objektov in neposredni okolici kmetije. MAP se namreč v velikih količinah izloča v fecesu simptomatskega goveda ter se tako prenaša v širše in ožje okolje. To kaže na problematiko preprečevanja širjenja okužb, kjer ukrepi ne smejo biti omejeni le na ločevanje zdravih in bolnih krav, temveč zahteva bolj radikalne ukrepe, še zlasti zaradi zoonotskega potenciala te bolezni.
Sezonska dinamika in distribucija M. avium paratuberculosis na kontaminiranih kmetijah
V predhodnih obdobjih smo izvedli vzorčenje kmetije in neposredne okolice, kjer je bil zabeležena paratuberkuloza. Vzorčenje smo ponovili še dvakrat in pridobili vpogled v sezonsko dinamiko kontaminacije okolja z Map. Določili smo območja, ki so potencialen vir za širjenje okužbe oz. kroženje Map znotraj populacije goveda v okviru kmetije. Poleg tega smo identificirali
potencialne vire za širjenje Map izven območja kmetije z ol<uženim govedom. Metode
Izvedli smo vzorčenje okolja kmetije, kjer je bila s klasičnimi mikrobiološkimi tehnikami (serološke in gojitvene metode) predhodno potrjena prisotnost Map pri govedu. Vzorčenje smo izvedli v maju, juliju in novembru, pri čemer smo nekatere vzorce zajeli v vsakem obdobju, določen del vzorcev pa le v enem ali dveh obdobjih.
Vzorčili smo feces krav s sumom na paratuberkulozo, silažo, vodo v napajalnikih v neposredni bližini goveda, steljo, odvodne kanale gnoja, zbiralnike gnojnice, deponije gnoja, izhode na pašnike, pašnike, vodotoke na pašnikih in v bližnji okolici.
Tekoče vzorce smo filtrirali čez filtre (0,22 |im, Nalgene) in izolirali DNK s Smarthelix Complex samples DNA Isolation Kit (IFB d.o.o.).Trdne vzorce smo zatehtali (okoli 500 mg) in izolirali DNK s Smarthelix DNAid Kit (IFB d.o.o.). Tekoče vzorce z veliko koloidnimi delci smo centrifugirali (3 ml, lO.OOOxg, 5 min) in DNK izolirali iz peleta kot iz trdnih vzorcev.
Detekcijo MAP smo izvedli z Real-time PCR System 7500 (ABI) z začetnimi oligonukleotidi in TaqMan sondo:
DH2F	5' GCCTTCGACTACAACAAGAGC
DH2R	5' GCGTCGGGAGTTTGGTAG
DH2P	5' FAM - GCCGCGCTGATCCTGCTTACT - TAMRA
Za pripravo umeritvene krivulje in kvantifikacijo smo v vektor pCR2.1 (Invitrogen) sklonirali insert IS900, ki je vseboval tarčo pomnoževanja z navedenimi začetnimi oligonukleotidi. Nastali konstrukt smo transformirali v £ co//TOPlO in iz prekonočne kulture izolirali plazmidno DNK, ki je služila kot standard za umeritveno krivuljo v RT-qPCR.
Za vsak vzorec smo pripravili dve redčitvi izolirane DNK (korak redčenja 1/10), redčitve pa nanašali v duplikatih na mikrotitrsko ploščico. Plazmidnim standardom smo pomerili DNK in posamezno redčitev nanesli v triplikatih.
Nekaj zaporedij pomnoženega odseka IS900 iz vzorcev smo sekvenirali (Macrogen, Južna Koreja), da smo potrdili identiteto pomnožkov in s tem specifičnost reakcije PCR.
Iz koncentracije genov IS900 v vzorcu smo izračunali št. bakterij/ml ali /g vzorca pri predpostavki, da en genom Map v povprečju vsebuje 15 genov za IS900 (število IS900 namreč variira med sevi, Pavlikssod., 2005)
Tloris kmetije smo pridobili iz katastrskega načrta Slovenije. V načrt smo zaradi preglednosti vnesli le qPCR rezultate relevantnih vzorcev (Tabela 14).
Rezultati
Skupno smo izvedli detekcijo iz 75 vzorcev, od tega 16 vzorcev iz majskega, 36 iz julijskega in 23 iz novemberskega vzorčenja, vse v 2010. V majskem vzorčenju smo zabeležili 94 %, v julijskem 64 % in novemberskem 74 % Map pozitivnih vzorcev.
Tabela 14. Popis vzorcev za detekcijo MAP s qPCR na IS900
Oinma viarca	Tip viorca	«■flfahc	Opš/orismuaja
1	voda	51	repajalnik na levi strani hleva/l
2	voda	5!	napajalnik na desni strani hisva/Z
3	snojsvlta	20 g	iitalvstsisiu
4	biofilrfä	2«3f	biofi!n-j ob robu ventilatorja za prezračevanje
c	gnojnica	jami	zbiralni odvodni vod v hlevu
7	voda	30 mi	luža pred hlevom, na v strani hleva
S	blato	50 2	pot goveda na pašnik na v strani hleva
3	s-flaia	20 g	ba lira no seno, pod streho
10	voda	3« m!	luža poleg poti goveda na pašnik na v strani hleva
11	fnojnsa	30 mi	gnojišče na J strani hleva
	¥003	somi	prelilčena voda v dveh zbiraInikih, poleg žrpalnsga Jtolpa gnojnice iz hieve
15	blato	401	pot goveda na pašnik na j strani hieva
14	frojnsa	30 ml	iz druge strani gnojišča na J strani hleva
15	voda	30 ml	kanaizvodoj kivodiod pokrite kontpresirans sifaže,, JZ od hleva
IS	voda	20 ml	stoječa voda v cevi cisterne za prevoz gnojnice/i
17	sfiaža	30g	pokrita silaža, fermierstirana, zunanje skladišče, pokritos polrvinilom
iS	gnojsvka	40 m!	staro gnojišče
19	voda	43 ml	pred vhodom v hlev,''2 |
20	voda	1 i	velik rezervoar vode za hievonv's., pri pokriti baliranisllaži
21	biofüm	10 g	izs-ušen napajalnik pred sta ležem s teleti, kovinski
22	voda	50 reh-il	napajalnik poleg 21
23	voda	li	napajalnik, b6ton»ski,, druga stran hleva kot 1 in 2
24	voaa	40 mi	samodozirnimaii napajalnik vstaležu
2S	voda	1 i	stoječa voda v trsju sredi pašnika
2S	voda	2!	potok v gozdičku na robu pasnika/Sv
27	inrebsk	40 g	kravjak na pašniku/SV
2S	voda	4i	potok pod cesto/iZ
25	isdimsm	40 f	brežina potoka 2S
50	ssdimsnt	20 g	Shojeno blato okoli krmilnika na pašniku/SV-vzorec 1
--	ssdin'sfit	20g	Shojeno blato okoli krm.ilnika na pašnlku./sv-vzorec2
V ožjem območju kmetije smo najvišje koncentracije Map zaznali v iztrebkih krav s sumom na paratuberkulozo (10^ - 10® Map/g, Slika 19) in v vzorcih, ki so bili v stiku s kravjimi iztebki, kot so kanali za odvod gnoja/gnojnice (lO" - lO' Map/ml, slika 19), deponije gnoja (10"* - 10® Map/g, slika 19), talna stelja znotraj hleva (10^ - 10® Map/g, slika 19 ) in pa shojena zemlja, pomešana z iztrebki na poti goveda na pašnik (10'^ - 10^ Map/g, slika 18). Slednje kaže na veliko verjetnost prenosa Map na območja izven hleva in možnost prenosa infekcije na zdravo govedo, kljub eventuelni izolaciji okuženih krav znotraj hleva.
Z Map je bila okužena tudi večina notranjih vodnih virov (napajalniki, kovinski ali betonski), pri čemer gre verjetno za sekundarno kontaminacijo preko kontakta okuženih krav z vodo. Vsi napajalniki so namreč na višini, ki omogoča kontakt s trupom goveda, še zlasti z zadkom, ki je pogosto prekrit z ostanki stelje in iztrebkov, kateri lahko zaidejo v vodo v napajalnikih. Kontaminirani so bili tako suhi kot polni napajiniki pri teletih, ki so predvidoma bolj dovzetna za okužbo z Map kot starejše govedo, simptomatika pa se lahko pojavi šele po parih letih, zaradi česar je kasneje težko sklepati na vir okužbe. Glede na to, da smo v vzorcih izvajali detekcijo DNK in ne RNK, obstaja možnost, da zaznane bakterije (vse ali le del) niso bile viabilne in dejansko ne predstavljajo neposredne grožnje za okužbo. Kljub temu je prisotnost same DNK pomemben indikator za sledenje kontaminacije._
Map negativni so bili le samodozirni kovinski napajalniki, montirani na ograjo staleža, kjer voda ni stoječa, temveč se dovaja glede na potrebo individualne krave. To nakazuje ne možno vlogo stoječe vode in pripadajoče združbe mikroorganimov na perzistenco Map v takšnih okoljih. Stoječe vode v okolici hleva so predvidoma zaradi spiranja kontaminiranih površin prav tako vsebovale visoke koncentracije Map (10^ - 10® Map/ml, slika 19).
Pri enkratnem vzorčenju (maj 2010) biofilma na okvirju ventilatorja za prezračevanje hleva smo zaznali lO" Map/g (slika 19), kar je izredno zanimivo in kaže na posredno (z dviganjem delcev suhe stelje, kontaminirane z Map) ali neposredno (aerosolizacija kontaminiranih tekočin - tvorba mikrokapljic) aerosolizacijo Map. Aerosolizacija lahko omogoča Map potovanje na daljše razdalje in kontaminacijo širšega območja okoli kmetije.
Pokrita silaža in balirano seno ter voda v zunanjih zaprtih rezervoarjih niso bili kontaminirani z Map oz. pod mejo detekcije (slika 19), kar kaže na izreden pomen izolacije kontaminiranih območij za preprečevanje širjenja okužbe.
Analiza vzorcev širše okolice kmetije je pokazala prisotnost Map v zemlji, kjer so bile sledi intenzivnega gazenja goveda (10^ - 10^ Map/g, slika 20). Kontaminirani so bili tudi vodni viri (do 10^ Map/ml, slika 2), vendar le na SV (vzorec 26) in V (vzorec 25) strani kmetije, medtem ko potok na JZ (vzorec 28) strani ni bil kontaminiran (Slika 20). Možen vzrok za to, je večji pretok vode v potoku na JZ strani, medtem ko je imel potok na SV precej manjši pretok, julija pa je voda dejansko stala. Vzorec št. 25 je bil odvzet iz stoječe vode v trsju oz. močvirnatem predelu nižje lege pašnika. To kaže na spiranje Map v vodna telesa, kjer se z Map obogatena stoječa voda ob prvem deževju (povečanem pretoku) premakne s tokom do bolj oddaljenih lokacij. Depozicija Map v predelih struge in na bregovih nižje po toku lahko kontaminira področje, ki je precej oddaljeno od vira.
Stsjiovanlski bbjeM ■ f

*
□ B □ O n
<00 1 10'10' y
10' ,06
10' 10» ^
MAP. določena s qPCR na IS900
ajo so zaokroženo In podar»« kol it. baktenj/ml ali /g. odvisno >rca. de preöposlavimo povpreövj 15IS90Ö na MAP genom xj. 2C»5). Pod slrtpd so 41. vzorcev (glej labote s pofMsom kažejo mesto odvzetega vzorca. <LOD • pod mejo detekcije.
Datum vzorienja
v primem, da vzorec nI bil odvzet na dok>£cn datum vzorčenja, je ustrezen stdpoc prokrtžan (H).
Glavne polj žnine Depofii}e na pašnik enc^a
Slika 19. Distribucija in sezonska dinamika MAP v živinorejskih objektih
Ä




ii





■ ^^


.....„^M
i

5
□ e □ D <L0D1 10'IO^'B^
Koncentracija MAP. določena 8 qPCR na ISMO
Konconlracijo «J zaokrožene in podane kol SI, baWsrii/ml aH /g. odvisno od vzorca. Se predpostavinw povprečno 15 iS900 na MAP genom (Pavtik J Ii« B s sod. 2005). Pod stolpci so it. vzorcev (glej tabelo s popisom vzwcov), ki 10 10' 80 na mestu odvzeteoa vzorca. <L00 - pod mejo dotekdjo.
-[—j Datum vzorčenja
2|3j v primenj, da vzorec ni bil
0	CS o	odvzel na doiofien datum r: ^	vzorčenja, je ustrezen
1	i	slolpec prekrižan (S).

Glavne pou živine na Pafcno Vodni painik povriine viri
Slika 20. Distribucija in sezonska dinamika iVlAP v pašnem območju.
Sezonska dinamika iVlap na večkrat vzorčenih mestih kaže na porast koncentracije bakterij v vodi notranjih napajalnikov v juliju, kar bi lahko bila posledica pogostejšega kontakta krav (bodisi okuženih, ki izločajo Map v fecesu, bodisi neokuženih krav, ki so kontaminirane z iztrebki okuženih) z vodo v napajalnikih zaradi povečane žeje v poletni vročini. Zaznali smo upad koncentracije Map v zunanji novi deponiji gnoja (vz. 11, slika 19) v juliju, medtem ko v notranjih vzorcih, ki so bili pomešani z iztrebki, ni bilo opaznejšega sezonskega trenda. Nekoliko povišane koncentracije Map v vzorcih zemlje iz poti na pašnike smo zaznali v novembru (vz. 8 in 13, slika 19).
2. Diskriminacija sevov znotraj skupine Mycobacterium avium in znotraj skupine M. tuberculosis
Razvito metodo v fazi II smo preizkusili tudi na DNK, izolirani iz fecesa krav s paratuberkuiozo in okoljskih vzorcih s kmetije v primeru M. avium in iz humanih vzorcev v primeru M. tuberculosis.
V preteklem obdobju smo poročali o raziskovanju in pripravi metodologij za detekcijo različnih bakterij (Faza II). Izdelali smo številne študije detekcije bakterij, ki pogosto okužujejo živilske proizvode, pri čemer pa je bil velik problem koreliranje raznolikosti sevov in njihovih patofizioloških lastnosti. Velika prednost teh detekcijski orodij je v tem, da se zagotovi sledijivost mikrobne kontaminacije. Zaradi kompleksnoti problema, smo v nadaljevanju izbrali mikroorganizme, ki so po številu sevov, evolucijski hitrosti spreminjanja genotipov in enostavnosti meritve ustrezni za nadaljne eksperimente. Izbrali smo različne bakterije iz Mycobacterium avium compieks in Mycobacterium tuberculosis. V predhodnem obdobju smo posvetili prvo M. tuberculosis in nato bakterijam iz M. avium kompleksa. Za namene detekcije in nadaljne sledljivosti teh dveh skupin bakterij smo razvilil zelo dobro metodo za izolacijo nukleinskih kislin iz vzorca, ki vsebuje Mycobacterium avium paratuberculosis. Metodo smo nadgradili z detekcijo in ločevanjem prisotnosti bakterij M. avium paratuberculosis, M.avium hominisuis in M. avium avium. Te metode smo uspešno pripravili ter zaključili s tem delom. V nadaljevanju smo razširili detekcijo na M. tuberculosis, ki načeloma ne okužuje živali, ampak se
prenaša med ljudmi. Namen je, da pripravimo metodo za ločevanje različnih sevov M. tuberculosis, brez predhodne bogatitve bakterij. Metode razvite na M. tuberculosis se potem lahko prenesejo tudi na druge mikroorganizme, ki imajo lahko bistveno večjo diverziteto sevov.
DNK smo izolirali s Smarthelix DNAid kitom (IFB, d.o.o.) razvito v fazi I, detekcijo pa izvedli s pomočjo predhodno razvite metode v fazi II.
PCR produkt, značilen za MAP (paratuberculosis podvrsto) smo zaznali v vseh testiranih vzorcih, medtem ko MAA (avium podvrsto) in MAH (hominisuis podvrsto) nismo zaznali v nobenem vzorcu (Slika 21).
Otss6Ciai.<^n Curv*
TemMratur« iCi
Slika 21. Tipizacija podvrst M. avium v kravjem fecesu in okoljskih vzorcih. Viden je samo specifičen produkt za MAP.
V	nekaterih vzorcih smo zaznali dodatne disociacijske krivulje, ki niso pripadale nobeni izmed teoretično določenih za posamezno podvrsto, ali pa smo dobili razne dodatne nespecifične disociacijske vrhove.
Pogoje multiplex PCR bo potrebno dodatno optimizirati, prav tako pa preveriti metodo tipizacije na več različnih sevih, da bolj natančno določimo specifiko skonstruiranih začetnih nukleotidov. Za ta namen bomo tudi določili nukleotidno zaporedje nespecifičnih PCR produktov in rezultatom ustrezno spremenili zasnovo in pogoje metode.
V	predhodnem obdobju smo preizkusili metodo in situ tipizacije sevov M. tuberculosis (MTB) na osnovi števila in lokacije insercijskih sekvenc IS6110. S to metodo smo tudi poskusili dobiti nukleotidna zaporedja okolic IS6110 za namene konstrukcije začetnih oligonukleotidov za in situ tipizacijio v multiplex formatu.
Ko smo optimizirali vse parametre, smo metodo uporabili tudi za poskus in situ tipizacije M. avium podvrste paratuberculosis (MAP), na insercijskih sekvencah tipa IS900.
Hitra detekcija in tipizacija je nujna za iskanje virov okužb in izvajanje ustreznih varnostnih ukrepov proti širitvi okužbe ter za načrtovanje poteka zdravljenja.
Metode
V	primeru MTB smo preizkusili različne endonukleaze za fragmentacijo genomske DNK in ugotovili, da za tvorbo ustrezno dolgih fragmentov za uspešno pomnoževanje z inverzno PCR, lahko uporabimo endonukleazo Bfa\, s prepoznavnim mestom:
5'.....ČT A G ^ , . 3'
Endonukleaza reže znotraj IS6110 in v bližini njenega 3' konca, slednja oddaljenost je odvisna od nukleotidnega zaporedja 3' okolice IS6110, torej njene lokacije v genomu. Endonukleaza je bila izbrana tako, da oddaljenost od mesta rezanja znotraj 1S6110 do mesta v 3' okolici ni daljša od 2000 bp, kar smo preverili na modelnem objavljenem genomu seva H37Rv.
V	primeru MAP smo za fragmentacijo genomske DNK uporabili endonukleazo EagI, s prepoznavnim mestom:
5. ^ G C C G , . . 3' 3'.. . 6 C C G G^C .. . 5"
Velikost fragmentov smo teoretično preverili na objavljenem genomu MAP sev K-10.
Fragmentirano DNK smo nato ponovno zlepili s T4 ligazo, pri koncentraciji DNK 0,5 ng/ul, s čimer smo dosegli preferenčno avtoligacijo in nastanek krožnih produktov. Krožno DNK smo pomnožili z inverzno PCR, z začetnima oligonukleotidoma
za MTB:
ISBfa!_2F ACTGGTAGAGGCGGCGAT ISBfal_R GGCTGCCTACTACGCTCAAC
za MAP:
IS9Eagl_f	CTGTTGAGGTTTCCGCTGATG
iS9Eagi_r	CGCAACCACGCTGTCTACCAC
ki sta pomnoževala le krožne produkte, ki so vsebovali insercijsko sekvenco (iS). PCR produkte smo nato preverili z elektroforezo, kjer smo dobili različno dolge pomnožene DNK odseke. To je odvisno od oddaljenosti obeh prepoznavnih mest za endonukleazo (glej shemo v prejšnjem poročilu) in se razlikuje za različne lokacije IS.
Število pomnoženih odsekov nam pove koliko IS je v genomu analiziranega seva, kar se razlikuje od seva do seva, poleg tega med sevi variirajo dolžine odsekov zaradi različnih lokacij IS v genomu.
Rezultati
Posamezne odseke smo izrezali iz agaroznega gela (Slika 22), PCR produkte očistili s silica kolonami in poslali sekvenirati.
1 2 3 4 5 6
Slika 22. In situ tipizacija sevov MAP. 1 - označevalec velikosti; 2,3 - sev MAP 446; 4,5 - sev 468/09; 6 - sev MAP 56/l.Seva 446 in 468/09 sta enaka, 56/1 pa nima zgornjih dveh odsekov.
Dobljena zaporedja smo poravnali s programom Bioedit (Slika 22), lokacije IS pa določili s poravnavo z algoritmiom Blast, dostopnemu v NCBI spletni bazi nukleotidnih zaporedij (Slika 23).
1g2 Mtb	Gl	C	PCCGGJ^			ccggggcggt	tcä	gggsccctctgccsgsgstgctgsgcccgtc
tg2	Gl	C	rccggj^	CO	}CJi	ccggggcggt	TCÄ	sccsgttggcccggccgtgsttgäcsttccä
TKI	G-I	C	PCCGGJi	c:	?CP	ccggggcggt	T CS	jssgggggscstctcsctcgtttgsggccsgc
TK2	Gl	c^	pccggž	c-:		ccggggcggt	TCP.	sccsgttggcccggccgtgsttgscsttccs
E2 Mtb	GT		rCCGGS	co	?cs	ccggggcggt	T CS	ssgggggäcstctcsctcgtttgsggccsgc
19D Efal	Gl	•C.	PCCGGž			,ccggggcggt	T CS	sccsgttggcccggccgtgsttgscsttccs
TEl	GT	'C.	pccggž	.CO	[■Cž	.ccggggcggt	t cs	sccägttggcccggccgtgsttgscättccs
TFl	Gl	•C.	rccggs	-CO		.ccggggcggt	T CS	sccsgttggcccggccgtgsttgscsttccs
Tli	gt	•Ci	PCCGGJi	,C0	JCJi	.ccggggcggt	TCR	sccsgttggcccggcggtgsttgscsttccs
ti2	gt		pccgga	,co		.ccggggcggt	t cs	ctcäggsäsccäcäcccgtccgcgggsctcc
Slika 23. Poravnava zaporedij inverznih PCR produktov pri MTB. Osenčeno je zaporedje IS6110, ki je skupno vsem zaporedjem, neosenčene so zaporedja okolic 3' konca IS6110, ki se razlikujejo za vsako IS. Vsa zaporedja pripadajo enemu sevu.
3'	IppT (Rvi739)
MTB H37RV
3' conserved hypothetical protein {TBMGJ}2232}
MTB KZN 1435
3' inter genie region PPEi5 (Rvi03Sc}/esxj (R%103Sc)
MT8 H37RV
3'
plcA (Rv235ic} MTB h37rv
5'
5'
5'
Slika 24. Lokacije analiziranih IS6110 enega seva MTB. Poravnava z algoritmom Blast v bazi nukleotidnih zaporedij NCBI. S črno so označene različne IS6110, oranžni del predstavlja pripadajočo okolico. Vpisani so geni, katerim pripada določeno nukleotidno zaporedje, podpisana je oznaka seva iz NCBI podatkovne baze, kjer je bila zaznana prisotnost iskanega
zaporedja.
V	prihodnjem obdobju bomo nadaljevali z in situ tipizacijo različnih sevov MTB in iVIAP ter določevanjem nukleotidnih zaporedij okolic IS. Nadalje bomo razmislili o možnosti izvedbe multiplex detekcije reprezentativnih lokacij IS. Za te namene bomo skonstruirali začetne oligonukleotide za posamezne lokacije in preverili, katere lokacije omogočajo zadovoljivo diskriminacijo za in situ tipizacijo sevov, v primerjavi z obstoječimi metodami tipizacije (RFLP, MIRU-VNTR).
In silico analiza lokacij insercijskih zaporedij tipa 900 na objavljenih genomih Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
Za namene in situ genotipizacije sevov Mycobacteriun) avium subsp. paratuberculosis [Map) direktno iz vzorcev, smo, podobno kot v primeru M. tuberculosis, z bioinformatskimi orodji izvedli analizo lokacij oziroma okolic insercijskih zaporedij tipa 900 (IS900). Zaporedja okolic bodo omogočila konstrukcijo oligonukieotidov, ki bodo temelj za genotipizacijo sevov Map, bodisi z multipleks PCR reakcijo na izbranih ustrezno diskriminatornih lokacijah IS900, bodisi s pripravo mikročipa za tarčno resekveniranje z metodami sekveniranja naslednje generacije.
Metode
V	javnih bazah podatkov je zaenkrat v celoti sekveniran in anotiran le en genom Map in sicer sev K-10, zaradi česar primerjava lokacij in okolic med posameznimi sevi ni bila možna. Veliko genomskih zaporedij Map je bilo posekveniranih v zadnjih parih letih, vendar so še v 'draft' verzijah in vsebujejo še veliko regij s slabo pokritostjo, zaradi česar določitev lokacij IS900 ni možna oz. je nezanesljiva. Pričakuje se porast javno dostopnih anotiranih genomov Map v prihodnjih letih, ko bo tudi mogoče izvesti primerjavo profilov IS900.
Zaporedje objavljenega genoma smo dobili v javni bazi podatkov NCBI (National Centre for Biotechnology Information) in ga analizirali v programu VectorNTI (Invitrogen). Vse prisotne IS900 vključno z okolico 1000 baznih parov gor- in doivodno smo poravnali v programu Bioedit. Zaporedja 5' in 3' okolic smo primerjali z NCBI bazo nukleotidnih zaporedij z uporabo algotima BLAST (NCBI) in poiskali pripadajoče genomske regije oziroma gene. Identiteto predvidenih prepisov v proteine smo preverili v bazi proteinskih zaporedij UNIPROT (www/.uniprot.org). V primeru, da gen v okolici IS900 ni bil anotiran za MAP, smo prevzeli anotacijo najbolj podobnih mikobakterijskih paralogov. Fizično lokacijo genov smo določili v aplikaciji za vizualizacijo anotiranih genomov Sequence View/er (NCBI).
Rezultati
Map, sev K-10 vsebuje 14 IS900, 8 v orientaciji proti-smiselne (ong. antisense) in 7 v orientaciji smiselne (ang. sense) DNK verige. Večina IS900 je locirana v okolici genov z neznano funkcijo, ki so unikatni za MAP in ne vsebujejo paralogov v M. tuberculosis H37Rv. Posledično se težko sklepa na fenotipske posledice posamezne insercije IS900 (Tabela 15).
Tabela 15. Lokacije IS900 v genomu MAP K-10.
homology/annotation
MAP
strain/ Gene Locus tag
m
5'end
J59QQ Gene Locus tag orient.
homology/annotation
3-end
MAP K-10
i	-	MAP_0033c	transcription factor WhiB family		MAP_0C35	Helix-turn-helix domain proteir
2	-	MAP_0i60	hypothetical protein	(-)	MAP_0i58	PPE family protein
3		MAP_0966c	hypothetical protein	(+)	MAP_096S	hypothetical protein
d	-	MAP_1032c	hypothetical protein	(+)	MAP_i034c	hypothetical protein
5	-	MAP_1721c	hypothetical protein	(+)	- MAP_1723	hypothetical protein
6	-	MAP_i772	hypothetical protein	(-)	MAP_177CC	hypothetical protein
7	-	MAP_17S4c	hypothetical protein	i+)	MAP_i786c	hypothetical protein
8	-	f,1AP_i794	hypothetical protein	(-)	MAP_i792	hypothetical protein
9	n,rA_l	MAP_2035	Sulfite reductase [ferredoKin] 1	!-!	MAP_2033	hypothetical protein
10	-	MAP_2i07c	hypothetical protein	(+)	MAP_2i09c	hypothetical protein
il	-	MAP_2204c	hypothetical protein	(-)	MAP_22D3c	hypothetical protein
12	ogt	rvlAP_2445	Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase	(-)	alkA MAP_2443	DNA-3-methyladenine glycosid
13	P£_6	MAP_2576c	PE family protein	(+)	rvlAP_2578	hypothetical protein
14	-	MAP_3479C	hypothetical protein	(+)	IpqD MAP_348i	Lipoprotein LpqD
Zaključki
Rezultati raziskovalnega projekta so naslednji:
1.	Metode izolacije nukleinskih kislin V raziskavi zrno razvili dve metodi:
a)	Izredno učinkovita izolacija nukleinskih kislin iz konnpleksnih matriksov (feces, prst, krma).
b)	Pripravili smo metodo hitre lize in sprotne obdelave velikega števila vzorcev izoliranih sevov (96 vzorcev hkrati) za potrebe tipizacije izolatov, ki tako nadgrajujejo bazo
2.	Priprava oligonukleotidnih začetnikov za potrebe tipizacije in detekcije določenih bakterij (Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campilobacter spp., Escherichia coli)
3.	Praktična priprava in situ tipizacije M. avium paratuberculosis in ločevanje sevov Mycobacterium avium kompleksa.
4.	Razširitev in situ tipizacije tudi na humane vzorce sevov M. tuberculosis
5.	Testiranje tipizacije in detekcije na okoljskih vzorcih - kmetiji, ki je kontaminirana z Map 5. Ugotavljanje sezonske dinamike kontaminiranosti z Map.
Zadnji rezultat prikazuje pravzaprav praktično vrednost raziskave. In sicer analiza vzorcev iz ožjega in širšega območja kmetije je pokazala visoko stopnjo kontaminiranosti z Map. Kljub temu, da z izbrano metodo kvantifikacije ne moremo ločiti med živimi in neživimi frakcijami Map, lahko predvidevamo, da je prenos živih bakterij v okolje izven hleva znaten. Literatura navaja, da lahko Map preživi v okolju izven gostitelja tudi več kot eno leto, zaradi česar lahko sklepamo, da je vsaj določen del zaznanih Map viabilnih.
Simptomatske krave lahko z iztrebki izločajo ogromne količine Map in verjetno poglavitno prispevajo k visokim koncentracijam bakterij v okoljskih vzorcih. Zaenkrat je neznano, ali se Map lahko razmnožuje v okolju izven gostitelja, predvideva pa se, da so okoljske amebe možen rezervoar, ki omogoča preživetje ali celo razmnoževanje Map v okolju.
Obseg kontaminacije, ki smo jo pokazali v raziskavi, kaže na obsežnost problematike preprečevanja nadaljnega širjenja okužb z Map. Glede na perzistentnost Map v okolju je
praktično nemogoče preprečiti pojave novih oi<užb zgolj z izolacijo simptomatskega goveda. Dodaten problem je izločanje Map v iztrebkih asimptomatskega goveda in dolga inkubacijska doba oz. latente faza infekcije, ki lahko traja tudi več let.
Za preprečevanja pojavljanja paratuberkuloze v čredah je zato potrebno upoštevati dejstvo obširne kontaminacije okolja in razviti nove strategije, ki bodo bodisi kontrolirale obseg kontaminacije, npr. z skrbno načrtovano infrastukturo in notranjo ureditvijo hlevov (samodozirni napojalniki), ali pa se bodo lotile problema z uporaba drugih preventivnih sredstev, kot npr. cepiva, ki pa zaenkrat na trgu še niso dostopna.
Vsekakor je za pravočasno identifikacijo okuženega goveda potrebno uvesti rutinsko molekularno testiranje za prisotnost Map v bioloških vzorcih, predvsem tudi zaradi možnega zoonotskega potenciala Map, ki se zadnje čase vse pogosteje navaja v strokovni literaturi (Crohn-ova bolezen).
Da bi se izsledki raziskava, ki nakazujejo na pripravo rutinskih metod, lahko praktično vpeljala v rutinske preiskave kontaminacije in vira okužbe, bi bilo potrebno še številne dodatne preiskave in validacije, predvsem pa:
1.	Izboljšati metodo hitre lize predvsem v smislu kroskontaminacije in vpeljave uporabe multikanalne pipete
2.	Povečati zbirko sevov za potrebe tipizacije in preveriti navzkrižnost rezultatov
3.	Na številnih vzorcih in različnih sevih drugih vrst kot Map preizkusiti in izdelati protokol, ki temelji na naši metodi in situ tipizacije
4.	Na podlagi številnih genomov in na podlagi naše in situ tipizacije izdelati metodo, ki bi prototipno fazo, do katere smo tekom te raziskave prišli, pripeljali do širše uporabnosti
3. Izkoriščanje dobljenih rezultatov:
3.1. Kakšen j e potencialni pometf rezultatov vašega raziskovalnega proj ekta za: 3 a) odkritje novih znanstvenih spoznanj;
3 b) izpopolnitev oziroma razširitev metodološkega instrumentarija;
c) razvoj svojega temeljnega raziskovanja;
d)	razvoj drugih temeljnih znanosti;
e)	razvoj novih tehnologij in drugih razvojnih raziskav.
3.2. Označite s katerimi družbeno-ekonomskimi cilji (po metodologiji OECD-ja) sovpadajo rezultati vašega raziskovalnega projekta:
2
Označite lahko več odgovorov.
a) razvoj kmetijstva, gozdarstva in ribolova - Vključuje RR, ki je v osnovi namenjen razvoju in podpori teh dejavnosti;
^ b) pospeševanje industrijskega razvoja - vključuje RR, ki v osnovi podpira razvoj industrije, vključno s proizvodnjo, gradbeništvom, prodajo na debelo in drobno, restavracijami in hoteli, bančništvom, zavarovalnicami in drugimi gospodarskimi dejavnostmi;
c)	proizvodnja in racionalna izraba energije - vključuje RR-dejavnosti, ki so v funkciji dobave, proizvodnje, hranjenja in distribucije vseh oblik energije. V to skupino je treba vključiti tudi RR vodnih virov in nuklearne energije;
d)	razvoj infrastrukture - Ta skupina vključuje dve podskupini:
•	transport in telekomunikacije - Vključen je RR, ki je usmeijen v izboljšavo in povečanje varnosti prometnih sistemov, vključno z varnostjo v prometu;
•	prostorsko planiranje mest in podeželja - Vključen je RR, ki se nanaša na skupno načrtovanje mest in podeželja, boljše pogoje bivanja in izboljšave v okolju;
3 e) nadzor in skrb za okolje - Vključuje RR, kije usmerjen v ohranjevanje fizičnega okolja. Zajema onesnaževanje zraka, voda, zemlje in spodnjih slojev, onesnaženje zaradi hrupa, odlaganja trdnih odpadkov in sevanja. Razdeljen je v dve skupini:
f)	zdravstveno varstvo (z izjemo onesnaževanja) - Vključuje RR - programe, ki so usmerjeni v varstvo in izboljšanje človekovega zdravja;
g)	družbeni razvoj in storitve - Vključuje RR, ki se nanaša na družbene in kulturne probleme;
^ h) splošni napredek znanja - Ta skupina zajema RR, ki prispeva k splošnemu napredku znanja in ga ne moremo pripisati določenim ciljem;
1X1 i) obramba - Vključuje RR, ki se v osnovi izvaja v vojaške namene, ne glede na njegovo vsebino, ali na možnost posredne civilne uporabe. Vključuje tudi varstvo (obrambo) pred naravnimi nesrečami.
3.3. Kateri so neposredni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje?_
1. Izvirni znanstveni članek:
TRAUNŠEK, Urban, TOPLAK, Nataša, JERŠEK, Barbara, LAPANJE, Aleš, MAJSTOROVIČ, Tamara, KOVAČ, Minka. Novel cost-efficient real-time PCR assays for detection and quantitation of Listeria monocytogenes. J. microbiol. methods. [Print ed.], 2011, vol. 85, issue 1, str. 40-46, doi: 10.1016/i.mlmet.2G11.01.018. fCOBISS.SI-ID 3871608]
2. Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci:
OCEPEK, Matjaž, PATE, Mateja, MUŠČET, Barbara, AVBERŠEK, Jana, LOGAR, Katarina, LAPANJE, Aleš, ZRIMEC, Alexis. Comparison of DNA extraction methods to detect Salmonella in water. V: BARLIČ-MAGANJA, Darja (ur.), RASPOR, Peter (ur.). 4th Congress of the Slovenian Microbiological Society with International Participation, Portorož, November 2008. Microbiology for today: book
of abstracts = zbornik povzetkov. Ljubljana: Slovensko mikrobiološko društvo: = Slovenian Microbiological Society, 2008, str. 149. [COBISS.SI-ID 2999418]
KOPINČ, Rok, MUŠČET, Barbara, BRENČIČ, Mihael, MATOZ, Tomo, ZRIMEC, Alexis, LAPANJE, Aleš. Identification of attached and unattached bacterial populations on dolomite bedrock. V: EUROBIOFILMS 2009 : programme & abstract book. [Rome: Fondazione Santa Lucia, 2009], str. 119-120. [COBISS.SI-ID 26208729]
RAZINGER, Jaka, MUŠČET, Barbara, ZRIMEC, Alexis, LAPANJE, Aleš. Fluctuations in the pumping regime decrease the stability of biofilm in highly perforated dolomite aquifers. V: EUROBIOFILMS 2009: programme & abstract book. [Rome: Fondazione Santa Lucia, 2009], str. 122-123. rCOBISS.SI-ID 262092411
KOPINČ, Rok, OCEPEK, Matjaž, LAPANJE, Aleš. Antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium avium subspecies under iron starvation. V: 21st European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 27th International Congress of Chemotherapy (ICC), Milan, Italy, 7-10 May 2011. [Milan: s.n., 2011], [Str. 1], fCOBISS.SI-ID 287579771
3.	Objavljeni povzetek strokovnega prispevka na konferenci
HUBAD, Barbara, KOPINČ, Rok, ZRIMEC, Alexis, LAPANJE, Aleš. Detection of airborne M. tuberculosis in a pulmonary hospital and tuberculosis diagnostic laboratory. V: NIEMANN, Stefan (ur.). 32nd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, 26th - 29th June 2011, Lübeck. Scientific Program including Abstracts : 32nd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, 26th - 29th June 2011, Lübeck, Germany. Werne: Agentur Konsens, 2011, str. 70. fCOBISS.SI-ID 287582331
KOPINČ, Rok, WYNE, James W., MICHALSKI, Wojtek P., LAPANJE, Aleš. Comparative genomics of mycobactin synthesis operons in sheep and cattle strains of M. avium subsp. paratuberculosis. V: NIEMANN, Stefan (ur.). 32nd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, 26th - 29th June 2011, Lübeck. Scientific Program including Abstracts : 32nd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, 26th - 29th June 2011, Lübeck, Germany. Werne: Agentur Konsens, 2011, str. 92-93. [COBISS.SI-ID 287584891
4.	Patentna prijava
LAPANJE, Aleš. Visoko zmogljiva izolacija nukleinskih kislin. Ljubljana: Urad RS za intelektualno lastnino, 2009. 7 str., ilustr. [COBISS.SI-ID 273827451
LAPANJE, Aleš. Avtomatizacija izolacije nukleinskih kislin iz kompleksnih vzorcev: številka prijave: P-201000223 z dne 26.7.2010. Ljubljana: Urad RS za intelektualno lastnino, 2010. 8 str., [ilustr.]. fCOBISS.SI-ID 275345531
LAPANJE, Aleš. Postopek za hitro genotipizacijo sevov Mycobacterium avium podvrste paratuberculosis : številka prijave: 201000231, z dne 28.7.2010. Ljubljana: Urad RS za intelektualno lastnino, 2010.10 str., [ilustr.]. [COBISS.SI-ID 275342971
5.	Patent
LAPANJE, Aleš. Visoko zmogljiva izolacija nukleinskih kislin. Ljubljana: Urad RS za intelektualno lastnino, 2009. 7 str., ilustr.: patentna prijava P-200900392 z dne 21.12. 2009 patent št. 23249 z
dne30.6.2011
6. Zaključene diplomske naloge
ŠTIMPFEL, Martin. Molekularno biološka analiza pritrjenih in planktonskih bakterijskih združb v lokalnem vodovodnem sistemu : diplomsko delo = Characterization of attached and planktonic bacterial communities in local water distribution system by molecular methods : graduation thesis, (Biotehniška fakulteta. Študij biotehnologije, Diplomska dela, 20). Ljubljana: [M. Štimpfel], 2009. XI, 56 f., [34] f. pril., ilustr., preglednice, http://www.digitalna-kniiznica.bf.uni-li.si/dn stimpfel martin.pdf. [COBISS.SI-ID 6116473]
ŽITNIK, Miha. Identifikacija pritrjenih in planktonskih bakterijskih vrst v dolomitnem vodonosniku : diplomsko delo, univerzitetni študij = Identification of attached and unattached bacterial species in dolomite aquifer: graduation thesis, university studies, (Biotehniška fakulteta. Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, Ljubljana, Diplomske naloge, 481). Ljubljana: [M. Žitnik], 2011. IX, 70 f., graf. prikazi, tabele. [COBISS.SI-ID 39297201
7.	Odobrena tema doktorske dizertacije
KOPINČ, Rok Vloga homeostaze železa v ekologiji podvrst bakterije Mycobacterium avium. Role of Iron Homeostasis in Ecology of Mycobacterium avium subspecies. Biotehniška fakulteta. Interdisciplinarni študij Biomedicine.
8.	Razvoj izdelkov
SmartHelix DNAid - postopek in mešanica kemikalij za učinkovito izolacijo nukelinskih kislin iz kompleksnih vzorcev (http://smart-helix.com/smarthelix-complex-samples-dna-extraction-kit.html)
Ezextract - postopek in mešanica kemikalij za izolacijo nukleinskih kislin iz velikega števila različnih izolatov (http://smart-helix.com/index.php?module=page&pagelD=53)
9. Mreženje
Na podlagi znanja pridobljenega tekom tega projekta, smo vzpostavili mednarodne stike z Veterinarskim raziskovalnim inštitutom iz Češke, Friedrich Loeffier inštitutum iz Nemčije, ChipShop podjetjem iz Nemčije, veterinarskim inštitutom Istituto Zooprofilattico Sperimentale za diagnostiko iz Italije in poglobili sodelovanja v Sloveniji: Univerza v Ljubljani - Veterinarska fakulteta, podjetje Omega d.O.o. in Inštitut za varovanje zdravja Ljubljana.
3.4. Kakšni so lahko dolgoročni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje?_
1.	Znanstvena odličnost
V	pripravi imamo še dva članka, ki ju mislimo objaviti v mednarodnih revijah z indeksom citiranosti.
2.	Podjetništvo
V	načrtu imamo implementacijo idej in prvih izdelkov v novo nastala odcepljena podjetja
3.	Mreženje
S pomočjo obiskov na konferencah se nam je povečala mreža sodelav in s tem kroženje znanja in raziskovalcev med podjetji in raziskovalnimi organizacijami._
4. Sodelovanje na EU projektih Rezultati raziskave se kažejo tudi v tem, da smo bili povabljeni v EU projekt FP7, ki je bil uspešno odobren. Nosilno podjetje je ChipShop iz Nemčije.
3.5. Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva?
^ a) v domačih znanstvenih krogih; 3 b) v mednarodnih znanstvenih krogih; KI c) pri domačih uporabnikih;
^ d) pri mednarodnih uporabnikih.
3.6. Kdo (poleg sofmanceijev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih?
3.7. Število diplomantov, magistrov in doktorjev, ki so zaključili študij z vključenostjo v raziskovalni projekt?_
Na podlagi pridobljenega znanja tekom tega projekta sta uspešno zaključila dva diplomanta. Oba sta aplicirala molekularne tehnike na pitno vodo: ŠTIMPFEL, Martin. Molekularno biološka analiza pritrjenih in planktonskih bakterijskih združb v lokalnem vodovodnem sistemu : diplomsko delo = Characterization of attached and planktonic bacterial communities in local water distribution system by molecular methods: graduation thesis, (Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Diplomska dela, 20). Ljubljana: [M. Štimpfel], 2009. XI, 56 f., [34] f. pril., ilustr., preglednice. http://w/w/w.digitaina-kniiznica.bf.uni-li.si/dn stimpfel martin.pdf. fCOBISS.SND 61164731
ŽITNIK, Miha. Identifikacija pritrjenih in planktonskih bakterijskih vrst v dolomitnem vodonosniku : diplomsko delo, univerzitetni študij = Identification of attached and unattached bacterial species in dolomite aquifer : graduation thesis, university studies, (Biotehniška fakulteta. Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, Ljubljana, Diplomske naloge, 481). Ljubljana: [M. Žitnik], 2011. IX, 70 f., graf. prikazi, tabele. [COBISS.SI-ID 39297201_
4. Sodelovanje s tujimi partnerji:
4.1. Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujimi raziskovalnimi inštitucijami._
Kot rezultat tega projekta je odprtje sodelovanja med 4 raziskovalnimi organizacijami in podjetji: Friedrich Loeffier inštituta iz Nemčije, ChipShop podjetja iz Nemčije, Veterinarskega inštituta Istituto Zooprofilattico Sperimentale iz Italije in Veterinarsko-raziskovalnega inštituta (VRI, Vuvei) iz Češke.
s FLI in ChipShop sodelujemo sedaj na projektu EU FP7 z namenom razvoja detekcije patogenov v zraku z uporabo molekularnih tehnik in izdelave mikrofluidnih naprav.
Z raziskovalci veterinarskega inštituta Istituto Zooprofilattico Sperimentale iz Italije in Veterinarskega raziskovalnega inštituta iz Češke sodelujemo v smislu pretoka raziskovalcev in v prihodnosti potencialne prijave novega EU projekta.	____
4.2. Kakšni so rezultati tovrstnega sodelovanja? Trenutno skupaj delamo na raziskavah na novo odobrenega EU projekta. Torej rezultat je uspešno odobren nov FP7 projekt in nadaljevanje dela na podobni tematiki.
5. Bibliografski rezultatf :
Za vodjo projekta in ostale raziskovalce v projektni skupini priložite bibliografske izpise za obdobje zadnjih treh let iz COBISS-a) oz. za medicinske vede iz Inštituta za biomedicinsko informatiko. Na bibliografskih izpisih označite tista dela, ki so nastala v okviru pričujočega projekta.
6. Druge reference'* vodje projekta in ostalih raziskovalcev, ki izhajajo iz raziskovalnega projekta:
3
Bibliografijo raziskovalcev si lahko natisnete sami iz spletne strani:http:/www.izum.si/
Navedite tudi druge raziskovalne rezultate iz obdobja financiranja vašega projekta, ki niso zajeti v bibliografske izpise, zlasti pa tiste, ki se nanašajo na prenos znanja in tehnologije.
Navedite tudi podatke o vseh javnih in drugih predstavitvah projekta in njegovih rezultatov vključno s predstavitvami, ki so bile organizirane izključno za naročnika/naročnike projekta.