230 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 3D BIOTISK KOT INOVATIVNA METODA ZA MODELIRANJE RAKA JAJČNIKOV 3D BIOPRINTING AS AN INNOVATIVE METHOD FOR MODELING OVARIAN CANCER AVTORJI / AUTHOS: Vesna Kokondoska Grgič, mag. bioteh.1, 2 doc. dr. Maša Sinreih, mag. farm.1 prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm.3 viš. znan. sod., asist. dr. Ivana Jovčevska, inž. kem.1, 4 1 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 2 Kemomed Research and Development, Brnčičeva ulica 31, 1231 Ljubljana 3 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, Aškerčeva cesta 7, 1000 Ljubljana 4 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Center za funkcijsko genomiko in biočipe, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Zaloška cesta 4, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: ivana.jovcevska@mf.uni-lj.si POVZETEK Rak jajčnikov je heterogena bolezen s kompleksnim tumorskim mikrookoljem. Zdravljenje poteka s ki- rurškim posegom, ki mu sledi kemoterapija. Velik izziv zdravljenja predstavlja pridobljena kemorezi- stenca. Da bi natančno proučili mehanizme napre- dovanja raka jajčnikov, so do sedaj najpogosteje uporabljali 2D celične kulture in živalske modele. Novejše raziskave kažejo, da so 3D kulture ustrez- nejši model za raziskovanje biologije raka jajčnikov in testiranje zdravilnih učinkovin. Sodobne tehnolo- gije, kot je 3D biotisk, omogočajo konstrukcijo kom- pleksnih struktur in ustvarjanje 3D celičnih modelov, ki so boljši približek naravni arhitekturi tumorja. 3D mono- ali kokulture so primernejše za odkrivanje novih proteinskih tarč in visokozmogljivo presejanje zdravilnih učinkovin. Razvoj kompleksnih 3D kultur bo prispeval k boljšemu razumevanju raka jajčnikov in identifikaciji učinkovitejših zdravilnih učinkovin. KLJUČNE BESEDE: 3D biotisk, 3D modeli celičnih kultur, invazija, mi- gracija, rak jajčnikov, sferoidi ABSTRACT Ovarian cancer is a heterogeneous disease with a complex tumour microenvironment. Current treat- ment consists of surgery followed by chemotherapy. Acquired chemoresistance is a major challenge in the treatment. To study the mechanisms of ovarian cancer progression in detail, mostly 2D cell cultures and animal models have been used so far. Recent studies show that 3D cultures are a more appropri- ate model for studying ovarian cancer biology and testing therapeutics. Modern technologies, such as 3D bioprinting, enable the construction of complex structures and the creation of 3D cellular models that better represent the natural architecture of the tumour. 3D mono- or co-cultures are better suited for the discovery of new protein targets and high- throughput screening of medicinal agents. The de- velopment of complex 3D cultures will contribute to a better understanding of ovarian cancer and the identification of more effective therapeutics. KEY WORDS: 3D bioprinting, 3D cell culture models, invasion, mi- gration, ovarian cancer, spheroids 231 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I 1UVOD Rak jajčnikov je najsmrtonosnejši ginekološki rak ter peti vodilni vzrok smrti zaradi raka pri ženskah po vsem svetu. Pojavlja se primarno pri ženskah po menopavzi in je zaradi nespecifičnih simptomov diagnosticiran v napredni fazi bo- lezni. Čeprav je zdravljenje raka jajčnikov v zadnjem de- setletju bistveno napredovalo, je petletna stopnja preživetja bolnic z rakom jajčnika še vedno pod 30 % (1–3). Glavni izziv zdravljenja raka jajčnikov predstavlja pridobljena ke- morezistenca (4). Da bi natančno proučili mehanizme napredovanja raka jajčnikov, so do sedaj najpogosteje uporabljali 2D celične kulture in živalske modele. Rak jajčnikov je zelo heterogena bolezen s kompleksnim tumorskim mikrookoljem, ki ga je težko oponašati z 2D modeli celičnih kultur in tudi z žival- skimi modeli. Kljub vsestranski uporabnosti je omejitev 2D celičnih kultur njihova poenostavljenost, ki ne odraža de- janskega stanja in vivo (5, 6). Mišji modeli raka jajčnikov so se nedvomno izkazali kot koristni za pridobitev informacij o biologiji raka in tudi za predklinično preskušanje zdravilnih učinkovin (7). Večina teh modelov temelji na ksenotran- splantaciji človeških celic raka jajčnikov v miši z imunsko pomanjkljivostjo. Slabosti teh modelov sta nepopolno pos- nemanje interakcij med celicami in gostiteljem ter nezmož- nost modeliranja zgodnje faze tumorskega razvoja (7). Pomanjkanje ustreznega modela in vitro, ki bi lahko repro- duciral naravno tumorsko okolje, prispeva k manjši uspeš- nosti predkliničnih raziskav novih zdravilnih učinkovin (8). Vpeljava 3D celičnih modelov in vitro za testiranje novih zdravilnih učinkovin za zdravljenje raka jajčnikov predstavlja nov pristop, ki bo spremenil potek predkliničnih raziskav ter posledično zdravljenje raka jajčnikov (9). 3D celične kul- ture gojimo v neadherentnih ali nizkoadherentnih pogojih, kot so plošče z ultranizko pritrditvijo (ultra-low attachment (ULA) plates). Pri teh pogojih površine plošč niso obdelane s proteini zunajceličnega matriksa (npr. kolagen, fibronektin, laminin), ki olajšajo pritrditev celic in tako omogočijo tvorbo uniformnih sferoidov z nizko variabilnostjo in visoko pono- vljivostjo izvedenih poskusov. Razvili so številne metodologije in tehnike za učinkovito ustvarjanje 3D celičnih modelov (8, 10–12). Najpogosteje uporabljani 3D modeli raka jajčnikov so večcelični tumorski Preglednica 1: Obstoječi sferični modeli raka jajčnikov (13). Table 1: Current spherical ovarian cancer models (13). 3D model Nastanek Prednosti Slabosti Uporaba pri raziskavah Večcelični tumorski sferoidi nastajajo v neadherentnih pogojih iz enoceličnih suspenzijskih kultur - kompaktni - reproducirajo dinamike tumorja in vivo (morfologija, celične interakcije, aktivacija poti ERK1/2 MAPK in PI3K ± AKT) - časovno potratni postopki za optimizacijo in karakterizacijo modela - pomanjkanje literaturnih virov - odpornost na ionizirajoče sevanje - občutljivost in odpornost na kemoterapijo - visokozmogljivo testiranje zdravil - migracija - invazija - hipoksija - metabolizem raka - angiogeneza Sferoidi rakavih matičnih celic, t. i. tumorsferoidi nastajajo v nizkoadherentn ih pogojih v gojišču za matične celice - hierarhijska organizacija - prisotnost redkih matičnih rakavih celic - sposobnost tvorbe tumorjev v modelih in vivo - ne posnemajo rakavega tkiva - ne replicirajo 3D strukture in mikrookolja tumorja in vivo - pomanjkanje označevalcev celične površine - odsotnost morfološkega fenotipa zaradi nestabilnosti fenotipa matičnih celic - odziv na kemoterapijo - personalizirano testiranje protirakavih učinkovin - sposobnost večlinijske diferenciacije - analiza rakavih matičnih celic 232 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 Sferoidi tumorjev, pridobljenih iz tkiv nastajajo iz rakavih celic po delni disociaciji rakavega tkiva - sposobnost rekapitulacije avaskularne tumorske mikroregije - posnamejo histološke karakteristike raka, profil genskega izražanja, mutacije, tumorigen in metastatski potencial - napovedovanje odziva bolnika na kemoterapijo - metastatski potencial Organotipski večcelični sferoidi nastajajo z gojenjem rakavega tkiva ex vivo brez disociacije - najbolj podobni tumorjem in vivo - morfološko podobni izvirnim tumorjem - povzamejo heterogenost raka - ohranjajo prisotnost makrofagov in žil s progastimi vlakni kolagena, povezanimi s fibroblasti - stabilni genetski profil - heterogeni modeli - učinek protirakavih učinkovin - migracija - invazija svetlocelične in mucinozne tumorje. Tumorji tipa I izvirajo iz predneoplastičnih lezij ali endometrioze, običajno napre- dujejo počasi in imajo boljšo prognozo. Tumorji tipa II so serozni karcinomi visokega gradusa (HGSOC), ki nastanejo de novo iz površinskega epitelija jajčnikov ali jajcevodov in predstavljajo več kot 70 % vseh primerov raka jajčnikov (16, 17). Zdravljenje raka jajčnikov je običajno operativno, sledi ke- moterapija, kot je prikazano na sliki 1. Najpogosteje upo- rabljana zdravila za kemoterapijo so derivati platine in tak- sani. Ta zdravila inducirajo apoptozo v tumorskih celicah (18). Trenutno ciljno zdravljenje uporabljamo samo za iz- boljšanje učinkovitosti standardnega zdravljenja. Ena izmed novih možnosti zdravljenja vključuje zaviralce encima poli- ADP-riboza polimeraze (zaviralci PARP), kot je zdravilo ola- parib. Proteini PARP so vključeni v regeneracijo celic po poškodbah, ki jih povzroči kemoterapija. Zaviralci PARP ustavijo regeneracijo celic in posledično rast tumorja (16). Druga možnost zdravljenja vključuje bevacuzimab, mono- klonsko protitelo, ki zavira vaskularni endotelijski rastni de- javnik A (VEGF-A) in blokira angiogenezo. Raziskave kažejo sferoidni modeli, sferoidi rakavih matičnih celic, t. i. tu- morsferoidi, sferoidi tumorjev, pridobljenih iz tkiv, in orga- notipski večcelični sferoidi (preglednica 1) (13). Metode 3D biotiska pri raku jajčnikov so zaenkrat še manj razvite. Čeprav še vedno ni popolnega 3D modela in vitro, ki bi nadomestil trenutne predklinične modele in vivo, razvoj no- vih metod in tehnologije premika področje k natančnejšemu pristopu proučevanja tumorjev in odzivu na zdravilne učin- kovine (14, 15). 2RAK JAJČNIKOV IN NJEgOVO ZDRAVLJENJE Rak jajčnikov predstavlja heterogeno skupino tumorjev (5). Glede na histologijo in stopnjo diferenciacije ga tradicio- nalno delimo na tumorje tipov I in II. Tip I so večinoma tu- morji nižjih gradusov z dobro diferenciacijo, ki predstavljajo 25  % primerov in vključujejo serozne, endometrioidne, 233 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I tudi, da so zaviralci tirozin kinaz RTK (npr. zdravilna učin- kovina ponatinib) učinkoviti pri zdravljenju različnih malignih rakov z zaviranjem proliferacije tumorskih celic (19). Zaviralci imunskih kontrolnih točk, kot sta pembrolizumab in nivolumab, ki sta najpogosteje uporabljana v onkologiji za zdravljenje HGSOC sta v zgodnjih kliničnih fazah. Gre za monoklonska protitelesa, ki sprožijo aktivacijo imunskih celic T za napad na rakave celice. Terapija z modificiranimi celicami T (CAR-T) je učinkovita pri zdravljenju hematoloških malignih bolezni, vendar je njen uspeh pri zdravljenju so- lidnih tumorjev omejen zaradi slabe učinkovitosti in visokih stroškov (20). Terapija s transgenimi T-limfocitnimi receptorji (TCR-T) predstavlja alternativni način zdravljenja za tovrstne tumorje (20). Medtem ko so pri terapiji CAR-T tarčni antigeni le proteini celične površine, TCR-T lahko prepozna tudi fragmente znotrajceličnih proteinov, če so prikazani na mo- lekulah poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (MHC). To je tako prednost kot slabost TCR-T, saj je odvi- sna od predstavitve molekul na MHC. Pri imunološko neod- zivnih tumorjih bo imela somatska izguba HLA-1 negativen vpliv na TCR-T. CAR-T je kljub temu vstopila v predklinična preskušanja (21). Za zdravljenje raka jajčnikov sta CAR-T in TCR-T trenutno v začetnih fazah kliničnega preskušanja (20, 22). Konvencionalno zdravljenje ni specifično, cilja na splošne podobnosti fiziologije rakavih celic in ne na posamezne dejavnike, ki se pojavijo pri pacientkah. To omejuje učin- kovitost zdravljenja in vodi do neželenih kliničnih izidov ter ponovitve raka, ki pa je odporen na zdravljenje. Zato so potrebni novi, selektivni načini zdravljenja. 3MODELNE CELIČNE LINIJE RAKA JAJČNIKOV Gojenje 2D tumorskih celičnih linij raka jajčnikov je prepro- sto, poceni in omogoča učinkovito testiranje različnih zdra- vilnih učinkovin. Vendar ti modeli ne reproducirajo tumor- Slika 1: Načini zdravljenja raka jajčnikov. Izdelano s pomočjo BioRender.com. Figure 1: Ovarian cancer treatment methods. Content created by using BioRender.com. 234 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 skega mikrookolja zaradi pomanjkanja medsebojne pove- zanosti in prisotnosti zunajceličnega ogrodja, vključno z molekulami, kot so kolagen, elastin, glikoproteini, glikoza- minoglikani, proteoglikani in rastni dejavniki, ki so ključni za vpliv terapije. Celični modeli ne zajemajo epigenetske, inter- in intratumorske kompleksnosti ter ne simulirajo infil- tracije celic, nekroze tumorja in mikrovaskularne proliferacije (23, 24). Poleg tega so številne signalne poti, ki so vključene v kemorezistenco, spremenjeno aktivirane v enoslojnih kul- turah, kar daje veliko lažno pozitivnih rezultatov pri rešetanjih z uporabo 2D celičnih modelov (25, 26). 3D celični modeli so postali ključni del celične biologije, saj verodostojno reproducirajo značilnosti in mikrookolje ra- kavih celic. Primerjava modelov 2D in 3D celičnih kultur je prikazana na sliki 2 ter podrobno opisna v preglednem članku Zottel in sod. (25). Uporaba 3D modelov omogoča natančnejšo reprodukcijo fizioloških pogojev, vključno s kompleksnimi interakcijami med celicami in zunajceličnim ogrodjem. Zato so 3D celični modeli pogosto občutljivejši na terapije z zdravilnimi učinkovinami. Raziskave kažejo, da so celice v notranjosti tumorja, ki so povezane z zunaj- celičnim ogrodjem, odpornejše na zdravljenje v primerjavi s tistimi, ki niso v stiku z zunajceličnim ogrodjem (27, 28). To poudarja pomembnost uporabe 3D modelov pri simu- laciji realnih pogojev in pridobivanju relevantnejših rezultatov pri raziskavah in testiranjih. Domcke in sod. so 47 celičnih linij raka jajčnikov razvrstili glede na njihovo genetsko podobnost s HGSOC (26). Nato so Barnes in sod. z uporabo transkriptomskih podatkov 45 pogosto uporabljanih celičnih linij raka jajčnikov razvrstili v pet skupin, ki predstavljajo pet glavnih podtipov raka jajčnikov (29). Haley in sod. so sistematično proučevali na- bor 2D celičnih linij HGSOC ter spremljali proliferacijo, klo- nogenost, fenotip, epitelno-mezenhimske transformacije in odpornost na cisplatin. Ugotovili so, da so najbolj agre- sivne celične linije OVCAR-5, OVCAR-8 in Kuramochi. Ce- lična linija COV362 je bila najbolj odporna na cisplatin, medtem ko je bila Caov-3 najbolj odzivna (30). Takšna si- stematična karakterizacija predstavlja dragocen vir infor- macij pri razvoju aplikacij, kot so modeliranje bolezni, ge- netske in epigenetske raziskave, temeljne raziskave, raziskave raka ter razvoj in testiranje zdravilnih učinkovin. Za 3D modele podobne karakterizacije še niso naredili. Trenutno je visoko zmogljivo rešetanje z uporabo modelov 3D celičnih kultur še vedno v razvoju, čeprav so sferoidi pokazali spodbudne rezultate, pripomogli pa so tudi k od- krivanju novih proteinskih tarč v tumorskem mikrookolju. Protokoli za pripravo 3D celičnih modelov so preprosti za Slika 2: Primerjava 2D in 3D modelov celičnih kultur. Izdelano s pomočjo BioRender.com. Figure 2: Comparison between 2D and 3D cell culture models. Content created by using BioRender.com. 235 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I uporabo in prenosljivi na različne formate mikrotitrskih plošč, kot so plošče s 96 ali 384 vdolbinami (8, 31). 4METODE 3D BIOTISKA Med 3D celične modele uvrščamo večcelične tumorske sferoidne modele, sferoide rakavih matičnih celic, t. i. tumorsferoide, sferoide tumorjev, pridobljenih iz tkiv, in or- ganotipske večcelične sferoide. 3D celične modele lahko pripravimo z ogrodjem in brez ogrodja (25). Glavni namen ogrodja je posnemanje naravnega zunajceličnega ogrodja. Le-ta celicam zagotavlja mehansko podporo, omogoča medcelično komunikacijo ter aktivira ključne celične pro- cese (npr. adhezija, migracija, proliferacija in diferenciacija). 3D biotisk je ena izmed metod, s katero pripravljamo sfe- roide z ogrodjem. 3D biotisk je napredna tehnika, ki omogoča konstrukcijo kompleksnih struktur za ponazoritev naravne arhitekture tkiv in vitro. Od leta 2014 to metodo uporabljamo za ustvar- janje 3D modelov v laboratorijih po vsem svetu (32). Bioti- skanje omogoča nadzor nad mehanskimi in biološkimi last- nostmi 3D struktur z visoko ločljivostjo v ravninah X, Y in Z. S pomočjo specializiranih biomaterialov lahko odziv ali aktivnost celic natančno prilagodimo, tako da posnemajo okolje in vivo. Biočrnilo za 3D biotisk je specializirana snov, ki jo uporabljamo za ustvarjanje 3D struktur z natančnim plastenjem biomaterialov, zmešanih z živimi celicami. Raz- voj pri formulaciji biomaterialov, pristopih za križno pove- zovanje ter računalniško podprtem oblikovanju je razširil uporabo 3D biotiska na področjih tkivnega inženiringa, re- generativne medicine in presejalnih testov za zdravila (25). Poznavanje različnih metod 3D biotiska, kot so stereolito- grafija, inkjet biotiskanje, lasersko biotiskanje in ekstruzijski biotisk, ter razumevanje prednosti in slabosti teh metod bosta pomagala izbrati ustrezno metodo biotiska za apli- kativno uporabo v znanosti (preglednica 2 in slika 3). Slika 3: Grafični prikaz najpogosteje uporabljanih tehnik 3D biotiska. Izdelano s pomočjo BioRender.com. Figure 3: Graphic representation of the most commonly used 3D bioprinting techniques. Content created by using BioRender.com. 236 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 P re gl ed ni ca 2 : P re dn os ti in s la bo st i r az lič ni h te hn ik 3 D b io tis ka nj a. Ta b le 2 : A dv an ta ge s an d di sa dv an ta ge s of d iff er en t 3 D b io pr in tin g te ch ni qu es . M et o d e 3D b io ti sk a V is ko zn o st b io čr ni la (m P a· s) R es o lu ci ja b io ti sk a (μ m ) C el ič na g o st o ta (c el ic /m L) Ž iv o st ce lic (% ) P re d no st i S la b o st i R ef er en ca S te re ol ito gr af ija < 5 00 0 25 10 6 – 10 7 > 8 5 - br ez s tr iž ni h si l n a ce lic ah - vi so ka n at an čn os t t is ka - iz de la va k om pl ek sn ih st ru kt ur - in te gr ac ija v eč m at er ia lo v - iz de la va m ik ro flu id ni h či po v - m ož no st c ito to ks ič ne ga vp liv a - iz kl ju čn o fo to po lim er iz ira jo či m at er ia li - vi so ki s tr oš ki (3 3, 3 4) In kj et b io tis k 3, 5– 12 30 –5 0 < 1 06 70 –9 5 - vi so ka c el ič na p re ži ve lo st - hi tr o bi ot is ka nj e - vi so ko zm og ljiv a m et od a - ni zk i c el ič na g os to ta in vi sk oz no st b io čr ni la - ne d os ež e un ifo rm ne ve lik os ti ka pl jic - za ht ev no ti sk an je v eč ra zl ič ni h ce lič ni h po dt ip ov hk ra ti (3 5) La se rs ki b io tis k 1– 80 00 10 –1 00 10 7 – 10 8 > 9 5 - br ez s tr iž ni h si l n a ce lic ah - vi so ka n at an čn os t t is ka - iz de la va k om pl ek sn ih st ru kt ur - in te gr ac ija v eč m at er ia lo v - m ož no st c ito to ks ič ne ga vp liv a - za pl et en p ro to ko l z a pr ip ra vo b io tis ka ln ik a - vi so ki s tr oš ki (3 6) E ks tr uz ijs ki bi ot is k 6– 30 × 1 07 20 0– 10 00 10 8 50 –8 5 - vi so ki c el ič na g os to ta in vi sk oz no st b io čr ni la - ve čc el ič ni m od el i - ko ak si al no b io tis ka nj e (m eš an je d ve h m at er ia lo v hk ra ti) - iz de la va k om pl ek sn ih st ru kt ur - in te gr ac ija v eč m at er ia lo v - ce no vn o ug od no - do st op ni p ro to ko li, r az vo j - m ož no st p oš ko db e ce lic za ra di v is ok eg a pr iti sk a - ni zk a re so lu ci ja in h itr os t tis ka nj a m at er ia lo v (3 7, 3 8) 237 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I Stereolitografija temelji na polimerizaciji na svetlobo ob- čutljivega biočrnila, pri čemer kot vir osvetlitve uporabljamo ultravijolično (UV) svetlobo. UV svetloba omogoča izjemno hitro procesiranje, ki se lahko izvaja na dva različna načina. Pri tehniki, ki temelji na laserju, se strjevanje vsake plasti doseže točkovno, s pomočjo sistema za optično skeniranje (slika 3). Po drugi strani pristop digitalne svetlobne projek- cije uporablja digitalno napravo z mikro ogledali za križanje celotnega prereza 3D strukture (39). Inkjet biotiskanje vključuje nadzorovano sproščanje biočr- nila na substrat s pomočjo termičnih ali zvočnih pritiskov. Termično brizgalno biotiskanje vključuje manipulacijo bio- črnila s toploto (slika 3), kar povzroči njegovo izparevanje in iztis iz šobe (40). Lasersko biotiskanje je tehnika, ki uporablja utripajoči la- serski žarek na tristranski trak, sestavljen iz lasersko pre- pustnega stekla, lasersko absorbirajočega kovinskega sloja (na primer titana ali zlata) in biočrnila (slika 3). Ta pristop ne zahteva šobe in ne vključuje neposrednega stika. Energija laserskega žarka se absorbira v tristranskem traku, kar hitro povzroči tvorbo lokaliziranega mehurčka na nasprotni strani. Mehurček nato iztisne določeno količino biočrnila na sprejemno podlago (28). Ekstruzijski biotisk uporablja pritisk za iztis biočrnila v nad- zorovani razporeditvi (slika 3), da se ustvari želena 3D bio- tiskana struktura (41). Tehnika je združljiva z različnimi bio- materiali (42). Pogoji pri ekstruzijskem biotisku so dovolj mili, da omogočajo preživetje celic ter posledično uporabo široke palete celic in tkivnih konstruktov z edinstvenimi lastnostmi pri fiziološko relevantnih gostotah celic (43). Za- radi vsestranskosti, preprostosti in stroškovne učinkovitosti je ta metoda trenutno najpogosteje uporabljana metoda 3D biotiska, ki jo uporabljamo predvsem na področjih tkiv- nega inženirstva in regenerativne medicine (44). Ekstruzijski biotisk so uspešno uporabili za ustvarjanje in vitro kože, hrustanca, rekonstrukcije kolena, mišičnega tkiva, maš - čobnega tkiva, krvnih žil in organoidov (43, 45–47). 5UPORABA 3D BIOTISKA ZA MODELIRANJE RAKA JAJČNIKOV Najpogosteje uporabljana tehnika za 3D biotiskanje modela raka jajčnikov je ekstruzijski biotisk. Tehnik, ki temeljijo na principu stereolitografije, inkjet in laserskega biotiska, v li- teraturi do sedaj še niso opisali za modeliranje raka jajčni- kov. Najpogosteje uporabljani biomateriali so naravni poli- meri na osnovi celuloze in kolagena, alginati in tudi polsin- tezni polimer želatine in metakrilata (gelatin-methacryloyl, GelMA). S pomočjo ekstruzijskega biotiskalnika so znanstveniki na- tisnili kokulturni model in uporabili celične linije raka jajčnikov OVCAR-5 in fibroblastov MRC-5, ki so bili natisnjeni na osnovi kapljičnega biotiskanja v kombinaciji z biopolimerom. Tvorili so ponovljive večcelične konstrukte z nadzorovano velikostjo konstrukta. Ta pristop lahko služi kot inovativni kokulturni model, ki vključuje tumorske in stromalne celice ter obeta zmogljivo in robustno rešetanje zdravilnih učin- kovin (41, 48, 49) . Biotiskanje ni le koristno pri ustvarjanju biološko in fiziološko relevantnih modelov, temveč tudi omogoča konstrukcijo modelov, povezanih z normalnimi tkivi za analizo učinkovitosti in neželenih učinkov hkrati (6). Druga raziskava opisuje 3D biotiskani model raka jajčnikov, pripravljen iz želatine in alginata z vključenimi rakavimi ce- licami SKOV-3 in z rakom povezanimi fibroblasti (cancer- associated fibroblasts, CAF). Opazili so, da se celice v ta- kem 3D modelu samodejno združujejo v agregate in da celice CAF obkrožajo rakave celice. Rezultati so pokazali, da celice na obrobju strukture bolj proliferirajo oz. se delijo v primerjavi s celicami v sredini, ker so bolj izpostavljene hranilom in kisiku, kar kaže na vzpostavitev gradienta plinov in hranil skozi biotiskane strukture, ki je ena glavnih značil- nosti naravnih tumorjev (50). Z uporabo ekstruzijskega biotiskalnika ter biomaterialov GelMA in alginata so znanstveniki leta 2021 izdelali 3D ti- skan model jajčnika in vitro. Uporabili so komercialno do- stopne celične linije COV434, KGN in ID8 ter primarne so- matske celice jajčnika za izvedbo tiskanja 3D struktur z vključenimi celicami. Rezultati so pokazali, da je GelMA primeren za izdelavo 3D tiskanih struktur, saj so zadostovali kriterijem meritve higroskopnosti, kinetike razgradnje in ohranjanja oblike biomateriala. Preživetje somatskih celic jajčnikov je bilo nižje kot pri komercialnih celičnih linijah. Kljub temu je sistem 3D tiskanja na osnovi GelMA zagota- vljal ustrezno mikrookolje za folikle jajčnika, ki so uspešno rasli, počili ter sprostili zrelo jajčece v opornih strukturah (51). 6PROUČEVANJE MIgRACIJE IN INVAZIJE S POMOČJO 3D BIOTISKANJA Razumevanje, kako rakave celice migrirajo ter kako me- hanska in kemijska sestava zunajceličnega ogrodja vplivata 238 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 na migracijo, je ključno za raziskovanje metastatskega pro- cesa, ki je odgovoren za večino smrti, povezanih z rakom. Migracijo in invazijo povezujemo z napredovanjem raka in razvili so številne metode z namenom razumevanja teh procesov, vključno z migracijskimi testi z uporabo tran- smembranskih komor, testi celjenja ran, testi območja iz- ključitve celic in sledenjem celic v času pri 2D celičnih kul- turah (52). Pri nastanku metastaz raka jajčnikov se posamezne celice ali skupki celic, ki izvirajo iz tumorja, razširijo s peritonealno tekočino po trebušni votlini in tvorijo večcelične tumorske sferoide ali agregirane tumorje. Ta pojav je težko reprodu- cirati in vitro z uporabo tradicionalnih 2D enoslojnih celičnih kultur, ker ne izražajo celičnih površinskih proteinov, po- trebnih za tvorbo metastaz v takšni meri kot 3D celične kulture (53, 54). Uporaba 3D biotiska kot metoda za izdelavo ogrodij v testih celične migracije ali invazije ponuja alternativo obi- čajnim tehnikam. S pomočjo 3D biotiska lahko ustvarjamo večnamenske strukture z natančnimi oblikami, kot so ka- pljice, kapljica na kapljicah ali kompleksnejše oblike. Bio- materiali, uporabljeni v teh testih, morajo biti kompatibilni s celičnimi linijami ter zagotavljati ustrezno prepustnost za prehajanje hranil in kisika. Po drugi strani mora imeti bio- material dobro opredeljene mehanske lastnosti, kot so ela- stičnost, togost in poroznost (55). Togost izbranih polime- rov, ki simulirajo zunajcelično ogrodje, ima ključno vlogo pri modeliranju invazije in migracije pri 3D modelih (56, 57). Kolagen iz zunajceličnega ogrodja, ki obdaja tumorje, je ključen za preoblikovanje tumorskega mikrookolja. V 3D modeliranju najpogosteje uporabljamo kolagen tipa I (58). V zdravem parenhimskem tkivu je območje tlaka od 440 Pa do 770 Pa (59, 60). V primeru tumorskega tkiva se tlak poviša do največ 35.000 Pa. Višja stopnja togosti v pri- merjavi z zdravim tkivom nastane zaradi preureditve kola- gena znotraj tumorskega mikrookolja (61). Raziskovalci so ugotovili, da vključitev telopeptidnih regij na konicah molekul kolagena v strukturo biomateriala vodi do povečane togosti, kar zagotavlja večjo stabilnost znotraj kulture. Primer telo- peptidnega biopolimera je TeloCol-10, sestavljen iz 95 % kolagena tipa I in 5 % kolagena tipa III. Uporaba telopep- tidnih biomaterialov ima pomembno vlogo pri optimizaciji protokolov za proučevanje invazije, saj celice iz predhodno natisnjenega sferoida lahko preidejo v naslednji sloj bio- materiala. S pomočjo gojitvenega medija in atraktantov lahko bolj ciljno izzovemo proces invazije in merimo časo- vno obdobje prehajanja celice iz točke 0 v točko 1, saj se celice premikajo v smeri atraktantov in hranil. Te aplikacije zahtevajo daljše inkubacijske čase za opazovanje celičnega obnašanja. Uporabne so tudi za spremljanje učinka doda- nih zdravilnih učinkovin (62). 7SKLEP Področje 3D biotiska je v zadnjih petih letih doseglo znaten tehnološki napredek in postalo najobetavnejši pristop za razvoj 3D konstruktov tumorskega tkiva, ki jih je mogoče uporabiti kot modele za proučevanje biologije raka in reše- tanje novih zdravilnih učinkovin. V primerjavi z 2D modeli 3D modeli raka natančneje reproducirajo značilnosti dejan- skih tumorjev, vključno z interakcijami med celicami ter med celicami in zunajceličnim ogrodjem. Biotiskanje ima poten- cial za izboljšanje modeliranja tumorskega mikrookolja in vitro na področju 3D modelov. Izbor tehnike biotiskanja te- melji na različnih kriterijih, vključno z vrsto uporabljenih bio- materialov, želenimi dimenzijami, obliko in kompleksnostjo izdelanih modelov in vitro. Biotisk omogoča natančno raz- poreditev različnih celic z biomaterialom, kar vodi v ustvar- janje zapletenih 3D struktur, ki posnemajo mikroarhitekturo tumorja, in je lahko uporaben pri proučevanju molekularnih in bioloških vzrokov raka. Vključitev tehnologije 3D biotiska za pripravo ponovljivega 3D modela raka jajčnikov bo omo- gočila hitro in učinkovito testiranje več zdravilnih učinkovin. Obstoječe metode biotiskanja je mogoče še izboljšati, ustvariti nove biomateriale in doseči pravo ravnovesje med biološkimi in mehanskimi dejavniki za ustvarjanje zaplete- nejših in bolj realističnih modelov raka in vitro. Dodatno bi lahko tehnike 3D biotiskanja napredovale v četrto dimenzijo z uporabo pametnih materialov in nanodelcev, ki se lahko odzovejo na zunanje dražljaje. To bi omogočilo simulacijo različnih stopenj raka s programiranjem širjenja in/ali raz- gradnje hidrogelnega matriksa. 8IZJAVA Pregledni članek je rezultat sodelovanja avtoric Vesne Ko- kondoske Grgič, Maše Sinreih in Ivane Jovčevske v sklopu aplikativnega projekta L4-4565 in programa P1-0390, fi- nanciranih s strani ARIS. Pregledni članek je tudi rezultat sodelovanja prof. Boruta Štruklja in Vesne Kokondoske Grgič med doktorskim usposabljanjem. 239 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I 9LITERATURA 1. Bast RC, Jr., Hennessy B, Mills GB. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nat Rev Cancer. 2009;9(6):415-28. 2. Torre LA, Trabert B, DeSantis CE, Miller KD, Samimi G, Runowicz CD, et al. Ovarian cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018;68(4):284-96. 3. IAfRo C. Globocan 2020 2020 [Available from: https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/25-Ovary- fact-sheet.pdf. 4. Aletti GD, Gallenberg MM, Cliby WA, Jatoi A, Hartmann LC. Current management strategies for ovarian cancer. Mayo Clin Proc. 2007;82(6):751-70. 5. Vaughan S, Coward JI, Bast RC, Jr., Berchuck A, Berek JS, Brenton JD, et al. Rethinking ovarian cancer: recommendations for improving outcomes. Nat Rev Cancer. 2011;11(10):719-25. 6. Liu T, Delavaux C, Zhang YS. 3D bioprinting for oncology applications. J 3D Print Med. 2019;3(2):55-8. 7. Wu R, Hendrix-Lucas N, Kuick R, Zhai Y, Schwartz DR, Akyol A, et al. Mouse model of human ovarian endometrioid adenocarcinoma based on somatic defects in the Wnt/beta- catenin and PI3K/Pten signaling pathways. Cancer cell. 2007;11(4):321-33. 8. Tofani LB, Abriata JP, Luiz MT, Marchetti JM, Swiech K. Establishment and characterization of an in vitro 3D ovarian cancer model for drug screening assays. Biotechnol Prog. 2020;36(6):e3034. 9. Belfiore L, Aghaei B, Law AMK, Dobrowolski JC, Raftery LJ, Tjandra AD, et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. Eur J Pharm Sci. 2021;163:105876. 10. Ciucci A, Buttarelli M, Fagotti A, Scambia G, Gallo D. Preclinical models of epithelial ovarian cancer: practical considerations and challenges for a meaningful application. CMLS. 2022;79(7):364. 11. Lee JM, Mhawech-Fauceglia P, Lee N, Parsanian LC, Lin YG, Gayther SA, et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 2013;93(5):528-42. 12. Loessner D, Holzapfel BM, Clements JA. Engineered microenvironments provide new insights into ovarian and prostate cancer progression and drug responses. Adv Drug Deliv Rev. 2014;79-80:193-213. 13. Weiswald LB, Bellet D, Dangles-Marie V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 2015;17(1):1-15. 14. White EA, Kenny HA, Lengyel E. Three-dimensional modeling of ovarian cancer. Adv Drug Deliv Rev. 2014;79-80:184-92. 15. Yee C, Dickson KA, Muntasir MN, Ma Y, Marsh DJ. Three- Dimensional Modelling of Ovarian Cancer: From Cell Lines to Organoids for Discovery and Personalized Medicine. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:836984. 16. Stewart C, Ralyea C, Lockwood S. Ovarian Cancer: An Integrated Review. Semin Oncol Nurs. 2019;35(2):151-6. 17. Palmirotta R, Silvestris E, D’Oronzo S, Cardascia A, Silvestris F. Ovarian cancer: Novel molecular aspects for clinical assessment. Crit Rev Oncol Hematol. 2017;117:12-29. 18. Chen X, Wu Y, Dong H, Zhang CY, Zhang Y. Platinum-based agents for individualized cancer treatment. Curr Mol Med. 2013;13(10):1603-12. 19. Banerjee S, Gonzalez-Martin A, Harter P, Lorusso D, Moore KN, Oaknin A, et al. First-line PARP inhibitors in ovarian cancer: summary of an ESMO Open - Cancer Horizons round-table discussion. ESMO open. 2020;5(6):e001110. 20. Wu JWY, Dand S, Doig L, Papenfuss AT, Scott CL, Ho G, et al. T-Cell Receptor Therapy in the Treatment of Ovarian Cancer: A Mini Review. Front Immunol. 2021;12:672502. 21. Daigre J, Martinez-Osuna M, Bethke M, Steiner L, Dittmer V, Krischer K, et al. Preclinical Evaluation of Novel Folate Receptor 1-Directed CAR T Cells for Ovarian Cancer. Cancers (Basel). 2024;16(2). 22. Deng M, Tang F, Chang X, Liu P, Ji X, Hao M, et al. Immunotherapy for Ovarian Cancer: Disappointing or Promising? Mol Pharmaceutics. 2024;21(2):454-66. 23. Pernik MN, Bird CE, Traylor JI, Shi DD, Richardson TE, McBrayer SK, et al. Patient-Derived Cancer Organoids for Precision Oncology Treatment. J Pers Med. 2021;11(5). 24. Zhang C, Jin M, Zhao J, Chen J, Jin W. Organoid models of glioblastoma: advances, applications and challenges. Am J Cancer Res. 2020;10(8):2242-57. 25. Zottel A, Kokondoska Grgič V, Sinreih M. 3D celični modeli in njihova uporaba pri testiranju protirakavih zdravilnih učinkovin. Farm Vestn. 2023;74(5):362-70. 26. Domcke S, Sinha R, Levine DA, Sander C, Schultz N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 2013;4:2126. 27. Ipek S, Ustundag A, Can Eke B. Three-dimensional (3D) cell culture studies: a review of the field of toxicology. Drug Chem Toxicol. 2023;46(3):523-33. 28. Law AMK, Rodriguez de la Fuente L, Grundy TJ, Fang G, Valdes-Mora F, Gallego-Ortega D. Advancements in 3D Cell Culture Systems for Personalizing Anti-Cancer Therapies. Front Oncol. 2021;11:782766. 29. Barnes BM, Nelson L, Tighe A, Burghel GJ, Lin IH, Desai S, et al. Distinct transcriptional programs stratify ovarian cancer cell lines into the five major histological subtypes. Genome Med. 2021;13(1):140. 30. Haley J, Tomar S, Pulliam N, Xiong S, Perkins SM, Karpf AR, et al. Functional characterization of a panel of high-grade serous ovarian cancer cell lines as representative experimental models of the disease. Oncotarget. 2016;7(22):32810-20. 31. Kurman RJ, Shih Ie M. The Dualistic Model of Ovarian Carcinogenesis: Revisited, Revised, and Expanded. AJP. 2016;186(4):733-47. 32. Hoch E, Tovar GE, Borchers K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. Eur J Cardiothorac Surg. 2014;46(5):767-78. 33. Miri AK, Nieto D, Iglesias L, Goodarzi Hosseinabadi H, Maharjan S, Ruiz-Esparza GU, et al. Microfluidics-Enabled Multimaterial Maskless Stereolithographic Bioprinting. Adv Mater. 2018;30(27):e1800242. 34. Grigoryan B, Sazer DW, Avila A, Albritton JL, Padhye A, Ta AH, et al. Development, characterization, and applications of multi- material stereolithography bioprinting. Sci Rep. 2021;11(1):3171. 35. Zhang J, Chen F, He Z, Ma Y, Uchiyama K, Lin JM. A novel approach for precisely controlled multiple cell patterning in microfluidic chips by inkjet printing and the detection of drug metabolism and diffusion. The Analyst. 2016;141(10):2940-7. 36. Dou C, Perez V, Qu J, Tsin A, Xu B, Li J. A State‐of‐the‐Art Review of Laser‐Assisted Bioprinting and its Future Research Trends. ChemBioEng Reviews. 2021;8. 37. Malekpour A, Chen X. Printability and Cell Viability in Extrusion- Based Bioprinting from Experimental, Computational, and Machine Learning Views. J Funct Biomater. 2022;13(2). 240 3D B IO TI S K K O T IN O VA TI V N A M E TO D A Z A M O D E LI R A N JE R A K A J A JČ N IK O V Farm Vestn 2024; 75 38. Ramesh S, Harrysson OLA, Rao PK, Tamayol A, Cormier DR, Zhang Y, et al. Extrusion bioprinting: Recent progress, challenges, and future opportunities. Bioprinting. 2021;21:e00116. 39. Skoog SA, Goering PL, Narayan RJ. Stereolithography in tissue engineering. J Mater Sci: Mater Med. 2014;25(3):845-56. 40. Cui X, Boland T, D’Lima DD, Lotz MK. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 2012;6(2):149-55. 41. Cui H, Nowicki M, Fisher JP, Zhang LG. 3D Bioprinting for Organ Regeneration. Adv Healthc Mater. 2017;6(1). 42. Ma X, Liu J, Zhu W, Tang M, Lawrence N, Yu C, et al. 3D bioprinting of functional tissue models for personalized drug screening and in vitro disease modeling. Adv Drug Deliv Rev. 2018;132:235-51. 43. Placone JK, Engler AJ. Recent Advances in Extrusion-Based 3D Printing for Biomedical Applications. Adv Healthc Mater. 2018;7(8):e1701161. 44. Idaszek J, Costantini M, Karlsen TA, Jaroszewicz J, Colosi C, Testa S, et al. 3D bioprinting of hydrogel constructs with cell and material gradients for the regeneration of full-thickness chondral defect using a microfluidic printing head. Biofabrication. 2019;11(4):044101. 45. Tarassoli SP, Jessop ZM, Al-Sabah A, Gao N, Whitaker S, Doak S, et al. Skin tissue engineering using 3D bioprinting: An evolving research field. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2018;71(5):615-23. 46. Datta P, Ayan B, Ozbolat IT. Bioprinting for vascular and vascularized tissue biofabrication. Acta Biomater. 2017;51:1-20. 47. You F, Eames BF, Chen X. Application of Extrusion-Based Hydrogel Bioprinting for Cartilage Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 2017;18(7). 48. Trivedi P, Liu R, Bi H, Xu C, Rosenholm JM, Akerfelt M. 3D Modeling of Epithelial Tumors-The Synergy between Materials Engineering, 3D Bioprinting, High-Content Imaging, and Nanotechnology. Int J Mol Sci. 2021;22(12). 49. Xu F, Celli J, Rizvi I, Moon S, Hasan T, Demirci U. A three- dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 2011;6(2):204-12. 50. Baka Z, Godier C, Lamy L, Mallick A, Gribova V, Figarol A, et al. A Coculture Based, 3D Bioprinted Ovarian Tumor Model Combining Cancer Cells and Cancer Associated Fibroblasts. Macromol Biosci. 2023;23(3):e2200434. 51. Wu T, Gao YY, Su J, Tang XN, Chen Q, Ma LW, et al. Three- dimensional bioprinting of artificial ovaries by an extrusion-based method using gelatin-methacryloyl bioink. Climacteric. 2022;25(2):170-8. 52. Kramer N, Walzl A, Unger C, Rosner M, Krupitza G, Hengstschlager M, et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 2013;752(1):10-24. 53. Chaicharoenaudomrung N, Kunhorm P, Noisa P. Three- dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 2019;11(12):1065-83. 54. Duval K, Grover H, Han LH, Mou Y, Pegoraro AF, Fredberg J, et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology (Bethesda). 2017;32(4):266-77. 55. Ramiah P dTL, Choonara YE, Kondiah PPD, Pillay V. Hydrogel- Based Bioinks for 3D Bioprinting in Tissue Regeneration. Front Mater. 2020;7:76. 56. Acerbi I, Cassereau L, Dean I, Shi Q, Au A, Park C, et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integr Biol (Camb). 2015;7(10):1120-34. 57. Levental KR, Yu H, Kass L, Lakins JN, Egeblad M, Erler JT, et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 2009;139(5):891-906. 58. Pickup MW, Mouw JK, Weaver VM. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO reports. 2014;15(12):1243-53. 59. Bourgot I, Primac I, Louis T, Noel A, Maquoi E. Reciprocal Interplay Between Fibrillar Collagens and Collagen-Binding Integrins: Implications in Cancer Progression and Metastasis. Front Oncol. 2020;10:1488. 60. de Hilster RHJ, Sharma PK, Jonker MR, White ES, Gercama EA, Roobeek M, et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020;318(4):L698-L704. 61. Sohutskay DO, Puls TJ, Voytik-Harbin SL. Collagen Self- assembly: Biophysics and Biosignaling for Advanced Tissue Generation. In: Zhang Y, editor. Multi-scale Extracellular Matrix Mechanics and Mechanobiology. Cham: Springer International Publishing; 2020. p. 203-45. 62. Takata M, Maniwa Y, Doi T, Tanaka Y, Okada K, Nishio W, et al. Double-layered collagen gel hemisphere for cell invasion assay: successful visualization and quantification of cell invasion activity. Cell Commun Adhes. 2007;14(4):157-67.