UNIVERZA!V!LJUBLJANI! VETERINARSKA!FAKULTETA! ! ! ! ! Tanja!Španić! ! ! ! ! ! HORMONSKO(ODVISNA(IN(HORMONSKO( NEODVISNA(SPOLNA(DIFERENCIACIJA(MOŽGANOV( MIŠI(BREZ(GENA( SF#1( ! ! ! ! Doktorska!disertacija! ! ! ! ! ! ! ! ! Ljubljana,!2015! ! ! ! ! UNIVERZA!V!LJUBLJANI! VETERINARSKA!FAKULTETA! ! UDK:!575.11:612.6.057:612.8.05:591.5:612.616.31:599.323:602.6(043.3)! ! Tanja!Španić,!dr.!vet.!med.! ! ! ! ! HORMONSKO(ODVISNA(IN(HORMONSKO( NEODVISNA(SPOLNA(DIFERENCIACIJA(MOŽGANOV( MIŠI(BREZ(GENA( SF#1( ! Doktorska!disertacija! ! ! HORMONE(DEPENDENT(AND(HORMONE( INDEPENDENT(BRAIN(SEXUAL(DIFFERENTIATION(IN( MICE(LACKING( SF#1% GENE( Doctoral!Dissertation! ! ! ! ! ! ! Ljubljana,!2015! ! Avtorica:!Tanja!Španić! ! Naslov!doktorske!disertacije:!HORMONSKO!ODVISNA!IN!HORMONSKO! NEODVISNA!SPOLNA!DIFERENCIACIJA!MOŽGANOV!MIŠI!BREZ!GENA! SF#1( ! Delo! je! bilo! opravljeno! v! Centru! za! genomiko! živali! Veterinarske! fakultete! v! Ljubljani.! Predstojnik:!prof.!dr.!Gregor!Majdič! ! ! ! Mentor:!prof.!dr.!Gregor!Majdič! ! ! ! Člani!strokovne!komisije!za!oceno!in!zagovor:! prof.!dr.!Milka!Vrecl,!predsednica! prof.!dr.!Jelka!Zabavnik!Piano,!članica! prof.!dr.!Marjan!Slak!Rupnik,!član! ! ! ! ! ! ! ! ! Izjavljam,! da! je! doktorska! disertacija! rezultat! lastnega! raziskovalnega! dela,! da! so! rezultati! korektno! navedeni! in! nisem! kršila! avtorskih! pravic! in! intelektualne! lastnine!drugih.!! Doktorandka:!Tanja!Španić!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! !! ! !! !! ! !! !! ! !! ! !! !! ! !! !! ! !! ! ”No!one!will!ever!win!the!battle!of!the!sexes.!! There!is!too!much!fraternizing!with!the!enemy.!”! Henry!Kissinger! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! From!me!to!you…! ! ! ! ! ! !! !! ! !! ! !! !! ! !! ! !! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 1! brez,gena,SF#1, Kazalo& KAZALO!TABEL! 5! KAZALO!SLIK! 6! IZVLEČEK! 9! ABSTRACT! 10! OKRAJŠAVE! 11! 1! UVOD! 15! 1.1! NAMEN!DELA!IN!HIPOTEZE! 16! 2! PREGLED!LITERATURE! 17! 2.1! NASTANEK!RAZLIK!MED!SPOLOMA! 17! 2.1.1! RAZVOJ!SPOLNIH!ORGANOV! 18! 2.1.1.1! Razvoj!mod! 18! 2.1.1.2! Razvoj!jajčnikov! 19! 2.1.2! KROMOSOMSKA!SPOLNA!DIFERENCIACIJA! 20! 2.1.2.1! Potek!procesa!utišanja!enega!izmed!kromosomov!X! 21! 2.1.3! GENETSKA!SPOLNA!DIFERENCIACIJA! 22! 2.1.4! HORMONSKA!SPOLNA!DIFERENCIACIJA! 25! 2.2! RAZLIKE!MED!SPOLOMA!V!MOŽGANIH! 26! 2.2.1! NASTANEK!RAZLIK!MED!SPOLOMA!V!MOŽGANIH! 26! 2.2.2! SPOLNO!RAZLIČNA!PODROČJA!V!MOŽGANIH! 29! 2.2.3! SPOLNO!DIMORFNA!PODROČJA!V!MOŽGANIH!PRI!LJUDEH! 34! 2.3! MIŠI!BREZ!GENA!ZA!STEROIDOGENI!DEJAVNIK!1! 35! 2.3.1! STEROIDOGENI!DEJAVNIK!1!–!SFk1! 35! 2.3.2! PRIPRAVA!TRANSGENIH!MIŠI!BREZ! SF#1! 36! 2.3.3! FENOTIP!MIŠI!Z!MUTACIJO!V!GENU! SF#1!IN!NJIHOVA!UPORABNOST! 37! 2.4! OBNAŠANJE! 38! 2.4.1! O!OBNAŠANJU!IN!O!PROUČEVANJU!OBNAŠANJA! 38! ! 2! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 2.4.2! SPOLNO!POGOJENA!OBNAŠANJA! 40! 2.4.2.1! Proučevanje!spolno!pogojenega!obnašanja!pri!modelnih!organizmih! 41! 2.4.2.2! Žensko!spolno!obnašanje! 43! 2.4.2.3! Agresivno!obnašanje! 44! 2.5! POMEN!PROUČEVANJA!RAZLIK!MED!SPOLOMA! 48! 3! MATERIALI!IN!METODE! 51! 3.1! VZREJA!IN!PRIPRAVA!ŽIVALI!ZA!POSKUS! 51! 3.1.1! VZREJA!ŽIVALI! 51! 3.1.2! PRIPRAVA!POSKUSNIH!ŽIVALI! 51! 3.1.2.1! Priprava!živali!za!ugotavljanje!izražanja!genov!v!možganih! 51! 3.1.2.2! Priprava!miši!za!ugotavljanje!vpliva!testosterona!na!obnašanje!in!izražanje! genov!v!možganih! 52! 3.1.3! DOLOČANJE!GENOTIPA!ŽIVALI! 54! 3.1.4! OPERATIVNA!ODSTRANITEV!SPOLNIH!ŽLEZ!PRI!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA!IN!SLEPA!OPERACIJA! PRI!MIŠIH!BREZ!GENA! SF#1! 55! 3.2! PRIPRAVA!HORMONOV!IN!NJIHOVA!UPORABA! 56! 3.2.1! KORTIKOSTEROIDNI!HORMONI! 56! 3.2.2! PRIPRAVA!ESTRADIOL!BENZOATA! 56! 3.2.3! PRIPRAVA!PROGESTERONA! 56! 3.2.4! UPORABA!SPOLNIH!HORMONOV!ESTRADIOL!BENZOATA!IN!PROGESTEONA! 56! 3.2.5! PRIPRAVA!TESTOSTERONSKIH!VSADKOV! 57! 3.3! PROUČEVANJE!IZRAŽANJA!GENOV!V!MOŽGANIH! 57! 3.3.1! IZOLACIJA!RNA! 57! 3.3.2! MIKROMREŽE! 58! 3.3.3! PRIPRAVA!KOMPLEMENTARNE!DNA!(CDNA)! 59! 3.3.4! REAKCIJA!PCR!V!REALNEM!ČASU!OZIROMA!KVANTITATIVEN!PCR!V!REALNEM!ČASU! (QPCR)! 60! 3.3.5! IMUNOHISTOKEMIČNO!BARVANJE!SVEŽIH,!PLAVAJOČIH!REZIN!ZA!PROUČEVANJE!IZRAŽANJA! GENOV! ! 63! 3.3.5.1! Analiza!področij!v!možganih! 64! 3.3.5.2! Zajemanje!digitalnih!slik!za!analizo! 64! 3.4! IZVEDBA!POSKUSOV!OBNAŠANJA! 65! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 3! brez,gena,SF#1, 3.4.1! POSKUS!ŽENSKEGA!SPOLNEGA!OBNAŠANJA! 66! 3.4.2! POSKUS!AGRESIVNEGA!OBNAŠANJA! 67! 3.5! STATISTIČNA!OBDELAVA!PODATKOV! 68! 3.5.1! ANALIZA!REZULTATOV!DNAkMIKROMREŽ! 68! 3.5.2! ANALIZA!REZULTATOV!QPCR! 69! 3.5.3! ANALIZA!REZULTATOV!TESTOV!OBNAŠANJA! 70! 4! REZULTATI! 71! 4.1! IZRAŽANJE!GENOV!V!VMESNEM!DELU!MOŽGANOV!PRI!MIŠIH!BREZ! SF#1%IN!PRI!MIŠIH! DIVJEGA!TIPA! 71! 4.1.1! IZRAŽANJE!GENOV!V!OSREDNJEM!DELU!MOŽGANOV!NA!DNAkMIKROMREŽAH! 71! 4.1.2! PREVERJANJE!IZRAŽANJA!GENOV!V!VMESENEM!DELU!MOŽGANOV!Z!METODO!QPCR! 73! 4.2! OBNAŠANJE!MIŠI!PO!DODAJANJU!TESTOSTERONA! 76! 4.2.1! IZRAŽANJE!ŽENSKEGA!SPOLNEGA!OBNAŠANJA!PRI!MIŠIH!SFk1!KO!IN!GDX/WT!PO! DODAJANJU!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU! 77! 4.2.2! AGRESIVNO!OBNAŠANJE!PRI!MIŠIH!SFkKO!IN!GDX/WT!PO!DODAJANJU!TESTOSTERONA!V! OBDOBJU!OB!ROJSTVU! 83! 4.3! VPLIV!DODAJANJA!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU!NA!IZRAŽANJE!BELJAKOVIN! KALBINDIN!IN!ARGININ!VAZOPRESIN!V!VMESNIH!MOŽGANIH!PRI!MIŠIH!BREZ! SF#1!IN!MIŠIH! DIVJEGA!TIPA! 86! 4.3.1! IZRAŽENOST!BELJAKOVINE!KALBINDIN!V!VMESNIH!MOŽGANIH! 86! 4.3.2! IZRAŽENOST!BELJAKOVINE!ARGININ!VAZOPRESIN!V!VMESNIH!MOŽGANIH! 88! 5! RAZPRAVA! 93! 5.1! RAZLIKE!V!IZRAŽANJU!GENOV!V!VMESNEM!DELU!MOŽGANOV!PRI!MIŠIH!BREZ! SF#1%IN!PRI! MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! 94! 5.2! VPLIV!DODAJANJA!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU!NA!OBNAŠANJE!PRI!MIŠIH! BREZ!GENA! SF#1!IN!GONADEKTOMIZIRANIH!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! 98! 5.2.1! ŽENSKO!SPOLNO!OBNAŠANJE!PO!DODAJANJU!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU! 99! 5.2.2! AGRESIVNO!OBNAŠANJE!PO!DODAJANJU!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU! 102! 5.3! VPLIV!TESTOSTERONA!V!OBDOBJU!OB!ROJSTVU!NA!IZRAŽANJE!KALBINDINA!IN!ARGININ! VAZOPRESINA!V!VMESNIH!MOŽGANIH!PRI!MIŠIH!BREZ!GENA! SF#1!IN!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! 104! 5.3.1! IZRAŽENOST!BELJAKOVINE!KALBINDIN!(CALB)!V!VMESNIH!MOŽGANIH! 104! ! 4! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 5.3.2! IZRAŽENOST!BELJAKOVINE!ARGININ!VAZOPRESIN!(AVP)!V!VMESNIH!MOŽGANIH! 106! 6! ZAKLJUČKI! 109! 7! POVZETEK! 110! 8! SUMMARY! 113! 9! ZAHVALA! 116! 10! REFERENCE! 117! ! ( & ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 5! brez,gena,SF#1, Kazalo!tabel! Tabela! 1:! Prikaz! aplikacije! TP! po! skupinah! (TPkE! –! živali! so! prejemale! TP! samo! pred! rojstvom;! TPkPN! –! živali! so! prejemale! TP! samo! po! rojstvu;! TPkE&PN! –! živali!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu;!KkK!–!kontrolne!živali,!ki!so!v!obeh! obdobjih!prejemale!samo!olje).!............................................................................................!53! Tabela! 2:! Uradne! oznake,! polna! imena,! druga! imena! in! dostopna! številka! v! bazi! NCBI!Gene!za!posamezen!gen!in!naloge,!ki!jih!opravlja.!...........................................!62! Tabela! 3:! Tabela! prikazuje! število! živali! uporabljenih! v! testih! obnašanja! in! za! analizo!izražanja!genov!v!možganih!glede!na!tretiranje!s!TP!in!po!posameznih! genotipih.!.......................................................................................................................................!65! , ! , ! 6! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Kazalo!slik! Slika!1:!Slika!prikazuje!mišje!možgane!v!vzdolžnem!prerezu.!Preiskovano!področje! je! označeno! med! dvema! črtkanima! črtama.! Vir! slike! je! The! Mouse! Brain! in! Stereotaxic!Coordinates!(291).!.............................................................................................!71! Slika!2:!Grafični!prikaz!primerjave!izražanja!genov!na!DNAkmikromrežah!pri!SFk1! KO!samcih!(KO!M)!in!SFk1!KO!samicah!(KO!F)!(KO!M!vs.!KO!F)!ter!pri!CAS/WT! samcih!(WT!M)!in!OVX/WT!samicah!(WT!F)!(WT!M!vs.!WT!F).!V!vsaki!skupini! so!bile!po!tri!živali.!.....................................................................................................................!72! Slika!3:!Grafični!prikaz!relativne!izraženosti!genov! Uty,,Eif2s3y,,Ddx3y,,Kdm5d!pri! samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!CAS/WT!(WT!M).!.................................................................!73! Slika! 4:! Grafični! prikaz! relativne! izraženosti! Eif2s3x! pri! samicah! SFk1! KO! (KO! F),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!pri!samcih!CAS/WT!(WT! M).!.....................................................................................................................................................!74! Slika! 5:! Grafični! prikaz! relativne! izraženosti! Xist#a,! gena,! ki! je! odgovoren! za! inaktivacijo!enega!kromosoma!X!pri!samicah.!..............................................................!75! Slika! 6:! Grafični! prikaz! relativne! izraženosti! Utx, pri! samicah! SFk1! KO! (KO! F),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!pri!samcih!CAS/WT!(WT! M).!.....................................................................................................................................................!76! Slika!7:!Grafični!prikaz!količnika!lordoze!(LQ)!–!povprečja!vseh!petih!analiziranih! testov!ženskega!spolnega!obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk 1!KO!(KO!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh! štirih!različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju! pred! rojstvom! (TPkE),! TP! v! obdobju! po! rojstvu! (TPkPN)! in! TP! tako! pred! kot! tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).!....................................................................................................!78! Slika!8:!Grafični!prikaz!števila!lordoz!5!(L5)!pri!zadnjem!testu!ženskega!spolnega! obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk1!KO!(KO!F),!samcih!SFk1! KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in! sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom!(TPkE),!TP!v! obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).!.!79! Slika!9:!Grafični!prikaz!količnika!lordoze!(LQ)!pri!samicah!OVX/WT!za!posamezen! test! v! različno! tretiranih! skupinah! (brez! dodajanja! TP! –! WT! F! K;! tiste,! ki! so! prejemale!TP!samo!pred!rojstvom!–!WT!F!E;!tiste,!ki!so!prejemale!TP!samo!po! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 7! brez,gena,SF#1, rojstvu!–!WT!F!PN;!tiste,!ki!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu!–!WT!F!E&TP). !............................................................................................................................................................!80! Slika!10:!Grafični!prikaz!števila!naskokov!v!vseh!petih!analiziranih!testih!ženskega! spolnega! obnašanja! pri! samicah! OVX/WT! (WT! F),! samicah! SFk1! KO! (KO! F),! samcih! SFk1! KO! (KO! M)! in! samcih! CAS/WT! (WT! M)! pri! vseh! štirih! različnih! tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom! (TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu! (TPkE&PN).!....................................................................................................................................!81! Slika!11:!Grafični!prikaz!števila!poskusov!naskokov!v!vseh!petih!analiziranih!testih! ženskega!spolnega!obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk1!KO! (KO!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh!štirih! različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred! rojstvom!(TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po! rojstvu!(TPkE&PN).!....................................................................................................................!82! Slika! 12:! Grafični! prikaz! števila! ugrizov! in! napadov! v! prvem! testu! agresivnega! obnašanja!pri!samcih!CAS/WT!(WT!M),!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1! KO!(KO!M)!in!samicah!SFk1!KO!(KO!F)!pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in! sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom!(TPkE),!TP!v! obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).!. 83! Slika! 13:! Grafični! prikaz! povprečja! skupnega! števila! ugrizov! in! napadov! v! vseh! testih!agresivnega!obnašanja!pri!samcih!CAS/WT!(WT!M),!samicah!OVX/WT! (WT! F),! samcih! SFk1! KO! (KO! M)! in! samicah! SFk1! KO! (KO! F)! pri! vseh! štirih! različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred! rojstvom!(TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po! rojstvu!(TPkE&PN).!....................................................................................................................!84! Slika!14:!Grafični!prikaz!časa!v!sekundah!od!začetka!testa!do!prvega!agresivnega! dogodka! v! vseh! testih! agresivnega! obnašanja! pri! samcih! CAS/WT! (WT! M),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samicah!SFk1!KO!(KO!F)! pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v! obdobju! pred! rojstvom! (TPkE),! TP! v! obdobju! po! rojstvu! (TPkPN)! in! TP! tako! pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).!.................................................................................!85! Slika! 15:! Prikaz! izražanja! kalbindina! v! MPOA! pri! miših! GDX/WT! in! SFk1! KO! po! dodajanju!TP!v!različnih!obdobjih!(40kkratna!povečava).!Na!delu,!ki!prikazuje! ! 8! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! WT! samca! brez! dodajanja! TP! je! obkroženo! t.i.! SDNkPOA.! To! področje! smo! primerjali!z!vsemi!ostalimi!skupinami.!.............................................................................!87! Slika! 16:! Prikaz! izražanja! kalbindina! v! MPOA! pri! miših! GDX/WT! in! SFk1! KO! po! različnih! tretmajih! s! TP! (100kkratna! povečava).! Na! delu,! ki! prikazuje! WT! samca! brez! dodajanja! TP! je! obkroženo! t.i.! SDNkPOA.! To! področje! smo! primerjali!z!vsemi!ostalimi!skupinami.!.............................................................................!87! Slika!17:!Prikaz!izražanja!arginin!vazopresina!(AVP)!v!LS!pri!miših!GDX/WT!in!SFk 1!KO!po!različnih!tretmajih!s!TP!(40kkratna!povečava).!Na!delu,!ki!prikazuje! WT! samca! brez! dodajanja! TP,! je! označena! združena! anteriorna! komisura! (aca),!septofimbrialno!jedro!(SFi)!in!LS.!...........................................................................!88! Slika!18:!Prikaz!izražanja!AVP!v!LS!pri!WT!in!SFk1!KO!miših!po!različnih!tretmajih!s! TP!(100kkratna!povečava).!Povečano!je!prikazano!področje!LS.!..........................!88! , , ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 9! brez,gena,SF#1, HORMONSKO(ODVISNA(IN(HORMONSKO(NEODVISNA(SPOLNA(DIFERENCIACIJA( MOŽGANOV(MIŠI(BREZ(GENA( SF#1! Izvleček! Ključne!besede:!nevroendokrinologija!–!veterinarska;!spol,!diferenciacija;!možgani! –! rast! in! razvoj;! spolno! vedenje! živali! –! fiziologija;! regulacija! genskega! izražanja;! spolni! kromosomi;! testosteron! –! fiziologija;! miši! z! odstranjenim! genom;! steroidogeni!dejavnik!1.! Steroidogeni! dejavnik! 1! (SFk1,! NR5A1)! ima! pomembno! vlogo! pri! razvoju! in! delovanju! endokrinega! sistema.! Pri! miših! brez! gena! SF#1! (SFk1! KO)! pride! že! v! zgodnjem! embrionalnem! razvoju! do! propada! zametkov! spolnih! in! nadledvičnih! žlez,!zato!te!miši!niso!nikoli!izpostavljene!lastnim!spolnim!hormonom.! SF#1!je!pri! miših! v! možganih! specifično! izražen! v! ventromedialnem! jedru! hipotalamusa! (VMH),! ki! se! v! njegovi! odsotnosti! ne! razvije! pravilno.! Miši! SFk1! KO! so! primeren! model!za!proučevanje!ločenega!vpliva!hormonov!in!genov!na!spolno!diferenciacijo.! Naše! raziskave! so! pokazale,! da! se! nekateri! geni,! ki! se! nahajajo! na! kromosomu! Y! ( Uty,, Eif2s3y,, Ddx3y,, Kdm5d)! in! na! kromosomu! X! ( Xist),! izražajo! v! možganih! neodvisno! od! prisotnosti! spolnih! hormonov.! Omenjeni! geni! so! različno! izraženi! med!spoloma!tako!pri!miših!SFk1!KO!kot!pri!miših!GDX/WT,!kar!kaže,!da!tudi!geni! sodelujejo!pri!spolni!diferenciaciji!v!možganih.! Proučevali! smo! tudi! vpliv! dodajanja! testosteron! propionata! (TP)! v! obdobju! ob! rojstvu!na!defeminizacijo!in!maskulinizacijo.!Z!opazovanjem!ženskega!spolnega!in! agresivnega!obnašanja!smo!ugotovili,!da!je!tretiranje!s!TP!tik!po!rojstvu!imelo!večji! vpliv! na! maskulinizacijo! v! obnašanju.! Ti! rezultati! se! ujemajo! tudi! z! izražanjem! beljakovin!kalbindin!(Calb)!in!arginin!vazopresin!(AVP)!v!možganih.!Pri!izražanju! kalbindina!smo!ugotovili,!da!je!za!maskulinizacijo!mišjih!možganov!pomembnejše! obdobje!tik!po!rojstvu,!saj!se!je!v!medialnem!predoptičnem!področju!t.i.!jedro!SDNk POA! izrazilo! pri! samicah! OVX/WT! in! miših! SF1kKO! samo! po! dodajanju! TP! po! rojstvu! ali! v! obeh! obdobjih.! Pri! samcih! WT! pa! je! lekto! prisotno! ne! glede! na! dodajanje!eksogenega!TP.!Do!podobnih!ugotovitev!smo!prišli!tudi!pri!proučevanju! izražanja!AVP!v!stranskem!pretinu!(LS),!s!to!razliko,!da!so!imuonopozitivna!vlakna! prisotna!pri!vseh!genotipih,!saj!je!to!posledica!aktivacijskega!učinka!testosterona. ! ! ! 10! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! HORMONE(DEPENDENT(AND(HORMONE(INDEPENDENT(BRAIN(SEXUAL( DIFFERENTIATION(IN(MICE(LACKING( SF#1% GENE( Abstract! Key!words:!neuroendocrinology!–!veterinary;!sex!differentiation!–!genetics;!brain!–! growth!and!development;!sexual!behaviour,!animal!–!physiology;!gene!expression,! regulation;! sex! chromosomes;! testosterone! –! physiology;! mice,! knockout! –! genetics;!steroidogenic!factor!1.! Steroidogenic! factor! 1! (SFk1,! NR5A1)! has! an! important! role! in! the! development! and! function! of! endocrine! system.! Mice! lacking! SF#1! gene! (SFk1! KO)! exhibit! an! early! developmental! regression! of! genital! ridges;! consequently! they! are! born! without! adrenal! glands! and! gonads,! and! are! therefore! they! never! exposed! to! endogenous! sex! steroid! hormones.! In! the! mouse! brain! SF#1! is! specifically! expressed! in! the! ventromedial! nucleus! of! the! hypothalamus! (VMH)! and! in! its! absence,! the! VMH! is! not! developed! properly.! Because! of! the! absence! of! endogenous!sex!steroids,!they!provide!an!excellent!model!for!separately!studying! the!influence!of!sex!steroid!hormones!and!genes!on!sexual!differentiation.! Our! study! shows! that! some! Ykchromosome! linked! genes! ( Uty,, Eif2s3y,, Ddx3y,, Kdm5d)! and! Xkchromosome! linked! gene! ( Xist)! are! expressed! in! the! brain! independently!of!the!sex!hormones,!since!they!are!differently!expressed!between! sexes!in!SFk1!KO!and!GDX/WT!mice.!This!shows!that!some!genes!also!have!a!role!in! sexual!differentiation!of!the!brain.! We!also!studied!the!influence!of!the!treatment!with!testosterone!propionate!(TP)! in!the!period!around!birth!on!the!defeminisation!and!masculinisation.!Results!from! female! sexual! and! aggressive! behaviour! revealed! that! treatment! with! TP! shortly! after!birth!had!a!greater!influence!on!masculinisation!in!behaviour.!In!the!medial! preoptic! area! calbidin! (Calb)! immunopositive! cells,! which! form! SDNkPOA,! were! present!in!OVX/WT!females!and!SFk1!KO!mice!only!when!they!were!treated!with! TP!after!birth!or!before!and!after!birth.!In!CAS/WT!males!this!nucleus!is!present! regardless! the! presence! of! exogenous! TP.! Similar! was! seen! in! expression! of! arginine!vasopressin!(AVP)!in!LS!where!the!immunopositive!fibres!were!present!in! all!genotypes!because!of!the!activation!effect!of!testosterone.! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 11! brez,gena,SF#1, Okrajšave! AH! medialni!hipotalamus;! angl.!anterior!hypothalamus! ALC! odrasle!Leydigove!celice;! angl.!adult!Leydig!cells! AMH! antimüllerjev!hormon! AR! androgenski!receptor! Arc! arkvatno!jedro;! angl.!arcuate!nucleus! AVP! arginin!vazopresin,! tudi!antidiuretični!hormon! AVPV! anteroventralni! del! periventrikularno! jedro;! angl.! anteroventral!periventricular!nucleus! BNST! spodnje! jedro! končne! strije;! angl.! bed! nucleus! of! the! stria! terminalis! BNSTM! medialni!del!spodnjega!jedra!končne!strije;! angl.!bed!nucleus!of! stria!terminaliskmedial! Calb! kalbindin!Dk28k,! angl.!calbindin! cc! možganski!prečnik,! corpus! calosum! DAX1! DSSkAHC$ kritično$ področje$ na$ kromosomu$ X;$ angl.! DSSkAHC! critical!region!on!the!X!chromosome! DNA! deoksiribonukleinska!kislina! DR! jedro!dorzalne!rafe;! angl.!dorsal!raphe!nucleus! E! embrionalni!dan,! angl.!embryonic!day! ER! estrogenski!receptor! FLC! zarodkove!Leydigove!celice;! angl.!fetal!Leydig!cells! GABA! gama!aminokbutirična!kislina; ,angl.!gammakaminobutyric!acid! HMG! homeokzaporedje;! angl.!high!mobility!group!HMGkbox! INAH! intersticialno! jedro! sprednjega! hipotalamusa;! angl., interstitial! nucleus!of!anterior!hypothalamus! L! lordoza,!usločenost!hrbta;! angl.!lordosis! LH! luteinizirajoči!hormon! LQ! Količnik!lordoze;! angl.!lordosis!quotient! LS! stranski!oziroma!lateralni!pretin;! angl.!lateral!septum! MeA! medialni!del!amigdale;! angl.!medial!amygdala! ! ! 12! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! miš!AFP!KO! miš! brez! gena! za! αkfeto! proteina;! angl.! alphakphetoprotein! knockkout!mouse! miš!ArKO! miš!brez!gena!za!encim!aromatazo;! angl.!aromatase!knockkout! mouse! miš!SFk1!KO! miš!brez!gena! SF#1; ! angl.!SFk1!knockout!mouse! miš!SFk1!KO!F! samica!brez!gena! SF#1; ! angl.!SFk1!knockout!mouse;!tudi!KO!F! miš!SFk1!KO!M! samec!brez!gena! SF#1; ! angl.!SFk1!knockout!mouse;!tudi!KO!M! miši!CAS/WT! miš!divjega!tipa!z!odstranjenimi!modi;! angl.!castrated!wild!type! mouse! miši!GDX/WT! miš! divjega! tipa! z! odstranjenimi! spolnimi! žlezami;! angl.! gonadectomized!wild!type!mouse! miši!OVX/WT! miš!divjega!tipa!z!odstranjenimi!jajčniki;! angl.!ovariectomized! wild!type!mouse! miši!WT! miši!divjega!tipa,! angl.!wild!type!mouse! MPOA! osrednji!ali!medialni!del!POA;! angl.!medial!preotic!area! PCR! verižna!reakcija!s!polimerazo! POA! predoptično!področje;! angl.!preoptic!area! PVN! paraventrikularno! jedro! hipotalamusa;! angl.! paraventricular! nucleus!of!the!hypothalamus! qPCR! PCR!v!realnem!času!oziroma!kvantitativni!PCR!v!realnem!času;! angl.!realktime!polymerase!chain!reaction!or!quantitative!realk time!PCR! RNA! ribonukleinska!kislina! RTkPCR! obratni!prepis!in!verižna!reakcija!s!polimerazo!;! angl.!reverse! transcription!polymerase!chain!reaction! SDNkPOA! spolno! dimorfno! jedro! predoptičnega! področja;! angl.! sexually! dimorphic!nucleus!of!the!POA! SFk1! steroidogeni! dejavnik! 1;! angl.! steroidigenic! factor! 1;! tudi! NR5A1! sf#1,,SF#1! gen!za!SFk1! SON! supraoptično!jedro;! angl.!supraoptic!nucleus! SOX9! SRYksorodna! beljakovina! s! homeokzaporedjem;! angl.! SRYk related!HMG!box! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 13! brez,gena,SF#1, Sry! spol% določujoče% področje% na% kromosomu% Y;% sex% determining% region!on!Y!chromosome! TP! testosteron!propionat! TPkE! živali,!ki!so!prejemale!TP!samo!pred!rojstvom! TPkE&PN! živali,!ki!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu! TPkPN! živali,!ki!so!prejemale!TP!samo!po!rojstvom! VMH! ventromedialno! jedro! hipotalamusa;! nucleus, ventromedialis, hypothalami;! angl.!ventromedial!nucleus!of!the!hypothalamus! VMH! ventromedialno! jedro! hipotalamusa;! angl.! ventromedial! nucleus!of!the!hypothalamus! WNT4! član% družine% wingless% mesta% vključitve% MMTV;% angl.! wingless! type!MMTV!integration!site!family!member!4! WT1,,Wt1, prepisovalni!dejavnik!Wilmsovega!tumorja!1! XCI! utišanje! enega! izmed! kromosomov! X;! angl.! X! chromosome! inactivation! XIST! nekodirajoč!del!RNK!na!kromosomu!X,! angl.!Xkinactive!specific! transcript! ! ! ! ! 14! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 15! brez,gena,SF#1, 1 UVOD! Če!se!na!začetku!vprašam:!zakaj!sploh!proučevati!razlike!med!spoloma?!Menim,!da! je!odgovor!na!to!vprašanje!vse!prej!kot!preprost.!! Kot! razlika! med! spoloma! je! definirano! karkoli,! kar! je! zanesljivo! različno! med! moškimi! in! ženskimi! osebki.! To! se! nanaša! na! neko! lastnost! (npr.! lastnost! v! strukturi,!obnašanju,!bolezni!...),!ki!se!med!spoloma!razlikuje!v!povprečju,!varianci,! razponu,!razmerju!…!(1)! Pri!sesalcih!je!genetski!spol!določen!že!ob!združitvi!spolnih!celic!s!komplementom! spolnih! kromosomov! X! in! Y.! Še! pred! začetkom! spolne! diferenciacije! je! v! spolnih! grebenih!izražen!gen! Sry,!ki!se!nahaja!na!kromosomu!Y!in!je!odgovoren!za!razvoj! mod! pri! moških! (XY)! zarodkih! (2).! Moda! nato! izločajo! antimüllerjev! hormon! (AMH),! ki! zavre! razvoj! ženskih! spolnih! organov,! in! testosteron,! ki! sodeluje! pri! razvoju! moških! spolnih! organov! ter! kasneje! sodeluje! pri! razvoju! sekundarnih! spolnih!znakov!(3).! Možgani! so! tudi! spolno! dimorfen! organ,! vendar! tega! ne! moremo! zaznati! na! prvi! pogled.! Spolni! steroidni! hormoni,! ki! jih! v! glavnem! izločajo! spolne! žleze,! imajo! pomembno! vlogo! pri! spolni! diferenciaciji! možganov! in! lahko! vplivajo! na! njihovo! strukturo!začasno!ali!stalno!(4).!Poleg!steroidnih!hormonov!iz!spolnih!žlez!lahko! na! razvoj! zarodka! delujejo! tudi! steroidni! hormoni! iz! nadledvičnih! žlez,! iz! centralnega! živčnega! sistema! (nevrosteroidi),! sosednjih! zarodkov! in! spolni! hormoni!iz!materine!krvi!(5,!6,!7).!Znano!je,!da!se!pri!vretenčarjih!iz!spolnih!žlez! izločajo! spolni! hormoni! skozi! vse! življenje! (4).! Pri! glodavcih! se! že! za! časa! embrionalnega! razvoja! pri! samcih! začne! izločati! testosteron,! medtem! ko! pri! samicah!jajčniki!do!kotitve!ne!izločajo!spolnih!hormonov!(8,!9)!.! V! preteklem! desetletju! so! dokazali,! da! imajo! tudi! geni,! ki! se! nahajajo! na! spolnih! kromosomih,!neposreden!vpliv!na!spolno!diferenciacijo!možganov!pri!sesalcih!in! pticah,!saj!so!potrdili!nekatere!razlike!med!spoloma!že!pred!nastankom!primarnih! steroidnih!tkiv!(10).! ! Znano!je,!da!se!nekatere!duševne!motnje!pojavljajo!pogosteje!pri!ženskah!kot!pri! moških.!To!velja!na!primer!za!depresivno!motnjo!in!motnje!hranjenja,!ki!se!dvakrat! ! 16! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! pogosteje! pojavljajo! pri! ženskah.! Medtem! ko! se! avtistične! motnje,! motnje! hiperaktivnosti!in!pomanjkanja!pozornosti!tudi!do!štirikrat!pogosteje!pojavljajo!pri! moških.! ! Da! bi! razumeli! razlike! med! spoloma! v! možganih! tako! v! strukturi,! pojavnosti! motenj! in! bolezni! ter! v! obnašanju! pri! človeku! velikokrat! pri! temeljnem! proučevanju!teh!vprašanj!uporabimo!živalske!modele,!ki!tako!veliko!doprinesejo!k! temu!razumevanju.!Tudi!miši!brez!gena!za! SF#1!so!eden!izmed!takih!modelov,!saj! zaradi! odsotnosti! nadledvičnih! in! spolnih! žlez! nikoli! niso! izpostavljene! lastnim! spolnim!hormonom,!kar!omogoča!proučevanje!hormonsko!odvisnih!in!hormonsko! neodvisnih! razlik! med! spoloma! tako! v! možganih! in! obnašanju! kot! tudi! v! drugih! organskih!sistemih.! 1.1 NAMEN!DELA!IN!HIPOTEZE! Namen! naših! raziskav! je! bil! ugotoviti! ali! poleg! hormonov! tudi! geni! vplivajo! na! spolno!različno!izražene!gene!v!vmesnem!delu!možganov!in!ali!lahko!z!dodajanjem! eksogenega! testosterona! dosežemo! maskulinizacijo! in! defeminizacijo! v! izražanju! nekaterih!beljakovin!in!v!obnašanju!pri!miših!divjega!tipa!z!odstranjenimi!spolnimi! žlezami!(GDX/WT)!seva!C57BL/6J!in!miših!istega!seva!brez!gena!za!steroidogeni! dejavnik!1!(SFk1!KO).! ! Miši!SFk1!KO!so!dober!model!za!ločeno!proučevanje!vpliva!hormonov!in!genov!na! nastanek!razlik!med!spoloma!v!možganih!in!v!obnašanju,!ker!jim!zaradi!odsotnosti! SF#1! že! v! zgodnjem! embrionalnem! razvoju! propadejo! zametki! spolnih! in! nadledvičnih! žlez.! Tako! miši! SFk1! KO! niso! niti! med! razvojem! niti! po! rojstvu! izpostavljene!lastnim!spolnim!hormonom.! ! V!naših!raziskavah!smo!hoteli!preveriti!naslednje!hipoteze:! k poleg! hormonov! tudi! geni! vplivajo! na! nastanek! razlik! v! izraženosti! genov! med!spoloma!v!možganih;! k dodajanje!spolnih!hormonov!pred!rojstvom!in!po!njem!lahko!pri!miših!brez! gena ,SF#1!povzroči!popolno!maskulinizacijo!njihovih!možganov.! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 17! brez,gena,SF#1, 2 PREGLED!LITERATURE! 2.1 NASTANEK!RAZLIK!MED!SPOLOMA! Že!kot!otroci!opazimo!in!spoznamo!razlike!med!spoloma,!sprva!samo!tiste!vidne!na! zunaj,!kasneje!pa!tudi!druge,!ki!so!nam!na!prvi!pogled!nevidne.! Ključ!do!razumevanja!nastanka!razlik!med!spoloma!leži!v!dejstvu,!da!že!na!začetku! vsaka!zigota!prejme!polovico!genske!zasnove!od!matere!in!polovico!od!očeta.!Zato! pri!sesalcih!z!združitvijo!zrele!jajčne!celice,!ki!nosi!kromosom!X,!in!semenčice,!ki! nosi!kromosom!X!ali!Y,!lahko!nastanejo!potomci!XX,!ki!so!ženskega!spola,!ali!XY,!ki! so! moškega! spola! (11)! in! tako! lahko! biološke! razlike! med! spoloma! pripišemo! spolnima! kromosomoma.! Različice! kromosomskih! komplementov! vodijo! do! nastanka!treh!ključnih!genetskih!razlik!med!spoloma!(12):!moške!celice!vsebujejo! gene!s!kromosoma!Y,!ki!so!pri!ženskih!celicah!odsotni;!ženske!celice!vsebujejo!dve! kopiji! genov! s! kromosoma! X! (ena! kopija! oziroma! en! kromosom! X! je! običajno! že! zelo! zgodaj! inaktiviran! oziroma! utišan! (13))! in! ženske! celice! prejmejo! eno! očetovsko! kopijo! kromosoma! X,! ki! pri! moških! celicah! ni! prisotna.! Te! genetske! razlike!so!vzrok!za!razlike!med!celicami!XX!in!XY.!Najpomembnejša!razlika!nastane! v!spolnih!žlezah,!za!katero!je!odgovoren!gen! Sry, ( angl.!sex!determining!region!on!Y! chromosome),!ki!se!nahaja!na!kromosomu!Y!in!usmeri!nediferencirane!gonade!v! razvoj!mod.!Vloga!gena! Sry!je!podrobneje!opisana!v!poglavju!2.1.3!Genetska!spolna! diferenciacija.! Razvita! moda! pri! moškem! spolu! in! jajčniki! pri! ženskem! izločajo! različne!spolne!hormone,!ki!delujejo!na!druga!tkiva!v!telesu,!da!se!lekta!razvijejo!in! delujejo! različno! v! odraslem! obdobju.! Vplivi! spolnih! hormonov! so! lahko! na! eni! strani!trajni,!nepovratni!ali!t.i.!organizacijski!vplivi!ali!na!drugi!strani!povratni,!t.i.! aktivacijski! vplivi,! ki! trajajo! toliko! časa,! kolikor! so! hormoni! prisotni! (14,! 15).! Velikokrat!je!aktivacijski!vpliv!omejen!že!s!predhodnim!organizacijskim!učinkom! delovanja!spolnih!hormonov.!Oba!načina!delovanja!spolnih!hormonov!pa!sta!vzrok! za!nastanek!razlik!med!spoloma!v!delovanju!različnih!tkiv.!Te!razlike!nas!pripeljejo! do! ključnega! razumevanja! dveh! pojmov,! in! sicer! razlik! med! spoloma! ( angl.! sex! differences)! in! spolnega! razlikovanja! ali! spolne! diferenciacije! ( angl.! sexual! differentiation).! Pri! spolni! diferenciaciji! gre! za! biološki! proces,! ki! privede! do! nepovratnih!razlik!med!spoloma!(1).! ! 18! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 2.1.1 Razvoj&spolnih&organov& Spol! zarodka! je! določen! že! zelo! zgodaj,! a! se! sam! razvoj! spolnih! organov! začne! nekoliko! kasneje,! in! sicer! med! t.i.! procesom! organogeneze.! Za! razliko! od! ostalih! zametkov!organskih!sistemov!se!zametki!spolnih!žlez!lahko!razvijejo!v!ženske!ali! moške!spolne!žleze,!jajčnik!ali!modo,!kar!imenujemo!bipotentnost!(3).!!! Med!spolno!diferenciacijo!se!oblikujejo!notranji!in!zunanji!spolni!organi.!! Spolno! diferenciacijo! delimo! na! tri! obdobja,! in! sicer! kromosomsko,! genetsko! in! hormonsko,! ki! vplivajo! eno! na! drugo! in! so! deloma! prepletena.! Kot! posledica! nastanejo! tako! morfološke! kot! tudi! funkcionalne! razlike! med! spoloma,! lekte! pa! vplivajo!na!spolno!identiteto,!spolno!usmerjenost,!spolno!obnašanje!in!kognitivne! funkcije!(16,!17).! ! Spolne! žleze! se! razvijejo! iz! spolnega! grebena,! ki! je! mezodermalnega! izvora! in! se! nahaja! na! ventralni! strani! mezonefrosa,! praledvic! zarodka.! Celice! celomskega! epitelija! proliferirajo! in! vdirajo! v! mezenhim! spolnega! grebena! ter! oblikujejo! primarne!klične!povezke,!ki!kasneje!obdajajo!spolne!celice.!Do!te!stopnje!je!razvoj! pri!obeh!spolih!isti!in!so!prisotni!tako!Wolffovi!kot!Müllerjevi!vodi!(3).! Pri! človeku! se! spolni! greben! pojavi! pri! štirih! tednih! embrionalnega! razvoja! in! ostane! nediferenciran! do! sedmega! tedna,! medtem! ko! se! pri! miših! oblikuje! v! desetem!dnevu!embrionalne!starosti!(3).! 2.1.1.1 Razvoj*mod* Ključno! obdobje! spolne! diferenciacije! pri! miših! je! med! 10,5! in! 12,5! dnevom! embrionalnega! razvoja! (E10! in! E12).! Začne! se! z! izražanjem! gena! Sry,! ki! leži! na! kromosomu! Y! (18,! 19),! in! usmeri! indiferentne! spolne! žleze! v! razvoj! mod.! Pri! človeku!je!to!obdobje!med!41.!in!44.!dnevom!starosti!zarodka.!Pod!vplivom! Sry!se! celice! v! primarnih! kličnih! povezkih! diferencirajo! v! Sertolijeve! celice! in! začnejo! izločati!antimüllerjev!hormon!(AMH),!kar!privede!do!propada!Müllerjevih!vodov!in! ohranitve! Wolffovih.! Spolni! (semenski)! trakovi! se! razvijajo! v! zavito! semensko! cevko.! Z! združitvijo! v! globini! pa! tvorijo! mrežje! cevk,! rete, testis.! Mezenhimalne! celice! pod! celomskim! epitelijem! se! diferencirajo! v! vezivno! plast! pod! epitelijem! ( tunica, albuginea).! Razvoj! mod! se! potem! nadaljuje! med! puberteto,! ko! semenski! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 19! brez,gena,SF#1, trakovi! luminizirajo,! oblikujejo! se! zavite! semenske! cevke,! v! katerih! dozorevajo! semenčice.!Za!ohranitev!Wolffovega!voda!je!odgovoren!testosteron,!ki!ga!izločajo! Leydigove!celice.!Leydigove!celice!se!razvijejo!takoj!po!pojavu!Sertolijevih!celic.!Iz! Wolffovega! voda! se! razvijejo! del! nadmodka,! semenovod! in! nekatere! pomožne! spolne!žleze!(3,!20).!! Leydigove! celice! so! zelo! pomembne! celice! pri! spolni! diferenciaciji! tako! v! času! embrionalnega!razvoja!kot!tudi!kasneje!po!rojstvu.!Pri!glodavcih!in!večini!sesalcev! poznamo! dve! populaciji! Leydigovih! celic,! in! sicer! t.i.! Leydigove! celice! plodu! in! odrasle! Leydigove! celice! (21).! Ti! dve! populaciji! se! ločita! po! ultrastrukturi,! življenjski! dobi! in! tudi! po! zmožnosti! proizvodnje! androgenov.! Zarodkove! Leydigove! celice! (FLC;! angl.! fetal! Leydig! cells)! so! prisotne! v! času! embrionalnega! razvoja! v! modih! zarodka! in! propadejo! kmalu! po! rojstvu.! Pri! različnih! živalskih! vrstah!se!obdobje!pojava!in!delovanja!FLC!razlikuje!(22).!Pri!miših!se!FLC!pojavijo! na! E12,5,! pri! podganah! na! E14,5,! pri! človeku! pa! v! sedmem! do! osmem! tednu! nosečnosti!(23,!9).!Pri!miših!so!prisotne!do!petega!dne!po!rojstvu!(PN!5)!(24).! Znano!je,!da!imajo!FLC!večjo!zmožnost!proizvodnje!testosterona!kot!odrasle!(ALC;! angl.!adult!Leydig!cells)!in!imajo!s!tem!pomembno!vlogo!pri!maskulinizaciji!plodu! (25).!! 2.1.1.2 *Razvoj*jajčnikov* Pri! zarodku! ženskega! spola! primitivne! spolne! niti! propadejo! in! takoj! se! začnejo! razvijati!nove,!ki!ne!potujejo!v!globino,!ampak!ostanejo!v!bližini!zunanje!površine! organa,! zato! jih! imenujemo! spolne! niti! skorje.! Te! se! oblikujejo! v! skupke! in! posamezen!skupek!obdaja!eno!zarodno!celico.!Zarodne!celice!se!razvijejo!v!jajčne! celice,! okolni! skupki! pa! v! celice! granuloze.! Celice! mezenhimskega! veziva,! ki! obdajajo! spolne! niti,! se! diferencirajo! v! celice! teke.! Müllerejvi! vodi! ostanejo! in! se! razvijejo!v!jajcevoda!in!maternico!(3).!! ! Na!razvoj!tako!spolnih!žlez!kot!tudi!možganov!ima!pomemben!vpliv!prisotnost!ali! odsotnost! testosterona.! Razvoj! spolnega! sistema! pa! je! odvisen! od! prisotnosti! oziroma!odsotnosti!mod!(26,!17,!3).!! ! 20! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 2.1.2 Kromosomska&spolna&diferenciacija& Ob!združitvi!spolnih!celic,!ko!pronukleus!semenčice!prodre!v!pronukleus!jajčeca!in! prinese!s!seboj!kromosom!X!ali!Y,!je!spol!kromosomsko!določen.!Pri!sesalcih!imajo! osebki! ženskega! spola! en! par! spolnih! kromosomov! z! dvema! kromosoma! X,! XX,! osebki!moškega!spola!pa!en!par!X!in!Y,!XY.!Pri!človeku!imata!oba!spola!po!22!parov! avtosomskih! kromosomov.! Pri! ženskem! spolu! sta! v! jajčnikih! aktivna! oba! kromosoma! X,! medtem! ko! je! povsod! drugod! po! telesu! en! kromosom! X! utišan.! Razvoj! jajčnika! je! odvisen! od! prisotnosti! dveh! kromosomov! X! in! odsotnosti! kromosoma! Y,! medtem! ko! je! kromosom! Y! odgovoren! za! determinacijo! moškega! spola!(3).! Proces! utišanja! enega! izmed! kromosomov! X! ( angl.! X! chromosome! inactivation,! XCI)! je! biološki! proces,! ki! zagotavlja! večjo! enakost! med! izraženostjo! genov! na! spolnih! kromosomih! med! spoloma! ( angl.! dosage! compensation).! Ključno! vlogo! v! procesu!XCI!ima!dolg!nekodirajoč!del!RNA,!ki!je!označen!kot! Xist, in!je!zelo!visoko! ter! specifično! izražen! samo! pri! utišanem! kromosomu! X! (27).! Delovanje! in! potek! procesa!utišanja!še!ni!v!celoti!poznan.!Že!leta!1961!je!bila!Lyonova!ena!prvih,!ki!je! menila,! da! je! proces! utišanja! enega! izmed! kromosomov! X! pri! mišjih! samicah! posledica! delovanja! genov! in! da! izbira! utišanega! kromosoma! X! poteče! naključno! (28).!To!je!dokazala!s!proučevanjem!mišjih!samic,!ki!so!bile!heterozigoti!za!gen!za! barvo! kožuščka,! ki! je! vezan! na! kromosom! X.! Na! podlagi! različno! izraženih! barv! kožuščka!je!domnevala,!da!se!je!enkrat!utišal!očetov,!drugič!pa!materin!kromosom! X!(28).!Kasneje!so!podobno!potrdili!tudi!za!ženske,!kjer!so!ugotavljali,!kateri!izmed! kromosomov! X! je! utišan! in! ugotovili,! da! sta! pri! ženskah! prisotni! dve! populaciji! celic,!in!sicer!ena,!ki!ima!utišan!očetov,!in!druga,!ki!ima!utišan!materin!kromosom! X.!Zato!so!poimenovali!tak!fenotip!kot!mozaičen,!ker!se!tudi!celice!znotraj!istega! organizma!razlikujejo!pri!izraženosti!genov,!ki!so!vezani!na!kromosom!X!(Xkvezani! geni).! Za! laboratorijske! miši! pa! to! ne! velja! v! popolnosti,! saj! so! zaradi! velikega! parjenja! v! sorodstvu! tako! očetovski! kot! materini! geni! na! kromosomu! X! že! zelo! podobni.!O!tem!veliko!piše!in!razpravlja!Migeonova!v!knjigi!z!naslovom!”Females! are!Mosaics,!X!inactivation!and!Sex!Differences!in!Disease”!(29).! Kakorkoli! že,! niso! pa! vsi! geni! na! utišanem! kromosomu! X! res! utišani.! Geni,! ki! se! nahajajo!na!t.i.!psevdokavtosomski!regiji!( angl.!pseudo-autosomal region, PAR) so ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 21! brez,gena,SF#1, homologni oziroma sorodni genom na kromosomu Y in so odgovorni za rekombinacije med mejozo pri XY fenotipu, pa tudi nekateri drugi posamezni geni niso utišani. Za te gene pravimo, da so ušli utišanju. Pri ljudeh velja, da med 15 do 20 odstotkov X-vezanih genov popolnoma uide utišanju, 10 % pa le delno (30).!Pri!človeku!se!na!kromosomu!Y!nahaja!okoli!0,15!%!vseh!genov,!kar!pomeni! 45! genov! od! približno! 20.000,! medtem! ko! jih! je! na! kromosomu! X! kar! 4,5! %! ali! 1.344!od!20.000!(31,!32,!11,!33).! O!pomenu!ravnovesja!med!spolnima!kromosomoma,!utišanju!in!prisotnosti!obeh! kromosomov,! pričajo! motnje! in! fenotipske! posledice! pri! na! primer! odsotnosti! drugega!kromosoma!X!(XO),!ki!je!pri!ljudeh!poznan!kot!Turnerjev!sindrom.!Takšne! ženske!imajo!nedelujoče!jajčnike,!so!neplodne,!nižje!rasti!…!(34).!Medtem!ko!sta!pri! moških!poznana!dva!fenotipa,!in!sicer!XXY!–!z!dodatnim!kromosom!X,!ki!je!poznan! kot! Klinefelterjev! sindrom,! in! moški! z! dodatnim! kromosomom! Y,! YYX,! Jacobov! sindrom.!V!obeh!primerih!so!ti!moški!neplodni!(35,!36).!Pri!ženskah!je!poznan!tudi! t.i.!XXX!kariotip!oziroma!47,!XXX!sindrom,!ki!pa!je!nemalokrat!spregledan,!ker!so!te! ženske! običajno! plodne,! imajo! pa! različne! anatomske! nepravilnosti! (npr.! manjši! obseg! glave),! kot! tudi! motnje! v! duševnem! razvoju! (več! je! razvojnih! motenj! v! koordinaciji! in! gibanju,! slušnem! razumevanju,! tudi! disleksije,! večja! pojavnost! psihiatričnih!motenj)!(37).! 2.1.2.1 Potek*procesa*utišanja*enega*izmed*kromosomov*X* Pri!miših!poteče!proces!utišanja!kromosoma!X,!XCI,!dvakrat.!V!zgodnji!fazi!razvoja,! na!stopnji!štirih!do!osmih!celic,!pride!do!utišanja!očetovega!kromosoma!X!v!vseh! celicah!zarodka!(38,!39).!Malo!kasneje!v!razvoju!se!ta!kromosom!ponovno!aktivira! v! celicah! notranje! mase! zarodka! (embrioblast),! medtem! ko! ostane! utišan! v! ekstraembrionalnem! tkivu! (trofoblast).! Drugič! pride! do! XCI! okoli! 5,5! dneva! embrionalnega! razvoja! (E5,5).! Tokrat! je! proces! utišanja! naključen,! tako! imata! očetov! in! materin! kromosom! X! enako! možnost! utišanja.! Ko! je! eden! izmed! kromosomov! X! utišan! v! drugem! procesu! utišanja,! je! ta! kromosom! utišan! v! vseh! hčerinskih!celicah!(27).! ! Osrednjo!vlogo!pri!XCI!ima!dolg!nekodirajoč!del!RNA!Xist!( angl.!Xkinactivekspecifick transcript),!ki!je!prepis!gena! Xist!in!leži!v!predelu!X!inaktivacijskega!centra!( angl.!X! ! 22! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! inactivation!center,!Xic)!na!kromosomu!X,!kjer!se!nahaja!gruča!genov!in!zaporedij! DNA,!ki!uravnavajo!proces!utišanja!kromosoma!X,!XCI!(40).!Procesirani!prepis! Xist! ovije! Xi! v! cis, obliko! in! vključi! kromatinski! kompleks! vključno! s! PRC2! (jedrni! komplement,! angl.!polycomb!repressive!complex!2)!,!ki!metilira!lizin!27!na!histonu! H3!(H3K27me3)!(41,!42,!43,!44).!Za!začetek!XCI!je!tako!Xist!nujno!potreben!in!ovije! Xi!v!vseh!diferenciranih!somatskih!celicah,!kar!so!dokazali!z!vizualizacijo!Xist!RNA! z!metodo!RNA!FISH!(fluorescentna! in,situ!hibridizacija),!kjer!ti!ovoji! Xist ka!tvorijo! značilne!“oblake”!(45).!Ko!enkrat!pride!do!stanja!Xi,!je!to!utišano!stanje!stabilno,!se! prenaša! na! hčerinske! celice! in! je! nepovratno.! Ta! proces! poteče! samo! v! ženskih! celicah!in!je!nujen!proces!za!normalno!delovanje!celic!(27).!! Antagonist! Xist ka! je! Tsix,! ki! je! protismiseln! prepis! Xist ka! in! se! v! celoti! prekriva! s! Xist kom!(46).!Tsix!prav!tako!predstavlja!nekodirajoča!RNA,!ki!je!prepis!aktivnega! kromosoma!X!( angl.!active!X,!Xa)!že!pred!in!med!nastopom!XCI!ter!s!tem!prepreči! delovanje! Xista ka!na!ta!kromosom!(46).! 2.1.3 Genetska&spolna&diferenciacija& Znano!je,!da!se!spolna!diferenciacija!začne!kaj!kmalu!po!združitvi!spolnih!celic.!Pri! človeškem! zarodku! moškega! spola! ima! lekta! že! dva! dni! po! spočetju! več! celic! kot! zarodek! ženskega! spola.! Poleg! tega! pa! je! tudi! presnovna! aktivnost! pri! moškem! zarodku!višja!(47,!17).! Ključni! gen! za! določitev! spola! je! SRY,! ki! je! iz! enega! eksona! z! zapisom! za! homeok zaporedje!( angl.!high!mobility!group!HMGkbox)!za!vezavo!na!DNA!(48).!Mutacije!v! področju! gena! SRY! imajo! za! posledico! nepravilen! razvoj! mod! ali! celo! njihovo! odsotnost,!kar!so!dokazali!v!več!študijah!(49,!50,!51,!52,!53).! ! Pri!moškem!se! SRY!začne!izražati!v!Sertolijevih!celicah!pri!E41!in!je!najbolj!izražen! na!E44,!potem!se!izraženost!zniža!in!ostane!nizka!do!konca!embrionalnega!razvoja.! Prisotnost!beljakovine!SRY!v!jedrih!Sertolijevih!celic!pri!človeku!so!potrdili!vse!do! odraslega! obdobja! (proučevali! so! moške! do! 32.! leta! starosti)! (54).! Pri! mišjih! samcih!se! Sry!izraža!v!obdobju!od!E10,5!do!E12,5,!z!največjo!izraženostjo!na!E11,5,! in! sicer! v! telesnih! celicah! spolnega! grebena,! ki! se! kasneje! razvijejo! v! Sertolijeve! celice.!Izraženost!je!prisotna!le!med!embrionalnim!razvojem!(18,!19).! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 23! brez,gena,SF#1, ! V! razvijajočem! se! spolnem! grebenu! Sry! aktivira! gen! Sox9,! ki! je! avtosomski! gen! s! pomembno!vlogo!pri!gonadogenezi!(55).!Pri!glodavcih!se!z!vezavo!Sry!na!področje! TESCO!( angl.!testiskspecific!core!enhancer!of! Sox9)!na!genu! Sox9!(55)!v!Sertolijevih! celicah!aktivira!mreža!genov,!ki!uravnavajo!medcelično!komunikacijo,!migracijo!in! diferenciacijo! v! plodova! moda.! Homeokzaporedje! Sry! (Sry! HMG! box)! zagotavlja! motiv! podpisa! za! veliko! družino! prepisovalnih! dejavnikov! (Sox;! angl.! Srykrelated! HMG! box),! ki! imajo! pomembno! vlogo! pri! razvoju! in! tkivno! specifičnem! uravnavanju!(56).!Sam!gen! Sry!pa!evolucijsko!nastane!s!podvajanjem! Sox3!gena,!ki! je! na! kromosom! X! vezani! član! te! družine! (57).! Gen! SOX9! se! začne! izražati! v! Sertolijevih! celicah! na! E10,5! z! največjo! izraženostjo! na! dan! E11,5.! Njegovo! izražanje! sovpada! z! izražanjem! SRY,! zato! domnevajo,! da! SRY! posredno! ali! neposredno! deluje! na! izražanje! SOX9! (58).! Pomembno! vlogo! Sox9! pri! spolni! diferenciaciji!potrjujejo!transgene!miši,!ki!imajo!izbrisan!150kbp!velik!regulatorni! del! Sox9! in! posledično! se! take! samice! razvijejo! v! sterilne! XX! samce,! kljub! odsotnosti! Sry, (59).!! ! Poleg! Sry! so! pri! spolni! diferenciaciji! in! razvoju! spolnih! žlez! udeleženi! še! mnogi! drugi! geni.! Prepisovanje! Sry! neposredno! uravnava! gen! Wilmsovega! tumorja! 1! ( Wt1,! WT1;,opomba,–,zapis,gena,ležeče,in,z,malimi,tiskanimi,črkami, kjer,je,samo, prva, črka, velika, tiskana, predstavlja, zapis, mišjega, gena, medtem, ko, ležeči, zapis, z, velikimi, tiskanimi, črkami, predstavlja, zapis, humanega, gena)! (60).! Pri! miših! je! izražen! v! predelu! mezonefrosa,! metanefrosa! in! spolnega! grebena! že! od! E9! dalje! (61).! Miši,! ki! so! brez! gena! Wt1,! kažejo! ženski! fenotip! ne! glede! na! kromosomski! spol,!vendar!zaradi!odsotnosti!ledvic!odmrejo!že!pred!rojstvom!(62).!Mutacije!na! genu! WT1!so!znane!tudi!pri!ljudeh!kot!sindrom!DeniskDrash!in!Fraiser!(63,!64,!65).! ! Gen! SF#1!kodira!steroidogeni!dejavnik!1!( SF#1,,NR5A1),!ki!je!prepisovalni!dejavnik! iz!družine!jedrnih!receptorjev.!SFk1!ima!ključno!vlogo!pri!zgodnjem!razvoju!tako! spolnih!kot!tudi!nadledvičnih!žlez!ter!delovanju!primarnih!steroidogenih!tkiv,!kot! so! skorja! nadledvične! žleze,! Leydigove! celice,! rumeno! telo,! celice! teke! in! celice! granuloze!(66).!Pri!miših!se!začne!izražati!že!zgodaj,!in!sicer!na!E9.!Pri!samicah!je! ! 24! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! izražen!le!do!E12,5,!pri!samcih!pa!ostaja!izražen!tako!v!jedrih!Sertolijevih!kot!tudi! Leydigovih!celicah!(67,!68).! SF#1!je!ključen!na!kar!treh!stopnjah!razvoja!mod:!1.!že! pred! začetkom! spolne! diferenciacije! v! spolnem! grebenu! sodeluje! pri! pripravi! okolja!za!izražanje! Sry;!2.!v!Sertolijevih!celicah!za!uravnavo!nastanka!AMH!in!3.!v! Leydigovih! celicah! ureja! izražanje! encimov,! ki! sodelujejo! pri! tvorbi! steroidnih! hormonov!(69).! ! Na!kromosomu!X!se!nahaja!gen! DAX1!( angl. !dosageksensitive!sexkreversal,!adrenal! hyperplasia!congenital!X!chromosome!1),!ki!prav!tako!sodeluje!pri!razvoju!mod.!Ob! njegovi! odsotnosti! se! Sertolijeve! celice! ne! razvijejo,! pride! do! motenj! spermatogeneze,! proliferacije! in! diferenciacije! Leydigovih! celic! (70,! 71,! 72).! Pri! prekomernem! izražanju! DAX1! pride! do! zavrtja! delovanja! SRY,! SF#1! in! SOX9! (73).! Pri!obeh!spolih!se!DAX1!izraža!v!prvi!polovici!embrionalnega!razvoja,!kasneje!pa!je! prisoten! samo! pri! ženskem! spolu,! kjer! vpliva! na! razvoj! jajčnikov! oziroma! zavira! razvoj!mod!(74).! ! Razvoj!spolnega!sistema!v!ženskega!velja!za!privzeti!način!razvoja.!Genov,!ki!bi!bili! po! vlogi! sorodni! SRY! in! SOX9! pri! razvoju! moškega! spolnega! sistema,! še! niso! dokazali.! Dokazali! pa! so! nekatere! beljakovine,! ki! nastajajo! v! jajčniku! in! preprečujejo! nastanek! mod.! Eden! takih! je! produkt! že! prej! opisanega! gena! DAX1.! Drugi! pa! je! WNT4! ( angl.! wingless! type! MMTV! (murine! mammary! tumor! virus)! integration! site! family,! member! 4),! ki! je! pri! ženskah! izražen! v! jajčniku! v! drugi! polovici! nosečnosti,! kjer! vzdržuje! število! oocitov! (17).! To! vlogo! pri! razvoju! ženskega! spolnega! sistema! so! potrdili! z! mišmi! brez! gena! Wnt4,! kjer! pri! samicah! pride!do!razvoja!Wolffovih!vodov!in!propada!Müllerjevih,!pri!samcih!pa!je!fenotip! normalen! (75).! Tako! se! pri! samicah! brez! Wnt4! jajčniki! ne! razvijejo! pravilno! in! njihove! celice! izražajo! AMH! ter! encime,! ki! sodelujejo! pri! tvorbi! testosterona.! Na! podlagi!tega!menijo,!da! Sry!zavira!izražanje! Wnt4, (49).! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 25! brez,gena,SF#1, 2.1.4 Hormonska&spolna&diferenciacija& Pri! primarni! spolni! diferenciaciji! gre! za! razvoj! spolnih! žlez,! jajčnikov! ali! mod,! iz! bipotentne! zasnove.! Ko! so! spolne! žleze! že! razvite,! se! začne! sekundarna! spolna! diferenciacija! –! razvoj! ženskega! ali! moškega! fenotipa,! ki! poteka! pod! vplivom! hormonskega! izločanja! jajčnikov! ali! mod.! Tako! ženska! kot! moška! sekundarna! spolna! diferenciacija! potekata! v! dveh! fazah,! in! sicer! se! prva! odvije! že! za! časa! embrionalnega!razvoja,!druga!pa!med!puberteto.! Med! embrionalnim! razvojem! hormoni! parakrino! uravnavajo! razvoj! gonad! in! sekundarnih! spolnih! organov.! Pri! osebkih! ženskega! spola! so! prisotni! Müllerjevi! vodi,!ki!se!kasneje!po!vplivom!estrogenov!razvijejo!v!maternico,!maternični!vrat,! jajcevoda! in! zgornji! del! vagine.! Wolffovi! vodi! pa! zaradi! odsotnosti! testosterona! propadejo.! Pri! razvoju! moškega! fenotipa! sta! tako! pomembna! dva! testikularna! faktorja,! in! sicer! AMH! (antikmüllerjev! hormon)! in! testosteron.! AMH! izločajo! Sertolijeve! celice! in! s! parakrinim! delovanjem! povzroči! propad! Müllerjevih! vodov! pri! miših! med! E16! in! E21,! pri! človeku! pa! osmi! do! deveti! teden! intra! uterinega! razvoja.!Na!izločanje!AMH!imajo!direkten!vpliv!SOX9!skupaj!z!SFk1,!WT1!in!GATA4! (beljakovina,! ki! veže! GATA;! angl.! GATA! binding! protein).! AMH! deluje! preko! receptorjev!tipa!2,!vendar!se!njihovo!število!postopoma!zmanjšuje.!Zato!ima!AMH! manjši!vpliv,!kljub!izločanju!med!embrionalnim!razvojem!in!do!pubertete!(76).!Pri! podganah! začnejo! FLC! izločati! testosteron! med! E18,5! in! E19,5,! pri! miših! okoli! E16,5,! pri! človeku! pa! med! dvanajstim! in! devetnajstim! tednom! razvoja! (77,! 26).! Začetek!tvorbe!testosterona!v!FLC!je!neodvisen!od!LH!(luteinizirajoči!hormon).!V! hipofizi!podgan!LH!zaznamo!šele!E16,!v!plazmi!pa!E17!(77).!Poleg!testosterona!pa! FLC! izločajo! tudi! inzulinu! podoben! rastni! faktor! 3! (INSL3),! ki! je! pomemben! za! razvoj!gubernakuluma!mod!in!zgodnji!spust!mod!v!trebušni!votlini,!kasnejši!spust! v! modnik! pa! je! pod! vplivom! testosterona! (72).! Pod! vplivom! testosterona,! ki! ga! izločajo! Leydigove! celice,! se! Wolffovi! vodi! razvijejo! v! nadmodek,! semenovod,! sekundarne!spolne!žleze!ter!ejakulatorni!aparat!(3).! V! zgodnjem! obdobju! razvoja! jajčnikov! pri! samicah! glodavcev! se! zarodne( celice( hitro&mitotično&delijo&med&E14!in!E15."Mejotična"delitev"se"najprej"pojavi"v"bližini" mezonefrosa!v!sredini!jajčnika,!zato!je!verjetno,!da!mezonefros!izloča!neko!snov,!ki! sproža!mejozo!(17). ! 26! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! ! Veliko! raziskav! v! zadnjem! desetletju! proučuje! neposredni! vpliv! spolno! vezanih! genov!na!možgane!(78).! 2.2 RAZLIKE!MED!SPOLOMA!V!MOŽGANIH! Da! so! možgani! spolno! dimorfen! organ,! je! zdaj! že! dobro! znano,! vendar! na! prvi! pogled,! s! prostim! očesom,! ne! moremo! določiti! njihovega! spola.! V! možganih! poznamo! razlike! med! spoloma! na! ravni! celotnih! možganov,! na! posameznih! področjih!in!na!celični!ravni.!Razlike!na!posameznih!področjih!pomenijo!razlike!v! velikosti!področja,!številu!celic!in!položaju!strukturnih!elementov!v!posameznem! možganskem!jedru,!v!številu!gradnikov,!ki!izražajo!določeno!beljakovino!ali!drugo! biološko!aktivno!molekulo.!Na!celični!ravni!pa!to!pomenijo!razlike!v!ultrastrukturi! elementov! živčnega! sistema,! velikosti! celičnega! telesa,! jedra! ali! jedrca,! številu! in! vrsti!sinaptičnih!povezav!ter!morfologiji!dendritov!(79).!! 2.2.1 Nastanek&razlik&med&spoloma&v&možganih& Številne!študije!v!zadnjih!stotih!letih!so!proučevale!in!potrdile!razlike!med!spoloma! v!možganih.!Tako!imamo!prve!raziskave!že!iz!začetka!20.!stoletja,!ki!so!postavile! temelje!(80,!81,!14),!in!kasnejše!iz!druge!polovice!20.!ter!začetka!21.!stoletja,!ki!so! jih!potrdile!in!nadgradile!(82,!15,!83,!84,!85,!78).! Za!nastanek!razlik!med!spoloma!v!možganih!so!ključni!spolni!steroidni!hormoni,!ki! jih! pretežno! izločajo! spolne! žleze.! To! izločanje! pri! vretenčarjih! običajno! poteka! skozi!celotno!življenjsko!obdobje,!vendar!se!dinamika!izločanja!in!vrsta!hormona! razlikuje!tako!med!spoloma!kot!med!vrstami.!Vpliv!spolnih!steroidnih!hormonov! na! možgane! je! lahko! trajen! (t.j.! organizacijski! vpliv)! in/ali! začasen! oziroma! prehoden! (t.j.! aktivacijski! vpliv).! Pri! večini! sesalcev! spolni! hormoni! vplivajo! na! strukturo!možganov!predvsem!v!dveh!obdobjih,!in!sicer!v!perinatalnem!obdobju!in! v!času!pubertete!(79).!! Prisotnost! oziroma! odsotnost! spolnega! kromosoma! Y! ima! neposreden! vpliv! na! razvoj! spolnih! žlez! in! s! tem! na! primarni! nastanek! razlik! med! spoloma.! S! spolno! diferenciacijo!gonad!pride!do!prvih!razlik!pri!izločanju!spolnih!hormonov,!in!sicer! pri! moškem! spolu! že! pred! rojstvom! moda! začnejo! izločati! testosteron.! Pri! miših! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 27! brez,gena,SF#1, pride! do! prvega! vrha! izločanja! testosterona! pri! E17! in! potem! še! enkrat! takoj! po! rojstvu! (86,! 87).! Testosteron! in! AMH,! ki! ju! izločata! plodova! moda,! privedeta! do! trajnega! razvoja! moškega! fenotipa.! Testosteron! je! tisti,! ki! je! odgovoren! za! maskulinizacijo! možganov.! V! možganih! se! testosteron! pri! večini! sesalcev! s! pomočjo!katalitičnega!encima!aromataze!pretvori!v!estradiol,!ki!preko!vezave!na! estrogenske!receptorje!(ER)!povzroči!maskulinizacijo!(88)!hipotalamusa!in!z!njim! povezanih! struktur,! vključno! z! vzpostavitvijo! povezav,! ki! so! potrebne! za! moško! spolno!obnašanje,!predvsem!kopulacijo!(89).!Prav!tako!pa!estradiol!preko!ER!pri! samcih!v!istih!možganskih!jedrih!zavre!nastanek!povezav,!ki!so!potrebne!za!razvoj! ženskega! sprejemljivega! ali! receptivnega! spolnega! obnašanja.! To! sta! dva! ločena! procesa,!ki!ju!označimo!kot!maskulinizacija!in!defeminizacija!(89).!Kako!ta!sistem! deluje!pri!samicah,!še!ni!natančno!poznano.! Pri!proučevanju!razlik!med!spoloma!v!obnašanju!in!možganih!pri!glodavcih!lahko! rečemo,! da! so! lekte! posledica! treh! neodvisnih! naravnih! procesov,! in! sicer! feminizacije,! ki! je! privzeta! oblika! razvoja! in! privede! do! izražanja! lordoze! (pod! ustreznimi! hormonskimi! pogoji),! maskulinizacije,! ki! poteče! pod! vplivom! testosterona!oziroma!njegovega!metabolita!estradiola!že!v!prenatalnem!obdobju!in! ima!za!posledico!moško!značilno!kopulatorno!obnašanje!v!odraslem!obdobju,!ter! defeminizacije,! ki! se! prav! tako! odvije! pri! moškem! fenotipu! med! delovanjem! estradiola! preko! ER! in! povzroči! izgubo! zmožnosti! značilnega! ženskega! spolnega! obnašanja! (90).! Maskulinizacija! in! defeminizacija! pri! samcih! običajno! potekata! v! tandemu,!kjer!je!estradiol!tisti,!ki!je!v!možganih!odgovoren!za!njiju.!Tu!se!pojavi! vprašanje,! zakaj! potem! niso! tudi! plodovi! ženskega! spola! maskulinizirani,! saj! so! prav! tako! izpostavljeni! estrogenom,! ne! lastnim,! ampak! materinim! in! estrogenom! posteljice,! ki! prehajajo! do! ploda.! Pri! miših! so! ugotovili,! da! jetra! ploda! izločajo! αk feto! protein,! ki! z! močno! afiniteto! nase! veže! estrogene! in! to! naj! bi! preprečilo! maskulinizacijo!pri!plodu!ženskega!spola!(88).!Z!raziskavami!na!miših!brez!gena!za! αkfeto! protein! (AFP! KO)! so! to! vlogo! potrdili,! saj! so! bile! potomke! AFP! KO! maskulinizirane! tako! v! možganih! kot! v! obnašanju! zaradi! izgube! zaščite! pred! materinimi! estrogeni! (91).! Kljub! temu,! da! velja! ženski! fenotip! možganov! za! privzeto! obliko! diferenciacije,! so! za! njihov! razvoj! potrebni! estrogeni.! To! so! dokazali! z! uporabo! miši! brez! gena! za! aromatazo! (ArKO),! ki! je! ključen! encim! pri! ! 28! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! nastanku! estrogenov.! Pri! potomkah! miši! ArKO! so! ugotovili,! da! kažejo! zmanjšano! spolno! sprejemljivost! in! so! manj! občutljive! na! vohalne! dražljaje! (91).! Ne! samo! prenatalno,!prisotnost!estrogenov!je!potrebna!tudi!postnatalno!in!v!času!pubertete,! za! izražanje! značilnega! ženskega! spolnega! obnašanja! (92),! kar! je! potrdila! tudi! nedavna!raziskava!(93).! Steroidni! hormoni,! ki! lahko! med! razvojem! delujejo! na! plod,! izvirajo! še! iz! drugih! virov,!saj!nastajajo!tudi!v!nadledvični!žlezi!(7),!centralnem!živčnem!sistemu,!kjer! jim!pravimo!nevrosteroidi,!(94,!95)!ali!pa!pridejo!od!sosednjih!plodov!(96)!ali!so! popolnoma!eksogenega!izvora,!iz!hrane!in!vode!(npr.!fitoestrogeni)!(97,!98).! ! Nedavne!študije!so!dokazale,!da!so!tudi!spolni!kromosomi!neposredno!odgovorni! za! nastanek! razlik! med! spoloma! v! možganih! in! da! ne! delujejo! samo! preko! hormonov,! ki! jih! izločajo! spolne! žleze.! Dewingova! in! njeni! sodelavci! so! s! hibridizacijo! in, situ! potrdili! prisotnost! prepisov! Sry! v! predelu! črne! substance! v! nevronih! srednjih! možganov,! ki! izražajo! tirozinsko! hidroksilazo,! in! v! skorji! pri! podganah!in!pri!miših!(99).! De! Vries! in! sodelavci! so! na! mišjem! modelu! premaknili! Sry! s! kromosoma! Y! na! avtosom! in! s! tem! dosegli,! da! pride! do! razvoja! testisov! neodvisno! od! prisotnosti! kromosoma!X!in!Y.!Pridobili!so!štiri!genotipe!miši!( angl.!four!core!genotype!–!FCG),! in! sicer! XX! samice! (brez! gena! Sry,! miš! z! jajčniki,! ženski! fenotip),! XY! samice! z! izbrisanim!genom! Sry!na!kromosomu!Y!(XY! Sry, k,!miši!z!jajčniki,!ženski!fenotip),!XY! samce,!ki!imajo!gen! Sry!premaknjen!na!avtosom!(miš!s!testisi,!moški!fenotip)!in!XX! samci! z! genom! Sry! na! avtosomu! (XX! Sry,, miši! s! testisi,! moški! fenotip).! Pri! obeh! skupinah! s! testisi,! torej! pri! samcih! XX Sry! in! XY,! so! ugotovili! gostejšo! prisotnost! vlaken,! ki! izražajo! arginin! vazopresin! (AVP)! v! stranskem! pretinu! (LS),! torej! pri! obeh! moških! skupinah.! Poleg! razlik! v! izražanju! AVP! so! pri! samcih! ugotovili! tudi! razlike!v!testih!obnašanja!(100).!! Kar! nekaj! različnih! študij! je! v! zadnjih! letih! dokazalo,! da! so! spolno! vezani! geni! izraženi! tudi! v! možganih.! Z! metodama! qPCR! in! northern! prenosom! so! dokazali! izražanje! genov,! ki! so! vezani! na! kromosom! Y! in! kromosom! X! v! možganih! tako! samcev! kot! samic,! ne! glede! na! prisotnost! spolnih! hormonov! (101).! Z! analizo! izražanja! genov! na! DNAkmikromrežah! so! v! možganih! samcev! in! samic! ugotovili! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 29! brez,gena,SF#1, prisotnost! večjega! števila! genov! vezanih! na! spolne! kromosome! (102,! 103).! V! nedavni! raziskavi! so! potrdili! izraženost! nekaterih! spolno! vezanih! genov! že! pri! zarodkih!pred!razvojem!spolnih!žlez!(E11,5)!in!tik!pred!rojstvom!(E18,5)!(104).! 2.2.2 Spolno&različna&področja&v&možganih& Eno! najbolj! raziskanih! in! proučevanih! spolno! dimorfnih! področij! v! možganih! je! zagotovo! predoptično! področje! ( angl.! preoptic! area;! POA),! ki! se! nahaja! v! rostrok ventralnem!delu!možganov,!med!sprednjo!komisuro!( angl.!anterior!commisure)!in! optičnima!živcema!( angl.!optic!tract),!na!kavdalnem!delu!pa!se!stika!s!sprednjim! delom!srednjega!hipotalamusa!( angl.!anterior!hypothalamus,!AH)!in!z!medialnim! delom!spodnjega!jedra!končne!strije!( angl.!bed!nucleus!of!stria!terminaliskmedial,! BNSTM).! Osrednji! ali! medialni! del! POA! ( angl.! medial! preotic! area,! MPOA)! ima! pomembno! vlogo! pri! uravnavanju! reproduktivnega! oziroma! spolnega! obnašanja! ter! pri! endokrinih! procesih.! Pri! podganjih! samcih! se! v! MPOA! nahaja! center! za! uravnavanje! kopulatornega! obnašanja! (105,! 106),! pri! samicah! pa! za! materinsko! obnašanje,! lordozo! ter! uravnava! ciklično! izločanje! gonadotropinov! (107,! 108).! V! več!raziskavah!so!pri!podganah!in!mongolskih!skakačih!ugotovili,!da!so!nevroni,!ki! izražajo!eno!izmed!oblik!estrogenskega!receptorja!(ER),!sposobni!vezati!estrogene! tako! med! fetalnim! življenjem! kot! tudi! v! odraslem! obdobju! (109,! 110,! 111,! 112,! 113).!Prisotnost!estrogenskih!receptorjev!(ER)!v!POA!so!potrdili!tudi!pri!dihurjih! (114).! Število! ER! in! mest! za! vezavo! estrogenov! pa! je! pri! samicah! večje! kot! pri! samcih! (115).! Podobna! razlika! med! spoloma! naj! bi! bila! tudi! pri! androgenskem! receptorju!(AR)!pri!podganah!(116,!117).!Znotraj!MPOA!se!nahaja!jedro,!ki!se!po! obliki,! površini! in! prostornini! močno! razlikuje! med! spoloma.! Pri! podganah! so! ga! poimenovali!kot!spolno!dimorfno!jedro!predoptičnega!področja!ali!SDNkPOA!( angl.! sexually!dimorphic!nucleus!of!the!POA)!in!je!pri!samcih!dva!in!pol!do!petkrat!večje! kot!pri!samicah!(118).!Podobno!spolno!dimorfno!področje!v!POA!so!opisali!še!pri! več!živalskih!vrstah!(110,!119,!120,!121,!122)!in!tudi!pri!človeku!(123,!124).!Tudi! pri!miših!so!preiskovali!to!področje,!vendar!z!metodo!barvanja!po!Nisslu!niso!našli! razlik!(125).!Medtem!ko!so!z!označevanjem!celic,!ki!izražajo!androgenski!receptor! (AR)! in! kalbindin! Dk28k! ( angl.! calbindin,! Calb),! določili! mejo,! kjer! naj! bi! se! pri! miših! nahajalo! spolno! dimorfno! področje,! podobno! kot! pri! podganah! (126).! ! 30! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Nastanek!razlik!v!SDNkPOA!je!posledica!delovanja!spolnih!hormonov!na!možgane,! in! sicer! v! odvisnosti! od! starosti! pri! izpostavljenosti! ter! od! živalske! vrste.! Pri! tretiranju! odraslih! podgan! s! testosteronom! niso! dosegli! vpliva! na! prostornino! jedra!(118),!medtem!ko!so!pri!odraslih!mongolskih!skakačih!to!uspeli!doseči!(110).! Ko! so! kmalu! po! skotitvi! tretirali! podganje! samice! s! testosteronom,! so! dosegli! povečanje!prostornine!SDNkPOA.!Če!pa!so!v!istem!obdobju!samce!kastrirali,!se!je! prostornina! SDNkPOA! zmanjšala! in! postala! podobna! tisti! pri! samicah! (118,! 127,! 112).!Pomemben!vpliv!spolnih!hormonov!pred!rojstvom!na!razvoj!jedra!SDNkPOA! so! dokazali! na! potomcih! podganjih! samic,! ki! so! bile! v! času! brejosti! tretirane! s! testosteronom! (128).! S! tem! tretiranjem! pa! niso! dosegli! razlik! pri! spolnem! obnašanju! v! odraslem! obdobju.! Ko! so! tretirali! živali! tako! pred! kot! po! rojstvu,! so! dosegli! morfološko! spremembo! fenotipa! jedra,! kar! pomeni! da! so! imele! tretirane! podganje!samice!jedro!primerljive!velikosti!kot!netretirani!samci.!Podobno!so!tudi! pri!drugih!živalskih!vrstah!dokazali,!da!imajo!estrogeni!v!embrionalnem!obdobju! ključno!vlogo!pri!oblikovanju!SDNkPOA!(129,!130,!131,!120,!132,!133).!Razlike!med! spoloma!v!velikosti!SDNkPOA!so!lahko!posledica!različnih!pojavov!med!razvojem! možganov,! ki! potekajo! pod! vplivom! delovanja! spolnih! hormonov,! in! sicer! v! nevrogenezi,! apoptozi! ali! potovanju! živčnih! celic! (134).! V! nevronih! MPOA! so! z! imunohistokemičnim! barvanjem! ugotovili,! da! se! encim! dekarboksilaza! glutaminske! kisline! ( angl.! glutamic! acid! decarboxylase;! GAD67),! ki! sodeluje! pri! biosintezi!nevrotransmiterja!GABA!( angl.!gammakaminobutyric!acid,!gama!aminok butirična!kislina),!pri!podganah!izraža!spolno!dimorfno!(135).!Različno!izraženost! so!potrdili!še!na!dan!P10!(po!rojstvu,! angl.!postnatal;!P),!na!dan!P15!pa!razlika!v! izraženosti! GAD67! ni! bila! več! prisotna! (136).! Bach! in! sodelavci! so! z! uporabo! agonista! receptorjev! GABA,! muscimola,! pokazali! morebiten! neposredni! vpliv! nevrotransmiterja!GABA!na!razvoj!POA,!saj!je!tretiranje!z!muscimolom!povzročilo! zmanjšanje! prostornine! SDNkPOA! pri! samcih,! pri! samicah! pa! tega! vpliva! ni! bilo! (137).!Na!podlagi!te!študije!bi!lahko!rekli,!da!ima!tretiranje!z!muscimolom!na!SDNk POA!enak!učinek!kot!kastracija,!s!to!razliko!da!so!mehanizmi!delovanja!muscimola! neodvisni!od!steroidnih!spolnih!hormonov.! V! raziskavah,! kjer! so! poškodovali! SDNkPOA! pri! podganjih! samcih! niso! ugotovili! bistvenih! sprememb! v! kopulatornem! obnašanju! (138,! 139).! Po! popolni! poškodbi! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 31! brez,gena,SF#1, MPOA!so!pri!podganjih!samicah!ugotovili!močno!zavrtje!materinskega!obnašanja! (140).! Delna! poškodba! MPOA! pa! ni! povzročila! bistvenih! odstopanj! pri! materinskem!obnašanju!samic!(140).! ! Amigdala!se!nahaja!pod!anteriornokmedialnim!delom!možganske!skorje!rostralno! od! hipokampusa.! Amigdala! je! del! limbičnega! sistema! in! sestavljena! iz! več! jeder.! Eno! izmed! najbolj! spolno! dimorfnih! jeder! amigdale! je! medialni! del! ( angl.! medial! amygdala,!MeA),!ki!sodeluje!pri!uravnavanju!spolnega!obnašanja!tako!pri!samcih! (erekcija!–!(141))!kot!pri!samicah!(lordoza,!izločanje!prolaktina!in!luteinizirajočega! hormona! (LH)! –! (142)),! pri! agresivnem! obnašanju! (143)! in! pri! igri! mladičev! moškega!spola!(144).!Področje!MeA!je!po!velikosti!večje!pri!samcih!kot!pri!samicah! (145,! 146).! Tu! so! tudi! telesa! nevronov! pri! samcih! večja! v! primerjavi! s! samicami! (147,! 79,! 148).! O! vplivu! spolnih! steroidnih! hormonov! na! razvoj! MeA! je! bilo! narejenih! veliko! raziskav,! vendar! je! na! tem! področju! še! vedno! veliko! nejasnega! (149,!150,!151).!Nishizuka!in!Arai!sta!pokazala!pomen!estrogenov!pri!razvoju!MeA! pri! samcih! in! vpliv! na! maskulinizacijo! obnašanja! (152,! 153).! Pri! podganah! so! ugotovili,! da! je! število! povezav! med! nevroni! v! MeA! pri! samcih! večje! kot! pri! samicah.!Nastajanje!teh!sinaps!naj!bi!urejali!spolni!steroidni!hormoni!v!zgodnjem! obdobju! po! rojstvu! (154).! Podobne! razlike! v! MeA! so! odkrili! tudi! pri! miših! seva! BALB/c!(148),!medtem!ko!takih!razlik!pri!miših!seva!C57BL/6J!niso!ugotovili!(79).! ! Področje! stranskega! oziroma! lateralnega! pretina! ( angl.! lateral! septum,! LS),! ki! se! nahaja! anteriornokdorzalno! od! predoptičnega! področja! ob! stranski! možganski! kletki,! sodeluje! pri! uravnavanju! neagresivnih! socialnih! vrstah! obnašanja! (155),! (156).! V! LS! so! aksoni! nevronov! iz! spodnjega! jedra! končne! strije! (BNST)! in! amigdale,!ki!izražajo!arginin!vazopresin!(AVP).!Gostota!teh!aksonov!je!pri!različnih! živalskih!vrstah!večja!pri!samcih!kot!pri!samicah!(157).!Da!pa!je!vsebnost!AVP!v!LS! odvisna! od! spolnih! hormonov,! so! dokazali! z! odstranitvijo! spolnih! žlez,! po! kateri! niso! več! zaznali! prisotnosti! AVP! v! LS.! To! izražanje! pa! so! ponovno! izzvali! s! tretiranjem!s!testosteronom!pri!obeh!spolih.!Na!spolno!različno!izraženost!AVP!pa! naj! bi! neposredno! vplivali! tudi! spolni! kromosomi,! kar! so! dokazali! z! uporabo! ! 32! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! mišjega! modela,! kjer! so! imeli! štiri! različne! genotipe,! in! sicer! XX! in! XY! samice! z! jajčniki!ter!XY!in!XX!samce!z!modi!(ta!model!miši!je!opisan!v!poglavju!2.2.1)!(100).! ! Vomeronazalni!sistem!(VNS)!je!pri!glodavcih!spolno!dimorfno!zgrajen.!Sestavljajo! ga! vomeronazalni! organ! in! številna! možganska! jedra:! področje! pomožnega! vohalnega!betiča!( angl.!accessory!olfactory!bulb,!AOB),!spodnje!jedro!pomožnega! vohalnega! trakta! ( angl.! bed! nucleus! of! accessory! olfactory! tract,! BOAT),! MeA,! BNST,! MPOA,! AVPV! in! VMH! (79).! Ker! VNS! sodeluje! pri! prenosu! odzivov! na! dražljaje,! ki! jih! izzovejo! feromonske! molekule! v! vomeronazalnem! organu,! do! možganskih!jeder,!mu!pripisujejo!ključno!vlogo!v!uravnavanju!razmnoževanja!pri! glodavcih!(158).! ! Anteroventralni!del!periventrikularnega!jedra!( angl.!anteroventral!periventricular! nucleus,! AVPV)! se! nahaja! bilateralno! ob! razširitvi! tretje! možganske! kletke! (angl.! third! ventricle,! 3V),! v! rostralnem! delu! MPOA! in! je! odgovoren! za! izločanje! sproščujočega! hormona! gonadotropinov! (angl.! gonadotropinkreleasing! hormone;! GnRH).! Tudi! v! AVPV! so! prisotne! spolno! dimorfne! razlike.! Ugotovili! so,! da! imajo! samice!večjo!prostornino!jedra!in!da!je!v!njem!več!celic!(159).!Kasneje!so!ugotovili,! da!je!za!nastanek!teh!razlik!odgovoren!testosteron!v!fetalnem!življenju,!saj!so!pri! samicah!podgan,!ki!so!bile!tretirane!s!testosteronom!ugotovili,!da!se!je!število!celic! v!AVPV!zmanjšalo,!medtem!ko!se!je!število!celic!pri!kastriranih!samcih!povečalo!v! primerjavi!s!kontrolnimi!samci!(160).!Kot!posledica!večjega!števila!nevronov!je!pri! samicah! tudi! več! nevronov,! ki! izražajo! beljakovino! tirozinsko! hidroksilazo,! ki! je! vključena!v!biosintezo!dopamina!(160).!Po!drugi!strani!pa!je!presenetljivo,!da!so!v! AVPV! pri! samcih! ugotovili! večjo! prisotnost! nevronov,! ki! izločajo! opioidni! peptid! enkefalin,!kar!kaže,!da!spolni!steroidni!hormoni!vplivajo!na!specifično!populacijo! celic!med!razvojem!tudi!znotraj!enega!jedra!(161).! ! Spodnje! jedro! končne! strije! ( angl.! bed! nucleus! of! the! stria! terminalis;! BNST)! sodeluje! pri! endokrinem! uravnavanju! spolnega! obnašanja,! iskanju! partnerja! in! izražanju! lordoze! (162,! 163).! BNST! je! del! vohalnega! sistema! in! povezava! medialnega! dela! amigdale! ( angl.! medial! amygdala,! MeA)! in! hipotalamusa! ter! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 33! brez,gena,SF#1, drugih! bazalnih! delov! sprednjih! možganov.! V! njem! se! končujejo! eferentne! povezave!MeA!(164).!Razlike!med!spoloma!so!prisotne!samo!v!posameznih!delih! BNST,!medtem!ko!se!celotna!prostornina!jedra!med!spoloma!ne!razlikuje.!Tako!so! spolno! dimorfne! razlike! prisotne! v! medialnokposteriornem! delu! (BNSTMP),! ki! je! pri!podganjih!samcih!večji!kot!pri!samicah!(145)!in!vsebuje!tudi!večje!število!celic! (165).!Do!podobnih!ugotovitev!so!prišli!tudi!pri!morskih!prašičkih!(119)!in!ljudeh! (166).! V! lateralnokanteriornem! (BNSTLA)! in! medialnokanteriornem! (BNSTMA)! delu!BNST!pa!so!ugotovili!ravno!nasprotno,!da!imajo!samice!večje!število!nevronov! kot!samci!(118,!108).! ! Ventromedialno! jedro! hipotalamusa! ( angl.! ventromedial! nucleus! of! the! hypothalamus,!VMH)!je!spolno!dimorfen!del!hipotalamusa,!ki!leži!v!srednjem!delu! hipotalamusa,!bilateralno!od!tretje!možganske!kletke.!Nevroni!VMH!se!povezujejo! z!mnogimi!drugimi!možganskimi!jedri,!kot!so!supraoptično!jedro!( angl.!supraoptic! nuleus,! SON),! arkvatno! jedro! ( angl.! arcuate! nucleus,! Arc),! mediana! eminenca,! amigdala,! POA,! jedri! srednjih! možganov! in! podaljšane! hrbtenjače.! Jedro! VMH! razdelimo! na! tri! podpodročja,! in! sicer! dorzokmedialno,! centralno! in! ventrok lateralno,!ki!se!med!seboj!razlikuje!po!izraženosti!beljakovin,!dovodnih!povezavah! in! vlogi! (167).! VMH! ima! pomembno! vlogo! pri! uravnavanju! razmnoževanja,! predvsem! materinskega! obnašanja! in! lordoze,! in! energetskega! stanja! v! telesu! (107).!Prostornina!VMH!je!pri!podganah!večja!pri!samcih,!sami!nevroni!pa!so!večji! pri!samicah!(168).!Pri!samcih,!ki!so!jih!kastrirali!že!na!P1,!so!dosegli!feminizacijo! VMH,! kar! se! je! kazalo! kot! zmanjšano! področje! in! povečana! velikost! nevronov! v! primerjavi! s! kontrolnimi! samci! (168).! Ob! prisotnosti! estrogenov! in! progesterona! so! takšni! samci! izražali! lordozo.! Pri! mišjih! samcih! so! ugotovili! večje! število! nevronov,!ki!izražajo!nevralno!sintazo!dušikovih!oksidov!( angl.!neural!nitric!oxide,! nNOS),!kalbindin!Dk28k!in!ER!(169,!170,!171).!Večje!število!nevronov,!ki!izražajo! holecistokinin,! pa! so! odkrili! pri! podganjih! samcih! (172).! Več! različnih! študij! je! dokazalo,! da! se! v! VMH! nekatere! beljakovine! izražajo! različno! med! spolnim! ciklusom,!kar!kaže!na!vpliv!spolnih!steroidnih!hormonov!na!to!izražanje!(173,!174,! 175).! ! ! 34! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Hipokampus! je! del! najstarejšega! dela! možganske! skorje! in! je! sestavljen! iz! več! področij,!in!sicer!iz!hipokampusa!(Amonov!rog,!CA),!hipokampusove!vijuge!( gyrus! parahippocampalis),! nazobčene! vijuge! ( gyrus! dentatus),! hipokampusovega! vlakna! ( fimbria! hippocampi)! in! svoda! ( fornix).! Področje! hipokampusa! je! odgovorno! za! učenje! in! prostorsko! orientacijo.! Pri! različnih! sevih! miši! so! dokazali! razlike! med! spoloma!v!številu!živčnih!celic!v!področju!hipokampusa!(176).!! 2.2.3 Spolno&dimorfna&področja&v&možganih&pri&ljudeh& Proučevanje! razlik! med! spoloma! v! možganih! pri! ljudeh! nam! odpre! številna! vprašanja.!Če!imajo!spolni!steroidi!ključno!vlogo!pri!maskulinizaciji!možganov!pri! živalih! ali! imajo! takšno! vlogo! tudi! pri! človeku?! Ali! se! moški! in! ženske! različno! obnašamo! zaradi! tega,! ker! so! moški! že! prenatalno! izpostavljeni! večji! količini! testosterona?! Ali! se! obnašamo! različno,! ker! so! vloge! posameznega! spola! že! indoktrinirane! v! naši! družini! in! v! družbi?! Zaradi! kompleksnosti! človeškega! obnašanja,! ki! je! pod! močnimi! družbenimi! vplivi,! je! na! ta! vprašanja! zelo! težko! odgovoriti.! Zagotovo! na! diferenciacijo! človeških! možganov! vpliva! preplet! večih! dejavnikov!vse!od!hormonskih,!genetskih!in!v!veliki!meri!družbenih!in!okoljskih.! Kljub!temu!so!na!nivoju!zgradbe!možganov!poznane!nekatere!razlike!med!spoloma! tudi!pri!ljudeh,!tako!v!velikosti!posameznih!delov!oziroma!področij!možganov!kot! na!funkcionalni!ravni.! Pri! človeku! je! tudi! najbolj! raziskano! in! opisano! spolno! dimorfno! jedro! v! predoptičnem! področju,! ki! je! poimenovano! kot! intersticialno! jedro! sprednjega! hipotalamusa!( angl., interstitial!nucleus!of!anterior!hypothalamus!1;!INAH1)!in!je! del!intersticialnih!jeder!1,!2,!3!in!4!v!predoptičnem!področju!(INAH1,2,3,4).!Jedro! INAH1!naj!bi!bilo!pri!moških!večje!kot!pri!ženskah!in!naj!bi!pri!moških!vsebovalo! tudi! večje! število! celic! (123,! 124).! V! kasnejši! raziskavi! so! ugotovili! razlike! v! področjih!INAH2!in!INAH3,!niso!pa!potrdili!razlik!v!INAH1!(124).! V! zadnjih! desetletjih! se! je! več! raziskav! ukvarjalo! s! proučevanjem! razlik! v! možganskem!prečniku!( corpus! calosum;,cc)!pri!otrocih!(177)!in!pri!odraslih!(178)! (179).! V! nedavni! raziskavi! so! z! magnetno! resonanco! (MR)! opravili! meritve! možganskega!prečnika!pri!odraslih!ljudeh!(starost!od!18!do!94!let)!in!ugotovili,!da! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 35! brez,gena,SF#1, je!to!področje!pri!ženskah!signifikantno!večje!kot!pri!moških.!Pri!obeh!spolih!pa!so! ugotovili,!da!se!področje!s!starostjo!zmanjšuje!(180).! Nekatere! razlike! med! spoloma,! kjer! sta! močno! povezana! razvoj! možganov! pod! vplivom! spolnih! hormonov! in! posledično! obnašanje! ljudi,! lahko! proučujemo! pri! nekaterih! prirojenih! napakah! kot! sta! prirojena! hiperplazija! nadledvične! žleze! ( angl.!adrenal!hyperplasia!concenita,!AHC)!pri!ženskah!in!popolna!neodzivnost!na! androgene!zaradi!okvare!androgenskega!receptorja!(AR)!pri!moških.!Ženske!z!AHC! so! že! v! času! embrionalnega! razvoja! izpostavljene! višjim! koncentracijam! androgenov,! ki! jih! izločajo! nadledvične! žleze.! Pri! takih! ženskah! je! značilno,! da! je! njihovo! obnašanje! bolj! podobno! značilnemu! moškemu! obnašanju! in! da! jih! pogosteje! spolno! privlačijo! ženske! (181,! 182).! Moški,! ki! imajo! AR! popolnoma! neodzivne! na! androgene,! so! po! videzu! bolj! podobni! ženskam,! moda! ostanejo! v! trebušni! votlini,! razvite! imajo! zunanje! ženske! spolne! organe! in! običajno! imajo! slabšo! prostorsko! predstavo! in! boljše! komunikacijske! sposobnosti,! kar! običajno! bolj!pripisujejo!ženskam!(183).! 2.3 MIŠI!BREZ!GENA!ZA!STEROIDOGENI!DEJAVNIK!1! 2.3.1 Steroidogeni&dejavnik&1&–&SFF1& Steroidogeni!dejavnik!1!( angl.!steroidigenic!factor!1;!SFk1,!NR5A1)!je!član!družine! jedrnih!receptorjev,!kamor!uvrščamo!tudi!beljakovino!vinske!mušice!FTZkF1!( angl.! Fushi!tarazu!factor!1)!in!homolog!jetrnega!receptorja!LRHk1!( angl., liver&receptor& homolog)'pri'vretenčarjih!(184).!SFk1!vsebuje!dva!cinkova!prsta,!preko!katerih!se! veže! na! DNA.! Vsa! tri! področja,! in! sicer! področje! prvega! heliksa! –! P,! povezovalno! področje! in! področje! drugega! heliksa! –! D,! so! visoko! ohranjena! med! vrstami,! pri! sesalcih! celo! 100kodstotno! (185).! Področje! P! omogoča! prepoznavanje! veznega! mesta! za! DNA,! področje! D! pa! sodeluje! pri! nastanku! beljakovinske! dimere! in! prepozna!velikost!presledka!med!veznima!mestoma!(186).! Najprej! je! bil! SFk1! opisan! kot! ključni! urejevalec! izražanja! različnih! encimov! iz! skupine! citokromov! P450! (184).! V! nadaljnjih! raziskavah! so! ugotovili,! da! se! SFk1! izraža!v!različnih!tkivih,!in!sicer!v!gonadah,!skorji!nadledvične!žleze,!možganih!v! VMH! in! v! parenhimu! vranice! (187).! V! teh! tkivih! uravnava! prepisovanje! številnih! ! 36! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! genov! kot! so! encimi,! ki! sodelujejo! pri! nastanku! steroidnih! hormonov,! steroidogenega! akutnega! regulatornega! proteina,! receptorja! za! adrenokortikotropni! hormon! (ACTH),! antimüllerjevega! hormona,! αkpodenote! glikoproteinskih! hormonov,! βkpodenote! LH! in! FSH! in! njunih! receptorjev,! receptorja! GnRH! in! drugih! (188).! SFk1! je! prvotno! spadal! v! skupino! jedrnih! receptorjev! sirot,! za! katere! ni! točno! znano! ali! je! za! njihovo! delovanje! potrebna! vezava!z!drugo!spojino!ali!so!v!celici!aktivni!sami.!Nato!pa!je!Li!s!sodelavci!ugotovil,! da! se! SFk1! lahko! aktivira! z! metaboliti! holesterola! (189).! Znano! je,! da! ima! SFk1! pomembno! vlogo! pri! razvoju! in! delovanju! endokrinega! sistema! in! je! nujno! potreben! pri! spolni! diferenciaciji.! Če! v! času! embrionalnega! razvoju! SF#1! ni! prisoten,!se!spolne!žleze!in!nadledvična!žleza!ne!razvijejo,!zato!se!vse!miši,!ki!so! brez! SF#1!(SFk1KO),!fenotipsko!razvijejo!kot!samice!ne!glede!na!genetski!spol!(190,! 191).! Pri! mišjih! zarodkih! so! deveti! dan! embrionalnega! razvoja,! ko! še! ni! mogoče! ločiti! med! spoloma,! z! metodo! in, situ! hibridizacije! potrdili! izraženost! prepisa! SF#1! v! embrionalni!zasnovi!gonad.!Pri!E12,5!so!z!isto!metodo!dokazali! SF#1!v!zasnovi!za! nadledvične! žleze! in! vmesnih! možganov! ter! v! že! diferenciranih! gonadah.! Pri! odraslih! miših! so! ugotovili! izraženost! SF#1! na! ključnih! mestih! poteka! steroidogeneze!–!v!celicah!skorje!nadledvične!žleze,!v!Leydigovih!celicah!moda!ter! v!celicah!teke!in!granuloze!v!jajčniku!(67,!192),!kar!kaže!na!pomembno!vlogo! SF#1! v!embrionalnem!razvoju!in!tudi!kasneje!tako!pri!steroidogenezi.! 2.3.2 Priprava&transgenih&miši&brez& SF>1& S!pripravo!miši!z!mutiranim!genom! SF#1!se!je!ukvarjalo!več!raziskovalnih!skupin.! Sadovsky! in! njegovi! sodelavci! so! odstranili! del! tretjega! eksona,! ki! nosi! zapis! za! vezavo! na! DNA! in! ki! ga! vsebujejo! vse! izooblike! gena! SF#1., Iz! genomske! knjižnice! miši!seva!129Sv!so!izolirali!14kkb!velik!genomski!klon!gena! SF#1.!Sto!nukleotidov! dolgo! zaporedje,! regijo! med! dvema! Pml! 1! (znotraj! prvega! in! drugega! cinkovega! prsta!–!domena,!ki!se!veže!na!DNA),!so!nadomestili!s!PGKkneomicinsko!kaseto.!Ta! transgeni!konstrukt!so!z!elektroporacijo!vnesli!v!celične!linije!ES!RW4!iz!mišjega! seva! 129Sv.! Homologne! rekombinate! so! odbrali! z! analogom! neomicina! in! jih! testirali! s! prenosom! po! Southernu.! Odbrane! celice! so! injicirali! v! blastulo! seva! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 37! brez,gena,SF#1, C57BL/6! in! lekto! vnesli! v! psevdogravidno! samico! istega! seva! (193).! Na! podoben! način!so!do!transgenih!miši!prišli!tudi!Luo!in!njeni!sodelavci!(69).!Tretja!skupina!je! odstranila! nekoliko! večje! področje! kot! prejšnji! dve,! in! sicer! na! eksonu! 5! (194).! Nekoliko! kasneje! je! ena! izmed! skupin! inaktivirala! gen! s! spremembo! začetne! aminokisline,! in! sicer! so! metionin! zamenjali! z! izolevcinom.! Uporabili! so! metodo! ciljanja!genov!in!s!tem!dosegli!selektivno!omejeno!izražanje!genov! SF#1!in! ELP3,!ne! pa! ELP1!in! 2!(195).! Pri!vseh!poskusih!so!imele!mutacije!v!genu! SF#1!skoraj!enake!posledice!za!razvoj!in! delovanje!endokrinega!sistema!(196).! 2.3.3 Fenotip&miši&z&mutacijo&v&genu& SF>1&in&njihova&uporabnost& V!odsotnosti! SF#1!v!embrionalnem!razvoju!se!spolne!žleze!in!nadledvična!žleza!ne! razvijejo,!zato!se!vse!miši!brez!gena! SF#1!( angl.!SFk1!knockout,!SFk1!KO)!fenotipsko! razvijejo!kot!samice!ne!glede!na!genetski!spol!(190,!191).!Razvoj!spolnega!grebena! pri!miših!SFk1KO!poteka'normalno'do'E10,5.'Po'tem'času'začnejo'celice'v'procesu' apoptoze'propadati'in'vsi'zametki'spolnih'in'nadledvičnih'žlez'propadejo'do'E12,5.! Ker!miši!SFk1!KO!nimajo!nadledvične!žleze,!kmalu!po!rojstvu!poginejo.!Z!dnevno! aplikacijo! mešanice! kortikosteroidov! in! kasnejšo! presaditvijo! nadledvične! žleze! jim!omogočimo!preživetje!in!s!tem!možnost!raziskovanja!odraslih!živali!(197).!Več! o!tem!v!poglavju!o!materialih!in!metodah.! ! Nepravilnosti! v! strukturi! VMH! so! dokazali! pri! novorojenih! (198)! in! pri! odraslih! miših!brez! SF#1!(197).!Pri!odraslih!SFk1!KO!so!poleg!strukturnih!in!funkcionalnih! nepravilnosti! v! VMH! ugotovili! pozen! nastanek! debelosti,! za! kar! naj! bi! bilo! odgovorno!zmanjšano!gibanje!živali!in!ne!več!zaužite!hrane!(197).! Miši! brez! gena! SF#1! so! edinstven! model! za! proučevanje! hormonsko! neodvisnih! spolnih! razlik! v! možganih,! saj! zaradi! odsotnosti! SF#1! niso! nikoli! izpostavljeni! endogenim!steroidnim!hormonom.! ! ! 38! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 2.4 !OBNAŠANJE! 2.4.1 O&obnašanju&in&o&proučevanju&obnašanja& Obnašanje! predstavlja! povezavo! med! organizmi! in! okoljem! ter! med! živčnim! sistemom!in!ekosistemom.!Obnašanje!ima!pomembno!vlogo!v!življenju!živali,!saj!je! ključno!pri!biološkem!prilagajanju.!Pri!ljudeh!je!obnašanje!način!definicije!našega! življenja,!komunikacije,!interakcije!z!drugimi,!s!seboj!in!z!okoljem.! Zapisi! o! začetkih! proučevanja! obnašanja! živali! izvirajo! iz! časa! Darwina,! ki! je! natančno!opisoval!in!zapisoval!svoja!opažanja.! Pred! štirimi! desetletji! je! skupina! priznanih! znanstvenikov! prejela! Nobelovo! nagrado!iz!fiziologije!ali!medicine!s!področja!obnašanja!živali.!To!so!bili!von!Frisch,! Lorenz! in! Tinbergen,! ki! so! bili! nagrajeni! za! odkritja! o! individualnih! in! socialnih! vzorcih!obnašanja.!! Današnje! študije! na! živalih! običajno! izvajamo! v! laboratorijih! in! ne! v! naravnem! okolju,! saj! tako! lažje! zagotovimo! standardne! pogoje! in! čim! bolj! izključimo! faktor! vpliva! zunanjega! okolja! ter! s! tem! zagotovimo! večjo! mero! možnosti! ponovitve! meritve.!Zaradi!kompleksnosti!samega!proučevanja!obnašanja!so!pri!takih!študijah! velikokrat! vključene! različne! vede:! anatomija,! fiziologija,! genetika,! biokemija,! ekologija,! farmakologija! …! Seveda! je! tako! proučevanje! ljudi! zelo! težko,! zato! se! s! tem! ukvarja! še! več! ved,! kot! so! sociologija,! psihologija,! antropologija,! filozofija! in! druge.!Njihova!dognanja!se!močno!prepletajo!in!povezujejo.!! Kaj!sploh!obnašanje!je?!Definicijo!sta!postavila!že!pionirja!behavioristike!v!sredini! prejšnjega! stoletja,! Skinner! in! Hebb,! ki! sta! v! različnih! delih! zapisala,! da! so! obnašanje! vsi! zaznavni! procesi,! ki! nastanejo! kot! odziv! živali! na! določeno! spremembo,! ki! lahko! pride! iz! notranjosti! telesa! ali! zunanjega! sveta! (199).! Tako! obnašanje! obsega! vse! od! preprostega! giba! okončine! do! kompleksnih! socialnih! interakcij.!Ko!proučujemo!obnašanje,!ga!moramo!razdrobiti!na!posamezne!enote,! ki!jih!lahko!prepoznamo,!ocenimo,!ovrednotimo!vsakič,!ko!se!pojavijo.!Včasih!je!to! preprost!gib,!kot!na!primer!premik!očesne!veke,!običajno!pa!je!to!zaporedje!akcij,! ki!imajo!za!posledico!nek!funkcionalen!izid!kot!je!hranjenje!ali!beg!pred!plenilcem.! Na! vprašanja! o! obnašanju! lahko! odgovorimo! na! štirih! različnih! ravneh,! ki! pa! se! med! seboj! prepletajo.! Ta! vprašanja! so! poznana! kot! Tinbergenovi! štirje! ”zakaj”! ( angl.! Tinbergen’s, Four, Whys).! 1.! Čemu! je! namenjeno! obnašanje?! Odgovor! na! to! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 39! brez,gena,SF#1, vprašanje!je!funkcionalne!narave,!kot!na!primer!vloga!obnašanja!pri!nadaljevanju! vrste.! 2.! Kako! to! obnašanje! nastane?! Odgovor! na! to! vprašanje! je! razlaga! mehanizma! nastanka! obnašanja.! 3.! Kako! se! obnašanje! razvije?! To! se! nanaša! na! razvoj!obnašanja!vse!preko!embrionalnega!razvoja!do!socialnih!interakcij!in!vpliva! okolja.!4.!Od!kod!izvira!obnašanje?!Ta!se!nanaša!na!evolucijo,!preko!filogenetskega! razvoja! vrst! in! skupnih! prednikov! (199).! Odgovore! na! vsa! ta! vprašanja! lahko! proučujemo! in! pridobivamo! z! različnimi! metodami,! kot! so:! poskus,! opazovanje,! primerjava! ali! modeliranje.! Običajno! je! pri! študijah! uporabljena! kombinacija! teh! metod.!Glede!na!proučevanje!obnašanja!ga!lahko!razdelimo!v!različne!kategorije,!in! sicer! socialno,! spolno,! starševsko,! teritorialno.! Če! pa! gledamo! na! uporabo! posameznih! organskih! sistemov,! ga! lahko! razdelimo! na! gibalno,! prehranjevalno,! spolno,! čutno,! izobraževalno! …! (200)! Tako! pri! živalih! kot! pri! ljudeh! proučujemo! tudi! miselne,! čustvene! in! motivacijske! procese,! ki! so! kompleksnejši! in! zahtevajo! višjo! organizacijo! živčnega! sistema.! Posamezne! čustvene! procese! običajno! proučujemo! na! mišjih! modelih,! ki! izraziteje! izražajo! posamezna! obnašanja,! ki! so! podobna! duševnim! motnjam! pri! ljudeh.! To! so! anksioznost,! depresija,! avtizem! …! (201).!Najbolj!proučevana!miselna!procesa!pri!živalih!sta!spomin!in!učenje!(202).! Motivacijski! procesi! predstavljajo! obnašanja,! ki! imajo! običajno! za! posledico! nagrado.!To!so!procesi,!kot!so!hranjenje,!pitje,!spolno!obnašanje!ali!pa!motnje!kot! na!primer!odvisnost!od!drog!in!alkohola.!Ključni!nevrotransmiter,!ki!sodeluje!pri! uravnavanju!teh!procesov,!je!dopamin.!S!proučevanjem!teh!procesov!se!velikokrat! ukvarjajo! farmakološke! raziskave,! saj! je! razumevanje! dogajanja! pri! določenih! motnjah! motivacijskega! sistema! zelo! pomembno! za! reševanje! teh! težav! in! zdravljenja!specifične!motnje!(203,!204).!! Pri! večini! živali! vzorci! obnašanja! odražajo! kompleksnost! in! funkcionalno! organiziranost!živčnega!sistema.!Če!pogledamo!evolucijsko!skalo,!vidimo,!da!živčni! sitem! izraža! dva! trenda,! in! sicer! z! višjo! diferenciacijo! je! tudi! večja! centralizacija.! Primerjalne!študije!med!različnimi!živalskimi!vrstami!so!pokazale,!da!so!razlike!v! obnašanju,! ki! je! povezano! s! prilagajanjem! okolju,! odraz! anatomije! centralnega! živčnega!sistema!in!njegove!razvitosti.! Eden!od!pomembnejših!nadzornih!mehanizmov!obnašanja!je!živčni!nadzor.!Živčni! kontrolni! mehanizem! koordinira! odziv! živali! na! dejavnike! iz! okolja.! Zunanje! stimuluse! žival! zazna! s! čutnimi! organi,! preko! katerih! stimulus! pride! do! živčnega! ! 40! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! sistema,! ki! ga! na! nek! način! prevede! v! odziv,! ki! ga! opazimo.! Hormoni! prenašajo! informacije!po!telesu!počasneje!od!živčnih!celic,!vendar!pa!skupaj!živčni!sistem!in! kontinuirana! prisotnost! hormonov! tvorita! odličen! nadzorni! mehanizem! reakcij! oziroma! odzivov.! Hormoni! vplivajo! na! obnašanje! preko! različnih! poti,! vse! preko! živčnega! sistema,! čutnega! zaznavanja,! efektorskega! sistema! in! razvoja.! Učinki! hormonov! so! običajno! posledica! njihovega! delovanja,! ki! so! pod! vplivom! tako! genotipa! kot! okolja! (letnega! časa,! dela! dneva)! in! dosedanjih! izkušenj.! Nekateri! ponavljajoči! se! vzorci! obnašanja! so! posledica! interakcije! med! hormonskim! in! živčnim!sistemom!kot!na!primer!menstrualni!ciklus!(pojatveni!ciklusi!pri!živalih)! (205).! Navsezadnje! je! obnašanje! posledica! prepletov! genetskih! in! okoljskih! vplivov.!Za!pravilno!izražanje!genov!je!potrebno!primerno!biokemijsko!okolje.!To! okolje!je!pod!močnim!vplivom!dejavnikov!tako!iz!organizma!kot!tistih!daleč!izven! njega.!Pri!mnogih!živalski!vrstah!so!odkrili!celične,!biokemijske!in!druge!razvojne! poti,!preko!katerih!geni!vplivajo!na!obnašanje.!Nekateri!vplivi!so!močno!povezani!z! razvojem!senzoričnokmotornega!sistema,!drugi!pa!imajo!večji!vpliv!na!obnašanje,! kot!so!učenje!in!čustvenost.!Izražanje!gena!in!fenotipske!posledice!tega!izražanja!so! odvisne! tudi! od! drugih! genov! v! genomu.! Vplivi! genov! na! razvoj! in! evolucijo! obnašanja! so! lahko! so! intrak! in! intergenomski.! Nekateri! seksualni! spori! ali! spor! starš!–!potomec!so!lahko!odraz!fenotipskega!vpliva!genov.!Izražanje!gena,!ki!ima!za! posledico! nek! fenotip! obnašanja,! se! lahko! prenese! s! starša! na! potomca! (temu! pravimo! vtisnjenje! ali! vtisk! v! genom;! angl.! genomic! imprinting),! kjer! so! geni! podedovani! od! matere! ali! očeta! v! različnih! tkivih! selektivno! utišani.! Vtisku! v! genom!pripisujejo!velik!pomen!pri!evoluciji!anatomije!možganov,!razumevanja!in! socialnega!obnašanja!pri!primatih!(206).!! 2.4.2 Spolno&pogojena&obnašanja& Moški!in!ženske!se!obnašamo!različno!in!če!pogledamo!z!vidika!evolucije!lahko!to! razliko! pripišemo! obstoju! dveh! različnih! spolov.! Če! pa! pogledamo! z! vidika! mehanizma!nastanka!razlik,!se!nam!porodita!dve!ključni!vprašanji,!in!sicer:!kaj!je! pravzaprav!različno!med!moškimi!in!ženskimi!možgani!in!kako!se!te!razlike!med! spoloma! izrazijo! preko! različnih! mehanizmov.! V! zadnjih! desetletjih! smo! dobili! veliko!odgovorov!predvsem!na!prvo!vprašanje.!Zdaj!je!jasno,!da!so!isti!steroidni!in! peptidni! hormoni! vključeni! v! regulacijo! proizvodnje! gamet,! brejosti! (nosečnosti),! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 41! brez,gena,SF#1, kotitve!(poroda)!in!starševske!nege!ter!imajo!hkrati!velik!vpliv!na!možgane,!saj!ti! isti!hormoni!direktno!vplivajo!na!razvoj!spolno!dimorfnih!področij!v!možganih!in! se! tem! vplivajo! tako! na! reproduktivna! kot! nekreproduktivna! obnašanja! (207)! (208).!Pri!odgovoru!na!drugo!vprašanje!imamo!več!študij.!Eno,!ki!je!bila!narejena! na!kuščarjih! Cnemidophorus, (209),!in!druge,!ki!so!jih!naredili!pri!monogamnih!in! poligamnih!prerijskih!voluharicah!(210,!211,!212).! Prisotnost! spolnih! hormonov,! tako! estrogenov! kot! testosterona,! je! ključna! za! izražanje!spolno!značilnega!obnašanja!pri!vretenčarjih.!Nedavne!genetske!študije! so! pokazale,! da! spolni! hormoni! sprožijo! aktivacijo! številnih! molekularnih! mehanizmov,! ki! nadzirajo! nastanek! in! potek! spolno! značilnega! obnašanja! (213,! 214).! 2.4.2.1 Proučevanje*spolno*pogojenega*obnašanja*pri*modelnih*organizmih* Žensko! spolno! obnašanje! pri! živalih! proučujemo! na! različnih! področjih! in! z! različnih! pogledov.! Nekateri! ga! proučujejo! izključno! s! stališča! obnašanja,! primerjave! in! evolucije,! medtem! ko! ga! drugi! dojemajo! kot! biološko! značilno! obnašanje!in!se!poglabljajo!v!nevroendokrine,!celične!in!molekularne!mehanizme! ženskega!spolnega!obnašanja.! Pri! glodavcih! je! perinatalna! izpostavljenost! spolnim! hormonom! ključna! za! obnašanja,!ki!služijo!razmnoževanju!vrste.!To!vključuje!proceptivno!in!receptivno! oziroma!spolno!sprejemljivo!obnašanje!pri!samicah!ter!dvorjenje!in!kopulacijo!pri! samcih! (215).! Za! značilno! moško! obnašanje! veljata! tudi! agresivno! in! teritoralno,! medtem!ko!je!materinsko!obnašanje!značilno!žensko!obnašanje.!Vse!to!je!posledica! organizacijske!vloge!spolnih!hormonov!med!razvojem!(216).!Da!bi!dokazali!vpliv! hormonov!med!razvojem!na!obnašanje,!so!izvedli!različne!poskuse.!Pokazali!so,!da! neonatalno! kastrirani! samci! izražajo! lordozo! –! usločenost! hrbta! –! v! odraslem! obdobju,! če! jim! dodajamo! estrogene! in! progesteron.! To! obnašanje! je! lahko! izničeno,! če! istočasno! s! kastracijo! dodajamo! androgene! ali! estrogene! hormone.! Neonatalno! tretiranje! samic! z! androgeni! ali! estrogeni! privede! do! izražanja! značilnega! moškega! obnašanja! v! odraslem! obdobju.! Pojavi! se! celo! agresivno! obnašanje!proti!vsiljivcu!in!nekatere!značilnosti!teritoralnega!obnašanja!(14,!217,! 218,! 213,! 216).! Motena! pretvorba! androgenov! v! estrogene! z! blokado! aktivnosti! ! 42! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! aromataze!pri!samcih!prvih!nekaj!dni!po!rojstvu!ali!izbris!gena!za!encim!aromatazo! pri! miših! prepreči! maskulinizacijski! učinek! androgenov! in! ne! pride! do! spolne! diferenciacije! v! možganih.! V! tem! primeru! estrogeni! odigrajo! ključno! vlogo! pri! trajni!organizacijski!obliki!dimorfnega!živčnega!sistema!(219,!220,!221,!222).!Miši,! ki!so!jim!tarčno!izbrisali!gen!za!estrogenski!receptor!(ER)!in!so!brez!obeh!izoform! estrogenskega! receptorja,! ERα! in! ERβ,! so! pomemben! model! za! proučevanje! nastanka!spolno!različnega!obnašanja.!Pri!odsotnosti!ERα!so!ugotovili,!da!je!ERα! nujen!za!razmnoževanje!in!izražanje!spolnega!obnašanja,!ki!je!posledica!delovanja! estrogenov,!medtem!ko!za!ERβ!niso!ugotovili!tako!pomembnih!učinkov!(223,!224).! Kljub!temu,!da!razloga!za!fenotip!obnašanja!miši!brez!ERα!ne!moremo!neposredno! povezovati!z!organizacijsko!vlogo!steroidov!med!razvojem!in!kasnejšo!aktivacijsko! v!odraslem!obdobju,!so!s!primerjavo!spolnega!obnašanja!mišjih!samcev!brez!ERα! in!tistih!brez!ERβ!prišli!do!pomembnih!ugotovitev.!Namreč,!pri!samcih!brez!ERα!so! ugotovili! močno! zmanjšano! kopulatorno! obnašanje,! tako! vstope! v! nožnico! kot! ejakulacijo! (225).! Medtem! ko! pri! pomanjkanju! funkcionalnih! ERβ! niso! ugotovili! sprememb! pri! moškem! spolnem! obnašanju,! kar! kaže,! da! imajo! signalne! poti,! ki! potekajo!preko!ERα!pomembno!vlogo!pri!maskulinizaciji!spolnega!obnašanja!(224,! 226).!Na!drugi!strani!pa,!ko!so!kastriranim!mišim!brez!ERβ!dodajali!estrogene!in! progesteron! ter! jih! potem! testirali! za! žensko! spolno! obnašanje,! so! lekti! izražali! lordozo,!ki!je!bila!dvakrat!bolj!izražena!kot!pri!miših!divjega!tipa!(226),!kar!kaže!na! vlogo!ERβ!pri!procesu!defeminizacije!spolnega!obnašanja.!Do!podobnih!ugotovitev! so! prišli! z! uporabo! farmakoloških! pripravkov:! pri! tretiranju! novorojenih! mišjih! samic! z! ERβ! selektivnimi! agonisti! je! prišlo! do! signifikantno! spremenjenega! izražanja! lordoze,! medtem! ko! selektivna! aktivacija! ERα! ni! povzročila! podobnega! učinka! (227).! Ti! podatki! kažejo! tudi! na! to,! da! sta! proces! maskulinizacije! in! defeminizacije!ločena!procesa!in!potekata!preko!različnih!ER.! Za!spolno!značilno!obnašanje,!moško!in!žensko,!je!pomembna!prisotnost!spolnih! hormonov! pred! (organizacijski! učinek)! in! po! rojstvu,! tudi! v! odraslem! obdobju! (aktivacijski!učinek)!(228,!229,!230,!231,!232,!233).! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 43! brez,gena,SF#1, 2.4.2.2 Žensko*spolno*obnašanje* Žensko! spolno! obnašanje! pri! glodavcih! razdelimo! v! tri! faze,! in! sicer! privlačnost,! proceptivnost! in! receptivnost.! V! prvi! fazi! privlačnosti! lahko! ocenimo,! koliko! je! samica! privlačna! za! samca! in! obratno.! V! veliki! meri! ja! ta! faza! odvisna! od! feromonov,!ki!jih!izločata.!Druga!faza!je!proceptivnost!ali!prekopulatorna!faza,!ki! nastopi!pred!kopulacijo.!Tu!lahko!ocenimo,!koliko!je!samica!motivirana!za!parjenje! (234).! Samica,! ki! je! pripravljena! na! paritev,! nemalokrat! prva! vzpostavi! stik! s! samcem.! Običajno! ga! ovohava! v! anogenitalnem! predelu! ali! pa! se! ga! s! smrčkom! dotakne!na!stranskih!delih!trupa.!Hitro!se!mu!približuje!in!oddaljuje,!kar!stimulira! samca,! da! se! ji! približa! in! začne! ovohavati! anogenitalni! predel! (235,! 236).! Tretja! faza! je! receptivnost! ali! spolna! sprejemljivost,! kjer! samica! s! svojim! obnašanjem! samcu!dovoli!naskok,!zato!to!fazo!imenujemo!tudi!kopulacijska.!Ko!samec!naskoči! samico,! se! lekta! refleksno! usloči,! to! je! t.i.! lordozni! refleks! ali! lordoza! (L,! angl.! lordosis),!pri!kateri!poleg!usločenega!hrbta!in!dvignjene!glave!samica!umakne!rep! na!stran!in!privzdigne!področje!perineuma,!da!omogoči!kopulacijo!oziroma!vstop! penisa! v! nožnico! (32).! Po! uspešni! kopulaciji! in! ejakulaciji! se! samica! umakne,! da! prepreči! ponovne! stike! s! samcem.! V! tem! času! se! izloča! prolaktin,! ki! pripravi! maternico!na!vsaditev!zarodka.! Ventromedialno! jedro! hipotalamusa! (VMH)! in! predoptično! področje! (POA)! sta! področji! v! možganih,! ki! uravnavata! refleks! lordoze.! Jedro! VMH! vsebuje! veliko! koncentracijo! estrogenskih,! progesteronskih! in! oksitocinskih! receptorjev,! zato! je! pomemben! urejevalec! mnogih! signalnih! poti.! Študije! so! pokazale,! da! neposredno! dovajanje! estrogenov! v! VMH! zadostuje! za! nastanek! lordoze.! Če! je! to! področje! poškodovano,!je!refleks!lordoze!zavrt!(237,!238).!Rubin!in!Barfield!sta!dokazala,!da! kombinacija!estrogenov!in!progesterona!deluje!močneje!kot!sami!estrogeni!(239).! Za! POA! velja,! da! je! ključno! področje! pri! zaviranju! lordoze.! S! farmakološko! poškodbo! POA! je! bila! lordoza! pri! podganjih! samicah! izboljšana,! ko! pa! so! to! področje! električno! stimulirali,! se! je! refleks! lordoze! poslabšal! (240).! Sam! potek! refleksa! lordoze! je! že! dodobra! znan.! Med! naskokom! se! že! pri! vzpenjanju! preko! dotikanja!kože!v!ledvenem!predelu!pri!spolno!sprejemljivi!samici!sproži!lordoza.! Ta!čutni!signal!potuje!preko!dorzalnih!korenin!ganglijev!do!hrbtenjače,!kjer!potem! potuje! naprej! do! mreževine! v! možganskem! deblu! ( angl.! medullary! reticular! ! 44! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! formation! in! the! hind! brain)! in! do! centralne! sivine! v! srednjih! možganih! ( angl.! midbrain! central! gray,! MCG).! VMH! in! POA! z! ustreznimi! hormoni! pošljeta! signal! preko!srednjega!dela!hipotalamusa!naprej!do!ostalih!predelov!možganov.!Signal!se! potem! vrača! preko! centralne! sivine! v! mreževino! v! srednjih! možganih! in! v! medialno! kolenasto! telo! talamusa! ( angl.! medial! geniculate! body).! Mreževina! in! medialno!kolenasto!telo!skupaj!aktivirata!motorične!živce!v!hrbtenjači!in!pride!do! lordoze! oziroma! usločenega! hrbta! (234,! 241).! Izražanje! lordoze! je! odvisno! od! prisotnosti! estrogenov! in! velikokrat! tudi! progesterona.! Do! izražanja! lahko! pride! tudi! v! odsotnosti! progesterona,! vendar! so! potem! potrebne! višje! koncentracije! estrogenov! (242).! Pri! miših! brez! progesteronskih! receptorjev,! kljub! dodajanju! obeh!potrebnih!hormonov,!niso!uspeli!izzvati!izražanja!lordoze!(243).!Podobno!so! dokazali!tudi!pri!podganah,!ki!so!jim!injicirali!protismiselno!DNA!( angl.!antisense! DNA)! za! progesteronski! receptor! neposredno! v! hipotalamus! in! potem! z! dodajanjem!estrogenov!ter!progesterona!dosegli!bistveno!slabše!izražanje!lordoze! kot!pri!kontrolni!skupini!(244).!Poleg!nujno!potrebnih!estrogenov!in!progesterona! je! za! pravilno! izražanje! lordoze! potrebna! prisotnost! tudi! nekaterih! drugih! nevropeptidov!in!nevrotransmiterjev.!Eden!pomembnejših!je!oksitocin,!ki!nastaja!v! PVN! (paraventrikularno! jedro! hipotalamusa)! in! SON.! Druga! sta! kateholamin,! ki! deluje!kot!nevrotransmiter!in!nevrohormon,!in!dopamin.!V!eni!zgodnejših!študij!so! pri!podganah!dokazali,!da!so!z!dodajanjem!dopaminskega!agonista!in!estrogenov! izzvali! izražanje! lordoze! (245).! Pri! refleksu! izražanja! lordoze! sodelujejo! še! acetilholin,!serotonin,!GABA,!opioidi!in!prolaktin!(246).!Spolni!hormoni!posredno! in!neposredno!vplivajo!na!izločanje!nevrotransmiterjev,!ki!spodbudijo!ali!zavrejo! določeno!obnašanje,!kar!je!odvisno!od!področja!v!živčnem!sistemu,!kjer!delujejo.! 2.4.2.3 Agresivno*obnašanje* Agresivno! obnašanje! sodi! v! skupino! socialnega! obnašanja! in! je! različno! med! spoloma.! Širši! pojem! socialnega! obnašanja! zajema! medsebojne! vplive! med! posamezniki,! od! katerih! ima! vsaj! eden! ali! več! posameznikov! korist,! kar! so! tako! agresivne!kot!neagresivne!oblike!medsebojnih!vplivov.!Če!pogledamo!na!agresivno! obnašanje!s!strani!osebka,!ki!je!tarča!agresivnega!obnašanja,!lahko!rečemo,!da!je!to! nasprotno!od!socialnega!obnašanja.!Če!pa!pogledamo!s!strani!osebka,!ki!agresivno! obnašanje!izvaja,!pa!lahko!rečemo,!da!so!na!nek!način!socialni!stiki!celo!izboljšani.! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 45! brez,gena,SF#1, Kot! na! primer! pri! zaščiti! kolonije! pred! plenilci! oziroma! vsiljivci,! materinska! agresivnost…! Za! agresivno! obnašanje! ni! značilna! samo! fizična! oblika! stika,! lahko! gre!tudi!samo!za!kretnjo,!grožnjo,!obred!ali!aktivnost,!ki!nakazuje!poraženca!(204).! Raziskave,! ki! se! ukvarjajo! s! proučevanjem! agresivnosti! tako! v! humani! kot! v! veterinarski!medicini,!si!prizadevajo!k!boljšemu!razumevanju!in!nadzoru!patološke! agresivnosti! (247),! medtem! ko! pri! poskusih! v! laboratoriju! uporabljamo! živalske! modele,! ki! izražajo! značilno! oziroma! vrstno! specifično! agresivno! obnašanje.! Ko! proučujemo! agresivno! obnašanje! pri! živalih,! je! zelo! pomembno,! da! upoštevamo! etologijo!agresivnega!obnašanja!za!posamezno!živalsko!vrsto.!Agresivni!znak,!drža! in!dejanje!so!orodja!živali,!da!doseže!želeni!cilj!ali!da!se!ubrani!napadalcu!(248).! Agresivno!obnašanje!se!pojavi,!ko!posamezniki!tekmujejo!za!ozemlje!(območje!–!v! primeru! laboratorijskih! pogojev),! hrano,! vodo! ali! druge! dobrine,! povezane! s! preživetjem! in! razmnoževanjem.! Ko! pa! gre! za! zaščito! območja! ali! potomcev! pa! govorimo!o!teritorialni!(ozemeljski)!ali!materinski!agresiji!(249).!Vrsto!agresije,!ko! gre! za! zaščito! ozemlja,! teritorialna! agresija,! imenujemo! rezidentkvsiljivec! ( angl.! residentkintruder! aggression).! V! tem! primeru! rezident! (domačin)! ščiti! svoj! teritorij.! To! je! značilno! agresivno! obnašanje! med! samci! ( angl.! intermale! aggression),!ki!se!odraža!kot!napadi,!ugrizi,!odrivanje,!preganjanje!vsiljivca!(250,! 251).! Agresivno! obnašanje! ima! nemalokrat! pozitivne! strani! tako! za! posameznika! kot!za!vrsto,!kot!na!primer!hierarhična!dominanca,!ki!se!vzpostavi!med!rivalskimi! samci.!Zmagovalni!samec!tako!doseže,!da!se!na!določenem!teritoriju!pari!samo!on.! Podoben!učinek!lahko!v!laboratorijskih!pogojih!dosežemo!z!izolacijo!ali!posamično! nastanitvijo!samcev!in!dosežemo!t.i.!z!izolacijo!izzvano!agresivnost!( angl.!isolationk induced!aggression)!(252,!249).!! Samo!agresivno!obnašanje!lahko!opredelimo!glede!na!način!izražanja!in!posledico! kot! napadalno! ( angl.! offensive)! ali! obrambno! ( angl.! defensive).! Obrambno! obnašanje! se! pojavi! kot! odgovor! na! grožnjo! ali! na! dražljaj,! ki! izzove! strah,! in! se! običajno!zaključi!s!pobegom!(253).!Pri!samcih!glodavcev!se!obrambno!obnašanje! kaže!kot!pobeg,!otopelost,!obrambna!poza!ali!grožnja!nazaj!proti!napadalcu!(254,! 255,!256).!Samice!glodavcev!po!porodu!kažejo!materinsko!agresivnost,!ki!vključuje! tako!obrambne!kot!napadalne!elemente!z!namenom,!da!bi!zaščitila!potomce!pred! moškim!vsiljivcem!(257).! ! 46! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Nasilje!velja!med!etologi!za!nekoliko!sporen!izraz,!kljub!temu!pa!je!opredeljeno!kot! eskalirano,!patološko!in!nenormalno!agresivno!obnašanje,!ki!se!kaže!kot!podaljšani! in! pogostejši! napadi! in! ugrizi! ter! z! močno! zmanjšano! latenco! (latenca! je! čas! od! začetka! testa! do! izražanja! določene! aktivnosti)! v! primerjavi! s! prilagojeno! agresivnostjo! oziroma! pričakovano! agresivnostjo! (248,! 258).! To! pomeni,! da! se! ugrize! v! bolj! občutljive! predele! telesa! smatra! za! nenormalno! oziroma! nasilno! v! primerjavi!z!ugrizi!prilagojene!ali!pričakovane!agresivnosti,!kjer!napadalec!grize!v! predel! hrbta! ali! bokov! (259).! Agresivnost! pri! ljudeh! in! pri! živalih! ima! nekatere! podobnosti,! vendar! pri! živalih! agresivnost! ni! tako! kompleksna! kot! je! pri! ljudeh.! Družbene! norme! postavljajo! meje,! kaj! je! sprejemljivo! in! primerno! agresivno! obnašanje,! medtem! ko! je! neprimerno,! pretirano! agresivno! obnašanje! oziroma! nasilje!resno!vprašanje!v!sociološki!in!medicinski!stroki,!ki!se!ukvarja!z!duševnim! zdravjem!(260).!Agresija!je!vključena!kot!simptom!pri!mnogih!duševnih!motnjah! kot!so!shizofrenija,!anksioznost,!prilagoditvena!motnja,!manična!depresija,!avtizem! in!druge!(253).! Agresivno! obnašanje! je! tudi! spolno! dimorfno! izraženo,! in! sicer! je! bolj! intenzivno! pri! samcih/moških! kot! pri! samicah/ženskah.! Izražati! se! začne! v! puberteti,! ko! se! moda!pod!vplivom!LH!(luteinizirajočega!hormona)!povečajo!in!začno!izločati!več! androgenov.!Če!pogledamo!to!obdobje!pri!glodavcih,!je!povezano!z!odstavitvijo!iz! gnezda,!iskanjem!in!vzpostavljanjem!teritorija,!iskanjem!hrane!in!samic!za!parjenje! (261).!Že!med!razvojem!in!tudi!potem!v!odraslem!obdobju!androgeni!pomembno! vplivajo! na! agresivno! obnašanje.! Pri! miših! že! zgodnja! odstranitev! mod,! takoj! po! rojstvu,! značilno! zmanjša! agresivnost,! kljub! dodajanju! testosterona! v! odraslem! obdobju.! Ravno! obratno! pa! dodajanje! testosterona! samicam! takoj! po! rojstvu! bistveno! poveča! njihovo! agresivnost! v! odraslem! obdobju! (262).! Pri! miših! in! podganah! so! ugotovili,! da! ima! celo! položaj! plodov! v! maternici! vpliv! na! razvoj! spolno! različnega! nevroendokrinega! sistema.! Ugotovili! so,! da! so! samice,! ki! so! v! maternici!ležale!med!dvema!moškima!plodoma,!izražale!bolj!agresivno!obnašanje! kot!tiste,!ki!so!ležale!med!dvema!samicama.!Isto!so!ugotovili!pri!samcih.!Poleg!tega! so!ugotovili!še!razlike!v!nekaterih!fizioloških!parametrih!in!v!morfologiji.!Nastanek! teh!sprememb!naj!bi!bil!posledica!delovanja!testosterona,!ki!ga!izločajo!samčki!v! času!fetalnega!razvoja!in!prehaja!na!sosednje!plodove!(96).!Če!odstranimo!moda,! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 47! brez,gena,SF#1, se! pri! večini! živalskih! vrst! agresivnost! močno! zmanjša.! Pri! samcu! prerijske! voluharice,! kalifornijske! miši! in! pri! miših! linije! CDk1! pa! vpliva! kastracije! na! zmanjšanje!agresivnosti!niso!ugotovili!(263,!264,!265).!Z!merjenjem!koncentracije! testosterona! v! krvi! so! hoteli! dokazati! povezavo! med! koncentracijo! in! izražanjem! agresivnega! vedenja,! vendar! so! nekatere! raziskave! dokazale! pozitivno! povezavo! med! koncentracijo! testosterona! v! krvi! in! agresivnostjo,! druge! pa! ne! (266).! Vpliv! testosterona! na! povečano! agresivnost! je! verjetno! prisoten! samo! v! mejah! fizioloških!vrednosti,!saj!so!ugotovili,!da!pri!povišanih!koncentracijah!testosterona! v!krvi!agresivnost!ni!bila!povečana!(267).! Testosteron! vpliva! na! agresivno! obnašanje! v! nespremenjeni! ali! pa! v! metaboliziranih! oblikah.! V! možganih! se! pretvori! v! 5αkdihidrotestosteron! ali! v! estradiol!(251).!Pri!samcih!brez!gena!za!ERα!je!agresivno!obnašanje!proti!drugemu! samcu! le! redko! izraženo,! kar! kaže! na! pomembno! vlogo! ERα! pri! agresivnem! obnašanju! (268,! 225).! Medtem! ko! pri! samcih! brez! ERβ! niso! opazili! bistvenih! sprememb!v!agresivnem!obnašanju!v!primerjavi!s!kontrolno!skupino!(269).! Agresivno! obnašanje! uravnavajo! področja! MPOA,! LS,! sprednji! hipokampus,! VMH,! področje!sivine!ob!ventriklih!( angl.!periaqueductal!gray,!PAG),!MeA!in!BNST,!ki!pa! se!povezujejo!še!z!možgansko!skorjo!in!področji,!ki!sprejemajo!dražljaje!iz!čutil.!Pri! glodavcih! so! za! uravnavanje! agresivnega! obnašanja! najpomembnejši! vohalni! betiči.! Pri! vrstah,! kjer! je! čutilo! za! vid! in! sluh! bolje! razvito,! pa! so! pomembnejša! področja! tista,! ki! sprejemajo! dražljaje! iz! teh! čutil! (270).! Ko! so! podganam! poškodovali!področja!LS,!BNST,!sprednjega!hipokampusa!in!MeA,!se!je!agresivno! obnašanje!zmanjšalo!(271).!Ko!pa!so!poškodovali!področje!orbitofrontalnega!dela! možganske! skorje,! je! bilo! agresivno! obnašanje! močneje! izraženo,! kar! kaže! zaviralno!vlogo!tega!področja!na!agresivno!obnašanje!(272).! Pri!samem!uravnavanju!agresivnosti!pa!imajo!posamezna!jedra!različne!vloge,!tako! na! primer! dorzomedialni! del! VMH! in! kavdoventralni! del! MeA! sodelujeta! pri! obrambnem! obnašanju,! medtem! ko! posterodorzalni! del! amigdale! sodeluje! pri! napadalnem!obnašanju!(273).! V! sistem! agresivnega! obnašanja! je! vključenih! več! nevrotransmiterjev.! Eden! ključnih! je! serotonin! (5khidroksitriptamin,! 5kHT).! Nepravilno! uravnavanje! vseh! podvrst!serotoninskih!receptorjev,!transporterjev,!sintetizirajočih!in!metaboličnih! ! 48! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! encimov,!je!neposredno!povezano!s!spremenjenim!agresivnim!obnašanjem!(253).! Znižana! koncentracija! serotonina! povečuje! agresivnost,! zvišana! pa! zmanjšuje.! Nizko! koncentracijo! lahko! uravnavamo! z! dodajanjem! različnih! farmakoloških! snovi,!kot!so:!metaboliti!predhodnikov!serotonina,!zaviralci!ponovnega!prevzema! serotonina!ali!z!agonisti!serotoninskih!receptorjev!5kHT1A!in!5kHT1B.!Z!dodajanjem! teh!snovi!so!pri!miših!zmanjšali!agresivno!obnašanje!(274,!275).!Da!serotoninska! receptorja!1A!in!1B!različno!delujeta!na!agresivno!obnašanje,!so!dokazali!pri!miših,! ki! so! brez! gena! za! 5kHT1A!in! miših,! ki! so! brez! gena! za! 5kHT1B.! Miši! se! fenotipsko! močno! razlikujejo.! Miši! brez! 5kHT1A! receptorjev! kažejo! več! tesnobnega! in! manj! reaktivnega! obnašanja,! so! tudi! manj! agresivne! (276).! Serotoninski! sistem! pa! se! povezuje! tudi! z! drugimi! nevrotransmiterji,! ki! imajo! vpliv! tudi! na! agresivno! obnašanje.!To!so!GABA,!glutamat!in!CRF!(kortikotropin!sproščujoči!dejavnik;! angl.! corticotropin!releasing!factor).!Povezuje!pa!se!tudi!z!nevropeptidi,!kot!so!arginin! vazopresin,! oksitocin,! nevropeptid! Y! (NPY,! angl.! neuropeptide! Y),! opioidi.! S! proučevanjem! genetsko! spremenjenih! miši! so! ugotovili! tudi! neposreden! in! posreden!vpliv!nekaterih!molekul!na!uravnavanje!izražanja!agresivnega!obnašanja.! Ena!pomembnejših!je!nNOS!(nevralna!sintaza!dušikovih!oksidov)!(253).! Poleg! že! omenjenih! snovi! pa! pri! uravnavanju! agresivnosti! zaradi! socialnega! srečanja!sodelujejo!tudi!dopamin!in!noradrenalin!(270).! ! S! proučevanjem! in! opazovanjem! obnašanja! pri! miših! ugotavljamo! tako! njihova! naravna/običajna! obnašanja! in! vedenjske! vzorce,! ki! so! posledica! fizioloških! procesov,!kot!tudi!obnašanja,!ki!so!posledica!patofizioloških!procesov.!Obnašanja,! ki! so! posledica! patofizioloških! procesov! proučujemo! z! uporabo! standardiziranih! testov! za! proučevanje! posameznih! duševnih! motenj! (kot! na! primer! anksioznost,! depresija,!obsesivno!kompulzivne!motnje!…).!! ! 2.5 POMEN!PROUČEVANJA!RAZLIK!MED!SPOLOMA! Naj!na!tem!mestu!predstavim!še!čisto!praktični!primer,!zakaj!je!proučevanje!razlik! med!spoloma!pomemben!tudi!pri!ljudeh.! Vemo,! da! smo! si! med! spoloma! različni,! tako! vizualno! kot! tudi! na! najmanjšem! celičnem,! genetskem! področju,! vendar! pa! se! sodobna! medicina! in! načini! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 49! brez,gena,SF#1, zdravljenja!bolezni!tega!velikokrat!ne!zavedajo.!Z!razvojem!znanosti!in!posledično! tudi! zdravil! pa! gre! zdravljenje! v! smeri! razvoja! osebnega! zdravljenja,! prilagajanja! zdravljenja!posamezniku.! V! večini! primerov,! ko! so! proučevali! izražanja! shizofrene! motnje! pri! ljudeh,! so! običajno! proučevali! moške.! Vendar! so! nedavne! študije! Jiméneza! in! njegovih! sodelavcev! pokazale,! da! to! ni! ravno! dobra! izbira! (277,! 278).! Ne! samo,! da! so! ugotovili! razlike! med! spoloma,! ugotovili! so! tudi! razlike! pri! ženskah! znotraj! menstrualnega!ciklusa.!Z!metodo!MRI!so!primerjali,!katera!področja!v!možganih!so! aktivna!v!poskusu,!ko!morajo!primerjati!3D!strukture!v!običajni!in!potem!v!rotirani! ali! zrcalni! obliki,! kar! je! poznano! kot! t.i.! mentalna! rotacijska! naloga! ( angl.! mental! rotation!task).!V!širši!populaciji!ljudi!velja,!da!imajo!moški!boljšo!prostorsko,!torej! 3D! predstavo,! kot! ženske,! kar! so! pokazale! številne! študije! (pregled! v! (279)).! V! študiji! bolnikov! s! shizofrenijo! v! primerjavi! z! zdravimi! ljudmi! se! je! pokazalo,! da! imajo!zdravi!moški!veliko!boljšo!prostorsko!predstavo!kot!zdrave!ženske,!medtem! ko!pri!bolnikih!s!shizofrenijo!pride!do!ravno!obratnega!pojava.!Moški!s!shizofrenijo! imajo! močno! zmanjšano! prostorsko! predstavo! v! primerjavi! z! zdravimi! moškimi,! hkrati! pa! tudi! nižjo! kot! zdrave! ženske! in! ženske! s! shizofrenijo.! Pri! ženskah! s! shizofrenijo! pa! ostane! ta! zmožnost! prostorske! predstave! približno! ista! kot! pri! zdravih! ženskah.! Če! bi! torej! proučevali! izražanje! tega! simptoma! samo! pri! enem! spolu! (test! mentalne! rotacije! je! zelo! pogost! test! pri! psihiatričnih! motnjah),! bi! nemara! ta! simptom! pri! enem! izmed! spolov! spregledali! ali! ga! ocenili! kot! zelo! pomembnega.!In!to!je!samo!eden!izmed!mnogih!primerov,!kjer!se!je!izkazalo,!da!je! potrebno! proučevati! oba! spola,! saj! so! spolne! razlike! v! pojavnosti! ali! v! resnosti! simptomov! znane! pri! številnih! duševnih! boleznih! kot! so! depresivna! motnja,! anksiozna! motnja,! avtizem,! pa! tudi! nevrodegenerativne! bolezni,! kot! sta! alzheimerjeva!in!parkinsonova!bolezen.! Nedavno!je!ameriški!nacionalni!inštitut!za!zdravje!(NIH)!sprejel!konvencijo,!da!je! za!predklinične!študije!potrebno!uporabiti!živali!in!celične!kulture!obeh!spolov.!To! je! povzročilo! nemalo! negodovanja! med! znanstveniki,! češ! da! bo! to! zelo! zvišalo! stroške! raziskav! (280).! Na! to! so! se! odzvali! znanstveniki! s! področja! proučevanja! razlik! med! spoloma! in! opozorili! na! stroške,! ki! jih! povzročijo! raziskave,! ki! ne! upoštevajo!razlik!med!spoloma.!Pride!do!neuspelih!kliničnih!študij!(ki!so!običajno! veliko! dražje! kot! predklinične),! do! napačnih! diagnoz! in! običajno! neprimernega! ! 50! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! zdravljenja! žensk,! saj! se! v! največ! primerih! že! v! bazičnih! raziskavah! uporablja! predvsem!ali!samo!samce!(281).! ! Področje! proučevanja! razlik! med! spoloma! ima! zato! velik! pomen! za! razvoj! personaliziranega! pristopa! zdravljenja! ne! samo! v! psihiatriji.! Ta! pomembnost! se! kaže! tudi! na! drugih! medicinskih! področjih,! saj! se! tudi! številne! druge! bolezni! pojavljajo!med!spoloma!različno!pogosto,!skoraj!zagotovo!kot!posledica!razlike!v! delovanju!naših!teles.!Med!takšne!bolezni!spadajo!tudi!številna!rakasta!obolenja!in! prav! v! onkologiji! se! že! uspešno! uporablja! oseben! pristop! k! zdravljenju! vsakega! bolnika,!glede!na!značilnosti!njegove!bolezni.!Vendar!pa!ostaja!na!tem!področju!še! veliko!odprtih!vprašanj,!na!katera!še!nimamo!odgovora,!med!katerimi!so!izjemno! pomembna!tudi!vprašanja!glede!razlik!med!spoloma.! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 51! brez,gena,SF#1, 3 MATERIALI!IN!METODE! 3.1 VZREJA!IN!PRIPRAVA!ŽIVALI!ZA!POSKUS! 3.1.1 &Vzreja&živali& Celotna! raziskava! je! bila! narejena! na! laboratorijskih! miših,! Mus! musculus,! seva! C57BL/6J,!ki!so!bile!vzrejene!na!Centru!za!genomiko!živali!Veterinarske!fakultete! Univerze! v! Ljubljani.! Za! raziskavo! smo! pridobili! dovoljenje! s! strani! Veterinarske! uprave!republike!Slovenije!(pod!številko!34401k32/2012/8)!in!je!bila!opravljena!v! skladu!z!etičnimi!načeli!direktive!Evropske!Unije!(2010/63/EU).!Miši!smo!vzrejali! pri!standardnih!laboratorijskih!pogojih,!in!sicer!pri!temperaturi!med!20!in!25!°C,! vlažnosti!40!do!60!%!in!z!umetno!osvetlitvijo!s!ciklusom!svetloba!proti!tema!12:12! ur.! Hrano! brez! fitoestrogenov! (Harlan! Teklad! 2016,! Velika! Britanija)! in! vodo! z! dodatkom! klorovodikove! kisline! (1mL! HCL/500mL! vode)! so! imele! na! voljo! ad! libitum.! 3.1.2 Priprava&poskusnih&živali& Za!raziskavo!smo!uporabili!model!gensko!spremenjenih!miši,!ki!imajo!del!gena!za! SFk1,!ki!kodira!vezavno!domeno!za!DNA,!izrezan!in!preostanek!prekinjen!z!zapisom! za!gen!za!neomicin!( SF#1,neo)!(195).!Miši!so!bile!prvotno!pripravljen!na!Univerzi! DUKE!v!Severni!Karolini!(ZDA)!(v!laboratoriju!prof.!dr.!Kietha!Parkerja),!od!koder! smo! jih! pripeljali! v! hlevček! Centra! za! genomiko! živali! v! Ljubljani.! Da! bi! pridobili! miši,!ki!so!homozigoti!za!izbiti!gen! SF#1,!SFk1!KO,!smo!morali!med!seboj!pariti!miši,! ki!so!heterozigoti!za!izbiti!gen!SFk1!(SFk1!HET).! 3.1.2.1 *Priprava*živali*za*ugotavljanje*izražanja*genov*v*možganih* Raziskava!je!bila!opravljena!v!dveh!delih.!V!prvem!delu!raziskave!smo!med!seboj! parili!miši!SFk1HET!tako,!da!smo!združili!enega!samca!in!tri!samice.!Vsako!samico! smo! pri! vidni! brejosti! odstavili! od! samca! in! je! bila! nato! do! odstavitve! mladičev! sama!z!njimi.!Vsi!mladiči!so!od!rojstva!(P0)!do!7.!dneva!po!rojstvu!(P7)!prejemali! mešanico! kortikosteroidov! (400! μg/mL! hidrokortizona;! 400! ng/mL! deksametazona;! 100! ng/mL! fludrokortizona);! raztopljenih! v! koruznem! olju.! Dnevno! so! mladiči! pod! kožo! (s.c.)! prejeli! 50! μL! kortikosteroidne! mešanice.! Za! ! 52! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! določitev!genotipa!smo!med!P4!in!P6!odvzeli!biološki!material,!ker!fenotipsko!ne! moremo! določiti! spola.! Po! genotipizaciji! smo! mladičem! SFk1! KO! presadili! nadledvično!žlezo,!da!smo!jih!ohranili!pri!življenju!brez!kortikosteroidnih!injekcij! (197).!Za!darovalce!nadledvične!žleze!smo!uporabili!samice!divjega!tipa!( angl.!wild! type,!WT)!iz!istega!gnezda!ali!iz!sorodnih!gnezd,!ki!se!v!starosti!niso!razlikovali!več! kot!tri!dni!od!prejemnika.!Nadledvični!žlezi!darovalca!smo!takoj!po!odvzemu!dali!v! hladno! sterilno! raztopino! rekombinatnega! človeškega! rastnega! dejavnika! fibroblastov! (angl.! fibroblast! growth! factor,! FGF;! k! 25ng/mL,! Sigma)! v! 0,05! M! fosfatnem! pufru! z! NaCl! (pH! 7,2! do! 7,4)! ( angl.! phosphate! buffered! saline,! PBS).! Mišim!SFk1!KO!smo!v!pazdušnem!področju!naredili!vbod!z!iglo!(21G!x!19/16’ !0,8!x! 40!mm,!Novico,!Italija)!in!obe!žlezi!pazljivo!vstavili!pod!kožo.!Ker!so!miši!že!več!kot! 20!generacij!povratno!parjene,!do!zavrnitvenih!reakcij!ne!prihaja.!Po!presaditvi!so! prejele! še! tri! dodatne! injekcije! kortikosteroidov,! in! sicer! na! P9,! P12! in! P16.! Enaindvajseti! dan,! P21,! so! bile! miši! odstavljene! od! matere.! Miši! WT,! ki! smo! jih! uporabili! za! kontrolne! živali! v! raziskavi,! so! bile! izpostavljene! istemu! protokolu! (vbod!v!pazdušno!področje!in!kortikosteroidne!injekcije).!Po!odstavitvi,!med!P21! in!P25,!smo!mišim!WT,!da!bi!zagotovili!boljše!kontrole!za!miši!SFk1KO,!odstranili! spolne!žleze.!Tako!smo!pridobili!miši!divjega!tipa!z!odstranjenimi!spolnimi!žlezami! –!GDX/WT!(angl.!wild!type!gonadectomised!mice),!kastrirane!samce!(CAS/WT)!in! sterilizirane! samice! (OVX/WT).! Pri! miših! SFk1! KO! smo! izvedli! enak! postopek,! vendar! samo! z! zarezami! in! brez! odstranitve! žlez,! ki! jih! zaradi! odsotnosti! SFk1! nimajo.! Med! posegom! so! bile! živali! anestezirane! s! 50! μL! mešanice! anestetikov! (ketamin,!acepromazin,!ksilazin).!Živali!smo!potem!nastanili!v!skupinah!(tri!do!pet! živali)! po! spolu! in! jih! ob! starosti! 60! do! 65! dni! (P60kP65)! žrtvovali! z! ogljikovim! dioksidom,! CO2,! in! jim! čim! prej! odvzeli! del! možganov,! ki! je! bil! namenjen! za! izolacijo!RNA,!ter!ga!zamrznili!na!k80!°C.!! 3.1.2.2 Priprava*miši*za*ugotavljanje*vpliva*testosterona*na*obnašanje*in*izražanje* genov*v*možganih* V! drugem! delu! raziskave! smo! prav! tako! proučevali! miši! brez! gena! SF#1! in! za! kontrolne! uporabili! miši! divjega! tipa,! GDX/WT.! V! tem! poskusu! smo! živalim! dodajali!testosteron!propionat!(TP)!na!tri!različne!načine.!Živali!v!prvi!skupini!so! bile! izpostavljene! TPkju! pred! rojstvom! (skupina! TPkE),! druga! skupina! po! rojstvu! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 53! brez,gena,SF#1, (TPkPN),!tretja!skupina!pred!in!po!rojstvu!(TPkE&PN)!ter!kontrolna!skupina!(KkK),! ki!ni!prejemala!TP,!ampak!samo!prefiltrirano!koruzno!olje.!! Samce!in!samice!SFk1!HET!smo!parili!v!skupinah!–!en!samec!in!tri!samice.!Vsako! dopoldne!smo!preverili!ali!je!pri!samici!prisoten!kopulatorni!čep!( angl.!plug),!kar!je! pomenilo,! da! je! prišlo! do! parjenja! in! ejakulacije.! Dan,! ko! smo! ga! opazili,! je! bil! označen!kot!polovica!embrionalnega!dne,!E0,5,!in!takrat!smo!samico!odstavili!od! samca.! Breje! samice! so! na! embrionalni! dan! E13,5! in! E16,5! prejele! podkožno! injekcijo! testosteron! propionata,! TP,! ki! smo! ga! najprej! raztopili! v! 96! %! etanolu! (Etanol,! Merck),!tako!da!smo!pripravili!koncentrat!20!mg!TP/1!ml!etanola.!Koncentrat!smo! nato!redčili!s!koruznim!oljem!(Corn!oil,!SigmakAldrich),!tako!da!smo!imeli!končno! koncentracijo!2!mg!TP/ml.!Živali!so!na!dan!prejele!100!μg!TP!na!v!volumnu!50!μL,! ali!pa!samo!koruzno!olje.! ! Mladiči!so!po!rojstvu!prejemali!prej!opisano!kortikosteroidno!mešanico!od!rojstva! do! P7.! Na! P1,! P3! in! P5! so! poleg! kortikosteroidne! mešanice! dobili! še! TP! v! koncentraciji! 100! μg! TP! na! žival! na! dan.! Za! lažje! razumevanje! še! prikaz! skupin! testnih!živali!in!obdobja!prejemanja!TP!v!Tabeli!1.! ! Aplikacija(TP! TPBE! TPBPN! TPBE&PN! KBK! V! času! embrionalnega! razvoja! (preko! brejih! TP! BBBBBBB! TP! BBBBBB! samic)!–!E13,5!in!E16,5! Mladiči! po! rojstvu! (P1,! P3!in!P5)! kkkkkkk! TP! TP! BBBBBB ! ! Tabela%1:,Prikaz,aplikacije,TP,po,skupinah,(TP#E,–,živali,so,prejemale,TP,samo,pred, rojstvom;, TP#PN, –, živali, so, prejemale, TP, samo, po, rojstvu;, TP#E&PN, –, živali, so, prejemale, TP, pred, in, po, rojstvu;, K#K, –, kontrolne, živali,, ki, so, v, obeh, obdobjih, prejemale,samo,olje)., ! ! 54! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Tako!smo!pridobili!živali!za!nadaljnja!testiranja,!in!sicer!samice!in!samce! SF#1!KO! in! WT.! Po! odstavitvi,! PN! 21,! smo! tudi! te! živali! operirali,! in! sicer! smo! odstranili! mišim!WT!spolne!žleze!(GDX/WT),!miši!SFk1!KO!pa!samo!zarezali!iz!zašili.! ! Po! 70.! dnevu! starosti! smo! začeli! s! testi! obnašanja,! in! sicer! najprej! s! testom! ženskega!spolnega!obnašanja,!potem!pa!še!agresivnega.!Po!zaključku!testiranj,!ko! so!bile!živali!stare!3!do!4!mesece,!smo!živali!žrtvovali!s!postopkom!tkivne!perfuzije! ter!odvzeli!kri!in!možgane!za!nadaljnje!proučevanje.!Pred!žrtvovanjem!so!bile!miši! anestezirane! z! mešanico! anestetikov,! kot! je! opisano! pri! operativnem! posegu.! Najprej! smo! jim! odvzeli! kri! iz! levega! srčnega! prekata! s! s! heparinom! (1! U/ml,! Sigma)! preprano! injekcijo! in! iglo! (0,8x! 40! mm! 21Gx1! 9/16'').! Kri! smo! nato! centrifugirali!5!minut!na!3000!obratih/minuto!pri!4!°C,!odpipetirali!krvno!plazmo! in! jo! shranili! pri! k20! oC.! Sledil! je! postopek! t.i.! tkivne! perfuzije,! kjer! smo! s! peristaltično!črpalko!(Ecoline!ISM1076,!Ismatech!SA,!Zürich,!Švica)!iz!živali!sprali! preostalo! kri! s! hladnim! 0,05! M! fosfatnim! pufrom! s! soljo! (PBS),! ki! mu! je! sledilo! učvrščevanje!z!raztopino!4kodstotnega!paraformaldehida!v!0,05!M!PBS,!s!hitrostjo! pretoka!5!mL/minuto.!Po!končani!fiksaciji!(5!minut)!smo!živalim!odvzeli!možgane! in! jih! še! čez! noč! pustili! v! 4kodstotnem! paraformaldehidu! ter! ga! naslednji! dan! zamenjali! z! 0,1M! fosfatnim! pufrom! (PB),! kjer! smo! jih! hranili! do! uporabe! za! imunohistokemično!barvanje!na!4!°C.! 3.1.3 Določanje&genotipa&živali& Genotip!živali!smo!določili!z!uporabo!metode!verižne!reakcije!s!polimerazo!( angl.! polymerase!chain!reaction,!PCR).!Mladičem!v!starosti!P4!do!P6!smo!odvzeli!košček! prsta!na!zadnji!nogi!in!poleg!pridobitve!materiala!za!genotipizacijo,!smo!ta!način! uporabili! za! označevanje! živali! (od! 1! do! 10).! Tkivu! smo! v! epruveto! (500! μL,! Eppendorf)! dodali! 200! μL! pufra! za! razgradnjo! (5X! Colorless! GoTaq®! Reaction! Buffer,!Promega,!WI,!ZDA)!in!15!μL!proteinaze!K!(15!mg/mL,!Sigma)!ter!ga!čez!noč! pustili!na!stresalniku!pri!55!°C!in!400!obratov!na!minuto!(Thermomixer,!Compact,! Eppendorf).!Razgrajeno!tkivo!smo!uporabili!za!določitev!genotipa!z!metodo!PCR.! Za! to! smo! uporabili! oligonukleotidne! začetnike! SFk1! F! 5’k ACAAGCATTACACGTGCACCk3’! in! SFk1! R! 5’kTGACTAGCAACCACCTTGCCk3’# za# določitev!alela!WT;!SFk1kneo!R!5’k!AGGTGAGATGACAGGAGATCk3’!za!določitev!alela! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 55! brez,gena,SF#1, SFk1KO;! za! določitev! prisotnosti! gena! Sry, začetnika) F) 5’k AGGCGCCCCATGAATGCATTk3’!in!R!5’k!TCCATGAGGCTGATATTTATAGk3’.!! Za! posamezno! reakcijo! smo! uporabili! 3! μL! razgrajenega! tkiva,! po! 50! ng! vsakega! oligonukleotidnega, začetnika, in, sterilno! destilirano! vodo! do! volumna! 10! μL.! Pri! temperaturi! 95! °C! smo! dodali! 10! μL! mešanice! nukleotidov! in! polimeraze! DNA! (Promega,! WI,! ZDA)! in! s! tem! zmanjšali! nastanek! nespecifičnih! produktov! PCR.! Končni! volumen! reakcije! je! bil! 20! μL.! Za! PCR! reakcijo! smo! uporabili! napravo! za! PCR!(ciklični!termostat;!2720!Thermal!Cycler,!Applied!Biosystems,!Thermo!Fisher! Scientific!Inc.,!ZDA)!in!protokol:! 95!°C!5!minut;! 40!ciklov:!94!°C!30!s,!54!°C!30!s,!72!°C!90!s;! 72!°C!8!minut.! Nastale!produkte!( SF#1!∼!500!bp;! SF#1,neo, ∼!500!bp;! Sry!∼!200!bp)!smo!analizirali! z!gelsko!elektroforezo!v!2!%!agaroznem!gelu!(Sigma)!(U=130V).! 3.1.4 Operativna&odstranitev&spolnih&žlez&pri&miših&divjega&tipa&in&slepa&operacija&pri& miših&brez&gena& SF>1& Operacijo!smo!izvedli!med!P21!in!P25,!pred!nastopom!pubertete.!Za!operacijo!smo! živali! anestezirali! z! mešanico! anestetikov:! ketamin! (Bioketan! (100! mg/mL! ketamina),!Vetoquinol,!Poljska;!uporabljena!koncentracija!100!μg/g!telesne!teže),! acepromazin! (Calmivet! (5mg/mL! acepromazina),! Vetoquinol,! Francija,! uporabljena! koncentracija! 2! μg/g! telesne! teže)! in! ksilazin! (Xylased! (20! mg/ml),! Bioveta,! Češka;! uporabljena! koncentracija! 10! μg/g! telesne! teže).! Vsaka! žival! je! prejela! 50! μl! mešanice! s.c.! Samicam! WT! smo! odstranili! jajčnike,! jajcevode! in! del! rogov! maternice! (OVX/WT)! skozi! zarezo,! ki! je! potekala! po! beli! črti! ( linea, alba),! medtem! ko! smo! pri! samcih! WT! (CAS/WT)! naredili! zarezo! na! vsaki! strani! v! področju!dimelj!in!skozi!odprtino!odstranili!modo!in!nadmodek.!Miši!SFk1!KO!smo! izpostavili! istim! pogojem:! anestezirali! smo! jih! z! mešanico! anestetikov! in! naredili! kirurško!rano!glede!na!genetski!spol!miši.!Pri!vseh!smo!rane!zašili!z!resorbtivno! kirurško!nitjo!6.0"(Safil,"Braun,"Esculap,"Tuttlingen,"Nemčija)."Takoj!po!posegu!je! miš! prejela! protibolečinsko! terapijo,! s.c., 50! μL! butorfanola! (Butador! (10! mg/ml! butorfanola);! Richter! Pharma! ag,! Avstrija;! uporabljena! koncentracija! 3! mg/kg! telesne!teže),!kar!smo!čez!4!ure!ponovili.! ! 56! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 3.2 PRIPRAVA!HORMONOV!IN!NJIHOVA!UPORABA! 3.2.1 Kortikosteroidni&hormoni& Da!smo!ohranili!miši!SFk1!KO!pri!življenju,!smo!vsem!mladičem!od!rojstva!do!P7! vsak! dan! injicirali! 50! μL! mešanico! kortikosteroidnih! hormonov! s.c.,! in! sicer! v! koncentracijah! 400! μg/mL! hidrokortizona! (H4001,! Sigma),! 400! ng/mL! deksametazona! (D1159,! Sigma)! in! 100! ng/mL! fludrokortizona! (F6127,! Sigma);! raztopljenih! v! koruznem! olju! (Corn! oil,! SigmakAldrich).! Olje! smo! predhodno! prefiltrirali!skozi!celuloznoacetatno!filtrirno!membrano!s!porami!premera!0,2!μm" (Sartorius,+ Goettingen,+ Nemčija).! Hidrokortizon! smo! raztopili! v! 95! %! etanolu! (Ethanol,!Merk)!(4!mg/mL),!deksametazon!smo!raztopili!v!sterilni!destilirani!vodi! (4! mg/mL),! fludrokortizon! pa! smo! raztopili! v! 95! %! etanolu! (5! mg/mL).! Za! pripravo!mešanice!za!injiciranje!smo!uporabili!18!mL!koruznega!olja!in!mu!dodali! prej!pripravljene!koncentracije,!in!sicer!2!mL!hidrokortizona,!2!μL!deksametazona! in!2!μL!fludrokortizona.! 3.2.2 Priprava&estradiol&benzoata& Estradiol!benzoat!(EB)!(βkestradiol!3kbenzoat,!Ek8515,!Sigma)!smo!raztopili!v!96!%! etanolu! v! koncentraciji! 1! mg/mL.! To! smo! še! dodatno! redčili! v! prefiltriranem! koruznem! olju! do! koncentracije! 20! μg/mL;! živali! so! prejele! 1! μg! EB/žival/dan! (injiciran!volumen!je!znašal!50!μL;!s.c.).! 3.2.3 Priprava&progesterona& Progesteron! (PR)! (Pk0130,! Sigma)! smo! raztopili! neposredno! v! prefiltriranem! koruznem! oljem! v! koncentraciji! 16! mg/mL,! kar! je! predstavljalo! 0,8! mg! PR/žival/dan!(v!50!μL/dan).! 3.2.4 Uporaba&spolnih&hormonov&estradiol&benzoata&in&progesteona& Estradiol! benzoat! (EB)! in! progesteron! (PR)! smo! poskusnim! mišim! injicirali! pod! kožo!po!protokolu!za!testiranje!ženskega!spolnega!obnašanja!(opisano!v!poglavju! 3.4.1).! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 57! brez,gena,SF#1, 3.2.5 Priprava&testosteronskih&vsadkov& Za# testosteronske# vsadke# smo# uporabili# kristalinični# testosteron! propionat! (Testosterone! propionat,! Fluka! Chemie! AG,! SigmakAldrich)! in! medicinsko! silikonsko! cevko! (Laboratory! tubing,! Silastic)! 1,02! mm! notranjega! in! 2,16! mm! zunanjega!premera.!Cevke!smo!narezali!na!15!mm"dolge"koščke."Cevko"smo"na"eni" strani!zalepili!z!medicinskim!silikonskim!gelom!(Medical!Adhesive!Silicone!Type!A! Not!Sterile,!Silastic,!Mich.,!ZDA).!Skozi!odprtino!na!drugi!strani!smo!cevko&napolnili& s"kristaliničnim"testosteron!propinoatom!v!dolžini!10!mm!ter!na!nasprotni!strani! ponovno! zalepili! s! silikonskim! gelom.! Testosteronske! vsadke! smo! z! operativnim! posegom! (v! enaki! anesteziji! kot! je! opisano! zgoraj)! vstavili! živalim! v! podkožje! v" področje( leve( lopatice( že( pred( testom( agresivnega( obnašanja( in( jih( pustili( do( žrtvovanja.*Vsi*načini*dajanja*spolnih*hormonov*so*bili*že*opisani*v*literaturi*in*se* uporabljajo)za)vzpodbuditev)določenih)vzorcev)obnašanja!(231,!1,!282).! 3.3 PROUČEVANJE!IZRAŽANJA!GENOV!V!MOŽGANIH! 3.3.1 Izolacija&RNA& Vsi!postopki!za!izolacijo!RNA!ter!nadaljnja!priprava!poteka!s!sterilnim!priborom!in! materialom,! ki! je! brez! prisotnih! encimov,! ki! razgrajujejo! RNA! in! DNA! (RNaze! in! DNaze).! Pri!starosti!60!do!65!dni!smo!po!trem!živalim!vsakega!genotipa!(SFk1!KO!samice!in! samci!ter!GDX/WT!samice!in!samci);!torej!skupno!12kim!živalim;!odvzeli!vmesni! del! možganov.! Vzorec! je! obsegal! predoptično! področje,! področje! hipotalamusa,! talamusa,!amigdale,!hipokampusa!in!možganske!skorje!v!tem!področju!(prikazano! na!Sliki!1).!Žrtvovali!smo!jih!s!CO2!in!jim!čim!prej!odvzeli!možgane.!Možgane!smo! položili!na!stekleno!podlago!na!možgansko!skorjo!in!z!ventralne!strani!zarezali!na! točki,! kjer! se! križata! očesna! živca,! ter! tik! za! hipokampusom.! Možgane! smo! zamrznili! na! k80! °C.! Ko! smo! imeli! vse! vzorce! smo! iz! njih! izolirali! RNA! po! standardnem!postopku!s!Trizolom®.!Možgane!smo!homogenizirali!v!1!mL!Trizola!s! homogenizatorjem!(IKA!T10!Basic!Ultra!–!Turrax,!Nemčija).!Po!homogenizaciji!smo! pustili! vzorec! 5! minut! pri! temperaturi! med! 15! in! 30! °C,! da! so! beljakovinski! kompleksi! popolnoma! razpadli.! Potem! smo! dodali! 200! μL! kloroforma! in! močno! ! 58! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! stresali!15!sekund!in!ponovno!pustili!2!do!3!minute!na!15!do!30!°C.!Sledilo!je!15k minutno! centrifugiranje! na! 4! °C! pri! 10.000! obratih.! Po! tem! smo! imeli! vzorce! na! ledu! in! odpipetirali! zgornjo! brezbarvno! vodno! fazo! v! novo! epruveto! in! RNA! precepitirali! s! 500! μL! hladnega! izopropil! alkohola.! Po! 10kminutni! inkubaciji! na! sobni!temperaturi!smo!epruveto!centrifugirali!na!4!°C!pri!13000!obratih!20!minut.! V!tej!fazi!se!je!RNA!oborila!na!dnu!epruvete.!Odpipetirali!smo!supernatant!in!RNA! sprali! s! 500! μL! 75! %! etanola,! nato! smo! vsebino! epruvete! dobro! premešali,! vorteksirali!in!nato!odpipetirali!etanol,!RNA!usedlino!smo!sušili!na!zraku!približno! 10!minut.!RNA!smo!raztopili!v!20!μL!vode!brez!nukleaz!in!jo!shranili!na!k80!°C!do! nadaljevanja! dela! na! Centru! za! funkcijsko! genomiko! in! biočipe! na! Medicinski! fakulteti!Univerze!v!Ljubljani.! 3.3.2 Mikromreže& Mikromreže! smo! uporabili! za! ugotavljanje! profila! izražanja! genov! v! osrednjem! delu! možganov.! V! poskusu! smo! uporabili! DNAkmikromreže! Affymetrix,! ki! vsebujejo!vse!gene!mišjega!genoma!t.i.!Gene!Chip®!Mouse!Genome!430!2.0!Array! (Affymetrix,!Santa!Clara,!CA,!ZDA).!V!tem!primeru!gre!za!enobarvne!mikromreže,! ker! lahko! na! njih! analiziramo! oziroma! hibridiziramo! le! po! en! vzorec.! Vsebujejo! 45000!setov!sond,!s!katerimi!analiziramo!preko!39000!prepisov!RNA,!od!tega!jih!je! 34000!anotiranih.! Postopek!priprave!in!izvedbe!poskusa!na!mikromrežah!traja!tri!dni.!Sestavljen!je!iz! več! korakov,! in! sicer! najprej! pripravimo! vzorec! za! hibridizacijo,! nato! ga! hibridiziramo! na! mikromreži,! sledi! spiranje,! označevanje! in! vizualizacija! mikromreže! ter! preverjanje! kvalitete.! Temu! sledi! normalizacija! in! obdelava! podatkov!z!interpretacijo!rezultatov.! ! Pripravo! cDNA! za! mikromreže! smo! izvedli! po! navodilih! proizvajalca.! Za! vsak! vzorec! smo! potrebovali! 5! µg! celotne! izolirane! RNA! in! pripravljen! kit! GeneChip®! Expression! 3’kAmplification! OnekCycle! Target! Labeling! and! Control! Reagents! Kit! (Affymetrix,! Santa! Clara,! CA,! ZDA).! Vzorce! smo! hibridizirali! na! mikromreže! GeneChip®!Mouse!Genome!430!2.0!Array!(Affymetrix,!Santa!Clara,!CA,!ZDA)!in!jih! sprali! z! GeneChip®! Fluidics! Station! 450,! kot! priporoča! proizvajalec.! Mikromreže! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 59! brez,gena,SF#1, smo!skenirali!z!GeneChip®!Scanner!3000!7G!in!slike!analizirali!z!GCOS!(GeneChip®! Operating!Software).! 3.3.3 Priprava&komplementarne&DNA&(cDNA)& Za!preverjanje!rezultatov,!ki!smo!jih!dobili!iz!DNAkmikromrež,!smo!uporabili!PCR!v! realnem! času! oziroma! kvantitativni! PCR! v! realnem! času! ( angl.! realktime! polymerase!chain!reaction!ali!quantitative!realktime!PCR;!qPCR;!).!Zato!smo!morali! pripraviti! komplementarno! cDNA! z! metodo! PCR! z! obratnim! prepisom! ( angl.! reverse!transcription!polymerase!chain!reaction;!RTkPCR).!! Najprej!smo!izmerili!koncentracijo!in!kvaliteto!izolirane!RNA,!tako!da!smo!izmerili! absorbanco!(pri!260!nm)!RNA!s!spektrofotometrom!(SmartSpec!3000™,!BiokRad,! ZDA).! Izračunali! smo! približno! koncentracijo! (upoštevajoč,! da! je! pri! A260=1!! koncentracija!RNA!40!µg/mL,!koncentracija!=!A260!x!40!x!redčitev).! Za!reakcijo!RTkPCR!smo!uporabili!2!µg!izolirane!RNA.!Skupni!volumen!posamezne! reakcije!je!bil!20!µL.! Za! pripravo! cDNA! smo! uporabili! HighkCapacity! cDNA! Reverse! Transcription! Kit! (Applied!Biosystems,!4368814).! Pripravili!smo!reakcijo!v!skupnem!volumnu!20!µL:! 2!µL!PCR!pufer!(10x!RT!Buffer!);! 0,8!µL!mešanica!deoksiribonukleotidov!(25x!dNTP!Mix,!100!mM);! 2!µL!naključni!oligonukleotidni!začetniki!(10x!RT!Random!Primers);! 1!µL!RNazni!inhibitor!(RNase!inhibitor);! 2!µg!RNA;! do!20!µL!DEPC!vode!(voda!brez!nukleaz).! Reakcijske!epruvete!smo!nato!vstavili!v!napravo!za!PCR,!kjer!je!reakcija!potekala! po! protokolu! priporočenem! za! kit,! ki! smo! ga! uporabili! (HighkCapacity! cDNA! Reverse!Transcription!Kit,!Applied!Biosystems):! 25!°C!10!minut;! 37!°C!120!minut;! 85!°C!5!minut;! 4!°C!neomejeno!(shranjevanje).! ! ! 60! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 3.3.4 Reakcija&PCR&v&realnem&času&oziroma&kvantitativen&PCR&v&realnem&času&(qPCR)& Gene,! ki! so! se! statistično! značilno! različno! izrazili! med! spoloma! na! DNAk mikromrežah,!smo!preverili!še!z!metodo!qPCR.! Za! izvedbo! qPCR! smo! uporabili! napravo! Applied! Biosystems! Abi! Prism! 7000! in! reagente! TaqMan®! Gene! Expression! Assay! in! reakcijo! izvajali! na! 96kjamičnih! mikrotitrskih! ploščah! (Applied! Biosystems),! s! specifičnimi! oligonukleotidnimi! začetniki! za:! Uty! (ubiquitously! transcribed! tetratricopeptide! repeat! gene,! na! kromosomu! Y),! Eif2s3y! (eukaryotic! translation! initiation! factor! 2,! subunit! 3,! strukturni!gen!na!kromosomu!Y);! Ddx3y!(DEAD!(AspkGlukAlakAsp)!box!polypeptide! 3,!na!kromosomu!Y);! Kdm5d!(lysine!(K)kspecific!demethylase!5D,!na!kromosomu! Y);! Xist! (inactive! X! specific! transcripts;! na! kromosomu! X);! Eif2s3x! (eukaryotic! translation! initiation! factor! 2,! subunit! 3,! strukturni! gen! na! kromosomu! x);! Actb! (betakaktin,! na! avtosomu! 5).! Actb,, aktinkbeta! je! eden! izmed! t.i.! vzdrževalnih! ali! hišnih!genov,!zato!smo!ga!uporabili!za!notranjo!kontrolo.!Dodaten!gen,!ki!smo!ga! preverili,!kljub!temu,!da!se!razlika!na!DNAkmikromrežah!ni!pokazala!je!Utx!(lysine! (K)kspecific!demethylase!6A;!na!kromosomu!X)!(Tabela!2).! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 61! brez,gena,SF#1, ! Druge! Dostopna! Oznaka! Uradno!ime! Naloga! oznake! številka! Uty! ubiquitously! Hydb;! NM_009484.2! Demetilacija! transcribed! mKIAA4057! histonov;! tetratricopepti dioksigenazna! de!repeat!gene! aktivnost;!vezava! kovinskih!ionov;! oksireduktazna! aktivnost!(283)! Eif2s3y! eukaryotic! Spy;!Tfy;!Eifk NM_012011.1! Vezava!nukleotidov;! translation! 2gy! vezava!GTPkjev;! initiation! prevajanje! factor! 2,! začetnega!dejavnika! podenota!3! (284)! Ddx3y! DEAD! (Aspk Dby;! NM_012008.2! Vezava!ATP;!vezava! GlukAlakAsp)! D1Pas1krs1;! RNA;!hidrolazna! zaporedje! 8030469F12 aktivnost;!vijačna! polipeptida!3! Rik! aktivnost;!(285)! Kdm5d! lysine! (K)k HY;! Smcy;! NM_011419.3! Vezava!DNA;! specific! Jarid1d! dioksigenazna! demethylase! aktivnost;!vezava! 5D! cinkovih!ionov;! (286)! Xist! inactive! X! AI314753;! Nonkcoding!RNA! Nekkodirajoč!gen! specific! A430022B1 znotraj!XIC!(X! transcripts! 1! inactivation!center)! (287)! Actb! betakaktin! Actx;! betak NM_007393.3! Vezava!ATP;!vezava! actin;! NOS;!vezava! E430023M0 nukleotidov;!vezava! 4Rik! protein!kinaze!(288)! ! 62! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Utx, lysine! (K)k Kdm6a! NM_009483.1! Demetilacija! specific! histonov;!vezava! demethylase! kromatina;! 6A! oksireduktana! aktivnost!(289)! ! Tabela,2:,Uradne,oznake,,polna,imena, druga,imena,in,dostopna,številka,v,bazi,NCBI, Gene,za,posamezen,gen,in,naloge,,ki,jih,opravlja., Za! vsak! gen! smo! najprej! pripravili! umeritveno! krivuljo! in! se! na! podlagi! teh! rezultatov! odločili,! da! bomo! za! nadaljnje! raziskave! uporabili! koncentracijo! 5! ng! cDNA!za!posamezno!reakcijo.!Umeritveno!krivuljo!smo!pripravili!iz!koncentracij!2,! 5,!10!in!25!ng!cDNA.!! Pripravili! smo! reakcijske! mešanice! v! končnem! volumnu! 15! µL.! Vse! reagente! in! mikrotitrsko!ploščo!smo!med!pripravo!hranili!na!ledu.! Posamezna!reakcijska!mešanica!qPCR!končnega!volumna!15!µL!je!vsebovala:! 7,5! µL! izhodiščne! zmesi! (TaqMan®! Universal! Master! Mix! II! with! UNG! (UracilkNk Glikozilaza),!2x);! 0,75! µL! mešanice! specifičnih! oligonukleotidnih! začetnikov! TaqMan®! Gene! Expression!Assays!(Thermo!Fisher!Scientific!Inc.,!Applied!Biosystems);! do!15!µL!vzorca!(cDNA!koncentracije!5!ng)!+!vode!DEPC.! Mikrotitrske! plošče! smo! vstavili! v! napravo! za! PCR! v! realnem! času! (Applied! Biosystems!Abi!Prism!7000)!in!reakcija!je!potekla!po!protokolu:! 50!°C!2!minuti!(inkubacija!UracilkNkGlikozilaze,!UNG);! 95!°C!10!minut!(aktivacija!polimeraze);! 40!ciklov:!! 95!°C!15!sekund!(denaturacija!DNA);! 60! °C! 1! minuta! (prileganje! začetnih! oligonukleotidov! in! ustvarjanje! novih! verig! DNA).! Sledila!je!statistična!analiza!podatkov,!ki!je!opisana!v!poglavju!3.5.2.! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 63! brez,gena,SF#1, 3.3.5 Imunohistokemično&barvanje&svežih,&plavajočih&rezin&za&proučevanje&izražanja& genov& Možgane,!ki!smo!jih!predhodno!pridobili!s!perfuzijo,!smo!pred!rezanjem!zalili!v!5! %! agarozo! (Agarose,! Sigma)! in! jih! v! hladnem! 0,05M! PBSku! z! vibrotomom! (Leica! VT1000!S,!Leica!Biosystems!Nussloch,!Nemčija)!razrezali!na!50!μm!debele!rezine.! Rezine!smo!najprej!inkubirali!v!0,1!M!glicinu!(Sigma),!raztopljenem!v!0,05!M!PBSk ju!30!minut,!nato!pa!v!0,5!%!natrijevem!borohidridu!(Sigma)!za!15!minut!na!4!°C! na! stresalniku! (50! tresljajev/minuto,! Tehtnica,! Domel,! Slovenija),! s! čimer! smo! odstranili!sledi!fiksativa!v!tkivu!rezin!in!prekinili!ob!fiksaciji!nastale!povezave!med! beljakovinami! v! celicah.! Glicin! in! natrijev! borohidrid! smo! sprali! s! 15k! in! 20k minutnim! spiranjem! v! hladnem! 0,05M! PBSku.! Na! rezinah! smo! blokirali! nespecifična! vezna! mesta! s! 5! %! normalnim! kozjim! serumom! ( angl.! normal! goat! serum,! NGS,! Chemicon,! Temecula,! CA,! ZDA)! z! 0,5! %! detergentom! Triton! Xk100! (Sigma)!in!1!%!H2O2!(Merck,!Nemčija)!za!30!do!120!minut!na!4!°C.!Nato!smo!rezine! prestavili!v!posodice!in!jim!dodali!ustrezno!razredčena!primarna!protitelesa!v!0,05! M!PBSkju,!ki!je!vseboval!1!%!goveji!serumski!albumin!(angl.!bovine!serum!albumin,! BSA,! Sigma)! in! 0,5! %! Triton! Xk100.! V! našem! poskusu! smo! uporabili! primarna! protitelesa! v! naslednjih! razredčitvah:! mišja! proti! beljakovini! za! vezavo! Ca2+! (Kalbindin! Dk28K,! kalbindin,! CALB1;! 1:20.000;! Sigma)! in! kunčja! proti! arginin! vazopresinu! (AVP;! 1:15.000;! ImunoStar,! WI,! ZDA).! Rezine! smo! inkubirali! s! primarnimi!protitelesi!na!stresalniku!2!do!3!dni!na!4!°C.!Nato!smo!jih!štirikrat!po! 15!minut!spirali!na!sobni!temperaturi!v!0,05!M!PBSkju,!ki!je!vseboval!1!%!NGS!in! 0,02!%!detergentom!Triton!Xk100.! Po!spiranju!smo!na!rezine!dali!sekundarna!protitelesa!v!0,05!M!PBSku!z!1!%!NGS!in! 0,5!%!detergentom!Triton!Xk100.!Rezine!smo!inkubirali!s!sekundarnimi!protitelesi! vsaj!2!uri!in!nato!ponovno!štirikrat!spirali!po!15!minut!v!0,05!M!PBSku!z!0,02!%! detergentom!Triton!Xk100.!Sekundarna!protikmišja!protitelesa!pridobljena!iz!oslov! (DAM,!Jackson!Immunoresearch,!PA,!ZDA)!in!vezana!z!biotinom!smo!uporabljali!v! razredčitvah! 1:2500,! protikkunčja! pridobljena! v! oslu! (DAR)! pa! v! koncentraciji! 1:500.!Spiranju!je!sledila!enourna!inkubacija!v!streptavidinu,!na!katerega!je!vezan! encim!peroksidaza!(Jackson!Immunoresearch,!ZDA)!razredčenem!v!0,05!M!PBSku!z! 0,5!%!Triton!Xk100!(redčitev!1:2500)!pri!sobni!temperaturi!in!s!tem!smo!označili! ! 64! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! vezana!sekundarna!protitelesa.!Sledilo!je!spiranje!eno!uro!v!0,05!M!slanem!pufru! Tris!(TBS;!0,05!M!Tris–HCl/0,9!%!NaCl;!pH!7.5;!Sigma)!pri!sobni!temperaturi.! Da!so!vezani!kompleksi!postali!vidni,!smo!uporabili!kromogeno!raztopino!0,025!%! DAB! (3'3'! k! diaminobenzidin/amonijev! niklov! (II)! sulfat,! Sigma)! v! Tris! pufru! (pH! 7,5),! ki! je! vseboval! 0,02! %! H2O2! na! sobni! temperaturi! 5! minut.! Peroksidazno! reakcijo!smo!prekinili!s!spiranjem!v!pufru!nizke!ionske!jakosti!trikrat!po!10!minut! na! stresalniku! pri! sobni! temperaturi.! Po! imunohistokemičnem! barvanju! smo! rezine!nanesli!na!predmetnice,!obdelane!z!adhezivom!(APES,!Sigma),!in!jih!pustili! sušiti!čez!noč.!Naslednji!dan!smo!rezine!na!predmetnicah!sprali!z!destilirano!vodo,! jih! posušili! ter! pokrili! s! hidrofobnim! medijem! za! pripravo! trajnih! mikroskopskih! preparatov! (Pertex! Medite,! Burgdorf,! Nemčija).! Kontrolo! in! oceno! delovanja! primarnih! protiteles! ter! imunoreaktivne! vzorce! distribucije! smo! ocenili! pod! svetlobnim!mikroskopom.! Postopek! je! bil! predhodno! optimiziran! in! preverili! smo! protitelesa,! zato! v! posamezni! seriji! nismo! delali! pozitivne! in/ali! negativne! kontrole.! Uporabili! smo! rezeine!od!začetka!predoptičnega!področja!pa!do!začetka!hipokampusa.! 3.3.5.1 Analiza*področij*v*možganih* Pri! kvalitativni! in! kvantitativni! analizi! biokemijsko! označenih! elementov! (telesa! nevronov,! dendriti! in! aksoni,! podporne! celice)! ter! analizi! mesta! nahajanja! v! rezinah! možganov! moramo! biti! pozorni! predvsem! na! dve! stvari,! in! sicer! na! kot,! pod!katerim!so!možgani!rezani,!in!na!meje!področja!v!možganih,!ki!ga!proučujemo.! Načini!so!opisani!in!uporabljeni!v!literaturi!(4,!290,!171).!Vse!strukture!in!področja! v! možganih! ter! oddaljenost! posameznih! rezin! od! bregme,! ki! so! uporabljeni! v! tej! nalogi,!smo!določili!na!osnovi!atlasa!mišjih!možganov!pod!naslovom!”The!mouse! brain!in!stereotaxic!coordinates”!(291,!292).! 3.3.5.2 Zajemanje*digitalnih*slik*za*analizo* Možgane!smo!slikali!s!svetlobnim!mikroskopom,!ki!ima!vgrajeno!digitalno!kamero! (Microphot!FXA!mikroskop!s!3CCDkkamero!Nikon,!Japonska!in!mikroskop!Eclipse! 80i! z! digitalno! kamero! DSkFi1,! Nikon).! Digitalne! slike! smo! uredili! s! programom! Photoshop!CS!za!operacijski!sistem!Windows!(Windows7,!Microsoft,!ZDA).!Pri!tem! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 65! brez,gena,SF#1, je! šlo! za! urejanje! osvetlitve! in! kontrasta! slike! pri! analizi! možganov.! S! tem! nismo! vplivali!na!kakovost!imunohistokemičnega!barvanja!na!sliki.! 3.4 !IZVEDBA!POSKUSOV!OBNAŠANJA! V! poskusih! obnašanja! smo! opazovali! samice! in! samce! brez! gena! SF#1! (SFk1! KO! samice!–!SFk1!KO!F;!SFk1!KO!samci!–!SFk1!KO!M)!ter!samice!in!samce!divjega!tipa,! ki!smo!jim!predhodno!odstranili!spolne!žleze!(OVX/WT!in!CAS/WT).!Živali!so!bile! poleg!spola!in!genotipa!razdeljene!glede!na!izpostavljenost!testosteron!propionatu! v! 4! skupine,! kot! je! opisano! v! poglavju! 3.1.2.! Skupno! je! bilo! testiranih! 113! živali.! Podrobnejša!sestava!skupin!testiranih!živali!je!prikazana!v!Tabeli!3.!Vsi!poskusi!so! bili!opravljeni!“na!slepo”,!kar!pomeni,!da!opazovalec!ni!vedel,!katero!miš!(glede!na! spol,!genotip,!tretiranje!…)!opazuje.!Živali!so!bile!nastanjene!skupinsko!od!3!do!5! živali! v! kletki.! Vse! poskuse! smo! opravili! v! skladu! s! predpisi! (v! skladu! s! priporočilom! Komisije! 2007/527/EC! in! z! Uredbo! EC! 1069/2009)! in! v! skrbi! za! dobrobit! živali.! Poskuse! smo! snemali! z! digitalno! kamero! (DCRkDVD! 101E,! Sony,! Japonska).!Opazovanja!in!pojav!različnih!dogodkov!med!opazovanji!smo!ocenjevali! s! programom! StopWatch+! (Center! for! Behavioral! Neuroscience,! Atlanta,! ZDA).! Nekaj!dni!pred!začetkom!poskusov!smo!živalim!zadnjič!zamenjali!nastilj,!da!ne!bi!s! svežim! povzročali! stresa! zaradi! navajanja,! saj! si! miši! z! izločki! označujejo! svoj! teritorij.!Med!poskusom!smo!iz!mrež!odstranili!hrano!in!vodo!in!po!koncu!poskusa! zamenjali!del!nastilja.! ! ! Kontrole! !TP!pred! TP!po! TP!pred!in! (brez!TP)! rojstvom! rojstvu! po!rojstvu! SF_1!KO!F! 8! 9! 6! 7! OVX/WT!! 6! 8! 10! 6! SF_1!KO!M! 7! 7! 5! 6! CAS/WT!! 7! 7! 8! 6! Skupno!število! 28! 31! 29! 25! , ,Tabela, 3:, Tabela, prikazuje, število, živali, uporabljenih, v, testih, obnašanja, in, za, analizo, izražanja, genov, v, možganih, glede, na, tretiranje, s, TP, in, po, posameznih, genotipih., ! 66! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 3.4.1 Poskus&ženskega&spolnega&obnašanja& Opazovanje! ženskega! spolnega! obnašanja! smo! izvedli! na! vsaki! živali! šestkrat! in! med!vsakim!testom!je!bilo!3!do!6!dni!odmora,!da!smo!s!tem!posnemali!pojatveni! ciklus!miši,!ki!v!povprečju!traja!4!do!6!dni!(293).!Živali!so!bile!testirane!v!temnem! delu!ciklusa!vsaj!2!uri!po!začetku!teme,!saj!so!takrat!bolj!aktivne.!Stimulusne!živali! (samce! z! izkušnjami! v! parjenju)! smo! vsaj! 6! ur! pred! testiranjem! prestavili! v! akvarijske!posode,!da!so!se!privadili!na!okolje,!nastilj!smo!jim!odstranili!tik!pred! testiranjem.!Testne!živali!smo!tretirali!s!hormoni,!in!sicer!z!1!μg!estradiol!benzoata! (EB)!okoli!48!ur!pred!poskusom!in!potem!še!0,8!mg!progesterona!(PR)!3!do!8!ur! pred! testiranjem! (294).! Poskuse! smo! običajno! že! sproti! ocenjevali! s! programom! StopWatch+,! poleg! tega! pa! smo! jih! tudi! snemali,! da! smo! lahko! kasneje! določene! parametre! dodatno! preverili.! Poskus! se! je! začel,! ko! smo! tesno! žival! dali! k! stimulusnemu! samcu.! Če! samec! v! 5kih! minutah! ni! pokazal! zanimanja! za! testno! žival,! smo! uporabili! drugega.! Skupno! smo! v! vseh! testiranjih! uporabili! 23! stimulusnih! samcev! (WT! ali! SFk1! HET).! Poskus! je! trajal! največ! 20! minut! ali! do! ejakulacije!ali!pa!do!napada!oziroma!ugriza!testne!živali.!Spolno!sprejemljivost!smo! ocenjevali!z!oceno!od!1!do!5,!kot!je!opisano!malo!kasneje.! V! poskusu! smo! ocenjevali! in! beležili! po! protokolu,! ki! je! predstavljen! v! delu! dr.! Grgurevič!(295):! • število!in!začetek!poskusov!naskoka!(kot!poskus!naskoka!smo!zabeležili!akt,! ko!se!je!stimulusni!samec!s!sprednjimi!tačkami!poskušal!vzpeti!na!ledveni! del!testne!živali,!vendar!mu!je!pri!tem!testna!žival!zbežala!ali!celo!brcala);! • število! naskokov! (za! naskok! smo! šteli! akt,! ko! je! stimulusni! samec! s! sprednjima!tačkama!tesno!prijel!žival!in!se!povzpel!na!njo,!testna!žival!pa!je! stala! na! tleh! vsaj! s! tremi! tačkami).! To! smo! izračunali! s! seštevkom! ocene! spolne!sprejemljivosti!(L0!do!L5);! • število!in!začetek!potiskov!medenice,!ki!sledijo!naskoku;! • število!in!začetek!kopulacije;!! • spolno!sprejemljivost!testne!živali,!ki!smo!jo!ocenjevali!kot!usločenost!hrbta! oziroma!lordoze!z!oceno!od!1!do!5!kot!je!opisano!v!prispevku!BurnskCusatok vove!in!njenih!sodelavcev!(86);! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 67! brez,gena,SF#1, • število!in!začetek!agresivnega!obnašanja!testne!živali,!ob!ugrizu!smo!poskus! končali;! • čas!ejakulacije!(konec!poskusa).! Ocenjevanje!lordoze!smo!prilagodili!in!izvedli,!kot!je!opisano!(295),!in!sicer:! L1!–!testna!miš$se$ob$poskusu$naskoka$za$kratek$čas$ustavi,$vendar$hitro$konča$stik$ s!samcem;! L2! –! testna! miš! pusti! samcu,! da! se! vzpne! na! ledveni! del,! vendar! se! ob! poskusu! kopulacije!odmakne!in!tako!prekine!kopulacijo;! L3!–!testna!miš!pusti!samcu,!da!se!vzpne!na!ledveni!del;!ko!poskuša!kopulirati,!se! premika!in!lahko!tudi!oglaša;!kopulacijo!prekine!stimulusni!samec;! L4!–!testna!miš!pusti!samcu!naskok!in!kopulacijo,!se!pri!tem!lahko!oglaša!in!lahko! tudi!rahlo!premika;!kopulacijo!prekine!samec;! L5!–!testna!miš!pusti!samcu!naskok!in!kopulacijo;!med!kopulacijo!je!pri!miru!in!se! ne!oglaša;!kopulacijo!prekine!samec.! Zaradi!ugotovitev!med!opazovanji!smo!dodali!še!L0,!ko!je!testna!žival!stala!na!tleh! samo!z!dvema!ali!s!tremi!tačkami,!vendar!je!kljub!temu!dovolila!naskok.! Iz!ocen!lordoze!smo!izračunali!t.i.!količnik!lordoze!( angl.!lordosis!quotient;!LQ),!ki! v!našem!primeru!predstavlja!delež!naskokov!z!dobro!lordozo!(L4!in!L5)!glede!na! vse!naskoke!(LQ!=!skupno!število!lordoz!4!in!5!/!število!naskokov)!(296).!! 3.4.2 Poskus&agresivnega&obnašanja& Za!ugotavljanje!agresivnega!obnašanja!smo!uporabili!iste!miši!kot!za!žensko!spolno! obnašanje.!Tri!do!6!dni!po!končanem!testiranju!ženskega!spolnega!obnašanja!smo! mišim! vstavili! vsadke! s! testosteron! propionatom! in! nato! začeli! s! testiranji! agresivnega!obnašanja!7!dni!po!vsaditvi!vsadkov.! Poskus!agresivnega!obnašanja!smo!izvedli!v!zadnjem!delu!svetlega!dela!ciklusa.!Za! stimulusno!žival!smo!uporabili!odraslega!samca!linije!A/J.!Testno!žival!smo!vsaj!6! ur! pred! poskusom! nastanili! v! akvarijsko! kletko! in! ji! prenesli! nastilj! iz! skupinske! kletke,! da! se! je! privadila! na! okolje,! ki! je! do! konca! testiranja! predstavljala! njeno! domače! okolje.! Stimulusni! samec! je! predstavljal! vsiljivca,! ki! je! pri! testni! miši! vzpodbudil! agresivno! obnašanje.! To! je! t.i.! test! ”residentkintruder”! (155,! 297).! Posamezen!test!je!trajal!največ!15!minut!oziroma!2!minuti!od!začetka!agresivnega! ! 68! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! obnašanja.! Test! smo! izvajali! v! treh! zaporednih! dneh! in! tako! vsako! miš! testirali! trikrat.!Posamezen!test!smo!ocenjevali!sproti!s!programom!StopWatch+!in!jih!tudi! snemali!za!kasnejše!preverjanje.!S!programom!StopWatch+!smo!beležili!naslednje! parametre:! • začetek!in!število!ugrizov;! • začetek!in!število!napadov!(ko!je!testna!miš!s!tačkami!udarila!stimulusnega! samca!ali!pa!se!je!zagnala!vanj);! • začetek,! število! in! trajanje! agresivnega! negovanja! (ko! je! testna! miš! stimulusni! pulila! dlake! ali! brke! ali! jo! kakorkoli! vidno! nadlegovala,! stimulusna!miš!obstane,!se!umika!ali!celo!cvili);! • začetek!in!število!vibriranj!z!repom;! • začetek,(število(in(trajanje(prerivanja((ko(obe(miši(stojita(na(zadnjih!tačkah& in!se!s!sprednjimi!prerivata);! • začetek,(število(in(trajanje(preganjanja((ko(poskusna(miš(podi(nasprotnika( po!kletki). , Testirane!miši!smo!v!treh!dneh!po!koncu!testiranja!žrtvovali!s!postopkom!tkivne! perfuzije!in!odvzeli!možgane!za!kasnejše!proučevanje.!! 3.5 STATISTIČNA!OBDELAVA!PODATKOV! 3.5.1 Analiza&rezultatov&DNAFmikromrež& Analiza!podatkov,!ki!smo!jih!pridobili!po!skeniranju!DNAkmikromrež!z!GeneChip®! Scanner! 3000! 7G! in! analizi! slik! z! GCOS! (GeneChip®! Operating! Software),! je! bila! opravljena! z! uporabo! statističnega! programa! Orange! (Laboratorij! za! bioinformatiko,! Fakulteta! za! računalništvo! in! informatiko,! Univerza! v! Ljubljani,! Ljubljana),!s!pomočjo!dr.!Petra!Juvana.! Pred! samo! analizo! podatkov! smo! izvedli! še! postopek! normalizacije! in! s! tem! preverili,! če! je! prišlo! do! kakšnega! večjega! odstopanja,! ki! je! lahko! posledica! tovarniške!napake!pri!izdelavi!mikromreže!ali!napake!pri!izvedbi!poskusa.! Po! statistični! obdelavi! podatkov! smo! za! diferenčno! (razlikovalno)! izražene! gene! upoštevali! tiste,! katerih! prilagojena! p kvrednost! je! nižja! od! 0,05.! Prilagojena! p k vrednost! je! popravljena! p kvrednost! za! primer! lažno! pozitivnih! rezultatov,! t.i.! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 69! brez,gena,SF#1, korekcija!FDR!( angl.!false!discovery!rate),!saj!je!zaradi!velikega!števila!testiranih! genov!verjetnost!lažno!pozitivnih!rezultatov!zelo!velika.! 3.5.2 Analiza&rezultatov&qPCR& Obdelavo!podatkov!smo!opravili!po!metodi!po!Pfafflu!(298,!299).! Za!analizo!podatkov!pridobljenih!v!poskusu!qPCR!smo!najprej!izračunali!relativno! izraženost!genov!po!metodi!z!učinkovitostjo!( angl.!efficiency,!E)!popravljene! Ct! ( delta! Ct),! ki! smo! jo! normalizirali! z! napako! ene! notranje! kontrole! (HKG,! vzdrževalni!ali!hišni!gen,! angl.!house!keeping!gene)!( angl.!efficiency!corrected! Ct! method! normalized! with! single! control! normalization! error).! Vsak! vzorec! smo! delali! v! dveh! zaporednih! vzorcih,! zato! smo! za! nadaljnje! izračune! uporabili! povprečje! teh! dveh! pražnih! ali! kvantitativnih! ciklov! –! Cq! ( angl.! quantification! cycle)!(300).!Učinkovitost!(E)!smo!izračunali!po!enačbi:! E!=!(10!k1/k!!−!1)!x!100! k!–!naklon!premice,!ki!ga!dobimo!iz!umeritvene!krivulje.! Naša!enačba!za!izračun!razlik!med!relativno!izraženostjo!se!je!glasila:! ! ! ! EkCq!GOI!KO! ! ! ! ! ! NFKO! ! ! Količni ! k!razlike !!!! !=! _______________________! ! ! !!! ! EkCqGOI!WT!! NF ! ! WT! ! ! Količnik!razlike!( angl.!fold!change)!–!med!relativno!izraženostjo!gena!pri!SFk1!KO! živali!in!pri!živali!GDX/WT! GOI!–!preiskovani!gen!( angl.!gene!of!interest)! HKG!–!vzdrževalni!ali!hišni!gen!! Povprečja!Cq!smo!izračunali!za!vsak!vzorec!in!vsak!gen.! Izračunali!smo!relativno!količino!gena!popravljeno!z!učinkovitostjo!za!vsak!vzorec! in!gen!(E!–Cq).! ! 70! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Normalizacijski!faktor!–!NF!( angl.!normalization!factor)!smo!izračunali!po!formuli:! ! NFvzorec!=!Bvzorec/C! ! Za!izračun!B!in!C!smo!morali!pred!tem!izračunati!A.!In!sicer:! A! =! z! učinkovitostjo! popravljeno! količino! vzorca! delimo! z! najvišjo! količino! posameznega!gena!za!vsak!posamezen!vzorec!in!vsak!HKG! B!=!geometrična!sredina!vseh!A!za!posamezni!vzorec! C!=!geometrična!sredina!vseh!B! ! Po! izračunu! relativne! izraženosti! posameznega! gena! smo! te! primerjali! med! SFk1! KO!in!GDX/WT!živalmi!in!ugotavljali!ali!so!statistično!značilno!različno!izraženi!z! metodo!analize!variance.! 3.5.3 Analiza&rezultatov&testov&obnašanja& Podatke! smo! statistično! analizirali! s! statističnim! programom! NCSS! (NCSS! 7,! Kaysville,!UT,!ZDA).! Uporabili! smo! metodo! analize! variance! (ANOVA)! ponavljajočih! meritev,! ker! smo! tako! poskuse! ženskega! spolnega! kot! tudi! agresivnega! obnašanja! izvajali! večkrat.! Statistično! smo! preverili! razliko! v! vsakem! posameznem! parametru! obnašanja! (opisani! pri! izvedbi! obnašanja).! Upoštevali! smo! več! neodvisnih! spremenljivk,! in! sicer! spol! (moški,! ženski),! genotip! (KO,! WT)! in! tretiranje! s! testosteron! propionatom! (pred! rojstvom,! po! rojstvu,! pred! in! po! rojstvu! ter! kontrolne).! Posamezne! teste! pa! smo! upoštevali! kot! ponavljajoča! se! meritev.! Za! statistično! značilno!razliko!smo!upoštevali!rezultat,!kjer!je!bila!vrednost!p!nižja!od!0,05.! Razlike! med! posameznimi! skupinami! znotraj! ene! spremenljivke! smo! dodatno! ovrednotili!s!Fisherjevim!LSD!( angl.!Fisher’s!least!significant!difference)! post,hoc! testom.! Vsi! rezultati! na! diagramih! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti,! ki! smo! jih! izračunali!iz!vseh!ponovitev!poskusov!pri!posameznih!živalih!s!standardno!napako.! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 71! brez,gena,SF#1, 4 !REZULTATI! 4.1 IZRAŽANJE!GENOV!V!VMESNEM!DELU!MOŽGANOV!PRI!MIŠIH!BREZ! SF#1% IN!PRI!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! 4.1.1 Izražanje&genov&v&osrednjem&delu&možganov&na&DNAFmikromrežah& Za! proučevanje! izražanja! genov! pri! miših! brez! gena! SF#1! (SFk1! KO)! in! pri! miših! divjega! tipa,! ki! smo! jim! pred! puberteto! odstranili! spolne! žleze! (GDX/WT),! smo! vzeli! vmesni! del! možganov! v! odraslem! obdobju! (pri! starosti! 60! dni,! PN60),! ki! je! obsegal! predoptično! področje,! področje! hipotalamusa,! talamusa,! amigdale,! hipokampusa!in!možganske!skorje!v!tem!področju!kot!je!prikazano!na!sliki!1.! 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 Bregma Lambda 6 Bregma 0 Inferior Colliculus Cerebellum 5 Cerebral Cortex Superior 1 Colliculus corpus c allosum 4 Hippoc 2 Olfactory Bulb LV 3 posterior c om Septum 3 4 V Thalamus Midbrain 2 anterior fornix 4 commissure Pons 1 Medulla Preoptic 5 Area Hypothalamus Spinal Cord 0 Interaural 6 Lateral 0 .2 4 mm Interaural 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 ! Slika! SAGITTAL S 1:!Sl ECTION OF ik a THE M !prik OUSE BR A Ia N zu A d jre aw !imi ng of š a j e se !cmo tion of ž t g he amn oue se! v br !avzdol in cut in a žnem sagittal !pr plane er .24 ez mm u.!Pr lateral to eis the kovano! midline (Fig 103 pod of this ročje! atlas). Ventricles are shown in black. The position of the skull marks (bregma, lambda and interaural) are indicated. The top grid line indicates anteroposterior locations in relation to the coronal plane passing through bregma. The bottom grid line shows anteroposterior locations in relation to a coronal plane passing je! through the označe interaural n line. o! The me left d! vertical dv grid ema line ! č shows rtkani dorsoventral ma! č locations rint ama relation t .o! Vir! a slik horizontal e! plane je! The! passing M through ouse! bregma. B The rigra ht vin! erticain! l grid shows dorsoventral positions in relation to a horizontal place passing through the interaural line. Stereotaxic!Coordinates!(291).! ! Po!obdelavi!podatkov,!pridobljenih!po!hibridizaciji!in!skeniranju!DNAkmikromrež,! je!analiza!pokazala!razlike!pri!izražanju!genov!med!spoloma,!in!sicer!dobili!smo!6! različno!izraženih!genov.!Štirje!od!teh!genov! Uty,,Eif2s3y,,Ddx3y,,Kdm5d!so!vezani! na! kromosom! Y! in! izraženi! le! pri! samcih! obeh! genotipov,! SFk1! KO! in! CAS/WT,! vendar!brez!razlik!med!genotipoma!samcev.!Druga!dva!različno!izražena!gena,! Xist! in! Eif2s3x,! sta! bila! signifikantno! višje! izražena! pri! samicah! obeh! genotipov! in! sta! vezana!na!kromosom!X!(prikaz!na!sliki!2).! ! 72! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 7! 5! samci! 3! e!ik 1! !razl WT!M!vs.!WT!F! ik % Eif2s3y% Ddx3y% Xist% Kdm5d% Eif2s3x% KO!M!vs.!KO!F! k1! oličn Uty% K k3! k5! samice! k7! Geni! ! ! ! Slika!2:!Grafični!prikaz!primerjave!izražanja!genov!na!DNAkmikromrežah!pri!SFk1! KO!samcih!(KO!M)!in!SFk1!KO!samicah!(KO!F)!(KO!M!vs.!KO!F)!ter!pri!CAS/WT! samcih!(WT!M)!in!OVX/WT!samicah!(WT!F)!(WT!M!vs.!WT!F).!V!vsaki!skupini! so!bile!po!tri!živali.! Geni! Uty,, Eif2s3y,, Ddx3y,, Kdm5d! so! izraženi! pri! samcih! obeh! genotipov! statistično! značilno! višje! kot! pri! samicah! (prikazani! na! zgornjem! delu! grafikona),! medtem! ko! sta! Xist! in! Eif2s3x! bolj! izražena! pri! samicah! obeh! genotipov!(prikazana!na!spodnjem!delu!grafikona).! Rezultati! po! analizi! DNAkmikromrež! so! podani! za! vrednost! p<0,05! z! upoštevanjem!stopnje!lažnih!odkritij!(FDR;! angl.!false!discovery!rate).! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 73! brez,gena,SF#1, 4.1.2 Preverjanje&izražanja&genov&v&vmesenem&delu&možganov&z&metodo&qPCR& Rezultate,! pridobljene! iz! poskusa! na! DNAkmikromrežah,! smo! preverili! z! metodo! qPCR.! Za! poskus! smo! uporabili! isti! vzorec! izolirane! RNA! kot! za! mikromreže.! Preverili!smo!izražanje!vsakega!gena!posebej!( Uty,,Eif2s3y,,Ddx3y,,Kdm5d, Eif2s3x, Xist)!in!ga!normalizirali!glede!na!izraženost!HKG! Actb,!ki!je!predstavljal!notranjo! kontrolo! oziroma! normalizacijo! v! našem! poskusu.! Vsi! rezultati! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti! relativne! izraženosti! posameznega! gena! z! označeno! standardno!napako!povprečja!(S.E.M.)!za!posamezen!genotip,!ki!smo!jo!izračunali,! kot!je!opisano!v!poglavju!3.5.2.!Rezultati!so!prikazani!na!slikah!3,!4!in!5.! ! 12! ote)! 11! 10! e!en 9! itrarn 8! 7! !(arb 6! ost KO!M! n 5! WT!M!! aže 4! 3! a!izr 2! 1! elativnR 0! ! Eif2s3y! Ddx3y! Kdm5d! Uty! ! Slika! 3:!Grafični!prikaz!relativne!izraženosti!genov! Uty,,Eif2s3y,,Ddx3y,,Kdm5d!pri! samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!CAS/WT!(WT!M).! Relativna! izraženost! genov! je! podana! v! arbitrarnih! enotah.! Izraženost! genov! med!genotipoma!(SFk1!KO!in!WT)!se!statistično!značilno!ne!razlikuje.!V!vsaki! skupini! so! bile! po! tri! živali.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečna! vrednost! z! označeno!±S.E.M.!za!posamezen!genotip.! Izražanje!teh!genov!smo!preverili!tudi!pri!samicah!obeh!genotipov,!vendar!lekti! pri!njih!niso!bili!izraženi,!saj!so!vsi!štirje!geni!vezani!na!kromosom!Y.! ! ! ! 74! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 14! e! 12! 10! x!(arbitrarns3 8! !Eif2 te)! ! ostn eno 6! aže 4! a!izr 2! elativnR 0! KO!F! WT!F! KO!M! WT!M! ! Slika! 4:!Grafični!prikaz!relativne!izraženosti! Eif2s3x!pri!samicah!SFk1!KO!(KO!F),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!pri!samcih!CAS/WT!(WT! M).!! Rezultati!kažejo,!da!je!izraženost! Eif2s3x!podobna!pri!vseh!štirih!genotipih!ne! glede!na!spol.!To!kaže,!da!je!tista!rahla!razlika!v!korist!ženskega!spola,!ki!se!je! izrazila! pri! rezultatih! iz! DNAkmikromrež,! statistično! neznačilna.! V! vsaki! skupini! so! bile! po! tri! živali.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečna! vrednost! z! označeno!±S.E.M.!za!posamezen!genotip.! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 75! brez,gena,SF#1, 1.5! ote)! 1.3! e!en 1.1! itrarn 0.9! !(arb 0.7! ostn Xist! 0.5! aže a!izr 0.3! ! 0.1! elativn ! R k0.1! KO!F! WT!F! KO!M! Genotip! ! Slika! 5:! Grafični! prikaz! relativne! izraženosti! Xist#a,! gena,! ki! je! odgovoren! za! inaktivacijo!enega!kromosoma!X!pri!samicah.! Relativna!izraženost!med!samicami!SFk1!KO!(KO!F)!in!samicami!OVX/WT!(WT! F)! se! statistično! ne! razlikuje.! Pri! samcih! SFk1! KO! (KO! M)! se! je! pojavila! zelo! nizka!izraženost! Xista ka,!ki!bi!jo!bilo!za!dokončno!potrditev!potrebno!preveriti! z! drugimi! metodami.! Pri! samcih! CAS/WT! nismo! ugotovili! izražanja! Xist ka.! V! vsaki! skupini! so! bile! po! tri! živali.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečna! vrednost!z!označeno!±S.E.M.!za!posamezen!genotp!(❊❊❊!p<0.001).! ! Znano! je,! da! del! genov,! ki! se! nahajajo! na! kromosomu! X,! uide! inaktivaciji! enega! kromosoma!X!pri!samicah!(pri!ženskah!do!15%)!(30).!Po!podatkih!iz!literature!je! gen! Utx! eden! izmed! genov,! ki! običajno! uidejo! tej! inaktivaciji! (301).! Ker! so! naši! rezultati! na! DNAkmikromrežah! pokazali! razliko! v! Uty! (ki! je! homolog! Utx ka! na! kromosomu! Y),! smo! dodatno! preverili! še! relativno! izražanje! Utx! v! naših! vzorcih,! vendar!razlike!med!genotipi!nismo!ugotovili!(Slika!6).! ! ! 76! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 6! ote)! 5! e!en itrarn 4! tx!(arb!U 3! ostn aže 2! a!izr 1! elativnR 0! KO!F! WT!F! KO!M! WT!M! ! Slika! 6:! Grafični! prikaz! relativne! izraženosti! Utx, pri! samicah! SFk1! KO! (KO! F),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!pri!samcih!CAS/WT!(WT! M).! Relativna!izraženost! Utx, ne!kaže!statistično!značilnega!izražanja!med!SFk1!in! WT!mišmi,!niti!med!spoloma.!V!vsaki!skupini!so!bile!po!tri!živali.!Rezultati!so! prikazani!kot!povprečna!vrednost!z!označeno!±S.E.M.!za!posamezen!genotip.! ! 4.2 OBNAŠANJE!MIŠI!PO!DODAJANJU!TESTOSTERONA! V! odraslem! obdobju! smo! miši! brez! gena! SF#1! (SFk1! KO)! in! miši! divjega! tipa! (GDX/WT)! obeh! spolov! naprej! testirali! v! testu! ženskega! spolnega! obnašanja,! potem! smo! jim! vstavili! testosteronske! vsadke! in! jih! testirali! še! za! agresivno! obnašanje.!Imeli!smo!štiri!različne!skupine!tretiranja:! • tretirane!pred!rojstvom!(TP!na!E13!in!E16)!(oznaka!TPkE);! • tretirane!po!rojstvu!(TP!na!PN!1,!PN3!in!PN5)!(oznaka!TPkPN);! • tretirane!pred!in!po!rojstvu!(TP!na!E13,!E16!in!PN!1,!PN3!in!PN5)!(oznaka! TPkE&PN);! • kontrolne!(samo!olje,!brez!TP)!(oznaka!KkK).! Oznake!o!tretiranju!veljajo!tako!za!žensko!spolno!obnašanje!kot!tudi!za!agresivno! obnašanje.!! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 77! brez,gena,SF#1, 4.2.1 Izražanje& ženskega& spolnega& obnašanja& pri& miših& SFF1& KO& in& GDX/WT& po& dodajanju&testosterona&v&obdobju&ob&rojstvu& V!odraslem!obdobju,!po!starosti!70!dni,!smo!živali!začeli!testirati!v!testu!za!žensko! spolno! obnašanje.! Vsaka! žival! je! bila! testirana! 6kkrat.! Ocenjevali! smo! lordozo! in! druge! parametre! ženskega! spolnega! obnašanja,! ki! ocenjujejo! tudi! stimulusnega! samca.!Prikazani!so!rezultati!za!količnik!lordoze!(LQ)!(Slika!7)!in!število!lordoz!(L),! ocenjenih!z!oceno!5!v!zadnjem,!šestem!testu,!kjer!se!je!pokazala!velika!razlika!med! vsemi! genotipi! v! primerjavi! s! samicami! divjega! tipa! (Slika! 8),! kar! kaže! na! defeminizacijo! in! maskulinizacijo! pri! živalih,! tretiranih! s! testosteronom.! Pri! kontrolnih!živalih!brez!gena! SF#1, (tistih,!ki!niso!prejemale!TP)!pa!kaže,!da!te!živali! niso! popolnoma! feminizirane,! saj! ne! kažejo! popolnega! ženskega! spolnega! obnašanja!in!torej!kljub!temu,!da!fenotipsko!samci!in!samice!SFk1!KO!izgledajo!kot! samice! OVX/WT,! njihovo! obnašanje! ne! ustreza! obnašanju! samic! WT! (OVX/WT)! (p<0.05).!Na!Sliki!9!je!prikazan!LQ!pri!samicah!WT!(OVX/WT)!v!posameznih!testih! in!v!vseh!štirih!različno!tretiranih!skupinah.!Rezultati!kažejo,!da!imajo!samice,!ki! niso! prejemale! TP,! najvišji! količnik! lordoze! in! da! imajo! vse! ostale! v! drugem,! tretjem! in! četrtem! testu! statistično! značilno! nižji! LQ.! V! zadnjem,! šestem! testu! (označen!kot!5,!ker!prvega!nismo!analizirali),!pa!je!ta!razlika!prisotna!samo!še!v! primerjavi! med! samicami,! ki! niso! prejemale! TP,! in! tistimi,! ki! so! prejemale! TP! po! rojstvu! (p<0,05).! Na! Slikah! 10! in! 11! je! prikazano! število! naskokov! in! poskusov! naskokov,! kjer! pa! se! niso! pokazale! statistično! značilne! razlike! niti! med! spoloma! niti!med!genotipoma!in!niti!med!različno!tretiranimi!skupinami.!Vsi!rezultati!testov! obnašanja!so!bili!analizirani!z!analizo!variance!(ANOVA)!ponavljajočih!se!meritev! in! ovrednoteni! s! Fisherjevim! LSD! post, hoc! testom.! Število! posameznih! živali! v! skupini!je!prikazano!v!poglavju!3.4!v!Tabeli!3.! ! ! 78! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 70! ! 60! )! 50! !(LQ KkK! oze 40! TPkE! !lordik 30! TPkPN! oličn TPkE&PN! K 20! 10! 0! WT!F!! KO!F! KO!M! WT!M! ! Slika!7:!Grafični!prikaz!količnika!lordoze!(LQ)!–!povprečja!vseh!petih!analiziranih! testov!ženskega!spolnega!obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk 1!KO!(KO!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh! štirih!različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju! pred! rojstvom! (TPkE),! TP! v! obdobju! po! rojstvu! (TPkPN)! in! TP! tako! pred! kot! tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).! Iz! grafa! je! razvidna! statistično! značilna! razlika! med! kontrolnimi! samicami! OVX/WT!(WT!F)!v!primerjavi!z!vsemi!ostalimi!genotipi,!SFk1!KO!samicami!(KO! F)!in!samci!(KO!M)!ter!CAS/WT!samci!(WT!M)!v!vseh!skupinah!in!samicami! OVX/WT!ostalih!tretiranih!skupin.!! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti! LQ! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno!testirano!skupino!miši!(❊!p<0,05).! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 79! brez,gena,SF#1, 6! ! 5! 4! KkK! 3! TPkE! Število!L5! TPkPN! 2! TPkE&PN! 1! 0! WT!F! KO!F! KO!M! WT!M! ! Slika!8:!Grafični!prikaz!števila!lordoz!5!(L5)!pri!zadnjem!testu!ženskega!spolnega! obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk1!KO!(KO!F),!samcih!SFk1! KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in! sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom!(TPkE),!TP!v! obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).! Graf! prikazuje! statistično! značilne! razlike! med! netretiranimi! samicami! OVX/WT! KkK! in! vsemi! ostalimi! skupinami! živali,! ki! smo! jih! testirali! pri! ženskem!spolnem!obnašanju.! Rezultati!so!prikazani!kot!povprečne!vrednosti!L5!v!zadnjem!testu!z!označeno! ±S.E.M.!za!posamezno!testirano!skupino!miši!(❊!p<0,05).! ! ! ! 80! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 80! ! !! !! ! !! 70! WT!F!K! 60! 50! WT!F!E! ! 40! LQ WT!F!PN! 30! 20! WT!F!E&PN! 10! !! 0! 1! 2! 3! 4! 5! Test! ! Slika!9:!Grafični!prikaz!količnika!lordoze!(LQ)!pri!samicah!OVX/WT!za!posamezen! test! v! različno! tretiranih! skupinah! (brez! dodajanja! TP! –! WT! F! K;! tiste,! ki! so! prejemale!TP!samo!pred!rojstvom!–!WT!F!E;!tiste,!ki!so!prejemale!TP!samo!po! rojstvu!–!WT!F!PN;!tiste,!ki!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu!–!WT!F!E&TP).!! LQ! je! pri! OVX/WT,! ki! niso! prejemale! TP! (WT! F! K),! pri! drugem,! tretjem! in! četrtem! testu! statistično! značilno! višji! od! ostalih,! tretiranih! skupin.! Pri! zadnjem!testu!pa!je!ta!razlika!prisotna!samo!še!med!netretiranimi!(WT!F!K)!in! tretiranimi!po!rojstvu!(WT!F!PN).! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečna! vrednosti! LQ! v! posameznem! testu! ženskega! spolnega! obnašanja! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno! testirano! skupino!miši!OVX/WT!(❊!p<0,05).! ! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 81! brez,gena,SF#1, 18! 16! !! ! 14! 12! ov!ok KkK! 10! ask TPkE! 8! TPkPN! Število!n 6! TPkE&PN! 4! 2! 0! WT!F! KO!F! KO!M! WT!M! ! Slika!10:!Grafični!prikaz!števila!naskokov!v!vseh!petih!analiziranih!testih!ženskega! spolnega! obnašanja! pri! samicah! OVX/WT! (WT! F),! samicah! SFk1! KO! (KO! F),! samcih! SFk1! KO! (KO! M)! in! samcih! CAS/WT! (WT! M)! pri! vseh! štirih! različnih! tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom! (TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu! (TPkE&PN).!! Graf!prikazuje!povprečno!število!naskokov!z!označeno!±S.E.M.!za!posamezno! testirano! skupino.! Med! skupinami! ni! izražene! nobene! statistično! značilne! razlike.!Pri!samicah!OVX/WT,!ki!so!prejemale!TP!samo!pred!rojstvom,!je!bilo! število! naskokov! nižje! kot! pri! ostalih! skupinah! samic! OVX/WT! (❊p<0,05),! vendar!se!ta!razlika!ne!pokaže!pri!drugih!ocenjenih!parametrih.! ! ! 82! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 20! !! 18! 16! a!ok 14! ask v!n K_K! 12! sou TP_E! 10! osk TP_PN! 8! TP_E&PN! Število!p 6! 4! 2! 0! WT!F! KO!F! KO!M! WT!M! ! Slika!11:!Grafični!prikaz!števila!poskusov!naskokov!v!vseh!petih!analiziranih!testih! ženskega!spolnega!obnašanja!pri!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samicah!SFk1!KO! (KO!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samcih!CAS/WT!(WT!M)!in!pri!vseh!štirih! različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred! rojstvom!(TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po! rojstvu!(TPkE&PN).! Graf! prikazuje! povprečno! število! poskusov! naskokov! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno!testirano!skupino.!Med!skupinami!ni!izražene!nobene!statistično! značilne!razlike.!Znotraj!skupine!samic!SFk1!KO!(KO!F)!je!statistično!značilna! razlika!med!kontrolno,!netretirano!skupino!(KkK),!in!tisto,!ki!so!prejemale!TP! samo!pred!rojstvom!(TPkE),!v!primerjavi!z!ostalima!dvema!skupinama!(TPkE! in! TPkE&PN).! Ta! razlika! se! pri! drugih! opazovanih! parametrih! ni! izrazila! (❊p<0,05).! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 83! brez,gena,SF#1, 4.2.2 Agresivno&obnašanje&pri&miših&SFFKO&in&GDX/WT&po&dodajanju&testosterona&v& obdobju&ob&rojstvu& Po!statistični!obdelavi!podatkov!za!posamezen!parameter!(ugriz,!napad,!agresivno! negovanje! …)! glede! njihovega! števila! in! časa! od! začetka! testa! do! začetka! posamezne!aktivnosti!(latenca),!se!je!pri!večini!pokazal!močan!vpliv!testa,!zato!je! prikazan!posebej!diagram!za!1.!test!(Slika!12),!ki!prikazuje!razliko!med!WT!samci! in! ostalimi! genotipi! v! kontrolni! skupini,! pri! ostalih,! tretiranih! skupinah! pa! ta! razlika!že!pri!prvem!testu!izgine.!Pri!vplivu!testa!gre!za!pričakovan!rezultat,!saj!ima! testna!miš!že!izkušnjo!od!prejšnjega!dne,!ker!test!poteka!v!treh!zaporednih!dneh.! Običajno!je!razlika!največja!med!prvim!in!tretjim!testom.!Zaradi!prevelikega!števila! posameznih! parametrov! so! predstavljeni! rezultati! pri! posameznem! genotipu! in! vplivu!testa!v!času!od!začetka!testa!do!prvega!agresivnega!dogodka!(za!katerega! smo! upoštevali! ali! pojav! ugriza! ali! napada! ali! agresivnega! negovanja)! in! skupno! število!najbolj!agresivnih!obnašanj!(napadi!in!ugrizi).! ! 18! ! ! 16! 14! ov!ad 12! ap!n WT!M! 10! v!+ WT!F! izo 8! gr KO!M! 6! KO!F! Število!u 4! 2! 0! KkK! TPkE! TPkPN! TPkE&PN! ! Slika! 12:! Grafični! prikaz! števila! ugrizov! in! napadov! v! prvem! testu! agresivnega! obnašanja!pri!samcih!CAS/WT!(WT!M),!samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1! KO!(KO!M)!in!samicah!SFk1!KO!(KO!F)!pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in! sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred!rojstvom!(TPkE),!TP!v! obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).! ! 84! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! Prikazana!je!statistično!značilna!razlika!med!samci!in!samicami!GDX/WT!(WT! M!in!WT!F)!v!primerjavi!s!SFk1!KO!samci!in!samicami!(KO!M!in!KO!F)!znotraj! kontrolne!skupine,!skupne,!ki!ni!prejemala!TP!(KkK)!(❊❊!p<0,01).!Pri!ostalih,! tretiranih!skupinah,!se!takšna!razlika!ne!pokaže.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno!testirano!skupino.! ! 18! 16! 14! ov!ad 12! ap!n WT!M! 10! v!+ WT!F! izo 8! gr KO!M! 6! KO!F! Število!u 4! 2! 0! KkK! TPkE! TPkPN! TPkE&PN! ! ! Slika! 13:! Grafični! prikaz! povprečja! skupnega! števila! ugrizov! in! napadov! v! vseh! testih!agresivnega!obnašanja!pri!samcih!CAS/WT!(WT!M),!samicah!OVX/WT! (WT! F),! samcih! SFk1! KO! (KO! M)! in! samicah! SFk1! KO! (KO! F)! pri! vseh! štirih! različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v!obdobju!pred! rojstvom!(TPkE),!TP!v!obdobju!po!rojstvu!(TPkPN)!in!TP!tako!pred!kot!tudi!po! rojstvu!(TPkE&PN).! Pri!številu!ugrizov!in!napadov,!upoštevajoč!vse!tri!teste,!razlika!iz!prvega!testa! ni!več!statistično!značilna.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno!testirano!skupino.! ! ! ! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 85! brez,gena,SF#1, ! 300! ! ! ! ! 250! a!(s)kd ogo 200! !d KkK! egavn 150! TPkE! esi TPkPN! !agr 100! TPkE&PN! rvega o!pd 50! Čas! 0! WT!M! WT!F! KO!M! KO!F! ! Slika!14:!Grafični!prikaz!časa!v!sekundah!od!začetka!testa!do!prvega!agresivnega! dogodka! v! vseh! testih! agresivnega! obnašanja! pri! samcih! CAS/WT! (WT! M),! samicah!OVX/WT!(WT!F),!samcih!SFk1!KO!(KO!M)!in!samicah!SFk1!KO!(KO!F)! pri!vseh!štirih!različnih!tretiranjih,!in!sicer!brez!dodanega!TP!(KkK),!TP!samo!v! obdobju! pred! rojstvom! (TPkE),! TP! v! obdobju! po! rojstvu! (TPkPN)! in! TP! tako! pred!kot!tudi!po!rojstvu!(TPkE&PN).! Statistično! značilna! razlika! se! kaže! pri! samicah! OVX/WT! in! pri! miših! SFk1! obeh!spolov,!kjer!imajo!miši,!ki!so!bile!tretirane!po!rojstvu!(TPkPN)!ter!pred!in! po! rojstvu! (TPkE&PN)! statistično! značilen! krajši! čas! do! prvega! agresivnega! dogodka,! v! primerjavi! s! kontrolno! skupino! (KkK)! in! skupino,! ki! je! dobivala! testosteron!samo!pred!rojstvom!(TPkE)!(❊!p<0.05).!Pri!WT!samcih!statistična! obdelava!ni!pokazala!značilnih!razlik.!Samice!OVX/WT,!miši!SFk1!KO,!tretirani! s! TP! po! rojstvu! in! tretirani! pred! in! po! rojstvu,! so! po! latencah! podobni! WT! samcem.! Rezultati! so! prikazani! kot! povprečne! vrednosti! z! označeno! ±S.E.M.! za! posamezno!testirano!skupino.! ! ! ! 86! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 4.3 VPLIV! DODAJANJA! TESTOSTERONA! V! OBDOBJU! OB! ROJSTVU! NA! IZRAŽANJE! BELJAKOVIN! KALBINDIN! IN! ARGININ! VAZOPRESIN! V! VMESNIH!MOŽGANIH!PRI!MIŠIH!BREZ! SF#1!IN!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! ! Z! metodo! imunohistokemičnega! barvanja! smo! na! plavajočih! rezinah! možganov! proučevali! izraženost! beljakovine! za! vezavo! Ca2+! (Kalbindin! Dk28K,! kalbindin,! Calb)!in!arginin!vazopresina!(AVP)!v!vmesnih!možganih!pri!miših!brez!gena! SF#1!in! divjega! tipa.! Primerjali! smo! miši! brez! gena! SF#1! in! divjega! tipa! z! odstranjenimi! spolnimi! žlezami! obeh! spolov.! Miši! so! bile! razdeljene! v! skupine! glede! na! izpostavljenost! eksogenemu! testosteron! propionatu! (TP)! kot! že! prej! opisano.! Uporabili!smo!živali!po!končanih!testih!obnašanja.!Žrtvovali!smo!jih!s!postopkom! tkivne!perfuzije!znotraj!treh!dni!po!koncu!testa!agresivnega!obnašanja,!da!so!bili! TP! podkožni! vsadki! še! aktivni,! saj! je! za! izražanje! AVP! potrebna! prisotnost! testosterona.!Proučevali!smo!rezine!vmesnega!dela!možganov!rostralno!od!bregme! 0,38!mm!ter!do!2,06!mm!kavdalno!od!bregme!(označeno!tudi!kot!k2,06!mm)!pod! 40kkratno!in!100kkratno!povečavo.! 4.3.1 Izraženost&beljakovine&kalbindin&v&vmesnih&možganih& Za!primerjavo!izraženosti!kalbindina!smo!izbrali!rezine!0,10!mm!kavdalno!(291)! od!bregme,!kjer!se!nahaja!medialno!predoptično!področje!(MPOA).!Na!Sliki!15!so! prikazane!slike!rezin!pod!40kkratno!povečavo.!Primerjali!smo!izražanje!kalbindina! med! WT! samci,! SFk1! KO! samci! in! samicami! ter! WT! samicami! v! vseh! štirih! skupinah,! in! sicer! tistimi,! ki! niso! prejemala! eksogenega! testosteron! propionata! (TP),!tistimi,!ki!so!ga!prejemale!samo!pred!rojstvom,!tistimi,!ki!so!ga!prejemale!po! rojstvu,!ter!tistimi,!ki!so!TP!prejeli!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu.!Ugotavljali!smo,!če! se! je! tudi! pri! ostalih! skupinah! pojavilo! t.i.! spolno! dimorfno/različno! jedro! v! POA! (SDNkPOA),!ki!je!značilno!za!samce!WT.!Kot!kažejo!fotografije,!je!pri!samcih!WT!v! vseh! štirih! skupinah! (ne! glede! na! tretiranje)! izraženo! SDNkPOA! (na! Sliki! 15! je! obkrožen!pri!samcu!WT!brez!dodatnega!TP).!Pri!ostalih!genotipih,!samicah!WT,!SFk 1!KO!samcih!in!samicah,!pa!samo!v!primeru!tretiranja!s!TP!po!rojstvu!ter!pred!in! po!rojstvu,!ne!pa!tudi!pri!živalih,!ki!so!prejemale!testosteron!samo!pred!rojstvom.! Na!Sliki!16!je!prikazano!SDNkPOA!pod!večjo!(100kkratno)!povečavo.! ! T.! Španić:! Hormonsko, odvisna, in, hormonsko, neodvisna, spolna, diferenciacija, možganov, miši, 87! brez,gena,SF#1, Za!vse!slike!od!15!do!18!veljajo!oznake:! • WT!M!K!–!samci!WT,!brez!dodajanja!TP!(KkK);! • WT!M!E!–!samci!WT,!ki!so!prejemali!TP!pred!rojstvom!(TPkE);! • WT!M!PN!–!samci!WT,!ki!so!prejemali!TP!po!rojstvu!(TPkPN);! • WT!M!EkPN!–!samci!WT,!ki!so!prejemali!TP!pred!in!po!rojstvu!(TPkE&PN);! • WT!F!K!–!samice!WT,!brez!dodajanja!TP!(KkK);! • WT!F!E!–!samice!WT,!ki!so!prejemali!TP!pred!rojstvom!(TPkE);! • WT!F!PN!–!samice!WT,!ki!so!prejemale!TP!po!rojstvu!(TPkPN);! • WT!F!EkPN!–!samice!WT,!ki!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu!(TPkE&PN);! • SFk1!KO!K!–!samci!brez! SF#1,!brez!dodajanja!TP!(KkK);! • SFk1!KO!E!–!samci!brez! SF#1,!ki!so!prejemali!TP!pred!rojstvom!(TPkE);! • SFk1!KO!PN!–!samci!brez! SF#1,!ki!so!prejemali!TP!po!rojstvu!(TPkPN);! • SFk1!KO!EkPN!–!samci!brez! SF#1,!ki!so!prejemali!TP!pred!in!po!rojstvu!(TPk E&PN);! • SFk1!KO!K!–!samice!brez! SF#1,!brez!dodajanja!TP!(KkK);! • SFk1!KO!E!–!samice!brez! SF#1,!ki!so!prejemale!TP!pred!rojstvom!(TPkE);! • SFk1!KO!PN!–!samice!brez! SF#1,!ki!so!prejemale!TP!po!rojstvu!(TPkPN);! • SFk1!KO!EkPN!–!samice!brez! SF#1,!ki!so!prejemale!TP!pred!in!po!rojstvu!(TPk E&PN).! ! Slika! 15:! Prikaz! izražanja! kalbindina! v! MPOA! pri! miših! GDX/WT! in! SFk1! KO! po! dodajanju!TP!v!različnih!obdobjih!(40kkratna!povečava).!Na!delu,!ki!prikazuje! WT! samca! brez! dodajanja! TP! je! obkroženo! t.i.! SDNkPOA.! To! področje! smo! primerjali!z!vsemi!ostalimi!skupinami.! ! ! Slika! 16:! Prikaz! izražanja! kalbindina! v! MPOA! pri! miših! GDX/WT! in! SFk1! KO! po! različnih! tretmajih! s! TP! (100kkratna! povečava).! Na! delu,! ki! prikazuje! WT! samca! brez! dodajanja! TP! je! obkroženo! t.i.! SDNkPOA.! To! področje! smo! primerjali!z!vsemi!ostalimi!skupinami.! ! ! 88! T.! Španić:! Hormonsko,odvisna,in,hormonsko,neodvisna,spolna,diferenciacija,možganov, miši,brez,gena,SF#1, ! 4.3.2 Izraženost&beljakovine&arginin&vazopresin&v&vmesnih&možganih& Za! proučevanje! izraženosti! AVP! smo! izbrali! rezine! 0,14! mm! rostralno! (291)! od! bregme,!kjer!se!nahaja!stranski!pretin!(LS),!v!predelu,!ko!se!anteriorna!(sprednja)! komisura! (aca)! že! zduži! in! se! na! sredini! med! LS! obeh! strani! že! pojavlja! septofimbrialno! jedro! (SFi).! Na! Sliki! 17! so! prikazane! slike! rezin! pod! 40kkratno! povečavo.!Primerjali!smo!izražanje!AVP!med!WT!samci,!SFk1!KO!samci!in!samicami! ter!WT!samicami!v!vseh!štirih!skupinah,!in!sicer!tisti,!ki!ni!prejemala!eksogenega! testosteron!propionata!(TP),!tisti,!ki!so!ga!prejemale!samo!pred!rojstvom,!tisti,!ki! so!ga!prejemali!po!rojstvu,!ter!tisti,!ki!so!TP!prejeli!tako!pred!kot!tudi!po!rojstvu.!Na! Sliki! 18! je! prikazano! enostransko! povečano! področje! LS! (100kkratna! povečava).! Rezultati!kažejo,!da!je!AVP!očitno!izražen!pri!samicah!OVX/WT!samo,!kadar!so!te! prejemale!TP!po!rojstvu!ali!pred!in!po!rojstvu,!ne!pa!tudi,!če!so!ga!prejemale!samo! pred!rojstvom.!Zanimivo!pa!je,!da!je!pri!miših!brez!gena! SF#1, prisotna!izraženost! AVP!v!LS!tudi!pri!miših,!ki!niso!bile!izpostavljene!testosteron!propionatu,!čeprav!je! izraženost!očitno!nižja,!kot!pri!samcih!divjega!tipa.! ! Slika!17:!Prikaz!izražanja!arginin!vazopresina!(AVP)!v!LS!pri!miših!GDX/WT!in!SFk 1!KO!po!različnih!tretmajih!s!TP!(40kkratna!povečava).!Na!delu,!ki!prikazuje! WT! samca! brez! dodajanja! TP,! je! označena! združena! anteriorna! komisura! (aca),!septofimbrialno!jedro!(SFi)!in!LS.! ! Slika!18:!Prikaz!izražanja!AVP!v!LS!pri!WT!in!SFk1!KO!miših!po!različnih!tretmajih! s!TP!(100kkratna!povečava).!Povečano!je!prikazano!področje!LS.!!! ! ! 89! ! ! Slika!15! 90! ! ! ! Slika!16! ! 91! LS! SFi! aca! ! ! Slika!17! 92! ! ! Slika!18! T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 93# brez(gena(SF;1# ! 5 RAZPRAVA! V#Slovarju#slovenskega#knjižnega#jezika#je#zapisano:# “razlíka#;e# ž# (ȋ)# 1. # kar( kaže( na( neenakost( med( primerjanimi( stvarmi:# razlika# nastane,#obstaja,#se#poveča;#odpraviti#razlike;#spoznati,#ugotoviti#razlike;#bistvena,# majhna,# opazna,# velika# razlika;# razlika# med# človekom# in# živaljo;# razlike# med# spoloma;#razlika#v#barvi,#obliki,#velikosti;#razlike#v#ceni,#kakovosti#izdelkov;#razlike# v#izobrazbi,#vzgoji;#razlike#v#pogledih#…”#(302)# # Že# pod# prvo# točko# opredelitve# pojma# razlika# so# omenjene# razlike# med# spoloma,# razlike,# ki# jih# vidimo,# razlike,# ki# jih# čutimo# in# razlike,# ki# jih# raziskujemo,# preiskujemo,#proučujemo#in#nemalokrat#tudi#občudujemo.#Zakaj#jih#proučevati,#v# čem#smo#si#tako#različni#in#ali#je#realnost,#ki#jo#poznamo,#res#posledica#neke#kemije,# delovanja# molekul,# hormonov,# genov,# okolja,# in# ne# nazadnje# družbe# in# družbenih# norm?#Odgovor#na#ta#vprašanja#je#zapleten,#dolg#in#v#celoti#zagotovo#še#nepoznan.# Delo# preteklih# let,# proučevanje# živalskih# modelov,# tudi# miši# brez# gena# za# SF;1, ( odpiranje# novih# vprašanj# in# iskanje# rešitev# ter# tu# predstavljeni# rezultati# predstavljajo#le#drobec#v#mozaiku#tega#še#neraziskanega#področja.# # Razlike#med#spoloma#pri#sesalcih#izvirajo#že#od#same#združitve#spolnih#celic,#ko#se# v#zigoti#združita#pronukleusa#jajčeca#in#semenčice,#in#s#tem#določita#kromosomski# spol;# XX# ali# XY.# Vsoto# vseh# spolno# vezanih# dejavnikov,# ki# vplivajo# na# delovanje# genov# (njihovo# omrežje)# in# celičnih# sistemov# ter# s# tem# privedejo# do# razlik# med# spoloma,#sta#Arnold#in#Lusis#nedavno#opredelila#kot#seksom#( angl.#sexome)#(303).# Menita,# da# je# za# razumevanje# delovanja# seksoma# in# seksomike# pomembno# prepoznati# in# razumeti# tri# ključne# spolno# vezane# dejavnike.# Prvi# izmed# teh# dejavnikov# naj# bi# bila# ravno# spolna# kromosoma# X# in# Y,# ki# že# sama# po# sebi# predstavljata#neenakost#v#zigoti,#če#primerjamo#žensko#zigoto#(XX)#z#moško#(XY).#V# ženski# zigoti# sta# prisotna# dva# kromosoma# X# (in# s# tem# dve# kopiji# genov# s# kromosomov#X),#v#moški#pa#en#kromosom#X#in#en#Y#ter#s#tem#geni#s#kromosoma#Y,# ki# so# prisotni# samo# pri# moškem# fenotipu# (304).# Eden# pomembnejših# spolno# vezanih# dejavnikov# je# zagotovo# gen# Sry,# ki# se# nahaja# na# kromosomu# Y# in# usmeri# # 94# T.# Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# nediferencirane#gonade,#da#se#razvijejo#kot#moda#in#ta#kasneje#izločajo#testosteron.# Pri# ženskem# fenotipu# se# ob# odsotnosti# Sry( pod# vplivom# delovanja# genov# iz# avtosomov#in#kromosoma#X#razvijejo#jajčniki,#ki#kasneje#izločajo#spolne#hormone.# Delovanje#spolnih#hormonov,#ki#jih#izločajo#ženske#in#moške#spolne#žleze,#je#zelo# pomembno#in#predstavlja#drugega#izmed#treh#spolno#vezanih#dejavnikov.#Hormoni# imajo#dva#ključna#učinka,#in#sicer#organizacijskega#in#aktivacijskega.#Organizacijski# učinek# delovanja# hormonov# se# začne# že# zgodaj# med# razvojem# in# povzroči# trajno,# nepovratno# diferenciacijo# genitalij,# možganov# in# drugih# organov# (14,# 305).# Aktivacijski#učinek#pa#je#povraten#učinek#delovanja#spolnih#hormonov,#ki#različno# delujejo# na# omrežje# genov# in# celične# sisteme.# Tretji# izmed# spolno# vezanih# dejavnikov# so# geni# na# kromosomih# X# in# Y,# ki# na# nastanek# razlik# med# spoloma# delujejo#preko#poti,#ki#ne#gredo#preko#spolnih#žlez#(304).# 5.1 RAZLIKE!V!IZRAŽANJU!GENOV!V!VMESNEM!DELU!MOŽGANOV!PRI!MIŠIH! BREZ! SF#1%IN!PRI!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA!! Miši,# ki# nimajo# prisotnega# gena# SF;1( (SF;1# KO) ,( so# rojene# brez# nadledvičnih# in# spolnih#žlez,#zato#nikoli#niso#izpostavljene#lastnim,#endogenim#spolnim#hormonom.# Ravno#zaradi#tega#predstavljajo#edinstven#model#za#proučevanje#vplivov#genetskih# dejavnikov#ločeno#od#hormonskih#tako#na#razvoj#in#delovanje#centralnega#živčnega# sistema#kot#tudi#drugih#mehanizmov#spolne#diferenciacije.#Kljub#temu#pa#obstaja# možnost,# da# so# v# času# embrionalnega# razvoja# v# neki# meri# izpostavljene# vplivu# spolnih# hormonov,# ki# prehajajo# preko# posteljice,# od# matere# ali# sosednjih# plodov# (96).# Možgani# so# tudi# sami# izvor# nekaterih# spolnih# steroidnih# hormonov# t.i.# nevrosteroidov# oziroma# živčnih# steroidnih# hormonov# (306,# 307,# 308).# V# nedavni# raziskavi# smo# tudi# v# možganih# miši# brez# SF;1# že# v# času# embrionalnega# razvoja ( potrdili# prisotnost# nekaterih# encimov,# ki# sodelujejo# pri# nastanku# nevrosteroidov# (309).# Delovanje# nevrosteroidov# je# dokaj# specifično# in# naj# bi# zaradi# njihove# zgradbe# imeli# pomembnejšo# vlogo# pri# spolni# diferenciaciji# živčevja# pri# sesalcih# (310,#311)#kot#pri#pticah,#kjer#se#pretvorijo#v#testosteron#(312).# Beljakovina# SF;1# ima# vlogo# tudi# pri# razvoju# VMH,# saj# so# spremembe# v# strukturi# tega#jedra#dokazali#tako#med#razvojem#kot#tudi#pri#odraslih#miših#brez# SF;1, ( zato#so# primeren#model#tudi#za#proučevanje#razvoja#in#funkcije#tega#jedra#(198,#194,#197).# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 95# brez(gena(SF;1# # Z#uporabo#qPCR#in#prenosa#northern#je#Xu#s#sodelavci#ugotavljal#izraženost#osmih# genov#vezanih#na#kromosom#Y#in#njihovih#homologov#na#kromosomu#X#v#možganih# miši,#ne#glede#na#genetski#spol#oziroma#prisotnost#spolnih#hormonov.#Proučevali# so# možgane# plodov# starih# 13,5# dni# (E13,5),# novorojenih# (PN1)# in# odraslih# miši.# Proučevali# so# izražanje# genov# v# možganih# pri# petih# različnih# genotipih# oziroma# fenotipih,#in#sicer#pri#samcih#XY#(z#modi),#samicah#XY#(zaradi#izbrisa#gena# Sry#so#te# miši#imele#jajčnike,#bile#so#fenotipsko#samice),#samcih#XY;# Sry((te#miši#so#imele# Sry# na#avtosomu,#zato#so#imele#prisotna#moda),#samicah#XX#(z#jajčniki)#in#samcih#XXSry# (te#miši#so#imele#gen#Sry#vezan#na#avtosom,#zato#so#razvile#moda).#Prepisi#šestih#na# kromosom# Y# vezanih# genov# Usp9y,# Uba1y,# Kdm5d,# Eif2s3y,# Uty# in# Ddx3y,# so# bili# izraženi# vsaj# pri# eni# ali# pri# večih# starostnih# skupinah# tako# pri# samcih# XY# kot# pri# samicah# XY,# zato# menijo,# da# za# izražanje# teh# genov# v# možganih# ni# potrebna# prisotnost# testikularnih# spolnih# hormonov.# Tudi# vseh# šest# homologov# na# kromosomu#X#( Usp9x, Uba1x, Kdm5c, Eif2s3x, Utx and Ddx3x)#je#bilo#izraženih#v# možganih,# s# tem# da# so# bili# pri# odraslih# miših# vsi# statistično# značilno# močneje# izraženi#pri#samicah#kot#pri#samcih,#ne#glede#na#utišanje#enega#izmed#kromosomov# X#(101).## Pri#proučevanju#izražanja#genov#v#vmesnem#delu#možganov#pri#odraslih#miših#brez# gena# SF;1# (SF;1# KO)# in# pri# miših# divjega# tipa# z# odstranjenimi# spolnimi# žlezami# (GDX/WT)# smo# ugotavljali# razlike# med# genotipoma# (SF;1# KO# proti# WT)# in# tudi# med#spoloma#(samice#proti#samcem).#Rezultati#poskusa#na#DNA;mikromrežah#so# pokazali#šest#diferenčno#izraženih#genov,#in#sicer# Uty,(Eif2s3y,(Ddx3y( in (Kdm5d,#ki# so# vezani# na# kromosom# Y# in# dveh,# Xist# in# Eif2s3x, # ki# sta# vezana# na# kromosom# X# (Slika#2).#Geni#s#kromosoma#Y#so#bili#statistično#značilno#bolj#izraženi#pri#samcih# obeh# genotipov,# kar# kaže# na# hormonsko# neodvisno# izražanje# teh# genov# v# možganih,#saj#so#samci#SF;1#KO#brez#lastnih#spolnih#hormonov.#Oba,#na#kromosom# X#vezana#gena# Xist#in# Eif2s3x,#sta#bila#bolj#izražena#pri#samicah#kot#pri#samcih#in# ponovno# brez# razlik# med# samicami# SF;1# KO# in# OVX/WT.# Tudi# ta# dva# gena# se# v# možganih# pri# samicah# izražata# ne# glede# na# prisotnost# spolnih# hormonov# iz# jajčnikov.# Rezultati# iz# DNA;mikromrež# niso# pokazali# nobenega# diferenčno# izraženega#avtosomskega#gena.#To#lahko#v#neki#meri#pripišemo#veliki#sorodnosti# miši,# uporabljenih# v# raziskavi,# ali# pa# velikosti# vzorca,# kjer# se# lahko# zaradi# # 96# T.# Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# razredčitev#in#priprave#vzorcev#šibkeje#izraženi#geni#izgubijo#in#zaznamo#samo#bolj# robustno#diferenčno#izražene#gene.# V# nedavni# raziskavi# je# Wolstenhome;ova# s# sodelavci# na# miših,# ki# imajo# zaradi# prerazporejenega# psevdoavtosomalnega# območja# ( angl.# pseudoautosomal# region,# PAR)# edinstven# kromosom# Y# (označen# kot# Y*),# ugotavljala# izražanje# spolno# dimorfnih# genov# v# možganih# v# času# embrionalnega# razvoja# (E11,5# in# E18,5).# Edinstven#kromosom#Y*#vsebuje#gene#iz#kromosoma#Y,#obrnjeno#podvojitev#dela# PAR# in# manjši# del# genov# iz# kromosoma# X# vključno# s# centromerom# (313,# 314).# S# parjenjem#normalnih#XX#samic#in#XY*#samcev#so#pridobili#potomce#štirih#različnih# genotipov,#in#sicer#normalne#XX#samice#(XX),#samice#z#enim#kromosomom#X#(XY*x),# samce#z#dvema#kromosomoma#X#(XXY*)#in#samce#z#enim#kromosomom#X#(XY*).#S# poskusom#na#DNA;mikromrežah#in#qPCR,#so#ugotovili#pri#samcih#Y*,#ne#glede#na# starost#in#prisotnost#kromosoma#X,#da#so#na#kromosom#Y#vezani#geni#( Uty,(Eif2s3y,( Ddx3y( in (Kdm5d)# bolj# izraženi# pri# samcih# kot# pri# samicah,# ne# glede# na# starostno# skupino.# Pred# razvojem# spolnih# žlez# (E11,5)# so# ugotovili# izraženost# šestih# na# kromosom# X# vezanih# genov# ( Xist,# Kdm5c,# Eif2s3x,# Tsix# in# neoznačen# prepis# 5530601H04Rik),#ki#so#ubežali#utišanju#enega#kromosoma#X#in#so#bili#bolj#izraženi# pri#živalih#XX.#Po#razvoju#gonad#pa#sta#ostala#pri#samicah#bolj#izražena#samo# Xist#in# Tsix((104).## V# predhodni# raziskavi# so# na# zarodkih# starih# 10,5# dni# (E10,5),# prav# tako# že# pred# razvojem#spolnih#žlez,#ugotovili#v#možganih#različno#izražene#gene#s#kromosoma#Y# ( Ddx3y#in# Eif2s3y)#ali#X#( Xist,# Utx#in# Eif2s3x)#(10).#Reinius#in#njegovi#sodelavci#so#pri# odraslih# miših# v# različnih# predelih# možganov# tudi# potrdili# izraženost# genov# na# kromosomu#Y#in#X,#in#sicer#10#že#znanih#( Xist,(Kdm5c,(Kdm5d,(Eif2s3x,(Eif2s3y,(Utx,( Uty,(Ddx3x,(Ddx3y,(Jpx)#in#7#še#neznanih#prepisov#s#kromosomov#Y#in#X#(315).# Gene,# ki# so# se# v# našem# poskusu# na# DNA;mikromrežah# pokazali# za# diferenčno# izražene,# smo# preverili# še# z# metodo# qPCR.# Za# vsak# gen# smo# preverili# relativno# izraženost#normalizirano#glede#na#izraženost#HKG# Actb#v#naših#vzorcih#vmesnega# dela#možganov#odraslih#miši#brez#gena# SF;1#in#gonadektomiziranih#miših#WT.#Pri# vseh# štirih,# na# kromosom# Y# vezanih# genih# Uty,# Eif2s3y,# Ddx3y# in# Kdm5d,# je# bila# relativna#izraženost#prisotna#samo#pri#samcih#obeh#genotipov,#SF;1#KO#in#CAS/WT,# vendar#brez#razlik#med#njima,#kar#je#potrdilo#rezultate#iz#DNA;mikromrež#(Slika#3).# Na#podlagi#teh#dveh#poskusov#menimo,#da#za#izražanje#teh#štirih#na#kromosom#Y# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 97# brez(gena(SF;1# vezanih#genov#v#možganih,#ni#potrebna#prisotnost#spolnih#hormonov,#kar#se#ujema# z#dosedanjimi#raziskavami#(101,#99,#315,#104).#Pri#preverjanju#izražanja# Eif2s3x,( za# katerega#menijo#in#so#v#nekaterih#študijah#dokazali,#da#uide#utišanju#kromosoma#X# (316,#317,#10,#101,#315)#pa#se#z#metodo#qPCR#v#naših#vzorcih#ni#pokazalo,#da#je# različno# izražen# (Slika# 4),# kar# sovpada# z# nedavno# študijo# Wolstenholme;ove# in# sodelavcev,# ki# so# ugotovili,# da# sta# edina# različno# izražena# X;vezana# gena# v# možganih# po# razvoju# spolnih# žlez# (E18,5)# Xist# in# Tsix# (104).# Pri# ugotavljanju# izraženosti# Xista# v# naših# vzorcih# (Slika# 5)# se# je# izkazalo,# da# je# bil# izražen# pri# samicah#obeh#genotipov,#SF;1#KO#in#OVX/WT,#in#brez#razlik#med#njima.#Pojavila#pa# se#je#tudi#šibka#izraženost#(100;krat#manjša#kot#pri#samicah)#pri#samcih#SF;1#KO.# Ta# izraženost# je# zaradi# prisotnosti# samo# enega# kromosoma# X# in# prisotnosti# kromosoma# Y# nenavadna,# zato# bi# morali# za# potrditev# te# izraženosti# opraviti# še# dodatno# preverjanje# izraženosti# genov# z# drugimi# metodam,# npr.# in# situ# hibridizacijo,# saj# Xist# izraža# samo# utišan# kromosom# X.# Možna# bi# bila# tudi# navzkrižna# reakcija# ologonukleotidnih# začetkov# z# genom# Tsix,# vendar# je# to# manj# verjetno,#saj#se#pri#WT#samcih,#ki#imajo#tudi#prisoten# Tsix,#izraženost#ni#pojavila.# V# nedavno# objavljeni# raziskavi# so# ugotavljali# ali# ima# dodajanje# testosterona# pred# rojstvom# vpliv# na# izražanje# spolno# dimorfnih# genov# v# skorji# možganov# in# hipokampusu#novorojenih#miši.#Preverili#so#izražanje#treh,#na#kromosom#Y#vezanih# genov#( Ddx3y,# Eif2s3y( in# Kdm5d),#ter#štirih,#na#kromosom#X#vezanih#( Eif2s3x,(Mid1,( Kdm6a( in# Xist),# in# enega# avtosomskega# gena# ( Klk8).# Ugotovili# so,# da# dodajanje# testosterona# pred# rojstvom# nima# vpliva# na# izražanje# teh# genov# v# nekaterih# predelih# možganov,# kar# je# še# dodaten# dokaz,# da# se# ti# geni# izražajo# ne# glede# na# prisotnost#spolnih#hormonov#(318).# Za# izražanje# gena# Utx# v# možganih# je# več# raziskav# pokazalo,# da# je# bolj# izražen# pri# genotipu#XX#kot#XY,#kar#kaže#na#to,#da#uide#utišanju#kromosoma#X#(319,#320,#301).# Zato#smo#preverili#ali#se#tudi#v#naših#vzorcih#pojavi#razlika#med#samci#in#samicami.# Izkazalo# se# je,# da# je# bila# izraženost# Utx# pri# vseh# štirih# genotipih# približno# enaka# (Slika#6).# # Pri# ugotavljanju# izraženosti# genov#v# vmesnem# delu# možganov# z# metodama# DNA; mikromreže#in#qPCR#pri#miših#SF;1#KO#in#GDX/WT#smo#ugotovili,#da#se#vezani#na# # 98# T.# Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# kromosom# Y# ( Uty,( Eif2s3y,( Ddx3y( in ( Kdm5d)# izražajo# pri# samcih# obeh# genotipov# neodvisno# od# prisotnosti# spolnih# žlez# in# spolnih# hormonov.# Za# izraženost# genov# vezanih#na#kromosom#X#v#istem#predelu#možganov,#pa#smo#s#qPCR#potrdili#samo# različno# izraženost# Xista( med# spoloma# in# brez# razlik# med# samicami# SF;1# KO# in# OVX/WT.# 5.2 VPLIV! DODAJANJA! TESTOSTERONA! V! OBDOBJU! OB! ROJSTVU! NA! OBNAŠANJE! PRI! MIŠIH! BREZ! GENA! SF#1! IN! GONADEKTOMIZIRANIH! MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! V# drugem# delu# raziskave# smo# proučevali# vpliv# dodajanja# testosteron# propionata# (TP)#v#obdobju#pred#rojstvom#in#tik#po#njem#pri#miših#brez# SF;1#in#miših#divjega# tipa#(GDX/WT)#seva#C57/Bl6J.#Testosteron#propionat#smo#injicirali#13.#in#16.#dan# embrionalnega#razvoja#(E13,5#in#E16,5)#ter#prvi,#tretji#in#peti#dan#po#rojstvu#(PN#1,# 3,# 5).# Pred# rojstvom# smo# izbrali# E13,5# in# E16,5,# ker# so# na# E13,5# spolne# žleze# že# diferencirane,#saj#ta#del#razvoja#pri#miših#poteče#med#E10,5#in#E12,5#(18,#19),#E16,5# pa# zato,# ker# se# na# E17# prvič# pojavi# povišano# izločanja# testosterona,# temu# dvigu# testosterona#pa#takoj#po#rojstvu#sledi#še#en#dvig#(86,#87),#zato#še#aplikacije#TP#na#1.,# 3.# in# 5.# dan# po# rojstvu.# V# tem# obdobju# naj# bi# imel# testosteron# oziroma# njegov# aromatiziran#metabolit#estradiol#pri#glodavcih#ključno#vlogo#pri#maskulinizaciji#in# defeminizaciji# možganov# in# s# tem# tudi# obnašanja# (213).# O# vplivu# perinatalnega# dodajanja# eksogenega# testosterona# na# spolno# obnašanje# pri# glodavcih# je# bilo# v# preteklosti#opravljenih#že#nekaj#različnih#raziskav,#med#drugimi#je#najbolj#znana#na# morskih#prašičkih#(14),#potem#pa#so#bile#še#nekatere#na#podganah,#ki#so#proučevale# vpliv#testosterona#prisotnega#v#obdobju#ob#rojstvu#(118,#127,#129).#Vendar#pa#še# vedno#ni#znano,#katera#obdobja#so#najbolj#pomembna#za#razvoj#možganov#samcev# in#zato#miši#brez#gena# SF;1,#ki#nimajo#endogenih#spolnih#hormonov,#predstavljajo# odličen#model#za#proučevanje#časovnih#točk,#v#katerih#je#nujno#potrebna#prisotnost# spolnih# hormonov# za# pravilen# razvoj# možganov# v# smer# moškega# ali# ženskega# fenotipa.# V# našem# primeru# smo# proučevali# vpliv# eksogenega# testosterona# v# obdobju# ob# rojstvu#preko#ženskega#spolnega#obnašanja,#kjer#smo#ugotavljali#defeminizacijo#v# obnašanju,#in#agresivnega,#kjer#smo#opazovali#maskulinizacijo#v#obnašanju.#Testne# živali# so# bile# miši# samice# in# samci# SF1;KO# (oznake# na# slikah# KO# F# in# KO# M)# ter# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 99# brez(gena(SF;1# samice# in# samci# GDX/WT# (oznake# na# slikah# WT# F# in# WT# M)# v# štirih# različnih# skupinah# tretiranja# (prikaz# skupin# v# Tabeli# 1# in# prikaz# skupnega# števila# živali# v# posamezni#skupini#v#Tabeli#3),#tako#v#testu#ženskega#spolnega#obnašanja#kot#tudi# agresivnega# obnašanja.# Vsem# mišim# divjega# tipa# smo# pred# puberteto# odstranili# spolne#žleze.# 5.2.1 Žensko+spolno+obnašanje+po+dodajanju+testosterona+v+obdobju+ob+rojstvu+ V# testu# ženskega# spolnega# obnašanja# smo# opazovali# spolno# sprejemljivost# (lordozo,#L)#testnih#živali,#ki#smo#jo#ocenjevali#po#lestvici#od#nič#do#pet,#ter#nekatere# značilnosti# stimulusnih# samcev,# kot# so# poskusi# naskoka,# naskoki,# potiski,# ejakulacija.# Vse# živali# smo# testirali# šestkrat,# analizirali# smo# teste# od# drugega# do# šestega#in#jih#označili#kot#test#od#ena#do#pet.# Za#normalno#žensko#spolno#obnašanje#pri#samicah#glodavcev#je#značilno#izražanje# lordoze# oziroma# usločenosti# hrbta,# za# kar# je# potrebna# prisotnost# estrogenov# in# progesterona.# Pravimo,# da# je# takrat# samica# spolno# sprejemljiva# in# ob# pristopu# samca# dovoli# naskok,# usloči# hrbet,# odmakne# rep# in# privzdigne# perineum.# Po# odstranitvi# jajčnikov# miši# in# podgane# potrebujejo# večkratno# izpostavljenost# estrogenom# in# progesteronu,# preden# dosežejo# visoko# stopnjo# spolne# sprejemljivosti#(321,#322,#323),#medtem#ko#samice#nekaterih#drugih#vrst#glodavcev# (morski# prašiček,# hrček)# že# po# eni# sami# aplikaciji# estrogenov# izražajo# žensko# spolno# obnašanje# (324).# Zato# smo# v# naših# poskusih# vsako# miš# testirali# šestkrat,# analizirali# pa# pet# testov.# Prvega# smo# izpustili# iz# analiz,# da# bi# s# prvo# aplikacijo# hormonov#dosegli#boljše#izražanje#ženskega#spolnega#obnašanja.## Po# analizi# naših# rezultatov# se# je# pokazala# ključna# statistično# značilna# razlika# v# količniku# lordoze# (LQ),# ki# je# najvišji# pri# samicah# OVX/WT# (WT# F)# skupine,# ki# ni# prejemala#TP#(označena#kot#kontrola,#K;K)#in#je#značilno#višji#kot#pri#vseh#ostalih# skupinah#miši#(Slika#7).#Ta#skupina#samic,#WT#F#K,#naj#bi#predstavljala#normalno# izraženo#žensko#spolno#obnašanje,#feminizirano#obliko#obnašanja,#in#to#se#je#tudi# potrdilo.# Če# jo# primerjamo# z# ostalimi# skupinami# miši# znotraj# skupine,# ki# ni# prejemala# TP,# vidimo,# da# imajo# vse# tri# skupine,# tako# samice# SF;1# KO# kot# oba# genotipa#samcev#(SF;1#KO#M#in#CAS/WT),#značilno#nižji#LQ#v#primerjavi#s#samicami# OVX/WT.# Do# podobne# ugotovitve# smo# prišli# v# pred# kratkim# objavljeni# raziskavi,# kjer#smo#proučevali#žensko#spolno#obnašanje#pri#miših#brez (SF;1( in#ugotovili,#da#so# # 100# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# samice# OVX/WT# imele# najvišji# LQ# v# primerjavi# z# ostalimi# genotipi.# Ugotovili# smo# tudi# razliko# v# LQ# med# spoloma# tako# med# mišmi# GDX/WT# kot# tudi# med# SF;1# KO# (325),# kar# pa# v# naši# raziskavi# za# SF;1# KO# miši# nismo# ugotovili# niti# v# kontrolni,# netretirani#skupini.#Miši#v#obeh#raziskavah#so#bile#podvržene#enakim#protokolom,# zato# vemo,# kaj# bi# lahko# bil# vzrok# teh# odstopanj.# Razlika# je# bila# samo# v# izvajalcih# oziroma#opazovalcih#poskusov.# Ena#izmed#razlik#med#samicami#OVX/WT#in#SF;1#KO#v#naših#poskusih,#ki#bi#lahko# vplivala#na#to,#da#samice#SF;1#KO#signifikantno#slabše#izražajo#lordozo,#je#v#tem,#da# imajo# samice# OVX/WT# do# starosti# 25# dni# prisotne# jajčnike,# kar# pa# je# v# obdobju# embrionalnega# razvoja# in# do# pubertete.# Znano# je,# da# jajčniki# že# v# obdobju# pred# puberteto#(med#petim#in#sedmi#dnevom#po#rojstvu)#in#v#času#adolescence#pri#miših# izločajo#progesteron#in#androstenedion,#glede#na#aktivnost#encima#citokrom#P450# aromataza# v# jajčnikih# pa# domnevajo,# da# jajčniki# izločajo# tudi# estrogene# (326).# Menijo,# da# estradiol# preko# različnih# mehanizmov# pri# samcih,# po# tem# ko# je# aromatiziran# metabolit# testosterona,# povzroči# maskulinizacijo# in# defeminizacijo,# pri# samicah# pa# v# nekoliko# kasnejšem# obdobju# po# rojstvu# (a# pred# puberteto)# sodeluje# pri# feminizaciji# (327)# možganov# in# posledično# tudi# obnašanja.# Pomen# prisotnosti# estradiola# pred# puberteto# in# v# adolescentnem# obdobju# potrjuje# raziskava#na#miših,#ki#so#brez#gena#za#encim#aromatazo#(ArKO),#kjer#so#ugotovili,# da#samice#ArKO#slabše#izražajo#lordozo,#kljub#dodajanju#estradiola#in#progesterona# v# odraslem# življenju,# kot# samice# divjega# tipa# (221).# V# kasnejši# raziskavi# so# prav# tako#na#miših#ArKO#to#potrdili#tako,#da#so#samicam#dodajali#estrogene#med#16.#in# 26.# dnevom# po# rojstvu,# s# čimer# so# dosegli# boljše# izražanje# lordoze# v# odraslem# obdobju# (primerljivo# s# samicami# divjega# tipa),# medtem# ko# se# po# dodajanju# estrogenov# med# 6.# in# 16.# dnem# po# rojstvu# izražanje# lordoze# ni# izboljšalo# (328).# Prisotnost# jajčnikov# do# 25.# dneva# starosti# bi# tako# lahko# razložila# razliko# med# samicami#SF;1#KO#in#WT#v#izražanju#lordoze,#ki#smo#jo#ugotovili#v#naši#raziskavi.# # Pri# samcih# glodavcev# je# znano,# da# maskuliniziran# stranski# pretin# (LS),# medialno# predoptično#področje#(MPOA)#in#dorzalno#jedro#rafe#( angl.#dorsal#raphe#nucleus,# DR)# zavirajo# izražanje# lordoze# in# hkrati# uravnavajo# moško# spolno# obnašanje,# agresivno#in#anksiozno#obnašanje#(329,#330,#331,#332,#333).#Pri#samcih#SF;1#KO,#ki# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 101# brez(gena(SF;1# niso# prejemali# testosteron# propionata# in# so# bili# kljub# temu# v# testu# ženskega# spolnega#obnašanja#v#obnašanju#bolj#podobni#samcem#CAS/WT,#pa#je#možno,#da#je# to#posledica#spremembe#v#strukturi#VMH#ali#pa#neposrednega#delovanja#genov#na# spolnih# kromosomih# v# možganih.# O# tem# poroča# več# študij# (povzete# v:# (334,# 335,# 336))# in# v# neki# meri# tudi# naš# prvi# poskus# v# ugotavljanju# izražanja# genov# v# vmesnem#delu#možganov,#kjer#smo#ugotovili,#da#se#geni,#vezani#na#kromosom#Y,#pri# samcih#SF;1#KO#izražajo#podobno#kot#pri#samcih#CAS/WT#in#bi#na#ta#način#lahko# pripomogli#k#maskulinizaciji#in#defeminizaciji#možganov#pri#njih.# # Za# slabšo# spolno# sprejemljivost# pri# miših# SF;1# KO# obeh# spolov# je# verjetno# odgovorna# tudi# spremenjena# struktura# VMH,# saj# je# VMH# eden# izmed# ključnih# urejevalcev#izražanja#lordoze#(239).#V#predhodni#raziskavi#na#miših#SF;1#KO#smo# ugotovili#tudi,#da#imajo#miši#SF;1#KO#v#področju#VMH#manj#imunoreaktivnih#celic,# ki#izražajo#progesteronski#receptor#(PR)#kot#miši#GDX/WT#(325).#O#spremenjenem# položaju# nekaterih# celic# in# živčnih# vlaken# v# področju# VMH# pri# miših# SF;1# KO# je# poročalo#že#več#raziskav#(337,#338,#339,#197).#V#dveh#raziskavah#so#ugotovili#tudi# razlike#pri#estrogenskem#receptorju#alfa#(ERα)#(339,#197),#za#katerega#menijo,#da# je#potreben#tudi#za#izražanje#progesteronskega#receptorja.#Z#okvaro#ali#s#popolnim# utišanjem# gena# za# ERα# so# ugotovili,# da# ima# ERα# pomembno# vlogo# pri# ženskem# spolnem# obnašanju,# saj# so# živali# z# utišanim# ERα# slabše# izražale# značilno# žensko# spolno# obnašanje# kot# pa# živali# divjega# tipa# (324,# 225),# medtem# ko# pri# miših# z# okvarjenim#genom#za#ERβ ( takšnih#sprememb#v#ženskem#spolnem#obnašanju#niso# potrdili#(230).## Naši#rezultati#pri#skupinah,#ki#so#prejemale#testosteron#propionat#(TP)#v#različnih# obdobjih,# pred,# po# ter# pred# in# po# rojstvu,# kažejo,# da# razlike# v# LQ# med# samicami# OVX/WT# in# ostalimi# genotipi# izginejo,# kar# kaže# na# defeminizacijo# pri# samicah# OVX/WT.# Med# ostalimi# genotipi# pa# vpliva# tretiranja# nismo# zaznali.# Pri# analizi# LQ# pri#samicah#OVX/WT#(Slika#9)#smo#ugotovili,#da#je#LQ#v#drugem,#tretjem#in#četrtem# testu# značilno# višji# pri# samicah,# ki# niso# prejemale# TP,# kot# pri# vseh# treh# ostalih# tretiranih#skupinah.#V#zadnjem#testu#pa#je#razlika#prisotna#samo#še#med#samicami# OVX/WT,#ki#niso#prejemale#TP#(K;K),#in#tistimi,#ki#so#ga#prejemale#samo#po#rojstvu# (TP;PN).#Menimo,#da#te#razlike#v#LQ#kažejo#na#defeminizacijo#pri#samicah#OVX/WT,# # 102# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# ki#smo#jo#opazili#po#dodajanju#TP#pred#rojstvom#(TP;E)#ter#pred#in#po#rojstvu#(TP; E&PN)#pri#proučevanju#ženskega#spolnega#obnašanja.# Pri#analizi#ostalih#parametrov,#tako#v#številu#naskokov#in#poskusov#naskokov#(Slika# 10#in#11)#kot#tudi#v#latencah#(rezultati#niso#prikazani),#nismo#ugotovili#razlik#med# testnimi#skupinami,#kar#kaže#na#to,#da#so#bile#testne#živali#po#dodajanju#estrogenov# in#progesterona#približno#enako#privlačne#za#izkušene#samce#ne#glede#na#genetski# spol.# Da# bi# to# natančneje# potrdili,# bi# morali# stimulusne# samce# preizkusiti# še# v# vohalnem# testu,# kjer# bi# jih# izpostavili# vonju# različno# tretiranih# živali# po# posameznih#genotipih.# Naši#rezultati#pri#proučevanju#ženskega#spolnega#obnašanja#tako#kažejo,#da#imajo# spolni#hormoni#pomembno#vlogo#pri#defeminizaciji#ženskega#spolnega#obnašanja,# saj#z#dodajanjem#estrogenov#in#progesterona#v#odraslem#obdobju#niti#pri#samicah# divjega# tipa,# ki# so# prejemale# TP# v# različnih# obdobjih# ob# rojstvu,# nismo# dosegli# takšnega#nivoja#izražanja#lordoze#kot#pri#samicah#OVX/WT,#ki#niso#prejemale#TP#v# nobenem#obdobju.#To#kaže,#kako#pomemben#je#organizacijski#(nepovraten)#učinek# testosterona# v# tem# obdobju# in# da# je# ta# organizacijski# učinek# trajen# ter# ga# aktivacijski#učinek#estrogenov#v#odraslem#obdobju#ne#more#spremeniti.# 5.2.2 Agresivno+obnašanje+po+dodajanju+testosterona+v+obdobju+ob+rojstvu+ Po# končanih# testiranjih# ženskega# spolnega# obnašanja# smo# živalim# vstavili# podkožne# vsadke# testosteron# propinata# (TP),# saj# je# dodobra# znano,# da# so# spolni# hormoni,# predvsem# testosteron,# potrebni# za# nastanek/pojav# agresivnega# obnašanja.#O#tem#so#poročali#že#pred#več#kot#50;imi#leti#(14).#V#našem#poskusu#smo# uporabili# t.i.# test# rezident# –# vsiljivec# za# proučevanje# agresivnosti# med# dvema# samcema#( angl.#intermale#aggression),#ki#je#spolno#različno#obnašanje,#značilno#za# samce.# Zaradi# izolacije# testne# miši# razvijejo# teritorialno# agresivno# obnašanje.# Testna#miš#je#bila#rezident,#domača#v#kletki#(izolirana#v#akvarijski#stekleni#kletki),# za# vsiljivca# smo# uporabili# odraslega# samca# linije# A/J.# Vsaka# miš# je# bila# testirana# trikrat#v#treh#zaporednih#dneh.# Po#analizi#podatkov#so#se#največje#razlike#pokazale#v#prvem#testu#(Slika#12),#kjer#so# živali# GDX/WT# večkrat# napadle# in# ugriznile# kot# miši# SF;1# KO,# vendar# samo# v# primerjavi# skupin,# ki# ob# rojstvu# niso# prejemale# eksogenega# TP# (K;K).# Pri# ostalih# skupinah,#ki#so#bile#izpostavljene#TP#z#injiciranjem#pred#(TP;E),#po#ter#pred#in#po# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 103# brez(gena(SF;1# rojstvu#(TP;E&PN),#se#ta#razlika#ni#pokazala.#S#ponovitvijo#testov#je#razlika#izginila# tudi# pri# netretirani# skupini# (Slika# 13),# kar# lahko# pripišemo# izkušnji# iz# prejšnjega# testa# oziroma# lahko# delno# pripišemo# aktivacijskemu# učinku# testosterona# iz# podkožnih#vsadkov.#Lahko#rečemo,#da#se#je#iz#testa#v#test#agresivnost#povečevala# (vsi#rezultati#niso#prikazani).# Pri# primerjavi# časa# od# začetka# poskusa# do# pojava# prvega# agresivnega# dogodka# (latenca)# so# se# pokazale# razlike# pri# samicah# OVX/WT# ter# pri# miših# SF;1# KO# (samicah#in#samcih),#ki#niso#prejemale#TP#(K;K)#in#tistimi,#ki#so#ga#prejemale#pred# rojstvom#(TP;E),#v#primerjavi#s#tistimi,#ki#so#ga#prejemale#po#rojstvu#ter#pred#in#po# rojstvu#(Slika#14).#Pri#samcih#CAS/WT#ta#razlika#ni#prisotna,#kar#potrjuje#že#znano# dejstvo,# da# ima# endogeni# testosteron# (oziroma# njegov# metabolit# estradiol)# med# razvojem# pri# samcih# ključno# vlogo# pri# maskulinizaciji# možganov# in# s# tem# tudi# obnašanja#v#odraslem#obdobju,#t.i.#organizacijska#vloga#testosterona#(88,#90,#340).# Pri# samicah# OVX/WT# in# miših# SF;1# KO# (samicah# in# samcih)# pa# smo# to# vlogo# testosterona#potrdili#z#dodajanjem#TP#po#rojstvu#ter#pred#in#po#rojstvu.#V#primeru,# ko#so#prejemale#TP#samo#pred#rojstvom,#so#bile#latence#podobne#kot#pri#tistih,#ki#so# bile#brez#TP.#Rezultati#kažejo,#da#je#za#pojav#značilnega#agresivnega#obnašanja#med# samcema#potrebna#prisotnost#testosterona#že#v#obdobju#ob#rojstvu,#da#pa#je#bolj# pomembno#obdobje#po#rojstvu#kot#pred#njim.#Druga#razlaga,#zakaj#je#bilo#agresivno# obnašanje#manj#izraženo#pri#miših,#ki#so#prejemale#TP#samo#pred#rojstvom,#pa#je# morda#tudi#v#času#tretiranja,#ker#smo#TP#injicirali#na#E13,5#in#E16,5,#kar#je#nekoliko# pred#najvišjim#izločanjem#endogenega#testosterona#na#dan#E17,5#(86,#88).#Ker#smo# testosteron# injicirali# pod# kožo# in# v# olju,# zaradi# česar# bi# se# moral# resorbirati# počasneje,# menimo,# da# je# ta# razlaga# manj# verjetna# in# da# je# bolj# verjetno,# da# je# obdobje# po# rojstvu# bolj# pomembno# za# razvoj# agresivnega# obnašanja.# Ti# naši# izsledki#se#ujemajo#z#nekaterimi#predhodnimi#raziskavami,#ki#so#pokazale,#da#lahko# z#dodajanjem#testosterona#tik#po#rojstvu#pride#tudi#do#agresivnega#obnašanja#pri# samicah#v#odraslem#obdobju#(341,#342).#Samci#miši#brez#gena#za#encim#aromatazo# (ArKO),# ki# imajo# zmanjšano# agresivno# obnašanje,# pa# so# se# v# odraslem# obdobju# obnašali# značilno# agresivno,# če# so# dobivali# eksogene# estrogene# kmalu# po# rojstvu# (343),#in#sicer#na#dan#rojstva#in#potem#še#vsak#četrti#dan#do#odstavitve#ter#3.#dan#po# rojstvu# in# potem# vsak# četrti# dan# do# odstavitve.# Ko# so# z# dodajanjem# estrogenov# # 104# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# začeli#šele#sedmi#dan#po#rojstvu#in#nadaljevali#vsak#četrti#dan,#pa#živali#v#odraslem# obdobju#niso#izražale#agresivnega#obnašanja#(343).# # Naši# rezultati# tako# kažejo,# da# je# za# maskulinizacijo# agresivnega# obnašanja# dovolj# kombinacija# prisotnosti# testosterona# v# zgodnjem# obdobju# po# rojstvu# (organizacijski#učinek)#in#kot#aktivator#v#odraslem#obdobju,#saj#so#bile#samice#WT# in#miši#SF;1#KO#po#dodajanju#TP#primerljivo#agresivne#kot#samci#WT.# 5.3 VPLIV! TESTOSTERONA! V! OBDOBJU! OB! ROJSTVU! NA! IZRAŽANJE! KALBINDINA! IN! ARGININ! VAZOPRESINA! V! VMESNIH! MOŽGANIH! PRI! MIŠIH!BREZ!GENA! SF#1!IN!MIŠIH!DIVJEGA!TIPA! Z#metodo#imunohistokemičnega#barvanja#smo#proučevali#izraženost#beljakovine#za# vezavo# Ca2+# (Kalbindin# D;28K,# kalbindin,# Calb)# in# arginin# vazopresina# (AVP)# v# vmesnih# možganih# pri# miših# SF;1# KO# in# GDX/WT.# Po# zaključku# testov# obnašanja# smo#za#raziskavo#uporabili#živali#iz#vseh#štirih#različno#tretiranih#skupin.# Vpliv# dodajanja# testosterona# v# obdobju# ob# rojstvu# na# maskulinizacijo# in# defeminizacijo#možganov#ter#na#žensko#spolno#in#agresivno#obnašanje#v#odraslem# obdobju# smo# ugotavljali# s# proučevanjem# izražanje# kalbindina# (Calb)# in# arginin# vazopresina#(AVP)#v#vmesnem#delu#možganov.#Osredotočili#smo#se#na#predele#od# predoptičnega#področja#do#konca#hipotalamusa,#saj#se#v#tem#delu#nahajajo#glavni# centri# za# urejanje# endokrinih# procesov# pri# sesalcih.# Do# zdaj# je# bilo# v# tem# delu# možganov# opisanih# največ# morfoloških# razlik# med# spoloma# in# ta# področja# vsebujejo# največ# nevronov,# ki# izražajo# receptorje# za# steroidne# hormone,# preko# katerih# le;ti# vplivajo# kot# najpomembnejši# dejavnik# pri# razvoju# in# delovanju# vmesnih#možganov#(344,#345,#346).#Za#izraženost#beljakovine#Calb#v#nevronih#in# AVP#v#stranskem#pretinu#(LS)#je#glede#na#predhodne#raziskave#potrebna#prisotnost# testosterona#(4),#zato#so#bile#vse#živali,#pri#katerih#smo#ugotavljali#izraženost#teh# beljakovin,#pred#žrtvovanjem#na#še#aktivnih#testosteronskih#vsadkih.# 5.3.1 Izraženost+beljakovine+kalbindin+(Calb)+v+vmesnih+možganih+ Prisotnost#imunoreaktivnih#celic#za#beljakovino#kalbindin#(Calb)#smo#primerjali#na# rezinah# 0,10# mm# kavdalno# od# bregme# (Bregma# ;0,10)# (291),# kjer# se# nahaja# medialno#predoptično#področje#(MPOA).# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 105# brez(gena(SF;1# Sprva# se# kalbindin# ni# uporabljal# za# dokazovanje# spolno# različnih# področij# v# možganih,#vendar#je#kasneje#kar#nekaj#študij#uporabilo#označevanje#s#kalbindinom# za# proučevanje# spolno# dimorfnih# področij# v# možganih# pri# podganah# in# s# tem# potrdilo#prisotnost#spolno#dimorfnega#jedra#v#predoptičnem#področju#(SDN;POA)# (347,#348,#349,#350,#351).#Temu#so#sledile#tudi#raziskave#pri#miših,#ki#so#z#uporabo# označevanja#s#kalbindinom#ugotovile,#da#imajo#samci#v#področju#medialnega#POA# (MPOA)#večje#število#Calb#imuonoreaktivnih#celic#kot#samice,#kar#kaže#na#podobno# spolno#dimorfno#jedro#kot#pri#podganah#(352,#290,#171)#s#pomembno#razliko,#da# lahko#pri#podganah#(in#večini#drugih#živalskih#vrst)#to#jedro#vidimo#že#z#navadnim# histološkim# barvanjem# (npr.# po# Nisslu),# pri# miših# pa# le# z# obarvanjem# celic,# ki# vsebujejo#kalbindin.# # V#našem#poskusu#smo#primerjali#izražanje#kalbindina#(Calb)#med#samci#CAS/WT,# samicami#OVX/WT,#samci#in#samicam#SF;1#KO#v#vseh#štirih#skupinah,#ki#smo#jim# dodajali#testosteron#propionat#pred#rojstvom#(TP;E),#po#rojstvu#(TP;PN),#pred#in# po# rojstvu# (TP;E&PN),# ali# pa# jim# testosteron# propionata# nismo# dodajali# (K;K)# (Slika# 15# in# 16).# Pričakovano# smo# pri# skupini,# ki# ni# prejemala# testosteron# propionata,# ugotovili# prisotnost# SDN;POA# samo# v# skupini# samcev# CAS/WT,# ki# so# bili# normalno# izpostavljeni# testosteronu# med# razvojem,# do# pubertete,# zaradi# prisotnosti#mod,#ne#pa#pri#ostalih#treh#skupinah#(samice#OVX/WT,#samci#in#samice# SF;1# KO).# Rezultati# kažejo,# da# je# pri# samcih# CAS/WT# v# vseh# štirih# skupinah# (ne# glede#na#tretiranje)#izraženo#SDN;POA#(obkroženo#pri#samcu#WT#brez#dodatnega# TP# –# Slika# 15).# Če# to# področje# primerjamo# z# ostalimi# genotipi# in# različno# tretiranimi#skupinami,#ugotovimo,#da#se#podobno#področje#pojavi#pri#samicah#WT# ter# pri# obeh# spolih# SF;1# KO# miši# samo# v# primeru,# ko# smo# jih# po# rojstvu# in# v# kombinaciji# pred# in# po# rojstvu# tretirali# s# TP.# V# primeru,# ko# so# bile# miši# brez# dodanega#TP#ali#ko#so#ga#prejemale#samo#pred#rojstvom,#se#pri#samicah#OVX/WT# ter#pri#samcih#in#samicah#SF;1#KO#to#jedro#ne#oblikuje.#Naši#rezultati#tako#kažejo,# da# je# za# nastanek# SDN;POA# pri# miših# pomembna# prisotnost# testosterona# v# zgodnjem# postnatalnem# obdobju,# ne# pa# samo# pred# rojstvom,# kar# se# ujema# z# rezultati# Orikase# in# Sakume# (353),# ki# sta# z# izražanjem# kalbindina# dokazala# pomembnost# prisotnosti# testosterona# po# rojstvu# pri# samicah# WT# dveh# različnih# sevov#miši#(C57BL/6J#in#ddN).#O#vlogi#SDN;POA#ne#vemo#še#zelo#veliko.#Raziskave# # 106# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# na# podganah# so# pokazale,# da# samci# s# poškodovanim# SDN;POA# slabše# izražajo# kopulatorno# obnašanje,# ki# je# značilnost# moškega# spolnega# obnašanja# (354,# 139).# Ob#tretiranju#z#zaviralci#aromataze#pa#je#SDN;POA#pri#podganjih#samcih#izginilo#in# tudi#moško#spolno#obnašanje#je#bilo#spremenjeno#(355).#Naši#rezultati#so#pokazali# tudi,#da#je#samo#prisotnost#testosterona#v#zgodnjem#obdobju#po#rojstvu#dovolj#za# normalno#oblikovanje#jedra#SDN;POA,#ter#da#na#spolne#razlike#v#oblikovanju#jedra# ne# vplivajo# spolni# kromosomi,# saj# se# je# jedro# ob# izpostavljenosti# testosteronu# po# rojstvu#podobno#izoblikovalo#pri#vseh#štirih#genotipih#miši.# 5.3.2 Izraženost+beljakovine+arginin+vazopresin+(AVP)+v+vmesnih+možganih+ Razlika# v# številu# vlaken,# ki# izražajo# AVP# v# stranskem# pretinu# (LS),# je# ena# najbolj# opisanih# in# proučevanih# spolnih# razlik# v# možganih# sesalcev# (157).# Večje# število# vlaken,# ki# izražajo# AVP,# najdemo# pri# samcih,# vendar# je# ta# izraženost# odvisna# od# aktivacijskega#učinka#testosterona.#Telesa#nevronov,#ki#oživčujejo#LS,#se#nahajajo#v# BNST# in# v# amigdali# (157).# Pri# podganah# so# ugotovili,# da# je# število# nevronov,# ki# izražajo# AVP# v# BNST,# spolno# dimorfno# in# da# je# za# maskulinizacijo# tega# sistema# odgovoren#testosteron#v#zgodnjem#obdobju#po#rojstvu#(356).# Za# primerjanje# izraženosti# AVP# pri# naših# živalih# smo# izbrali# rezine# 0,14# mm# rostralno# (291)# od# bregme# (Bregma# 0,14),# kjer# je# LS# (Slika# 17# in# 18).# Primerjali# smo# imunoreaktivna# vlakna,# ki# izražajo# AVP,# med# samci# CAS/WT,# samci# in# samicam#SF;1#KO#ter#samicami#OVX/WT#v#vseh#štirih#skupinah,#in#sicer#tisti,#ki#ni# prejemala#eksogenega#TP#(K;K),#tisti,#ki#ga#je#prejemala#samo#pred#rojstvom#(TP; E),#tisti,#ki#ga#je#prejemala#po#rojstvu#(TP;PN),#ter#tisti,#ki#je#TP#prejela#tako#pred# kot#tudi#po#rojstvu#(TP;E&PN).# # Večja# izraženost# AVP# v# LS# pri# samcih# je# delno# odvisna# tudi# od# prisotnosti# samih# spolnih# kromosomov# (100),# kar# so# dokazali# z# uporabo# t.i.# modela# “four# core# genotype”,#kjer#so#imele#samice#XY Sry(–#(prisotna#oba#različna#spolna#kromosoma,# kromosom#X#in#Y,#vendar#brez#gena# Sry)#višjo#izraženost#AVP#kot#samice#XX.# Predhodna#študija,#kjer#so#ugotavljali#razlike#pri#izraženosti#AVP#pri#miših#SF;1#KO# in#GDX/WT,#ni#pokazala#razlik#med#samci#in#samicami#SF;1#KO,#saj#po#dodajanju# testosterona#v#odraslem#obdobju#ni#bilo#opaznih#razlik#med#spoloma#tako#pri#miših# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 107# brez(gena(SF;1# GDX/WT# kot# pri# miših# SF;1# KO# (357).# To# se# lahko# razloži# s# tem,# da# miši# niso# dobivale#dodatnega#testosterona#v#obdobju#ob#rojstvu,#tudi#pred#žrtvovanjem#pa#so# bile#v#tej#raziskavi#izpostavljene#testosteronu#krajši#čas#kot#pa#v#naši#raziskavi.# Naši# rezultati# potrjujejo,# da# je# za# izražanje# AVP# v# LS# nujno# potrebna# prisotnost# testosterona.#Pri#samcih#CAS/WT#je#izraženost#AVP#podobna#v#vseh#skupinah#ne# glede#na#dodajanje#TP,#medtem#ko#slike#kažejo,#da#je#pri#samicah#OVX/WT#več#AVP# imunopozitivnih# vlaken# v# primeru,# ko# so# prejemale# TP# po# rojstvu# ter# pred# in# po# rojstvu.#Podoben#vzorec#se#kaže#tudi#pri#živalih#SF;1#KO,#s#tem#da#so#pri#samcih#in# samicah#SF;1#KO#AVP#imunopozitivna#vlakna#prisotna#tudi#v#skupinah,#ki#niso#bile# izpostavljene# eksogenemu# TP# in# ko# so# ga# prejemale# samo# pred# rojstvom.# S# primerjavo# vseh# štirih# genotipov,# ki# so# prejemali# TP# po# rojstvu# ter# pred# in# po# rojstvu,# med# skupinami# ni# vidnih# večjih# razlik.# Podobno# kot# pri# izražanju# kalbindina#rezultati#kažejo,#da#je#pomembnejše#delovanje#testosterona#v#zgodnjem# obdobju#po#rojstvu#kot#pred#rojstvom.# # Naj# na# tem# mestu# povzamem,# kaj# kažejo# rezultati# obeh# naših# raziskav# predstavljenih# v# tej# disertaciji.# V# prvem# delu# smo# dokazali,# da# se# geni,# vezani# na# kromosom# Y# ( Uty,( Eif2s3y,( Ddx3y( in ( Kdm5d),# izražajo# neodvisno# od# prisotnosti# spolnih#hormonov,#saj#so#tudi#pri#miših#SF;1#KO#izraženi#različno#med#spoloma,#kar# pa#je#isto#kot#pri#miših#WT.#Za#gene,#vezane#na#kromosom#X,#smo#pri#odraslih#miših# potrdili,#da#je# Xist#tisti,#ki#je#različno#izražen#med#spoloma,#vendar#brez#razlik#med# samicami#SF;1#KO#in#WT.# Pri#proučevanju#ženskega#spolnega#in#agresivnega#obnašanja#po#različnih#obdobjih# dodajanja# testosteron# propionata# (TP)# lahko# na# podlagi# rezultatov# opazovanj# zaključimo,# da# smo# s# tretiranji# s# TP# dosegli# defeminizacijo# in# maskulinizacijo# v# obnašanju,#ki#pa#je#bila#bolj#izrazita#ob#dodajanju#testosterona#po#rojstvu,#kar#kaže# na# to,# da# je# zgodnje# obdobje# po# rojstvu# bolj# pomembno# za# pravilen# razvoj# zmožnosti# izražanja# teh# obnašanj,# kot# obdobje# pred# rojstvom.# Podobno# vlogo# testosterona#po#rojstvu#kaže#tudi#oblika#jedra#SDN;POA,#ki#ga#oblikujejo#celice,#ki# izražajo#kalbindin#(Calb)#in#izražanje#arginin#vazopresina#(AVP)#v#vmesnem#delu# možganov#pri#SF;1#KO#in#WT#miših,#saj#smo#le#v#primeru#dodajanja#testosterona#po# rojstvu# dosegli# maskulinizacijo# možganov.# V# primeru# izražanja# kalbindina# smo# tako# pri# miših,# ki# so# prejemale# testosteron# po# rojstvu# ugotovili# v# medialnem# # 108# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# predoptičnem# področju# (MPOA)# jedro,# ki# je# pri# podganah# označeno# kot# spolno# dimorfno#(SDN),#pri#miših,#ki#so#testosteron#prejemale#samo#pred#rojstvom,#pa#do# oblikovanja#tega#jedra#ni#prišlo.#Pričakovano#pa#je#bilo#to#jedro#prisotno#pri#samcih# CAS/WT# v# vseh# skupinah,# ne# glede# na# tretiranje# s# testosteronom.# Tako# lahko# rečemo,#da#je#testosteron#v#perinatalnem#obdobju#odgovoren#za#organizacijo#tega# področja,# ki# se# oblikuje# kot# posledica# delovanja# testosterona# oziroma# njegovega# aromatiziranega# metabolita# estradiola# v# perinatalnem# obdobju.# Za# izražanje# imunoreaktivnih# vlaken,# ki# izražajo# AVP# v# stranskem# pretinu,# bi# lahko# rekli,# da# velja# podobno,# vendar# so# vlakna# prisotna# v# vseh# skupinah# in# genotipih# zaradi# aktivacijskega#učinka#testosterona#v#odraslem#obdobju.# # # # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 109# brez(gena(SF;1# 6 Zaključki! Naši#rezultati#kažejo,#da#se#nekateri#geni,#ki#so#vezani#na#kromosom#Y#( Uty,(Eif2s3y,( Ddx3y( in ( Kdm5d)# in# na# kromosom# X# ( Xist),# izražajo# v# možganih# neodvisno# od# prisotnosti#spolnih#hormonov,#kar#potrjuje#našo#prvo#hipotezo.#Omenjeni#geni#so# različno#izraženi#med#spoloma#tako#pri#miših#SF;1#KO#kot#pri#miših#GDX/WT.#S#tem# poskusom#smo#potrdili#vlogo#genov#pri#spolni#diferenciaciji#v#možganih.# # Z# dodajanjem# testosteron# propionata# (TP)# v# obdobju# ob# rojstvu# smo# dosegli# defeminizacijo# in# maskulinizacijo# v# obnašanju,# kar# potrjujejo# rezultati# iz# proučevanja# ženskega# spolnega# in# agresivnega# obnašanja.# Rezultati# kažejo,# da# je# obdobje#tik#po#rojstvu#pomembnejše#kot#obdobje#pred#rojstvom.# # Podobno# kot# pri# proučevanju# obnašanja# smo# tudi# pri# izražanju# beljakovine# kalbindin#(Calb)#ugotovili,#da#je#za#maskulinizacijo#mišjih#možganov#pomembnejše# obdobje#tik#po#rojstvu,#saj#se#je#v#medialnem#preoptičnem#področju#t.i.#jedro#SDN; POA#izrazilo#pri#samicah#OVX/WT#in#miših#SF1;KO#samo#po#dodajanju#testosterona# po# rojstvu# ali# v# obeh# obdobjih.# Pri# samcih# OVX/WT# pa# je# prisotno# ne# glede# na# dodajanje#eksogenega#TP.#Do#podobnih#ugotovitev#smo#prišli#tudi#pri#proučevanju# izražanja#beljakovine#arginin#vazopresin#(AVP),#s#to#razliko,#da#so#imunopozitivna# vlakna# prisotna# pri# vseh# genotipih,# saj# je# to# posledica# aktivacijskega# učinka# testosterona.# # ! # 110# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 7 Povzetek! Pri#sesalcih#poznamo#fenotipsko#dva#različna#spola,#in#sicer#ženskega#in#moškega,# ki#sta#genetsko#določena#že#ob#združitvi#spolnih#celic#ob#prisotnosti#kromosomov#X# in#Y.#Pri#moških#osebkih#(XY),#kjer#je#prisoten#kromosom#Y#in#s#tem#gen# Sry, #pride# do#razvoja#mod,#ki#že#v#času#fetalnega#razvoja#izločajo#testosteron#in#AMH,#ki#sta#že# v# zgodnjem# razvoju# odgovorna# za# razvoje# moškega# fenotipa.# Testosteron# se# v# možganih# glodavcev# aromatizira# v# estradiol.# Estradiol# vzpodbudi# razvoj# nevroendokrinega#sistema#in#posledično#tudi#obnašanja#značilnega#za#moški#spol# (pravimo# da# ju# maskulinizira)# in# zavre# razvoj# nevroendokrinega# sistema# in# obnašanja,# ki# sta# značilna# za# ženski# spol,# tj.# ju# defeminizira.# Pri# XX,# torej# ženskih# osebkih,# Sry# ni# prisoten# in# gre# razvoj# spolnih# organov# v# ženske# spolne# organe:# v# jajčnike,#jajcevode#in#maternico#iz#Müllerjevih#vodov.#Jajčniki#v#fetalnem#obdobju# ne#izločajo#spolnih#hormonov.#Zato#je#dolgo#časa#veljalo#prepričanje,#da#se#ženski# fenotip# možganov# razvije# brez# vpliva# spolnih# hormonov,# kar# pa# ne# velja# popolnoma,# saj# je# kar# nekaj# raziskav# dokazalo,# da# jajčniki# kmalu# po# rojstvu,# v# obdobju#pred#puberteto,#izločajo#estrogene.# Pri# sekundarni# spolni# diferenciaciji# sodelujejo# različni# genetski# mehanizmi,# ki# delujejo#tudi#neodvisno#od#hormonov,#vendar#je#o#teh#vplivih#veliko#manj#znanega,# saj#je#zelo#težko#izključiti#vpliv#spolnih#žlez#med#razvojem.# # V# naših# raziskavah# smo# uporabili# miši# brez# gena# za# prepisovalni# dejavnik# steroidogeni# faktor# 1# (SF;1# KO),# ki# so# zaradi# odsotnosti# SF;1# brez# spolnih# in# nadledvičnih# žlez# že# od# zgodnjega# embrionalnega# razvoja# in# posledično# niso# izpostavljeni# spolnim# hormonom.# Miši# SF;1# KO# fenotipsko,# ne# glede# na# genetski# spol,# izgledajo# kot# samice.# Zaradi# tako# zgodnjega# propada# zametkov# spolnih# žlez# možgani#miši#SF;1#KO#niso#nikoli#izpostavljeni#lastnim#spolnim#hormonom#in#tako# predstavljajo#dober#model#za#proučevanje#ločenega#vpliva#hormonov#in#genov#tako# na#strukturo#kot#tudi#na#delovanje#možganov,#posameznih#jeder#v#možganih#ter#na# obnašanje.# Poleg# vpliva# na# razvoj# spolnih# in# nadledvičnih# žlez# pa# ima# SF;1# pomembno#vlogo#tudi#pri#razvoju#ventromedialnega#jedra#v#hipotalamusu#(VMH),# zato#imajo#miši#SF;1#KO#spremenjeno#strukturo#tega#jedra#in#predstavljajo#dober# model#tudi#za#proučevanje#vlog#in#delovanja#VMH.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 111# brez(gena(SF;1# # Namen#naših#raziskav#je#bil#ugotoviti#ali#se#geni#v#možganih#izražajo#neodvisno#od# prisotnosti#spolnih#žlez#in#posledično#hormonov,#ki#jih#le;te#izločajo.#In#ali#lahko#z# dodajanjem# eksogenega# testosterona# v# obdobju# pred,# po,# pred# in# po# rojstvu# dosežemo#maskulinizacijo#in#defeminizacijo#možganov#pri#miših#SF;1#KO.## # Rezultati# v# raziskavi# izražanja# genov# z# metodama# na# DNA;mikromrežah# in# qPCR# kažejo,# da# se# nekateri# geni,# ki# so# vezani# na# kromosom# Y# ( Uty,( Eif2s3y,( Ddx3y( in ( Kdm5d)# in# na# kromosom# X# ( Xist),# izražajo# v# možganih# neodvisno# od# prisotnosti# spolnih# steroidnih# hormonov,# ki# jih# izločajo# spolne# žleze.# Ti# geni# so# bili# različno# izraženi#med#spoloma#tako#pri#miših#SF;1#KO#kot#pri#miših#GDX/WT,#niso#pa#bili# različno#izraženi#med#genotipoma#SF;1#KO#in#WT.# # Z#dodajanjem#spolnih#hormonov,#natančneje#testosteron#propionata#(TP),#pred#in# po# rojstvu,# smo# želeli# pri# miših# brez# gena# SF;1# in# pri# samicah# OVX/WT# doseči# v# možganih# fenotip,# ki# bo# podoben# samcem# CAS/WT,# torej# smo# želeli# povzročiti# maskulinizacijo#in#defeminizacijo#pri#obnašanju#in#tudi#v#možganih#teh#miši.#Tako# smo#v#raziskavi#z#dodajanjem#TP#v#obdobju#ob#rojstvu#pri#proučevanju#ženskega# spolnega# obnašanja# ugotovili,# da# samo# samice# divjega# tipa# (OVX/WT)# brez# tretiranja# izražajo# visok# količnik# lordoze# (LQ)# in# da# se# je# le;ta# po# tretiranju# s# TP# značilno# znižal# ne# glede# na# obdobje# tretiranja.# To# kaže# na# vpliv# testosterona# na# defeminizacijo# v# obnašanju# pri# samicah# OVX/WT.# Pri# ostalih# genotipih,# tudi# pri# samicah# SF;1# KO,# je# bil# LQ# statistično# slabše# izražen# kot# pri# samicah# OVX/WT.# Nismo#pa#ugotovili#razlik#med#spoloma#znotraj#miši#SF;1#KO.#Pri#analizi#podatkov# za# agresivno# obnašanje# smo# ugotovili,# da# so# miši# GDX/WT,# ki# niso# prejemale# TP,# bolj#agresivne#(imele#so#večje#skupno#število#ugrizov#in#napadov)#od#miši#SF;1#KO# brez# dodanega# testosterona.# Dodajanje# testosterona# po# rojstvu# je# povečalo# agresivno#obnašanje#tako#pri#samicah#OVX/WT#kot#pri#samcih#in#samicah#SF;1#KO,# kar# kaže,# da# je# obdobje# po# rojstvu# pomembnejše# za# maskulinizacijo# obnašanja# samcev#pod#vplivom#testosterona#kot#obdobje#pred#rojstvom.#Pri#samcih#CAS/WT# nismo#ugotovili#značilnih#razlik#glede#na#tretiranje#s#TP.# Pri# izražanju# beljakovine# kalbindin# (Calb)# v# medialnem# predoptičnem# področju# (MPOA)#smo#ugotovili,#da#so#pri#samcih#CAS/WT#prisotne#celice,#ki#so#oblikovane#v# # 112# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# jedro# podobno# spolno# dimorfnemu# jedru# pri# podganah# (SDN;POA),# ne# glede# na# dodajanje# TP.# Pri# ostalih# genotipih# pa# smo# opazili# oblikovanje# tega# jedra# le# ob# dodajanju#testosterona#po#rojstvu#ter#pred#in#po#rojstvu,#kar#kaže,#podobno#kot#pri# agresivnem#obnašanju,#na#pomembnejšo#vlogo#TP#na#maskulinizacijo#v#zgodnjem# obdobju#po#rojstvu#kot#pred#rojstvom.#Pri#izražanju#beljakovine#AVP#v#stranskem# pretinu# (LS)# pa# smo# ugotovili# prisotnost# imunopozitivnih# vlaken# pri# vseh# genotipih,# saj# je# za# to# izražanje# potreben# aktivacijski# učinek# testosterona# pred# proučevanjem#oziroma#žrtvovanjem#miši.#Kljub#temu#pa#se#kaže,#da#je#pri#samcih# CAS/WT# večja# izraženost# v# primeru# brez# TP# in# pri# tretiranju# pred# rojstvom# v# primerjavi#z#ostalimi#genotipi.# # S# proučevanjem# miši# SF;1# KO# smo# tako# pokazali,# da# se# nekateri# geni# izražajo# v# možganih#ne#glede#na#prisotnost#spolnih#hormonov,#ki#jih#izločajo#spolne#žleze,#ter# da# je# za# maskulinizacijo# in# defeminizacijo# možganov# in# obnašanja# pomembnejše# zgodnje#obdobje#po#rojstvu#kot#pa#obdobje#pred#rojstvom.# # ! # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 113# brez(gena(SF;1# 8 Summary! In# mammals# there# are# two# phenotypically# distinct# sexes,# female# (XX)# and# male# (XY),#which#are#determined#at#the#time#of#fertilisation,#when#two#sex#cells#merge.# In#males#with#the#Y#chromosome,# Sry#gene#from#Y#chromosome#is#responsible#for# undifferentiated# gonads#to#develop#as#testes,#which#start#to#secrete,#testosterone# and#AMH#early#during#development#and#these#two#hormones#are#responsible#for# development# of# male# phenotype.# In# the# brain,# at# least# in# rodents,# testosterone# is# aromatised#into#estradiol.#Estradiol#then#induces#the#neuroendocrine#system#and# consequently#behaviour#to#develop#towards#the#male#phenotype#(masculinisation)# and#inhibits#development#into#the#female#phenotype#(defeminisation).#In#females,# where# Sry# gene# is# not# present,# fetal# genital# ridges# develop# into# female# gonads,# namely# ovaries# and# other# parts# of# the# female# reproductive# system# (oviducts,# uterus# and# upper# part# of# vagina)# develop# from# Müllerian# ducts.# During# fetal# development,# ovaries# do# not# excrete# steroid# hormones.# Until# recently,# it# was# thought# that# female# brain# phenotype# develops# without# the# influence# of# sex# hormones,#but#some#very#recent#studies#suggest#that#low#prepubertal#secretion#of# estrogens#exists.# In# addition# to# hormones,# genes# from# sex# chromosomes# might# differentially# regulate#development#of#male#and#female#cells#also#in#the#brain,#although#the#role# of#sex#chromosomes#in#brain#sexual#differentiation#is#still#largely#not#understood.# # In#our#studies,#mice#without#transcription#factor#steroidogenic#factor#1#(SF;1#KO)# were#used.#Due#to#the#absence#of#SF;1,#these#mice#are#born#without#adrenal#glands# and# gonads,# and# are# consequently# not# exposed# to# endogenous# sex# steroid# hormones#during#development.#Therefore,#regardless#of#the#genetic#sex,#male#and# female# SF;1# KO# mice# appear# phenotypically# females.# SF;1# KO# mice# are# never# exposed#to#endogenous#sex#steroids#due#to#early#regression#of#developing#gonads# and# that# is# why# they# provide# an# excellent# model# for# studying# independent# influence#of#sex#steroid#hormones#and#genes#on#sexual#differentiation#of#the#brain# and# individual# nuclei# of# the# brain,# on# brain# structure# and# function,# and# on# behaviour.# However,# besides# its# role# in# the# development# of# adrenal# glands# and# gonads,# SF;1# has# an# important# role# in# the# development# of# the# ventromedial# # 114# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# nucleus#of#the#hypothalamus#(VMH).#SF;1#KO#mice#have#an#impaired#structure#of# the#VMH#and#are#therefore#also#a#good#model#for#studying#function#of#the#VMH.# # The# purpose# of# our# study# was# to# determine# if# there# are# sex# differences# in# brain# gene#expression#regardless#on#the#presence#of#gonads,#and#if#it#is#possible#to#induce# complete# masculinisation# and# defeminisation# of# the# brain# by# administration# of# exogenous#testosterone#to#the#SF;1#KO#mice#during#prenatal,#postnatal#or#pre;#and# postnatal#development.# # Experiments# using# genomic# DNA# microarrays# and# qPCR# revealed# that# some# Y; linked# genes# ( Uty,( Eif2s3y,( Ddx3y( in ( Kdm5d)# and# one# X;linked# gene# ( Xist)# are# expressed# in# the# adult# brain# in# sex# dependent# manner# independently# of# the# presence# of# gonads,# as# they# are# differentially# expressed# also# between# SF;1# KO# males#and#females,#the#same#as#in#GDX/WT#mice.# # With# administration# of# exogenous# testosterone# propionate# (TP)# before# and# after# birth,#we#wanted#to#induce#masculinisation#and#defeminisation#of#the#brain#similar# to#WT#males#also#in#SF;1#KO#mice#and#OVX/WT#females.#In#tests#of#female#sexual# behaviour,# OVX/WT# females# without# added# TP# expressed# the# highest# lordosis# quotient# (LQ),# which# was# significantly# decreased# in# mice# receiving# neonatal# TP# treatment.#In#all#other#genotypes,#including#SF;1#KO#females,#LQ#was#significantly# lower# in# comparison# to# untreated# OVX/WT# females# regardless# of# neonatal# testosterone#treatment,#and#there#were#no#differences#between#SF;1#KO#males#and# females# observed.# Analyses# of# aggressive# behaviour# revealed# that# GDX/WT# mice# without# TP# treatment# had# much# higher# total# number# of# attacks# and# bites# in# comparison#to#SF;1#KO#mice.#Administration#of#TP#after#birth,#but#not#before#birth# only,#increased#aggressiveness#in#OVX/WT#females#and#in#male#and#female#SF;1#KO# mice,# suggesting# that# postnatal# period# is# more# important# in# masculinisation# of# aggressive#behaviour#than#the#prenatal#period.## # Cells# expressing# calbindin# (Calb)# protein# in# the# medial# preoptic# area# (MPOA)# in# CAS/WT#males#are#forming#a#nucleus#similar#to#sexual#dimorphic#nucleus#in#the#rat# brain# (SDN;POA),# and# this# was,# as# expected,# not# influenced# by# neonatal# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 115# brez(gena(SF;1# testosterone#treatment#in#CAS/WT#males.#In#other#groups/genotypes,#this#nucleus# was# present# only# after# treatment# with# TP# during# postnatal# and# during# pre;# and# postnatal# period,# what# is# similar# to# the# results# from# the# behavioural# study# and# again# suggests# that# postnatal# treatment# has# more# important# influence# on# masculinisation#of#the#brain#than#prenatal#testosterone#treatment.# Expressions#of#arginine#vasopressin#(AVP)#in#the#fibres#of#LS#require#activational# effect# of# testosterone# in# adulthood.# Although# in# the# present# study# all# mice# were# treated# with# testosterone# before# sacrifice,# there# were# still# apparent# differences# between#genotypes#with#CAS/WT#males#having#more#immuno;positive#AVP#fibres# in#comparison#to#all#other#groups.# # In# conclusion,# results# of# our# studies# reveal# that# some# genes# are# expressed# in# sexually#dimorphic#manner#even#in#complete#absence#of#gonads#in#SF;1#KO#mice.# Furthermore,# behavioural# studies# and# studies# of# calbindin# immunoexpression# suggest#that#postnatal#exposure#to#testosterone#is#crucial#and#more#important#for# complete# masculinisation# and# defeminisation# than# prenatal# exposure# to# testosterone.## # 116# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 9 Zahvala! Najprej#naj#se#zahvalim#mojemu#najdražjemu,#ki#mi#stoji#ob#strani#že#skoraj#18#let:# Nenad#–#hvala#ti!#Hvala#ti#za#vse,#še#posebno#pa#za#zadnja#leta,#ki#so#bila#še#posebno# zanimiva#in#vihrava#…# Hvala#moji#mami#in#mojemu#tati#ter#najdražji#sestri!#Hvala#vam,#ker#me#podpirate# pri# vsem# delu# in# verjamete# vame!# Hvala# tudi# Leonu# in# seveda# malemu# Levčku.# Hvala#Ivana,#Gordana#in#Josip.# # Gregor,# hvala# ti# za# to# življenjsko# priložnost# in# izkušnjo.# Hvala# za# vso# pomoč# in# vodenje# pri# delu# ter# za# prijetna# druženja,# ki# smo# jih# imeli# kot# celoten# kolektiv.# Hvala,#da#si#mi#omogočil#toliko#udeležb#na#kongresih#in#predvsem#za#trenutke,#kot# je# bila# večerja# s# prof.# Artom# Arthurjem.# V# čast# mi# je,# da# sem# v# teh# letih# spoznala# toliko#velikih#in#pomembnih#ljudi#s#področja#proučevanj#razlik#med#spoloma.# #Hvala#tudi#članom#strokovne#komisije,#prof.#dr.#Milki#Vrecl,#prof.#dr.#Jelki#Zabavnik# Piano# in# prof.# dr.# Marjanu# Slaku# Rupniku# –# hvala# vam,# ker# ste# se# tako# hitro# in# učinkovito#odzvali#ter#mi#dali#konstruktivne#komentarje#in#seveda#končno#oceno.## Hvala#Roku#Koširju#za#vso#pomoč#pri#izvedbi#poskusov#z#mikromrežami.# #Potem#pa:#hvala,#Tomi!#Brez#tebe#bi#moje#delo#trajalo#še#kakšno#leto#več#!#Hvala#za# vse#znanje,#ki#si#mi#ga#predal#in#vse#ure#pogovorov#o#nevroznanosti#ter#za#vse#ure# smeha#in#NFS!# Katra,#tudi#brez#tebe#bi#zelo#težko.#V#teh#letih#sva#postali#veliko#več#kot#sodelavki.# Pogovori,#smeh#in#nepogrešljive#kave#…# Neža,#Katja,#Nina,#Jasmina#–#v#Centru#za#genomiko#je#bilo#z#vami#super!#Hvala#za# vso#pomoč#pri#miših#in#poskusih,#za#konstruktivne#debate#in#prijetna#druženja!# Luka,#Nejc,#Urška,#Vesna,#Meta#–#ekipa#celičarjev#–#malo#nam#je#tesno,#ampak#zato# toliko#bolj#zabavno!# # Nikakor#ne#morem#mimo#moje#Gaje!#Gajči,#skupaj#sva#začeli#to#znanstveno#pot#in# približno#istočasno#tudi#zaključili.#Kljub#kilometrom#med#nama,#sva#še#vedno#zelo# blizu!# Petra#in#Sara#–#hvala#vama!#V#zadnjih#letih#smo#precej#narazen,#ampak#v#mislih#in# srcih#pa#zelo#blizu!# Pa#seveda:#Vesna,#Tilen,#Samo,#Maria,#Gašper,#Ajda,#Sara#…#;#za#vsa#ta#leta!# # In# ne# nazadnje,# hvala# ti# življenje,# da# si# mi# prineslo# moje# ”fefke”:# Jana,# Rebeka# in# Simona!#Ne#morem#brez#vas!#Hvala#vam!#Rada#vas#imam!#Skupaj#gremo#naprej!#Die# Fantastischen#4!# #Hvala#tudi#celotni#ekipi#Europe#Donne#in#ostalim#puncam!# # Hvala#ti,#moj#kosmatinko,#Ruby!# # # # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 117# brez(gena(SF;1# # 10 Reference!! 1.# Eckel# L,# Arnold# A,# Hampson# E,# Becker# J,# Blaustein# J,# Herman# J.# Research# and# methodological# issues# in# the# study# of# sex# differences# and# hormone;behavior# relations.# In:# Becker# JB,# ed.# Sex# differences# in# the# brain:# from# genes# to# behavior:# Oxford#;#New#York:#Oxford#University#Press,#2008:#741—52.# 2.#Koopman#P,#Munsterberg#A,#Capel#B,#Vivian#N,#Lovell;Badge#R.#Expression#of#a# candidate#sex;determining#gene#during#mouse#testis#differentiation.# Nature#1990;#348:#450—2.# 3.#Gilbert#SF.#Developmental#biology.#9th#ed.#Sunderland,#Sinauer#Associates,#2010:# 20—80.# 4.# Tobet# SA# FT.# Sex# differences# in# neural# morphology# influenced# hormonally# throughout# life.# In:# Gerall# AA,# Moltz# H,# Ward# IL,# eds.# Handbook# of# behavioral# neurobiology,#sexual#differentiation.#New#York:#Plenum#Press,#1992:#363.# 5.#vom#Saal#FS.#Sexual#differentiation#in#litter;bearing#mammals:#influence#of#sex#of# adjacent#fetuses#in#utero.#J#Anim#Sci#1989;#67:#1824—40.# 6.# London# SE,# Schlinger# BA.# Steroidogenic# enzymes# along# the# ventricular# proliferative#zone#in#the#developing#songbird#brain.## J#Comp#Neurol#2007;#502:#507—21.# 7.#Nguyen#AD,#Conley#AJ.#Adrenal#androgens#in#humans#and#nonhuman#primates:# production,#zonation#and#regulation.#Endocr#Dev#2008;#13:#33—54.# 8.# Greco# TL,# Payne# AH.# Ontogeny# of# expression# of# the# genes# for# steroidogenic# enzymes#P450#side;chain#cleavage,#3#beta;hydroxysteroid#dehydrogenase,#P450#17# alpha;hydroxylase/C17;20# lyase,# and# P450# aromatase# in# fetal# mouse# gonads.# Endocrinology#1994;#135:#262—8.# 9.# Majdic# G,# Saunders# PT,# Teerds# KJ.# Immunoexpression# of# the# steroidogenic# enzymes#3;beta#hydroxysteroid#dehydrogenase#and#17#alpha;hydroxylase,#C17,20# lyase#and#the#receptor#for#luteinizing#hormone#(LH)#in#the#fetal#rat#testis#suggests# that#the#onset#of#Leydig#cell#steroid#production#is#independent#of#LH#action.## Biol#Reprod#1998;#58:#520—5.# # 118# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# # 10.# Dewing# P,# Shi# T,# Horvath# S,# Vilain# E.# Sexually# dimorphic# gene# expression# in# mouse#brain#precedes#gonadal#differentiation.# Brain#Res#Mol#Brain#Res#2003;#118:#82—90.# 11.#Rhen#T#CD.#Why#are#there#two#sexes?#In:#Becker#JB#BK,#Geary#N,#Hampson#E,# Herman# JP,# and# Young# EA,# eds.# Sex# Differences# in# the# Brain,# From# Genes# to# Behavior.#New#York:#Oxford#University#Press,#2008:#Chapter#1:#3—14.# 12.# Arnold# AP,# Burgoyne# PS.# Are# XX# and# XY# brain# cells# intrinsically# different?# Trends#Endocrinol#Metab#2004;#15:#6—11.# 13.#Lyon#MF.#X;chromosome#inactivation.#Curr#Biol#1999;#9:#R235—7.# 14.# Phoenix# CH,# Goy# RW,# Gerall# AA,# Young# WC.# Organizing# action# of# prenatally# administered#testosterone#propionate#on#the#tissues#mediating#mating#behavior#in# the#female#guinea#pig.#Endocrinology#1959;#65:#369—82.# 15.#Arnold#AP,#Breedlove#SM.#Organizational#and#activational#effects#of#sex#steroids# on#brain#and#behavior:#a#reanalysis.#Horm#Behav#1985;#19:#469—98.# 16.#Berne#RM,#Koeppen#BM,#Stanton#BA.#The#Hypothalamus#and#pituitary#gland.#In:# Berne#RM,#eds.##Physiology:#5th#ed.#Philadelphia:#Elsevier,#2004:#819.# 17.#Wilson#CA,#Davies#DC.#The#control#of#sexual#differentiation#of#the#reproductive# system#and#brain.#Reproduction#2007;#133:#331—59.# 18.#Gubbay#J,#Collignon#J,#Koopman#P,#Capel#B,#Economou#A,#et#al.#A#gene#mapping# to#the#sex;determining#region#of#the#mouse#Y#chromosome#is#a#member#of#a#novel# family#of#embryonically#expressed#genes.#Nature#1990;#346:#245—50.# 19.#Hacker#A,#Capel#B,#Goodfellow#P,#Lovell;Badge#R.#Expression#of#Sry,#the#mouse# sex#determining#gene.#Development#1995;#121:#1603—14.# 20.#Bavdek#S.# Temelji#embriologija#za#študente#veterinarske#medicine.# Ljubljana:# Veterinarska#fakulteta,#Ljubljana,#1993:30—42.### 21.#Roosen;Runge#EC,#Anderson#D.#The#development#of#the#interstitial#cells#in#the# testis#of#the#albino#rat.#Acta#Anat#(Basel)#1959;#37:#125—37.# 22.#McGeady#TA.#Veterinary#embryology.#Oxford:#Blackwell,#2006:#244—5.## 23.#Huhtaniemi#I,#Pelliniemi#LJ.#Fetal#Leydig#cells:#cellular#origin,#morphology,#life# span,#and#special#functional#features.#Proc#Soc#Exp#Biol#Med#1992;#201:#125—40.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 119# brez(gena(SF;1# # 24.#Baker#PJ,#O'Shaughnessy#PJ.#Role#of#gonadotrophins#in#regulating#numbers#of# Leydig# and# Sertoli# cells# during# fetal# and# postnatal# development# in# mice.# Reproduction#2001;#122:#227—34.# 25.#George#FW,#Simpson#ER,#Milewich#L,#Wilson#JD.#Studies#on#the#regulation#of#the# onset#of#steroid#hormone#biosynthesis#in#fetal#rabbit#gonads.# Endocrinology#1979;#105:#1100—6.# 26.#Berne#RM.#Physiology.#5th.#St.#Louis,#Mo.:#Mosby,#2004:#920—6.## 27.#Pontier#DB,#Gribnau#J.#Xist#regulation#and#function#explored.## Hum#Genet#2011;#130:#223—36.# 28.# Lyon# MF.# Gene# action# in# the# X;chromosome# of# the# mouse# ( Mus(musculus(L. ).# Nature#1961;#190:#372—3.# 29.#Migeon#BR.#Females#are#mosaics:#X#inactivation#and#sex#differences#in#disease.# 2nd#ed.#Oxford:#Oxford#University#Press,#2014.## 30.# Carrel# L,# Willard# HF.# X;inactivation# profile# reveals# extensive# variability# in# X; linked#gene#expression#in#females.#Nature#2005;#434:#400—4.# 31.# Carvalho# AB,# Dobo# BA,# Vibranovski# MD,# Clark# AG.# Identification# of# five# new# genes#on#the#Y#chromosome#of# Drosophila(melanogaster.## Proc#Natl#Acad#Sci#USA#2001;#98:#13225—30.# 32.# Becker# JB.# Sex# differences# in# the# brain# :# from# genes# to# behavior.# New# York:# Oxford#University#Press,#2008:#109—53.## 33.# # List# of# human# proteins# in# the# Uniprot# Human# reference# proteome.# http://www.uniprot.org/#(06.#05.#2015)# 34.# Leppig# KA,# Disteche# CM.# Ring# X# and# other# structural# X# chromosome# abnormalities:#X#inactivation#and#phenotype.# Semin#Reprod#Med#2001;#19:#147—57.# 35.#Lee#JT,#Bartolomei#MS.#X;inactivation,#imprinting,#and#long#noncoding#RNAs#in# health#and#disease.#Cell#2013;#152:#1308—23.# 36.# Chery# J,# Larschan# E.# X;marks# the# spot:# X;chromosome# identification# during# dosage#compensation.#Biochim#Biophys#Acta#2014;#1839:#234—40.# # # 120# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 37.#Otter#M,#Schrander;Stumpel#CT,#Curfs#LM.#Triple#X#syndrome:#a#review#of#the# literature.#Eur#J#Hum#Genet#2010;#18:#265—71.# 38.#Huynh#KD,#Lee#JT.#Inheritance#of#a#pre;inactivated#paternal#X#chromosome#in# early#mouse#embryos.#Nature#2003;#426:#857—62.# 39.# Okamoto# I,# Otte# AP,# Allis# CD,# Reinberg# D,# Heard# E.# Epigenetic# dynamics# of# imprinted#X#inactivation#during#early#mouse#development.# Science#2004;#303:#644—9.# 40.#Penny#GD,#Kay#GF,#Sheardown#SA,#Rastan#S,#Brockdorff#N.#Requirement#for#Xist# in#X#chromosome#inactivation.#Nature#1996;#379:#131—7.# 41.#Baumgartner#BJ,#Eusterman#VD,#Willard#CC,#Morris#JT.#Pathology#quiz#case#1.# Diagnosis:# Mycobacterium(tuberculosis# cervical# lymphadenitis# (scrofula)# with# left# parotid#gland.#Arch#Otolaryngol#Head#Neck#Surg#2004;#130:#990;#diag#2—3.# 42.#Mak#W,#Baxter#J,#Silva#J,#Newall#AE,#Otte#AP,#et#al.#Mitotically#stable#association# of# polycomb# group# proteins# eed# and# enx1# with# the# inactive# x# chromosome# in# trophoblast#stem#cells.#Curr#Biol#2002;#12:#1016—20.# 43.# Plath# K,# Fang# J,# Mlynarczyk;Evans# SK,# Cao# R,# Worringer# KA,# et# al.# Role# of# histone#H3#lysine#27#methylation#in#X#inactivation.#Science#2003;#300:#131—5.# 44.#Zhao#J,#Sun#BK,#Erwin#JA,#Song#JJ,#Lee#JT.#Polycomb#proteins#targeted#by#a#short# repeat#RNA#to#the#mouse#X#chromosome.#Science#2008;#322:#750—6.# 45.#Brown#CJ,#Hendrich#BD,#Rupert#JL,#Lafreniere#RG,#Xing#Y,#et#al.#The#human#XIST# gene:#analysis#of#a#17#kb#inactive#X;specific#RNA#that#contains#conserved#repeats# and#is#highly#localized#within#the#nucleus.#Cell#1992;#71:#527—42.# 46.# Lee# JT,# Davidow# LS,# Warshawsky# D.# Tsix,# a# gene# antisense# to# Xist# at# the# X; inactivation#centre.#Nat#Genet#1999;#21:#400—4.# 47.#Mittwoch#U.#Genetics#of#sex#determination:#exceptions#that#prove#the#rule.# Mol#Genet#Metab#2000;#71:#405—10.# 48.# Pontiggia# A,# Rimini# R,# Harley# VR,# Goodfellow# PN,# Lovell;Badge# R,# et# al.# Sex; reversing#mutations#affect#the#architecture#of#SRY;DNA#complexes.# EMBO#J#1994;#13:#6115—24.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 121# brez(gena(SF;1# 49.# Veitia# R,# Ion# A,# Barbaux# S,# Jobling# MA,# Souleyreau# N,# et# al.# Mutations# and# sequence# variants# in# the# testis;determining# region# of# the# Y# chromosome# in# individuals#with#a#46,XY#female#phenotype.#Hum#Genet#1997;#99:#648—52.# 50.# McElreavey# KD,# Vilain# E,# Boucekkine# C,# Vidaud# M,# Jaubert# F,# et# al.# XY# sex# reversal#associated#with#a#nonsense#mutation#in#SRY.# Genomics#1992;#13:#838—40.# 51.# McElreavey# K,# Vilain# E,# Barbaux# S,# Fuqua# JS,# Fechner# PY,# et# al.# Loss# of# sequences#3'#to#the#testis;determining#gene,#SRY,#including#the#Y#pseudoautosomal# boundary#associated#with#partial#testicular#determination.# Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#1996;#93:#8590—4.# 52.#Jager#RJ,#Harley#VR,#Pfeiffer#RA,#Goodfellow#PN,#Scherer#G.#A#familial#mutation# in#the#testis;determining#gene#SRY#shared#by#both#sexes.# Hum#Genet#1992;#90:#350—5.# 53.#Vilain#E,#McElreavey#K,#Jaubert#F,#Raymond#JP,#Richaud#F,#et#al.#Familial#case# with# sequence# variant# in# the# testis;determining# region# associated# with# two# sex# phenotypes.#Am#J#Hum#Genet#1992;#50:#1008—11.# 54.#Hanley#NA,#Hagan#DM,#Clement;Jones#M,#Ball#SG,#Strachan#T,#et#al.#SRY,#SOX9,# and# DAX1# expression# patterns# during# human# sex# determination# and# gonadal# development.#Mech#Dev#2000;#91:#403—7.# 55.#Sekido#R,#Lovell;Badge#R.#Sex#determination#involves#synergistic#action#of#SRY# and#SF1#on#a#specific#Sox9#enhancer.#Nature#2008;#453:#930—4.# 56.# Guth# SI,# Wegner# M.# Having# it# both# ways:# Sox# protein# function# between# conservation#and#innovation.#Cell#Mol#Life#Sci#2008;#65:#3000—18.# 57.# Katoh# K,# Miyata# T.# A# heuristic# approach# of# maximum# likelihood# method# for# inferring#phylogenetic#tree#and#an#application#to#the#mammalian#SOX;3#origin#of# the#testis;determining#gene#SRY.#FEBS#Lett#1999;#463:#129—32.# 58.# Morais# da# Silva# S,# Hacker# A,# Harley# V,# Goodfellow# P,# Swain# A,# et# al.# Sox9# expression# during# gonadal# development# implies# a# conserved# role# for# the# gene# in# testis#differentiation#in#mammals#and#birds.#Nat#Genet#1996;#14:#62—8.# 59.# Bishop# CE,# Whitworth# DJ,# Qin# Y,# Agoulnik# AI,# Agoulnik# IU,# et# al.# A# transgenic# insertion# upstream# of# sox9# is# associated# with# dominant# XX# sex# reversal# in# the# mouse.#Nat#Genet#2000;#26:#490—4.# # 122# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# # 60.#Hossain#A,#Saunders#GF.#The#human#sex;determining#gene#SRY#is#a#direct#target# of#WT1.#J#Biol#Chem#2001;#276:#16817—23.# 61.#Mundlos#S,#Pelletier#J,#Darveau#A,#Bachmann#M,#Winterpacht#A,#et#al.#Nuclear# localization#of#the#protein#encoded#by#the#Wilms'#tumor#gene#WT1#in#embryonic# and#adult#tissues.#Development#1993;#119:#1329—41.# 62.#Kreidberg#JA,#Sariola#H,#Loring#JM,#Maeda#M,#Pelletier#J,#et#al.#WT;1#is#required# for#early#kidney#development.#Cell#1993;#74:#679—91.# 63.# Pelletier# J,# Bruening# W,# Kashtan# CE,# Mauer# SM,# Manivel# JC,# et# al.# Germline# mutations# in# the# Wilms'# tumor# suppressor# gene# are# associated# with# abnormal# urogenital#development#in#Denys;Drash#syndrome.#Cell#1991;#67:#437—47.# 64.#Little#M,#Wells#C.#A#clinical#overview#of#WT1#gene#mutations.## Hum#Mutat#1997;#9:#209—25.# 65.#Barbaux#S,#Niaudet#P,#Gubler#MC,#Grunfeld#JP,#Jaubert#F,#et#al.#Donor#splice;site# mutations#in#WT1#are#responsible#for#Frasier#syndrome.# Nat#Genet#1997;#17:#467—70.# 66.#Lala#DS,#Ikeda#Y,#Luo#X,#Baity#LA,#Meade#JC,#et#al.#A#cell;specific#nuclear#receptor# regulates#the#steroid#hydroxylases.#Steroids#1995;#60:#10—4.# 67.#Ikeda#Y,#Lala#DS,#Luo#X,#Kim#E,#Moisan#MP,#et#al.#Characterization#of#the#mouse# FTZ;F1# gene,# which# encodes# a# key# regulator# of# steroid# hydroxylase# gene# expression.#Mol#Endocrinol#1993;#7:#852—60.# 68.# Majdic# G,# Saunders# PT.# Differential# patterns# of# expression# of# DAX;1# and# steroidogenic#factor;1#(SF;1)#in#the#fetal#rat#testis.## Endocrinology#1996;#137:#3586—9.# 69.# Luo# X,# Ikeda# Y,# Parker# KL.# A# cell;specific# nuclear# receptor# is# essential# for# adrenal#and#gonadal#development#and#sexual#differentiation.# Cell#1994;#77:#481—90.# 70.# Yu# RN,# Ito# M,# Jameson# JL.# The# murine# Dax;1# promoter# is# stimulated# by# SF;1# (steroidogenic# factor;1)# and# inhibited# by# COUP;TF# (chicken# ovalbumin# upstream# promoter;transcription# factor)# via# a# composite# nuclear# receptor;regulatory# element.#Mol#Endocrinol#1998;#12:#1010—22.# # # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 123# brez(gena(SF;1# 71.#Muscatelli#F,#Strom#TM,#Walker#AP,#Zanaria#E,#Recan#D,#et#al.#Mutations#in#the# DAX;1# gene# give# rise# to# both# X;linked# adrenal# hypoplasia# congenita# and# hypogonadotropic#hypogonadism.#Nature#1994;#372:#672—6.# 72.# Sharpe# RM.# Pathways# of# endocrine# disruption# during# male# sexual# differentiation#and#masculinization.# Best#Pract#Res#Clin#Endocrinol#Metab#2006;#20:#91—110.# 73.# Park# SY,# Jameson# JL.# Minireview:# transcriptional# regulation# of# gonadal# development#and#differentiation.#Endocrinology#2005;#146:#1035—42.# 74.#Vilain#E,#McCabe#ER.#Mammalian#sex#determination:#from#gonads#to#brain.# Mol#Genet#Metab#1998;#65:#74—84.# 75.#Vainio#S,#Heikkila#M,#Kispert#A,#Chin#N,#McMahon#AP.#Female#development#in# mammals#is#regulated#by#Wnt;4#signalling.#Nature#1999;#397:#405—9.# 76.# Rey# R,# Lukas;Croisier# C,# Lasala# C,# Bedecarras# P.# AMH/MIS:# what# we# know# already#about#the#gene,#the#protein#and#its#regulation.# Mol#Cell#Endocrinol#2003;#211:#21—31.# 77.# El;Gehani# F,# Tena;Sempere# M,# Huhtaniemi# I.# Vasoactive# intestinal# peptide# stimulates#testosterone#production#by#cultured#fetal#rat#testicular#cells.# Mol#Cell#Endocrinol#1998;#140:#175—8.# 78.#Arnold#AP.#Sex#chromosomes#and#brain#gender.# Nat#Rev#Neurosci#2004;#5:#701—8.# 79.#Cooke#B,#Hegstrom#CD,#Villeneuve#LS,#Breedlove#SM.#Sexual#differentiation#of# the#vertebrate#brain:#principles#and#mechanisms.# Front#Neuroendocrinol#1998;#19:#323—62.# 80.#Lillie#FR.#The#theory#of#the#Free;Martin.#Science#1916;#43:#611—3.# 81.#Jost#A.#The#age#factor#in#the#castration#of#male#rabbit#fetuses.# Proc#Soc#Exp#Biol#Med#1947;#66:#302.# 82.#McEwen#BS.#Gonadal#steroids#and#brain#development.# Biol#Reprod#1980;#22:#43—8.# 83.#Itoh#Y,#Melamed#E,#Yang#X,#Kampf#K,#Wang#S,#et#al.#Dosage#compensation#is#less# effective#in#birds#than#in#mammals.#J#Biol#2007;#6:#e2:#15.# # # 124# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 84.#Breedlove#SM.#Sexual#differentiation#of#the#human#nervous#system.# Annu#Rev#Psychol#1994;#45:#389—418.# 85.#Simerly#RB.#Wired#for#reproduction:#organization#and#development#of#sexually# dimorphic#circuits#in#the#mammalian#forebrain.# Annu#Rev#Neurosci#2002;#25:#507—36.# 86.#Burns;Cusato#M,#Scordalakes#EM,#Rissman#EF.#Of#mice#and#missing#data:#what# we#know#(and#need#to#learn)#about#male#sexual#behavior.# Physiol#Behav#2004;#83:#217—32.# 87.#Motelica;Heino#I,#Edwards#DA,#Roffi#J.#Intermale#aggression#in#mice:#does#hour# of#castration#after#birth#influence#adult#behavior?# Physiol#Behav#1993;#53:#1017—9.# 88.#MacLusky#NJ,#Naftolin#F.#Sexual#differentiation#of#the#central#nervous#system.# Science#1981;#211:#1294—302.# 89.#Davis#EC,#Popper#P,#Gorski#RA.#The#role#of#apoptosis#in#sexual#differentiation#of# the#rat#sexually#dimorphic#nucleus#of#the#preoptic#area.# Brain#Res#1996;#734:#10—8.# 90.#McCarthy#MM,#Arnold#AP.#Sex#differences#in#the#brain:#what's#old#and#what's# new#In:#Becker#JB,#Berkley,#K.#J.,#Geary#N.,#eds.#Sex#differences#in#the#brain:#from# genes#to#behavior:#Oxford#;#New#York:#Oxford#University#Press,#2008:#15—34.# 91.#Bakker#J,#De#Mees#C,#Douhard#Q,#Balthazart#J,#Gabant#P,#et#al.#Alpha;fetoprotein# protects# the# developing# female# mouse# brain# from# masculinization# and# defeminization#by#estrogens.#Nat#Neurosci#2006;#9:#220—6.# 92.# Sisk# CL,# Zehr# JL.# Pubertal# hormones# organize# the# adolescent# brain# and# behavior.#Front#Neuroendocrinol#2005;#26:#163—74.# 93.# Kercmar# J,# Tobet# SA,# Majdic# G.# Social# isolation# during# puberty# affects# female# sexual#behavior#in#mice.#Front#Behav#Neurosci#2014;#8:#e337(8).# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4179611/#(06.05.2015)# 94.# Prange;Kiel# J,# Wehrenberg# U,# Jarry# H,# Rune# GM.#Para/autocrine#regulation#of# estrogen#receptors#in#hippocampal#neurons.#Hippocampus#2003;#13:#226—34.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 125# brez(gena(SF;1# 95.# Amateau# SK,# Alt# JJ,# Stamps# CL,# McCarthy# MM.# Brain# estradiol# content# in# newborn# rats:# sex# differences,# regional# heterogeneity,# and# possible# de# novo# synthesis#by#the#female#telencephalon.#Endocrinology#2004;#145:#2906—17.# 96.#Ryan#BC,#Vandenbergh#JG.#Intrauterine#position#effects.## Neurosci#Biobehav#Rev#2002;#26:#665—78.# 97.# Tilson# HA,# Kodavanti# PR,# Mundy# WR,# Bushnell# PJ.# Neurotoxicity# of# environmental#chemicals#and#their#mechanism#of#action.# Toxicol#Lett#1998;#102—103:#631;5.# 98.#Lephart#ED,#West#TW,#Weber#KS,#Rhees#RW,#Setchell#KD,#et#al.#Neurobehavioral# effects#of#dietary#soy#phytoestrogens.#Neurotoxicol#Teratol#2002;#24:#5—16.# 99.#Dewing#P,#Chiang#CW,#Sinchak#K,#Sim#H,#Fernagut#PO,#et#al.#Direct#regulation#of# adult#brain#function#by#the#male;specific#factor#SRY.#Curr#Biol#2006;#16:#415—20.# 100.#De#Vries#GJ,#Rissman#EF,#Simerly#RB,#Yang#LY,#Scordalakes#EM,#et#al.#A#model# system# for# study# of# sex# chromosome# effects# on# sexually# dimorphic# neural# and# behavioral#traits.#J#Neurosci#2002;#22:#9005—14.# 101.# Xu# J,# Burgoyne# PS,# Arnold# AP.# Sex# differences# in# sex# chromosome# gene# expression#in#mouse#brain.#Hum#Mol#Genet#2002;#11:#1409—19.# 102.# Yang# X,# Schadt# EE,# Wang# S,# Wang# H,# Arnold# AP,# et# al.# Tissue;specific# expression#and#regulation#of#sexually#dimorphic#genes#in#mice.# Genome#Res#2006;#16:#995—1004.# 103.#Yang#J,#Zou#Y,#Zhu#J.#Identifying#differentially#expressed#genes#in#human#acute# leukemia#and#mouse#brain#microarray#datasets#utilizing#QTModel.# Funct#Integr#Genomics#2009;#9:#59—66.# 104.# Wolstenholme# JT,# Rissman# EF,# Bekiranov# S.# Sexual# differentiation# in# the# developing#mouse#brain:#contributions#of#sex#chromosome#genes.# Genes#Brain#Behav#2013;#12:#166—80.# 105.#Lisk#RD.#Copulatory#activity#of#the#male#rat#following#placement#of#preoptic; anterior#hypothalamic#lesions.#Exp#Brain#Res#1968;#5:#306—13.# 106.#Szechtman#H,#Caggiula#AR,#Wulkan#D.#Preoptic#knife#cuts#and#sexual#behavior# in#male#rats.#Brain#Res#1978;#150:#569—95.# # 126# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 107.# Madeira# MD,# Lieberman# AR.# Sexual# dimorphism# in# the# mammalian# limbic# system.#Prog#Neurobiol#1995;#45:#275—333.# 108.#Segovia#S,#Guillamon#A.#Sexual#dimorphism#in#the#vomeronasal#pathway#and# sex#differences#in#reproductive#behaviors.## Brain#Res#Brain#Res#Rev#1993;#18:#51—74.# 109.# Maurer# RA,# Woolley# DE.# Demonstration# of# nuclear# 3H;estradiol# binding# in# hypothalamus# and# amygdala# of# female,# androgenized;female,# and# male# rats.# Neuroendocrinology#1974;#16:#137—47.# 110.#Commins#D,#Yahr#P.#Adult#testosterone#levels#influence#the#morphology#of#a# sexually#dimorphic#area#in#the#Mongolian#gerbil#brain.# J#Comp#Neurol#1984;#224:#132—40.# 111.#Commins#D,#Yahr#P.#Autoradiographic#localization#of#estrogen#and#androgen# receptors#in#the#sexually#dimorphic#area#and#other#regions#of#the#gerbil#brain.# J#Comp#Neurol#1985;#231:#473—89.# 112.# Handa# RJ,# Corbier# P,# Shryne# JE,# Schoonmaker# JN,# Gorski# RA.# Differential# effects# of# the# perinatal# steroid# environment# on# three# sexually# dimorphic# parameters#of#the#rat#brain.#Biol#Reprod#1985;#32:#855—64.# 113.# Jacobson# CD,# Arnold# AP,# Gorski# RA.#Steroid# autoradiography# of# the# sexually# dimorphic#nucleus#of#the#preoptic#area.#Brain#Res#1987;#414:#349—56.# 114.# Holbrook# PG,# Baum# MJ.# Characterization# of# estradiol# receptors# in# brain# cytosols#from#perinatal#ferrets.#Brain#Res#1983;#283:#1—8.# 115.# Brown# TJ,# Naftolin# F,# Maclusky# NJ.# Sex# differences# in# estrogen# receptor# binding#in#the#rat#hypothalamus:#effects#of#subsaturating#pulses#of#estradiol.## Brain#Res#1992;#578:#129—34.# 116.# Tobet# SA,# Baum# MJ,# Tang# HB,# Shim# JH,# Canick# JA.# Aromatase# activity# in# the# perinatal#rat#forebrain:#effects#of#age,#sex#and#intrauterine#position.## Brain#Res#1985;#355:#171—8.# 117.#Tobet#SA,#Shim#JH,#Osiecki#ST,#Baum#MJ,#Canick#JA.#Androgen#aromatization# and#5#alpha;reduction#in#ferret#brain#during#perinatal#development:#effects#of#sex# and#testosterone#manipulation.#Endocrinology#1985;#116:#1869—77.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 127# brez(gena(SF;1# 118.#Gorski#RA,#Gordon#JH,#Shryne#JE,#Southam#AM.#Evidence#for#a#morphological# sex#difference#within#the#medial#preoptic#area#of#the#rat#brain.# Brain#Res#1978;#148:#333—46.# 119.#Hines#M,#Davis#FC,#Coquelin#A,#Goy#RW,#Gorski#RA.#Sexually#dimorphic#regions# in#the#medial#preoptic#area#and#the#bed#nucleus#of#the#stria#terminalis#of#the#guinea# pig# brain:# a# description# and# an# investigation# of# their# relationship# to# gonadal# steroids#in#adulthood.#J#Neurosci#1985;#5:#40—7.# 120.#Tobet#SA,#Zahniser#DJ,#Baum#MJ.#Sexual#dimorphism#in#the#preoptic/anterior# hypothalamic#area#of#ferrets:#effects#of#adult#exposure#to#sex#steroids.## Brain#Res#1986;#364:#249—57.# 121.#Panzica#GC,#Viglietti;Panzica#C,#Calacagni#M,#Anselmetti#GC,#Schumacher#M,#et# al.# Sexual# differentiation# and# hormonal# control# of# the# sexually# dimorphic# medial# preoptic#nucleus#in#the#quail.#Brain#Res#1987;#416:#59—68.# 122.#Ayoub#DM,#Greenough#WT,#Juraska#JM.#Sex#differences#in#dendritic#structure# in#the#preoptic#area#of#the#juvenile#macaque#monkey#brain.# Science#1983;#219:#197—8.# 123.#Swaab#DF,#Fliers#E.#A#sexually#dimorphic#nucleus#in#the#human#brain.# Science#1985;#228:#1112—5.# 124.#Allen#LS,#Hines#M,#Shryne#JE,#Gorski#RA.#Two#sexually#dimorphic#cell#groups#in# the#human#brain.#J#Neurosci#1989;#9:#497—506.# 125.#Young#JK.#A#comparison#of#hypothalami#of#rats#and#mice:#lack#of#gross#sexual# dimorphism#in#the#mouse.#Brain#Res#1982;#239:#233—9.# 126.#Shah#NM,#Pisapia#DJ,#Maniatis#S,#Mendelsohn#MM,#Nemes#A,#et#al.#Visualizing# sexual#dimorphism#in#the#brain.#Neuron#2004;#43:#313—9.# 127.#Jacobson#CD,#Csernus#VJ,#Shryne#JE,#Gorski#RA.#The#influence#of#gonadectomy,# androgen# exposure,# or# a# gonadal# graft# in# the# neonatal# rat# on# the# volume# of# the# sexually#dimorphic#nucleus#of#the#preoptic#area.#J#Neurosci#1981;#1:#1142—7.# 128.# Ito# S,# Murakami# S,# Yamanouchi# K,# Arai# Y.# Prenatal# androgen# exposure,# preoptic#area#and#reproductive#functions#in#the#female#rat.# Brain#Dev#1986;#8:#463—8.# # 128# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 129.#Dohler#KD,#Coquelin#A,#Davis#F,#Hines#M,#Shryne#JE,#et#al.#Differentiation#of#the# sexually#dimorphic#nucleus#in#the#preoptic#area#of#the#rat#brain#is#determined#by# the#perinatal#hormone#environment.#Neurosci#Lett#1982;#33:#295—8.# 130.#Dohler#KD,#Coquelin#A,#Davis#F,#Hines#M,#Shryne#JE,#et#al.#Pre;#and#postnatal# influence#of#testosterone#propionate#and#diethylstilbestrol#on#differentiation#of#the# sexually#dimorphic#nucleus#of#the#preoptic#area#in#male#and#female#rats.# Brain#Res#1984;#302:#291—5.# 131.#Dohler#KD,#Srivastava#SS,#Shryne#JE,#Jarzab#B,#Sipos#A,#et#al.#Differentiation#of# the#sexually#dimorphic#nucleus#in#the#preoptic#area#of#the#rat#brain#is#inhibited#by# postnatal#treatment#with#an#estrogen#antagonist.# Neuroendocrinology#1984;#38:#297—301.# 132.#Byne#W,#Bleier#R.#Medial#preoptic#sexual#dimorphisms#in#the#guinea#pig.#I.#An# investigation#of#their#hormonal#dependence.#J#Neurosci#1987;#7:#2688—96.# 133.# Hines# M,# Alsum# P,# Roy# M,# Gorski# RA,# Goy# RW.# Estrogenic# contributions# to# sexual#differentiation#in#the#female#guinea#pig:#influences#of#diethylstilbestrol#and# tamoxifen#on#neural,#behavioral,#and#ovarian#development.# Horm#Behav#1987;#21:#402—17.# 134.# Jacobson# CD,# Gorski# RA.# Neurogenesis# of# the# sexually# dimorphic# nucleus# of# the#preoptic#area#in#the#rat.#J#Comp#Neurol#1981;#196:#519—29.# 135.#Flugge#G,#Wuttke#W,#Fuchs#E.#Postnatal#development#of#transmitter#systems:# sexual#differentiation#of#the#GABAergic#system#and#effects#of#muscimol.# Int#J#Dev#Neurosci#1986;#4:#319—26.# 136.# McCarthy# MM.# Frank# A.# Beach# Award.# Functional# significance# of# steroid# modulation# of# GABAergic# neurotransmission:# analysis# at# the# behavioral,# cellular,# and#molecular#levels.#Horm#Behav#1995;#29:#131—40.# 137.#Bach#F,#Flugge#G,#Wuttke#W.#GABAergic#influence#on#the#development#of#the# sexually#dimorphic#nucleus#of#male#and#female#rats.#Brain#Res#1992;#573:#341—4.# 138.#Arendash#GW,#Gorski#RA.#Effects#of#discrete#lesions#of#the#sexually#dimorphic# nucleus# of# the# preoptic# area# or# other# medial# preoptic# regions# on# the# sexual# behavior#of#male#rats.#Brain#Res#Bull#1983;#10:#147—54.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 129# brez(gena(SF;1# 139.#De#Jonge#FH,#Louwerse#AL,#Ooms#MP,#Evers#P,#Endert#E,#et#al.#Lesions#of#the# SDN;POA#inhibit#sexual#behavior#of#male#Wistar#rats.## Brain#Res#Bull#1989;#23:#483—92.# 140.#Jacobson#CD,#Terkel#J,#Gorski#RA,#Sawyer#CH.#Effects#of#small#medial#preoptic# area#lesions#on#maternal#behavior:#retrieving#and#nest#building#in#the#rat.# Brain#Res#1980;#194:#471—8.# 141.# Kondo# Y,# Sachs# BD,# Sakuma# Y.# Importance# of# the# medial# amygdala# in# rat# penile#erection#evoked#by#remote#stimuli#from#estrous#females.# Behav#Brain#Res#1997;#88:#153—60.# 142.# Rajendren# G,# Moss# RL.# The# role# of# the# medial# nucleus# of# amygdala# in# the# mating;induced# enhancement# of# lordosis# in# female# rats:# the# interaction# with# luteinizing#hormone;releasing#hormone#neuronal#system.# Brain#Res#1993;#617:#81—6.# 143.# Vochteloo# JD,# Koolhaas# JM.# Medial# amygdala# lesions# in# male# rats# reduce# aggressive#behavior:#interference#with#experience.# Physiol#Behav#1987;#41:#99—102.# 144.#Meaney#MJ,#McEwen#BS.#Testosterone#implants#into#the#amygdala#during#the# neonatal#period#masculinize#the#social#play#of#juvenile#female#rats.# Brain#Res#1986;#398:#324—8.# 145.# Hines# M,# Allen# LS,# Gorski# RA.# Sex# differences# in# subregions# of# the# medial# nucleus#of#the#amygdala#and#the#bed#nucleus#of#the#stria#terminalis#of#the#rat.# Brain#Res#1992;#579:#321—6.# 146.#Cooke#BM,#Tabibnia#G,#Breedlove#SM.#A#brain#sexual#dimorphism#controlled# by#adult#circulating#androgens.#Proc#Natl#Acad#Sci#USA#1999;#96:#7538—40.# 147.#Staudt#J,#Dorner#G.#Structural#changes#in#the#medial#and#central#amygdala#of# the# male# rat,# following# neonatal# castration# and# androgen# treatment.# Endokrinologie#1976;#67:#296—300.# 148.# Morris# JA,# Jordan# CL,# King# ZA,# Northcutt# KV,# Breedlove# SM.# Sexual# dimorphism#and#steroid#responsiveness#of#the#posterodorsal#medial#amygdala#in# adult#mice.#Brain#Res#2008;#1190:#115—21.# # 130# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 149.#Osterlund#M,#Kuiper#GG,#Gustafsson#JA,#Hurd#YL.#Differential#distribution#and# regulation#of#estrogen#receptor;alpha#and#;beta#mRNA#within#the#female#rat#brain.# Brain#Res#Mol#Brain#Res#1998;#54:#175—80.# 150.# DonCarlos# LL,# Garcia;Ovejero# D,# Sarkey# S,# Garcia;Segura# LM,# Azcoitia# I.# Androgen#receptor#immunoreactivity#in#forebrain#axons#and#dendrites#in#the#rat.# Endocrinology#2003;#144:#3632—8.# 151.#Morris#JA,#Jordan#CL,#Dugger#BN,#Breedlove#SM.#Partial#demasculinization#of# several# brain# regions# in# adult# male# (XY)# rats# with# a# dysfunctional# androgen# receptor#gene.#J#Comp#Neurol#2005;#487:#217—26.# 152.#Nishizuka#M,#Arai#Y.#Organizational#action#of#estrogen#on#synaptic#pattern#in# the#amygdala:#implications#for#sexual#differentiation#of#the#brain.# Brain#Res#1981;#213:#422—6.# 153.#Nishizuka#M,#Arai#Y.#Synapse#formation#in#response#to#estrogen#in#the#medial# amygdala#developing#in#the#eye.#Proc#Natl#Acad#Sci#USA#1982;#79:#7024—6.# 154.# Nishizuka# M,# Arai# Y.# Regional# difference# in# sexually# dimorphic# synaptic# organization#of#the#medial#amygdala.#Exp#Brain#Res#1983;#49:#462—5.# 155.# Gatewood# JD,# Wills# A,# Shetty# S,# Xu# J,# Arnold# AP,# et# al.# Sex# chromosome# complement#and#gonadal#sex#influence#aggressive#and#parental#behaviors#in#mice.# J#Neurosci#2006;#26:#2335—42.# 156.# Veenema# AH,# Neumann# ID.# Central# vasopressin# and# oxytocin# release:# regulation#of#complex#social#behaviours.#Prog#Brain#Res#2008;#170:#261—76.# 157.# De# Vries# GJ,# Panzica# GC.# Sexual# differentiation# of# central# vasopressin# and# vasotocin# systems# in# vertebrates:# different# mechanisms,# similar# endpoints.# Neuroscience#2006;#138:#947—55.# 158.#Halpern#M.#The#organization#and#function#of#the#vomeronasal#system.#Annu# Rev#Neurosci#1987;#10:#325—62.# 159.# Bleier# R,# Byne# W,# Siggelkow# I.# Cytoarchitectonic# sexual# dimorphisms# of# the# medial#preoptic#and#anterior#hypothalamic#areas#in#guinea#pig,#rat,#hamster,#and# mouse.#J#Comp#Neurol#1982;#212:#118—30.# 160.# Simerly# RB,# Swanson# LW,# Handa# RJ,# Gorski# RA.# Influence# of# perinatal# androgen# on# the# sexually# dimorphic# distribution# of# tyrosine# hydroxylase; # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 131# brez(gena(SF;1# immunoreactive#cells#and#fibers#in#the#anteroventral#periventricular#nucleus#of#the# rat.#Neuroendocrinology#1985;#40:#501—10.# 161.# Simerly# RB.# Prodynorphin# and# proenkephalin# gene# expression# in# the# anteroventral# periventricular# nucleus# of# the# rat:# sexual# differentiation# and# hormonal#regulation.#Mol#Cell#Neurosci#1991;#2:#473—84.# 162.#Emery#DE,#Sachs#BD.#Copulatory#behavior#in#male#rats#with#lesions#in#the#bed# nucleus#of#the#stria#terminalis.#Physiol#Behav#1976;#17:#803—6.# 163.#Lopez#HS,#Carrer#HF.#Investigation#of#peripeduncular;hypothalamic#pathways# involved#in#the#control#of#lordosis#in#the#rat.#Brain#Res#1982;#253:#287—302.# 164.#de#Olmos#JS,#Heimer#L.#The#concepts#of#the#ventral#striatopallidal#system#and# extended#amygdala.#Ann#N#Y#Acad#Sci#1999;#877:#1—32.# 165.# Guillamon# A,# Segovia# S,# del# Abril# A.# Early# effects# of# gonadal# steroids# on# the# neuron#number#in#the#medial#posterior#region#and#the#lateral#division#of#the#bed# nucleus#of#the#stria#terminalis#in#the#rat.# Brain#Res#Dev#Brain#Res#1988;#44:#281—90.# 166.#Allen#LS,#Gorski#RA.#Sex#difference#in#the#bed#nucleus#of#the#stria#terminalis#of# the#human#brain.#J#Comp#Neurol#1990;#302:#697—706.# 167.#McClellan#KM,#Parker#KL,#Tobet#S.#Development#of#the#ventromedial#nucleus# of#the#hypothalamus.#Front#Neuroendocrinol#2006;#27:#193—209.# 168.# Dorner# G,# Staudt# J.# Structural# changes# in# the# hypothalamic# ventromedial# nucleus# of# the# male# rat,# following# neonatal# castration# and# androgen# treatment.# Neuroendocrinology#1969;#4:#278—81.# 169.#Yokosuka#M,#Okamura#H,#Hayashi#S.#Postnatal#development#and#sex#difference# in# neurons# containing# estrogen# receptor;alpha# immunoreactivity# in# the# preoptic# brain,#the#diencephalon,#and#the#amygdala#in#the#rat.# J#Comp#Neurol#1997;#389:#81—93.# 170.# Ikeda# Y,# Nagai# A,# Ikeda# MA,# Hayashi# S.# Sexually# dimorphic# and# estrogen; dependent#expression#of#estrogen#receptor#beta#in#the#ventromedial#hypothalamus# during#rat#postnatal#development.#Endocrinology#2003;#144:#5098—104.# 171.# Budefeld# T,# Grgurevic# N,# Tobet# SA,# Majdic# G.# Sex# differences# in# brain# developing#in#the#presence#or#absence#of#gonads.## # 132# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# Dev#Neurobiol#2008;#68:#981—95.# 172.# Micevych# PE,# Park# SS,# Akesson# TR,# Elde# R.# Distribution# of# cholecystokinin; immunoreactive# cell# bodies# in# the# male# and# female# rat:# I.# Hypothalamus.# J# Comp# Neurol#1987;#255:#124—36.# 173.# Luine# V,# Hearns# M.# Relationship# of# gonadal# hormone# administration,# sex,# reproductive# status# and# age# to# monoamine# oxidase# activity# within# the# hypothalamus.#J#Neuroendocrinol#1990;#2:#423—8.# 174.#Lauber#AH,#Mobbs#CV,#Muramatsu#M,#Pfaff#DW.#Estrogen#receptor#messenger# RNA# expression# in# rat# hypothalamus# as# a# function# of# genetic# sex# and# estrogen# dose.#Endocrinology#1991;#129:#3180—6.# 175.#Funabashi#T,#Brooks#PJ,#Kleopoulos#SP,#Grandison#L,#Mobbs#CV,#et#al.#Changes# in#preproenkephalin#messenger#RNA#level#in#the#rat#ventromedial#hypothalamus# during#the#estrous#cycle.#Brain#Res#Mol#Brain#Res#1995;#28:#129—34.# 176.#Wimer#RE,#Wimer#C.#Three#sex#dimorphisms#in#the#granule#cell#layer#of#the# hippocampus#in#house#mice.#Brain#Res#1985;#328:#105—9.# 177.#de#Lacoste#MC,#Holloway#RL,#Woodward#DJ.#Sex#differences#in#the#fetal#human# corpus#callosum.#Hum#Neurobiol#1986;#5:#93—6.# 178.#Bishop#KM,#Wahlsten#D.#Sex#differences#in#the#human#corpus#callosum:#myth# or#reality?#Neurosci#Biobehav#Rev#1997;#21:#581—601.# 179.#Holloway#RL,#Anderson#PJ,#Defendini#R,#Harper#C.#Sexual#dimorphism#of#the# human# corpus# callosum# from# three# independent# samples:# relative# size# of# the# corpus#callosum.#Am#J#Phys#Anthropol#1993;#92:#481—98.# 180.# Ardekani# BA,# Figarsky# K,# Sidtis# JJ.# Sexual# dimorphism# in# the# human# corpus# callosum:#an#MRI#study#using#the#OASIS#brain#database.# Cereb#Cortex#2013;#23:#2514—20.# 181.# Ehrhardt# AA,# Meyer;Bahlburg# HF.# Effects# of# prenatal# sex# hormones# on# gender;related#behavior.#Science#1981;#211:#1312—8.# 182.# Berenbaum# SA# HM.# Early# androgens# are# related# to# childhood# sex;typed# toy# preferences.#Physiol#Science#1992;#3:#203—6.# 183.#Money#J,#Schwartz#M,#Lewis#VG.#Adult#erotosexual#status#and#fetal#hormonal# masculinization# and# demasculinization:# 46,XX# congenital# virilizing# adrenal# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 133# brez(gena(SF;1# hyperplasia# and# 46,XY# androgen;insensitivity# syndrome# compared.# Psychoneuroendocrinology#1984;#9:#405—14.# 184.# Lala# DS,# Rice# DA,# Parker# KL.# Steroidogenic# factor# I,# a# key# regulator# of# steroidogenic# enzyme# expression,# is# the# mouse# homolog# of# fushi# tarazu;factor# I.# Mol#Endocrinol#1992;#6:#1249—58.# 185.# Wong# M,# Ramayya# MS,# Chrousos# GP,# Driggers# PH,# Parker# KL.# Cloning# and# sequence#analysis#of#the#human#gene#encoding#steroidogenic#factor#1.# J#Mol#Endocrinol#1996;#17:#139—47.# 186.# Umesono# K,# Evans# RM.# Determinants# of# target# gene# specificity# for# steroid/thyroid#hormone#receptors.#Cell#1989;#57:#1139—46.# 187.# Bakke# M,# Zhao# L,# Hanley# NA,# Parker# KL.# SF;1:# a# critical# mediator# of# steroidogenesis.#Mol#Cell#Endocrinol#2001;#171:#5—7.# 188.# Parker# KL,# Schimmer# BP.# Steroidogenic# factor# 1:# a# key# determinant# of# endocrine#development#and#function.#Endocr#Rev#1997;#18:#361—77.# 189.# Li# Y,# Choi# M,# Cavey# G,# Daugherty# J,# Suino# K,# et# al.# Crystallographic# identification# and# functional# characterization# of# phospholipids# as# ligands# for# the# orphan#nuclear#receptor#steroidogenic#factor;1.#Mol#Cell#2005;#17:#491—502.# 190.# Zhao# L,# Bakke# M,# Hanley# NA,# Majdic# G,# Stallings# NR,# et# al.# Tissue;specific# knockouts#of#steroidogenic#factor#1.#Mol#Cell#Endocrinol#2004;#215:#89—94.# 191.# Zhao# L,# Bakke# M,# Parker# KL.# Pituitary;specific# knockout# of# steroidogenic# factor#1.#Mol#Cell#Endocrinol#2001;#185:#27—32.# 192.# Ikeda# Y,# Shen# WH,# Ingraham# HA,# Parker# KL.# Developmental# expression# of# mouse# steroidogenic# factor;1,# an# essential# regulator# of# the# steroid# hydroxylases.# Mol#Endocrinol#1994;#8:#654—62.# 193.# Sadovsky# Y,# Crawford# PA,# Woodson# KG,# Polish# JA,# Clements# MA,# et# al.# Mice# deficient# in# the# orphan# receptor# steroidogenic# factor# 1# lack# adrenal# glands# and# gonads# but# express# P450# side;chain;cleavage# enzyme# in# the# placenta# and# have# normal#embryonic#serum#levels#of#corticosteroids.# Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#1995;#92:#10939—43.# # # 134# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 194.#Shinoda#K,#Lei#H,#Yoshii#H,#Nomura#M,#Nagano#M,#et#al.#Developmental#defects# of#the#ventromedial#hypothalamic#nucleus#and#pituitary#gonadotroph#in#the#Ftz;F1# disrupted#mice.#Dev#Dyn#1995;#204:#22—9.# 195.#Luo#X,#Ikeda#Y,#Schlosser#DA,#Parker#KL.#Steroidogenic#factor#1#is#the#essential# transcript#of#the#mouse#Ftz;F1#gene.#Mol#Endocrinol#1995;#9:#1233—9.# 196.#Shima#Y,#Zubair#M,#Komatsu#T,#Oka#S,#Yokoyama#C,#et#al.#Pituitary#homeobox#2# regulates# adrenal4# binding# protein/steroidogenic# factor;1# gene# transcription# in# the#pituitary#gonadotrope#through#interaction#with#the#intronic#enhancer.## Mol#Endocrinol#2008;#22:#1633—46.# 197.# Majdič# G,# Young# M,# Gomez;Sanchez# E,# Anderson# P,# Szczepaniak# LS,# et# al.# Knockout# mice# lacking# steroidogenic# factor# 1# are# a# novel# genetic# model# of# hypothalamic#obesity.#Endocrinology#2002;#143:#607—14.# 198.# Ikeda# Y,# Luo# X,# Abbud# R,# Nilson# JH,# Parker# KL.# The# nuclear# receptor# steroidogenic# factor# 1# is# essential# for# the# formation# of# the# ventromedial# hypothalamic#nucleus.#Mol#Endocrinol#1995;#9:#478—86.# 199.# Barnard# CJ.# Animal# behavior# :# mechanism,# development,# function,# and# evolution.#Harlow,#England:#Pearson#Education,#2004:#2—32.## 200.# Crawley# JN.# What's# wrong# with# my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic#and#knockout#mice.#2nd#ed.#Hoboken:#Wiley;Interscience,#2007:#253.## 201.# Crawley# JN.# What's# wrong# with# my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic#and#knockout#mice.#New#York:#Wiley;Liss,#2000:#179—209.## 202.# Crawley# JN.# What's# wrong# with# my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic# and# knockout# mice.# 2nd# ed.# Hoboken:# Wiley;Interscience,# 2007:# 83— 131.## 203.# Barnard# CJ.# Animal# behavior:# mechanism,# development,# function,# and# evolution.#Harlow,#England:#Pearson#Education,#2004:#167—219.## 204.# Crawley# JN.# What's# wrong# with# my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic#and#knockout#mice.#2nd#ed.#Hoboken:#Wiley;Interscience,#2007:#209— 27.## 205.# Barnard# CJ.# Animal# behavior# :# mechanism,# development,# function,# and# evolution.#Harlow,#England:#Pearson#Education,#2004:#94—166.## # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 135# brez(gena(SF;1# 206.# Barnard# CJ.# Animal# behavior# :# mechanism,# development,# function,# and# evolution.#Harlow,#England:#Pearson#Education,#2004:#220—54.## 207.#Jonasson#Z.#Meta;analysis#of#sex#differences#in#rodent#models#of#learning#and# memory:#a#review#of#behavioral#and#biological#data.## Neurosci#Biobehav#Rev#2005;#28:#811—25.# 208.#Cahill#L.#Why#sex#matters#for#neuroscience.# Nat#Rev#Neurosci#2006;#7:#477—84.# 209.# Crews# D.# Evolution# of# neuroendocrine# mechanisms# that# regulate# sexual# behavior.#Trends#Endocrinol#Metab#2005;#16:#354—61.# 210.# Carter# CS,# DeVries# AC,# Getz# LL.# Physiological# substrates# of# mammalian# monogamy:#the#prairie#vole#model.#Neurosci#Biobehav#Rev#1995;#19:#303—14.# 211.#Young#LJ,#Murphy#Young#AZ,#Hammock#EA.#Anatomy#and#neurochemistry#of# the#pair#bond.#J#Comp#Neurol#2005;#493:#51—7.# 212.# Nair# HP,# Young# LJ.# Vasopressin# and# pair;bond# formation:# genes# to# brain# to# behavior.#Physiology#(Bethesda)#2006;#21:#146—52.# 213.# Morris# JA,# Jordan# CL,# Breedlove# SM.# Sexual# differentiation# of# the# vertebrate# nervous#system.#Nat#Neurosci#2004;#7:#1034—9.# 214.# Baum# MJ.# Activational# and# organizational# effects# of# estradiol# on# male# behavioral#neuroendocrine#function.#Scand#J#Psychol#2003;#44:#213—20.# 215.# Gagnidze# K,# Pfaff# DW,# Mong# JA.# Gene# expression# in# neuroendocrine# cells# during#the#critical#period#for#sexual#differentiation#of#the#brain.## Prog#Brain#Res#2010;#186:#97—111.# 216.#Wu#MV,#Manoli#DS,#Fraser#EJ,#Coats#JK,#Tollkuhn#J,#et#al.#Estrogen#masculinizes# neural#pathways#and#sex;specific#behaviors.#Cell#2009;#139:#61—72.# 217.#Beach#FA,#Noble#RG,#Orndoff#RK.#Effects#of#perinatal#androgen#treatment#on# responses#of#male#rats#to#gonadal#hormones#in#adulthood.# J#Comp#Physiol#Psychol#1969;#68:#490—7.# 218.# Baum# MJ.# A# comparison# of# the# effects# of# methyltrienolone# (R# 1881)# and# 5# alpha;dihydrotestosterone#on#sexual#behavior#of#castrated#male#rats.# Horm#Behav#1979;#13:#165—74.# # 136# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 219.# Simon# NG,# Whalen# RE.# Sexual# differentiation# of# androgen;sensitive# and# estrogen;sensitive#regulatory#systems#for#aggressive#behavior.# Horm#Behav#1987;#21:#493—500.# 220.#Bakker#J,#Honda#S,#Harada#N,#Balthazart#J.#Sexual#partner#preference#requires# a#functional#aromatase#(cyp19)#gene#in#male#mice.# Horm#Behav#2002;#42:#158—71.# 221.# Bakker# J,# Honda# S,# Harada# N,# Balthazart# J.# The# aromatase# knock;out# mouse# provides#new#evidence#that#estradiol#is#required#during#development#in#the#female# for#the#expression#of#sociosexual#behaviors#in#adulthood.## J#Neurosci#2002;#22:#9104—12.# 222.# McCarthy# MM,# Wright# CL,# Schwarz# JM.# New# tricks# by# an# old# dogma:# mechanisms# of# the# Organizational/Activational# Hypothesis# of# steroid;mediated# sexual#differentiation#of#brain#and#behavior.#Horm#Behav#2009;#55:#655—65.# 223.#Ogawa#S,#Taylor#JA,#Lubahn#DB,#Korach#KS,#Pfaff#DW.#Reversal#of#sex#roles#in# genetic#female#mice#by#disruption#of#estrogen#receptor#gene.## Neuroendocrinology#1996;#64:#467—70.# 224.# Ogawa# S,# Chan# J,# Chester# AE,# Gustafsson# JA,# Korach# KS,# et# al.# Survival# of# reproductive#behaviors#in#estrogen#receptor#beta#gene;deficient#(betaERKO)#male# and#female#mice.#Proc#Natl#Acad#Sci#USA#1999;#96:#12887—92.# 225.#Ogawa#S,#Washburn#TF,#Taylor#J,#Lubahn#DB,#Korach#KS,#et#al.#Modifications#of# testosterone;dependent# behaviors# by# estrogen# receptor;alpha# gene# disruption# in# male#mice.#Endocrinology#1998;#139:#5058—69.# 226.#Kudwa#AE,#Bodo#C,#Gustafsson#JA,#Rissman#EF.#A#previously#uncharacterized# role#for#estrogen#receptor#beta:#defeminization#of#male#brain#and#behavior.# #Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#2005;#102:#4608—12.# 227.# Kudwa# AE,# Michopoulos# V,# Gatewood# JD,# Rissman# EF.# Roles# of# estrogen# receptors#alpha#and#beta#in#differentiation#of#mouse#sexual#behavior.# Neuroscience#2006;#138:#921—8.# 228.# Scordalakes# EM,# Rissman# EF.# Aggression# in# male# mice# lacking# functional# estrogen#receptor#alpha.#Behav#Neurosci#2003;#117:#38—45.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 137# brez(gena(SF;1# 229.# Raskin# K,# de# Gendt# K,# Duittoz# A,# Liere# P,# Verhoeven# G,# et# al.# Conditional# inactivation# of# androgen# receptor# gene# in# the# nervous# system:# effects# on# male# behavioral#and#neuroendocrine#responses.#J#Neurosci#2009;#29:#4461—70.# 230.#Kudwa#AE,#Rissman#EF.#Double#oestrogen#receptor#alpha#and#beta#knockout# mice#reveal#differences#in#neural#oestrogen;mediated#progestin#receptor#induction# and#female#sexual#behaviour.#J#Neuroendocrinol#2003;#15:#978—83.# 231.#Wersinger#SR,#Sannen#K,#Villalba#C,#Lubahn#DB,#Rissman#EF,#et#al.#Masculine# sexual#behavior#is#disrupted#in#male#and#female#mice#lacking#a#functional#estrogen# receptor#alpha#gene.#Horm#Behav#1997;#32:#176—83.# 232.# Juntti# SA,# Tollkuhn# J,# Wu# MV,# Fraser# EJ,# Soderborg# T,# et# al.# The# androgen# receptor# governs# the# execution,# but# not# programming,# of# male# sexual# and# territorial#behaviors.#Neuron#2010;#66:#260—72.# 233.#Ogawa#S,#Chester#AE,#Hewitt#SC,#Walker#VR,#Gustafsson#JA,#et#al.#Abolition#of# male# sexual# behaviors# in# mice# lacking# estrogen# receptors# alpha# and# beta# (alpha# beta#ERKO).#Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#2000;#97:#14737—41.# 234.#Nelson#R.#An#introduction#to#behavioral#enodcrinology.#3rd#ed.## Sunderland:#Sinauer#Associates,#2005:#319—85.## 235.#Erskine#MS.#Solicitation#behavior#in#the#estrous#female#rat:#a#review.# Horm#Behav#1989;#23:#473—502.# 236.# Garey# J,# Kow# LM,# Huynh# W,# Ogawa# S,# Pfaff# DW.# Temporal# and# spatial# quantitation#of#nesting#and#mating#behaviors#among#mice#housed#in#a#semi;natural# environment.#Horm#Behav#2002;#42:#294—306.# 237.#Yamanouchi#K.#Inhibitory#and#facilitatory#neural#mechanisms#involved#in#the# regulation#of#lordosis#behavior#in#female#rats:#effects#of#dual#cuts#in#the#preoptic# area#and#hypothalamus.#Physiol#Behav#1980;#25:#721—5.# 238.# Clark# AS,# Pfeifle# JK,# Edwards# DA.# Ventromedial# hypothalamic# damage# and# sexual#proceptivity#in#female#rats.#Physiol#Behav#1981;#27:#597—602.# 239.#Rubin#BS,#Barfield#RJ.#Induction#of#estrous#behavior#in#ovariectomized#rats#by# sequential# replacement# of# estrogen# and# progesterone# to# the# ventromedial# hypothalamus.#Neuroendocrinology#1983;#37:#218—24.# # 138# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 240.#Hoshina#Y,#Takeo#T,#Nakano#K,#Sato#T,#Sakuma#Y.#Axon;sparing#lesion#of#the# preoptic# area# enhances# receptivity# and# diminishes# proceptivity# among# components#of#female#rat#sexual#behavior.#Behav#Brain#Res#1994;#61:#197—204.# 241.#Knobil#E,#Neill#JD,#eds.#In:#Encyclopedia#of#reproduction.#San#Diego:#Academic# Press,#1998:123—57.### 242.#Pak#TR,#Honda#RJ.#Steroid#hormone#receptors#and#sex#differences#in#behavior.# In:#Becker#JB,#ed.#Sex#differences#in#the#brain:#from#genes#to#behavior;#New#York:# Oxford#University#Press,#2008:#109—39.# 243.# Mani# SK,# Blaustein# JD,# O'Malley# BW.# Progesterone# receptor# function# from# a# behavioral#perspective.#Horm#Behav#1997;#31:#244—55.# 244.# Ogawa# S,# Olazabal# UE,# Parhar# IS,# Pfaff# DW.# Effects# of# intrahypothalamic# administration#of#antisense#DNA#for#progesterone#receptor#mRNA#on#reproductive# behavior#and#progesterone#receptor#immunoreactivity#in#female#rat.# J#Neurosci#1994;#14:#1766—74.# 245.#Hamburger;Bar#R,#Rigter#H.#Apomorphine:#facilitation#of#sexual#behaviour#in# female#rats.#Eur#J#Pharmacol#1975;#32:#357—60.# 246.# Meisel# R.# Copulation,# mammals.# In:# Knobil# E,# Neill# JD,# eds.# Encyclopedia# of# reproduction.#San#Diego:#Academic#Press,#1998:#675—80.# 247.# Volavka# J,# Czobor# P,# Citrome# L,# McQuade# RD,# Carson# WH,# et# al.# Efficacy# of# aripiprazole# against# hostility# in# schizophrenia# and# schizoaffective# disorder:# data# from#5#double;blind#studies.#J#Clin#Psychiatry#2005;#66:#1362—6.# 248.# Miczek# KA,# Fish# EW,# De# Bold# JF,# De# Almeida# RM.# Social# and# neural# determinants# of# aggressive# behavior:# pharmacotherapeutic# targets# at# serotonin,# dopamine#and#gamma;aminobutyric#acid#systems.# Psychopharmacology#(Berl)#2002;#163:#434—58.# 249.#Miczek#KA,#de#Almeida#RM.#Oral#drug#self;administration#in#the#home#cage#of# mice:# alcohol;heightened# aggression# and# inhibition# by# the# 5;HT1B# agonist# anpirtoline.#Psychopharmacology#(Berl)#2001;#157:#421—9.# 250.# Miczek# KA,# O'Donnell# JM.# Intruder;evoked# aggression# in# isolated# and# nonisolated# mice:# effects# of# psychomotor# stimulants# and# L;dopa.# Psychopharmacology#(Berl)#1978;#57:#47—55.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 139# brez(gena(SF;1# 251.#Simon#NG,#Cologer;Clifford#A,#Lu#SF,#McKenna#SE,#Hu#S.#Testosterone#and#its# metabolites#modulate#5HT1A#and#5HT1B#agonist#effects#on#intermale#aggression.# Neurosci#Biobehav#Rev#1998;#23:#325—36.# 252.#Brain#P,#Benton#D.#The#interpretation#of#physiological#correlates#of#differential# housing#in#laboratory#rats.#Life#Sci#1979;#24:#99—115.# 253.# Takahashi# A,# Quadros# IM,# de# Almeida# RM,# Miczek# KA.# Behavioral# and# pharmacogenetics#of#aggressive#behavior.## Curr#Top#Behav#Neurosci#2012;12:73—138.# 254.# Blanchard# RJ,# Wall# PM,# Blanchard# DC.# Problems# in# the# study# of# rodent# aggression.#Horm#Behav#2003;#44:#161—70.# 255.# Pellis# SM,# Pellis# VC.# Play;fighting# in# the# Syrian# golden# hamster# Mesocricetus( auratus# Waterhouse,# and# its# relationship# to# serious# fighting# during# postweaning# development.#Dev#Psychobiol#1988;#21:#323—37.# 256.#Rasia;Filho#AA,#Giovenardi#M,#de#Almeida#RM.#Drugs#and#aggression.# Recent#Pat#CNS#Drug#Discov#2008;#3:#40—9.# 257.#Parmigiani#S,#Ferrari#PF,#Palanza#P.#An#evolutionary#approach#to#behavioral# pharmacology:#using#drugs#to#understand#proximate#and#ultimate#mechanisms#of# different#forms#of#aggression#in#mice.#Neurosci#Biobehav#Rev#1998;#23:#143—53.# 258.# Miczek# KA,# Fish# EW,# De# Bold# JF.# Neurosteroids,# GABAA# receptors,# and# escalated#aggressive#behavior.#Horm#Behav#2003;#44:#242—57.# 259.#Haller#J,#Mikics#E,#Halasz#J,#Toth#M.#Mechanisms#differentiating#normal#from# abnormal#aggression:#glucocorticoids#and#serotonin.# Eur#J#Pharmacol#2005;#526:#89—100.# 260.#Ferris#CF,#Stolberg#T,#Kulkarni#P,#Murugavel#M,#Blanchard#R,#et#al.#Imaging#the# neural# circuitry# and# chemical# control# of# aggressive# motivation.# BMC# Neurosci# 2008;#9:#e111(35#str).# http://www.biomedcentral.com/1471;2202/9/111/#(06.05.2015)# 261.# Nelson# RJ.# An# introduction# to# behavioral# endocrinology.# 4th# ed.# Sunderland:# Sinauer#Associates,#2011:#455—520.## 262.#Edwards#D.#Early#androgen#stimulation#and#aggressive#behavior#in#male#and# female#mice.#Physiol#Behav#1969;#4:#333—8.# # 140# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# # 263.# Demas# GE,# Moffatt# CA,# Drazen# DL,# Nelson# RJ.# Castration# does# not# inhibit# aggressive#behavior#in#adult#male#prairie#voles#( Microtus(ochrogaster).## Physiol#Behav#1999;#66:#59—62.# 264.#Trainor#BC,#Marler#CA.#Testosterone,#paternal#behavior,#and#aggression#in#the# monogamous#California#mouse#( Peromyscus(californicus).## Horm#Behav#2001;#40:#32—42.# 265.#Trainor#BC,#Greiwe#KM,#Nelson#RJ.#Individual#differences#in#estrogen#receptor# alpha# in# select# brain# nuclei# are# associated# with# individual# differences# in# aggression.#Horm#Behav#2006;#50:#338—45.# 266.#Johnson#F,#Whalen#RE.#Testicular#hormones#reduce#individual#differences#in# the#aggressive#behavior#of#male#mice:#a#theory#of#hormone#action.# Neurosci#Biobehav#Rev#1988;#12:#93—9.# 267.#Albert#DJ,#Jonik#RH,#Watson#NV,#Gorzalka#BB,#Walsh#ML.#Hormone;dependent# aggression# in# male# rats# is# proportional# to# serum# testosterone# concentration# but# sexual#behavior#is#not.#Physiol#Behav#1990;#48:#409—16.# 268.# Ogawa# S,# Lubahn# DB,# Korach# KS,# Pfaff# DW.# Behavioral# effects# of# estrogen# receptor#gene#disruption#in#male#mice.#Proc#Natl#Acad#Sci#USA#1997;#94:#1476—81.# 269.# Krege# JH,# Hodgin# JB,# Couse# JF,# Enmark# E,# Warner# M,# et# al.# Generation# and# reproductive#phenotypes#of#mice#lacking#estrogen#receptor#beta.# Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#1998;#95:#15677—82.# 270.#Nelson#RJ,#Trainor#BC.#Neural#mechanisms#of#aggression.# Nat#Rev#Neurosci#2007;#8:#536—46.# 271.#Kruk#MR.#Ethology#and#pharmacology#of#hypothalamic#aggression#in#the#rat.# Neurosci#Biobehav#Rev#1991;#15:#527—38.# 272.# de# Bruin# JP,# van# Oyen# HG,# Van# de# Poll# N.# Behavioural# changes# following# lesions#of#the#orbital#prefrontal#cortex#in#male#rats.# Behav#Brain#Res#1983;#10:#209—32.# 273.#Swanson#LW.#Cerebral#hemisphere#regulation#of#motivated#behavior.# Brain#Res#2000;#886:#113—64.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 141# brez(gena(SF;1# 274.# Chiavegatto# S,# Dawson# VL,# Mamounas# LA,# Koliatsos# VE,# Dawson# TM,# et# al.# Brain#serotonin#dysfunction#accounts#for#aggression#in#male#mice#lacking#neuronal# nitric#oxide#synthase.#Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#2001;#98:#1277—81.# 275.# Miczek# KA,# Maxson# SC,# Fish# EW,# Faccidomo# S.# Aggressive# behavioral# phenotypes#in#mice.#Behav#Brain#Res#2001;#125:#167—81.# 276.#Zhuang#X,#Gross#C,#Santarelli#L,#Compan#V,#Trillat#AC,#et#al.#Altered#emotional# states# in# knockout# mice# lacking# 5;HT1A# or# 5;HT1B# receptors.# Neuropsychopharmacology#1999;#21:#52S—60S.# 277.#Soriano#MF,#Jimenez#JF,#Roman#P,#Bajo#MT.#Inhibitory#processes#in#memory# are#impaired#in#schizophrenia:#evidence#from#retrieval#induced#forgetting.# Br#J#Psychol#2009;#100:#661—73.# 278.#Jimenez#JA,#Mancini;Marie#A,#Lakis#N,#Rinaldi#M,#Mendrek#A.#Disturbed#sexual# dimorphism#of#brain#activation#during#mental#rotation#in#schizophrenia.# Schizophr#Res#2010;#122:#53—62.# 279.#Bosco#A,#Longoni#AM,#Vecchi#T.#Gender#effects#in#spatial#orientation:#cognitive# profiles#and#mental#strategies.#Appl#Cogn#Psychol#2004;#18:#519—32.# 280.# Clayton# JA,# Collins# FS.# Policy:# NIH# to# balance# sex# in# cell# and# animal# studies.# Nature#2014;#509:#282—3.# 281.# McCullough# LD,# McCarthy# MM,# de# Vries# GJ.# NIH# policy:# status# quo# is# also# costly.#Nature#2014;#510:#340.# 282.# Dominguez;Salazar# E,# Bateman# HL,# Rissman# EF.# Background# matters:# the# effects# of# estrogen# receptor# alpha# gene# disruption# on# male# sexual# behavior# are# modified#by#background#strain.#Horm#Behav#2004;#46:#482—90.# 283.#National#Center#for#Biotechnology#Information.#Uty,#ubiquitously#transcribed# tetratricopeptide#repeat#gene,#Y#chromosome.# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_009484#(11.11.2014)# 284.# National# Center# for# Biotechnology# Information.# Eif2s3y,# eukaryotic# translation#initiation#factor#2,#subunit#3,#structural#gene#Y;linked.## http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/26908#(11.11.2014)# 285.# National# Center# for# Biotechnology# Information.# Ddx3y,# DEAD# (Asp;Glu;Ala; Asp)#box#polypeptide#3,#Y;linked.# #http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/26900#(11.11.2014)# # 142# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# # 286.# National# Center# for# Biotechnology# Information.# Kdm5d;# lysine# (K);specific# demethylase#5D.# #http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/20592#(11.11.2014)# 287.# National# Center# for# Biotechnology# Information.# Xist;# inactive# X# specific# transcripts.## http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/213742#(11.11.2014)# 288.#National#Center#for#Biotechnology#Information.#Actb;#actin,#beta.# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11461#(11.11.2014)# 289.# National# Center# for# Biotechnology# Information.# Utx,# lysine# (K);specific# demethylase#6.# #http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22289#(11.11.2014)# 290.#Edelmann#M,#Wolfe#C,#Scordalakes#EM,#Rissman#EF,#Tobet#S.#Neuronal#nitric# oxide# synthase# and# calbindin# delineate# sex# differences# in# the# developing# hypothalamus#and#preoptic#area.#Dev#Neurobiol#2007;#67:#1371—81.# 291.#Paxinos#G,#Franklin#KBJ.#The#mouse#brain#in#stereotaxic#coordinates.#Compact# 2nd#ed.#Amsterdam#;#Boston:#Elsevier#Academic#Press,#2004:5—45.### 292.# Paxinos# G,# Franklin# KBJ,# Franklin# KBJ.# The# mouse# brain# in# stereotaxic# coordinates.#2nd#ed.#San#Diego:#Academic#Press,#2001:#16.### 293.#Caligioni#CS.#Assessing#reproductive#status/stages#in#mice.# Curr#Protoc#Neurosci#2009;#Appendix#4:#(11#str.).# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2755182/#(06.05.2015)# 294.#Sinchak#K,#Micevych#PE.#Progesterone#blockade#of#estrogen#activation#of#mu; opioid#receptors#regulates#reproductive#behavior.#J#Neurosci#2001;#21:#5723—9.# 295.#Grgurevič#N.#Genetsko#pogojene#razlike#med#obnašanjem#samcev#in#samic#pri# miših# brez# gena# za# steroidogeni# faktor# 1.# Ljubljana:# Univerza# v# Ljubljani,# Veterinarska#fakulteta,#2011.#Doktorska#disertacija.# 296.#Crawley#JN.#Reproductive#behavior.#In:#Crawley#JN,#ed.#What's#wrong#with#my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic# and# knockout# mice:# 2nd# ed.# Hoboken:#Wiley;Interscience,#2007:#190—2.# 297.# Crawley# JN.# What's# wrong# with# my# mouse?:# behavioral# phenotyping# of# transgenic#and#knockout#mice.#New#York:#Wiley;Liss,#2000:#167—79.## # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 143# brez(gena(SF;1# 298.#Pfaffl#MW.#A#new#mathematical#model#for#relative#quantification#in#real;time# RT;PCR.#Nucleic#Acids#Res#2001;#29:#e45#(6#str).# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC55695/##(06.05.2015)# 299.# Vandesompele# J,# De# Preter# K,# Pattyn# F,# Poppe# B,# Van# Roy# N,# et# al.# Accurate# normalization# of# real;time# quantitative# RT;PCR# data# by# geometric# averaging# of# multiple#internal#control#genes.#Genome#Biol#2002;#3:#(7#str).# http://genomebiology.com/2002/3/7/research/0034#(06.05.2015)# 300.# Bustin# SA,# Benes# V,# Garson# JA,# Hellemans# J,# Huggett# J,# et# al.# The# MIQE# guidelines:# minimum# information# for# publication# of# quantitative# real;time# PCR# experiments.#Clin#Chem#2009;#55:#611—22.# 301.#Xu#J,#Deng#X,#Watkins#R,#Disteche#CM.#Sex;specific#differences#in#expression#of# histone#demethylases#Utx#and#Uty#in#mouse#brain#and#neurons.# J#Neurosci#2008;#28:#4521—7.# 302.#"Razlika".#Slovar#slovenskega#knjižnega#jezika.## http://bos.zrc;sazu.si/cgi/a03.exe?name=sskj_testa&expression=razlika&hs=1# (15.1.2015)# 303.#Arnold#AP,#Lusis#AJ.#Understanding#the#sexome:#measuring#and#reporting#sex# differences#in#gene#systems.#Endocrinology#2012;#153:#2551—5.# 304.#Arnold#AP.#The#end#of#gonad;centric#sex#determination#in#mammals.# Trends#Genet#2012;#28:#55—61.# 305.#Arnold#AP.#The#organizational;activational#hypothesis#as#the#foundation#for#a# unified#theory#of#sexual#differentiation#of#all#mammalian#tissues.# Horm#Behav#2009;#55:#570—8.# 306.# Corpechot# C,# Robel# P,# Axelson# M,# Sjovall# J,# Baulieu# EE.# Characterization# and# measurement#of#dehydroepiandrosterone#sulfate#in#rat#brain.## Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#1981;#78:#4704—7.# 307.#Corpechot#C,#Synguelakis#M,#Talha#S,#Axelson#M,#Sjovall#J,#et#al.#Pregnenolone# and#its#sulfate#ester#in#the#rat#brain.#Brain#Res#1983;#270:#119—25.# 308.#Robel#P,#Baulieu#EE.#Neurosteroids#Biosynthesis#and#function.## Trends#Endocrinol#Metab#1994;#5:#1—8.# # 144# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 309.# Spanic# T,# Fabjan# T,# Majdic# G.# Expression# levels# of# mRNA# for# neurosteroidogenic# enzymes# 17beta;HSD,# 5alpha;reductase,# 3alpha;HSD# and# cytochrome#P450#aromatase#in#the#fetal#wild#type#and#SF;1#knockout#mouse#brain.# Endocr#Res#2015;#40:#44—8.# 310.#Baulieu#EE.#Neurosteroids:#a#new#function#in#the#brain.## Biol#Cell#1991;#71:#3—10.# 311.#Plassart;Schiess#E,#Baulieu#EE.#Neurosteroids:#recent#findings.#Brain#Res#Brain# Res#Rev#2001;#37:#133—40.# 312.# Soma# KK,# Alday# NA,# Hau# M,# Schlinger# BA.# Dehydroepiandrosterone# metabolism# by# 3beta;hydroxysteroid# dehydrogenase/Delta5;Delta4# isomerase# in# adult#zebra#finch#brain:#sex#difference#and#rapid#effect#of#stress.## Endocrinology#2004;#145:#1668—77.# 313.# Eicher# EM,# Lee# BK,# Washburn# LL,# Hale# DW,# King# TR.# Telomere;related# markers#for#the#pseudoautosomal#region#of#the#mouse#genome.# Proc#Natl#Acad#Sci#U#S#A#1992;#89:#2160—4.# 314.# Burgoyne# PS,# Mahadevaiah# SK,# Perry# J,# Palmer# SJ,# Ashworth# A.# The# Y*# rearrangement#in#mice:#new#insights#into#a#perplexing#PAR.# Cytogenet#Cell#Genet#1998;#80:#37—40.# 315.#Reinius#B,#Shi#C,#Hengshuo#L,#Sandhu#KS,#Radomska#KJ,#et#al.#Female;biased# expression# of# long# non;coding# RNAs# in# domains# that# escape# X;inactivation# in# mouse.#BMC#Genomics#2010;#11:#e614#(16#str).# http://www.biomedcentral.com/1471;2164/11/614/#(06.05.2015)# 316.# Ehrmann# IE,# Ellis# PS,# Mazeyrat# S,# Duthie# S,# Brockdorff# N,# et# al.# Characterization# of# genes# encoding# translation# initiation# factor# eIF;2gamma# in# mouse# and# human:# sex# chromosome# localization,# escape# from# X;inactivation# and# evolution.#Hum#Mol#Genet#1998;#7:#1725—37.# 317.#Agulnik#AI,#Mitchell#MJ,#Mattei#MG,#Borsani#G,#Avner#PA,#et#al.#A#novel#X#gene# with#a#widely#transcribed#Y;linked#homologue#escapes#X;inactivation#in#mouse#and# human.#Hum#Mol#Genet#1994;#3:#879—84.# # # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 145# brez(gena(SF;1# 318.# Armoskus# C,# Mota# T,# Moreira# D,# Tsai# HW.# Effects# of# prenatal# testosterone# exposure#on#sexually#dimorphic#gene#expression#in#the#neonatal#mouse#cortex#and# hippocampus.#J#Steroids#Horm#Sci#2014;#5:e139#(22#str).# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25411648#(06.05.2015)# 319.# Disteche# CM,# Filippova# GN,# Tsuchiya# KD.# Escape# from# X# inactivation.# Cytogenet#Genome#Res#2002;#99:#36—43.# 320.#Brown#CJ,#Greally#JM.#A#stain#upon#the#silence:#genes#escaping#X#inactivation.# Trends#Genet#2003;#19:#432—8.# 321.#Dohanich#GP,#Clemens#LG.#Inhibition#of#estrogen;activated#sexual#behavior#by# androgens.#Horm#Behav#1983;#17:#366—73.# 322.# Blasberg# ME,# Clark# AS.# Anabolic;androgenic# steroid# effects# on# sexual# receptivity#in#ovariectomized#rats.#Horm#Behav#1997;#32:#201—8.# 323.# Tsukahara# S,# Yamanouchi# K.# Distribution# of# glutamic# acid# decarboxylase,# neurotensin,# enkephalin,# neuropeptide# Y,# and# cholecystokinin# neurons# in# the# septo;preoptic#region#of#male#rats.#J#Reprod#Dev#2003;#49:#67—77.# 324.#Rissman#EF,#Early#AH,#Taylor#JA,#Korach#KS,#Lubahn#DB.#Estrogen#receptors# are#essential#for#female#sexual#receptivity.#Endocrinology#1997;#138:#507—10.# 325.# Grgurevic# N,# Budefeld# T,# Spanic# T,# Tobet# SA,# Majdic# G.# Evidence# that# sex# chromosome#genes#affect#sexual#differentiation#of#female#sexual#behavior.# Horm#Behav#2012;#61:#719—24.# 326.# Mannan# MA,# O'Shaughnessy# PJ.# Steroidogenesis# during# postnatal# development#in#the#mouse#ovary.#J#Endocrinol#1991;#130:#101—6.# 327.#Tsukahara#S,#Kanaya#M,#Yamanouchi#K.#Neuroanatomy#and#sex#differences#of# the#lordosis;inhibiting#system#in#the#lateral#septum.# Front#Neurosci#2014;#8:#e299#(24#str).# http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4166118/#(06.05.2015)# 328.# Brock# O,# Baum# MJ,# Bakker# J.# The# development# of# female# sexual# behavior# requires#prepubertal#estradiol.#J#Neurosci#2011;#31:#5574—8.# 329.#Albert#DJ,#Wong#RC.#Hyperreactivity,#muricide,#and#intraspecific#aggression#in# the# rat# produced# by# infusion# of# local# anesthetic# into# the# lateral# septum# or# surrounding#areas.#J#Comp#Physiol#Psychol#1978;#92:#1062—73.# # 146# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# # 330.#Albert#DJ.#Hyperreactivity#following#temporary#chemical#lesions#in#the#region# ventral#to#the#anterior#septum#but#not#in#the#anterior#olfactory#nucleus,#the#lateral# olfactory#tract,#or#the#olfactory#bulb.#Physiol#Behav#1980;#25:#481—3.# 331.# Van# De# Poll# NE,# Van# Dis# H.# The# effect# of# medial# preoptic;;anterior# hypothalamic#lesions#on#bisexual#behavior#of#the#male#rat.# Brain#Res#Bull#1979;#4:#505—11.# 332.#Hennessey#AC,#Wallen#K,#Edwards#DA.#Preoptic#lesions#increase#the#display#of# lordosis#by#male#rats.#Brain#Res#1986;#370:#21—8.# 333.# Kakeyama# M,# Yamanouchi# K.# Lordosis# in# male# rats:# the# facilitatory# effect# of# mesencephalic#dorsal#raphe#nucleus#lesion.#Physiol#Behav#1992;#51:#181—4.# 334.#McCarthy#MM,#Arnold#AP.#Reframing#sexual#differentiation#of#the#brain.# Nat#Neurosci#2011;#14:#677—83.# 335.# Arnold# AP.# Conceptual# frameworks# and# mouse# models# for# studying# sex# differences#in#physiology#and#disease:#why#compensation#changes#the#game.# Exp#Neurol#2014;#259:#2—9.# 336.# Cox# KH,# Bonthuis# PJ,# Rissman# EF.# Mouse# model# systems# to# study# sex# chromosome#genes#and#behavior:#relevance#to#humans.# Front#Neuroendocrinol#2014;#35:#405—19.# 337.# Budefeld# T,# Grgurevič# N,# Tobet# SA,# Majdič# G.# Sex# differences# in# brain# developing#in#the#presence#or#absence#of#gonads.## Dev#Neurobiol#2008;#68:#981—95.# 338.#Budefeld#T,#Tobet#SA,#Majdic#G.#Altered#position#of#cell#bodies#and#fibers#in#the# ventromedial#region#in#SF;1#knockout#mice.#Exp#Neurol#2011;#232:#176—84.# 339.#Dellovade#TL,#Young#M,#Ross#EP,#Henderson#R,#Caron#K,#et#al.#Disruption#of#the# gene#encoding#SF;1#alters#the#distribution#of#hypothalamic#neuronal#phenotypes.# J#Comp#Neurol#2000;#423:#579—89.# 340.# Majdic# G,# Tobet# S.# Cooperation# of# sex# chromosomal# genes# and# endocrine# influences# for# hypothalamic# sexual# differentiation.# Front# Neuroendocrinol# 2011;# 32:#137—45.# # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 147# brez(gena(SF;1# 341.# vom# Saal# FS.# Prenatal# exposure# to# androgen# influences# morphology# and# aggressive#behavior#of#male#and#female#mice.#Horm#Behav#1979;#12:#1—11.# 342.# Whitsett# JM,# Bronson# FH,# Peters# PJ,# Hamilton# TH.# Neonatal# organization# of# aggression#in#mice:#correlation#of#critical#period#with#uptake#of#hormone.# Horm#Behav#1972;#3:#11—21.# 343.#Toda#K,#Saibara#T,#Okada#T,#Onishi#S,#Shizuta#Y.#A#loss#of#aggressive#behaviour# and#its#reinstatement#by#oestrogen#in#mice#lacking#the#aromatase#gene#(Cyp19).#J# Endocrinol#2001;#168:#217—20.# 344.# Simerly# RB,# Chang# C,# Muramatsu# M,# Swanson# LW.# Distribution# of# androgen# and# estrogen# receptor# mRNA;containing# cells# in# the# rat# brain:# an# in# situ# hybridization#study.#J#Comp#Neurol#1990;#294:#76—95.# 345.# Mitra# SW,# Hoskin# E,# Yudkovitz# J,# Pear# L,# Wilkinson# HA,# et# al.# Immunolocalization# of# estrogen# receptor# beta# in# the# mouse# brain:# comparison# with#estrogen#receptor#alpha.#Endocrinology#2003;#144:#2055—67.# 346.#Sato#S,#Braham#CS,#Putnam#SK,#Hull#EM.#Neuronal#nitric#oxide#synthase#and# gonadal# steroid# interaction# in# the# MPOA# of# male# rats:# co;localization# and# testosterone;induced#restoration#of#copulation#and#nNOS;immunoreactivity.# Brain#Res#2005;#1043:#205—13.# 347.# Stuart# E,# Lephart# ED.# Dimorphic# expression# of# medial# basal# hypothalamic; preoptic# area# calbindin;D(28K)# mRNA# during# perinatal# development# and# adult# distribution#of#calbindin;D(28K)#mRNA#in#Sprague;Dawley#rats.# Brain#Res#Mol#Brain#Res#1999;#73:#60—7.# 348.# Lephart# ED.# Dimorphic# expression# of# calbindin;D28K# in# the# medial# basal# hypothalamus#from#perinatal#male#and#female#rats.# Brain#Res#Dev#Brain#Res#1996;#96:#281—4.# 349.# Brager# DH,# Sickel# MJ,# McCarthy# MM.# Developmental# sex# differences# in# calbindin;D(28K)# and# calretinin# immunoreactivity# in# the# neonatal# rat# hypothalamus.#J#Neurobiol#2000;#42:#315—22.# # # 148# T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov( miši(brez(gena(SF;1# 350.#Sickel#MJ,#McCarthy#MM.#Calbindin;D28k#immunoreactivity#is#a#marker#for#a# subdivision# of# the# sexually# dimorphic# nucleus# of# the# preoptic# area# of# the# rat:# developmental#profile#and#gonadal#steroid#modulation.# J#Neuroendocrinol#2000;#12:#397—402.# 351.# Orikasa# C,# Kondo# Y,# Sakuma# Y.# Transient# transcription# of# the# somatostatin# gene# at# the# time# of# estrogen;dependent# organization# of# the# sexually# dimorphic# nucleus#of#the#rat#preoptic#area.#Endocrinology#2007;#148:#1144—9.# 352.# Bodo# C,# Rissman# EF.# The# androgen# receptor# is# selectively# involved# in# organization#of#sexually#dimorphic#social#behaviors#in#mice.# Endocrinology#2008;#149:#4142—50.# 353.#Orikasa#C,#Sakuma#Y.#Estrogen#configures#sexual#dimorphism#in#the#preoptic# area#of#C57BL/6J#and#ddN#strains#of#mice.#J#Comp#Neurol#2010;#518:#3618—29.# 354.# Arendash# GW,# Gorski# RA.# Suppression# of# lordotic# responsiveness# in# the# female#rat#during#mesencephalic#electrical#stimulation.## Pharmacol#Biochem#Behav#1983;#19:#351—7.# 355.#Houtsmuller#EJ,#Brand#T,#de#Jonge#FH,#Joosten#RN,#van#de#Poll#NE,#et#al.#SDN; POA# volume,# sexual# behavior,# and# partner# preference# of# male# rats# affected# by# perinatal#treatment#with#ATD.#Physiol#Behav#1994;#56:#535—41.# 356.# Wang# Z,# Bullock# NA,# De# Vries# GJ.# Sexual# differentiation# of# vasopressin# projections# of# the# bed# nucleus# of# the# stria# terminals# and# medial# amygdaloid# nucleus#in#rats.#Endocrinology#1993;#132:#2299—306.# 357.#Budefeld#T.#Gensko#pogojene#razlike#med#spoloma#pri#urejanju#telesne#teže#in# izraženosti# genov# v# vmesnih# možganih# pri# miših# brez# gena# za# SF;1.# Ljubljana:# Univerza#v#Ljubljani,#Veterinarska#fakulteta,#2009.#Doktorska#disertacija.# # # # T.#Španić:# Hormonsko(odvisna(in(hormonsko(neodvisna(spolna(diferenciacija(možganov(miši( 149# brez(gena(SF;1# # #