ZORA KOROŠEC-KORUZA PROUČEVANJE USTREZNIH METOD ZA ODKRIVANJE VIROZ V SELEKCIJI VINSKE TRTE (Vitis vinifera) ZA OTKRIVANJE VIRUSNIH ZARAZA U SELEKCIJI VINOVE LOŽE (Vitis vinifera) DISERTACIJA Ljubljana-Zagreb, 1990 SVEUČILISTE U ZAGREBU FAKULTET POIJOPRIVREDNIH ZNANOSTI ZORA KOROŠEC - KORUZA PROUČEVANJE USTREZNIH METOD ZA ODKRIVANJE VIROZ V SELEKCIJI VINSKE TRTE (Vtis vinifera ) ISTRAŽIVANJE POGODNIH METODA ZA OTKRIVA^JE VIRUSNIH ZARAZA U SELEKCIJI VINOVE LOŽE (Vitis vinifera) DISERTACIJA Ljubljana - Zagreb, 1990 Predložena disertacija je predana na oceno Fakulteti poljoprivrednih znanosti SveučiliSta u Zagrebu z namenom pridobitve znanstvene stopnje doktorja poljoprivrednih znanosti iz područja zaštite bilja. Disertacija je opravljena delno na Zvodu za zaštitu bilja Fakultete poljoprivrednih znanosti v Zagrebu in delno v laboratoriju in na poskusnem posestvu Biotehniške fakultete (Ljubljana - Nova Gorica). Delo obsega 74 strani in vključuje 18 tabel, 5 grafov, ..... strani prilog in 4 fotografije, ter citira 98 referenčnih bibliografskih del. Ob tej priliki se iskreno zahvaljujem prof. dr. Ani Sarič, ki mi je kot mentor te disertacije pomagala pri pripravi in izpeljavi dela, ter me uvedla v čudoviti svet virologije. Hvala tudi kolegom iz proizvodnje, ki so mi z materialom in delom na terenu pomagali pri izpeljavi poskusov, ter kolegom iz Kmetijskega instituta Slovenije za uporabo njihovih aparatur. Doktorska disertacija je bila zagovarjana na Fakulteti poljoprivrednih znanosti Sveučilišta u Zagrebu 29.IV.1991 pred komisijo: dr. Ana Šarič, redni profesor dr. Ranko Licul, redni profesor dr. Slava Doberšek-Urbanc, redni profesor Biotehniške fakultete v Ljubljani dr. Bogdan Cvjetkovič, redni profesor UDK IZVLEČEK Korošec - Koruza Z.: Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz v selekciji vinske trte ( Viti s vinifera) V primerjavi z rezultati opravljene selekcije vinske trte v Sloveniji je bila preizkušena in standardizirana metoda ELISA (enzimsko imunosorbcijski test) in indeksiranje za GFV (grapevine fanleaf virus), GLRaV s (grapevine leafroll associated viruses) in za kompleks bolezni razbrazdanja lesa, GSP (grapevine stem pitting complex). Zanesljivost ELISA je velika od 88% do 98% pri odkrivanju GFV, za ostale bolezni mora biti metoda kombinirana z indeksiranjem. V neselekcioniranem materialu cv. 'rebula' in starih trt je veliko okužb z GFV (do 34%) in tudi od 2% - 12 % okužb v trsih, odbranih za razmnoževanje. Višina odkritih okužb je obratno sorazmerna s stopnjo selekcije. Ugotovljena je prepletenost pojava deformacije plodnice v cvetu z okužbo GFV. Preliminarni ELISA testi za GLRaV so odkrili tip I pri cv. 'refošk' in 'žametovka', manj je tipov II in III, nikoli v mešani okužbi. Etiologija bolezni GLR in GSP ni povsem pojasnjena. Podana je shema zdravstvene in klonske selekcije za vinograde v Sloveniji, ki sledi podobnim shemam v državah EGS. UDC 532.38:576.858.8:634.835 Korošec - Koruza Z.: The study of adequate methods for virus diseases diagnosis in the selection of grapevine ( Viti s vinifera) Enzyme immunosorbent assay (ELISA) and the indexing procedure for GFV (grapevine fanleaf virus), GLRaV s (grapevine leafroll associated viruses) and grapewine wood desorders diseases were standardised and compared with the results of the grapevine selection work in Slovenia. The accuracy of the ELISA showed to be high in detecting GFV (88% to 98%). In the čase of the other non selected vines of cv. 'rebula' and some old grapevine varieties the incidence of the GFV is high up to 34%, in the group of the selected vines the infections are less frequent from 2% to 12%. The incidence of the GFV is reverse proportional to the degree of the selection work. The GFV is often intermixed with the staminate flower. The preliminary ELISA for the GLRaV revealed the infections with the type I for cvs. 'refošk' and 'žametovka', type II and III are rare, they never occured in the mixed infections. The etiology of the grapevine leafroll and wood desorders diseases has not been cleared out completely. The scheme for the clonal and sanitary selection work in viticulture in Slovenia have been proposed following the programmes in the CEE countries. v KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 i UVOD i 1.1 OBRAZLOŽITEV TEME 2 12 VIRUSNE BOLEZNI VINSKE TRTE IN NJIHOVI POVZROČITELJI 4 1.2.1 NEPO virusi 4 1.2.2 Clostero virusi 6 1.2.3 Kompleksne in virozam podobne bolezni z nepojasnjeno etiologijo 7 1.3 DIAGNOSTIKA VIRUSOV IN VIROZ 9 1.3.1 Prenos virusov na zeljaste rastline 9 1.3.2 Dokazovanje bolezni s trtnimi indikatorji 9 1.3.3 Imunokemljske metode odkrivanja virusov 11 1.3.3.1 Imunodifuzija v gelu 12 1.3.3.2 Enzimsko-imunosorbcijski test (ELISA) 12 1.4 ZDRAVSTVENA SELEKCIJA VINSKE TRTE 14 1.4.1 Pridelava zdravega t rs ne ga materiala v svetu 14 1.4.2 Zdravstvena slika matičnih vinogradov v Sloveniji 15 2 MATERIAL IN METODE DELA 17 2.1 TESTIRAM MATIČNI TRSI 18 2.1.1 Cv. ' rebula* 18 2.1.2 Cv. ' refosk' 19 2.1.3 Trsi iz programa klonske selekcije in genske banke 19 2.1.4 Cv. * malvazija' 20 2.1.5 Podlage in indikatorji 21 2.2 METODE ZA VREDNOTENJE MATIČNIH TRSOV 22 2.2.1 Pozitivna množična selekcija (P) 22 2.2.2 Odbira tipov in elit 22 2.3 DOKAZOVANJE VIRUSOV Z BIOTESTI 23 2.3.1 Prenos na zeljaste rastline 23 2.3.2 Indeksiranje 23 2.4 EUSA TEST 24 2.4.1 Tehnična izvedba: kemikalije, serumi in oprema 24 2.4.2 Metode za interpretacijo rezultatov 27 3 REZULTATI 28 3.1 UPORABNOST EUSA TESTA ZA ODKRIVANJE GFV 29 3.1.1 Tehnične zahteve testa in njegova zanesljivost 29 3.1.2 Interpretacija rezultatov 31 3.1.3 Čas vzorčenja in vrsta materiala za EUSA teste 37 3.2 SELEKCIJA MATIČNIH TRSOV cv. REBULA 39 3.2.1 Vrednotenje rezultatov pozitivne selekcije z EUSA testi na GFV 39 3.2.2 Zastopanost posameznih znakov kužne izrojenosti v E+ in E- skupini 39 3.2.3 Razlike v pridelku med selekcijskimi skupinami 40 3.2.4 Primerjava rezultatov biotestov in testov EUSA za GFV 41 3.2.5 Ugotavljanje in vrednotenje tipov cv. rebula 42 VI KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 3.3 ODKRIVANJE GFV V MATERIALU KLONSKE SELEKCIJE, STARIH SORT IN PRI VZORČENJU V TRSNICI - ELISA TEST 45 3.4 ODKRIVANJE ArMV Z EUSA TESTOM 46 3.5 UGOTAVLJANJE BOLEZNI RAZBRAZDANJA LESA (GSP) IN ZVIJANJA LISTOV (GLR) 47 3.5.1 Znaki in obseg bolezni pri cv. ' refosk' -morfološka selekcija 47 3.5.2 Povezave GSP z boleznijo kužne izrojenosti (GFV) 48 3.5.3 Znaki in obseg bolezni pri cv. žametovka - morfološka selekcija 48 3.5.4 Indeksiranje na GSP in GLR bolezni 48 3.6 ODKRIVANJE CLOSTEROVIRUSOV Z EUSA TESTOM 50 4 RAZPRAVA 55 4.1 UPORABNOST IN REZULTATI ENZIMSKO-IMUNSKEGA TESTA EUSA 56 4 2 USPEŠNOST METOD ZDRAVSTVENE SELEKCIJE 59 4.3 PROGRAM VKLJUČEVANJA ZDRAVSTVENE SELEKCIJE V SELEKCIJO VINSKE TRTE V SLOVENIJI 60 5 SKLEPI 62 64 73 74 75 76 6 LITERATURA 7 POVZETEK 8 SAZETAK 9 SUMMARY 10 PRILOGE ŽIVLJENJEPIS KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 KAZALO TABEL Tabela 1: Seznam indikatorjev za določanje viroz vinske trte, ICVG 1987 OIV, 1987 (60) 10 Tabela 2: Reakcije posameznih indikatorjev na bolezen zvijanja listov in kompleks razbrazdanja lesa, diferencialno indeksiranje (56). 11 Tabela 3: Razpored, obseg in namen ELISA testov - zbirni podatki po serijah (1 - 12), glej tudi prilogo 1 25 Tabela 4: Zbirni prikaz rezultatov ponovljenih ELISA testov za GFV, po posameznih trsih in serijah testov (1983-1985) 30 Tabela 5; Primerjava spektrofotometričnega odčitavanja ELISA testov za GFV (X = 405 nm) in vizuelnega odčitka po rumeni barvi (viz +; viz -; viz + -), ter izračun praga, serija 7, 1985 32 Tabela 6: Spektrofotometrično odčitavanje rezultatov ELISA za GFV (X =405 nm) pri podlagah vzorčenih iz trsnice in izračun praga, serija 7, 1985 34 Tabela 7: Spektrofotometrično odčitavanje rezultatov ELISA za GFV (X=405tim) pri rebuli (elite) in pozitivnih (E ) trsih, serija 8, 1988 36 Tabela 8: Primerjava rezultatov testiranja (ELISA) za GFV ob vzorčenju maj - junij vs. september, v istem letu in/ali kasnejših letih 38 Tabela 9: Prekrivanje rezultatov pozitivne selekcije in testov ELISA za GFV, grupiranje po pozitivni selekciji. 39 Tabela 10: Zastopanost posameznih znakov bolezni kužna izrojenost v E+ in E" skupini, rebula, Ampelografski vrt, 1983-1986 39 Tabela 11: Povprečne vrednosti treh elementov rodnosti (za n št.trsov v skupini), rebula Ampelografski vrt, 1983 40 Tabela 12: Primerjava rezultatov biotestov in ELISA testov za GFV pri cv. 'rebula', Ampelografski vrt (1983 - 1985) za 25 trsov in njihove povprečne ocene v pozitivni selekciji (P) 41 Tabela 13: Podatki o pridelkih pri različnih tipih rebule, Ampelografski vrt, 1988 43 Tabela 14: Prekrivanje okužb GFV in ArMV pri cv. rebula, Ampelografski vrt, 1985, ELISA test 46 Tabela _15: Trsi z znaki razbrazdanja, cv. 'refošk', Tomaj (Vodopivec M.), 1985-1988 po podlagah. 47 Tabela 16: Zbirni rezultati indeksiranja na GLR - GSP kompleks za refošk in žametovko, 1984-1988 49 Tabela 17: Rezultati ELISA testov za liste trt z znaki zvijanja in rdečenja - GLR in z znaki razbrazdanja lesa GSP (Gugerli, 1987 os. inform.) 50 Tabela 18: Rezultati ELISA za GLRaV tip I. (žametovka, laški rizling, refošk), 1989 52 1 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1 UVOD 2 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.1 OBRAZLOŽITEV TEME Vinogradništvo se v iskanju kakovostne in racionalne proizvodnje vse bolj obrača k selekciji. Trto sadimo in odbiramo za 20 let ali več in mnogokrat kasnejši agrotehnični ukrepi ne presežejo rezultatov pravilno zastavljene in opravljene selekcije. Ker se trta za proizvodnjo razmnožuje le vegetativno, je selekcija osnovni način žlahtnenja, po katerem se dobre lastnosti najdejo, prenašajo in ohranjajo. V selekciji vinske trte, ki traja odkar človek goji trto, se je v zadnjih letih poleg genetske t.i. klonske selekcije uveljavil še pojem zdravstvene selekcije. Pri vegetativnem razmnoževanju trte se enako in obenem z genetskimi lastnostmi prenašajo tudi virusi in njim podobni organizmi. Njihova prisotnost lahko izzove motnje, ki povsem prekrijejo dobre genetske lastnosti trte. Odkrivanje in preučevanje teh motenj je naloga zdravstvene selekcije. Tako kot v drugih vejah rastlinske proizvodnje so se tudi v vinogradništvu začele uveljavljati sodobne metode za prepoznavanje in odpravljanje virusnih in njim podobnih bolezni. V Sloveniji ima vinogradništvo še vedno pomemben delež tako po površini, kakor tudi po gospodarskem deležu proizvodnje, čeprav so se vinogradi od 39.000 ha pred drugo svetovno vojno zmanjšali na sedanjih 21.000 ha. Krizo, v kateri se je znašlo vinogradništvo obenem z ostalim gospodarstvom in še posebej s kmetijstvom, lahko prebrodi le z visoko kvaliteto in čimboljšim izkoristkom naravnih danosti. To nudi domač, visoko selekcioniran sadilni material. Množična pozitivna selekcija, predvsem žlahtnih trt, manj pa podlag, se v Sloveniji opravlja zakonsko že vrsto let in iz tega osnovnega dela izhajajo tudi že prvi rezultati klonske selekcije. Kar tej selekciji manjka, je zdravstvena selekcija, kot jo opravljajo v ostalih vinogradniško pomembnih deželah Evrope in v svetu. Pri opravljanju pozitivne množične selekcije sem opazila veliko virusnih obolenj in spoznala, da okužbe ostajajo v mladih vinogradih kljub temu, da so bili izhodiščni matični trsi zanje že vizuelno pregledani. Z začetki klonske selekcije je bilo nujno vpeljati nove metode za odkrivanje virusov in jih tudi prilagoditi oziroma povezati z vsem selekcijskim delom v program, primeren za proizvodnjo brezvirusnega ali testiranega trsnega materiala. Enzimsko - imunosorbcijske metode, predvsem ELISA test, so uspešno vpeljane pri proizvodnji brezvirusnih rastlin pri mnogih kulturah. Ker je bil tudi nam potreben test, ki bi lahko vključil večje serije materiala, sem se odločila, da ga preizkusim. 3 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Najprej sem ga uporabila za odkrivanje najbolj znane bolezni, kužne izrojenosti (povzročitelji NEPO virusi), nato pa še za kompleks bolezni zvijanja listov in razbrazdanja lesa (povzročitelji closterovirusi). V mejah možnosti zastavljenega dela sem izbrani enzimsko - imunosorbcijski test preizkusila v primerjavi z biotesti, predvsem z indeksiranjem, ki je za nekatere bolezni edini rutinski test. Z rezultati prvih testiranj sem želela dobiti podatke o tehničnih zahtevah testa, kasneje pa iz dobljene zdravstvene slike testiranih skupin napotek za izbiro metode ali njihove kombinacije. Že v množični selekciji sem se pri negativni odbiri srečala z zelo različno zdravstveno sliko odvisno od tega, kako različna je bila pot do sadilnega materiala, kakšen je bil izvor materiala in stopnja selekcije. Zelo me je zanimalo ali z izpopolnjenimi metodami lahko postavimo ostrejšo sliko med genetsko in zdravstveno pogojenimi lastnostmi. Največ testov sem opravila s trsi iz primorskega vinorodnega rajona (cvs. ' rebula' , ' refošk' , ' zelen' ). Iz posavskega in podravskega rajona sem testirala manj trsov, ki pa niso nič manj pomembni, saj gre za material, ki je že na visoki stopnji klonske selekcije (cvs. 'laški rizling', ' žametovka'). Za osnovni objekt sem izbrala selekcijski vinograd rebule v Ampelografskem vrtu v Novi Gorici, ki je poskusno posestvo Biotehniške fakultete Ljubljana. Za rebulo sem se odločila zato, ker je avtohtona sorta, dovolj razširjena in zanimiva za pridelavo v briškem in vipavskem okolišu, vendar premalo selekcionirana. Enak pomen in vlogo ima v preostalem delu rajona, to je v koprsko - kraškem okolišu, refošk. Prve enzimsko - imunosorbcijske teste sem opravila 1. 1983 v laboratoriju Instituta za zaštitu bilja Fakultete poljoprivrednih znanosti v Zagrebu, kasnejše pa na Katedri za sadjarstvo in vinogradništvo Biotehniške fakultete v Ljubljani in v selekcijskem centru za krompir Kmetijskega inštituta Slovenije v Komendi. Indeksiranje in selekcijsko delo mi je omogočila trsnica Vrhpolje, KK Vipava. 4 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.2 VIRUSNE BOLEZNI VINSKE TRTE IN NJIHOVI POVZROČITELJI V zadnjih tridesetih letih je poznavanje virusnih bolezni vinske trte zelo napredovalo in tovrstne raziskave se širijo v vseh vinogradniških deželah. Najpomembnejši mejniki v zgodnjih raziskavah so bili: - dokaz, da se bolezen kužne izrojenosti prenaša z nematodo Xiphinema index, Hevvitt s sod., 1958 (42) - mehanični prenos povzročitelja kužne izrojenosti in rumenega mozaika s sokom obolele trte na zeljaste rastline, Cadman s sod., 1960 (11) - izolacija, purifikacija in identifikacija virusa kužne izrojenosti (Grapevine fanleaf virus GFV), Dias, 1963 (20) - uporaba toplotne terapije in meristemske kulture za vzgojo zdravih trt, Gifford in Hevvitt, 1961 (29), Galzy, 1964 (26). Poleg virusov so bili kot povzročitelji bolezni odkriti še drugi organizmi: - mikoplazmam podobni (mycoplasma-like organism MLO) povzročitelji zlate trsne rumenice (Flavescence dorče - FD), Caudwell s sod., 1971 (14), - rickettsiam podobne bakterije kot povzročitelji Pierce-ve bolezni, Goheen s sod., 1973 (34). Seznam virusov odkritih na trti je vse daljši, po Martelli-ju, 1988 (56) jih je 28, vendar še vedno ostaja veliko bolezni z oznako "virozam podobne". Veliko je še kompleksov bolezni, pri katerih ni pojasnjena vloga posameznih povzročiteljev in interakcije med njimi. Po pomenu in razširjenosti prevladujejo pri trti virusi dveh skupin in sicer NEPO virusi in closterovirusi. 1.2.1 NEPO virusi To je dobro znana in razširjena skupina rastlinskih virusov poliedrične oblike, ki jih v tleh prenašajo nematode rodov Kiphinema Cobb in Longidorus (Micoletzky) Filipjev (Nematode transmissible, Polvhedral), Harrison in Murant, 1977 {11). Tipski predstavnik skupine je virus obročkaste pegavosti tobaka (Tobacco ringspot virus, TobRSV). Virus pahljačavosti listov vinske trte -grapevine fanleaf virus GFV in virus mozaika repnjaka - arabis mosaic virus ArMV glede na lastnosti delcev predstavljata svojo podskupino, Quacquarelli s sod., 1979 (62). Na trti je bilo do zdaj odkritih 12 NEPO virusov (56). V Evropi sta pogosta in ekonomsko pomembna le GFV in ArMV, v severni Ameriki na križancih ameriških in evropskih vrst rodu Vit is povzročajo propadanje vinogradov tudi: virus obročkaste pegavosti tobaka (TobRSV), virus obročkaste pegavosti paradižnika (TomRSV), virus rozetastega mozaika breskve (PRMV) in virus lisavosti listov borovnic (BBLMV). 5 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 GFV - Grapevine fanleaf nepo virus - virus pahljačavosti listov vinske trte. V starejši literaturi je omenjen kot eden od virusov bolezni kužne izrojenosti ali infekciozne degeneracije. Osnovni opis virusa povzemam po Hewitt-u s sod. (43). Trta reagira na okužbo z GFV zelo različno. Najpogostejše so deformacije listov in mladic, mozaik, slaba rast trsov in osipanje cvetov. Bolezen poznamo pod mnogimi imeni - panachura, court-noue\ Reisigkrankheit, arricciamento, ipd. Ime virusa so prevzeli po pahljačastih listih, ki jih po okužbi z GFV dobi trtni indikator Vitis rupestris var. St. George. Na okuženi trti se namreč koti med listnimi žilami zmanjšajo in list dobi obliko pahljače. Motnje v cvetenju in oplodnji po katerih ima trta osipane in slabo dozorele grozde so gospodarsko najbolj škodljive in merljive posledice okužb z GFV (8). Cesto smo jih ugotavljali tudi v naših vinogradih (45). Virus je povsod razširjen, menijo celo, da je trtin naravni spremljevalec, ki se je tisočletja uspešno širil z introdukcijo trt in kasneje še s cepljenjem (32, 44). V naravi je GFV omejen na rod Vitis, vendar ga mehanično lahko prenesemo na številne zeijaste rastline. Prenos na Chenopodium quinoa Willd in C. amaranticolor Coste et Reyn je pomemben v proučevanju in diagnostiki virusa. V vinogradu se virus prenaša z nematodo Xiphinema index Thorne et Allen, dokazali so tudi prenos s X. italiae Meyl(10). Vendar je glavna pot širjenja bolezni in virusa z uporabo okuženih cepičev in podlag pri razmnoževanju trte. Neposredne odpornosti med žlahtnimi trtami niso odkrili (95), znane pa so razlike v odpornosti podlag in ameriških trt na nematodo prenašalko (16, 57, 65, 72). GFV je srednje imunogen in so ga že zgodaj dokazovali serološko (6, 35). Biokemična identifikacija virusa je bila opravljena tudi glede na posamezne izolate iz trte ali iz C. quinoa, ki kažejo različne znake in stopnje bolezni (62, 81, 92). ArMV - Arabis mosaic nepo virus - virus mozaika Arabis-a. Osnovni opis povzemam po Murant-u, 1970 (59). Na trti se okužba z ArMV ne kaže z izrazitimi znaki, lahko pride do rahlega rumenenja listov, ki pa ga zlahka prežremo. V naravi je najden le v Evropi, tu pa ima širok krog gostiteljev in povzroča več znanih bolezni. Na hmelju povzroča deformacijo "koprivina glava" (nettle head), na malinah rumenenje in kržljavost rastlin, na kumaricah mozaik in pritlikavost, na solati in zeleni klorozo in 6 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 pritlikavost, najti ga je na sladkorni pesi, hrenu, rabarbari, beli detelji in še kje. Prenaša se s sokom okuženih rastlin, v tleh z nematodo Kiphinema diversicaudatum (Micoletzky) Thorne. Pri mnogih zeljastih rastlinah med katerimi so številni pleveli je dokazan prenos s semenom. ArMV prenašajo tudi vrste predenice {Cuscuta sp.). ArMV je dober imunogen in prav z novejšimi imunokemijskimi metodami ga bolj pogosto odkrivajo tudi na trti. Zanimiva a nepojasnjena je njegova vloga v mešanih okužbah (78). V primeru propadanja sorte vinske trte "Kerner", je Stellmach, 1987 (79) v podlagi obolelih trt praviloma odkril ArMV. 1.2.2 Closterovirusi Glavne značilnosti skupine povzemam po Bar-Joseph-u in Murant-u, 1982 (4). Virusi te skupine imajo dolge vretenasto nitaste in zelo fleksibilne delce. Po dolžini jih razvrščajo v tri skupine, 730 nm, 1250-1450 nm in 1650-2000 nm. Tipski predstavnik je virus rumenenja repe (Beet yellows virus, BYV). Krog gostiteljev za posamezne closteroviruse, razen za BYV, je razmeroma ozek, v glavnem povzročajo rumenenja zaradi nekroze floema, tam je tudi najti značilne skupke virusnih delcev in akumulacije mešičkov. Closterovirusi niso prenosljivi z dotikom ali s semenom. V naravi jih prenašajo uši in tudi ščitaste uši. GVA - grapevine closterovirus A - trtni virus A Iz tobaka okuženega s sokom trte, ki je imela bolezen razbrazdanja lesa je Conti s sod., 1.1980, (18) izoliral in identificiral closterovirus in ga imenoval GSP-AV - grapevine stem-pitting associated virus. Na podlagi izdelanih serumov je Milne s sod. 1984 (58) z metodo ISEM (= imunosorbent electronmycroscopy) ugotavljal pogostost virusa v trtah. Virus so takrat preimenovali v GVA -grapevine virus A, ker je bila najdena večja korelacija z GLR kot z znaki razbrazdanja. Okuženost trt različnega izvora in različne zdravstvene slike z GLR je bila zelo pogosta. Dolžina delca je 800 nm. Krog gostiteljev je zelo ozek, od 24 testnih rastlin sta reagirala le Nicotiana clevelandii Gray in N. megalosiphon L. Virus se ne prenaša s semenom ali z ušjo Myzus persicae, ki je pogosti prenašalec ostalih closterovirusov. Dokazan je prenos s Pseudococcus longispinus Targioni, Tozetti, Planococcus ficus Signoret in Planococcus citrii Risso (68,69,71). 7 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990____________________________________ 1.2.3 Kompleksne in virozam podobne bolezni z nepojasnjeno etiologijo Zvijanje listov - grapevine leafroll disease (GLR2 je zelo razširjena in že dolgo znana bolezen vinske trte. Po tem, da se prenaša pri vegetativnem razmnoževanju in cepljenju so sklepali na virozo (30). Oboleli trsi dobijo v drugi polovici poletja močno navzdol uvihane liste, ki se predčasno barvajo in sicer rdeče pri rdečih in rumeno pri belih sortah, obžilni pas lista ostane zelen. Grozdje se slabše obarva, neenakomerno dozoreva in ima manj sladkorja (8, 30). S termoterapijo so dobili zdrave trse z normalno obarvanimi grozdi. To je bil še en dokaz, da gre za virozo (33). Povzročitelja bolezni niso uspeli mehanično prenesti na zeljaste rastline in ga izolirati. V programih proizvodnje zdravih trt so bolezen odkrivali s trsnimi indikatorji. Razbrazdanie lesa - grapevine stem pitting - _GSP) je bolezen, ki so jo intenzivno raziskovali v preteklih 10 letih. Poškodbe v obliki večjih ali manjših jamic, žlebičkov ali brazd se pojavijo na lesu (deblu) podlage in/ali žlahtnega dela trte. Zaradi zmanjšanja obsega ksilema, trta trpi sušo, zaostaja v rasti in propade. Bolezen so 1.1979 natanko opisali v Italiji (1), marsikje v literaturi za to bolezen še uporabljajo italijanski izraz "legno riccio". Pri nas smo jo v večjem obsegu prvič registrirali leta 1976 v vinogradih sorte cv. ' refošk' na Krasu (51) in na cv. ' kardinal' v Makedoniji (61). Tudi to bolezen so dokazovali in v selekciji odkrivali le s trtnimi indikatorji (27,28). Plutavost lubja - corky bark (CB) je po znakih na listju bolezen podobna GLR, a je lahko za trto bolj usodna. Obarvani listi v jeseni dolgo ostanejo na trti. Les nekaterih kultivarjev pokaže globoke brazde, prekrite z več sloji plute. Les na osnovi rozg lahko rahlo nabrekne in lub poči. Lesni cilinder, kambij in pluta pri mnogih sortah zelo degenerirata. Pri mnogih žlahtnih trtah je bolezen latentna. Pojavi pa se že v obliki inkompatibilnosti pri cepljenju na nekatere ameriške podlage (31). O bolezni je pri nas manj znanega kot v Ameriki, Teliz s sod., 1980 (87) je poročal celo o hitrem širjenju v vinogradih v Mehiki. Kakor se po znakih na indikatorjih bolezni ločijo med seboj, pa njihova etiologija ni razčiščena. V povezavi z njimi so našli različne virusne delce, največkrat podobne onim iz skupine closterovirusov, manjše izometrične - sferične celice in celo viroide. V iskanju povzročiteljev GLR je Tanne s sod., 1977 (84) purificirala in opisala potyvirus (grapevine poty virus - GPV). Namba s sod., 1979 (cit. po Tanne, 1985) (85) je prvi poročal o prisotnosti closterovirus-like delcev pri trtah z znaki GLR. To povezavo je potrdil tudi Faoro s sod., 1981 (25). 7 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.2.3 Kompleksne in virozam podobne bolezni z nepojasnjeno etiologijo Zvijanje listov - grapevine leafroil disease (GLR) je zelo razširjena in že dolgo znana bolezen vinske trte. Po tem, da se prenaša pri vegetativnem razmnoževanju in cepljenju so sklepali na virozo (30). Oboleli trsi dobijo v drugi polovici poletja močno navzdol uvihane liste, ki se predčasno barvajo in sicer rdeče pri rdečih in rumeno pri belih sortah, obžilni pas lista ostane zelen. Grozdje se slabše obarva, neenakomerno dozoreva in ima manj sladkorja (8, 30). S termoterapijo so dobili zdrave trse z normalno obarvanimi grozdi. To je bil še en dokaz, da gre za virozo (33). Povzročitelja bolezni niso uspeli mehanično prenesti na zeljaste rastline in ga izolirati. V programih proizvodnje zdravih trt so bolezen odkrivali s trsnimi indikatorji. Razbrazdanje lesa - grapevine stem pitting - (GSP) je bolezen, ki so jo intenzivno raziskovali v preteklih 10 letih. Poškodbe v obliki večjih ali manjših jamic, žlebičkov ali brazd se pojavijo na lesu (deblu) podlage in/ali žlahtnega dela trte. Zaradi zmanjšanja obsega ksilema, trta trpi sušo, zaostaja v rasti in propade. Bolezen so 1.1979 natanko opisali v Italiji (1), marsikje v literaturi za to bolezen še uporabljajo italijanski izraz "legno riccio". Pri nas smo jo v večjem obsegu prvič registrirali leta 1976 v vinogradih sorte cv. ' refošk' na Krasu (51) in na cv. ' kardinal' v Makedoniji (61). Tudi to bolezen so dokazovali in v selekciji odkrivali le s trtnimi indikatorji (27,28). Plutavost lubja - corky bark (CB) je po znakih na listju bolezen podobna GLR, a je lahko za trto bolj usodna. Obarvani listi v jeseni dolgo ostanejo na trti. Les nekaterih kultivarjev pokaže globoke brazde, prekrite z več sloji plute. Les na osnovi rozg lahko rahlo nabrekne in lub poči. Lesni cilinder, kambij in pluta pri mnogih sortah zelo degenerirata. Pri mnogih žlahtnih trtah je bolezen latentna. Pojavi pa se že v obliki inkompatibilnosti pri cepljenju na nekatere ameriške podlage (31). O bolezni je pri nas manj znanega kot v Ameriki, Teliz s sod., 1980 (87) je poročal celo o hitrem širjenju v vinogradih v Mehiki. Kakor se po znakih na indikatorjih bolezni ločijo med seboj, pa njihova etiologija ni razčiščena. V povezavi z njimi so našli različne virusne delce, največkrat podobne onim iz skupine closterovirusov, manjše izometrične - sferične celice in celo viroide. V iskanju povzročiteljev GLR je Tanne s sod., 1977 (84) purificirala in opisala potyvirus (grapevine poty virus - GPV). Namba s sod., 1979 (cit. po Tanne, 1985) (85) je prvi poročal o prisotnosti closterovirus-like delcev pri trtah z znaki GLR. To povezavo je potrdil tudi Faoro s sod., 1981 (25). 8 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Conti s sod., 1980 (18). je iz trt z znaki razbrazdanja lesa izoliral closterovirus in ga imenoval GSP-AV-grapevine stem pitting associated virus. Antiserum na ta virus, ki so ga kasneje preimenovali GVA je Milne s sod., 1984 (58) uporabil, da je z metodo imunosorbcijske elektronske mikroskopije (ISEM) dokazal povezavo teh delcev z znaki razbrazdanja lesa in zvijanja listov. Povezavo med GVA in boleznijo GLR sta potrdila tudi Engelbrecht in Kasdorf, 1985 (24), ter obenem dokazala prenos clostero-delcev v naravi. Virusne delce dveh dolžin (clostero-like, 700 nm in 1300 nm), ter specifične delce sta Corbett in Wid, 1985 (19) našla na trtah z znaki GLR, GSP in CB, ter tudi na trtah brez znakov teh bolezni. Se najmanj potrditev so bile deležne povezave bolezni z viroidi, Pena-Iglesias s sod. (63), Semancik s sod., 1987(77). Iz obolelih trt so poleg closterovirusov in njim podobnih dolgih nitastih delcev cesto našli manjše specifične delce, ki pa niso bili že znani in na trti odkriti NEPO virusi (5, 13). Gugerli s sod., 1984 (40) je opisal dva tipa clostero-like delcev drugačnih od GVA in je zanje razvil ELISA test. Rosciglione in Gugerli, 1986 (70) sta z mikroskopskimi in serološkimi raziskavami te delce povezala z GLR in GSP. Zee s sod., 1987 (94) je s SDS imunodifuzijo, ELISA testi in IEM testi na closteroviruse dokazal vlogo teh delcev v bolezni zvijanja listov. Barba s sod., 1987 (2) je v izolatih trt z GLR odkril closteroviruse, ki niso reagirali na tipe L, II. ali na GVA tip. Sliko kompleksa bolezni je dopolnilo odkritje, da Planococcus ficus ne prenaša samo delcev GVA, ampak tudi closteroviruse, povezane z boleznijo GLR -serotip III (86). Vse več avtorjev je potrdilo, da je ločevanje bolezni v osnovi možno z indeksiranjem in Martelii (56) je postavil ločitveno shemo indeksiranja, po kateri določimo naslednje štiri tipe bolezni - zvijanja listov - GLR. - plutavost lubja - CB - jamičavost lesa tipa Rupestris - RSP - žlebičavost lesa tipa Kober 5BB. 9 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.3 DIAGNOSTIKA VIRUSOV IN VIROZ Vizuelna diagnoza bolezni po znakih na okuženi trti (morfološka zdravstvena selekcija) je lahko le osnovna orientacija za nadaljne preiskave. Te se opravijo na posredovalnih rastlinah (biotesti), serološko ali z elektronsko mikroskopijo. 1.3.1 Prenos virusov na zeljaste rastline Viruse, ki so mehanično prenosljivi s sokom okužene rastline lahko dokazujemo, razmnožujemo in ločujemo na različnih zeljastih rastlinah. Te rastline stalno in specifično reagirajo na določeno okužbo. Za vsak mehanično prenosljiv virus je znan krog gostiteljev z značilno reakcijo. Pri trti tako dokazujemo predvsem NEPO viruse. Dobra testna rastlina je Chenopodium quinoa. Na GFV reagira z lokalnimi lezijami in sistemičnim mrežastim mozaikom (43). Slaba stran testa je v tem, da ni povsem zanesljiv, tako se npr. pri temparaturi nad 22°C znaki maskirajo in test postane neuporaben. Zaradi enostavnosti in kratkotrajnosti postopka je biotest z zeljastimi rastlinami lahko prvi izločilni (screening) test (52). Lahko je tudi ločilni test v mešanih okužbah, kjer pa se zahteva čim širši krog gostiteljev - zeljastih test rastlin. 1.3.2 Dokazovanje bolezni s trtnimi indikatorji Te vrste biotestov slone na dveh predpostavkah: - okužba (=virus) se prenese s cepljenjem, ne glede na način cepljenja. - trta - indikator, ki mora biti brez znanih viroz, stalno in za posamezno bolezen značilno reagira na okužbo po cepljenju z virusnim materialom. Zahtevane lastnosti indiktorjev so: dobro ukoreninjanje, enostavna oskrba (odpornost za glivične bolezni) in dobra kompatibilnost z evropskimi trtami (17, 21, 55). Indikator mora odkriti predvsem maskirane ali latentne okužbe ter take, kjer povzročitelj še ni definiran in zanj nimamo ustreznih imunokemijskih metod. Prvotna tehnika cepljenja je bila "chip budding", kjer je oko trte - kandidata pri katerem ugotavljamo okužbo, cepljeno na ukoreninjen indikator (55). Mladica indikatorja pokaže okužbo v dveh ali treh letih. Hitrejša je metoda cepljenja na zeleno, ali strojnega cepljenja, kjer je trta kandidat v vlogi podlage, indikator pa cepič. Uveljavljajo se tudi postopki mikrocepljenja (7). Seznam indikatorjev so v zadnjih letih zelo razširili predvsem zaradi kompleksnih bolezni. Po priporočilu OIV in ICVG iz L 1987 (60) je potrebno indeksirati osem bolezni vinske trte, tab. 1. 10 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Tabela t; Seznam indikatorjev za določanje viroz vinske trte, ICVG 1987 OIV, 1987 (60) zap. št. Bolezen Indikator 1. Kužna izrojenost (fanleaf) Vit i s rupestris var. St. George 2. Zvijanje listov (leafroll) * V. vinifera cv. 'modri pinot', ' cabernet franc' , ' Mission' 3. Razbrazdanje lesa V. rupestris var. St. George, (stem pitting) ( V. berlandieri x V. riparia) Kober 5BBX^ (Couderc 1613 x V. vinifera cv. 'Thompson Seedless') - LN 33xx) 4. Plutavost lubja (corky bark) LN 33 5. Mozaik lucerne V. vinifera cv. ' chardonnay' (alfalfa mosaic) 6. Fiek (fleck) Vitis rupestris var. St.George 7. Obžilni mozaik Vitis riparia Gloire de Montpellier (vein mosaic) 8. Žilna nekroza (vein necrosis) {V. rupestris x V. berlandieri) -110 Richter * Med indikatorji za zvijanje listov priporočajo izbiro glede na klimatske razmere kraja, kjer se indeksiranje opravlja. x) v nadaljnjem besedilu Kober 5BB xx) v nadaljnjem besedilu LN 33 Še bolj natančno razdelitev indeksiranja je napravil Martelli za kompleks bolezni GLR - GSP (56), tab, 2. 11 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Tabela 2: Reakcije posameznih indikatorjev na bolezen zvijanja, listov in kompleks razbrazdanja lesa, diferencialno indeksiranje (56). bolezen indikator/znaki LN 33 V. rupestris V. vinifera* Kober 5BB** zvijanje listov (leaf roll - GLR) 0 0 - zvijanje in rdečenje listov - zeleni obžilni pas 0 jamičavost lesa tipa rupestris (rupestris stem pitting) 0 - jamičast les izpod cepljei nega mesta ? 0 plutavost lubja (corky bark) - rdečenje listov - žlebičast les - odebelitve in razpoke na mladici - pritlikava rast - žlebičast les ? 0 žlebičavost lesa tipa Kober 0 0 ? - žlebičast les, brez znakov na listju * - glede na različne geografske lege priporočajo cvs. ' Cabernet franc' , ' Cabernet sauvignon' , ' Mission' , ' modri pinot' **- velja tudi za ostale križance ameriških trt (podlage) 0 - ni znakov - odsotnost znakov je ena od glavnih potrditev bolezni ? - znaki niso definirani 1.3.3 Imunokemijske metode odkrivanja virusov Virusni delci so s svojim velikostnim razredom in zunanjim beljakovinskim plaščem, ki je sestavljen iz mnogih identičnih podenot, v glavnem dobri antigeni. Serološki testi so lahko odločilni v končni identifikaciji nekega neznanega virusa in pri proučevanju povezav med sorodnimi izolati ali soji (96). Osnova seroloških testov je imunogena reakcija virusov pri pridobivanju seruma in zmožnost vezave, ki jo imajo posamezna antitelesa (=serum) do njim lastnih specifičnih (homolognih) antigenov, to je virusov. Ko se vezeta ustrezna količina antigenov in antiteles v netopno obliko, pride do vidne precipitacijske reakcije ali obarjanja. To vidno obarjanje se lahko izvede v tekočem ali v gel sistemu. Slednje teste imenujemo imunodifuzijski testi. 12 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.3.3.1 Imunodifuzija v gelu Reakcija antitelo - antigen se opravi v agar gelu. Skozi njegovo mrežasto strukturo pronicajo reagenti, na mestu vezave zaznamo precipitacijski krog ali linije. Med različnimi oblikami imunodifuzije v gelu se najčešče uporablja test dvojne difuzije, znan kot Ouchterlonv test. Uporabljali so ga predvsem za proučevanje in dokazovanje sferičnih virusov, ki zlahka prodirajo skozi gel, ter jih ni potrebno posebej tretirati. Pri trti so tako identificirali in določevali sorodnost raznim NEPO virusom (6, 35, 55). Ena od prednosti je tudi v tem, da lahko uporabljamo neprečiščen rastlinski sok, ter majhne količine seruma. 1.3.3.2 Enzimsko-imunosorbcijski test (ELISA - Enzvme Linked Immunosorbent Assay, Enzvme Linked Immunospecific Assay) V rastlinsko virologijo so bile te metode prenesene iz medicine in veterine. Osnovne značilnosti testa za določanje rastlinskih virusov sta postavila Clark in Adams, 1977 (15). Predvsem je ta test uporaben za dokazovanje virusov, ki so v rastlini v zelo majhni koncentraciji. Uveljavil se je kot test za rutinsko preverjanje zdravstvenega stanja sadilnega materiala pri rastlinah, ki jih razmnožujemo vegetativno. Glavne prednosti enzimsko-imunosorbcijskega testa so: - velika občutljivost in specifičnost, - zanesljivost rezultatov, ki so merljivi, - možnost testiranja velikih serij vzorcev in - možnost avtomatizacije postopka ter obdelave podatkov. V grobem razlikujemo tri oblike testov, kompetitivni, indirektni in test dvojnega sendviča. Slednjega v fitopatologiji največkrat uporabljajo. Princip testa dvojnega sendviča je v tem, da neko trdno podlago (polistirenske, mikrotitrirne plošče, paličice ali kroglice) najprej obložimo oziroma prevlečemo s specifičnimi antitelesi (=serum). Nanje se vežejo antigeni, to je virusi, ki jih dobimo v neprečiščenem soku rastline, ki jo testiramo. Na kompleks antitelo -antigen vežemo spet antitelesa, ki so tokrat markirana z enzimom. Po dodatku enzimskega substrata dobimo reakcijo s hidroiizo substrata, ki je obenem barvna reakcija. To obarvanje ugotavljamo na oko ali merimo spektrofotometrično. Najpogosteje uporabljene mikrotitrirne plošče imajo oblikovane bazenčke -luknjice, v katerih potekajo opisane reakcije z zelo majhnimi količinami reagentov 13 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 (100-200 [11/luknjico). Pregled uporabnosti testov po Gugerliju, 1983 (39) obsega 60 del, v fitopatologiji predvsem za ugotavljanje virusov krompirja, hmelja, šarke slive in klorotične pegavosti listov jablane. Sutula s sod., 1986 (80) ugotavlja, da je problem pri uporabi teh metod nepopolna ali nepravilna interpretacija rezultatov, vendar o tem pri določanju rastlinskih virusov ne piše skoraj nihče (1). Tijsen, 1985 (89) je natančno opredelil te probleme pri uporabi metod v medicini, v fitopatologiji teh študij ni, zato je včasih težko oceniti ali primerjati posamezna testiranja. Pri vinski trti se je ELISA test uveljavil po letu 1980 in to predvsem za NEPO viruse (9, 23, 49, 83). Nekaj serumov je na razpolago tudi že za trtne clostero-viruse (40, 88). Veliko specifičnost postopka so še povečali z uporabo monoklonalnih anti-teles (38, 48). 14 KOROSEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1.4. ZDRAVSTVENA SELEKCIJA VINSKE TRTE Pod zdravstveno selekcijo v širšem pomenu besede razumemo vse metode s katerimi pridemo do zdravega materiala za razmnoževanje. Zdrav pa pomeni brez znanih virusnih in njim podobnih bolezni, ki se sicer prenašajo pri vegetativnem razmnoževanju in poslabšajo rast ali pridelek vinske trte. 1.4.1 Pridelava zdravega trsnega materiala v svetu Osnovni ukrep za pridelavo zdravih trt je vizuelni pregled matičnih rastlin žlahtne trte in podlag na znake znanih bolezni. To selekcijo imenujemo tudi negativna, ker iz nadaljnega razmnoževanja izključimo rastline z znaki bolezni. Te znake pa zlahka zamenjamo s podobnimi nevirusnimi motnjami na trti, ali pa so znaki viroz latentni ali maskirani. Se posebej to velja za podlage. Zato je vizuelna zdravstvena selekcija dokaj nezanesljiva. To je le prvi izločilni krog odbire, ki spremlja množično selekcijo. Na vseh višjih stopnjah odbire vključujejo bioteste in imunokemijske metode (52). Brez široko zasnovane klonske selekcije ni smiselno nobeno testiranje. Campbell 1985 (12) opozarja na nevarnosti pri širjenju genetsko (in seveda proizvodno) odličnega materiala z neznano zdravstveno sliko. Pri tem lahko pride do prevelike akumulacije nekega virusa v danem okolju in do novih izbruhov bolezni predvsem zaradi vpliva spremenjenega okolja, zaradi mutacije virusa ali zaradi sinergizma z novimi neznanimi patogeni. Zelo pogosti so primeri zloma tolerance pri cepljenju različnih podlag in žlahtne trte (22, 74). V ZDA, predvsem v Kaliforniji, so že leta 1970 (31, 55) sprejeli stroge predpise za registracijo in priznavanje vinske trte, ki temeljijo predvsem na testiranju za viroze. Registrirana je lahko le cepljenka, ki je izšla iz zdravstvene selekcije. Mnogo manj so poudarjali genetsko selekcijo, kar je po eni strani razumljivo, ker zaradi kratke dobe razvoja vinogradništva in širjenja trt (dobrih 100 let), nimajo tako raznolikega in selekcije potrebnega trsnega materiala (32). Vinogradniške dežele Evrope, predvsem Francija in Nemčija so v okviru EGS v letu 1968 sprejele vrsto predpisov o proizvodnji in prometu s trsnim sadilnim materialom (75). Predpisi temeljijo na principu klonske selekcije, zaščite sort, povečane kakovosti pridelave in velikem pomenu zdravstvenih pregledov. Uvedene so bile tri kategorije sadilnega materiala: - standardni (brez testiranja na viroze), - certificirani (testiran in negativen na virus), - bazni (izhodiščni testirani). Slednja dva sta na višji kakovostni ravni predvsem zato, ker sta brez znanih viroz in razmnožena pod nadzorom, ki prepreči reinfekcijo. 15 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 V Italiji je bil po letu 1977 organiziran obsežen program vrednotenja in pridelave certificiranega materiala (55). Na 22 raziskovalnih postajah v vseh vinogradniških območjih so v prvih letih testirali preko 4000 klonov - kandidatov za več kot 200 različnih trtnih kultivarjev. V južni Italiji so leta 1970 postavili program za klonsko in zdravstveno selekcijo, predvsem za izločevanje bolezni razbrazdanja lesa in zvijanja listov (73). Podobne programe v Italiji uvajajajo tudi v velikih trsnicah kot je trsnica v Rauscedo, iz katere stalno prihaja trsni sadilni material v Slovenijo (21). Zelo znana je shema klonske selekcije in pridelave zdravega trsnega materiala iz Francije (90). Že od 1. 1977 so vanjo vključene vse velike državne in strokovne institucije: INRA - opravlja bazne raziskave in določa metodologijo dela ANTAV - je tehnično jedro in organizator pridelave z velikimi površinami za kolekcije baznega materiala in ONIVIT - zagotavlja nadzor nad testiranji in pridelavo, ter izdaja certifikate za sadilni material. V Nemčiji, kjer klonska selekcija poteka že več kot 100 let so kmalu po letu 1965 vpeljali za klone vsa možna testiranja na viroze. Delež okuženih trsov v tem materialu je bil zelo nizek. Zaradi številnih novih odkritij in velike možnosti reinfekcije predvsem z NEPO virusi preko tal, so veliki selekcijski centri (npr. Geisenheim) po letu 1985 začeli z retestiranjem vseh baznih in matičnih vinogradov (67). Uporaba tkivne kulture za pridobivanje zdravih trt je zelo pogosta, vendar še ni presegla raziskovalnih programov in ni posegla na področje selekcije (3, 36). 1.4.2 Zdravstvena slika matičnih vinogradov v Sloveniji Z redno opravljeno negativno selekcijo so iz večine vinogradov v Sloveniji izkrčili najbolj očitne osipače in hiravce, nosilce GFV. Pozitivna selekcija, kjer je bila poglavitna naloga odbira bujnih in zelo rodnih trsov je tako tudi izločila iz razmnoževanja slabo rastoče trte (Reisigkrankheit) (52, 66). Kljub temu še po tretjem krogu selekcije ob ustreznem pregledu najdejo dosti okuženih trsov. To si razložimo z maskiranjem znakov, z latentnimi okužbami podlag ali z reinfekcijo preko nematod, kjer se obnavlja vinograd na vinograd brez razkuževanja ali počivanja tal. Ker se je v preteklih letih veliko materiala, še zlasti ključev podlag, prineslo iz drugih vinorodnih okolij z nižjo stopnjo selekcije je tudi v tem dober in stalen vir novih okužb. Se bolj zaskrbljujoče kot pri GFV je stanje glede okužb z boleznijo zvijanja listov (GLR), ki jo zelo redko posebej izločajo in je pojav predčasnega rdečenja listov ponavadi opisan kot nekaj normalnega. Zaradi pomanjkljive zaščite trte 16 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 pred boleznimi in škodljivci, zaradi suše in fizioloških motenj so vizuelni pregledi na GLR mnogokrat skoraj nemogoči. Po pregledu matičnih vinogradov ocenjujemo, da je to še resnejši primer kot bolezen kužne izrojenosti. Drugih bolezni v zdravstveni selekciji ne označujejo, tudi oznake "degeneriran trs" v selekcijskih knjigah ni več najti. Bolezen razbrazdanja lesa še po desetih letih prvih objav o pojavu bolezni pri nas (31) ostaja "nova" in redko kje je zajeta v preglede ob negativni selekciji. Pregled nad zdravstvenim stanjem naj bi dale selekcijske knjige, ki pa so redkokdaj opremljene s fitosanitarno oceno ali natančnim popisom bolezni, obsegom okužb ipd. Ker se fitosanitarno pregledujejo le pozitivni trsi, kar je približno 30% vseh trt v vinogradu, nimamo pregleda nad obsegom bolezni v celoti. Tudi material, ki je bil v klonski selekciji, ni bil sistematično pregledan na viroze ali retestiran, le v zadnjih množitvah po letu 1985 je bil cepljen na zdravstveno preverjene podlage (52). Razen nekaj klonskega materiala iz uvoza imamo tako v prometu le standardni material (82). 17 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 2 MATERIAL IN METODE DELA 18 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 2.1 TESTIRANI MATIČNI TRSI Za testiranje sem odbrala predvsem trse, ki po pridelovalnih lastnostih ustrezajo za vstop v klonsko selekcijo ali so že selekcionirani in razmnoženi kot potencialni kloni, niso pa še bili testirani na znane viroze. En trs predstavlja en vzorec, ker pri trtnih virusih velja sistemična okužba, vsi vegetativni deli enega trsa imajo isto zdravstveno sliko. Med sortami sem se odločila predvsem za tiste domače samonikle kultivarje (sorte)*, ki imajo dovolj velik delež v pridelavi in so tržno zanimivi. Pri njih smo vezani na lastni razmnoževalni material (cepiči) in na domačo selekcijo. Drug kriterij izbire so bili večji zdravstveni problemi, npr. obsežna okužba z GFV, nepojasnjena etiologija bolezni (GSP, GLR), povezave med posameznimi boleznimi in podobno. 2.1.1 Cv. ' rebula' Rebula je zanimiva kot bela in kot naša samonikla sorta, ki je še vedno na nizki selekcijski stopnji z obilico tipov. Ti tipi niso ampelografsko definirani, sliko še zakrivi visok odstotek trsov z znaki kužne izrojenosti (GFV), ki se ponekod zamenjujejo z lastnostjo tipa. Tako je že Vertovc 1. 1844 (91) opisal tipe, ki se osipajo (sipka ali sipa), tip nore rebule, ki nič ne rodi in še druge. Za osnovni matični vinograd sem izbrala poskusni vinograd v Ampelografskem vrtu (Nova Gorica). Zasajen je bil 1. 1971 s selekcioniranim materialom. Gojitvena oblika je dvokraki Guyot. Od skupaj 1032 trsov jih je bilo v letu 1983 po končani petletni pozitivni masovni selekciji v postopku še 830 med njimi jih je 40% imelo pozitivno značko. Veliko trsov je imelo znake kužne izrojenosti, med njimi so bili tudi trsi z zelo dobro oceno za pridelek. Zato sem se najprej odločila za obsežen GFV - ELISA test, ki sem ga dopolnila z indeksiranjem. Za prvo testiranje z ELISA sem naključno izbrala 70 pozitivno in 70 negativno označenih trsov. Kasneje sem v testiranje vključila še druge po pridelku dobre trse in trse z oznako "nora rebula" - VBG - brez grozdja. Skupaj je bilo tes-tiranih 221 trt. Vsaka ima šifro, ki pomeni vrsto in sadilno mesto. Npr. Rb 1.15: rebula prva vrsta petnajsti trs. Pregled trsov je v prilogi 1. Kolikor so nam dovoljevale tehnične zmogljivosti rastlinjaka in laboratorija, smo nekatere trse vzporedno indeksirali na Rupestris St. George in preizkusili v testu na zeljaste rastline (C. guinoa, C. amaranticolor). 1) V vinogradništvu izraz kultivar (cv.) še ni povsem nadomestil izraza sorta, v tekstu ju uporabljam enakovredno oz. sinonimno 19 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Testirali smo tudi nekaj trsov iz matičnih vinogradov Preserje, Zalošče (evidenca po selekcijski knjigi, trsnica KK Vipava, Vrhpolje, reb V 1-5). Pri rebuli v selekciji niso bili posebej označeni trsi z znaki GLR ali GSP na closteroviruse smo testirali le en elitni in en trs brez grozdja - VBG. 2.1.2 Cv. ' refoSk' Refošk je trta Krasa (teranovka) in Istre, ki je potrebna temeljite selekcije, da si povrne izgubljeno pridelovalno vrednost. Obširno zdravstevno selekcijo refoška smo začeli po letu 1978, ko smo ugotavljali obseg propadanja mladih trt in povezovali to propadanje z boleznijo razbraz-danja lesa (GSP). Takrat je bilo pregledanih 25 vinogradov v starosti od 3-6 let, na štirih podlagah (K 5 BB, S04, Rupestris 420 A). Propadlo je povprečno 19% trt, v nekaterih vinogradih tudi 30% ali 50% (51). V enem od teh vinogradov (Škrlj-Tomaj, 1500 trsov, 19% propadlih) smo 1. 1980 zasadili indikatorje LN 33 in Rupestris St. George, da bi ugotovili, ali gre za prenašalca v vinogradu. Edini selekcijski vinograd refoška v letu 1983 je bil vinograd Sveto v Komnu na Krasu s skupno 4300 trsi. Za spremljanje sem odbrala spodnji del s skupno 1870 trsi. Ker so začeli selekcijo tudi v manjših vinogradih, sem v preglede vključila tudi te. Zaradi potreb po boljših cepičih so bili po letu 1979 v selekcijo vključeni tudi zelo stari trsi (več kot 30 let) iz različnih lokacij na Krasu. S tem so hoteli ohraniti stare tipe kraškega refoška. Cepiči teh trsov so bili leta 1979 cepljeni na štiri podlage (420 A, K 5BB, S04, Rupestris) in poskusno posajeni v Tomaj (Vodopivec). Ta vinograd sem 1. 1983 izbrala kot drugi matični vinograd za cv. ' refošk' . Zanimiv je zaradi zdravstvene slike starih matičnih trsov in cepljenja na z različne podlage. Poleg ELISA _ GFV in GLRaV testa smo opravili še indeksiranje na LN 33, modri pinot in Rupestris, ter natančno ponovno vizuelno selekcijo za bolezni GLR in GSP. 2.1.3 Trsi iz programa klonske selekcije in stare sorte. Klonsko selekcijo cvs. ' laški rizling' in ' sauvignon' je začel inž. S. Matekovič v Mariboru že leta 1958. Poleg tega poteka odbira žametovke v Krškem od 1. 1972 (53). Tam so eni in drugi že v tretji množitvi. Do zdaj niso bili testirani na znane viroze, bili pa so redno in natančno zdravstveno pregledani. V GFV - ELISA test sem vključila laški rizling 178 (pet subklonov - 27, 29, 30, 32, 36) in'dve žametovki: 12/6 in II-3/4 (vzorec 39, 43). Trse 1. rizlinga smo testirali posamič, pri Zametovkah, ki so posajene v repeticiji po pet trsov, so trsi v 20 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 repeticiji dali vsak eno siljenko, le-te smo združili v en vzorec kakor pri sondiranju materiala v trsnici. Poleg tega sem iz istega vinograda vključila dva trsa z močnim rdečenjem listov (vzorec 42, 46). V primorskem rajonu je v začetni fazi klonske selekcije le cv. ' zelen' (matični vinograd Slap pri Vipavi). Leta 1983 je bila zaključena pozitivna selekcija. Po opravljeni vizuelni zdravstveni selekciji so bili za testiranje na ELISA zanimivi trsi z oceno P > 3.0, v selekcijski knjigi je bilo opisanih mnogo primerov osipanja - sum na GFV. Po letu 1982 je zelo naraslo zanimanje za cv. ' beli pinot' , posebno še v vipavskem okolišu. Zato je bila zastavljena obširna pozitivna množična selekcija tega kultivarja. Zaradi velikega povpraševanja po sadilnem materialu so bila izdana dovoljenja za rez cepičev že v tretjem letu selekcije. Zato smo se odločili za vzorčno testiranje teh cepičev na GFV (matični vinograd Preserje) z ELISA testom. V januarju sem si pripravila siljenke za listne ekstrakte. V vsakem od 11 snopov cepičev (50 rozg/snop) smo narezali 10 kratkih ključev za siljenke in jih razdelili v dva vzorca po 5 ključev. Tako smo izračunali, da z 22 vzorci mrežno pretestiramo cca 3300 cepičev. Shema sondiranja: 10-12 matičnih_____fc 50 rozg _____k , m_________fc fA un..^„^5-a vzorec očes, vsake = 30tf očes) trsov _> (6 oee£ vsaka--------> « *nop -------> 10 ključev <^ ^^ Za namen ohranjanja starih sort in njihovega proučevanja sta v Ložah pri Vipavi in v Ampelografskem vrtu postavljena dva kolekcijska nasada, skupaj preko 25 sort. Med njimi so zanimive predvsem zelen, glera, pinela, poljšakica, pagadebiti, pergolin, vitovska grganja in kot edina rdeča sorta še sladkočica. Ker so vse na nizki selekcijski stopnji, me je zanimalo njihovo zdravstveno stanje. Pregled po testih in obsegu dela je v prilogi 2. 2.1.4 Cv. ' malvazija V sortimentu belih sort primorskega rajona ima malvazija stalno mesto, čeprav se marsikje zlorablja njena sposobnost, da veliko rodi. V starih matičnih vinogradih smo opazili mnogo znakov bolezni kužne izrojenosti, še posebej deformacij listov in osipanja grozdov. Novih matičnih vinogradov ni, oskrba s cepiči se rešuje z materialom iz hrvaške Istre. Tudi matični vinograd v Ampelografskem vrtu smo izločili iz selekcije že v letu 1980 zaradi velikega števila (40%) trsov z znaki kužne izrojenosti. Povzročitelj bolezni GFV je bil dokazan z zeljastim in serološkim testom (imunodifuzija v gelu) (81). Iz vzorca zemlje v tem vinogradu je bil tudi izoliran in identificiran prenašalec virusa, to je ne mat od a Kiphinema index (46). 21 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Zato sem se odločila, da sem med temi trsi s tipičnimi znaki okužbe z GFV izbrala pozitivne kontrolne trse, kot stalni vir GVF - izolata (si. 1). 2.1.S Podlage in indikatorji Slovenija se s podlagami vinske trte oskrbuje v glavnem od drugod. V letu 1983 smo imeli le cca 16 ha matičnjakov, zato tudi selekcije podlag praktično ni. Nase testiranje je bilo le vzorčno. Iz proizvodnega maticnjaka podlag ( V. berlandieri x V. riparia) - 420 A^' v Ampelografskem vrtu, ki je bil zasajen l. 1968 s selekcioniranim materialom iz Francije, smo med 950 trsi naključno izbrali 45 trsov za ELISA test na GFV. V poskusnem vinogradu imamo tudi dve certificirani podlagi 420 A in (V. berlandieri x V. riparia) S04^) iz Davis-a v Kaliforniji (ZDA), posajene 1. 1974. Enakega izvora so indikatorji. Certificiran in indikatorski material smo po nekaj letih dolžni retestirati. Vse matične trse indikatorjev (Rupestris St. George, Mission, LN 33 in Baco 22A) smo retestirali z ELISA testom na GFV, za katerega je največja možnost okužbe preko nematod prenašalk v tleh. V trsnici Vrhpolje smo med razpoložljivimi podlagami (ključi), pripravljenimi za cepljenje v letu 1985 odbrali 36 vzorcev za ELISA teste na GFV. Shema vzorčenja: št. snopa podlaga vzorec / oznaka (primer) 1 3309 ^T--------- a 3309 la 2 S04 NsN b 3309 lb 3 S04 \N c 3309 le 4 S04 \ d 3309 Id 5 K 5 BB 6 K 5 BB 7 K 5 BB 8 420 A 9 420 A Snop ima 50 rozg dolžine 2 m, v vsakem sem narezala 20 ključev in jih razdelila v štiri vzorce po pet ključev. Po siljenju sem za listni ekstrakt enega vz nabrala lističe iz vseh petih ključev v vzorcu. 2) V nadaljnjem besedilu 420 A 3) V nadaljnjem besedilu S04 22 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 2.2 METODE ZA VREDNOTENJE MATIČNIH TRSOV 2.2.1 Pozitivna množična selekcija (P) Pozitivna množična selekcija je določena z metodo za odbiranje in potrjevanje matičnih trsov v vinogradih in matičnjakih, ki je sestavni del pravilnika o načinu odbiranja in potrjevanja matičnih rastlin in enotnih metodah za opravljanje strokovne kontrole nad pridelovanjem sadik (66). Selekcija traja pet let, trsi, ki dobijo dovolj visoko pozitivno oceno, gredo v nadaljnje razmnoževanje. Del te odbire je tudi negativna odbira na virusne in njim podobne bolezni. Trsi s temi znaki se izločijo iz razmnoževanja kljub eventuelno pozitivni oceni pridelka. Pozitivni trsi morajo dati sortno primeren pridelek, izkazovati morajo višjo odpornost na glivične bolezni in to ne glede na leto in obremenitve. Pozitivne ocene iz posameznih let petletne odbire se lahko seštevajo in pri delitvi s številom let dobimo povprečno oceno pozitivne selekcije (Ps + npr.: ocene (3, 3, 4, 5, 3) dajo povprečno oceno 3,6. Tako smo izračunavali ocene in razvrščali trse pri sorti rebula v matičnem vinogradu v Ampelografskem vrtu, evidenca selekcije je v selekcijski knjigi, posebej sem vodila kartoteko odbranih trt. 2.2.2 Odbira tipov in elit Najboljše trse z visoko oceno (P + £ 3,0) in z značilnostmi želenega tipa smo imenovali elitni trsi. To so izhodiščni trsi za klonsko selekcijo, ki so na prvi stopnji podvrženi testiranju na znane viroze. Tipska in klonska selekcija morata biti opravljeni v mnogo večjem obsegu in v več letih kot je bilo mogoče opraviti v okviru te teme. Elitne trse preverjamo po pridelku individualno. Vsi trsi so obremenjeni s približno enakim številom očes (pri cv. ' rebula' od 24 do 30 očes/trs). Za vsak trs sem preštela grozde, stehtala pridelek in iz teh dveh podatkov izračunala povprečno težo grozda za trs. Pri določanju kvalitete grozdja sem tehtala težo 100 jagod, določala sladkorno stopnjo (merjeno z refraktometrom v % ali °Oe) in s titracijo z NaOH določila skupne kisline (v g/l) jagodnega soka - mošta. Iz vrednosti teže grozda, teže 100 jagod in razmerja pridelek : sladkor sem okvirno določila tipe. Dodatne oznake so možne še po posebnih značilnostih sorte. Pri nekaterih trsih sem ugotavljala kaljivost peloda v 15% raztopini saharoze. 23 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 2.3 DOKAZOVANJE VIRUSOV Z BIOTESTI 2.3.1 Prenos na zeljaste rastline Pri trtnih virusih je test z zeljastimi rastlinami v postopku selekcije uporaben predvsem kot prvi izločilni test (mrežni test). Kot testne rastline sem uporabila Chenopodium quinoa in C. amarantJcolor. Sejala sem jih v rastlinjaku v Novi Gorici od februarja do marca. Pri trsih - kandidatih za testiranje sem pozimi narezala ključe, ki sem jih dala v vodo v topel prostor. Po nekaj tednih trta zbrsti in mlade lističe sem uporabila za inokulum. Kot ekstrakcijski pufer sem uporabila 2 % raztopino nikotinske baze (55). Testne rastline sem opazovala 30 dni po inokulaciji, temperatura v prostoru je bila kontrolirana in ni presegla 22X1. 2.3.2 Indeksiranje Prenos okužbe na trsni indikator - indeksiranje je pri večini virusnih okužb vinske trte glavni dokazni postopek. Indeksiranje sem opravila po metodi cepljenja suho na suho. Trs kandidat je podlaga, indikator je cepič. Drugi način je chip budding - okuliranje na suho, pri čemer je podlaga indikator. Ta način sem uporabila tam, kjer nismo imeli na razpolago dovolj lesa (ključe) trsa ki smo ga testirali ali pa je bil v slabšem stanju in ni bilo pričakovati želenega koreninjenja. Cepljenje in siljenje sem opravila v trsnici KK Vipava, v Vrhpolju, v času vsakoletnega cepljenja od marca do aprila. Siljenje nacepljenih indikatorjev je potekalo po standardni metodi v trsničarski pridelavi. Za vsako kombinacijo trs/indikator sem imela najmanj pet cepljenk. Indikatorje sem sadila v kartonažni tehniki in jih prvo leto gojila v rastlinjaku. Naslednja leta sem jih sadila v kontrolirano indeksno trsnico v Ampelografskem vrtu. Indikatorje iz programa OIV imamo v svojem matičnjaku brezvirusnih podlag in sort. Sadili smo ga iz osnovnega materiala, ki nam ga je prijazno odstopil prof. A.C. Goheen iz univerze Daviš (Kalifornija, ZDA). Iz inštituta Conegliano (Italija) smo kasneje dobili še indikator "cabernet franc". 24 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 2.4 ELISA TEST Prve teste sem opravila v letu 1983 za GFV, kasneje je bilo delo opravljeno po serijah glede na čas, material, namen in razpoložljive serume. Obseg in namen dela po posameznih serijah je prikazan v tab. 3^. Prvih osem serij je bilo za odkrivanje GFV. Izbor materiala je bil prilagojen selekcijskemu delu in rezultatom prejšnjih testov, predvsem za cv. ' rebula' . Prve serije so bile namenjene tehnični izvedbi testa, obenem sem že pričakovala prve rezultate za vključevanje v klonsko selekcijo cv. ' rebula' . Zaradi ugotavljanja zanesljivosti testa sem v sedmi seriji prešla na spektrofotometrično odčitavanje rezultatov. S tem se je tudi pojavil problem postavitve ločnice E+/E~. Zato sem pod serijo 8 predstavila rezultate dveh let (1986 in 1988). V seriji 9 sem v manjšem obsegu testirala trs s sumljivimi znaki osipanja še na drugi soroden nepo virus - ArMV, ki ga povezujejo z boleznijo kužne izrojenosti (55, 78). Nadaljnje serije so za GFV predstavjale rutinski test, začela pa sem s testiranji na closteroviruse, povezane s kompleksom bolezni GLR - GSP, obenem so bili že na razpolago prvi serumi zanje. Po naših in mednarodnih predpisih pa smo dolžni selekcijski material za oznako "testiran" preizkusiti vsaj glede GLR. S tem se je tudi spremenil izbor materiala, od rebule sem se obrnila k refošku in žametovki, ki sta problematični sorti za GLR - GSP kompleks. 2.4.1 Tehnična izvedba, kemikalije, serumi in oprema Med enzimsko-imunosorbcijskimi testi sem se odločila za test dvojnega sendviča (double antibodv sandwich method, das ELISA)^) po Clark-u in Adams-u, 1977 (15). Shema postopka je v prilogi 3. Kot testni material sem povsod, kjer ni drugače označeno, uporabila mlade trtne liste. Nabrala sem jih v vinogradu v času rasti ali pa sem si v času mirovanja v laboratoriju iz ključev rozg (2-3 očesa) pripravila siljenke, ki brez težav vzbrstijo v vodi ob sobni temperaturi. Reagenti so bili pripravljeni po standardni recepturi (37), le za ekstrakcijski pufer sem uporabila PBS z dodatkom 2% nikotinske baze, kot je priporočeno za trto (97). Pri zadnjih testih za GLRaV sem uporabila tris HC1 pufer (40). Preizkusila sem naslednje kombinacije: - ekstrakcijski pufer BIOREBA (K1+) - ekstrakcijski pufer BIOREBA + 2% nikotina (K2+) - PBS brez nikotina (K3+) - PBS + 2% nikotina (K4+) 4) - v nadaljnjem besedilu ELISA ali ELISA test Tabela 3: Razpored, obseg in namen ELISA testov ~ zbirni podatki po serijah (1 - 12), glej tudi prilogo 1 Zap.- št. mesec/ serije leto št. plošč vrsta v seriji materiala št. namen testa vzorcev testni laboratorij način odčitavanja op. rt 0> O O tri i C podlage - Jaška 12 t marec 1983 3 rebula P+ in P-A.vrt kontrolni test (mlvz) indikatorji refošk - Kras/LN33 L. rizling - osipanje 88 8 8 11 2 2 junij 1983 4 rebula P+, P- A.vrt matični trsi stare sorte indikatorji kontrole 89 6 8 3 julij 1983 4 rebula A. vrt P+, P-indik +K 67 14 4 april 1984 1 rebula A. vrt -stare sorte, pinot indikatorji 12 16 4 5 september 1983 2 rebula A. v. P+P-kontrole 42 6 6 maj 1985 2 rebula A. v. matični trsi( Preserje) zelen (Slap) 30 63 -odkrivanje GFV, -standardizacija postopka -zanesljivost testa -preverjanje K+ -povezanost GFV in GSP -odkrivanje GFV po znakih vizuelne selekcije -GFV in rumeni mozaik -uporaba predhodno obloženih plošč -standardizacija postopka -odkrivanje GFV -uporaba domačih plošč -ponovitev +/- reakcij -ugotavljanje GFV in osipanja, vzorčenje Zavod za zaštitu vizuelno bilja (FPZ Zagreb) vizuelno Zavod za zaštitu bilja (FPZ Zagreb) Katedra za vinogradništvo (BF Ljubljana) Zavod za zaštitu bilja (FPZ Zagreb) -preizkus časa vzorčenja katedra za za GFV (pomlad vs, jesen) vinogradništvo (BF Ljubljana) -selekcija (GFV) Zavod za -selekcija, povezava GFV zaštitu bilja in osipanja (FPZ Zagreb) -več ponovitev na plošči in med ploščami -dve plošči iz zrarzo-valnika nista dali reakcije vizuelno vizuelno vizuelno vizuelno in spektro-fotometrično » O > sr n <& • 3 s I N t P a r* •—: "t nO to a 3 n> z a. N » O S. s 3 N S. a ca 9? ISO Zap. št. mesec/ št. plošč vrsta serije leto_______v seriji materiala št. namen testa vzorcev* testni laboratorij način odčitevanja op. 3- O (\) 73 0 CA < m m O a> j* (D O D ?u £:: C . " N D > 00* N CD 3- ~0 p> T o O <•;: C p Cx 0) N < P 3 TO "1 (D eb, C r+ —». n o (D vJD N O 3 8 10 11 12 junij 198S junij 1988 sept. 198S julij 1986 2 1 junij 1988 3 julij 1989 2 oktober 1989 1 rebula podlage 46 indikatorji 7 mlvz 10 pinela, zelen 2 maj 1986 2 žametovka 7 1. rizling 4 b. pinot 22 rebula rebula indikatorji stare sorte refošk rebula stare sorte refošk refošk žametovka 1. rizling 34 -selekcija na GFV (A.vrt, Preserje) -postavitev praga E+/E--vzorčenje v trsnici -retestiranje -zanesljivost testa -selekcija klonov GFV -selekcija subklonov GFV -vzorčenje v trsnici GFV 50 -selekcija na GFV 71 -odkrivanje Ar M V 6 -ponovitev testa za 3 ArMV 12 IS 8 Zavod za zaštitu bilja (FPZ Zagreb) spektro-fotometrično in vizuelno zavod za zaštitu bilja (FPZ Zagreb) zavod za zaštitu bilja (FPZ Zagreb) vizuelno in spektro-fotometrično vizuelno in spektro-fotometrično 54 -odkrivanje GFV in GLRaV Center za krompir spektro- 32 -elite in Upi za GFV Komenda (KIS) fotometrično 16 -odkrivanje GFV rutinski test 12 -GFV vs GLRaV Center za krompir spektro-Komenda (KIS) fotometrično -odkrivanje GLRaV tip 1 (ponovitev serije) Biologija (BF Ljubljana) spektro-fotometrično 3 * vštete so ponovitve ** rezultati prikazani združeno v prilogi 27 KOROSEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Kot trdno osnovo, na katero vežemo antitelesa, sem uporabljala standardne polystyrenske mikrotitrirne plošče s 96 vzorčnimi luknjicami tuje (INOTECH-BIOREBA) ali domače izdelave (GOLIAS). Uporabljala sem sveže obložene plošče ali take, ki smo jih z antitelesi obložili nekaj mesecev prej in jih do uporabe hranili pri -20°C. Inkubacijski čas in temperaturo (30°C - 7 h, 37°C - 4 h) sem prilagajala poteku in obsegu dela. V nekaj primerih sem kot modifikacijo uporabljala polovično količino reagentov (100 [11) na vzorec. Zaradi zanesljivosti postopka sem vsak listni ekstrakt (=vzorec) testirala v dveh sosednjih luknjicah (leva in desna ponovitev testa). Pri spektrofotometričnem odčitku sem vzela srednjo vrednost obeh odčitkov. Večje odstopanje med levim in desnim odčitkom je znak napake (robni efekt, napačno oblaganje, prelivanje vzorcev pd.). Na vsaki plošči so bili poleg 43 vzorcev vedno še kontrolni vzorci in sicer: K+ (pozitivni vzorec), K" (negativni vzorec - listni ekstrakt trte preverjeno brez okužbe, npr. indikator St. George za GFV) in včasih še vzorec čistega ekstrakcijskega pufra. Poleg odčitavanja rezultatov na oko po spremembi barve, sem v nekaterih primerih lahko uporabljala tudi čitalec - spektrofotometer (Dvnatech Microplate Reader MR 700). V prilogi 4. je kopija odčitka. Za dokazovanje trtnih virusov nimamo domačih serumov. Na voljo sem imela reagente, ter serume (IgG in conjug. IgG, AP-IgG poliklonalni serum) švicarske izdelave (BIOREBA AG). 2.4.2 Metode za interpretacijo rezultatov V testih, kjer smo obarvanje plošč odčitavali na oko, sem po dogovoru vse sumljive (slabo vidne) reakcije ponovila in po ponovitvi v primeru +/- reakcije upoštevala, da je test pozitiven. Pri spektrofotometričnem odčitavanju sem za vsak primer posebej na tri načine izračunala mejo med pozitivnimi in negativnimi vzorcid 2x K- ali 3xK", ter iz povprečne vrednosti odčitka v skupini negativnih vzorcev (xneg). To skupino sem izbrala na podlagi odčitkov kontrolnih vzorcev, meja ali ločnica med pozitivnimi (virusnimi) in negativnimi (zdravimi) vzorci (E+/E~) je 3x xneg ali 4x xneg. Podoben izračun je s postavitvijo standardne deviacije za skupino negativnih vzorcev, meja je pri xneg+3sd (ali x + 4sd=, kjer je sd + ....., n je število testov (37). Pri interpretaciji rezultatov koristi tudi prikaz le-teh s frekvenčno distribucijo (histogram) za posamezno ploščo ali skupino testov (80). Za absorbcijske vrednosti (OD - optical densitv) sem izbrala ustrezen interval (0,1 ali 0,2 enote) in vanje razporedila rezultate glede na pogostost pojavljanja. S tem načinom sem prikazala smiselnost izračunavanja ločnic po različnih metodah (E+/E~) za nekaj značilnih serij. 28 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 3 REZULTATI 29 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 3.1. UPORABNOST EUSA TESTA ZA ODKRIVANJE GFV Na podlagi obsežne literature in prvih razpoložljivih serumov sem preizkusila ELISA test za GFV. 3.1.1 TehniCne zahteve testa in njegova zanesljivost V prvi seriji testov sem dobila rezultate povsem odgovarjajoče že znanemu GFV statusu testiranih trsov. Vse ponovitve na mikrotitrirnih ploščah so se ujemale. Pozitivne kontrole so reagirale z močnim, jasno rumenim obarvanjem že nekaj minut po dodajanju enzimskega substrata. Nobena od negativnih kontrol ni dala obarvanja. Plošče, predhodno obložene z antitelesi, hranjene nekaj dni do dveh mesecev pri -20°C, so dale enako dobre reakcije kot sveže obložene, razen v primeru, da smo jih uporabili direktno iz zmrzovalnika, takrat niso reagirali niti pozitivni kontrolni vzorci (serija 2). Dve kombinaciji dolžine trajanja inkubacije in temperature (2 uri na 37°C ali 4 ure na 32°C ) sta dali enako dobre rezultate, prilagodila sem jih poteku dela. Pri dodajanju 100 nI reagenta na bazen namesto 200 nI sem dobila pri istih vzorcih enako jasne reakcije. Mikrotitrirne plošče domače izdelave so pokazale nekaj več odstopanj med levo in desno ponovitvijo testa. Pri domačih ploščah smo odkrili ve] mehaničnih poškodb in odstopanja pri dimenziji bazenčkov. Med ekstrakcijskimi pufri za GFV so enako dobro reakcijo dali pripravljeni BIOREBA preparati kot tudi pufri z dodatkom nikotina. Za potrditev uvajanja ELISA testov v selekcijo sem potrebovala podatek o zanesljivosti odkrivanja GFV. V številnih ponovitvah znotraj serije, med serijami v zaporedju, med različnimi sortami in med različno okuženim materialom, sem dobila podatke o zanesljivosti testov, kot jih kaže tab. 4. Od 55 trsov, ki sem jih večkrat testirala v isti ali v različnih serijah, sem dobila štiri take, ki so dali sumljivo +- reakcijo. Pri tem smo šteli drugo in vsako nadaljno ponovitev kot eno. Pri dveh trsih predvidevamo, da gre lahko tudi za novo okužbo, saj sta med drugo in sedmo serijo potekli dve leti. Iz teh podatkov smo dobili tudi lastne pozitivne in negativne kontrolne trse (npr. trsi Mlvz 2.5, Mivz 2,6, Mlvz 2.9). 30 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Tabela 4: Zbirni prikaz rezultatov ponovljenih ELISA testov za GFV, po posameznih trsih in serijah testov (1983-1985) zap. trs serija (ponovitev) testa zaključna št. 1 2 3 4* 6 7 " ocena E testa 1 Rt ) 2.10 + 2 2.16 + - 3 2.25 -- 4 2.26 - 5 2.29 -- - 6 2.34 + + 7 2.39 -- 8 2.47 -- 9 2.53 + 10 2.55 - 11 2.60 + 12 2.80 + 13 2.81 - 14 2.87 + 15 3.5 + + 16 3.8 + + 17 3.9 + 18 3.15 - - 19 3.19 + + + 20 3.21 - - - 21 3.31 - 22 3.35 - 23 3.41 + + 24 3.42 + 25 3.72 - 26 4.9 - - 27 4.38 + + + 28 4.39 - - 29 4.88 - 30 5.13 + + 31 5.14 - 32 5.16 - 33 5.18 + 34 5.20 - 35 5.28 - -- 36 5.32 - -- 37 5.35 - 38 5.54 39 6.5 — 40 6.9 + + 41 6.32 + + + 42 7.43 - 43 Mlvz2 44 » 2.4 + + 45 « 2.5 + + 46 » 2.6 + + + 47 2.9 + + + + + 48 2.20 + + + + 49 zelen x 3 + + + 50 refošk 1.17 -- 51 St.G/1 - - - 52 K5BB-Tg - - 53 S04 Ih - - - 54 420 - - 55 Pine [a 2/17 + + sumljiv sumljiv nova okužba** + + sumljiv sumljiv + + + nova okužba** + + * serija 5 je izpuščena iz primerjave ker je šlo tam za vzorčenje v septembru, ki ga ne obravnavamo za enakovredno zaradi nižje koncentracije GFV v listin; ** možnost nove okužbe v vinogradu, časovni razmik serije "2" in "7" je dve leti. 31 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 3.1.2 Interpretacija rezultatov Prva odčitavanja smo opravili vizuelno - s prostim očesom po obarvanju. Sumljive ali slabo vidne reakcije smo ponovili, vendar jih nikoli ni bilo več kot 2-3 na ploščo. V seriji 7 sem prvič primerjala vizuelne in spektrofotometrične odčitke. Spektro-fotometrične odčitke, razvrščene po velikosti od najvišjega do najnižjega, sem uporabila za izračun praga med pozitivnimi (GFV/E+) in negativnimi (GFV/E-) vzorci, tab. 5^ Primer 1: Če za velikost razreda negativnih vzorcev vzamemo n=26 (vsi vzorci, ki dajo odčitke nižje od tistega za ekstrakcijski pufer), in je x~neg povprečna vrednost odčitka za razred negativnih vzorcev, dobimo: xneg = 0.131 prag a = xneg + 3sd sd = 0.0237 = 0.201 prag b = 3kc A - B A - B A - B (Martelli) 1 ref 3.2(Škrlj)GSP 5/3 3 5/2 0 - - Rup-SP 2 3.47 " GSP 10/2 1 5/0 0 5/1 1 Rup-SP+GLR 3 4.17 0 15/0 0 5/0 0 5/0 0 neuspelo 4 4.35 0 10/4 0 10/1 0 5/1 0 0 5 ref 7.35(sel.)GSP+ GLR 8/3 3 5/2 2 8/2 0 Rup-SP+CB 6 7.41 GLR 10/2 0 5/1 1 - - CB 7 8.78 8/4 0 10/2 0 - - 0 8 8.80 GSP+GLR?) 10/2 0 5/1 1 - - CB 9 8.81 0 6/3 0 3/1 0 6/0 0 0 10 ref 11/11 Tomaj 0 10/2 2 5/2 1 - - Rup-SP+CB 11 11/24 0 10/4 0 4/1 0 4/1 0 0 12 14/41 0 10/5 0 15/1 0 4/2 0 0 13 ref 2.10A.vrt GSP 16/3 2 - - - - Rup - SP 14 ref 51 Tomaj GLR 18/2 0 - - - - 0 15 52 GSP 10/2 2 5/0 0 5/1 1 Rup-SP+GLR 16 žam 7.26 GSP+ GLR 15/2 0 5/1 0 6/2 2 GLR 17 7.17 GSP+ (GLR?) /1 1 5/2 0 5/0 0 Rup-SP 18 6,21 GSP+ GLR 5/2 2 5/0 0 3/0 0 Rup-SP 19 6.17 GSP+ GLR 4/1 0 5/2 0 5/0 0 0 20 6.23 GLR 4/0 0 15/1 0 3/0 0 0 Skupaj uspeh cepljenj a 189/47 117/20 64/10 (25%) (17%) (16% legenda: A: št. cepljenih indikatorjev/št. uspelih cepljenj B: št. indikatorjev z znaki okužbe O: ni znakov (ni definirane bolezni) - zdrav -: ni bilo cepljeno Pri indikatorju LN 33 sem vedno opazila le rdečenje listov, nikoli pa zadebelitve mladic, ki so omenjene kot značilnost bolezni plutavosti lubja (CB). Rezultati so orientacijski predvsem za GLR in CB, manjka indeksiranje za razbrazdanje tipa Kober, pri oznaki GLR v morfološki selekciji gre za rdečenje listov z zelenim obžilnim pasom. 50 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 3.6 ODKRIVANJE CLOSTEROVIRUSOV Z ELISA TESTOM Od razpoložljivih serumov je bil šele v letu 1988 nam prvič na razpolago serum za GLRaV tip I. V letu 1987 smo nekaj vzorcev za testiranje poslali dr. Gugerliju (Nyon, Švica), tab. 17 (osebna informacija). Njegove rezultate sem uporabila kot referenco za lastna testiranja v letu 1988-89. Tabela 17: Rezultati ELISA testov za liste trt z znaki zvijanja in rdečenja -GLR in z znaki razbrazdanja lesa GSP (Gugerli, 1987 os. inform.) Zap. Sorta, trs, vizuelna OD vrednosti št. lokacija ocena GLRaV GLRaV GVA GLR GSP tip I tip III 1. Pagadebiti A. vrt + _ 149 140 148 138 150 139 2. Refošk 7.35 Komen ? + 130 151 183 187 3. Refošk 7.41 •• + _ 130 150 135 148 150 4. Refošk 8.78 ? — 140 138 143 146 150 147 5. Refošk 8.80 ? + 138 138 153 147 144 143 6. Refošk 8.81 - - 139 137 142 143 140 145 7. Sladkočrn 10 Lože - - 1470x 1457^+ 147 146 8. Glera 3.9 + - 141 140 148 151 148 149 9. Žametovka 6.17 Stara vas + + 639 s 749 > + 147 141 147 141 10. Žametovka 6.21 ? + 719 s 741) + 145 149 144 149 11. Žametovka 6.23 + - 143 135 1523u 1543> 159 159 12. Žametovka 7.17 ? + 327 ) + 225' 146 150 147 138 13. Žametovka 7.18 + ? 530 U 649' 547 620 147 138 14. Žametovka 7.26 + + 293 x 301 > + 146 145 107 171 15. Negativna kontrola 135 141 166 162 174 184 16. Pozitivna kontrola 800 x 794 f + 2000 \ 2000' + 743 \ 774 ,+ Na GLRaV-I so reagirali vsi trsi žametovke z značilnim rdečenjem listov, ne pa beli sorti glera in pagadebiti z močno zvitimi listi. Trs 6.23 kljub močnemu rdečenju ni reagiral na serum tipa I, ampak na tip III. Trsa 7.17 in 7.26, ki sta 51 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 dala po Gugerliju negativno reakcijo na tip I, vendar sta imela visoko OD (> 2 x OD negativne kontrole), sta dala na isti serum pozitivno reakcijo pri ponovitvi testa v letu 1988. Nobeden od refoškov z močnim rdečenjem ni dal reakcije na GLRaV-I ali III v letu 1987. V letih 1987-88 sem poslala na testiranje nekaj listnih vzorcev refoškov z močnim razbrazdanjem lesa in vsi so dali pozitivno reakcijo na GLRaV-tip I (Gugerli - osebna inf.). Enega od teh trsov (Ref 52 Tomaj) sem zato kasneje v testih uporabila kot K+, tak 18. V letu 1988 sem testirala vzorce refoška in žametovke na GLRaV-I (4 plošče), vendar nisem dobila nikakršnih reakcij. Zadnji odčitki so bili 90 minut po dodajanju enzimskega substrata. V letu 1990 sem teste ponovila, reakcije so se pokazale šele naslednji dan (cca 12 ur po dodajanju enzimskega substrata). Rezultati teh testov z referenčnimi podatki testiranja za nekatere trse so v tab. 18. Poleg standardnih listnih ekstraktov smo testirali še zmrznjene liste, les in jagode. 52 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Tabela 18: Rezultati ELISA za GLRaV tip I. (žametovka, laški rizling, refošk), 1989, po velikosti odčitka Zap. št. trs/oznaka OD odčitek referenca (Gugerli, 1987, 1988) GLRaV-I GLRaV-II GLRaV-III 1 Ref 15/11 Tomaj selekc. 834 2 M. pinot A.v. 2.5 685 3 Ref 52 Tomaj 544 4 Ref 52 Tomaj (K+) 430 5 Ž. čr. 42 Krško 379 6 Ref 12/42 Tomaj selekc. 354 7 Ž. čr. 7.26 Stara vas 346 8 Ref 16/2 Tomaj selekc. 342 9 Ref 53 Tomaj 327 10 Ž. čr. 7.16 Stara vas 290 11 Ž. čr. 6.21 Stara vas 288 12 Ž. čr. 46 Krško 279 13 Ž. čr. 39 Krško, klon 264 14 Ž. čr. 7.17 Stara vas 255 15 Ž. čr. 43 Krško, klon 251 16 Ž. čr. 7.26 les 244 17 Ž. čr. 6.17 Stara vas 236 18 Ž. čr. MB - Zafošnik 183 19 Ž. čr. 7.26 zmrz. list 183 20 Ž. čr. 6.23 Stara vas (K~) 175 21 Ž. čr. 6.23 Stara vas 181 22 L. rizling 27 Krško 174 23 29 " 171 24 36 grozdje 169 25 36 " les 168 26 Mlvz 2.20 167 27 Neoplanta 1 A.v. 165 28 Ref A.v. 1.7 164 29 L. rizling 30 Krško 163 30 L. rizling 36 Krško 156 31 Ref 11/24 Tomaj selekc. 154 32 Rebula 5.14 A.v - elita 153 33 L. rizling 29 Krško - les 152 34 Zweigelt 112 Krško 152 35 Ref 3.11 A.v. 151 36 Ž. čr. 42 Krško - les 150 37 Mlvz 2.9 149 38 Ref A.v. 2.10 148 39 Ref 20 Tomaj 147 40 L. rizling 32 Krško 147 41 Rebula 5.14 A.v. - les 146 42 Rebula 5.7 A.v. - VBG 144 43 Z. čr. 6.17 zmrznjen list 143 44 Mlvz 2.9 zmrznjen list 141 45 Ref 14/41 Tomaj selekc. 140 46 Ref 3.11 A.v. - les 139 47 Ref 51 Tomaj 138 48 Ekstrakcijski pufer 138 53 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Iz razporeditve OD odčitkov po velikosti (tab. 18) se vidi, da je K+ vzorec (Ref 52 Tomaj) v obeh ponovitvah dal visoke vrednosti. Vzorec K" ima ponovitev v vzorcu Ž.čr. 6.23 in oba vzorca sta dala skoraj enaka odčitka. V grobem sem mejo med E+ in E~ vzorci določila z 2 x OD za K" (=350) ali z 2 x OD za pufer (=276). Vrednosti med tema dvema so sumljive do pozitivne. Med refoški z znaki močnega razbrazdanja je poleg K+ v skupini sumljivih reagiral le Se en trs (Ref 53 Tomaj), ostalih pet (Ref 51, 20, A. v. 1.7, 2.10, 3.11) pa ne. Med petimi selekcijskimi trsi starega tipa refoška (Tomaj) so trije z visoko vrednostjo OD, eden celo z višjo kot je za K+. Vsi trsi žametovke, ki so po Gugerliju dali pozitivno reakcijo na GLRaV tip I, so v zgornjem delu tabele, čeprav tudi med sumljivimi in negativnimi. Standardni listni ekstrakti iz svežih listov so dali mnogo višje vrednosti kot ekstrakti iz zmrznjenih listov, lesa ali grozdja. Vseh pet subklonov laškega rizlinga 178 je v negativni skupini. Dva klona žametovke, za katera je bil vzorec sestavljen iz listov petih trt v repeticiji (Ž.č. 39 in 43) sta dala višje vrednosti na meji s sumljivimi. Dva vzorca z močnim rdečenjem iz istega vinograda (Ž.č. 42, 46) sta v pozitivni oziroma sumljivi skupini. Vzorec listov 400 let stare žametovke (zap. št. 18) iz Maribora je na negativni strani tabele, listi so v letu 1989 kazali predčasno rdečenje. Vzorec modrega pinota z močnim rdečenjem listov je dal OD vrednosti višje od K+. Vzorci rebule (nora) in malvazije z znano GFV okužbo niso reagirali na GLRaV tip I, kakor tudi ne elitni trs, ki je v 1. 1989 kazal znake predčasnega rumenenja listov. V grafu 5 je prikazana frekventna porazdelitev odčitkov ELISA za GLRaV tip I. Tudi tu imamo velik odklon negativnih vzorcev v desno, med njimi so napačno pozitivni ali napačno negativni vzorci. Visoke in različne nespecifične reakcije (background) med vzorci različnega izvora ali sort ter dolga inkubacijska doba (12 ur) otežujejo postavitev jasne meje E+/E~. Devet vzorcev iz razreda OD 0.250 - 0.350 in mejne vzorce je treba ponovno testirati. 54 KOROSEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 frekvenca 20 20 10 Ž.č. 13 23 \ - odpornosti - kužno izrojenost (GFV) - bujnosti - zvijanje listov (GLRaV) - deformacije lesa MATIČNI VINOGRAD -? pozitivna trta (elitni trs, kandidat) Več let: - meritve pridelka - meritve rasti - odpornost - vinifikacija - posebnosti - 1. preizkušanje (5 let) - 2. preizkušanje (5 let) negativna trta - indeksiranje - serološki testi (ELISA) TRS BREZ ZNANIH BOLEZNI & KLON (=bazni material) modri (certifie) material strogo nadzorovano razmnoževanje retestiranje V Z P O R E D N I P R O G R A M I I N T R O D U K C I 61 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 Izbira metod pri odkrivanju viroz vinske trte je bila odvisna od več predpostavk, ki so oblikovale zastavljeno temo. Prva odločitev je bila glede na to, s kakšnimi problemi se srečujemo v naših vinogradih, s katerimi vrstami bolezni in v kakšnem obsegu. Važni so predpogoji za izvedbo posameznih metod, dosedanje delo in v našem primeru predvsem stopnja že dosežene selekcije. Naslednja odločitev je bila glede na to, kar se iz širšega raziskovalnega dela in obsežne, predvsem tuje literature ponuja kot rešitev za ugotovljene probleme. Zadnja, čeprav ne najmanj pomembna izbira je bila žal opravljena glede na to, kar sem v danih, predvsem materialnih in organizacijskih razmerah lahko opravila. Čeprav daleč od tega, da bi z dobljenimi rezultati rešila problem odkrivanja viroz vinske trte v selekciji, vidim v rezultatih prispevek k reševanju teh problemov. Rezultati morda ne bodo zanimivi le za ozko vinogradniško področje, ampak tudi za sorodne panoge npr. sadjarstvo, ter za bazne raziskave. Delo ni le ocena in primerjava posameznih metod, ampak so le-te že dale povratno informacijo o tem, kakšna je zdravstvena slika obdelanega trsnega materialain kje so nadaljnje usmeritve v raziskavah in njihovi aplikaciji. Enzimsko-imunosorbcijski test (ELISA), ki sem ga uporabila in primerjala predvsem z morfološko selekcijo in biotesti, je dobil svoje mesto, čeprav ne brez zadržkov, vendar z znanimi omejitvami. V vseh obravnavanih primerih se je pokazala velika prepletenost med genetsko in zdravstveno selekcijo, ter nuja, da se opravljata povezano in usklajeno. 62 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 S SKLEPI 63 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 - Enzimsko-imunski test je ob ustreznih standardih (kontrolni vzorci, pravo vzorčenje, grupiranje vzorcev) najbolj ustrezna pot za odkrivanje okužb z GFV. - S testom ELISA smo pri elitnih trsih cv. ' rebula' delno lahko ločili genetske in zdravstvene tipe. Rumeni tip (A) priporočamo za razmnoževanje. Kritična skupina trt s prikrito GFV okužbo (17%) je prevelika, da bi selekcijsko delo na viroze zaključili z morfološko selekcijo. - Indeksiranje na vse možne indikatorje ostane glavni način odkrivanja in ločevanja bolezni znotraj kompleksa GLR-GSP. Preliminarni ELISA testi za closteroviruse so pokazali v glavnem GLRaV okužbe. Delno se vidi razlike v virološki sliki med sortami, kar je posledica njihove dosedanje selekcijske poti, treba je raziskati ali gre za razlike v odpornosti med sortami. Morfološka selekcija v primeru bolezni zvijanja listov popolnoma odpove. - Pokazalo se je, da je okuženost z virozami v veliki meri odvisna od stopnje selekcije v posamezni populaciji. Med starimi sortami je odstotek GFV okužb najvišji, vprašanje je ali te okužbe prekrivajo dobre lastnosti ter jih je zato treba vključiti in ohraniti v genski banki. - Glede na rezultate primerjalnih metod lahko postavimo shemo za pridelavo zdravega t rs nega materiala v Sloveniji. S širšim ugotavljanjem zdravstvene slike naših vinogradov, bi dobili povratno informacijo o nadaljnjih smereh in ustreznih metodah za odkrivanje virusov vinske trte. 64 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 6 UTERATURA 65 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 1 Anonvm. 1979. II legno riccio delia vite in Italia. Inf.tore fitopatol.29(2}:3-18 2 Barba M., Faggioli F., Cupidi A., Quacquarelli A. 1987. Closteroviruses associated with leaf roll of grapevine. Proč. 9tn Meeting ICVG, Jerusalem, 26 (Abstr.) 3 Barlass M., Skene K.G.M., Woodham R.C., Krake L.R. 1982. Regeneration of virus-free grapevines using in vitro apical culture. Ann. Appl. Biol. 101:291-295 4 Bar-Joseph M., Murant A.F. 1982. Closterovirus group. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, No.260 5 Belli G., Faoro F., Fortusini A., Tornaghi R. 1985. Further data on grapevine leafroll etiologv. Phvtopathol. Mediter. 24:148-151 6 Blaich R., Wind R. 1982. Anreicherungsmethode fUr den serologischen Nachweis von Virus in Rebblattern. Vitis 21:40-42 7 Benin M., Grenan S. 1984. Le microgreffage: nouvelle technique d' člimination des virus de la vigne. Progr. Agric. Vitic. 101:33-36 8 Bovey R. 1970. Importance e"conomique des viroses de la vigne. Buli. OIV, 43:124-138 9 Bovey R., Brugger J.J., Gugerli P. 1980. Detection of fanleaf virus in grapevine tissue extracts by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) and immune electron microscopy (IEM) Proč. 7tn Meeting ICVG, Niagara Falls 1980, Canada Agriculture: 259-275 10 Bovey R. Gartel W., Hewitt W.B., Martelli G.P., Vuittenez A. 1980. Virus and virus-like diseases of grapevines - Colour atlas of symptoms. Ed. Payot Lausanne, (angl. franc. nem.) 181 pp. 186 phot. 11 Cadman C.H., Dias H.F., Harrison B.D. 1960. Sap-transmissible viruses associated with diseases of grapevines in Europe and North America, Nature 187:577-579 12 Campbell W.P. 1985. Selection versus heat treatment as a means of obtaining plants free from specified viruses. Phytopathol. Mediter. 24:211 (Abstr.) 13 Castellano M.A., Martelli G.P., Savino V., Boscia D. 1985. Progress in the study of the phloem-limited isometric virus-like particles associated with leafroll-diseased grapevines. Phytopathol. Mediter. 24:165-169 66 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 14 Caudwell A., Giannotti J., Kuszala C, Larrue J. 1971. Etude du role de particules de type "mvcoplasme" dans V etiologie de la Flavecsence dorče de la vigne. Examen citologique des plantes malades et des cicadelles infectieuses. Ann. Phvtopathol., 3: 107-123 15 Clark M.F., Adams A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzvme-iinked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. gen. Virol. 34:475-483 16 Coiro M.L, Lamberti F., Borgo M., Egger E. 1985. Reproduction of Xiphinema index on different grapevine rootstocks. Phvtopathol. Medit. 24:177-179 17 Converse R.H. 1979. Recommended virus-indexing procedures for new USDA small fruit and grape cultivars. Plant Dis. Reptr. 63:848-851 18 Conti M., Milne R.G., Luisoni E., Boccardo G. 1980. A closterovirus from a stempitting-diseased grapevine. Phytopathology 70:394-399 19 Corbett M.K., Wiid J. 1985. Closterovirus-like particles in extracts from diseased grapewines. Phytopath. Mediter. 24:91-100 20 Dias H.F. 1963. Host range and properties of grapevine fanleaf and grapevine yellow mosaic viruses. Ann. Appl. Biol. 51d 85-87 21 Egger E., Gollino G., Antoniazzi P. 1980. Research on grapevine indicator varieties suitable for detecting leafroil in northern Italy. Proč. 7*n Meeting ICVG, Niagara Falls 1980 (Canada Agriculture): 329-331 22 Engelbrecht D.J. 1979. Nature and effect of the breakdown in tolerance of Jacquez rootstock to grapevine stem-grooving in grafted Vit is vinifera L. cv. Queen of the vineyard vines. Proč. 6th Meeting ICVG, Cordoba 1976, Mono-grafias INIA No.l8.Ministr. de Agricult. Madrid:171-178 23 Engelbrecht D.J. 1980 Indexing grapevines for grapevine fanleaf virus by enzyme-linked immunosorbent assay. Proč 7tn meeting ICVG, Niagara Falls 1980 Canada Agriculture :277-282 24 Engelbrecht, D.J., Kasdorf G.G.F. 1985. Association of a closterovirus with grapevines indexing positive for Grapevine leafroil disease and evidence for its natural spread in grapevine. Phytopathol. Mediter. 24d 101-105 25 Faoro R., Tornaghi R., Fortusini A., Belli G. 1981. Association of a possible closterovirus with grapevine leafroil in northern Italy. Riv. Pat. veg. S IV, 17d 183-189 67 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 26 Galzy R. 1964. Technique de thermotherapie des viroses de la vigne. Annls Epiphyt., 15:245-256 27 Garau R., Prota U. 1987. Researches on wood disorders (steni pitting and/or stem grooving) of grapevine, in Sardinia. Proč. 9th Meeting ICVG, Jerusalem, 28-29 (Abstr.) 28 Gartel, W. (1985). Stem grooving (stem pitting, legno riccio) like symptoms in vines of cv. Kerner in Germany. Phytopathol. Mediter. 24:56-59 29 Gifford E.M. Jr., Hewitt W.B. 1961. The use of heat therapy and in vitro shoot tip culture to eliminate fanleaf virus from the grapevine. Amer. J. Enol. Vitic. 12:129-130 30 Goheen A.C. 1970. Grape leafroll. V Frazier N.W. et ali. Virus Diseases of small Fruits and Grapevines. Univ. Calif. Div. Agr. Sci. Berkeley, Calif.:209-212 31 Goheen A.C. 1988. Diseases caused by viruses and viruslike agents. V: Compendium of grape diseases. Ed. Pearson R.C., Goheen A.C. (APS Press) p. 47-54 32 Goheen A.C, 1989. Virus diseases and grapevine selection. Am. J. Enol. Vitic, 40: 67-72 33 Goheen A.C, Luhn C.F. 1973. Heat inactivation of viruses in grapevines. 5tn ICVG meeting, Salice Terme, Riv. Patol. Veg. Ser. IV. 9 (suppl): 287-289 34 Goheen A.C, Nyland G., Lowe S.K. 1973. Association of a rickettsia-like organism with Pierce' s disease of grapevines and alfalfa dwarf and heat treatment of the disease in grapevine. Phytopathology 63:341-345 35 Gooding G.V.Jr 1965. Application of serology to the study of viruses of Vitis.. Proč. Intern. Conf. Virus Vectors Perenn. Hosts. Daviš Califd 211-222 36 Gouzoune N.I., Litvak A.I. Kouzmenko A.P., Djenčev S.Y., Zlenko V.A., Gleba 1.1., Pivegne N.M. 1988. Emploi de la culture in vitro dans la selection de la vigne. Proč. 68e Assemblče gčnčrale OIV Pariš, Viticulture 1, 21 pp. 37 Gugerli P. 1979. Le test immuno-enzymatique (ELISA) et son application pour la diagnostic rapide des viroses de la pomme de terre. Rev. suisse Agric. 11:253-260 38 Gugerli P., Fries P. 1981. Utilisation d' anticorps monoclonaux pour le diagnostic de virus chez les plants. Rev. suisse Vitic. Arboric. Hortic. 13:323 68 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 39 Gugerli P., 1983. Use of enzvme immuno-assay in phytopathology. V: S. Avrameas et al., ( ed. ) Immuno-enzymatic Techniques, . Elsevier Biometrical Press Amsterdam:369-384 40 Gugerli P., Brugger J.J., Bovey R. 1984. L' enroulement de la vigne: mise en evidence de particules virales et dčveloppement d' une mčthode immuno-enzymatique pour le diagnostic rapide. Rev. suisse Vitic. Arboric. Hortic. 16:299-304 41 Harrison B.D., Murant A.F. 1977. NEPO virus group. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses No.185 42 Hewitt W.B., Raski D.J., Goheen A.C. 1958. Nematode-vector of soil-borne fanleaf virus of grapevine. Phytopahtology 48d 586-595 43 Hevvitt W.B., Martelli G., Dias H.F., Taylor R.H. 1970. Fanleaf virus of grapevine. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses No 28. 44 Hevvitt W.B. 1979. On the origin and distribution of Vitis and the virus diseases of the grapevine. Proč. 6tn meeting ICVG, Cordoba 1976, Mono-grafias INIA 18, Ministr. de Agricult. Madrid: 3-5 45 Hrček L., Korošec Z. 1976. Vpliv virusnih bolezni na količino in kakovost pridelka grozdja pri vinski trti. Zb. Biotechn. Fak. Univ. Ljubljana, Kmetijstvo 28:111-117 46 HrZič A. 1982. Nematološke raziskave v Sloveniji. Sod. kmet. 7-8: 295-298 47 Huglin P., Guillot R., Valat C, Vuittenez A. 1980. L* čvaluation genetique et sanitaire du materiel clonal de la vigne. Buli. OIV 53:857-882 48 Huss B., Walter B., Etienne L., van Regenmortel M.H.V. 1986. Grapevine fanleaf virus detection in various grapevine organs using polyclonal and monoclonal antibodies. Vitis 25:178-188 49 Jimenez F., Goheen A.C. 1980. The use of enzyme-linked immunosorbent assay for detection of grape fanleaf virus. Proč. 7tn Meeting ICVG, Niagara Falls 1980, Canada Agriculture, : 283-291 50 Kolber M., Lehoczky J., Kobza S. 1980. Time of sampling and storage of leaf extracts studied on grapevine fanleaf virus (GFLV) with ELISA. Zeszyty Problemovve Postepow Nauk. Rolniczych (291): 173-180 51 Korošec Z. 1982. Propadanje mladih trt na Krasu. Sod. kmet. 7 - 8:312-316 69 KOROSEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 52 Korošec-Koruza Z. 1988. Selekcija vinske trte na virusne in njim podobne bolezni. URP - Biološke osnove kmetijskih rastlin, Poročilo RSS: 149-158 53 Koruza B., Zafošnik A., Petan P. 1987. Razvoj in rezultati klonske selekcije vinske trte ( Vitis vinifera L.) cv. ' laški rizling* v Sloveniji. Zb. Biotehn. fak. Univ. Ljubljana, Kmetijstvo 49d 137-161 54 Legin R., le Gall O., Walter B. 1987. Comparaison de plusieurs types d' enroulement de la vigne. Schvveizerische landwirtschaftliche Forschung, 3, 26:313-316 55 Martelli G.P. 1979. Identification of virus diseases of grapevine and production of disease-free plants. Vitis 18:127-136 56 Martelli G.P. 1988. Recent progres de la virologie de la vigne. (Recent advances in grapevine virologv). Proč. 68e Assemblee gčnerale OIV, Pariš, Viticulture 1, 25 pp. 57 Meredith C.P., Lider L.A., Raski D.J., Ferrari N.L. 1982. Inheritance of tolerance to Xiphinema index in Vitis species. Am.J.Enol.Vitic. 33:154-157 58 Milne R.G., Conti M., Lesemann D.E., Stellmach G., Tanne E., Cohen J. 1984. Closterovirus-like particles of two types associated with diseased grapevines. Phytopathol. Z. 110:360-368 59 Murant A.F. 1970. Arabis mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses No. 16 60 OIV, 67e Assemble gčnčrale (Rome, 1987} 1988 resolutions Buli. OIV, 61:683-684 61 Pejčinovski F. 1977. O nekim virozama vinove lože u Makedoniji. Proč. (Savetovanje o ekskorozi i virusnim bolestima vinove lože, Mostar, Hepok (publ.):165-175 62 Quacquarelli A., Gallitelli D., Savino V., Piazzolla P., Martelli G.P. 1979. Some properties of grapevine fanleaf and other NEPO- viruses infecting the grapevine. Proč. 6th meeting ICVG, Cordoba 1976, Monografias INIA Madrid 18:41-49 63 Pena-Iglesias A., Večino B. 1987. Cytological studies of grapevine leaf roll infected tissue: Further evidence of viroid etiology and improvement of diagnosis. Vitis 26:37-41 70 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 64 Ramsdell D.C, Andrews R.W., Gillet J.M., Morris C.E. 1979. A comparison betvveen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Chenopodium quinoa for detection of peach rosette mosaic virus in "Concord" grapevines. Plant Dis. Reptr. 63(1):74-78 65 Raski D.J., Goheen A.C, Lider L.A., et Meredith C.P. 1983. Strategies against grapevine fanleaf virus and its nematode vector. Plant Disease, 67:335-339 66 Rep. sekr. kmet. prehr. gozd. 1983. Metoda za odbiranje in potrjevanje matičnih trsov v vinogradih in matičnjakih - pravilnik UL SRS 36-424/74 67 Ries R. 1987. Rčsultats de la sčlection clonale a Geisenheim. Tests viro-logiques chez le seUectionneur, possibilitčs et limites du controle des virus. Schvveizerische landwirtschaftliche Forschung, 3, 26: 332-335 68 Rosciglione B., Castellano M.A., Martelli G.P., Savino V.,Cannizzaro G. 1983. Mealvbug transmission of grapevine virus A. Vitis 22:331-347 69 Rosciglione B., Castellano M.A. 1985. Further evidence that mealvbugs can transmit Grapevine virus A(GVA) to herbaceous host. Phytopathol. Mediter. 24: 186-188 70 Rosciglione B., Gugerli P. 1986. Maladies de V enroulement et du bois strie" de la vigne: analyse microscopique et serologique. Revue suisse Vitic. Arboric. Hortic. 18(4):207-211 71 Rosciglione B., Gugerli P. 1987. Transmission of grapevine leafroll and associated clostervirus to healthy grapevine by the mealybug Planococcus citrii (Syn). Proč. 9tn Meeting ICVG Jerusalem: 13-14(Abstr.) 72 Rudel M. 1985. Grapevine damage induced by particular virus-vector combi-nations. Phytopathol. Mediter. 24:183-185 73 Savino V., Boscia D., Martelli G.P. 1985. Incidence of some graft - transmisible virus-like diseases of grapevine in visually selected and heat-treated stocks from Southern Italy. Phytopath. Mediter. 24: 204-207 74 Savino V., Boscia D., Musci D., Martelli G.P. 1985. Effect of legno riccio (stem pitting) on "Italia" vines grafted onto rootstocks of different origin. Phytopathol. Mediter. 24:68-72 75 von Schenk W. 1969 Die Bedeutung der neuen Saatgutgesetzgebung fUr die Rebenveredlung. Vort. XI. Geisenheimer Rebenveredlertagung: 11-36 76 Schmidt L. 1956. Štitaste uši Hrvatske. Zaštita bilja 36, dodatak:3-ll 71 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 77 Semancik Y.S., Rivera-Bustamante R., Goheen A.C. 1987. Widespread occurence of viroid-like RNA's in grapevines. Am. J. Enol. Vitic, 38d 35-40 78 Stellmach G., Berres R. 1985. Investigations on mixed infections of nepo-viruses in Vit is spp. and Chenopodium quinoa Willd. by means of ELISA. Phytopathol. Mediter. 24:125-128 79 Stellmach G. 1987. Die Kerner - Krankheit: Theoretische und praktische Aspekte einer todlichen Rebenvirose. Wein-Wiss. 6:421-426 80 Sutula C.L., Gillett J.M., Morrissey S.M., Ramsdell D.C. 1986. Interpreting ELISA data and establishing the positive-negative threshold. Plant Dis.70, 8:722-726 81 Sarič A., 1980. Biochemical identification of viruses in grapevine (Final technical report) USDA Project No. E30-CR-IR6, Grant No. FG-YU-208, p. 29, 7 tab. 82 Sarič A., Ivanek M. 1985. Zdravstvena selekcija u proizvodnji loznog sadnog materiala. Jugoslov. vinograd, vinar. 9: 14-16 83 Tanne E. 1980. The use of ELISA for the detection of some NEPO viruses in grapevines. Proč. 7*n Meeting ICVG, Niagara Falls 1980, Canada Agri-culture : 293-296 84 Tanne E., Sela L, Klein M., Harpaz I. 1977. Purification and characterization of a virus associated with the grapevine leafroll disease. Phytopathology 67:442-447 85 Tanne E., Givony L. 1985. Serological detection of two viruses associated with leafroll-diseased grapevines. Phytopathol. Mediter. 24:106-109 86 Tanne E., Ben-Dov Y., Raccah B. 1987. Transmission of clostero-like particles by mealybugs (pseudococcidea) in Israel. Proč. 9th Meeting ICVG, Jerusalem, 15-16 (Abstr.) 87 TeTiz D., Goheen A.C, Valle P. 1980. Occurrence and spread of grape corky bark and stem pitting in Mexico. Plant Disease 64:584-586 88 TeTiz D., Tanne E., Gonsalves D., Zee F. 1987. Field serological detection of viral antigens associated with grapevine leafroll disease. Plant Disease 71: 704-709 89 Tijson P. 1985. Practice and theory of enzyme immunoassay s. V: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Vol. 15, Ed. Elsevier, Amsterdam, 2-19, 385-418 72 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 90 Valat C. 1979. Organisation de la sčlection clonale en France en vue de la production de plants de vigne sains. Vignevini, VI, 5: 11-20 91 Vertovc M. 1844. Vinoreja za Slovence. Perložni list h "Kmetijskim in rokodelskim Novicam" Ljubljana, 253 pp 92 Vrdoljak M., Sarič A. 1981. Electrophoretic investigation of some grapevine fanleaf virus isolates. Acta Bot.Croat. 40:51-60 93 Vuittenez A. 1980. The new improvements of serological methods and their possible application to detect and identifv viruses and virus-like diseases of the grapevine. Proč. 7tn Meeting ICVG, Niagara Falls 1980 (Canada Agri-culture Research Branch):225-243 94 Zee F., Gonsalves D., Goheen A., Kim K.S., Pool R., Lee R.F. 1987. Cytopatho-logy of leafroll-diseased grapevines and the purification and serologv of associated closteroviruslike particles. Phytopathology 77:1427-1434 95 Walker M.A., Meredith, C.P., Goheen A.C. 1985. Sources of resistance to grapevine fanleaf virus (GFV) in Vitis species. Vitis 24d 218-228 96 Walkey D.G.A. 1984. Applied plant virology. Ed. Heinemann Ltd. London, pp 329 97 Walter B., Vuittenez A., Kuszala J. Stocky G., Burckard J. van Regenmortel M.H.V. 1984. Dčtection serologique des virus du court-nouč de la vigne par le test ELISA. Agronomie 4d 527-534 98 Woodham R.C., Antcliff A.Y., Krake L.R. Taylor R.N. 1984. Yield differences between Sultana clones related to virus status and genetic factors. Vitis 23:73-83 73 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 7 POVZETEK Na podlagi že opravljenega selekcijskega dela v Sloveniji so bile preizkušene različne metode za odkrivanje viroz vinske trte. Kot osnovna primerjalna metoda je bil izbran enzimsko-imunosorbcijski test (ELISA), opravljen po principu dvojnega sendviča, ki se je pokazal kot najprimernejši za odkrivanje okužb z virusom pahljačavosti listov vinske trte (GFV). Za primer GFV je bila napravljena tehnična standardizacija testa, ki zahteva predvsem stalne kontrolne vzorce, grupiranje vzorcev na podlagi iste sorte, iste vrste in starosti materiala in isto predhodno obdelavo. Najbolj primeren material so sveži mladi lističi, nabrani ob času cvetenja ali lističi iz siljenk, pripravljeni v času mirovanja. Za interpretacijo rezultatov in primerjavo testov se zahteva spektrofotometrično odčitavanje s smiselno postavljeno mejo E+/E-. Interpretacija rezultatov pri zelo visokih nespecifičnih reakcijah (OD 0.200) je vprašljiva, potrebno je ponoviti več testov. Ponavljanje testov je pokazalo visoko zanesljivost (od 88% do 98%). V selekcijskem vinogradu cv. ' rebula' je bilo med 232 trsi odkritih 34% okužb z GFV (43% če vštejemo tudi VBG trte), od tega med naključno pozitivno odbranimi od 12% do 17%. Morfološka selekcija te kritične skupine torej ne odkrije. ELISA test je delno ločil genetske in zdravstvene tipe rebule, za razmnoževanje je priporočen rumeni (A) tip. Vsi trsi z oznako ' nora rebula' (VBG) so tudi nosilci GFV. Ugotovljena je delna ali popolna deformacija ženskega dela cveta (plodnice). Hipotetično gre za dve možnosti: stalno kombinacijo virus - genetska napaka ali za močan vpliv virusa GFV. Pri ugotavljanju virološke slike se je pokazalo, da so najbolj okužene populacije z najnižjo selekcijsko stopnjo (genska banka 67%) najmanj pa kionski kandidati ali vsaj množično selekcioniran vinograd (2% elite - 12% P+ trsi). Indeksiranje kot druga uporabna metoda v diagnostiki viroz vinske trte se je pokazalo kot tehnHno zahtevno in problematično, predvsem zaradi nizkega prijema cepljenja (22%), Vendar v kompleksu bolezni zvijanja listov (grapevine leaf roll, GLR) in razbrazdanje lesa (grapevine stem pitting, GSP) ostaja indeksiranje glavni dokazni postopek. Uspel je prenos znakov razbrazdanja na indikator V. rupestris St. George, ki je potrdil razširjenost bolezni "Rupestris stem-pitting", predvsem na cv. ' refošk' . Indikator LN 33 nikoli ne pokaže tipičnega znaka zvijanja listov (GLR) ali zadebeiitve in pokanja mladic (plutavost lubja, corky bark, CB). V preliminarnih ELISA testih na closteroviruse povezane z boleznijo GLR-GSP je bila pogosta pozitivna reakcija na closterovirus GLRaV I pri cv. ' refošk' in cv. ' žametovka' , manj je tipa I in III in nikoli v mešani okužbi. Vendar se slika znakov bolezni iz morfološke selekcije ne prekriva z rezultati indeksiranja in ELISA, iz česar lahko sklepamo na kompleksno etiologijo teh bolezni, kot jo ugotavljajo tudi številni tuji avtorji. Morfološka selekcija je tu kot metoda za diagnostiko viroz zelo nezanesljiva. Ta del raziskav zahteva razširitev indeksiranja na vse možne indikatorje in določitev populacije closterovirusov za avtohtone sorte. Glede na velik pomen selekcijskega dela v vinogradu lahko s kombinacijo preizkušenih metod za diagnostiko viroz postavimo model za vključevanje teh metod v selekcijo. Vsaki višji stopnji genetske selekcije je potrebno vzporedno postaviti čim bolj uspešne metode za odkrivanje viroz, vse pa je potrebno povezati v sistem selekcije, testiranje in priznavanja trsnega razmnoževalnega materiala kot velja v skupnosti EGS. 74 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 8SA2ETAK Na osnovu več obavljenog selekcijskog rada u Sloveniji, istraženi su najpogodniji metodi za otkrivanje virusnih zaraza vinove lože. Kao osnovni komparativni metod odabran je enzimsko- imunosorbcijski test na principu dvostrukog sendvič metoda (ELISA) koji se pokazao kao najpogodniji za otkrivanje zaraza virusom lepezavosti lista vinove lože (GFV). Na primeru GFV izradjena je tehnička standardizacija postupka u kojoj se traži izbor stalnih kontrolnih uzoraka, njihovo grupisanje uz izbor sorte, materijala i prethodne obrade. Najpogodniji materijal su sveZi mladi lističi za vreme cvatnje lože ili isti od poteranih reznica u zimsko doba. Za interpretaciju rezultata i komparaciju testova preporučuje se čitanje spektrofotometrom sa logično postavljenom granicom E+/E~. Interpretacija rezultata sa vrlo visokom nespe-cifičnom reakcijom (OD = 0.200) je pod upitnikom, treba ponoviti više testova. Pouzdanost testa je visoka - od 88% do 98%. U selekcionom vinogradu cv. ' rebula* je od 232 čokota otkriveno 34% GFV zaraza (43% ako ubrajamo i čokote VBG-bez roda), od tog broja medju slučajno odabranim pozitivnim čokotima od 12% do 17% (čokoti kritična grupa). Morfološka selekcija prema tome ne otkriva zaraza ove kritičke grupe. ELISA test je delimično odvojio genetske i zdravstvene tipove rebule, za razmnožavanje je preporučen žuti (A) tip. Svi čokoti sa oznakom VBG su i nosioci GFV zaraze. Utvrdjena je delimična ili potpuna deformacija ženskog dela cveta (plodnika). Hipotetički se radi o dve mogučnosti: Stalnoj kombinaciji virus- genetska deformacija ili o velikom uticaju zaraze na plodnik. Kod postavljanja virološke slike vinograda se pokazalo da je največa zaraza u populaciji na najnižem stepenu selekcije (banka gena - 68%) i najniža uz klonske kandidate ili vinograd pozitivne masovne selekcije (2% - 12%). Indeksiranje kao drugi metod koji se upotrebljava u dijagnostici virusnih zaraza pokazalo se kao tehnički složeno i problematično, naročito zbog niskog prijema kaiemljenja (22%). Medjutim, u kompleksu bolesti uvijanja lišča (GLR) i deformacija drveta (GSP) indeksiranje ostaje glavni dokazni postupak. Izvršen je prenos simptoma uZlebljenosti drveta na indikator Vitis rupestris St. George čime je potvrdjena proširenost bolesti "Rupestris stempitting", i to naročito na cv. ' refošk' . Indikator LN 33 ni u jednom slučaju nije pokazivao tipične simptome uvijanja lišča (GLR) ili zadebljanja i pucanja mladica (corky bark, CB). U preliminarnim ELISA testovima na closteroviruse povezane sa GLR-GSP kompleks bolesti bila je cesta pozitivna reakcija na closterovirus GLRaV I kod cv. ' refošk' i cv. ' žametovka' , manje ima tipa I i III, ali nikada u mešovitoj zarazi. Simptomi bolesti iz morfološke selekcije nisu u logičnoj vezi sa rezul-tatima indeksiranja i ELISA testa, što indicira na kompleks svojstva etiologije bolesti, kao što su to utvrdili i mnogi strani autori. Morfološka selekcija u tim bolestima nije od nikakve koristi. Ovaj deo istraZivanja traži proširenje indeksiranja na sve raspoložive indikatore i determinaciju populacije closterovirusa za autohtone sorte. S obzirom na veliki značaj selekcijskog rada u vinogradarstvu, kombinacijom proverenih metoda za dijagnostiku virusnih zaraza mogli bismo postaviti model za uključivanje ovih metoda u selekcijski rad. Svakom višem stepenu genetske selekcije treba paralelno postaviti što uspešnije metode za otkrivanje virusnih zaraza i njihovo povezivanje u sistem selekcije, testiranja i priznavanja loznog sadnog materiala kakvi vaze u Evrcpskoj ekonomskoj zajednici. 75 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 9 SUMMARY Different methods for detecting virus diseases of the grapevine were tested on the basis of the previous selection work in viticulture in Slovenia. Double sandwich enzvme-linked immunosorbent assay (das ELISA) was chosen as the main comparative method and as the best known way in the detection of the grapevine fanleaf virus disease (GFV). In the čase of GFV the required standards for ELISA were as follows: the standard negative and positive control samples, the grouping of samples according to the grapevine cultivar, the age and the source of the plant material, and the preliminary treatment. Young leaves sampled at bloom tirne in the vineyard or on the dormant cuttings forced to grow in greenhouse were the best source of the material. To interprete the ELISA data the spectrofotometric reading is necessary where the positive/negative threshold (E+/E-) is well defined. The high non-specific reactions of the negative controls (OD 0.200) were questionable and the results called for repeating the tests. The procedure gave the high acuracy of 88% to 98%. In the mother block vineyard of cv. 'rebula' the group of 232 vines were sampled randomly and 34% of vines showed to be positive to GFV (43% when VBG -vines with no crop were included). The group of positive vines showed lower incidence of virus disease (12% to 17%). This is critical group because it is never detected as the diseased material by morphological visual selection work. ELISA partially differentiated betvveen genetic and sanitary types of cv. 'rebula', the type A being recommended for tha viticultural practice. Ali the vines noted as VBG, gave the positive GFV reaction. The partial of the complete deformation of the pistile in the VBG group was established. Two hypotetic conclusions are proposed: the constant coincidence of the genetic abnormality and the GFV infection of the strong negative influence of the GFV on the development of the grape flower. Establishing the sanitary status of the vineyards the less selected polulations (the old collections) showed the highest incidence of GFV (64%) and the clonal or positive mass selected plots showed the lowest GFV infections (2% - 12%). We transmitted the "Rupestris stem pitting" symptoms for cv, 'refošk' to the Rupestris St. George. In contrary to the field symptoms the indicator LN 33 showed no tipical leaf rolling or shoot swelling or cracking knovn from the corky bark disease (CB). Preliminary ELISA for the GLR associated closteroviruses revealed the presence of the GLRaV type I (cv. 'refošk' and cv. 'žametovka') more frequently as the types II od III, but no mixed infections have been detected. The sanitary status of the vineyard does not correspond to the results of the indexing and the ELISA, the etiology of the diseases has not been cleared out completely. The visual selection is not the adequate method in this čase. The expanded indexing procedure to ali possible indicator varieties is recommended especially for the autochtone grapevine cultivars. According to the great impact of the selection work in viticulture the scheme of the diagnostic methods for virus diseases and the clonal selection work is proposed. Ali the elaborate selection work ahould be combined with the diagnostic methods for known virus diseaccc as it is proposed in aH viticulture countries in CEE. 76 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 10 PRILOGE 77 KOROŠEC-KORUZA Z. Proučevanje ustreznih metod za odkrivanje viroz vinske trte ... v selekciji. Disertacija, Zagreb, 1990 SEZNAM PRILOG la Zbirni podatki selekcije cv. ' rebula' , Ampelografski vrt, 1983-1989 lb Zbirni podatki selekcije cv. 'rebula', dobri trsi (P+70) le Zbirni podatki selekcije cv. 'rebula', slabi trsi (P-70) 2 Zbirni pregled testiranja starih sort primorskega rajona 3 Shema uporabljenega ELISA testa 4 Evidenca ELISA testa (primer) 5 Slike Priloga Jas Zbirni podatki selekcije cv. 'rebula' , Arapelografski vrt, 1983 - 1989 zap. trta množična selekcija biotesti EL1SA (GFV) seriia ArMV prid siki Št. pozitivna negativna (znaki) želj. lndk. 1 2 3 4 S 6 7 8 9 leto kg/trs število grozdov x teža grozda sladkor 0°e kisi. g/l teža 100 Jagod x | P A | B | C | D 1 1.13 3.2 + X 2 1.15 4.4 + 3 1.18 2.8 + X X X 4 1.24 3.0 + X S 1.27 2.8 + X X 6 1.31 2.8 + 7 1.32 3.4 + 8 1.33 2.8 + X 9 1.38 2.2 - X X 10 1.39 3.4 + X U 1.40 2.4 - X X 12 1.43 3.2 + 13 1.48 1.0 - 14 1.50 3.0 + IS 1.61 3.0 + 16 1.66 1.6 - 17 1.69 1.0 - 1B 1.74 2.8 + X X 19 1.77 3.4 + X X 20 1.81 1.0 - X X 21 1.85 1.0 - TI 2.5 3.0 + X 23 2.7 2.0 - X 24 2.8 2.4 + X 2S 2.9 2.0 - X X X 26 2.10 2.4 + X X 27 2.11 3.2 •*- X X 28 2.12 2.8 + X X 29 2.13 3.2 + X 30 2.14 3.0 iW X 31 2.15 1.8 ~ no rlccio 32 2.16 3.0 X X 33 2.17 3.4 + X X 34 2.18 2.6 + 36' 2.19 1.8 - X X 36 2.21 3.S X X 37 2.22 2.8 + X 38 2.23 2.8 + X X X 39 2.25 22 - X 40 2.26 4.0 + X X 41 2.27 22 _ zvijanje 42 2.28 1.4 X 43 2.29 4.2 + X 44 2.30 2.8 + - ± 83 17.10 110 155 87 10.40 61 170 88 7.40 38 19S 6S 10.9 83 10.15 73 138 87 S.90 4S 131 88 3.80 31 123 81 13.2 83 7.20 39 185 87 6.70 57 117 88 4.15 27 154 83 9.00 46 196 87 7.60 53 143 88 7.15 30 238 66 11.4 83 9.00 46 196 87 3.20 23 137 83 3.80 24 1S2 87 S.9S 31 192 83 6.30 33 191 83 3.55 23 154 88 2.10 16 131 83 0 0 0 88 6.60 33 200 75 9.3 83 0 0 0 83 0 0 0 88 1.60 10 160 83 8.30 48 173 88 4.35 27 180 83 5.80 39 226 88 6.10 30 203 89 3.50 25 140 83 4.40 21 210 83 4.90 27 216 83 9.10 24 207 83 3.30 32 103 87 S.95 43 138 88 1.00 12 83 83 8.55 32 267 83 S.S0 23 241 83 3.35 21 160 87 S.10 34 1S0 , 88 10.85 56 194 83 6.35 34 187 83 7.25 38 191 87 4.70 26 166 88 6.45 28 230 83 5.SO 41 134 87 S .35 38 140 88 3.15 15 210 83 7J5 38 188 87 6.6S 57 116 88 6.35 29 219 75 7.6 83 6.15 37 166 83 4.SS 37 123 83 7.20 38 189 87 8.SS U 194 88 S.90 36 164 83 8.6S 36 240 88 4.30 21 205 89 7.S0 - 74 ll.S 197 180 277 240 2S9 223 zap. trta množična selekcija biotestl ELISA (GFV) seriia ArMV pridelki št. pozitivna negativna (znaki) želj. indk. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 leto kg/trs število grozdov x teža grozda sladkor 0°e kisi. g/l teža 100 Jagod * | P A | B | C | D 4-5 2.31 3.0 + X X 46 2.32 2.2 - X X 47 2.34 2.0 - X X X 48 2.3S 3.0 + X X 49 2.38 4.0 X X SO 2.39 2.2 - SI 2.40 2.2 - S2 2.41 1.6 - X X X S3 2.43 3.4 + S4 2.44 1.4 _ X X X SS 2.47 22 - X X S6 2.S1 3.0 + X X S7 2.53 2.8 + X 58 2.54 2.4 + S9 2.55 2.8 + X 60 2.57 2.8 + X 61 2.S8 22 - X X 62 2.59 1.4 - X X X 63 2.59 1.4 - X X X 64 2.60 1.0 - X X X 6S 2.61 2.0 - 66 2.68 2.0 _ X 67 2.69 1.6 - X X 68 2.70 2.4 - X X 69 2.74 3.8 + X 70 2.80 2.0 _ X 71 2.81 3.0 + X X 72 2.84 h + 73 2.85 + X 74 2.86 1.4 - X 7S 2.87 3.2 + 76 3.2 2.4 + X X 77 3.4 2.8 + 78 3.5 1.2 - X 79 3.6 1.6 - X 80 3.7 2.4 - X X 81 3.8 1.2 - X X X 62 3.9 3.4 + X X 83 3.10 2.4 - X X 84 3J1 2.4 4 X 8S 3.14 2.0 - 86 3.15 3.2 + X X 87 3.16 22 _ X X X 88 3.18 12 + X 89 3.19 1.2 _ X x GLR 90 3.21 4.0 - 91 3.22 32 + X 92 3.23 42 + 93 3.24 22 - X 94 3.2S 22 - X X 4 4 4 (+) " 95 3.31 3.4 96 3.32 3.2 4 X X 97 3.33 2.4 - X X 98 3.34 2.0 - * 83 3.20 - 83 4.65 - 83 0.85 83 13.7 88 11.10 89 7.00 - 83 3.45 - 83 7.40 87 5.65 88 4.30 83 9.15 - 83 S.S0 83 4.20 - 83 5.85 83 2.20 83 0.40 - 83 0.40 83 5.75 89 - 83 5.05 - 83 3.65 - 83 12.S0 88 8.50 89 - - 83 6.00 - 83 8.85 89 9.50 83 6.95 88 2.50 83 2.7S 88 1.30 - 7.6S ± 88 8.70 - 88 0.20 83 4.20 - 83 0 83 6.35 83 4.10 83 4.10 - 83 7.80 88 4.60 83 7.90 83 15.00 88 9.40 89 7.30 83 4.75 83 9.00 87 8.10 88 7.00 89 5.20 83 6.45 - 83 4.15 88 6.35 83 9.20 87 10.75 88 1.30 89 6.50 83 9.20 18 178 24 194 8 106 68 201 38 291 74 11.3 - - 6S 11.5 32 108 43 172 37 153 2S 172 45 203 41 134 25 168 34 172 15 147 2 20 3 20 47 122 - 78 10.01 40 126 19 191 57 219 41 207 70 10.8 - - 70 11.7 47 128 S2 170 46 207 43 162 31 168 24 115 9 144 33 232 44 197 69 10.3 2 10 29 148 0 0 37 172 26 158 34 120 37 210 22 209 75 1S8 67 157 47 200 73 10.2 41 178 35 136 38 239 33 245 3S 200 74 9.7 - 67 12.1 51 126 25 166 31 204 48 191 S9 182 10 130 83 9.3 37 176 48 191 240 221 225 2S8 230 194 239 200 173 308 zap. trta množična selekcija biotestl ELISA (GFV) seriia *rMV pridelki št. pozitivna negativna (znaki) želj. Indk. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 leto kg/trs število groz dov x teža grozda sladkor 0°e kisi. g/l teža 100 jagod X | P A 1 B | C | D 99 3.35 3.R 100 3.40 2.8 101 3.41 2.0 102 3.42 1.0 103 3.44 2.2 104 3.45 2.4 105 3.49 1.0 106 3.S3 2.0 107 3.54 2.6 108 3.55 2.6 109 3.S8 2.4 110 3.61 2.4 111 3.62 2.0 112 3.6S 2.4 113 3.66 2.6 114 3.68 2.8 11S 3.69 2.0 116 3.71 3.R 117 3.72 3.0 1)8 3.73 2.8 119 3.74 2.0 120 3.7S 2.R 121 3.77 12 122 3.78 2.6 123 3.79 3.2 124 3.80 22 12S 3.81 2.6 126 3.84 2.6 127 3.85 2.4 128 3.86 2.4 129 4.2 3.0 130 4.3 2.2 131 4.4 2.0 132 4.9 2.8 133 4.11 2.4 134 4.12 2.2 135 4.14 1.0 136 4.16 1.8 137 4.22 2.0 138 4.26 3.0 139 4.27 2.8 140 4.35 3.2 141 142 143 4.37 4.38 4.39 II 144 4.40 2.8 145 146 4.47 4.50 H (-) + GLR 83 16.75 77 218 89 11.80 61 193 83 2.20 15 146 83 2.00 18 111 83 3.70 19 194 87 11.45 46 248 88 10.55 42 2S1 89 7.70 50 154 83 4.80 83 4.80 87 5.19 88 6.60 83 5.15 88 2.45 83 745 88 5.10 83 8.15 88 9.00 83 4.90 89 2.70 83 9.3S 87 8.30 88 2.20 88 3.70 83 645 83 6.35 83 4.40 87 6.85 88 3.70 83 2.90 88 3.45 89 5.40 83 5.20 88 7.20 89 3.65 83 4.65 83 9.45 83 3.05 88 5.20 89 8.50 83 4.30 83 3.80 83 0 83 2.20 88 8.00 89 9.35 83 5.95 83 2.70 87 8.15 88 9J0 89 540 83 103 88 140 83 7.15 83 345 83 7.60 88 3.50 83 7.90 89 6.90 88 4.10 29 30 58 165 41 117 38 241 26 2S4 42 123 27 21 47 154 25 204 44 185 42 214 27 181 15 180 40 233 33 2S1 15 147 21 176 26 244 28 226 32 138 m 180 25 148 17 170 22 157 41 132 36 144 41 176 17 215 155 163 31 98 25 208 42 202 2S 172 26 146 18 122 37 216 39 240 24 248 20 135 40 202 41 222 69 149 10 120 31 231 26 125 49 155 25 140 40 198 48 144 29 141 73 10.0 247 61 73 10.7 9.6 199 219 66 58 80 11.8 14.6 84 216 211 307 88 345 22 152 33S 8^^°883$888fi SSSSSSa^^,^ 32 trt^ui trt<>trt"cot^ ■4"+-+-+*6a5t^so •+<6-+vi-4>*6a3 J* •o o * o 4> 14 T3 ■8 "S k a 11 IX So >• o o — "C f S £ H X0 00 5 v 00 M 3 I ** | o C < m eo eri o > u. O <: ■>* to u cu pj >M — 3 jI T) ote a Xi z? m N _ M a 2 «5 N T> u j* *> g 4> tO 1 m i C < o C R a, 3 _ N £ K rta ♦j d . «J *J N »a a 8 K -O*- vOvO»tAS . O9,*00e> trte-sl^O*© , tOOM?'* . C* votrtvo trte>oo^t-» cj^eo ' eovocor; trtp»trtS*o t>NflvOo ' «*» S88 S38S3°3 SS^SSSss sSSSSJ• sgSSS■ a § S- 38' 82-SS 3* 8S2s°Ssg s g »s« assa s« S58s2°a85i g o o oog oiopo oo ©ooooootrt o 59*5 55000» *2®Q?2 ?3?2 o*oWQ52?2®<"' 00 00 co cooooo coooooco cOoo eoeo oooo oooo oooo 1 1 1 11 11 1 1 1 1 1 111 1 111 + + i i + 1 1+ 1 n 1 1 1 + 11 1 + + + 1 1 XX XXX X XX X X X X X XX X X X X X XX X XXX XXX X XX X X X XXX XX X X XX I I I + + +11 I + + I + + + + + + + + + I I + I + + +11 I + I + + + I I 11+ + •«* eoppeoo pooo o (^ (j cot>j o. no«# peo ^•o-oe-jco.Hjco/ocop© es oO-jO^ 22 « •* >a eo 0.0 —> eoeNco ^tn eoer^-ooep^eoercoo trt trt-BvoKt^ eoc^G S S S Ses e-j e^toco *? c9^es^«}esc4eNe-t cšeseN evj^evjes-iesešeN ~~e* cs K 00, eq S06 m o^ t« "^t^O} "~'~'^:eieio^c-feN •O trt trt "9 trt O SO O »O sOvOvO »O vOo "O'O ^3 "O O *0*OvO O OtrtsrtOo^eovOt"« -»-e^^P —SSeMesescs^ 5 o>o>ot-~t^r^>.t^t>.t^tN. c^t-^čoeoeo r^0Oer> o^-esM^trtvot-^ eoo>2 S cococo e>ooe>e7Ner>oo ^^S S zap. trta množična selekcija blotestl ELISA (GFV) serila \rMV pridelki št. pozitivna negativna (znaki) zel). lndk. 1 2 3 4 S 6 7 8 9 leto kg/trs Število grozdov x teža grozda sladkor 0°e kisi. g/l teža 100 jagod * | P A | B | C | D 202 6.42 1.0 W)3 6.49 2.4 204 6.S1 1.0 205 6.S2 1.0 Z06 6.61 2.4 207 6.62 3,2 208 6.63 2.4 209 6.65 2.0 210 6.64 1.0 211 6.66 1.4 212 7.4 2.0 213 7.9 2.2 214 7.10 2.2 215 7.14 1.8 216 7.16 2.6 217 72$ 3.0 218 7.27 2.8 219 7.35 3.8 220 7.39 1.0 221 7.41 2.6 m 7.42 2.0 223 7.43 2.8 224 7.44 3.0 22S 7.63 2.0 226 7.70 3.0 227 7.76 2.8 228 8.2 2.0 229 8.6 2.6 230 8.9 2.8 231 8.1S 2.8 232 9.18 3.0 83 83 0 0 0 83 0 0 0 83 3.90 26 150 83 5.50 42 132 83 6.70 48 139 83 2.40 26 92 88 0 0 0 83 0 0 0 83 3.15 38 82 83 4.20 35 120 83 3.40 29 117 83 7.40 36 20S 88 0 0 0 83 5.85 38 154 63 3.75 35 107 63 6.15 46 177 89 6.25 3S 179 89 6.85 35 253 88 4.20 30 140 89 7.00 _ _ 89 4.20 26 162 80 10.2 229 LEGENDA: pozitivna x = izračun vrednosti: vsota ocen/St. let selekcija p _ ozn^a za pozitivno množično selekcijo + pridelovalno dobra trta - pridelovalno slaba trta negativna (znaki) A - premaknjena vitica selekija B _ ^^onaacl^. na rozgl (dvojni členki, biforkacije) x - trs ima C - oslpanje D - trta brez grozdja, "nora" ali VBG biotestiizelj - zeljasta rasti. (Cheuopodinm sp.) lndk - trtui indikator brez reakcije (=brez virusa) 4 z reakcijo (z virusom) ELISA: 1 do 9: zaporedna Številka serije - brez reakcije (negativna reakcija - brez virusa) + z reakdjo (pozitivna reakcija - z virusom) t sumljiva reakcija pridelki: 0 - nI pridelkov, nI podatka Priloga Ib: Zbirni podatki selekcije cv. ' rebula' , dobri trsi (70 P+) trta množična selekcija biotesti EUSA (GFV) seriia pridelki pozitivna negativna (znaki) želj. lndk. 1 2 3 4 S 6 7 8 9 leto kg/trs Število grozdov x teža grozda sladkor 0°e kisi. f/l teža 100 jagod X | P A ( B ( C | D 1.15 4.4 + - - - - 83 17.10 110 155 1.18 2.8 + X X X - 83 10.15 73 138 1.31 2.8 + - - 83 7.20 39 18S 1.32 3.4 + - 83 9.00 46 196 1.33 2.8 + X : 83 9.00 46 196 1.39 3.4 + X 83 6.30 33 191 2.10 2.4 + X X 4 4 83 5.80 39 226 2.11 3.2 + X X 4 4 - - 83 4.40 21 210 2.12 2.8 + X X - 83 4.90 27 216 2.13 3.2 + X - - 83 9.10 24 207 2.16 3.0 X X + - - - 83 6.5$ 32 267 2.17 3.4 + X X 83 5.50 23 241 2.22 2.8 + X 4 - 83 6.3$ 34 187 2.23 2.8 + X X X - 83 7.2S 38 191 2.26 4.0 + X X - 83 7.1$ 38 188 2.29 4.2 4 X a + 83 7.20 38 189 2.30 2.8 + 4 4 83 8.6S 13.7 36 240 2.« 3.4 4 - 83 68 201 2.S1 3.0 + X X - - 83 7.40 43 172 2.S3 2.8 + X _ - 2.54 2.4 + - 83 9.1S 45 203 2.SS 2.8 4 X - - 83 5.50 41 134 2.57 2.8 + X + 83 4.20 25 168 2.74 3.8 + X - - 83 12.50 57 219 2.81 n + X X - - 83 8.8$ 52 170 2.85 + X - 83 6.95 43 162 2.87 32 + + - 7.6S 33 232 3.9 3.4 + X X + + 83 6.3$ 37 172 3.15 3.2 + X X _ - - 83 7.80 37 210 3.18 42 + X - (+) - - 83 IS .00 67 157 3.22 3.2 + X - 83 9.00 38 239 3.31 3.4 + X - - 83 9.20 48 191 3.32 3.2 + X X - 83 9.20 48 191 3.35 3.8 + X - 83 16.7S 77 218 3.66 2.6 4 X X 4 ♦ 4 4 (-) + - 83 8.15 44 185 3.68 2.8 + X X - 83 4.90 27 181 3.72 3.0 + X X - + - 83 9.3S 40 233 3.75 2.8 + X - 63 6.35 26 244 3.79 3.2 4 X X - + + 83 4.40 32 138 3.81 2.6 + X X 4 4 - 83 5.20 36 144 4.2 3.0 4 X - - 83 9.4S S8 163 4.9 2.8 + X X - - 83 3.0S 31 98 4.26 3.0 4 X X - - 83 $.9$ 24 248 4.27 2.8 + X - - 83 2.70 20 13$ 4.35 3.2 + X X - 83 10.3 69 149 4.37 2.8 + X - 83 7.1S 31 231 4.40 2.8 4 CLR + - - 83 7.90 40 198 4.47 2.6 + - - 88 4.10 29 141 4.71 2.6 + X X - - 83 $.60 30 186 4.88 3.0 + X - - 83 7.55 43 176 S.14 3.6 + X - - 83 14.4$ 77 187 5.16 3.2 + - 83 6.9S 38 183 S.18 22 - X 4 4 7.90 42 188 5.32 3.0 + - s _ 6.1$ 31 198 5.35 3.8 4 X X - - 83 8.60 42 204 5.38 3.2 + X X - - 83 6.20 36 172 5.53 3.4 + X X - - - 83 6.55 37 177 5.54 3.8 + X - - - - 83 6.10 35 174 S.86 4.0 + X - 83 8.10 S2 156 6.2 2.6 + - - 83 3.70 20 185 6.5 2.8 4 X s 83 8.70 56 155 6.10 2.8 4 - 83 7.20 41 176 6.15 2.6 4 X X X 4 83 4.20 32 162 6.27 2.6 4 X - 83 4.30 20 215 6.36 2.8 4 - 83 6.10 54 113 6.37 2.6 4 X - 83 7.3S 42 17S 6.62 3.2 4 X - 63 S.SO 42 132 7.27 2.8 4 X 83 7.40 36 205 7.41 2.6 4 X X + 83 5.8S 38 154 7.43 2.8 4 X - 83 8.1S 46 177 Priloga le: Zbirni podatki selekcije cv. 'rebula', slabi trsi (70 P-) trta množična selekcija biotestl ELISA (GFV) seriia pridelki pozitivna negativna (znaki) želj. indk. 1 2 3 4 S 6 7 8 9 leto kg/trs Število grozdov x teža grozda sladkor 0°e kisi. g/l teža 100 jagod x | P A | B | C | D 1.38 2.2 1.40 2.4 1.8S 1.0 2.9 2.0 2.15 1.8 2.19 1.8 2.25 2.2 2.27 2.2 2.28 1.4 2.32 2.2 2.34 2.0 2.41 1.6 2.44 1.4 2.58 2.2 2.59 1.4 2.59 1.4 2.60 1.0 2.61 2.0 2.69 1.6 2.70 2.4 2.B0 2.0 2.86 1.4 3.S 1.2 3.7 2.4 3.8 1.2 3.10 2.4 3.14 2.0 3.16 2.2 3.19 1.2 3.24 22 3.25 22 3.41 2.0 3.42 1.0 3.44 2.2 3.54 2.6 3.61 2.4 3.62 2.0 3.65 2.4 3.77 22 3.80 22 3.85 2.4 4.11 2.4 4.12 2.2 4.14 1.0 4.16 1.8 4.38 1.6 4.39 2.4 4.52 2.4 4.59 1.8 4.61 2.0 5.7 1.0 5.13 1.8 5.20 \2 5.21 1.6 5.33 2.4 6.9 2.2 6.20 2.2 6.22 1.8 6.31 1.8 6.32 1.0 6.42 1.0 6.51 1.0 6.S2 1.0 6.61 2.4 6.63 2.4 6.65 2.0 6.66 1.4 7.9 22 7.14 1.8 7.42 2.0 7.63 2.0 X X X X XXX legno riccio x x x zvijanje x GLR - - - 83 3.80 24 1S2 + 83 3.S5 23 154 83 0 0 0 83 8.30 48 173 - - 83 3.30 32 103 - - 83 3.35 21 160 - - 83 5.S0 41 134 83 6.15 37 166 i 83 4.SS 37 123 - - 83 3.20 18 178 * - 83 4.65 24 194 - 83 0.85 8 106 - 83 3.45 32 108 - 83 5.65 34 172 »• 83 2.20 15 147 + 83 0.40 2 20 + - 83 0.40 2 20 83 5.75 47 122 83 5.05 40 126 - 83 3.65 19 191 - - 83 6.00 47 128 83 2.75 24 115 - 88 0.20 2 10 83 4.20 29 148 - 83 0 0 0 83 4.10 26 1S8 83 4.10 34 120 83 7.90 75 158 83 4.75 35 136 83 6.45 SI 126 - 83 4.15 25 166 83 2.20 15 146 + - 83 2.00 18 111 83 3.70 19 194 - 83 4.80 29 165 - 83 4.80 41 117 - 83 5.1S 42 123 - - 83 7.25 47 154 83 6.35 28 226 - 83 2.90 17 170 - 83 4.65 30 155 - 83 4.30 2S 172 83 3.80 26 146 - 83 0 - 83 2.20 18 122 + - 83 3.25 26 125 - - 83 7.60 49 1SS - 83 5.65 34 166 83 5.70 93 61 83 S.00 32 156 + = 83 0 0 0 83 4.60 3S 131 83 4.80 31 15S 83 5.25 47 112 83 6.60 30 220 83 4.00 29 138 83 5.S0 34 162 83 4.70 35 134 + - 83 2.10 18 111 + - 83 0 0 0 + 83 0 0 0 ♦ i 83 0 0 0 + - 83 0 0 0 - 83 3.90 26 150 83 6.70 48 139 83 2.40 26 92 83 3.15 38 82 83 4.20 35 120 - 83 3.40 29 117 83 3.75 35 107 88 4.20 30 140 Priloga 2: Zbirni pregled testiranja starih sort primorskega rajona zap. sorta namen, lokacija indeksiranje ELI S A št št. trsov na GFV GFV GLRaV I + 1 zelen 67 Slap - selekcija 0 6+ 61- 0 močno osipanje 5 Lože muzejski nasad + 4+ 1 - 0 2 pinela 2 genska banka + 15 selekcija -1 Lože 3 glera 3 genska banka Lože + 5 A. vrt 4 vitovska 9 Kras - selekcija grganja 1 A. vrt - gen. banka 5 pagadebiti 2 A. vrt - 2-0 genska banka 6 klarnica 2 A. vrt 2+ 7 pika 1 A. vrt 1+ Skupaj 22 genska banka 15+ 7- (68%) 3+ ________________91 selekcija_______________________________11+ 80-(14%) 0 Legenda: + pozitivni test - negativni test 0 test ni bil opravljen 2+ 0 2+ 10- 1+ 1+ 0 4- 1- 3+ 6- 0 1- - Priloga 3: Shema uporabljenega ELISA testa (double antibody sandwich method) 1. Oblaganje ploSč z antitelesi dodaj 200 ml (100 y.l) mešanice pufra in IgG v vsako luknjico in tesno prekrij ploščo 2. Inkubacija pri 30°C za 4h (37°C za 2h) 3. Pranje po inkubaciji - izprazni plošče -in jih 3x do 4x pazljivo iz peri s pralnim pufrom (250 - 500 \A/luknjico) 4. Dodajanje rastlinskega ekstrakta na 1 g listov dodaj 10 ml ekstr. pufra zgneti in precedi, ter dodaj 200 ^l/luknjico 5. Inkubacija pri 6°C za 16n (možno tudi 4° - 10° in 12h - 20h) 6. Pranje kot zgoraj 7. Dodajanje konjugiranega IgC Razredči conj.- IgG v konjugantnem pufru in dodaj 200 ^l/luknjico, tesno prekrij 8. Inkubacija pri 30°C za 5h (4h - 37°C) 9. Pranje isto kot zgoraj 10. Dodajanje encimskega substrata dodamo 200(il p-nitrophenylphosphate substrata v diethanolnem pufru 11. Inkubacija 60 min pri sobni temperaturi v temi! 12. Ustavljanje reakcije, če je potrebno s 50 ^l/luknjico 3M NaOH 13. Vrednotenje, vizuelno po rumeni barvi ali s spektrofotometrom pri 405 [im Reakcija: Ap p-Nitropheny lphosophate + H2O -------------> phosphate + p-nitrophenol Priloga 4: Evidenca ELISA testa (primer) a) seznam vzorcev - šifriranje b) izpisek OD vrednosti iz čitalca in shema c) rezultati d) fotografija (pogojno) si. 4 a) Seznam vzorcev - šifriranje - 13.julij.1989 ^ GFV ^ šiL _3 šifra vzorec - trs šifra vzorec - trs 86 Rb 3.84 110 Rf 6 R-T 87 Rb 2.81 111 Rf T 88 Rb 7.4 112 Rf 1 RT 89 Rb 1.27 113 Pika 90 Rb 1.74 114 Rb 2.29 91 6.25 115 Rb 7.29 92 6.49 116 Mlvz 2.20 K+ 93 7.44 117 Rb 5.80 94 Vit. grg. 4 118 Rb 5.68 95 L. rizL Lože 119 Rb 4.70 96 Vit. grg. 18 120 Rb 5.84 97 Rb 6.16 121 Rb 4.70 98 Rb7.25 122 Rb 3.4 101* Rf IV/30-R 123 Rb 1.61 102 Rf II/56-R 124 Rb 3.40 103 Rf I/45-R 125 Rb 1.24 104 Rf 28 R-ŠT 126 Rb 6.26 105 Rf 19 R-ŠT 127 Rb 5.70 106 Rf 17 R-ŠT 128 Rb 2.84 107 Rf 27 R-K 129 Rb 3.11 108 Rf 24 R-K 130 Rb 5.82 109 Rf 1 K1+ - ekst. pufer BIOREBA 2 K2+ PVP +2% nikotin K3+ PVP brez nikotina K4+ ekst. pufer BIOREBA1 K5+ BIOREBA 2 + 2% nikotin * vzorca 99, 100 izvzeta zaradi večjega števila pufrov b) Priloga 4: Izpisek OD Ifrednosti iz čitalca DYNATEECII L_ £* O O f< č\ T O R I EE MR^iZiiZi PR I NTOLIT OPTION 1 iDE RE ID = /B-Jp!*... D ATE: -.A3*LJJJSjL OPERATOR: _lCtS^_tfilfe; DUAL MODE REF FILTER 5 TEST FILTER 2 THRESHOLD = 1.99 CALIBRATION - 1.00 PLATE 1 IZ 3 ^r S «±- "7" 3 S> i «25 1 3. 1 IZ" <=» ELANK 0.883 8.171 0.151 8.150 0.155 8.152 0.149 6.398 0.440 8.186 0.172 Et 8.158 0.150 8.975 0. »38 0.144 1.630 8.599 8.194 8.178 0.166 3.184 0.176 C 8.136 0.145 8.168 0.162 0.148 0.160 8.152 8.155 8.184 0.169 8.174 8.213 D 8.146 0.151 0.175 0.148 8.151 8.157 8.166 8.162 8.163 8.174 8.185 0.161 E 8.153 0.153 OVER OVER 0.195 0.176 8.211 0.210 8.174 0.174 8.177 8.281 F^ 8.735 0.685 8.167 0.169 8.167 0.261 OVER OVER 8.611 8.762 0.168. 8.231 13 8.161 0.153 8.288 0.180 8.461 0.1:38 0.188 9.177 8.282 0.182 0.174 0.170 t-I 8.175 8.172 0.194 0.1S6 0.198 0.223 8.269 0.275 8.293 0.179 8.174 0.174 * INDICATES UNREAD WELL # INDICATES COMBINED DATA DYNATECH LABORATOR I EH- c) Rezultat ELISA šifra 116 108 K 4 K 1+ 117 113 K 5+ K 2+ 127 89 128 129 112 118 115 110 126 P 101 122 120 125 P 109 121 93 90 111 vz orec 13.7.1989 - GFV - ploščica št. 3 rangiranje OD vrednosti max ------ E+ / E- OD Op. šifra vzorec ■» min OD Mlvz 220 Rf 24 R kontrola kontrola Rb 5.80VBG Pika kontrola kontrola Rb 5.70VBG Rb 1.27 Rb 2.84 Rb 3.11 Rf 1R-T Rb 5.68 Rb 7.29 Rf GRT Rb 6.26 pufer-čisti Rf IV/30-R Rb 3.4 Rb 5.84 Rb 1.24 pufer-čisti Rf R-T Rb 4.70 Rb 7.44 Rb 1.74 Rf R-T TRIS HC1 TRIS HC1 over over 1.630 0,975 0.686 0.670 0.599 0.488 PVP+nikotin 0.461 0.419 E+/E- 0.272 0.236 0.229 0.224 0.214 0.210 0.210 0.194 0.193 0.192 0.190 0.190 0.188 0.184 0.182 0.180 0.179 0.174 rob rob rob rob rob 130 Rb 5.82 174 106 Rf 17 R-ŠT 173 124 Rb 3.40 173 123 Rb 1.61 172 114 Rb 2.29 168 92 Rb 6.49 168 105 Rf 19 R-Š 168 98 Rb 7.25 166 95 L. rizl. Loče 165 K+ St. G. 162 104 Rf 18-R-S 161 86 Rb 3,84 161 103 Rf I. 45-R 160 119 Rb 4.70 157 91 Rb 6.25 154 96 Vtg 18 154 107 Rf 17-R-K 153 97 Rb 6.16 153 87 Rb 2.21 152 88 Rb 7.4 151 102 Rf II.56-R 148 K 3+ Kontrola 144 94 VTG-4 140 Op. PVP brez nikot. Priloga 5: Slike Slika 1: Znaki bolezni kužne izrojenosti na K+ trsu - Mlvz 2.7 slika 2: Tipi rebule levo - tip C - zelena osipka v sredini Č - rumena osipka desno A - rumena rebula Slika 3: Zakrnela plodnica tipa nore rebule VBG Slika 4: Evidenca ELISAtesta &VUENJEHS Rojena sem bila 6. junija 1949 na Viru pri Domžalah kot druga hči v družini Ljudmile in Jurija Korošca. Po končani gimnaziji v Ljubljani sem se 1. 1968 vpisala na Biotehniško fakulteto v Ljubljani - na agronomski oddelek, kjer sem v juniju 1974 diplomirala na smeri sadjarstvo - vinogradništvo. Že med študijem sem se vključila v strokovno delo na katedri za vinogradništvo, kjer sem se takoj po diplomi zaposlila kot pripravnik - raziskovalec. Vključena sem bila v delo zdravstvene selekcije vinske trte, ki jo je takrat kot eden od prvih v Jugoslaviji začel prof. dr. L. Hrček. Začela sem z eksperimentalnim delom biološke sekcije v fakultetnem poskusno-pedagoškem objektu Ampelo-grafski vrt v Novi Gorici. V letu 1976 sem dobila enoletno štipendijo RSS (sklad Borisa Kidriča) za podiplomsko izpopolnjevanje v ZDA. Kot nadaljevanje jugoslovanskega projekta o zdravstveni selekciji vinske trte sem dobila mesto na državni univerzi Daviš v Kaliforniji. Pod mentorstvom dr. A.C. Goheen-a sem pripravila nalogo s področja indeksiranja viroz in poslušala predavanja iz fito-patologije in vinogradništva. S priznanimi izpiti iz tega študija in z delno opravljeno magistrsko nalogo sem se po vrnitvi v 1. 1978 vpisala na interdisciplinarni program Biologija na Sveučilištu v Zagrebu. Tu sem pod mentorstvom prof. dr. Ane Šarič v juliju 1980 obranila magistrsko nalogo iz indeksiranja vinske trte na viroze. Se med bivanjem v ZDA sem dobila naziv asistenta za področje vinogradništva na Biotehniški fakulteti in po vrnitvi tudi opravljala vaje iz vseh predmetov tega področja. Poleg tega sem sodelovala pri 28 diplomskih nalogah pri izdelavi podiplomskega programa za področje vinogradništva. Od 1. 1980 sem vodila raziskovalni nalogi Selekcija vinske trte glede na viroze oz. Proučevanje introduciranih kultivarjev vinske trte. Preko Poslovne skupnosti za vinogradništvo in vinarstvo Slovenije, kjer sem sodelovala v raznih strokovnih organih, sem opravljala naloge s področja ampelografije, priznavanja introduciranih kultivarjev in klonov ter trsničarstva. V letu 1983 sem tudi prevzela vodstvo Ampelografskega vrta, kjer sem do zdaj usposobila rastlinjak, termotkomoro, v obnovi vinograda pa razširila kolekcijo klonskega materiala in obnovila muzejski nasad starih sort. Od 1. 1984 zasedam mesto višjega strokovnega sodelavca za področje vinogradništva in s ciklusi predavanj in vaj sodelujem v pedagoškem procesu.