I-139 Strokovni prispevek/Professional article DOLOČANJE PLODOVE KRVNE SKUPINE MED NOSEČNOSTJO DETERMINATION OF FETAL BLOOD GROUP IN PREGNANCY Irena Bricl1, Tadeja Dovč-Drnovšek1, Tanja Blejec2, Primož Rožman1 1 Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana 2 Klinični oddelek za perinatologijo, Ginekološka klinika, Klinični center, Šlajmerjeva 3, 1000 Ljubljana Prispelo 2004-02-13, sprejeto 2004-03-10; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 139–42 Key words: genotyping, blood group antigens, RhD, peri- pheral blood of pregnant woman Abstract – Background. Prenatal diagnostics with the ge- notyping using the PCR analysis of the fetal DNA holds an important place in modern gynaecology. Lately, noninvasive fetal genotyping became feasible after fetal DNA was proven and isolated from the peripherral blood of the mother. Methods. Peripherral blood samples of ninety-six RhD nega- tive women in their 23–33 week of pregnancy were collected and the DNA of the fetus isolated with the modified method of Finning et al. Fetal RHD genotype was than determined with real time PCR method using the ABI Prism 7900 Sequence Detection System. The presence of the three parts of the RHD gene, intron 4, exon 7 as well as 10, was assesed. In order to confirm the presence of fetal DNA, the presence of the SRY gene was used with male fetuses. If the PCR reaction results of the RHD and SRY gene were negative, we assumed that the fetus was a female whose RhD was negative. In order to verify that, a presence of eight chosen polymorphic alleles was deter- mined from the the DNA samples of the mother and from her plasma, thus indirectly confirming that it was the DNA of the fetus which was being tested. Results. In this research we accuratly predicted the genotype and gender of the fetuses of 96 RhD negative pregnant women from their peripheral blood. The predicted results of the research were compared with the actual gender and RhD phenotype of the newborn, that were determined at birth. Our accuracy in predicting the gender and the presence of the RHD gene using our real-time PCR method was 100%. Conclusions. We anticipate the fetal genotype, determined on the basis of the fetal DNA being present in the peripheral blood of the mother, to take on a leading role in prenatal investigations, especially in cases of RhD immunisation during pregnancy and in prevention of RhD immunisation with anti-D immunoglobulin in the 28th week of pregnancy. Ključne besede: genotipizacija; krvnoskupinski antigeni; RhD; periferna kri nosečnice Izvleček – Izhodišča. Prenatalna diagnostika z genotipizaci- jo plodove deoksiribonukleinske kisline (DNK) zavzema po- membno mesto v modernem porodništvu. V zadnjem času je možno iz venske krvi matere osamiti plodovo DNK, kar omo- goča neinvazivno prenatalno genotipizacijo. Material in metode. V 23. do 33. tednu nosečnosti smo 96 RhD-negativnim nosečnicam odvzeli vensko kri, iz nje osa- mili plodovo DNK s prilagojenim načinom po Finningu s sod. in določili plodov genotip RHD. Detekcijo gena RHD smo izvedli z metodo PCR v realnem času na instrumentu ABI Prism 7900 Sequence Detection System. Določali smo prisotnost treh delov genskega zapisa gena RHD, tj. introna 4, eksona 7 in eksona 10. Za potrditev, da gre za plodovo DNK, smo pri moških plodih sklepali na podlagi prisotnosti gena SRY. Če sta bila rezultata PCR reakcije za gena RHD in SRY negativna, smo sklepali, da nosi nosečnica plod ženskega spola, ki je RhD-negativen. V teh primerih smo za potrditev, da gre za plodovo DNK, določali še prisotnost osmih naključnih polimorfnih alelov iz vzorca DNK matere in vzorca DNK plo- da iz materine plazme in tako posredno potrdili, da je šlo za plodovo DNK. Rezultati. V raziskavi smo 96-im RhD-negativnim nosečni- cam iz vzorca venske krvi pravilno napovedali plodov geno- tip RHD in njegov spol. Napovedane rezultate preiskav smo primerjali z dejanskim spolom in fenotipom RhD novoro- jenčka, ki smo ju določili po rojstvu. Natančnost napovedi spola in prisotnosti gena RHD z našo metodo PCR v realnem času je bila 100%. Zaključki. Pričakujemo, da bo določitev plodovega genotipa na podlagi proste DNK v periferni krvi nosečnice zavzela po- membno mesto v prenatalnih preiskavah, še posebno v pri- merih imunizacije na RhD antigen med nosečnostjo in pri izvajanju predporodne preventive z imunoglobulinom anti- D v 28. tednu nosečnosti. Uvod Prenatalna diagnostika s preiskavami plodove deoksiribonu- kleinske kisline (DNK) zavzema pomembno mesto v moder- nem porodništvu. Za pridobitev plodovih celic in DNK sta bila še do nedavnega potrebna invazivna postopka amniocenteza in biopsija horionskih resic, ki predstavljata določeno tveganje za nosečnico in plod (1). V zadnjem času so odkrili, da se v periferni krvi nosečnice nahajajo tudi celice ploda in celo nje- ZDRAV VESTN 2004; 73: I-139–42 I-140 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I gova prosta DNK, kar je odprlo možnosti za neinvazivno pre- natalno diagnostiko (2, 3). Ker so plodove celice v krvi no- sečnice maloštevilne in postopki njihove osamitve zahtevni, celice pa včasih v krvnem obtoku obstanejo še desetletja po porodu, celična DNK ni najprimernejša za rutinsko diagnosti- ko (4, 5). Šele po odkritju večje količine proste plodove DNK in ribonukleinske kisline (RNK) v krvi nosečnice, sta DNK in RNK postali lahko dostopen vir plodovega genskega materi- ala (6, 7). V prenatalni diagnostiki ima pomembno vlogo določitev pri- sotnosti plodovih krvnoskupinskih genov oziroma njihovih ale- lov. Še posebej je pomembna njihova določitev v primerih imunizacije nosečnice in posledične hemolitične bolezni plo- da in novorojenčka (HBPN), ki nastane zaradi skrajšane živ- ljenjske dobe plodovih oziroma novorojenčkovih eritrocitov. Hemolizo povzročijo eritrocitna protitelesa razreda IgG v krvi nosečnice, ki prehajajo skozi posteljico v plodov krvni obtok in se vežejo na eritrocitne antigene, podedovane od očeta (8, 9). Za hudo obliko HBPN so najpogosteje odgovorna protite- lesa anti-D. HBPN lahko povzročijo še številna druga protitele- sa; najpogosteje so to protitelesa specifičnosti anti-A in anti-B, sledijo anti-K, anti-c in anti-E. Poleg teh so opisani tudi bolj ali manj številni primeri protiteles drugih specifičnosti, kot so npr. anti-Cw, -Cx, -C, -e, -ce, -k, -Kpa, -Kpb, -Jsa, -Jsb, -Fya, -Fyb, -Jka, -Jkb, -M, -N, -S, -s, -Lw, -U, -Lea in -Leb (10, 11). Določitev plodovega genotipa RHD je pomembna za vodenje nosečnosti pri RhD-negativnih nosečnicah, imuniziranih na an- tigen RhD predvsem takrat, ko je partner heterozigot za anti- gen RhD, torej je lahko plod RhD-pozitiven ali -negativen (12). Določitev plodovega genotipa RHD pri RhD-negativnih no- sečnicah bi v prihodnosti lahko imela pomembno vlogo tudi pri odločitvi o predporodni zaščiti z imunoglobulinom (Ig) an- ti-D v 28. tednu nosečnosti. V zadnjem času so razvili izjemno občutljive metode za ugo- tavljanje proste DNK ploda v periferni krvi nosečnice. Med njimi je najbolj zanesljiva metoda verižne reakcije s polimera- zo v realnem času (real-time PCR) (6). Namen naše raziskave je bil razvoj in uvedba zgornje metode, ki bi omogočala določiti plodov genotip RHD iz venske krvi RhD-negativne nosečnice. Material in metode Vzorci krvi nosečnic in novorojenčkov V 23. do 33. tednu nosečnosti smo 96 RhD-negativnim nosečni- cam odvzeli 6–10 mL venske krvi v epruveto z antikoagulan- tom (EDTA). Iz teh vzorcev smo najprej napravili običajne serološke preiskave pred vbrizgavanjem preventivnega od- merka IgG anti-D, nato pa iz njih osamili plodovo DNK in iz nje določili njegov RHD genotip. Po porodu smo prejeli podatek o novorojenčkovem spolu in nato iz vzorca popkovnične krvi z načinom v gelu določili krvno skupino ABO in RhD. Od vseh odvzetih in testiranih vzorcev je imelo šest nosečnic prisotna protitelesa anti-D. Vse nosečnice so podpisale pristopno izja- vo za sodelovanje v raziskavi, ki jo je odobrila republiška Komi- sija za medicinsko etiko. Osamitev DNK iz plazme Za osamitev DNK smo uporabili način po Finningu s sod. (13). Vzorec venske krvi nosečnice smo najkasneje 24 ur po odvze- mu centrifugirali 10 minut pri 2500 × g. Plazmo smo previdno odstranili v novo epruveto, ne da bi se dotaknili plasti mononu- klearnih celic, preostanek krvi pa smo shranili na –20oC za morebitne nadaljnje preiskave. Plazmo smo nato 10 minut cen- trifugirali pri 10000 × g. Supernatant smo prenesli v novo tubo in ga do uporabe shranili na –20 °C. DNK smo osamili iz 600– 800 µL supernatanta plazme s pomočjo pripravka QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) po navodilih proiz- vajalca. DNK smo eluirali v 70 µl vode in jo takoj preskusili. Osamitev DNK iz popkovnične krvi ter preostale materine venske krvi smo ravno tako osamilii s pomočjo pripravka QI- Aamp Blood Mini Kit. PCR v realnem času Ugotovitev gena RHD DNK, ki smo ga osamili iz plazme no- sečnice, smo izvedli z metodo PCR v realnem času z napravo ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Bio- systems, Foster City, USA), ki je kombinacija termalnega po- množevalca DNK in detektorja fluorescence. Z metodo PCR v realnem času lahko optično spremljamo pomnoževanja žele- nega zaporedja DNK (6, 14). Metoda temelji na 5'-3' nukleazni aktivnosti Taq polimeraze (Thermofilus aquaticus) (15), ki od- ceplja fluorescentni reporter s hibridizirane sonde (16). Začet- ne oligonukleotide in sonde, označene s fluorescentnim re- porterjem VIC ali FAM (na 5') in dušilcem signala (quencher) MGB (minor groove binder) ali TAMRA (na 3'), smo izbrali s pomočjo programa primer Express Software 2.0 (Applied Bio- systems, Foster City, USA), pripravili pa so jih v Applied Bio- systems (Applied Biosystems, Warrington, GB). Reakcijske mešanice za PCR v realnem času smo pripravili v ploščah s 96 vdolbinicami. 20 µL reakcijske mešanice je vsebo- valo dva začetna oligonukleotida in sondo oziroma štiri začet- ne oligonukleotide in dve sondi pri t. i. dupleks reakciji PCR, vodo, univerzalno mešanico reagentov za PCR (Universal PCR Mastermix; Applied Biosystems, Foster City, USA) in 5 µL DNK. Vsak vzorec smo preskusili v dvojniku oziroma v trojniku. Re- akcijski pogoji so bili enaki za vse PCR reakcije, in sicer 50 oC za 2 minuti, 95 oC za 10 minut, nato 45 ponovitev na 95 oC za 15 sekund in 60 oC za 1 minuto. Rezultate pomnoževanja smo ovrednotili s programom Sequ- ence Detector System 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Antikontaminacijski ukrepi, pozitivna in negativna kontrola Za preprečitev lažno pozitivnih rezultatov in kontaminacije med posameznimi postopki smo upoštevali stroge preventiv- ne ukrepe (17–19). Pri vsaki preiskavi smo vključili tudi več slepih poizkusov z vodo. Za pozitivno kontrolo prisotnosti DNK smo pomnožili del ge- na za humani serumski albumin. Zaporedje začetnih oligonu- kleotidov in sonde za albumin smo izbrali s programom Pri- mer Express (Applied Biosystems, Foster City, USA) na osnovi nukleotidnega zaporedja iz baze podatkov genske banke (Gen- Bank M12523). Koncentracije začetnih oligonukleotidov in sonde so bile 200 nM in 75 nM. Ugotavljanje gena RHD Z metodo PCR v realnem času smo določali prisotnost več delov gena RHD, in sicer introna 4, eksona 7 in eksona 10.  Z detekcijo omenjenih treh regij namreč znatno povečamo pravilno napovedno vrednost prisotnosti antigena RhD pri kavkazijcih (20). Zaporedje začetnih oligonukleotidov in sonde smo izbrali s programom Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, USA) na podlagi nukleotidnega zaporedja iz baze podatkov genske banke (za intron 4: GenBank Y10605; za eksona 7 in 10: GenBank X63097). Koncentracije začetnih oligonukleotidov in sonde za detekcijo introna 4 so bile 400 nM in 150 nM, za detekcijo eksona 7 350 nM in 250 nM, za detekcijo eksona 10 pa 300 nM in 100 nM. Pomnoževalna reakcija za detekcijo eksona 7 in eksona 10 je bila narejena v skupni reakcijski vdolbinici – s t. i. dupleks re- akcijo. I-141 Za pozitiven rezultat – tj. prisotnost nukleotidnega zaporedja na DNK, ki smo ga preskusili v krvi matere – smo se odločili, če sta bili dve reakciji od treh za določeno zaporedje na DNK pozitivni. Ugotavljanje gena SRY, prisotnega pri plodu moškega spola Za potrditev prisotnosti proste plodove DNK smo v vseh pre- skušenih vzorcih določali tudi prisotnost gena SRY, ki se nahaja samo na moškem kromosomu Y. Na ta način smo v primeru negativnega rezultata za gen RHD potrdili prisotnost plodove DNK (6). Zaporedje začetnih oligonukleotidov in sonde smo izbrali s programom Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, USA) na osnovi nukleotidnega zaporedja iz baze podatkov gen- ske banke (GenBank L08063). Koncentracije začetnih oligonukleotidov in sonde so bile 300 nM in 100 nM. Ugotavljanje genetičnih označevalcev pri RHD-negativnem plodu ženskega spola Če sta bila rezultata PCR reakcije za gena RHD in SRY negativ- na, smo sklepali, da ima nosečnica plod ženskega spola, ki je RHD-negativen. Za potrditev, da smo v teh primerih dejansko preiskovali prosto plodovo DNK, ne pa materine, smo izbrali naslednji način: iz objavljenih podatkov po Alizadeh s sod. 2002 smo izbrali osem bialelnih polimorfizmov (S 01a, S 03, S 04a, S 05b, S 06, S 08b, S 10a in S 11a) z velikim odstotkom heterozigotnosti (21). Nosečnicam, ki naj bi nosile RHD-negativen plod ženskega spola, smo iz DNK venske krvi določali prisotnost vseh osmih izbranih alelov. V primeru, ko smo našli v vzorcih DNK, doblje- nih iz materine plazme, vsaj en alel, ki ga v vzorcu DNK, dob- ljenem na standarden način iz mononuklearnih celic (MNC) matere ni bilo, smo lahko sklepali, da je to plodov alel. S tem smo potrdili, da gre za plodovo DNK. Vse te rezultate smo preverili tudi na DNK novorojenčka, dobljeni po rojstvu. Rezultati V raziskavi smo 96 RhD-negativnim nosečnicam iz vzorca ven- ske krvi napovedali plodov genotip RHD in njegov spol. Na- povedane rezultate preiskav smo primerjali z dejanskim spo- lom in fenotipom RhD novorojenčka, ki smo ju določili po rojstvu. Natančnost napovedi spola in prisotnosti gena RHD s PCR v realnem času je bila 100% (Razpr. 1). RhD-pozitivnih moških smo napovedali 41, RhD-pozitivnih žensk 25, RhD- negativnih moških pa 15. Razpr. 1. Natančnost napovedi genotipa RHD in spola ploda iz materine plazme kot vira fetalne DNK. Table 1. The accuracy of prediction of fetal RHD genotype and gender from maternal plasma as a source of fetal DNA. Število napove- Število napove- Natančnost geno- danih RHD+ danih RHD– tipizacije RHD No. of No. of Accuracy of predicted RHD+ predicted RHD– RHD genotyping Število Moški Ženska Moški Ženska (%)Number Male Female Male Female 96 41 25 15 15 100 V 15 (15,6%) primerih so bili izsledki PCR reakcije za gen RHD in SRY negativni, zato smo sklepali, da gre za plod, ki je RhD-negativna deklica. Pri teh 15 primerih smo z določitvijo izbranih osmih alelov po Alizadeh s sod. 2002 v 14 primerih zasledili vsaj en plodov alel. Le v enem primeru nismo dokazali prisotnosti plodovega (očetovega) alela. Vseh petnajst no- sečnic je dejansko rodilo RhD-negativne deklice. Prišli smo tudi do zanimivih rezultatov. Tako sta dve od 96 nosečnic nosili dvojčke. Z analizo njunih vzorcev krvi smo pri obeh napovedali vsaj enega RhD-pozitivnega dečka. Obe sta rodili po dva RhD-pozitivna dečka. Pri šestih nosečni- cah s protitelesi anti-D smo pravilno predvideli RhD-pozitiven plod moškega spola, pri eni pa RhD-pozitiven plod ženskega spola. Razpravljanje Prednost določitve plodovega genotipa RHD iz materine pla- zme je v tem, da niti nosečnica niti plod nista ogrožena pri pridobivanju plodovega materiala. V ta namen smo oblikovali nov način za določitev plodove krvne skupine RhD. Z raziska- vo smo pokazali, da je naš način primeren za prenatalno geno- tipizacijo RHD iz plazme RhD-negativne nosečnice. Do po- dobnih zaključkov so prišli tudi pri drugih podobnih raziska- vah (13). Vzorci venske krvi nosečnice, odvzeti v drugem in zadnjem trimesečju nosečnosti, vsebujejo dovolj proste plo- dove DNK za uspešno genotipizacijo (22). Izbrani deli zapo- redja gena RHD, ki smo jih uporabili, so se izkazali primerni za preizkušanje v naši populaciji. Za druge rase je potrebno pri- lagoditi izbrana zaporedja gena RHD glede na frekvenco ra- zličnih haplotipov sistema RhD oziroma je za pravilno vredno- tenje rezultatov v pomoč informacija o etničnem poreklu star- šev (13, 20). Pri dokazovanju prisotnosti proste plodove DNK v plazmi RhD-negativne nosečnice je pri rezultatu, ki potrjuje, da je plod ženskega spola in RhD-negativen, priporočljivo do- ločiti še polimorfizme drugih genov, da lahko dokažemo, da smo preiskovali plodovo DNK. Izbrana kombinacija 8 alelnih polimorfizmov se je potrdila za zelo primerno, saj je bil v 14 od 15 primerov vsaj en polimorfizem „informativen”. Kljub trditvam, da prosta plodova DNA obstaja v materini pla- zmi še desetletja po porodu, v naši raziskavi nismo imeli na- pačnih napovedi glede spola ali prisotnosti gena RHD v no- sečnosti (23). Določitev plodovega gena RHD iz materine plazme je bila možna tudi pri RhD-negativnih nosečnicah kljub prisotnosti protiteles anti-D. Pravilna napoved otrokovega genotipa RHD v takih primerih je še posebno pomembna za nadaljnje vode- nje nosečnosti. Metoda daje možnost, da se preventiva imuni- zacije RhD v 28. tednu nosečnosti po dosedanji doktrini omeji le na tiste nosečnice, katerih plod je RhD-pozitiven. Zaključki Pričakujemo, da bo določitev plodovega genotipa na osnovi proste DNK ploda v venski krvi nosečnice z metodo PCR v realnem času zavzela danes v porodništvu pomembno mesto. Predvsem je pomembno poznati plodov genotip RHD v pri- meru imunizacije na antigen RhD med nosečnostjo in pri izva- janju preventivnega programa zaščite v 28. tednu nosečnosti pred senzibilizacijo RhD. Literatura 1. Brandenburg H, Jahoda MG, Pijper L, Reuss A, Kleyer WJ, Wladimiroff JW. Fetal loss rate after chorionic villus sampling and subsequent amniocente- sis. Am J Med Genet 1990; 35: 178–80. 2. Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, Knoll Jh, Latt SA. Isolation of fetal DNA rom nucletaed erythrocytes in maternal blood. Proc Natl cad Sci USA 1990; 87: 3279–83. 3. Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF, Sargnt IL, Redman CWG, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maretnal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485– 7. 4. Bianchi DW, Zickwol GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male progenitor cell persist in maternal blood as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 705–8. BRICL I, DOVČ-DRNOVŠEK T, BLEJEC T, ROŽMAN P. DOLOČANJE PLODOVE KRVNE SKUPINE MED NOSEČNOSTJO I-142 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I 5. Little MT, Langlois S, Douglas Wilson R, Lansdorp P. Frequency of foetal cells in sorted subpopulations of nucleated erythroid and CD34+ hematopoetic progenitor cells from maternal peripheral blood. Blood 1997; 89: 2347–58. 6. Lo YM, Tein MS, Lau TK et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications or noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 1998; 62: 768–75. 7. Poon LLM, Leung TN, Lau TZ, Lo YMD. Presence of fetal RNA in maternal plasma. (Technical Brief). Clin Chem 2000; 46: 1832–4. 8. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Haemolytic disease of the fetus and newborn. In: Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M eds. Blood transfusion in clinical medicine. 10th ed. Oxford: Blackwell Science, 1997: 390–424. 9. Bowman JM. Historical overview: Haemolytic disease of the fetus and new- born. In: Kennedy HS, Wilson SM, Kelton JG eds. Perinatal transfusion medicine. Arlington: AABB, 1990: 1–52. 10. Carreras Versico LA, Torres OW, Virgilio OS, Pizzolato M. Mild haemolytic disease of the newborn due to Anti-Lewis a. Vox Sang 1993; 64: 194–5. 11. Bharucha ZS, Joshi SR, Bhatia HM. Haemolytic disease of the newborn due to Anti-Leb. Vox Sang 1981; 41:36–9. 12. Tonn T, Westrup D, Seidl C, Kirchmaier CM, Seifried E. Sensitive determina- tion of the Rh D genotype in mixed samples using fluorescence-based poly- merase chain reaction. Vox Sang 1997; 57: 177–81. 13. Finning KM, Martin PG, Soothill PW, Avnt ND. Prediction of fetal status from maternal plasma. Introduction of a new noninvasive fetal RHD genotyping service. Transfusion 2002; 42: 1079–85. 14. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Wolliams PM. Real time quantitative PCR. Geno- me Res 1996; 6: 986–94. 15. Holland PM, Abramson RD, Watson R Gelfand DH. Detection o specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of the Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 7276–80. 16. Honda H, Miharu N, Ohashi Y, Ohama K. Succesful diagnosis of fetal gender using conventional PCR analysis of maternal serum. Clin Chem 2001, 47: 41–6. 17. Kwok S, Higuchi R. Avoiding false posisitev with PCR. Nature 1989; 339: 237–8. 18. Honda H, Miharu N, Ohashi Y, Ohama K. Successful diagnosis of fetal gender using conventional PCR analysis o maternal serum. Clin Chem 2001; 47: 41–6. 19. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use o uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 1990; 93: 125–8. 20. Wagner FF, Frohmajer A, Flegl WA. RHD positive haplotypes in D negative Europeans. BMC Genetics 2001; 2: 10. 21. Alizadeh M, Bernard M, Danic B et al. Quantitative assessment of hematopo- etic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative ploymerase chain reaction. Blood 2002; 99: 4618–25. 22. Lo YMD, Hjelm NM, Path FRC et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl J Med, 1998; 339: 1734–8. 23. Invernizzi P, Biondi ML, Battezzati PM et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma decades after pregnancy. Hum Genet 2000; 110: 587–91.