Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 97-107. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: L10 COBISS Code 1.02 TRANSKRIPCIJSKO URAVNAVANJE ADIPOGENEZE IN VLOGA KOAKTIVATORJA PGC-1? * Tamara MILOŠEVIČ BERLIČ a) in Peter DOVČ b) a) Krka, d. d., Dunajska 65, SI-1000 Ljubljana, dr., e-pošta: tamara.berlic@krka.biz. b) Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, prof., dr., e-pošta: peter.dovc@bfro.uni-lj.si. Delo je prispelo 10. novembra 2004, sprejeto 03. decembra 2004. Received November 10, 2004, accepted December 03, 2004. IZVLEČEK Adipogeneza je kompleksen proces, na katerega vpliva veliko število genetskih in okoljskih faktorjev. Ker je posledica prekomernega nalaganja maščob debelost, pogosto pa tudi pojav diabetesa tipa 2, postaja proučevanje molekulskih osnov adipogeneze vse bolj pomembno tudi z vidika zdravja človeka. V živalski proizvodnji proces tvorbe maščobnega tkiva pomembno vpliva na kakovost prirasta, preko porabe krme pa na ekonomičnost proizvodnje. Poleg leptina in leptinskega receptorja, ki odločilno uravnavata nalaganje maščob, je bil v zadnjem času odkrit tudi mehanizem uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva, ki vključuje adaptivno termogenezo in biosintezo mitohondrijev. Pomembna regulatorja teh procesov sta PPAR? in njegov koaktivator PGC-1?. V pričujočem prispevku opisujemo mehanizem uravnavanja adipogeneze in vlogo PPAR? in PGC-1? v njem. Prikazana je tudi medvrstna primerjava aminokislinskih zaporedij PGC-1? in možnosti za razvoj farmacevtskih učinkovin, ki bi vplivale na izražanje PGC-1?. Ključne besede: prašiči / adipogeneza / molekularna genetika / transkripcijsko uravnavanje / termogeni koaktivator PGC-1? TRANSCRIPTIONAL CONTROL OF ADIPOGENESIS AND ROLE OF THE COACTIVATOR PGC-1? † ABSTRACT Adipogenesis is a complex proces, depending on numerous genetic and environmental factors. Study of the molecular basis of adipogenesis becomes, due to its central role in obesity and diabetes type-2 in human, more and more important also in human medicine. Adipogenesis is of central importance also for animal production, due to its impact on carcass composition, meat quality and profitability of fattening. In addition to the role of leptin and leptin receptor in adipogenesis, a new regulatory mechanism was recently discovered, which includes adaptive thermogenesis and biosynthesis of mitochondria. Important regulators of these processes are PPAR? and his co-activator PGC-1?. In this article we describe the mechanism of adipogenesis regulation and the role of PPAR? and PGC-1? in it. The interspecies comparison of PGC-1? amino sequence and possibilities for development of drugs regulating PGC-1? are presented. Key words: pigs / adipogenesis / molecular genetics / transcriptional control / thermogenic coactivator PGC-1? * Prispevek je del doktorskega dela Tamare Miloševič Berlič z naslovom ´Molekulski mehanizmi uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva pri prašiču (Sus scrofa)`, mentor prof. dr. Peter Dovč. † This article is part of a doctoral thesis ´Molecular background of fat tissue formation in pig (Sus scrofa)`, issued by Tamara Miloševič Berlič, supervisor prof. Peter Dovč, Ph.D. 98 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. UVOD Maščobno tkivo je v zadnjih dvajsetih letih postalo predmet intenzivnih raziskav. Raziskave je spodbudila predvsem dostopnost nesmrtnih celičnih linij preadipocitov, ki je omogočila preučevanje lastnosti maščobnih celic (adipocitov) in vitro (v kulturi), pa tudi spoznanje, da ima maščobno tkivo odločilno vlogo pri vzdrževanju energetskega ravnovesja v telesu. Na intenzivnost raziskav sta v veliki meri vplivala tudi razširjenost debelosti in diabetesa tipa 2 pri človeku. Tvorba maščobnega tkiva (adipogeneza) je kompleksen proces, ki ga uravnavajo številni endogeni (genetski, nevroendokrini) in eksogeni (okoljski) dejavniki. Raziskave zadnjih let so usmerjene predvsem v iskanje genetskih dejavnikov, saj nam poznavanje le-teh omogoča boljši vpogled in razumevanje molekulskega ozadja nalaganja maščevja in posledične debelosti. Na molekulski ravni proces adipogeneze uravnava zapletena mreža celega niza transkripcijskih faktorjev, ki prispevajo k tvorbi in diferenciaciji maščobnih celic (Rosen in sod., 2000). Osrednjo vlogo ima PPAR? (angl. peroxisome proliferator-activated receptor ?), ki sodi v družino jedrnih hormonskih receptorjev (angl. nuclear hormone receptors). Ta protein ni pomemben le v adipogenezi, ampak tudi v drugih fizioloških in patoloških procesih v telesu. Uravnava namreč tudi diferenciacijo številnih drugih tipov celic (npr. hepatocitov, miocitov, fibroblastov, keratinocitov), zato so proteini PPAR? in ligandi, ki te proteine aktivirajo, pomembne terapevtske tarče za zdravljenje mnogih bolezni človeka. Sprememba v sintezi in/ali aktivnosti teh transkripcijskih faktorjev lahko namreč povzroči določene presnovne bolezni, za katere so značilne povečane ali zmanjšane zaloge maščobnega tkiva, zato je poznavanje podrobne strukture PPAR? in razumevanje mehanizma njegove aktivacije ključno za pridobivanje novih zdravil. Debelost je problem današnjega časa. Etiopatogeneza debelosti je večvzročna. Med eksogene vzroke spadajo: premalo gibanja, razmeroma lahka dostopnost hrane, stresi in anksiozna stanja. Tudi endogenih oz. genetskih vplivov je več: sestava organizma, energijske potrebe, osnovna presnova in termogeneza, ki jo povzročajo gibanje, uživanje hrane in toplotne spremembe. Pogostnost (incidenca) debelosti še vedno narašča in je v zadnjem času postala velik zdravstveni problem. Tudi število novo odkritih genov in drugih molekulskih označevalcev, ki jih povezujejo z debelostjo pri človeku, je vedno večje (trenutno preko 250). Pri tem je pomembna predvsem identifikacija tistih mutacij in kombinacij genov, ki bistveno prispevajo k dovzetnosti za razvoj debelosti, in okoljskih dejavnikov, ki omogočajo izražanje teh genov (Rankinen in sod., 2002). Zaradi izjemne podobnosti v fiziologiji in presnovi lipidov so prašiči odličen model za preučevanje debelosti, diabetesa in številnih drugih presnovnih bolezni človeka (Fajas in sod., 1998; Sundvold in sod., 2001). Z razumevanjem molekulskega ozadja nalaganja maščobe lahko bistveno prispevamo k zmanjšanju nastanka debelosti in zmanjšanju tveganja za razvoj z debelostjo povezanih bolezni. To znanje je pomembno tudi pri reji domačih živali, saj prekomerno nalaganje maščevja pri prašiču vpliva tako na gospodarnost reje kot na kakovost prašičjega mesa. Tvorba maščobnega tkiva (adipogeneza) Sesalci imajo dve vrsti maščobnega tkiva, belo (angl. white adipose tissue, WAT) in rjavo (angl. brown adipose tissue, BAT), ki se razlikujeta po presnovnih značilnostih. Rjavi in beli adipociti imajo različno vlogo pri vzdrževanju energetskega ravnovesja. Funkcija belih adipocitov je shranjevanje energije v obliki trigliceridov, funkcija rjavih pa poraba metaboličnih hraniv, pri čemer se sprošča toplota. Motnje v tem stanju dinamičnega ravnotežja med vnosom in porabo energije vodijo v povečanje ali zmanjšanje količine belega maščevja, npr. pri debelosti Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 99 oz. lipodistrofičnih sindromih (podhranjenost, nervozna anoreksija). V fiziološkem smislu je vloga rjavega maščevja adaptacija na mraz in zaščita pred debelostjo. Maso maščobnega tkiva v osnovi določa število adipocitov in ravnotežje med vnosom in porabo energije. Pri vzpostavljanju energetskega ravnovesja v telesu imajo pomembno vlogo geni, ki uravnavajo presnovo maščob in razgradnjo hranilnih snovi. Nalaganje maščevja je kvantitativna poligenska lastnost, kar pomeni, da je izražanje take lastnosti v večini primerov pod vplivom velikega števila genov. Prispevek posameznih genov k izoblikovanju lastnosti je lahko zelo različen - z delovanjem nekaterih genov lahko pojasnimo velik del fenotipske variance (Weller in sod., 1990). Masa maščobnega tkiva se lahko spremeni zaradi spremembe v številu, velikosti ali volumnu adipocitov. Povečano število celic je rezultat neprekinjene stimulacije procesa celične diferenciacije, zmanjšano število pa je posledica apoptoze in dediferenciacije adipocitov. Zanimivo je, da proces diferenciacije mezenhimskih zarodnih celic v adipocite poteka celo življenje (Fajas in sod., 1998). Molekulsko uravnavanje adipogeneze Diferenciacija celic je odraz sprememb v izražanju genov. Morfološke spremembe, ki spremljajo adipogenezo (npr. sprememba oblike celic, kopičenje maščobe), so posledica aktiviranja genov in sprememb v sintezi in delovanju adipogenih transkripcijskih faktorjev. Ti transkripcijski faktorji skupaj stimulirajo izražanje genov, specifičnih za adipocite, kar vodi v značilen fenotip zrelih adipocitov. Pomembna stopnja v diferenciaciji adipocitov je prekinitev rasti celic. Na tej stopnji se, po stimulaciji z ustreznimi hormoni, preadipociti začnejo diferencirati v adipocite. Proces uravnavajo medsebojno odvisni adipogeni transkripcijski faktorji PPARy (angl. peroxisome proliferator-activated receptor y\ C/EBP (angl. CCAAT/ enchancer-binding protein) in ADD/SREBP1 (angl. adipocyte determination and differentiation factor 1/sterol regulatory element binding protein-1). Ključno vlogo ima PPARy Ključno vlogo pri uravnavanju adipogeneze ima transkripcijski faktor PPARy. Je poglavitni koordinator diferenciacije adipocitov - aktivirani PPARy namreč sproži izhod iz celičnega cikla. PPARy se veže na promotorje genov, specifičnih za maščobne celice, in aktivira njihovo izražanje. Zato, da se lahko veže na DNA in aktivira transkripcijo, se mora povezati z jedrnim receptorjem RXR (angl. retinoid receptor X) v heterodimer. Heterodimeri PPARy/RXR se vežejo na specifične PPAR-odzivne elemente (angl. PPAR response elements, PPRE) v ciljnih genih (Spiegelman in sod., 2000). Dodatni adipogeni učinek PPARy je tudi zmanjšanje izražanja leptina (hormona, ki ga izločajo maščobne celice), kar povzroči povečan vnos energije v adipocite (Fajas in sod., 1998). Pri uravnavanju aktivnosti PPARy imajo osrednjo vlogo proteini C/EBP. Rezultati številnih poskusov kažejo na zaporedno aktivacijo celega niza transkripcijskih faktorjev, vpletenih v adipogenezo (slika 1). Najprej se pojavita proteina C/EBPß in C/EBPÔ, sledi PPARy, ki nadalje aktivira C/EBPa. C/EBPa vzajemno vzdržuje raven PPARy (pozitivna kontrola) in na ta način ohranja diferencirano stanje. Aktivacijo PPARy lahko s produkcijo endogenega liganda za PPARy sproži tudi ADD1/SREBP1C. Vsi omenjeni faktorji prispevajo k izražanju genov, ki so značilni za dokončno diferenciran fenotip maščobnih celic. Na pomen PPARy v patologiji debelosti kaže tudi polimorfizem v genu PPARy, ki je povezan z nižjimi koncentracijami leptina pri debelih ljudeh v primerjavi s kontrolno skupino, ki ima normalno obliko PPARy. 100 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Slika 1. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze – zaporedna aktivacija številnih družin transkripcijskih faktorjev (prirejeno po Rosen in sod., 2000). Figure 1. Transcriptional control of adipogenesis – sequential activation of several transcriptional factors (adapted from Rosen et al., 2000). V maščobnem tkivu prašiča sta prisotni dve izoformi proteina PPAR? (?1 in ?2), prevladuje pa PPAR?1. Zanimivo je, da PPAR?1 prevladuje tudi v podkožnem maščevju človeka, medtem ko je za uravnavanje adipogeneze pri glodalcih pomembnejša izoforma PPAR?2 (Tontonoz in sod., 1994). Houseknecht in sodelavci (1998) so klonirali cDNA za PPAR? prašiča in preiskovali uravnavanje izražanja gena PPAR? v podkožnem maščobnem tkivu prašiča. Ugotovili so, da gen PPAR? prašiča nosi zapis za 1,8 kb dolgo molekulo mRNA in da je na ravni aminokislinskega zaporedja 99, 96 oz. 97-odstotno identičen s PPAR? človeka, miši oz. krave. Z analizo northern so potrdili, da se mRNA za PPAR? v skeletni mišici ne izraža, medtem ko so z analizo western potrdili visoko raven proteina PPAR? v maščobnem tkivu prašiča v primerjavi z drugimi tkivi. Zmanjševanje kalorične vrednosti obrokov in stradanje prašičev sta povzročila znatno znižanje vsebnosti proteina PPAR?2 v podkožnem tkivu, ne pa tudi PPAR?1, v primerjavi s kontrolno skupino prašičev, hranjenih ad libitum. Mehanizem diferencialnega uravnavanja izražanja PPAR?2 in PPAR?1 še ni povsem jasen. Na osnovi teh rezultatov so Houseknecht in sodelavci (1998) sklepali, da na izražanje PPAR? med drugim vplivata tudi vrsta in kalorična vrednost hrane oz. endokrini dejavniki (hormoni). Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 101 Na aktivnost PPARy vplivajo tudi transkripcijski koaktivatorji Aktivacija transkripcije z jedrnimi receptorji vključuje delovanje mnogih dejavnikov, ki tvorijo komplekse, sestavljene iz več proteinov. Ti delujejo zaporedno (tj. ob različnem času) in/ali v kombinaciji in s tem poskrbijo za dodatno raven uravnavanja transkripcije. Da bi transkripcijski faktorji aktivirali izražanje tarčnih genov, morajo najprej razrahljati strukturo kromatina in zbrati elemente bazalnega transkripcijskega aparata. To opravijo proteini, imenovani koaktivatorji, ki v osnovi predstavljajo 'most' med jedrnimi receptorji in transkripcijskim aparatom. Koaktivatorski proteini olajšajo komunikacijo med jedrnimi receptorji, bazalnim transkripcijskim aparatom in kromatinskim okoljem in na ta način posredno olajšajo transkripcijo. Ti proteini torej niso neposredno vezani na DNA, ampak nanjo delujejo preko jedrnih receptorjev. Na aktivnost bazalnega transkripcijskega aparata vplivajo tudi neposredno preko interakcij s proteini. Za koaktivatorje jedrnih receptorjev so značilni visoko ohranjeni amfipatični motivi LXXLL (v katerih L prestavlja levcin, X pa katerokoli aminokislino), ki so pomembni pri interakcijah med koaktivatorji in jedrnimi receptorji. Ti motivi uravnavajo tudi interakcije med posameznimi koaktivatorji, za katere je značilna velika kombinatorna fleksibilnost. Poleg omenjenih so pomembna še druga aminokislinska zaporedja, ki prispevajo k specifičnosti vezave na PPARy (Rosenfeld in Glass, 2001). Termogeni koaktivator PGC-1a Koaktivatorji jedrnih receptorjev so precej raznolika skupina proteinov - uravnavajo lahko zelo specifične celične procese. Pri uravnavanju presnove in porabi energije ima ključno vlogo koaktivator PGC-1a (angl. PPARy coactivator-1 oc\ ki sproži biogenezo (tj. povečanje števila) mitohondrijev in podvajanje mtDNA ter uravnava adaptivno termogenezo in ß-oksidacijo maščobnih kislin (Knutti in Kralli, 2001; Wu in sod., 1999; Lin in sod., 2002; Lehman in sod., 2000). PGC-1a uravnava tudi determinacijo tipa mišičnih vlaken (Lin in sod., 2002) in glukoneogenezo (tj. encimsko sintezo glukoze), ki poteka v jetrih in je pomembna komponenta v patogenezi diabetesa tipa 2 (Herzig in sod., 2001). Koaktivator PGC-1a poveča učinkovitost aktivacije transkripcije s PPARy. Veže se na PPARy in številne druge jedrne receptorje in ima pomembno vlogo pri zbiranju drugih koaktivatorjev in njihovi vezavi na PPARy. PGC-1a je namreč istočasno v interakciji s številnimi transkripcijskimi faktorji, zbranimi na promotorju določenega gena, ki kumulativno učinkujejo na transkripcijsko aktivnost gena. Vezava koaktivatorja povzroči alosterično spremembo v transkripcijskem faktorju, ki temu omogoča vezavo na številna različna vezna mesta na DNA. Z vezavo na heterodimer PPARy/RXR pa PGC-1a ovira tudi vezavo korepresorjev in na ta način aktivira transkripcijo ciljnih genov (Puigserver in sod., 1998). Transkripcijski koaktivatorji niso stalno aktivni proteini, ki jih je treba le primerno 'namestiti' na genomsko DNA, da začnejo aktivirati gene. Raziskave Puigserverja in sodelavcev (1999) kažejo, da vezava transkripcijskih faktorjev aktivira PGC-1a. Neaktivno stanje koaktivatorja vzdržuje represor, medtem ko fosforilacija PGC-1a z MAPK (angl. mitogen-activated protein kinase) sprosti represor in s tem poveča aktivnost PGC-1a (Knutti in sod., 2001). Znano je, da koaktivator PGC-1a obstaja v treh stanjih, ki se razlikujejo po transkripcijski aktivnosti. PGC-1a, ki ni vezan na noben transkripcijski faktor, ima šibko transkripcijsko aktivnost in minimalno sposobnost vezave kompleksa SRC-1 in CBP/p300. Z vezavo na transkripcijski faktor se PGC-1a aktivira in konformacijsko spremeni, kar omogoči vezavo drugih kofaktorjev, ki aktivirajo transkripcijo tega lokusa (Puigserver in sod., 1999). Transkripcijski faktor nato zbere koaktivatorski kompleks, ki se delno veže tudi na PGC-1a, in vzdržuje kromatin v 'odprti' 102 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. konfiguraciji. Transkripcijski faktorji aktivirajo PGC-1? tudi tako, da odmaknejo represorje, ki vzdržujejo neaktivno stanje PGC-1? (Knutti in sod., 2001). Model tri-stopenjske aktivacije PGC-1? je prikazan na sliki 2. Slika 2. Model tri-stopenjske aktivacije PGC-1a (prirejeno po Puigserver in sod., 1999). Figure 2. PGC-1 a is present in three different states (adapted from Puigserver et al., 1999). Uravnavanje aktivnosti PGC-1a poteka na več ravneh. S podhladitvijo organizma, stradanjem in fizično aktivnostjo se sinteza PGC-1a poveča, medtem ko je za vzdrževanje bazalne ravni PGC-1a potreben leptin (Kakuma in sod., 2000). Nadalje se raven PGC-1a uravnava s specifičnim izražanjem v tkivih, ki imajo velike zahteve po energiji (kot npr. rjavo maščevje, srce, ledvica, možgani) ali pomembno vlogo v adaptivni termogenezi (Wu in sod., 1999; Larrouy in sod., 1999; Esterbauer in sod., 1999). PGC-1a so prvotno izolirali iz knjižnice cDNA rjavega maščevja miške (Puigserver in sod., 1998). V začetku so menili, da izolirani protein nima bližnjih homologov, saj s pregledovanjem podatkovnih zbirk niso našli strukturno sorodnih proteinov. Pred kratkim pa so iz knjižnice cDNA rjavega maščevja miši klonirali nov koaktivator, ki je homologen PGC-1a, in ga poimenovali PGC-1ß (Lin in sod., 2002). PGC-1a in PGC-1ß se izražata v istih tkivih, predvsem v rjavem maščevju in v srcu, vendar uravnavanje njunih mRNA med izpostavljenostjo mrazu in med diferenciacijo rjavih maščobnih celic poteka različno. Od do sedaj znanih koaktivatorjev se PGC-1a razlikuje tudi po tem, da je njegova sinteza tkivno-specifična in odvisna od fiziološkega stanja živali. Dokazano je, da izpostavitev mrazu in delovanje ß-adrenergičnih agonistov inducira izražanje PGC-1 a (Puigserver in sod., 1998). Poleg PGC-1a miši so bili izolirani in karakterizirani tudi PGC-1a človeka (Esterbauer in sod., 1999; Larrouy in sod., 1999), podgane (Goto in sod., 2000) in prašiča (Miloševič Berlič, 2002; Miloševič Berlič in sod., v tisku). Gen PGC-1a obsega -67 kb v genomu človeka. Pri vseh omenjenih vrstah je sestavljen iz 13 eksonov, ki kodirajo 91-kDa protein, katerega aminokislinsko zaporedje je 95-odstotno identično s prašičjim in 94-odstotno identično z mišjim ortologom. Visok odstotek identičnosti aminokislinskih zaporedij PGC-1a med različnimi živalskimi vrstami kaže na evolucijski pomen tega gena. Tudi primerjava kodogenega zaporedja prašičjega PGC-1a s homolognimi regijami pri drugih vrstah (slika 3) kaže na visoko evolucijsko ohranjenost domen, ki predstavljajo potencialna vezna mesta za transkripcijske faktorje. Med njimi sta pomembni predvsem dve: domena, ki veže jedrne receptorje in domena, ki je v interakciji s PPARy. Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 103 prašič 1 MAWDMCNQDS--VWTDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 58 človek 1 MAWDMCNQDSESVWSDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 60 miš 1 MAWDMCSQDS--VWSDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 58 ******.*** **:********************************************* prašič 59 QSEIISNQYNNEPSNIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGDVTTE 118 človek 61 QSEIISNQYNNEPSNIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGDVTTD 120 miš 59 QSEIISNQYNNEPANIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGAVTTD 118 *************:***************************************** ***: prašič 119 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAN-HNHRIRTN 177 človek 121 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAN-HNHRIRTN 179 miš 119 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAANHTHRIRTN 178 prašič 178 PAVVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTETRNSSRDKCTSK 237 človek 180 PAIVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTENRNSSRDKCTSK 239 miš 179 PAIVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTENRNSSRDKCASK 238 **:*********************************************.********:** prašič 238 KKAHTQSQSQHLQAKPTSLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 297 človek 240 KKSHTQSQSQHLQAKPTTLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 299 miš 239 KKSHTQPQSQHAQAKPTTLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 298 **:***.**** *****:****************************************** prašič 298 PPHKANQDNPFRASPKLKPPCKTVVPPPSKKTRYSESSGTHGNNSTKKGPEQSELYAQLS 357 človek 300 PPHKANQDNPFRASPKLKSSCKTVVPPPSKKPRYSESSGTQGNNSTKKGPEQSELYAQLS 359 miš 299 PPHKANQDNPFKASPKLKPSCKTVVPPPTKRARYSECSGTQGSHSTKKGPEQSELYAQLS 358 prašič 358 KTSALGGGHEERKARRPSLRLFGDHDYCQSINSKAEILINISQELHDSRQLDSKDAASDW 417 človek 360 KSSVLTGGHEERKTKRPSLRLFGDHDYCQSINSKTEILINISQELQDSRQLENKDVSSDW 419 miš 359 KSSGLSRGHEERKTKRPSLRLFGDHDYCQSLNSKTDILINISQELQDSRQLDFKDASCDW 418 prašič 418 QRQMCSSTDSDQCYLTETSEASRQVSPGSARKQLQDQEIRAELNKHFGHPSQAVFDDEAD 477 človek 420 QGQICSSTDSDQCYLRETLEASKQVSPCSTRKQLQDQEIRAELNKHFGHPSQAVFDDEAD 479 miš 419 QGHICSSTDSGQCYLRETLEASKQVSPCSTRKQLQDQEIRAELNKHFGHPCQAVFDDKSD 478 * ::******.**** ** ***:**** *:********************.******: * prašič 478 KTSELRDSDFSNEQFSKLPMFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLNSPWDGTQSYSLFDVSPS 537 človek 480 KTGELRDSDFSNEQFSKLPMFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLSYPWDGTQSYSLFNVSPS 539 miš 479 KTSELRDGDFSNEQFSKLPVFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLSYPWDGTQPYSLFDVSPS 538 **.****.:**********:******************.***. ******.****:**** prašič 538 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSQHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 597 človek 540 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSRHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 599 miš 539 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSRHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 598 **********************************:************************* prašič 598 CYYSESGHCRHRTHRNSPLCARSRSRSPYSRRPRYDSYEEYQHERLKREEYRREYEKRES 657 človek 600 CYYYESSHYRHRTHRNSPLYVRSRSRSPYSRRPRYDSYEEYQHERLKREEYRREYEKRES 659 miš 599 CYYYESSHYRHRTHRNSPLYVRSRSRSPYSRRPRYDSYEAYEHERLKRDEYRKEHEKRES 658 *** **.* ********** .****************** :******:***:*:***** prašič 658 ERAKQRERQRQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 717 človek 660 ERAKQRERQRQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 719 miš 659 ERAKQRERQKQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 718 *********:************************************************** prašič 718 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDSNSDDFDPASTKSK 777 človek 720 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDSNSDDFDPASTKSK 779 miš 719 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDTNSDDFDPASTKSK 778 **********************************************:************* prašič 778 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 796 človek 780 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 798 miš 779 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 797 ******************* Slika 3. Aminokislinsko zaporedje prašičjega PGC-1? v primerjavi z zaporedjem človeškega (AAD51615) in mišjega (AAC13554) homologa. Zvezdice predstavljajo identične amino kisline, dvopičja in pike pa polimorfna mesta. Delecije amino kislin so predstavljene s črticami. Motiv LXXLL (ak 142-146), tri mesta za fosforilacijo s proteinsko kinazo A (ak 237-240, 372-375 in 652-657) ter interaktivna domena PPAR (ak 291-337) so označene z okvirji. Dve SR-bogati domeni (ak 564-597 in 619-631) in domena, ki veže RNA (RRM) (ak 675-751) so podčrtane. Zaporedje bipartitnega signala za nuklearno lokalizacijo (ak 649-666) in tetrapeptidni motiv DHDY (ak 380-383) sta poudarjena. Figure 3. The deduced amino acid sequence of the porcine PGC-1? is compared with human (AAD51615) and mouse (AAC13554) sequences. Asterisks represent identical amino acids, while colons and dots indicate polymorphic sites. Deletions of amino acids are shown by dashes. An LXXLL motif (aa 142-146), three consensus sites for phosphorylation by protein kinase A (aa 237-240, 372-375 and 652-657), PPAR interactive domain (aa 291-337) are boxed. Two SR-rich domains (aa 564-597 and 619-631), and an RNA binding domain (RRM) (aa 675-751) are underlined. A consensus sequence of bipartite nuclear localization signal (aa 649-666) and a tetrapeptide motif DHDY (aa 380-383) are shown in boldface type. 104 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Prisotnost številnih domen na PGC-1a, ki omogočajo vezavo različnih proteinov, ki se vežejo na DNA, odpira možnosti za usmerjanje delovanja PGC-1a na promotorje izbranih tarčnih genov in za razvoj zdravilnih učinkovin, ki bi selektivno delovale na posamezne skupine tarčnih genov. Adaptivna termogeneza Debelost je kronična presnovna bolezen, ki je posledica porušenega ravnotežja med vnosom in porabo energije. Energija se v organizmu porablja na različne načine, med drugim z bazalnim metabolizmom, s fizično aktivnostjo in z adaptivno oz. netresavo termogenezo. Adaptivna termogeneza je fiziološki proces, kjer se energija sprošča v obliki toplote. Porabo energije sprožijo spremenjene razmere v okolju, predvsem stres zaradi izpostavitve mrazu in prekomerno hranjenje (t.i. z dieto sprožena termogeneza). S podhladitvijo organizma se zaradi hipertrofije rjavega maščobnega tkiva, biogeneze mitohondrijev in povečane sinteze in aktivacije razklopnega proteina UCP-1 (angl. uncoupling protein-1) poveča oddajanje energije v obliki toplote (Puigserver in sod., 1998). Do energetskih izgub pride zaradi razklopa sinteze ATP in zgorevanja kisika ter uhajanja protonov skozi notranjo membrano mitohondrijev. Zaradi prekinitve vezave fosfata v oksidativni fosforilaciji teče dihalna veriga v prazno in prosta energija reakcije se sprosti v obliki toplote. Proces adaptivne termogeneze uravnavajo možgani (slika 4), ki zaznajo podhladitev organizma in sprožijo aktivacijo simpatičnega živčevja, sproščanje norepinefrina in posledično aktivacijo ß-adrenergičnih receptorjev na površini celic. V celicah rjavega maščevja se poveča koncentracija cAMP, sekundarnega prenašalca, ki aktivira lipolizo (tj. razgradnjo lipidov) in stimulira aktivacijo transkripcije UCP-1, hipertrofijo rjavega maščobnega tkiva in biogenezo mitohondrijev (Lowell in Spiegelman, 2000). Hkrati se poveča tudi koncentracija termogenega koaktivatorja PGC-1a, ki uravnava biogenezo mitohondrijev. PGC-1a prek indukcije proteina NRF-1 (angl. nuclear respiratory factor-1) aktivira sintezo encimov dihalne verige in mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (mtTFA), ki pa je ključen za aktivacijo transkripcije in podvajanje mtDNA (Puigserver in sod., 1998; Wu in sod., 1999). Zaradi možne vloge adaptivne termogeneze tako v patogenezi kot pri zdravljenju debelosti pri človeku, je zanimanje za ta proces precejšnje. Vlogo PGC-1a v adaptivni termogenezi kaže predvsem njegova povezava s ključnimi tkivi in hormoni, vključenimi v ta tkivno-specifični proces. Splošno sprejeto mnenje je, da imata pomembno vlogo predvsem skeletno mišičje in rjavo maščevje - s podhladitvijo organizma se namreč v skeletnem mišičju in rjavem maščevju, ne pa tudi v drugih tkivih, sproži izražanje PGC-1a (Puigserver in sod., 1998). Pri majhnih sesalcih, kot so npr. miši in podgane, poteka adaptivna termogeneza v glavnem v mitohondrijih rjavih maščobnih celic in skeletnega mišičja, medtem ko ima pri večjih živalih in človeku osnovno vlogo v termogenezi skeletno mišičje (Wu in sod., 1999). Znanih je veliko genov, ki so neposredno udeleženi v adaptivni termogenezi, transkripcijsko uravnavanje tega procesa pa do danes še ni docela znano. Obetaven pristop k rešitvi tega vprašanja je preučevanje diferenciacije in izražanja genov v celicah rjavega maščevja. Vlogo rjavega maščevja v obrambi organizma pred debelostjo so razjasnili z odstranitvijo tega tkiva pri miškah; miške brez rjavega maščevja so zelo debele in slabo odzivne na inzulin (angl. insulin resistance), poleg tega pa so zanje značilne tudi druge bolezenske spremembe, povezane z debelostjo (Lowell in sod., 1993; Lowell, 1998). Analiza vloge rjavega maščevja pri človeku in drugih velikih sesalcih je bolj kompleksna. Odrasli ljudje namreč nimajo definiranih področij rjavega maščobnega tkiva, pač pa so celice rjavega maščevja razpršene med celicami belega maščobnega tkiva (Krief in sod., 1993). Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 105 Slika 4. Uravnavanje biogeneze mitohondrijev s termogenim koaktivatorjem PGC-1a (prirejeno po Wu in sod., 1999). Figure 4. Pathway of mitochondrial biogenesis through PGC-1a (adapted from Wu et al, 1999). ZAKLJUČEK V zadnjih letih smo bili priča izjemnemu porastu znanja o molekulskih mehanizmih uravnavanja adipogeneze. Ta odkritja so vodila do novih vprašanj - zanimiva je predvsem vloga maščob v hrani, ki lahko služijo kot ligandi za PPARy. Na osnovi novejših rezultatov je realno pričakovanje, da bomo na to in podobna vprašanja kmalu znali odgovoriti. Molekulski mehanizmi, povezani s porabo energije in termogenezo pri prašiču, so podobni molekulskim mehanizmom pri človeku. Poznavanje teh presnovnih poti nudi obetavne možnosti za zdravljenje debelosti in diabetesa. Genetske raziskave adipogeneze so nujne za identifikacijo kombinacij genov in mutacij v kodogenih regijah teh genov, ki povečajo dovzetnost za debelost. Razmevanje procesa diferenciacije adipocitov nam omogoča razvoj strategij za spreminjanje aktivnosti transkripcijskih faktorjev s farmacevtskimi učinkovinami, zato so proteini iz družine PPAR vse bolj zanimivi za farmacevtsko industrijo. Glavni razlog je njihova vloga v presnovi maščob, in potencialna vloga v procesih, ki vodijo do ateroskleroze, vnetij, raka in motenj plodnosti. Sintetični ligandi za PPAR, vključno s fibrati in tiazolidindioni (TZD), so se pokazali kot zelo učinkoviti za zdravljenje diabetesa. Farmakološki pristop k povečevanju količine ali aktivnosti PGC-1a bi bil sprejemljiv, če ne bi imel neželenih učinkov. Za razvoj uspešnih aplikacij je potrebno še podrobnejše znanje o delovanju PGC-1a, ki v glavnem temelji na fizioloških raziskavah v celičnih kulturah. Novejše raziskave na transgenih miših so pokazale, da ima lahko čezmerno izražanje PGC-1a neželene učinke (pri transgenih miših so namreč opazili kardiomiopatije) in da je ustrezno uravnavanje 106 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. izražanja PGC-1? ključno za nemoten razvoj. Nadaljnji študij živalskih modelov z izničenim genom za PGC-1? ali s specifičnimi aleli PGC-1? bo omogočil oceno pozitivnih in negativnih učinkov, ki jih povzroča spremenjena raven izražanja PGC-1?. CONCLUSION As outlined above, recent years have witnessed a phenomenal increase in knowledge regarding the molecular control of adipogenesis. These findings now lead to next level of questions. Of particular interest is the role of dietary fats to serve as precursors to PPAR? ligands. Based upon recent progress, it is likely that answers to these questions will be forthcoming. Molecular mechanisms related to energy expenditure and thermogenesis in pigs are similar with the molecular mechanisms in humans. These pathways can be used as novel therapeutic approaches for the treatment of obesity and diabetes. Genetic approaches are critical in identifying the combination of genes and mutations that predispose to obesity. Knowledge of adipocyte differentiation process (adipogenesis) permits us to devise strategies to modulate the activity of transcription factors by drugs. PPARs are now attracting the attention of pharmaceutical industry. They play a key role in lipid metabolism and have potential roles in atherosclerosis, inflammation, cancer and infertility. Synthetic PPAR ligands includig fibrates and tiazolidinediones (TZDs), have proven effective in the treatment of diabetes. Pharmacological strategies to increase the amount or activity of PGC-1? could also be useful, if this can be done without deleterious effect. Of course, the likelyhood of success depends upon better understanding of the function of PGC-1?. Physiologicl roles of PGC-1? in energy homeostasis have been tested for the most part in cell culture systems. Recent studies with transgenic mice have shown, that too much PGC-1? can be undesirable (transgenic mice develop cardiomyopathy) and that approopriate regulation of this coactivator is important. Future studies in animal models with loss of PGC-1? function and/or specific alleles of PGC-1? will be necessary to elucidate beneficial and adverse effects of PGC-1?. VIRI Esterbauer, H./ Oberkofler, H./ Krempler, F./ Patsch, W. Human peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PPARGC1) gene: cDNA sequence, genomic organization, chromosomal localization, and tissue expression. Genomics, 62(1999), 98–102. Fajas, L./ Fruchart, J.C./ Auwerx, J. Transcriptional control of the adipogenesis. Curr Opin Cell Biol, 10(1998), 165–173. Goto, M./ Terada, S./ Kato, M./ Katoh, M./ Yokozeki, T./ Tabata, I./ Shimokawa, T. cDNA cloning and mRNA analysis of PGC-1 in epitrochlearis muscle swimming-exercised rats. Biochem. Biophys. Res. Commun., 274(2000), 350–354. Herzig, S./ Long, F./ Jhala, U.S./ Hedrick, S./ Quinn, R./ Bauer, A./ Rudolph, D./ Schutz, G./ Yoon, C./ Puigserver, P./ Spiegelman, B./ Montminy, M. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature, 413(2001), 179–183. Houseknecht, K.L./ Bidwell, C.A./ Portocarrero, C.P./ Spurlock, M.E. Expression and cDNA cloning of porcine peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR?). Gene, 225(1998), 89–96. Kakuma, T./ Wang, Z.W./ Pan, W./ Unger, R.H./ Zhou, Y.T. Role of leptin in peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 expression. Endocrinol., 141(2000)12, 4576–4582. Knutti, D./ Kralli, A. PGC-1, a versatile coactivator. Trends Endocrinol. Metabol., 12, 8(2001), 360–365. Knutti, D./ Kressler, D./ Kralli, A. Regulation of the transcriptional coactivator PGC-1 via MAPK-sensitive interaction with a repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(2001)17, 9713–9718. Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 107 Krief, S./ Lonnqvist, F./ Raimbault, S./ Baude, B./ Van Spronsen, A./ Arner, P./ Strosberg, A.D./ Ricquier, D./ Emorine, L.J. Tissue distribution of beta 3-adrenergic receptor mRNA in man. J. Clin. Invest., 91(1993), 344-349. Larrouy, D./ Vidal, H./ Andreelli, F./ Laville, M./ Langin, D. Cloning and mRNA tissue distribution of human PPAR-gamma coactivator-1. Int. J. Obesity, 23(1999), 1327-1332. Lehman, J.J./ Barger, P.M./ Kovacs, A./ Saffitz, J.E./ Medeiros, D.M./ Kelly, D.P. Peroxisome proliferator-activated receptor y coactivator-1 promotes cardiac mitochondrial biogenesis. J. Clin. Invest., 106(2000)7, 847-856. Lin, J./ Puigserver, P./ Donovan, J./ Tarr, P./ Spiegelman, B.M. Peroxisome proliferator-activated receptor y coactivator 1ß (PGC-1ß), a novel PGC-1-related transcriptional coactivator associated with host cell factor. J. Biol. Chem., 277(2002)3, 1645-1648. Lowell, B.B. Adaptive thermogenesis. Turning on the heat. Curr. Biol., 8(1998)15, R517-R520. Lowell, B.B./ Spiegelman, B.M. Towards a molecular understanding of adaptive thermogenesis. Nature, 404(2000), 652-660. Lowell, B.B./ Susulic, S./ Hamann, A./ Lawitts, J.A./ Himms-Hagen, J./ Boyer, B.B./ Kozak, L.P./ Flier, J.S. Development of obesity in transgenic mice after genetic ablation of brown adipose tissue. Nature, 366(1993), 740-742. Miloševič Berlič, T./ Kokalj-Vokac, N./ Anderson, S.I./ Archibald, A.L./ Dovc, P. Porcine Peroxisome Proliferator- Activated Receptor-Gamma Coactivator-1 (PPARGC1) gene: cDNA sequence, chromosomal localization and polymorphisms. Anim. Genet. In press. Miloševič Berlič, T. Molekulski mehanizmi uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva pri prašiču (Sus scrofa). Doktorska disertacija, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinani podiplomski študij botehnologije, 2002. Puigserver, P./ Adelmant, G./ Wu, Z./ Fan, M./ Xu, J./ O'Malley, B./ Spiegelman, B.M. Activation of PPAR-gamma coactivator-1 through transcription factor docking. Science, 286(1999), 1368-1371. Puigserver, P./ Wu, Z./ Park, C.W./ Graves, R./ Wright, M./ Spiegelman, B.M. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell, 92(1998), 829-839. Rankinen, T./ Perusse, L.,/ Weisnagel, S.J.,/ Snyder, E.E./ Chagnon, Y.C./ Bouchard, C. The Human Obesity Gene Map: The 2001 Update. Obesity Research, 10(2002)3, 196-225. Rosen, E.D./ Walkey, C.J./ Puigserver, P./ Spiegelman, B.M. Transcriptional regulation of adipogenesis. Genes Dev., 14(2000), 1293-1307. Rosenfeld, M.G./ Glass, CK. Coregulator codes of transcriptional regulation by nuclear receptors. J. Biol. Chem., 276(2001)40, 36965-36868. Spiegelman, B.M./ Puigserver, P./ Wu, Z. Regulation of adipogenesis and energy balance by PPARy and PGC-1. Int. J. Obesity, 24(2000)4, S8-S10. Sundvold, H./ Grindflek, E./ Lien S. Tissue distribution of porcine proxisome proliferator-activatd receptor a: detection of alternatively spliced mRNA. Gene, 273(2001), 105-113. Tontonoz, P./ Hu, E./ Spiegelman, B.M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPARy2, a lipid-activated transcription factor. Cell, 79(1994), 1147-1156. Weller, J.I./ Kashi, Y./ Soller, M. Power of daughter and granddaughter designs for determining linkage between marker loci and quantitative trait loci in dairy cattle. J. Dairy Sci., 73(1990)9, 2525-2537. Wu, Z./ Puigserver, P./ Andersson, U./ Zhang, C./ Adelmant, G./ Mootha, V./ Troy, A./ Cinti, S./ Lowell, B.B./ Scarpulla, R.C./ Spiegelman, B.M. Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Cell, 98(1999), 115-124.