UVOD V za~etku leta 2001 smo na Onkolo{kem in{titutu v Ljubljani pri~eli z onkolo{kim genetskim svetovanjem osebam oz. dru`inam, pri katerih sumimo, da gre za dedno obliko raka. Pri veliki ve~ini oseb, ki so obiskale to ambulanto, je {lo za sum, da gre za dedno obliko raka dojk in jaj~nikov. Omenjeni vrsti raka predstavljata poleg raka {irokega ~revesa in danke najpogostej{o vrsto dednega raka. V prispevku bomo opisali svoje izku{nje z onkolo{kim genetskim svetovanjem pri dednem raku dojk in jaj~nikov. Dedni rak dojk in jaj~nikov ve~inoma povzro~ata mutirana tumorska supresorska gena BRCA 1 in BRCA 2. Ogro`enost za nastanek raka dojk je pri nosilcih mutiranih genov BRCA 1 ali BRCA 2 (pri slednjem tudi pri mo{kih) zelo velika, saj do 70. leta starosti zna{a 60–80 odstotkov. Ob tem je treba poudariti, da je splo{na, do`ivljenjska ogro`enost `ensk za nastanek raka dojk v Sloveniji 5,5 %. Tudi ogro`enost za nastanek raka jaj~nikov je pri nosilkah mutacij ve~ja in zna{a 30–40 odstotkov pri mutaciji gena BRCA 1 (do 70. leta starosti) in 20 odstotkov pri mutaciji gena BRCA 2. Mutacije omenjenih genov so povezane tudi z ve~jo ogro`enostjo za nastanek nekaterih drugih vrst raka; BRCA 1 povezujemo z nastankom raka {irokega ~revesa, BRCA 2 pa z nastankom raka trebu{ne slinavke, ustne votline, `elodca in prostate (1). Od prve identifikacije in kloniranja obeh genov so znanstveniki vpisali v bazo podatkov BIC (Breast Cancer Information Core) `e ve~ kot 3700 razli~nih predispozirajo~ih mutacij, ki se pojavljajo po vsej dol`ini obeh genov. Najve~krat se dolo~en tip mutacije pojavlja le v neki dru`ini. Pri nekaterih skupinah ljudi pa se specifi~na mutacija lahko pojavlja ve~krat v razli~nih dru`inah. Imenujemo jo mutacija founder. Do sedaj so jo najve~krat odkrili pri a{kenazi Judih, Islandcih in Nizozemcih. Ta mutacija zelo poenostavi in poceni genetsko testiranje, kadar je v neki populaciji dovolj pogosta. METODE Bolniki V prvih mesecih delovanja ambulante za onkolo{ko genetsko svetovanje smo aktivno vabili `enske, ki so redno hodile v ambulanto Centra za bolezni dojk na Onkolo{kem in{titutu in so imele tudi obremenjujo~o dru`insko anamnezo z vsaj dvema sorodnicama v prvem/drugem kolenu, ki sta imeli raka na dojkah/jaj~nikih. Po nekaj mesecih pa so splo{ni zdravniki, ginekologi ali pa bolnice same tolikokrat odlo~ili za svetovanje, da smo prenehali aktivno vabiti. Le vse mo{ke z rakom dojk smo povabili pisno. Napotitev v ambulanto za onkolo{ko genetsko svetovanje je indicirana, kadar gre za rak dojk pred 40. letom, bilateralni rak dojk ali rak dojk in jaj~nikov, kadar gre za mo{kega z rakom dojk oziroma ~e je pozitivna dru`inska anamneza: sorodnica v prvem kolenu z rakom dojk pred 40. letom, sorodnik v prvem kolenu z rakom dojk, sorodnica v prvem kolenu z bilateralnim rakom dojk, dve sorodnici v prvem/drugem kolenu z rakom dojk pred 60. letom ali z rakom jaj~nikov ne glede na starost, tri sorodnice v prvem ali drugem kolenu z rakom dojk ali jaj~nikov ne glede na starost. Vsem osebam, ki pridejo na svetovanje, vnaprej po{ljemo formular, na podlagi katerega ustvarimo rodovnik, ter v lai~nem jeziku napisano informacijo o dednem raku dojk in jaj~nikov. Rodovnik omogo~i izra~un, kolik{na je verjetnost mutacije pri neki osebi/dru`ini, {e preden ta pride na prvo svetovanje. Ker se na podlagi vnaprej prebranih informacij o dednem raku pripravi tudi bolnik, je svetovanje mo~no olaj{ano. Pri vseh osebah z ve~ kot 10 % verjetnostjo mutacije genov BRCA 1/BRCA 2 predlagamo genetsko testiranje. Preden naredimo test, preiskovana oseba privoli in podpi{e, da se strinja s testiranjem, potem pa ji vzamemo vzorec venske krvi, da iz levkocitov izoliramo in analiziramo dedni zapis, na podlagi katerega ugotovimo, ali gre za mutacijo na genih BRCA 1 ali BRCA 2. Analiza mutacij Ker sta gena BRCA 1 in BRCA 2 velika, mutacije i{~emo z razli~nimi presejalnimi testi. Tako uporabljamo na velikih eksonih obeh genov (ekson 11 na BRCA 1 in eksona 10 in 11 na BRCA 2) PTT-test (Protein truncation Test), kot ga je opisal F. B. L. Hoegervorst s sodelavci (2). Druge manj{e eksone obeh genov in konca 5’ in 3’velikih eksonov pa analiziramo s F-CSGE-testom (Fluorescence based Conformation Sensitive Gel Electrophoresis), kot ga je opisal Ganguly s sodelavci (3). Dobljene PCR-fragmente nato analiziramo na sekvencionerju (ALF express automatic sequencer – Pharmacia). Vzorci, ki poka`ejo nenormalne vrhove, kar ka`e na prisotnost heterodupleksov (ki nakazujejo mutacijo ali polomorfizem), pozneje sekvencioniramo (Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit – USB) in ugotavljamo tip mutacij. Mutacijo founder pa testiramo s hitro metodo za ugotavljanje ponavljajo~e se mutacije, ki temelji na PCR. Uporabljamo poseben modificiran primer, ki ustvari specifi~no restrikcijsko mesto v divjem tipu fragmenta, ne pa v mutiranem PCR-fragmentu. Po encimski restrikciji se DNA kontrolne skupine pacientov po elektroforezi na agaroznem gelu oblikuje v enojne trakove (oba alela sta odrezana), medtem ko se DNA nosilcev mutacij po ONKOLOGIJA / novosti v onkologiji                                  55 posameznem PCR-fragmentu, ki ote`uje interpretacijo rezultata, dobljenega s F- CSGE-analizo, smo pri vseh sedmih pacientih opravili dodatno neposredno sekvencioniranje eksona 17 na genu BRCA 2. Tako smo to mutacijo (IVS16-2A > G) odkrili {e pri ~lanih dveh drugih dru`in, kjer metoda F-CSGE ni pokazala nobenega heterodupleksa. Poskus smo ponovili na ve~ vzorcih in odkrili, da ni nobene povezave med genotipom in profilom vrha (ki naj bi pri metodi F- CSGE nakazal heterodupleks, torej mutacijo), kar pomeni, da je metoda F- CSGE premalo ob~utljiva in nereproducibilna za ugotavljanje mutacij na eksonu 17 gena BRCA 2. Tako smo za odkrivanje te specifi~ne mutacije na eksonu 17 uvedli hitro, natan~no in reproducibilno metodo z uvedbo testa, ki temelji na restrikciji PCR-fragmenta (kot je opisano v metodah). elektroforezi oblikuje v dva trakova; poleg navadno dolgega traku imamo {e dodatnega, ki je dalj{i (alel divjega tipa je odrezan, mutirani alel pa ne). Napake spojitve obeh alelov, ki nastanejo pri nosilcih mutacij, potrdimo s sekven~no analizo RNA-vzorcev, izoliranih iz levkocitov. Da bi ugotovili, ali gre pri ponavljajo~i se mutaciji v resnici za mutacijo founder, smo za odvzem krvi prosili tudi sorodnike nosilcev mutacije. Vzorce smo alizirali s polimorfnimi ozna~evalci (D13S310, D13S1695, D13S1698, D13S171) – haplotipizacija (4). REZULTATI IN DISKUSIJA V 18 mesecih smo svetovali 158 osebam (140 `enskam, 18 mo{kim). Kar 80 % vabljenih je bilo pripravljenih, da se svetovanja udele`ijo. To je v nasprotju s podatki v literaturi, po katerih je pripravljenost navadno le 25–30 %. Glavni razlog za to je pri osebah na Zahodu verjetno strah pred izgubo delovnega mesta in zdravstvenega zavarovanja. 54 osebam smo predlagali genetski test na prisotnost mutacij v genih BRCA 1 in BRCA 2 in ga tudi opravili. Ob pisanju prispevka {e nimamo kon~nih rezultatov za vse. Trenutno lahko poro~amo o 10 odkritih mutacijah gena BRCA 2 v skupno 5 razli~nih dru`inah in o 2 primerih mutacije gena BRCA 1 v dveh dru`inah. Pri vseh 10 mutacijah gena BRCA 2 gre za isto mutacijo IVS16-2 A > G, za katero se je izkazalo, da je mutacija founder. Ker predstavlja temelj vseh poznej{ih rezultatov poglobljena za~etna laboratorijska analiza prvih sedmih dru`in, ki jo je opravila dr. Mateja Krajc v sodelovanju z Laboratorijem onkolo{ke genetike Svobodne univerze v Bruslju (Vrije Universiteit Brussel), bomo v nadaljevanju nekoliko iz~rpneje poro~ali o prvih sedmih dru`inah (5). Vse so imele bremenilno dru`insko anamnezo in so ustrezale na{im in belgijskim merilom za testiranje BRCA 1/2 (Tabela 1). Glede na belgijske izku{nje in izsledke v literaturi smo pri~akovali, da bomo izolirali dve do tri mutacije, predvsem v dru`inah, v katerih se pojavlja poleg raka dojk tudi rak jaj~nika. Nepri~akovano pa PTT-test, s katerim so v Belgiji na{li ve~ino predispozirajo~ih mutacij, pri slovenskih dru`inah ni pokazal okvare na genih BRCA 1/2. Testiranje smo zato raz{irili {e na manj{e eksone obeh genov ter na konca 3’ in 5’velikih eksonov, in sicer z metodo F-CSGE; pokazali so se nenormalni vrhovi, ki so kazali na heteroduplekse DNA petih PCR-fragmentov. Poznej{e sekvencioniranje teh petih PCR-fragmentov pa je pokazalo prisotnost obi~ajnega polimorfizma, o katerem so `e poro~ali v podatkovno bazo BIC (IVS7-34C > T na BRCA 1 in 203A > G, IVS8 + 56C > T, IVS14 + 53C > T, IVS16-14T > C na BRCA 2). Vseeno pa smo poleg omenjenega polimorfizma v fragmentu, ki pokriva ekson 17 na genu BRCA 2, pri enem pacientu na{li mutacijo (IVS16-2A > G, Slika 1). Zaradi polimorfizma v ONKOLOGIJA / novosti v onkologiji 56 DRU@INA 1 2 3 4 5 6 7 Število bolnikov z rakom dojke 4 6 7 1 4 2 3 Starost ob 43-44-50- diagnozi 45-47-65- NP 50-60-60- 44 43-44-63- 28-42 36-51- 73 61 71 60 Število bolnic z rakom jaj~nika 0 0 3 1 1 0 0 Starost ob diagnozi - - 45-60- NP 79 46 - - Prisotnost raka dojke in jaj~nika 0 0 3 0 0 0 0 pri istem bolniku Število bolnic z bilateralnim 1 0 0 0 0 0 0 rakom dojk Število bolnikov z 1 1 1 drugim malignim rak 0 0 kolorektalni 0 0 plju~ni obolenjem testisov rak rak NP = ni podatka Slika 1 Legenda Slike 1: (a) Mutacija na genu BRCA 2 (IVS16–2A > G) je bila ugotovljena pri treh dru`inah. Normalne mRNA (b) in tudi molekule brez prvih 20 nukleotidov eksona 17 (c) smo na{li v limfocitih nosilcev mutacij. Prepis skraj{anih mRNA pa pri nosilcih te mutacije privede do nastanka kraj{ih (nenormalnih) molekul BRCA 2. Tabela 1: Karakteristike prvih sedmih slovenskih dru`in, pri katerih smo opravili testiranje BRCA 1/2 Prav tako lahko poka`emo, da prvih 20 nukleotidov eksona 17 na mRNA mutiranega BRCA 2 alela v treh dru`inah manjka, kar je posledica napa~nega prepisa z genomske DNA na mRNA (Slika1). V nasprotju s tem pri osmih kontrolnih vzorcih tega primanjkljaja nismo opazili. Zanimivo je, da smo opisano mutacijo na{li izklju~no pri dru`inah, v katerih se pojavlja le rak dojk, kar je v skladu z opisano literaturo. Seveda pa bomo na{o hipotezo, da je mutacija IVS16-2A > G predispozirajo~a izklju~no za rak dojk, lahko potrdili le z analizo ve~jega {tevila dru`in. Ta informacija nam bo v veliko pomo~ pri onkolo{kem genetskem svetovanju, predvsem pri razporedu in tipu kontrolnih pregledov bolnikov in tudi njihovih zdravih sorodnikov, ki so mutacijo podedovali, zboleli pa niso. Prav tako nam bodo izsledki te raziskave lahko pomagali pri raziskovanju molekularnih mehanizmov, odgovornih za nastanek rakaste celice pri nosilcih te specifi~ne ponavljajo~e se mutacije. V podatkovni bazi BIC je mutacija IVS16-2A > G opisana le trikrat. Dvakrat so jo na{li pri Myriadu, in sicer pri Ameri~anih, ki izvirajo iz Zahodne Evrope, enkrat pa jo je v bazo vnesel dr. M. Santarosa iz Aviana, italijanskega mesta, ki je od slovenske meje oddaljeno manj kot 100 kilometrov. To lahko ka`e, da izolirana mutacija izvira in se {iri v populaciji, ki je `ivela in {e `ivi na obmo~ju sedanje Slovenije. Hipotezo u~inka founder smo potrdili s polimorfnimi ozna~evalci ob genu BRCA 2 (Tabela 2). Podobno ugotavljajo tudi Nizozemci; med njihovim prebivalstvom se pojavljata dve mutaciji founder na genu BRCA 1, ki pokrivata pribli`no 36 odstotkov vseh mutacij na genu BRCA 1. Nobena od teh dveh mutacij ni bila odkrita pri belgijskih dru`inah, kar ka`e, da se te mutacije lahko obdr`ijo na zelo majhnem obmo~ju. Op.: V skupini za Onkolo{ko genetsko svetovanje sodelujejo {e Nikola Be{i}, Janez @gajnar, Marjetka Ur{i~ Vr{~aj, Cvetka Bilban Jakopin, Srdjan Novakovi} in Katarina Lokar. Literatura: 1. Ford D, Easton DF, Stratton M et al. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families. Am J Hum Genet 1998; 62: 676–89. 2. Hogervorst FB, Cornelis RS, Bout M et al. Rapid detection of BRCA1 mutations by the protein truncation test. Nat Genet 1995; 10: 208–12. 3. Ganguly T, Dhulipala R, Godmilow L and Ganguly A. High throughput fluorescence-based conformation-sensitive gel electrophoresis (F-CSGE) identifies six unique BRCA2 mutations and an overall low incidence of BRCA2 mutations in high-risk BRCA1-negative breast cancer families. Hum Genet 1998; 102: 549–556. 4. Neuhausen S, Godwin A, Gershoni R et al. Haplotype and phenotype analysis of nine recurrent BRCA-2 mutations in 111 families: results of an international study. American J Hum Genet 1998; 62: 1381–88. 5. Goelen G, Teugels E, Bonduelle M, Neyns B and De Gr~ve J. High frequency of BRCA 1/2 mutations in 42 Belgian families with a small number of symptomatic subjects. Journal of Medical Genetics 1999; 36: 304–8. ■ ONKOLOGIJA / novosti v onkologiji 57 Tabela 2: Rezultati analize haplotipov, ki je bila opravljena na enem bolniku iz vsake dru`ine, v kateri smo uporabili pet razli~nih STR-ozna~evalcev ob lokusu BRCA 2 Dru`ina IVS16-2A > G D13S310 D13S1695 D13S171 D13S1697 1 ne 3/4 5/6 1/6 3/4 2 da 1/4 1/9 1/1 1/3 3 ne 1/1 5/6 1/6 1/3 4 ne 1/2 1/6 1/1 1/9 5 ne 2/4 5/8 1/1 3/4 6 da 3/4 6/9 1/1 3/3 7 da 3/4 6/9 1/1 3/9 Haplotiope, povezane z obolevanjem, smo lahko rekonstruirali pri treh dru`inah z mutacijo (rezultati niso prikazani). Kot je razvidno iz tabele, imajo vse tri dru`ine z mutacijo haplotip 4-9-1-3.