318 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) Področje medicine: Mikrobiologija in imunologija Stomatologija Nevrobiologija Onkologija Reprodukcija človeka Srce in ožilje Metabolne in hormonske motnje Javno zdravstvo (varstvo pri delu) Psihiatrija Tip članka: Uvodnik Izvirni znanstveni članek Pregledni znanstveni članek Klinični primer Strokovni članek Zdrav Vestn | mesec – mesec 2017 | Letnik 86id Inštitut za sodno medicino, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana Korespondenca/ Correspondence: irena Zupanič pajnič, e: irena.zupanic@mf.uni- lj.si Ključne besede: identifikacija; človeški posmrtni ostanki; genetska tipizacija; mikrosateliti; mtdna Key words: identification; human remains; genetic typing; microsatellites; mtdna Citirajte kot/Cite as: Zdrav Vestn. 2017; 86:318–29. prispelo: 30. 10. 2016 sprejeto: 9. 4. 2017 Javno zdravstvo (varstvo pri delu)pregledni znanstveni članek Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 Genetska identifikacija pogrešanih oseb Missing persons genetic identification Matija Bajželj, irena Zupanič pajnič Izvleček Prispevek na pregleden način opisuje identifikacijo pogrešanih oseb iz neprepoznavnih posmrtnih ostankov, ki jo opravimo z molekularno-genetskimi metodami. Izredno polimorfna, individualno specifična področja, ki nam omogočajo prepoznavo pogrešanega, so mikrosateliti na avtosomih in kromosomu Y ter kontrolna regija mitohondrijske DNA. Za primerjavo genetskih profilov je potreb- no odvzeti biološki material iz posmrtnih ostankov in pridobiti primerjalne referenčne vzorce. Če so ostanke našli kmalu po domnevni smrti pogrešanega, poskušamo pridobiti primerjalne vzorce z njegovih osebnih predmetov. Če teh ni, uporabimo kot referenčne vzorce brise ustnih sluznic nje- govih sorodnikov ali morebitna, v zdravstvenih ustanovah arhivirana tkiva, če je bila v času življe- nja pogrešane osebe opravljena biopsija za potrebe medicinske diagnostike. Kadar ni ne osebnih predmetov, ne svojcev in ne arhiviranih tkiv pogrešane osebe, genetska identifikacija ni možna. Kot biološki material najpogosteje uporabimo kri, mehka tkiva, nohte, zobe ali kosti, kar je odvisno od stanja posmrtnih ostankov. Postopki, ki jih uporabljamo za ekstrakcijo DNA iz različnih tkiv, se med seboj razlikujejo po zahtevnosti in času, ki ga porabimo za pridobitev DNA. Najzahtevnejša in časovno potratna je izolacija DNA iz kosti in zob, zato se zanjo odločimo le v primeru skeletiziranih posmrtnih ostankov, ali ko iz drugih tkiv ne uspemo pridobiti zadostne količine DNA za genetsko identifikacijo. Ob ujemanju genetskih profilov neprepoznavnih posmrtnih ostankov in primerjalnih vzorcev pogrešane osebe je potrebno moč genetskega dokaza statistično ovrednotiti in podati verje- tnost identifikacije. Abstract This article presents identification of missing persons from badly preserved post-mortem remains using molecular genetics methods. Extremely polymorphic and individually specific genetic mark- ers that enable the identification of missing persons are microsatellites on autosomal chromosomes, microsatellites on Y chromosome and control region of mitochondrial DNA. For genetic profile comparison, biological material from post-mortem remains and reference samples have to be col- lected. If post-mortem remains are found shortly after the presumed death of the missing person, their personal items are used for comparison. If these are not available, (the missing person‘s) rela- tives could be used as reference samples or achieved tissues stored in medical institutions if biopsy for the needs of medical diagnostics was performed earlier during their life. When reference samples are not available, genetic identification is not possible. The type of biological material sampled from the deceased depends on the condition of human remains. Blood, soft tissues, nails, teeth or bones are most commonly used for genetic identification, and the time required for DNA extraction de- pends on the type of biological material. The most demanding and time consuming is extraction of DNA from teeth and bones, therefore we use it in cases when only skeleton is available or we cannot get a sufficient amount of DNA for genetic identification from other tissues. If the genetic profile of post-mortem reamains and a reference sample of the missing person match, the strength of genetic evidence has to be statistically evaluated and the probability of identification reported. Genetska identifikacija pogrešanih oseb 319 preGLedni ZnanstVeni čLanek 1. Uvod Genetski identifikacijski testi s prei- skavo DNA veljajo v svetu kot dokazni material v civilnih in kazenskih postop- kih že skoraj trideset let; v Sloveniji se uporabljajo dobrih dvajset let. Poleg identifikacije bioloških sledi v krimina- listiki in preverjanju sorodstvenih pove- zav z molekularno-genetskimi metoda- mi identificiramo tudi pogrešane osebe. Te so lahko žrtve množičnih nesreč, kot so naravne katastrofe (potresi, poplave, požari, tsunamiji), letalske in železniške nesreče ter teroristični napadi. Tudi v primerih zoglenelih trupel, utopljencev ali obešencev, ki jih najdejo po daljšem času in so s tradicionalnimi sodnome- dicinskimi metodami neprepoznavni, se za identifikacijo poslužujemo genetskih preiskav. Kot primerjalne vzorce lahko uporabimo osebne predmete pogrešane osebe, biološke vzorce njegovih sorodni- kov ali morebitna v zdravstvenih ustano- vah arhivirana tkiva. Kadar ni ne osebnih predmetov, ne svojcev in ne arhiviranih tkiv pokojnika, genetska identifikacija ni možna  (1). Identifikacija pogrešanih oseb je do odkritja izredno polimorfnih področij molekule DNA temeljila na tra- dicionalnih sodnomedicinskih in antro- poloških metodah. Danes se te metode dopolnjujejo s preiskavo DNA, ki pred- stavlja zadnjo fazo v postopku identifi- kacije (2). Pogosto je genetska identifika- cija edina možna metoda identifikacije pogrešanih oseb, zlasti v primerih, ko so posmrtni ostanki slabo ohranjeni (3). Preiskavo DNA uporabljamo pri identi- fikaciji pogrešanih oseb zaradi lastnosti molekule DNA, ki je edinstvena za vsa- kega posameznika in ostaja enaka vse življenje, v nekaterih delih organizma, zlasti v kosteh in zobeh, pa ostane raz- meroma dobro ohranjena tudi dlje časa po smrti (4), zato je možno pridobiti ge- netski material tudi iz zelo starih skele- tnih ostankov. Pri nas so bili najstarejši skeletni ostanki, uporabljeni za genetsko identifikacijo, 300 let stari skeleti iz Au- erspergove grobnice (5). Uspešnost genetskih identifikacijskih metod je odvisna od količine in kako- vosti izolirane DNA in torej od ohra- njenosti biološkega materiala, ki ga iz posmrtnih ostankov pridobimo. Če je le možno, analiziramo dolžinske polimor- fizme jedrne DNA (avtosomne kromo- some in kromosom Y), saj je ta najbolj polimorfna. Pri starih in problematič- nih vzorcih pa se lahko zgodi, da zara- di močne razgradnje jedrne DNA te ni mogoče pridobiti v zadostnih količinah. V takih primerih se poslužujemo prei- skave mitohondrijske DNA (mtDNA), ki je zaradi krožne oblike manj izposta- vljena razgradnji v naravnem okolju in se v celici nahaja v številnih kopijah, kar omogoča njeno analizo iz slabo ohra- njenih vzorcev  (6). Z genetskimi meto- dami identificiramo skeletne ostanke in slabo ohranjene ali močno poškodovane človeške posmrtne ostanke (v letalskih, železniških in prometnih nesrečah, ek- splozijah in požarih zoglenela in močno poškodovana trupla, žrtve naravnih ne- sreč, terorističnih napadov ali vojn, žrtve povojnih množičnih pobojev v prikritih grobiščih in druge). Ob preiskavi jedrne DNA nam tipizacija mtDNA v rutinskih preiskavah omogoča celosten pristop k molekularno-genetskim identifikacijam biološkega materiala (7). Identifikacija pogrešane osebe s pre- iskavo DNA je sestavljena iz štirih sto- penj; odvzem biološkega materiala iz po- smrtnih ostankov, odvzem referenčnega materiala za primerjavo s posmrtnimi ostanki (osebni predmeti, arhivirana tkiva ali biološki vzorci sorodnikov), preiskava DNA posmrtnih ostankov in referenčnih vzorcev (ekstrakcija DNA, 320 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) določitev količine DNA v vzorcih, po- množevanje DNA in določitev genetskih profilov) in v zadnji fazi primerjava ge- netskih profilov posmrtnih ostankov in referenčnih vzorcev, ki ob ujemanju pro- filov zajema interpretacijo in statistič- no ovrednotenje genetskega dokaza  ter izračun verjetnosti sorodstvenih pove- zav  (8). Preveriti je potrebno še čistost ekstrakcijskih in pomnoževalnih nega- tivnih kontrol. Pridobljene genetske pro- file posmrtnih ostankov pa je potrebno primerjati tudi z genetskimi profili oseb iz eliminacijske podatkovne zbirke, ki jo sestavljajo osebe, ki so sodelovale pri ka- teri koli fazi identifikacije. 2. Biološki material, odvzet iz posmrtnih ostankov Ohranjenost DNA v posmrtnih ostankih s starostjo pada, na kar v naj- večji meri vpliva okolje, v katerem se je truplo nahajalo od smrti do najdbe. Od stanja posmrtnih ostankov je odvisno, kako zahtevna bo identifikacija pogre- šane osebe. Najtežje so identifikacije v primeru letalskih nesreč ali eksplozij, ko je genetska identifikacija nujna. Posmr- tni ostanki so lahko posamični, močno razgrajeni ali pa so pomešani med seboj (eksplozije in množična grobišča, pri ka- terih so bili različni deli telesa preneseni med različnimi grobovi)  (3). Če so po- smrtni ostanki fragmentirani, je ključne- ga pomena njihovo vzorčenje (vsak del trupla mora biti shranjen samostojno in kot tak tudi označen). Da različni deli trupla pripadajo isti osebi, lahko potrdi- mo z genetsko preiskavo. Deli trupla, ki imajo enak genetski profil, pripadajo isti osebi (9). V forenzično-genetskem laboratori- ju morajo biti na razpolago tehnike, ki omogočajo pridobitev DNA iz najrazlič- nejših bioloških materialov. Od ohra- njenosti posmrtnih ostankov je odvisna izbira biološkega materiala za genetsko preiskavo. Preiskavo opravimo najhitre- je, če uspemo pridobiti DNA iz krvi, sle- dijo ji mehka tkiva in nohti, postopek pa je najdaljši pri popolnoma skeletiziranih posmrtnih ostankih, ki nam omogoča- jo pridobiti DNA le iz kosti in zob. Kri in mehka tkiva je za genetsko preiskavo možno pridobiti le v primeru, ko je bilo truplo najdeno kmalu po smrti. Če ima- mo opravka s trupli, ki so bila povožena z vlakom ali udeležena v prometnih ne- srečah in je truplo pooglenelo, običajno iz takega trupla dobimo dovolj kako- vostno kri iz aorte  (2). Pri pooglenelih truplih lahko za genetske preiskave upo- rabimo tudi vzorce rdečega mišičnega tkiva globoko v telesu, hrustanca iz kolka in brisa mehurja (10). Nohte uporabimo takrat, ko je truplo močno razgrajeno, a ni skeletirizirano, tu so nohti še prisotni. V primeru, da imamo opravka s skeleti- ziranimi posmrtnimi ostanki, ki so bili najdeni več let po smrti, se odločimo za ekstrakcijo DNA iz kosti in zob. Ekstrak- cija DNA iz skeletnih ostankov zahteva največ predpriprav in časa (3). 3. Primerjalni ali referenčni material Kot referenčni material lahko upo- rabimo neposredni referenčni material, osebne predmete pogrešanega ali bio- loški material njegovih sorodnikov  (3). Neposredni referenčni material je bi- ološki material, ki ima določeno doku- mentacijo, s katero lahko potrdimo, da pripada pogrešani osebi. Običajno ga odvzame zdravnik med zdravniškim pregledom (biopsije) v času življenja po- grešanega. Najpomembnejša prednost neposrednega referenčnega materiala je v tem, da nedvomno pripada pogrešani osebi ter je njegova kakovost dovolj ve- lika, da lahko iz njega pridobimo kom- pleten genetski profil (3). Če ni ustrezne Genetska identifikacija pogrešanih oseb 321 preGLedni ZnanstVeni čLanek dokumentacije glede izvora neposre- dnega biološkega materiala, je potreben dober premislek, ali ga bomo uporabili. Kot osebne predmete uporabimo pred- mete, za katere menimo, da jih je upora- bljala le pogrešana oseba (zobna ščetka, brivnik, glavnik, ponošena oblačila)  (3). Osebni predmeti za razliko od neposre- dnega referenčnega materiala nimajo spremljajoče dokumentacije, ki bi potr- jevala njihovo avtentičnost. Možno je, da so osebne predmete pogrešanega upo- rabljali tudi drugi družinski člani, kar v praksi opazimo pri pridobitvi mešanih genetskih profilov iz referenčnih zobnih ščetk, zato je pomembno, da pridobimo informacije o tem, kdo je osebne pred- mete pogrešanega dejansko uporabljal. Če je osebne predmete pogrešanega uporabljalo več oseb, jih moramo tipizi- rati in njihove genetske profile uporabiti za eliminacijske namene ob primerjavi profilov posmrtnih ostankov in oseb- nih predmetov pogrešanega. Za osebne predmete ni nobenega zagotovila, da bo kakovost bioloških sledi na njih dovolj velika za pridobitev kompletnega genet- skega profila, a običajno iz njih prido- bimo kompletne profile. Poleg neposre- dnega referenčnega materiala in osebnih predmetov lahko kot referenčni material uporabimo tudi biološke vzorce soro- dnikov pogrešane osebe (3). Če se odlo- čimo za uporabo sorodnikov, imamo na voljo dovolj kakovosten biološki vzorec (kri ali slino, običajno odvzeto v ambu- lanti) za pridobitev kompletnih profi- lov, upoštevati pa moramo možnost, da sorodniki s pogrešanim niso genetsko povezani, kot se predvideva, kar se zgo- di v primeru nebiološkega očetovstva ali posvojitve  (3). Pridobitev referenčnega materiala genetsko nepovezanih soro- dnikov lahko privede v lažno negativne rezultate genetske identifikacije  (11). V študiji, ki jo je opravil Hartman s sode- lavci  (12), so večji del pogrešanih oseb (82 %) uspešno identificirali s pomočjo referenčnih vzorcev sorodnikov. Bli- žnji sorodniki omogočajo natančnejšo identifikacijo kot daljnji sorodniki  (13). Če bližnjih sorodnikov ni, moramo za uspešno genetsko identifikacijo zbra- ti večje število daljnjih sorodnikov, kar močno poveča stroške genetske preiska- ve  (9). S pomočjo sestričen, bratrancev, nečakov in nečakinj po materini liniji na primer lahko preverimo ujemanje mt- DNA, ki se prenaša po materini liniji v nespremenjeni obliki iz roda v rod. Če poznamo daljnje sorodnike po očeto- vi liniji, pregledamo kromosom Y, ki se v nespremenjeni obliki prenaša z očeta na sina, zaradi česar imajo vsi moški po- tomci identičen kromosom Y. To je zelo pomembno, ko stopimo v stik s svojci pogrešanih oseb ali žrtev povojnih po- bojev in jim razložimo, da lahko za iden- tifikacijo poleg bližnjih uporabimo tudi daljnje sorodnike. S preiskavo več še ži- večih sorodnikov povečamo statistično verjetnost, ki je potrebna za pozitivno identifikacijo (7). Pri vseh masovnih ka- tastrofah, kjer začnemo z identifikacijo pogrešanih oseb neposredno po nesreči (letalske in železniške nesreče, teroristič- ni napadi …), so za genetske preiskave najprimernejši referenčni vzorci osebni predmeti ali arhivirana tkiva. Tovrstni vzorci nam namreč omogočajo nepo- sredno primerjavo genetskih profilov v smislu iskanja identičnosti, kar je, zaradi majhnega števila referenčnih vzorcev in visokih izračunanih verjetnosti identifi- kacije, iz ekonomskega vidika najbolj ra- cionalen pristop. Pri zastarelih masovnih katastrofah (množična grobišča iz časa 2. svetovne vojne v Sloveniji, množična grobišča v Bosni in Hercegovini …) pa osebnih predmetov in arhiviranih biolo- ških vzorcev pogrešanih po vrsti let več ni možno zbrati, zato nam služijo kot re- ferenčni vzorci biološki vzorci njihovih še živečih sorodnikov (9). 322 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) 4. Kronološko dokumentiranje postopka identifikacije Kronološko dokumentiranje postop- ka je nujno za zagotavljanje pristnosti vzorca. Dokumentiranje se prične s fazo odvzema vzorca, potrebno pa ga je vo- diti skozi celoten postopek identifikacije. Po odvzemu je potrebno vzorec ustrezno shraniti in označiti. Pri identifikaciji so- delujejo strokovnjaki različnih področij, kar mora biti ustrezno dokumentirano. Ustrezno shranjevanje evidenčnega ma- teriala in z njim povezana kronološka dokumentacija o odvzemu, transportu in opravljenih analizah so ključnega po- mena za ustrezno genetsko identifikacijo in poročilo o identiteti, ki se ga veliko- krat uporabi tudi na sodiščih (3). 5. Preiskave DNA za identifikacijo pogrešanih oseb DNA je nosilka genetske informacije v živih organizmih in se nahaja v jedru vsake evkariontske celice  (14). Moleku- le DNA najdemo tudi v mitohondrijih, organelih, odgovornih za proizvodnjo celične energije  (15). Vsaka celica vse- buje približno 500 mitohondrijev, vsak mitohondrij pa 5 do 10 molekul DNA. MtDNA predstavlja pri človeku pribli- žno 0,3 % genomske DNA. Je dvoveri- žna, kovalentno zaprta krožna molekula, ki jo sestavljata zunanja težka veriga (ve- riga H) in notranja lahka veriga (veriga L). Mitohondrijski genom je razmero- ma majhen, njegova dolžina je približno 16.500 baznih parov. Veliko mitohon- drijev vsebujejo srčno, mišično in jetr- no tkivo. Znotraj vsakega mitohondrija je več kopij njegovega kromosoma. Ker smo ljudje strukturno in funkcionalno grajeni podobno, je zato tudi DNA med posamezniki podobna. Vendar v mole- kuli DNA obstajajo področja, v katerih se posamezniki med seboj razlikujemo, kar preiskujemo pri identifikaciji pogre- šanih oseb. Pri jedrni DNA imajo ome- njena področja obliko ponavljajočih se zaporedij, imenovanih mikrosateliti ali kratke tandemske ponovitve (angl. Short Tandem Repeat, STR), ki predstavljajo dolžinske polimorfizme, pri mtDNA pa preiskujemo sekvenčne polimorfizme v kontrolni regiji  (3). Mikrosateliti imajo obliko kratkih nukleotidnih zaporedij, ki se v genomu ponavljajo v številnih iden- tičnih ali sorodnih kopijah. Nahajajo se v nekodirni DNA in sicer v intronih in nukleotidnih zaporedjih med geni. Dol- gi so 2–7 baznih parov, število ponovitev pa je manjše od 100 (16). Ponavljajoča se zaporedja naj bi predstavljala 3 % člove- škega genoma oziroma približno 90 mi- lijonov baznih parov  (17). Pri genetski identifikaciji pogrešanih oseb opravlja- mo preiskave mikrosatelitov na avto- somnih kromosomih in kromosomu Y, kadar imamo na razpolago le daljnje so- rodnike po materini liniji, ali v primeru, da je DNA močno razgrajena in preiska- va jedrne DNA ni mogoča, pa preiskuje- mo polimorfizme mtDNA. 5.1. Preiskave mikrosatelitov na avtosomnih kromosomih Avtosomni mikrosateliti, ki se dedu- jejo kodominantno, se nahajajo na ka- terem koli izmed 22 parov avtosomnih kromosomov, torej kromosomih, ki niso odgovorni za določitev spola. Variabil- nost mikrosatelitov znotraj populacije je tako visoka, da lahko z uporabo ve- čjega števila lokusov med seboj razliku- jemo kateri koli osebi, razen enojajčnih dvojčkov. Avtosomne mikrosatelite po- množujemo z verižno reakcijo s polime- razo (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR), v kateri se oba alela heterozigo- tnega para zaradi podobne velikosti in dolžin do 400 baznih parov učinkovito pomnožujeta (14). V reakciji PCR hkra- Genetska identifikacija pogrešanih oseb 323 preGLedni ZnanstVeni čLanek ti pomnožujemo večje število področij STR, kar nam omogoča hitrejšo analizo in manjšo porabo iz posmrtnih ostan- kov ekstrahirane DNA. Po strokovnih priporočilih naj bi bilo za identifikaci- jo pogrešanih oseb, če se kot referenčni material uporablja biološki material so- rodnikov, potrebno preiskovati najmanj dvanajst avtosomnih mikrosatelitov (12). V praksi uporabljamo različne komplete za pomnoževanje 15 ali več mikrosateli- tov hkrati (18). Kadar imamo opravka z močno razgrajeno DNA, se lahko zgo- di, da daljših področij STR ne uspemo pomnožiti, zato so na trgu kompleti, ki omogočajo pomnoževanje področij STR, katerih dolžina ne presega 250 ba- znih parov (3). 5.2. Preiskave mikrosatelitov na spolnem kromosomu Y Poleg preiskave mikrosatelitov avto- somnih kromosomov se lahko pri iden- tifikacijah poslužujemo tudi preiskave mikrosatelitov spolnih kromosomov. Tako kot avtosomi in kromosom X, tudi kromosom Y vsebuje mikrosateli- te, vendar jih je na kromosomu Y manj zaradi njegove majhnosti. Kromosom Y je namreč drugi najmanjši človeški kromosom; dolg je 60 milijonov baznih parov  (16). Kromosom Y ni udeležen v rekombinaciji, zato lahko z genetsko preiskavo mikrosatelitov kromosoma Y sledimo paternalni liniji, saj imajo vsi potomci istega očeta identičen haplotip kromosoma Y. Odsek molekule DNA, ki je podedovan le po enem od staršev, imenujemo haplotip. Pri identifikaciji pogrešanih oseb lahko s pomočjo kro- mosoma Y kot referenčne vzorce upora- bimo tudi daljnje sorodnike po očetovi liniji. Ta vrsta analize pa ni uporabna pri žrtvah ženskega spola (19). 5.3. Preiskava mitohondrijske DNA Pri mtDNA za identifikacijske name- ne preiskujemo sekvenčne polimorfizme v kontrolni regiji. Prednost mtDNA pred avtosomno pri identifikaciji močno raz- grajenih vzorcev posmrtnih ostankov je v tem, da se DNA ohrani dlje časa, saj jo pred razgradnjo ščitita krožna oblika in mitohondrijska ovojnica, obenem pa je v celici prisotna v številnih kopijah. Mutacije se v mitohondrijskem genomu pojavljajo precej pogosteje v primerjavi z jedrnim genomom. Vzrok je izposta- vljenost mtDNA reaktivnim kisikovim spojinam, ki nastajajo pri oksidativni fosforilaciji  (20). MtDNA se prenaša z matere na otroke, zato lahko s pomočjo analize mtDNA sledimo le materini lini- ji  (3). Če iz posmrtnih ostankov zaradi razgrajenosti DNA uspemo pridobiti le profil mtDNA, lahko kljub temu opravi- mo identifikacijo, vendar lahko kot re- ferenčne osebe uporabimo le sorodnike po materini strani. Preiskave mtDNA pa so uporabne tudi za določanje identite- te starih posmrtnih ostankov, ko so med še živečimi sorodniki na voljo le več ge- neracij oddaljeni sorodniki po materini liniji. Ker pri mtDNA ni rekombinacije, je stopnja identifikacije s preiskavo mt- DNA nižja od stopnje identifikacije, ki jo dosegamo z preiskavami jedrne DNA. Stopnja identifikacije, ki jo dosegamo z preiskavo jedrne DNA, je praktično 100 %, stopnja identifikacije s preiskavo mtDNA pa je 98–99 %, kar velja tudi za kromosom Y, ki se prenaša iz očeta na si- nove in se ne rekombinira (21). Za izvedbo genetske preiskave mora- mo pridobiti DNA iz posmrtnih ostan- kov. Temu sledi določitev količine DNA v vzorcih ter pomnoževanje DNA v reakciji PCR, pri čemer pridobimo ge- 324 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) netske profile avtosomne jedrne DNA, če pomnožujemo mikrosatelite kromo- soma Y, pa haplotipe kromosoma Y. Pri sekvenciranju kontrolne regije mtDNA, pridobimo haplotipe mtDNA. 6. Pridobitev DNA iz posmrtnih ostankov 6.1. Pridobitev DNA iz krvi, mehkih tkiv in nohtov Izolacija DNA iz krvi je med manj zahtevnimi ekstrakcijskimi metodami v forenzični genetiki in nam omogoča hitro pridobitev DNA. Hemoglobin in- hibira reakcijo PCR, zato ga je potrebno iz ekstrakta odstraniti  (22). Učinkovita metoda čiščenja DNA je vezava DNA na magnetne delce in njeno spiranje, pri če- mer uporabimo avtomatiziran postopek, ki poteka v napravi Biorobot EZ1 (Qia- gen). Prednost te metode pred v foren- zičnih preiskavah pogosto uporabljano organsko ekstrakcijo je v tem, da ne zah- teva uporabe strupenih organskih topil, kot sta fenol in kloroform (23). Celoten postopek čiščenja DNA je avtomatiziran in traja le 20 minut. Nukleinske kisline se vežejo na s silicijem prevlečene povr- šine magnetnih delcev v prisotnosti ka- otropičnih soli, ki lizirajo celice, denatu- rirajo proteine, inaktivirajo nukleaze in pospešujejo vezavo DNA na magnetne delce (24). Ekstrakcija DNA iz krvi je v primerjavi z ekstrakcijo DNA iz kosti veliko hitrejša, saj celoten postopek ek- strakcije traja le slabo uro, ekstrakcija DNA iz kosti pa več dni (25). Mehka tkiva uporabimo v primeru, ko zaradi slabo ohranjenih posmrtnih ostankov ekstrakcija iz krvi ni več mo- žna. Za genetsko identifikacijo najpri- mernejši vzorci mehkega tkiva so srčno, mišično, jetrno in ledvično tkivo (17). Ko je potrebno identificirati moč- no razpadlo truplo, pridobimo genetski material iz zob ali kosti, lahko pa kot al- ternativo uporabimo tudi nohte. Nohti vsebujejo keratin, ki ga le redki mikro- organizmi lahko uporabijo kot hrani- lo. Zato DNA v nohtih ni tako podvr- žena razgradnji kot v mehkih tkivih in se lahko ohrani tudi dlje časa po smrti. Najprimernejši so nohti na palcih nog, saj so najdebelejši. Postopek ekstrakci- je iz nohtov je krajši in manj zahteven kot iz kosti in zob. Pri svežih nohtih je verjetnost pridobitve kakovostnih profi- lov sorazmerno velika, v primeru starih nohtov pa je kakovost profila odvisna od okolja, v katerem so se ti nahajali. Kera- tinizirana tkiva vsebujejo disulfidne vezi, zato je potrebna inkubacija v ekstrakcij- skem pufru z dodanim DTT. Metoda al- kalne ekstrakcije in uporaba pufra TNCa  omogočata razgradnjo keratiniziranega tkiva že v 2–5 urah (21). 6.2. Pridobitev DNA iz skeletnih ostankov V primeru, ko gre za identifikacijo pogrešane osebe, katere posmrtni ostan- ki so slabo ohranjeni ali pa je minilo več let do odkritja, ekstrakcija DNA iz krvi in mehkih tkiv ni več možna, saj so se ta tkiva razgradila. Po smrti organizma namreč nukleaze celičnih lizosomov kot tudi bakterije in glive razgrajujejo DNA. DNA pa se lahko tudi več stoletij ohrani v kosteh in zobeh, saj je vezana na hi- droksiapatit in je zato težje razgradljiva. Kako dobro se DNA v skeletnih ostankih ohrani, je odvisno od okolja, v katerem se ti nahajajo. Dejavniki okolja, ki vpliva- jo na ohranitev molekule DNA, so tem- peratura, vlažnost, UV sevanje, pH in kemijske lastnosti zemlje, v kateri so bili skeletni ostanki zakopani, ter prisotnost mikroorganizmov  (26). Najboljše za ohranitev DNA so nizke temperature in čim manj padavin. Velik vpliv ima tudi, če se skeletni ostanki hitro posušijo. Naj- Genetska identifikacija pogrešanih oseb 325 preGLedni ZnanstVeni čLanek bolje se DNA ohrani v skeletnih ostan- kih, ki se nahajajo v prsti z nevtralnim ali rahlo bazičnim pH in kjer je koncentra- cija soli povečana, vsebnost huminskih kislin in vlažnost pa nizki. Velik vpliv ima tudi način shranjevanja skeletnih ostankov takoj po izkopu. Najbolje je, če identifikacijo opravimo takoj po izko- pu, slabše pa, če so skeletni ostanki dlje časa shranjeni pri sobni temperaturi. Če identifikacije ne moremo opraviti takoj, je najustrezneje, da delčke kosti in zob zamrznemo (1). Za ekstrakcijo DNA so najprimer- nejše dolge kosti, ki imajo največji de- lež kompaktne kostnine in posledično tudi več hidroksiapatita, na katerega se vežejo molekule DNA. Vezava najverje- tneje poteka tako, da se med seboj po- vežejo hidroksilne skupine v molekuli hidroksiapatita s fosfatnimi skupinami v molekuli DNA. Med dolgimi kostmi so najprimernejše stegnenice in golenice, najmanj primerne pa so ploščate kosti, npr. lobanjske kosti (1). Če v laboratorij prejmemo celotne ste- gnenice, najprej odrežemo 8–10 cm dolg in 2–3 cm širok košček kosti, ki ga potem uporabimo za nadaljnjo identifikacijo. Kosti očistimo zemlje in jih speremo v destilirani vodi, ki ji dodamo detergent. Sledi večkratno spiranje z vodo. Poskr- beti moramo, da so kosti ustrezno ozna- čene. Z brusilnikom odstranimo povr- šinsko plast, pri čemer pregrevanje kosti preprečimo z uporabo tekočega dušika. Mehanskemu čiščenju sledi kemično či- ščenje z detergentom, vodo in etanolom, zato da odstranimo površinsko kontami- nacijo (27). Detergent oksidativno deluje in povzroči, da se sodobna (eksogena) DNA, ki je večinoma na površini, raz- cepi na kratke fragmente ali posamezne baze, medtem ko endogena DNA ostane nepoškodovana zaradi vezave na hidro- ksiapatit. Pri mletju je ključnega pome- na pridobitev finega kostnega prahu, ki omogoča bolj učinkovito dekalcifikacijo, pregrevanje med mletjem pa ponovno preprečujemo z uporabo tekočega duši- ka. Za ekstrakcijo uporabimo pol grama kostnega prahu, ki ga dekalcificiramo v z 0,5 M EDTA. Ta omogoča raztapljanje ogrodja iz hidroksiapatita in temelji na tvorbi kompleksov med EDTA in ioni kalcija (1). Cilj mehanskega in kemične- ga čiščenja je pridobitev endogene DNA kosti in odstranitev eksogene (sodobne) DNA iz površine. Zato je zelo pomemb- no preprečevanje kontaminacije. Za delo v laboratoriju uporabljamo zaščitni plašč, kapo in masko ter dvojne rokavice. Vse pripomočke, ki jih potrebujemo za brušenje, rezanje in mletje kosti, obri- šemo z natrijevim hipokloridom, desti- lirano vodo in etanolom, steriliziramo in čez noč obsevamo z UV svetlobo. Z belilom, vodo in etanolom pred in po končanem delu očistimo delovne površi- ne. Pri vseh postopkih uporabljamo ne- gativne kontrole, da preverjamo čistočo izolacijskih in pomnoževalnih reagentov in laboratorijske plastike. Pomembna je tudi priprava eliminacijske podatkovne zbirke (28). 7. Določitev količine DNA v vzorcih Pred pomnoževanjem DNA v reakciji PCR opravimo kvantifikacijo ali dolo- čitev količine DNA v vzorcu z reakcijo PCR v realnem času. S to reakcijo lah- ko presodimo, ali je vzorec primeren za tipizacijo mikrosatelitov jedrne DNA ali le za tipizacijo mtDNA. Kadar hkrati pomnožujemo kratek in dolg fragment DNA, lahko iz njunega razmerja izraču- namo tudi stopnjo razgrajenosti DNA, ki smo jo pridobili iz posmrtnih ostan- kov, kar nam pomaga pri izbiri genet- skih označevalcev, ki jih bomo tipizirali. Poleg količine DNA v vzorcu in stopnje njene degradiranosti, lahko z novejšimi 326 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) kvantifikacijskimi kompleti ugotavlja- mo tudi prisotnost inhibitorjev reakci- je PCR v ekstraktu  (29). Če je začetna koncentracija DNA v vzorcu zelo nizka, se zaradi stohastičnega učinka možnost napak pri pomnoževanju v reakciji PCR poveča, saj lahko pride do izpada alelov zaradi nepomnožitve, kar moramo upo- števati pri interpretaciji rezultatov. 8. Pomnoževanje DNA v reakciji PCR Ne glede na to, katera področja člove- škega genoma želimo preiskovati (jedr- no DNA ali mtDNA), je najprej potreb- no pomnoževanje DNA v reakciji PCR. Metoda PCR je zelo uporabna v foren- zično-genetskih preiskavah, saj preisku- jemo zelo majhne količine DNA, ki je pogosto tudi močno razgrajena. Reakcija PCR pomnožuje molekule DNA na enak način, kot se to dogaja v celici. Reakci- ja temelji na prileganju in podaljševanju dveh oligonukleotidnih začetnikov, ki omejujeta področje DNA, ki ga želimo pomnožiti  (17). Najprej poteče denatu- racija, zaradi katere se dvojna vijačnica razpre. Potem vsak oligonukleotidni za- četnik hibridizira z eno od ločenih ve- rig, medtem pa temperaturno obstojna DNA polimeraza podaljšuje verigo. Iz ene molekule DNA ob optimalnih po- gojih dobimo 2n molekul produkta, kjer n pomeni število ciklov reakcije, teh pa je običajno 28–30  (17). Med reakcijo se pomnoženi fragmenti DNA označujejo s fluorescenčnimi barvili, ki nam služijo za zaznavo produktov v kapilarni elek- troforezi, ki mora imeti sposobnost raz- likovanja med fragmenti, ki se med seboj razlikujejo za en sam nukleotid  (3). Pri tem postopku fluorescentno označene fragmente DNA ločimo na podlagi nji- hove molekulske mase. Produkte reakci- je PCR vbrizgamo v kapilaro, ki vsebuje denaturacijski polimer. Električni tok, ki steče skozi polimer, povzroči, da se ne- gativno nabiti produkti premikajo proti pozitivnemu delu kapilare. Fragmenti DNA z manjšo molekulsko maso potuje- jo hitreje, laserski žarek jih registrira in v reakciji PCR hkrati pomnožene mikro- satelite tako lahko razlikujemo med se- boj na podlagi različnih dolžin in obar- vanja z različnimi fluorokromi (3). 9. Statistična ocena moči genetskega dokaza in interpretacija rezultatov Laboratorijskemu delu v postopku identifikacije pogrešane osebe sledi in- terpretacija dobljenih rezultatov. Genet- ski profil posmrtnih ostankov primerja- mo z referenčnim vzorcem in potrdimo ali ovržemo ujemanje (3). Če se genetski profil posmrtnega ostanka in genetski profil referenčnega vzorca (npr. zobne ščetke kot osebnega predmeta pogreša- ne osebe) ujemata, nas zanima, kakšna je verjetnost, da imata oba genetska profila isti izvor, oziroma, kakšna je verjetnost, da ima naključno izbrana oseba iz slo- venske populacije enak genetski profil kot biološka sled, najdena na preiskovani zobni ščetki, ali kakšna je verjetnost, da je ujemanje profila posmrtnih ostankov in profila bioloških sledi na zobni ščetki naključno (9). Ujemanje dveh genetskih profilov statistično ovrednotimo z verje- tnostnim razmerjem, ki ga označimo s kratico LR (angl. Likelihood Ratio) in je obratno sorazmerno frekvenci genetske- ga profila: LR = 1 / frekvenca genetskega profila  (9). Pri izračunu verjetnostnega razmerja primerjamo verjetnost dogod- ka, da pripada biološka sled na zobni ščetki pogrešanemu (števec) in verje- tnost dogodka, da pripada biološka sled na zobni ščetki naključno izbrani osebi iz slovenske populacije, če je pogreša- ni Slovenec (imenovalec). Verjetnost v Genetska identifikacija pogrešanih oseb 327 preGLedni ZnanstVeni čLanek števcu je 1, verjetnost v imenovalcu pa je enaka frekvenci genetskega profila. Ver- jetnostno razmerje nam pove, kolikokrat bolj verjetno je, da pripada biološka sled na zobni ščetki pogrešanemu, kot da pri- pada naključno izbrani osebi iz sloven- ske populacije (9). Izračunamo ga s po- močjo različnih forenzičnih statističnih programov (30). 10. Primeri genetskih identifikacij pogrešanih oseb Kot primer uporabe genetskih me- tod za identifikacijo pogrešanih oseb naj omenim letalsko nesrečo v Spitsbergnu. Olaisen in sodelavci (31) so identificirali 139 od skupno 141 ruskih in ukrajinskih žrtev s primerjavo s sorodniki. Najpri- mernejši referenčni vzorci so bile ma- tere, očetje ali otroci žrtev, če so bile na razpolago le sestre ali bratje, pa so kot referenčne uporabili vzorce več bratov in/ali sester. Zaradi izredno visokega odstotka uspešnih identifikacij (98,6 %), hitrih analiz in razmeroma nizke cene (3–5 % cene celotne operacije) se je ge- netska identifikacija izkazala kot izredno primerna identifikacijska metoda pri množičnih katastrofah. Z genetskimi metodami so iden- tificirali tudi večino žrtev množičnih pobojev na ozemlju bivše Jugoslavi- je  (32,33). Uspešna je bila identifikacija žrtev povojnih množičnih pobojev v Sloveniji  (34-36), kjer imamo eviden- tiranih preko 600 množičnih grobišč. Pri desetih grobiščih smo opravili mo- lekularnogenetsko identifikacijo. To so grobišča, za katera so v glavnem bili na razpolago poimenski seznami žrtev, na osnovi katerih smo lahko zbrali primer- jalne vzorce ustnih sluznic še živečih so- rodnikov. Največje grobišče, ki smo ga molekularno genetsko obdelali, je gro- bišče Konfin I, iz katerega so leta 2006 izkopali skeletne ostanke 88 žrtev, kjer smo uspeli pridobiti brise ustnih sluznic še živečih bližnjih in daljnjih sorodnikov za 44 žrtev. Za preiskave smo uporabili stegnenice, katerih genetske profile smo primerjali s še živečimi sorodniki. Ob primerjavi genetskih profilov kosti s še živečimi sorodniki smo pri 32 kosteh za- sledili ujemanje z referenčnimi osebami (sestrami, brati, hčerkami, sinovi, bra- tranci in nečaki) ter statistično ovredno- tili verjetnosti sorodstvenih povezav, ki je pri vseh 32 žrtvah presegala zahtevano verjetnost 99,9 % (verjetnost sorodstva, ki presega vrednost 99,9 %, zadostuje za pozitivno identifikacijo). Pred pri- četkom molekularnogenetskih preiskav smo z namenom sledljivosti v primeru pojava kontaminacije pripravili elimina- cijsko podatkovno zbirko, ki je vsebova- la genetske profile vseh oseb, ki smo bile kakor koli v stiku s skeletnimi ostanki med izkopom, shranjevanjem vzorcev ter antropološko in genetsko študijo. Avtosomno jedrno DNA, kromosom Y in mtDNA smo tipizirali pri kosteh, pri referenčnih osebah – še živečih soro- dnikih, smo tipizirali avtosomno jedrno DNA, za sorodnike po materini liniji pa je bilo potrebno pridobiti tudi haplotipe mtDNA, za sorodnike po očetovi liniji pa tudi haplotipe kromosoma Y. Pri ose- bah za eliminacijsko podatkovno zbirko smo poleg avtosomne jedrne DNA tipi- zirali še mtDNA in pri moških osebah mikrosatelite kromosoma Y. Dokazali smo, da je ob preiskavi večjega števila genetskih označevalcev (avtosomni mi- krosateliti, mikrosateliti kromosoma Y in kontrolna regija mtDNA) in vključi- tvi tako bližnjih kot daljnjih sorodnikov žrtev v analizo, možno pozitivno identi- ficirati žrtve druge svetovne vojne, za ka- tere je zaradi časovne oddaljenosti tež- ko pridobiti še živeče bližnje sorodnike. Za žrtve povojnih pobojev v slovenskih grobiščih smo uspeli določiti tudi barvo oči in las (37). 328 Zdrav Vestn | julij – avgust 2017 | Letnik 86 JaVno ZdraVstVo (VarstVo pri deLu) Kot primer genetske identifikacije pogrešanih oseb v rutinskih preiskavah Laboratorija za molekularno genetiko Inštituta za sodno medicino naj nave- dem balonarsko nesrečo, ki se je 23. av- gusta 2012 zgodila na Ljubljanskem bar- ju. Zaradi striženja vetra pri tleh balon ni uspešno pristal, temveč ga je pričelo odbijati od tal, kar je povzročilo, da so nekateri potniki padli iz balona, tisti, ki so na balonu ostali, pa so zaradi vžiga utrpeli hude telesne poškodbe, nekateri celo smrtne. Na balonu je bilo 32 ljudi, 12 udeležencev nesreče je bilo huje poško- dovanih, 14 lažje. Umrlo je šest ljudi, štir- je na kraju nesreče, dva pa kasneje v bol- nišnici  (38). Štirje smrtno poškodovani in eden preživeli, ki pa je kasneje tudi umrl, so bili tako hudo poškodovani, da smo lahko njihovo identiteto potrdili le z genetskimi metodami. Kot primerjalne vzorce smo analizirali bližnje sorodnike preminulih (brate, sestre, sinove, mate- re, očete), iz pooglenelih trupel pa smo odvzeli kri iz aorte, iz katere smo uspeli pridobiti genetske profile. Identifikacijo vseh pogrešanih smo izvedli v 36 urah. 11. Zaključek Genetska identifikacija je najnovejša identifikacijska metoda, katere razvoj se je pričel po odkritju izredno polimorf- nih odsekov DNA. Sodnomedicinske in antropološke metode tako danes do- polnjuje genetska identifikacija, katere rezultati so najzanesljivejši in nam omo- gočajo identifikacijo močno razgrajenih, fragmentiranih ali skeletiziranih nepre- poznavnih posmrtnih ostankov. Literatura 1. Zupanič Pajnič I. Molekularno genetska iden- tifikacija posmrtnih ostankov. Med Razgl. 2013;52(2):213–234. 2. Zupanič Pajnič I. Molekularno genetska identi- fikacija neznanih trupel iz skeletnih ostankov in zob. In: Luzar B, Poljak M, Glavač D, Balažic J, ur. Molekularna diagnostika v medicini. 15. spomin- sko srečanje akademika Janeza Miličinskega in 36. memorialni sestanek profesorja Janeza Plečnika in 1. srečanje slovenskega društva za humano geneti- ko z mednarodno udeležbo. Ljubljana: Medicinska fakulteta; 2005. p. 73–84. 3. Sozer Ca. DNA Analysis for Missing person Iden- tification in Mass Fatalities. Boca Raton: Taylor & Francis; 2014. 4. Comitè international de la Croix-Rouge. Missing people, DNA analysis and identification of human remains. A guide to best practice in armed conflic- ts and other situations of armed violence. 2 nd ed. Geneva: ICRC; 2009. 5. Zupanič Pajnič I. Molekularnogenetska preiskava 300 let starih skeletov iz Auerspergove grobnice. Zdrav Vestn. 2013;82(12):796–808. 6. Zupanič Pajnič I, Balažic J, Komel R. Sequence polymorphism of the mitochondrial DNA con- trol region in the Slovenian population. Int J Legal Med. 2004;118(1):1–4. 7. Zupanič-Pajnič I. Genetika v pravosodju in njena uporaba pri preverjanju sorodnosti in identifikaci- jah. Drevesa. 2013;20:16–20. 8. Montelius K, Stenersen M, Sajantila A. Disaster Victim Management: DNA Identification. En- cyclopedia of Forensic and Legal Medicine. 2nd ed. New york: Elsevier, 2015. 9. Zupanič Pajnič I. Forenzična genetika. Med Razgl. 2011;50(3):325–340. 10. Ferreiraa TG, Paula KA, Nogueirac RF, Oliveira ES, Moraesa AV. A comparative study between muscle, cartilage and swab from inside the urinary bladder samples for DNA typing of severely burnt bodies in disaster victim identification (DVI). Fo- rensic Sci Int Genet Suppl Ser. 2015;5:e617-e618. 11. Baeta M, Núñez C, Cardoso S, Palencia-Madrid L, Herrasti L, Etxeberria F, de Pancorbo M. Digging up the recent Spanish memory: genetic identifica- tion of human remains from mass graves of the Spanish Civil War and posterior dictatorship. Fo- rensic Sci Int Genet. 2015;19:272–279. 12. Hartman D, Benton L, Morenos L, Beyer J, Spiden M, Stock A. Examples of kinship analysis where Profiler Plus™ was not discriminatory enough for the identification of victims using DNA identifica- tion. Forensic Sci Int. 2011;205(1–3):64–68. 13. Bradford L, Heal J, Anderson J, Faragher N, Duval K, Lalonde S. Disaster victim investigation recom- mendations from two simulated mass disaster sce- narios utilized for user acceptance testing CODIS 6.0. Forensic Sci Int Genet. 2011;5(4):291–296. 14. Butler JM. Forensic DNA Typing: Biology & Te- chnology behind STR Markers. San Diego: Acade- mic Press; 2001. 15. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular biology of the cell. New York: Garland Science; 2002. 16. Šterlinko H. Preiskava avtosomalnih in na kromo- som Y vezanih mikrosatelitnih in minisatelitnih lokusov za reševanje sodnomedicinskih primerov Genetska identifikacija pogrešanih oseb 329 preGLedni ZnanstVeni čLanek [Master’s Thesis], Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2000. p. 2–5. 17. Zupanič I. Uvedba preiskave DNA za prepozna- vanje oseb in preverjanje sorodstvenih povezav v slovenski populaciji [Master’s Thesis]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 1999. p. 2–3,38. 18. Zupanič Pajnič I, Gornjak Pogorelc B, Balažic J, Zupanc T, Štefanič B. Highly efficient nuclear DNA typing of the World War II skeletal remains using three new autosomal short tandem repeat amplification kits with the extended European Standard Set of loci. Croat Med J. 2012;53(1):17–23. 19. Diegoli MT. Forensic typing of short tandem repe- at markers on the X and Y chromosomes. Forensic Sci Int Genet. 2015;18:140–151. 20. Goodwin W, Linacre A, Hadi S. An introduction to Forensic Genetics. Chichester: John Wiley & Sons; 2007. p. 125–127. 21. Zupanič Pajnič I. Identifikacija oseb iz starih in slabo ohranjenih bioloških materialov s polimor- fizmi mitohondrijske DNA [PhD Thesis]. Ljublja- na: Univerza v Ljubljani; 2006. p. 2–3. 22. Al-Soud WA, Radstrom P. Purification and cha- racterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clinical Microb. 2001;39(2):485–493. 23. Zupanič-Pajnič I, Debska M, Gornjak-Pogorelc B, Vodopivec Mohorčič K, Balažic J, Zupanc T, Ger- šak K. Highly efficient automated extraction of DNA from old and contemporary skeletal rema- ins. J Forensic Legal Med. 2016;37:78–86. 24. Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim van Dillen PME, Van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nu- cleic acids. J Clinical Microb. 1990;28(3):495–503. 25. Qamar W, Khan MR, Arafah A. Optimization of conditions to extract high quality DNA for PCR analysis from whole blood using SDS-Proteinase K method. Saudi J Biol Sci. 2016. In press. 26. Pääbo S. Ancient DNA: extraction, characterizati- on, molecular cloning, and enzymatic amplifica- tion. Proc Natl Acad Sci USA.1989;86(6):1939–43. 27. Zupanič Pajnič I. Visoko učinkovita metoda eks- trakcije DNA iz skeletnih ostankov. Zdrav Vestn. 2011;80(3):171–181. 28. Zupanič Pajnič I. Extraction of DNA from human skeletal material. Methods Mol Biol. 2016;1420:89– 108. 29. Ewing MM, Thompsona JM, McLarena RS, Purpe- rob VM, Thomasb KJ, Dobrowskic PA, DeGrootc GA, Romsosd EL, Stortsa DR. Human DNA quan- tification and sample quality assessment: Deve- lopmental validation of the PowerQuant1 system. Forensic Sci Int Genet. 2016;23:166–177. 30. Brenner CH. DNA-VIEW 2007 User Guide, Oa- kland (CA); 2007. 31. Olaisen B, Stenersen M, Mevag B. Identification by DNA analysis of the victims of the august 1996 Spitsbergen civil aircraft disaster. Nature Genet. 1997;15(4):402–405. 32. Davoren J, Vanek D, Konjhodzić R, Crews J, Huffi- ne E, Parsons TJ. Highly effective DNA extraction method for nuclear short tandem repeat testing of skeletal remains from mass graves. Croat Med J. 2007;48(4):478–485. 33. Jakovski Z, Nikolova K, Jeneska B, Cakar Z, Stan- kov A, Poposka V, Pavlovski G, Duma A. Foren- sic DNA analysis in the identification of human remains in mass graves. J Cli Path Forensic Med. 2010;1(1):1–4. 34. Zupanič Pajnič I. Genetic identification of Second World War victim’s skeletal remains. Saarbrücken: Lap Lambert Academic Publishing; 2013. 35. Zupanič Pajnič I. Molekularno genetska iden- tifikacija domobranskih žrtev. Zdrav Vestn. 2008;77(11):745–750. 36. Zupanič-Pajnič I, Gornjak-Pogorelc B, Balažic J. Molecular genetic identification of skeletal rema- ins from the Second world war Konfin I mass grave in Slovenia. Int J Legal Med. 2010;124(4):307–317. 37. Chaitanya L, Zupanič Pajnič I, Walsh S, Balažic J, Zupanc T, Kayser M. Bringing colour back af- ter 70 years: Predicting eye and hair colour from skeletal remains of World War II victims using the HIrisPlex system, Forensic Sci Int Genet. 2016;26(1):48–57. 38. STA. Leto dni po balonarski nesreči na Barju: štiri osebe še z zdravstvenimi težavami. 2013. Available from: http://www.24ur.com/novice/slovenija/leto- -po-balonarski-nesreci-na-barju-stiri-osebe-se-z- -zdravstvenimi-tezavami.html.