GDK: 813.11:174.7 Larix spp.(045)=163.6 Prispelo / Recived: 28. 1. 2008 Pregledni znanstveni članek Sprejeto / Accepted: 25. 7. 2008 Scientific review paper POLIFENOLI V RAZLIČNIH VRSTAH MACESNA (Larix spp.) Janja zULE1, Gašper KozJAN2 Izvleček V članku so predstavljene različne vrste polifenolnih spojin, kot so npr. lignani, oligolignani in flavonoidi, ki jih najdemo v tkivih macesnov, to je dreves iz rodu Larix. opisana je njihova biosinteza, kemijska struktura in lastnosti, med katerimi je poudarjen predvsem njihov antioksidativni potencial. Predstavljene so metode kvantitativne izolacije iz drevesnih tkiv in kemijske karakterizacije z uporabo sodobnih kromatografskih analiznih tehnik. Raziskave so pokazale, da so največje koncentracije lignanov in flavonoidov v grčah, vejah in skorji dreves. Najpomembnejši med flavonoidi v tkivih macesnov je taksifolin. Glavni predstavnik lignanov, ki jih bomo našli predvsem v grčah, je sekoizolaricirezinol, poleg njega pa sta zastopana tudi laricirezinol in ciklolaricirezinol. Polifenoli so ključnega pomena za obstojnost lesa, saj pomenijo učinkovito kemijsko zaščito pred različnimi okužbami. zaradi visokih koncentracij bioaktivnih lignanov v grčah iglavcev bi slednje lahko rabile kot vir za tehnološko pridobivanje teh dragocenih komponent. Ključne besede: macesen (Larix spp.), polifenoli, lignani, oligolignani, flavonoidi, obstojnost lesa, antioksidativne lastnosti, kemijska karakterizacija POLYPHENOLS IN DIFFERENT LARCH (Larix spp.) SPECIES Abstract Various types of polyphenolic compounds, .such as lignans, oligolignans and flavonoids, which occur in different tissues of wood from the larch (Larix) genus, are presented in the article. Their biosynthesis, chemical structure and properties, including a distinctive antioxidative potential, are described. The methods of quantitative isolation from wood as well as their chemical characterization by means of sophisticated chromatographic analytical techniques are presented. It has been experimentally established that the highest concentrations of lignans and flavonoids are present in knots, branches and bark of trees. The most important flavonoid in larch tissues is taksifolin, while the predominating lignans in knots are secoisolariciresinol and less abundant lariciresinol and cycloisolariciresinol. The presence ofpolyphenols is crucial for wood durability, as these compounds represent efficient chemical protection of wood against biological decay. Due to high concentrations of bioactive lignans in knots of conifers, the latter represent a suitable source for technological production of valuable substances. Key words: larch (Larix spp.), polyphenols, lignans, oligolignans, flavonoids, wood durability, antioxidative properties, chemical characterization zbornik gozdarstva in lesarstva 86 (2008), s. 51 - 58 UVOD INTRODUCTION Macesne oz. drevesa iz rodu Larix uvrščamo med golo-semenke iz družine Pinaceae. Najdemo jih v hladnejši delih severne hemisfere, kot so npr. Aljaska, Kanada in rusija. Macesni rastejo tudi v goratih predelih zDA, v evropskih Alpah in Karpatih, Mongoliji, Kitajski, Koreji in Japonski (GIERLINGER et al. 2004). V rod Larix uvrščamo Larix de-cidua Mll. ali evropski macesen, Larix kaempferi (Lamb.) carr. ali japonski macesen, Larix sibirica Ledeb., Larix gme-lini Rupr. Kuzen, katerega rastišče se razprostira v severnemu delu Kitajske (Snen et al. 1986), Larixgmelinii ^upr.) Kuzen. var. olgensis (A^enry) ostenf. & Syrach, katerega področje je v kitajskih provincah Jilin in heilongjiang (Yang et al. 2005), Larix laricina (Du RoF) Koch, Larix potaninii Batalin, ter druge vrste in podvrste iz roda Larix. evropski macesni lahko zrastejo prek 50 m v višino in imajo premer tudi do 1,5 m. Posamezna drevesa lahko dosežejo starost celo več kot 600 let. Tipična za macesnov les sta rumenkasta beljava in rdečerjava črnjava. cenjen je zaradi dobrih mehanskih lastnosti, barve, značilnega ustroja in naravne obstojnosti. Uporabljajo ga predvsem v gradbeništvu in pohištveni industriji. OBSTOJNOST LESA WOOD DURABILITY Naravna obstojnost ali odpornost lesa na trohnenje je sposobnost, da se ta upre biološkemu razkroju (EAToN / Hale 1 mag. J. z. Inštitut za celulozo in papir, bogišičeva 8, 1000 Ljubljana, SLo 2 G. K, univ. dipl. inž. les., Javor Pivka, Snežniška cesta 12, 6257 Pivka 1993). Predvsem je pomembna obstojnost čmjave, ki sestavlja notranji del debla z nižjo vsebnostjo vlage. Črnjava je obarvana jedrovina, ki ne vsebuje več živih celic, nakopičene rezervne snovi pa so se odstranile oz. pretvorile v ekstraktivne spojine. Ekstraktivi so heterogena skupina kemijskih spojin, med katere prištevamo tudi terpenoide, tropolone, flavonoide, stilbene, lignane in druge aromate oz. polifenole (ScHEFFER / coWLING 1966). Povezavo med vsebnostjo ekstraktivov v črnjavi in naravno obstojnostjo so preučevali že številni avtorji (HAWLEY / FLEcK / RIcHARDS 1924; RUDMAN 1963; Schultz et al 1990; Schultz et al. 1995; scal- BERT 1991; DEBELL / morrell / gartner 1997, Œ-LIMENE et al. 1999). Čeprav imajo posamezni izolirani ekstraktivi nizko biocidno aktivnost, ustrezne kombinacije spojin po vsej verjetnosti delujejo sinergistično, pri čemer se njihova biocidnost in antioksidativni potencial močno povečata (ScHULTz / Nicholas 2002). Vsekakor na obstojnost lesa pomembno vplivata tako celokupna količina ekstraktivov kot tudi njihova porazdelitev v drevesnih tkivih CHILLIS 1987; KLEIST / Schmidt 1999). številne analize so pokazale, da je pri iglavcih precej več bioaktivnih komponent v grčah, vejah, skorji in celo koreninah kot pa v jedrovini drevesnih debel (holmbom et al., 2003). Grče iglavcev tako v povprečju vsebujejo 5-15 %, v nekaterih ekstremnih primerih pa tudi do 30 % polifenolov, med katerimi prevladujejo lignani, ki sodijo med najbolj učinkovite naravne antioksidante in bio- cide. Njihova primarna funkcija je kemijska obramba drevesa pred vdorom mikroorganizmov, lahko pa sodelujejo tudi pri regulaciji rasti. Polifenoli tudi bistveno vplivajo na naravno obarvanost lesa. Ker je njihova sinteza genetsko regulirana, vsebuje vsaka drevesna vrsta specifične spojine, po katerih se loči od drugih sorodnih vrst. SINTEZA, VRSTE IN LASTNOSTI POLIFENOLOV SYNTHESIS, TYPES AND PROPERTIES OF POLYPHENOLS Polifenoli sestavljajo heterogeno skupino spojin, katerih molekule vsebujejo dve ali več fenolnih skupin. Njihova sinteza poteka po šikamatni in fenilpropanoidni poti in je predstavljena na sliki 1. Med polifenole prištevamo tanine, stilbene, lignane, kino-ne in flavonoide. Strukturne formule tipičnih predstavnikov posameznih skupin so prikazane na sliki 2. Flavonoide sestavlja c6c3c6 ogljikov skelet, medtem ko strukturo stilbenov karakterizira konjugirana dvojna vez. za lignane je značilna oksidativna sklopitev dveh fenilpropan-skih (c6c3) enot prek vezi med ß-mestoma na propanskih stranskih verigah. Poleg dimernih lignanov se v lesu pojavljajo tudi manjše količine trimerov in tetramerov, ki jih v splošnem imenujemo oligolignani (SJÖSTRÖM 1981). Lignani E4P PEP Ftnlprcpanoidnapot Legenda: E4P eritroza-4-fosfat PEP fosfoenolpiruvat DAHP 3-deoksi-D-arabinoheptulosonat-7- fosfat DHQ dehidrokvinat DHSh dehidrošikimat QA kinijskna kislina šikimijskna kislina fenilalanin hidroksibenzojska kislina hidroksicimetna kislina. ShA PhA c6-c c6-c Slika 1: Sinteza polifenolnih spojin v iglavcih (Shein et al. 2001) Fig. 1: Synthesis of polyphenolic compounds in conifers (Shein et al. 2001) STILBEN1 Pinosilvm Pinorezinol HO OCHj KOMPONENTI HIDROLIZI RAJ OČI H TANINOV o. w HO HO—^ ^—COOH HO Ga I na kislina FLAVONOIDI oh OH HO. W OH O Tgkçifqlin OH Elagna kislina IZOFLWONI oh OH Slika 2: Predstavniki polifenolnih skupin Fig. 2: Representative polyphenolic compounds se ne pojavljajo le v olesenelih delih rastlin, marveč tudi v listih, cvetovih, sadežih in semenih. Doslej so jih identificirali že nekaj sto. Najbolj znani lignani v iglavcih so: pinorezinol, laricirezinol, sekoizolaricirezinol, matairezinol, ciklolaricire-sinol, hidroksimatairezinol, a-konidendrin in a-konidendrin-ska kislina (WILLFÖR / SMEDS / HoLMBoM 2006). Vsebnosti nekaterih lignanov v rastlinskih tkivih, sadežih in prehrambnih proizvodih so prikazane v tabeli 1, iz katere je razvidno, da se izrazito visoke koncentracije lignanov pojavljajo v drevesnih grčah. Lignani in številni drugi rastlinski polifenoli so zelo učinkoviti antioksidanti. To so kemijske spojine, ki zaradi svoje specifične elektronske konfiguracije preprečujejo ali upo-časnjujejo oksidacijo drugih življenjsko pomembnih spojin v živih tkivih, ki so izpostavljena prostim radikalom. Prosti radikali, kot npr. superoksidni ali peroksidni anioni, so zelo reaktivne molekule, ki s svojo aktivnostjo poškodujejo celice, ker v njih tvorijo nove proste radikale. Največkrat povzročajo oksidativne spremembe lipidov, proteinov in deoksiribo-nukleinske kisline. Po reakciji z molekulami antioksidantov prosti radikali pridobijo manjkajoče elektrone in se pretvorijo v stabilno stanje ter tako ne morejo več povzročati degenerativnih sprememb v celicah. zaradi visoke vsebnosti polifenolov v različnih drevesnih vrstah in njihovega antioksidativnega oz. zaščitnega delovanja je v zadnjih letih čedalje več raziskav posvečenih njihovi izolaciji, kemijski, biološki in fiziološki karakterizaciji ter njihovi potencialni uporabnosti v farmacevtski in živilski stroki. IZOLACIJA IN KEMIJSKA KARAKTERIZACIJA ISOLATION AND CHEMICAL CHARACTERIZATION za določitev sestave in koncentracij polifenolnih spojin v lesu je treba le te izolirati iz matriksa, pri čemer pa se ne smejo kemijsko spremeniti. Vzorčenje lesa, shranjevanje in predobdelava vzorcev so ključnega pomena za uspešnost celotne analize. Pomembno je pridobiti reprezentativne vzorce in jih po odvzemu čimprej zamrzniti, da se izognemo nežele- Preglednica 1: Količine izbranih lignanov (pg/g suhe teže) v hrani, rastlinah ter lesnih tkivih (Willför / Smeds / Holmbom 2006) Table 1: Concentrations of selected lignans (ßg/g dry weight) in foods, plants and wood tissues (Willför / Smeds / Holm- bom 2006) Material Sekoizolariciresinol Matairezinol Laricirezinol Hidroksimatairezinol Pinosrezinol Lanena semena 3700 10,9 2900 5,5 30,4 33,2 12600 58,6 Sezamova semena 293 4,8 95 0,7 Rženi otrobi 1,3 1,7 Ržena moka 7,2 1,7 Temen ržen kruh 0,1 0,1 1,2 1,7 zeleni ohrovt 0,2 0,1 6 16,9 Brokoli 4,1 0,2 0,4 0 9,7 3,2 Česen 0,5 0 2,9 2 Jagode 15 0,8 0 0 1,2 2,1 olivno olje 0 0 0 2,4 Črni čaj 24,2 3 zeleni čaj 28,9 2 Picea abies jedrovina 3-370 10-520 17-370 10-20 Picea abies grče 1400-6800 1700-5500 1000-2500 3600-88000 sledovi Abies alba jedrovina 140 250 180 150 20 Abies alba grče 29000-36000 2500-2600 4600-10000 7000-7800 360-1000 nim reakcijam, kot so oksidacija, polimerizacija in encimat-ske pretvorbe. Pred samo izolacijo sta potrebna še sušenje in mletje v čim milejših razmerah (sušenje z zmrzovanjem, vakuumsko sušenje, mletje s hlajenjem). Ekstrakcijo polifenolov lahko opravimo z različnimi ekstrakcijskimi tehnikami in z uporabo različnih organskih topil. Navadno se uporabljajo kombinacije topil, in sicer klo-roforma in etil acetata (SHEN et al. 1986), etanola, klorofor-ma in etil acetata (Yang et al. 2005a, Yang et al. 2005b), acetona (95 %) in vode (5 %) (WILLFÖR et al. 2003a), kloroforma, etil acetata in metanola (oHTSU / TANAKA / MATSUNAGA 1998a), etanola, vode, etil acetata in butanola (XUE et al. 2004) ter čisti topili kloroform (oHTSU et al. 1998) in metilen klorid (oHTSU / TANAKA / MATSUNAGA 1998b). Kvalitativno in kvantitativno analizo lahko napravimo s pomočjo različnih vrst kromatografije, kot so tankoplastna (TLc), tekočinska (HPLc) ali plinska (Gc), in z uporabo različnih vrst detektorjev, pri čemer velja omeniti masni spektrometer (MS). Analizni postopek za določitev polifenolov je prikazan na sliki 3. SPECiFiČNi POLiFENOLi V RAZLiČNiH VRSTAH IZ RODU LARIX SPECIFIC POLYPHENOLS IN DIFFERENT SPECIES FROM LARIX GENUS Najbolj raziskane vrste macesna so sibirski (Larix sibirica Ledeb.) in japonski macesen (Larix kaempferi (Lamb.) carr.). Po literaturnih podatkih vsebujejo japonski macesni večjo koncentracijo polifenolov kot drugi predstavniki (GIERLIN-Ger et al. 2004). Pri raziskavah so številni avtorji ugotavljali povezavo med vsebnostjo polifenolov in odpornostjo proti glivam, ki razgrajujejo les (WINDEISEN et al. 2002; GIER-LINGER et al. 2002). Ruski strokovnjaki so se osredotočili na pridobivanje bioaktivnih komponent iz odpadnih oz. tehnološko nepomembnih delov dreves, kot so npr. skorja in veje (LAPTEVA / TYUKAVNIKA / RYZHOVA 1971; BABKIN et al. 2001; ALEKSANDRoVA et al. 2004). Pri analizah hidrofilnih ekstraktivov različnih vrst macesna so avtorji ugotovili, da sta v vseh prevladujoči polifenolni komponenti flavonoida, in sicer taksifolin (dihidrokvercetin oz. 3,3', 4',5,7-pentahidroksiflavanon, c15H12O7) in aroma-dendrin (dihidrokamferol-3,4',5,7-tetrahidroksiflavanon, Slika 3: Shema analize lignanov, flavonoidov in stilbenov (Willför / Smeds / Holmbom 2006) Fig. 3: Scheme of lignan, flavonoid and stilbene analysis (Willför / Smeds / Holmbom 2006] c15H1206), v manjši meri pa se pojavljata tudi kvercetin (3,5,7,3',4'- pentahidroksiflavon) in kamferol (3,5,7,4' - te-trahidroksiflavon). Posamezne vrste se med seboj razlikujejo tako po celokupni vsebnosti flavonoidov kot tudi po utežnem razmerju med posameznimi spojinami. Zanimiv je podatek, da so izmerili v jedrovini evropskega macesna v povprečju okrog 1,15 % aromadendrina in taksifolina, medtem ko ju je v japonskem macesnu skupaj kar 2,50 %, preračunano na suho težo lesa. Tudi razmerje med njima je v obeh primerih različno. Medtem ko sta obe spojini približno enako zastopani pri evropskem macesnu, pa je pri japonskem macesnu bistveno več taksifolina (GRIPENBERG 1952; BREWERTON 1956; NAIR / VON RUDLOFF 1959; NAIR / VON RUDLOFF 1959; BARTON / GARDNER 1960; GIWA / SWAN 1975). Flavonoidov je precej več v jedrovini kot v beljavi debla. Njihova koncentracija raste v radialni smeri od sredine navzven, tako da so največje vsebnosti prav na meji jedrovina-belja-va. V svoji primerjalni študiji je KOLHIR s sodelavci (1996) primerjal antioksidativne lastnosti taksifolina, izoliranega iz macesna, s komercialnim zdravilom kvercetinom. Prišel je do ugotovitve, da je izolirani taksifolin učinkovitejši antioksi-dant kot sintetično pripravljeni kvercetin. Polifenoli so tudi dobro zastopani v skorji in grčah macesnov. SHEN in sodelavci (1986) so iz skorje sibirskega macesna ekstrahirali lariksinol, (-)-epiafzelehin, (+)-katehin ter (-)-epikatehin. Yang in sodelavci (2005a; 2005b) so se sistemsko lotili kemijske analize skorje macesna. Izolirali so (-)-7-hidroksilaricirezinol 9'-p-kumarat, (+)-laricirezinol 9'-kofeinat, (+)-izolaricirezinol 9'-p-kumarat, (7R, 8S)-3'-O-metilcedrusin 9-p-kumarat ter laricirezinol 9'-p-kumarat, za katerega so s preliminarnimi testi ugotovili, da ima inhibitor-ne učinke na rast tumornih celic. SHEIN in sodelavci (2001) so opazovali akumulacijo polifenolov v kalusu Larix sibirica Ledeb. Pri izpostavitvi lesa modivkam Ceratocystis laricico-la in Ceratocystis polonica so polifenoli bistveno prispevali k odzivu drevesa na infekcijo. Polifenolni ekstrakt iz skorje Larix sibirica Ledeb. je pokazal precej večjo bioaktivnost kot komercialni antioksidant ionol (KHAIRULLINA et al. 2006). Iz grč evropskega macesna je WILLFÖR s sodelavci (2003b) ekstrahiral polifenolne komponente, med katerimi je bilo v ekstraktu okoli 40 % lignanov, 18 % oligolignanov in 17 % flavonoidov. Med lignani so prevladovali izolarici-rezinol, laricirezinol in sekoizolaricirezinol. Lignani in oligolignani dominirajo tudi v ekstraktih grč zvrsti , Larix laricina (Du Roi) Koch in Larix sibirica Ledeb. V obeh primerih je bilo v grčah največ sekoizolaricirezino-la (PIETARINEN et al. 2006a). Tabela 2 prikazuje vsebnosti polifenolnih skupin in posameznih komponent, pojavljajočih se v ekstraktih grč Larix laricina (Du Roi) Koch in Larix si-birica Ledeb. Strukturne formule tipičnih lignanov, ki se pojavljajo v različnih vrstah iz rodu Larix prikazuje slika 4. Preglednica 2: Vsebnost polifenolov v ekstraktih grč v dveh vrstah macesna (Larix laricina (Du Roi) Koch in Larix sibirica Ledeb.) Table 2: Polyphenole content in knot extracts of two larch species (Larix laricina (Du Roi) Koch in Larix sibirica Ledeb.). Spojina Larix laricina (Du Roi) Koch Larix sibirica Ledeb. Lignani 22 % 24 % Sekoizolaricirezinol 15 % 15 % Laricirezinol 4 % Nortakelogenin 1 % Ciklolaricirezinol 3 % Todolaktol A+ Izoliovil 2 % 2 % oligolignani 12 % 15 % Flavonoidi 13% 4 % Taksifolin 11 % 3 % GRČE IGLAVCEV - NAJBOGATEJŠI ViR LIGNANOV V NARAVI KNOTS OF CONIFERS - THE REACHEST SOURCE of lignans IN NATURE Grče iglavcev vsebujejo v povprečju 20-100krat večjo koncentracijo polifenolov kot jedrovina. Najbolj raziskane so različne vrste smrek, predvsem navadna smreka (Picea abies Karst.), nekatere vrste jelk (Abies) in rdeči bor (Pinus sylvestris L.). Razlike med njimi so znatne. za navadno smreko je tipična visoka vsebnost hidroksimatairezinola (HMR), ki je pri številnih poskusih pokazal močno antikancerogeno in antimikrobno delovanje. V jelkah (Abies lasiocarpa, Abies balsamea) je prevladujoča spojina sekoizolaricirezinol, zaznati pa je tudi precej višjih lignanov oz. oligolignanov. V grčah rdečega bora je glavni lignan (-)-nortrakelogenin, poleg tega pa je najti tudi precej stilbenov. o polifenolni sestavi grč macesnov je manj podatkov, vsekakor pa prevladujeta sekoi-zolaricirezinol in laricirezinol. Nedvomno so grče potencialna surovina za pridobivanje posameznih bioaktivnih komponent. Na Finskem je leta 2005 stekla industrijska proizvodnja HMR, pri kateri kot izhodiščni material uporabljajo odpadne grče lesa navadne smreke, ki je sicer namenjen proizvodnji celuloze. Shema postopka je prikazana na sliki 5. Lignane najprej ekstrahirajo iz grč z etanolom, nato iz zmesi oborijo HMR z dodatkom kalijevega acetata. Nastali adukt ima 90 - 95 % čistost. Grče, ki motijo proizvodnjo celuloze, bi sicer sežgali, tako pa postanejo koristna surovina. ocenjujejo, da je možno pri dnevni predelavi 1000 ton smrekovine v celulozna vlakna pridobiti 100 ton HMR letno. HMR je že na tržišču kot pre-hransko dopolnilo (HoLMBoM et al., 2007). Prihodnje raziskave bodo nedvomno usmerjene tudi k preučevanju polifenolov v vrstah, kot so npr. macesni, ki pa so zaradi svojih specifičnosti še posebej zanimivi. ZAKLJUČEK conclusion Dobro naravno obstojnost in specifično barvo lesa različnih vrst macesna gre pripisati njihovi specifični polifenolni sestavi. V jedrovini prevladujejo flavonoidi, v grčah in skorji pa je najti tudi lignane. Vse navedene skupine odlikujejo antioksidativne lastnosti, ki bi se jih dalo s pridom izrabljati za različne tehnološke namene. Ker so največje koncentra- Srn rekov les —► Mletje —Prebiranje —Razvlaknjevanje —TMP vtakna i t Preveliki se kanci ; Ločevanje Grče Navaden les Bioenercfija , Obarjanje HMR lignan Surov ekstrakt —*■ ^ M \