Pregledni prispevek/Review article
OD KONVENCIONALNIH K ZMERNEJŠIM OBLIKAM SPODBUJANJA JAJČNIKOV V POSTOPKU ZUNAJTELESNE
OPLODITVE
from the conventional to the milder approaches to ovarian stimulation for in vitro fertilization
Eda Vrtačnik-Bokal Univerzitetni klinični center Ljubljana, Šlajmerjeva 3, 1000 Ljubljana
Izvleček
Izhodišča
Metode
Zunajtelesno oploditev (ZTO) opravljamo z jajčnimi celicami, kijih pridobimo v naravnih in spodbujenih ciklusih. Po svetu se uporabljajo različni pristopi pri spodbujanju jajčnikov. Po uvedbi antagonistov gonadoliberinov in strategij za zmanjševanje mnogoplodnih nosečnosti z uvajanjem selektivnega prenosa enega zarodka, se je spet povrnilo zanimanje za oživitev naravnega postopka in zmernega spodbujanja v postopkih ZTO. Namen zmernega spodbujanja jajčnikov je doseči učinkovitost vložka in uvesti bolnicam prijazno obravnavanje, s katerim bi dosegli uravnoteženost med izhodom in tveganji zdravljenja.
Podatke o naravnih, modificiranih naravnih, zmernih in konvencionalnih postopkih ZTO smo iskali v Pubmedu do leta 2009.
Rezultati
Zaključki
Podatki, ki smo jih obravnavali v tem preglednem članku, ne omogočajo, da bi lahko priporočili, kateri protokol zmernega spodbujanja je najbolj primeren. Vsekakor pa je jasno, da je prav uvedba antagonistov gonadoliberinov v klinično praksa omogočila tudi zmernejše oblike spodbujanja pri ZTO zaradi sposobnosti preprečevanja prezgodnjega vrha luteinizirajočega hormona (LH) s kompetitivno blokado receptorjevgonadoliberinov. Študije prav tako kažejo, da zmerno vnašanje gonadotropinov v sredini folikularne faze, ko se serumska koncentracija folikel stimulirajočega hormona (FSH) zniža, zadostuje za preprečitev selekcije enega samega dominantnega folikla, hkrati pa pospeši rast ostalih zrelih foliklov, ki so senzibilizirani na FSH s posledično odzivnostjo na LH.
Uvajanje zmernega spodbujanja in modificiranega naravnega ciklusa v standardno klinično prakso izgleda upravičeno, potrebne pa so dodatne prospektivne raziskave, da bi našli najprimernejši način zmernega spodbujanja.
Ključne besede zunajtelesna oploditev; modificirani naravni postopek; zmerno spodbujanje jajčnikov; konvencionalno spodbujanje jajčnikov
Abstract
Background
Methods
In-vitro fertilization (IVF) is performed with oocytes collected in natural and stimulated cycles. Different approaches to ovarian stimulation have been employed worldwide. Following the introduction of gonadotrophin realising hormone (GnRH) antagonists and strategies to reduce multiple birth such as single embryo transfer, there is an interest in the revival of natural and mild approaches to ovarian stimulation in IVF. Particulary mild ovarian stimulation aims to achieve cost-effective, patient-friendly regimens which optimize the balance between outcomes and risks of treatment.
Pubmed was searched up to 2009for papers on natural, modified natural, mild and conventional IVF cycles.
Results
Data discussed in this review do not allow any conclusions to be drawn regarding the most optimal mild ovarian stimulation protocol. However, it is absolutelly clear that introduc-
tion of GnRH antagonists into clinical practice has allowed for the introduction of milder stimulation approaches for IVF treatment because of preventingpremature luteinising hormone (LH) rise by competitive blockade of the GnRH receptors. Studies also show that mild exogenous gonadotrophins interference with the decrease in follicle-stimulating hormone ((FSH) levels in the mid-folicular phase was sufficient to override the selection of a single dominant follicle and enhance the most mature follicles to growth due to their increased sensitivity for FSH and acquired responsiveness to LH.
Conclusions	The implementation of mild stimulation and modified natural cycle into standard clinical
practise appears to be justified, although more prospective studies are needed to find the most appropriate mild stimulation approaches.
Key words	in vitro fertilization; modified natural cycle; mild in-vitrofertilization; conventional in-vitro
fertilization
Uvod
Spodbujanje jajčnikov z gonadotropini je pomemben del postopka zunajtelesne oploditve (ZTO). Čeprav je bil prvi uspešni postopek rojstvo Luise Brown leta 1978 posledica aspiriranja folikla v nespodbu-jenem menstruacijskem ciklusu,1 je bila v zadnjih 25 letih pozornost usmerjena v različne protokole z namenom, da bi pridobili več jajčnih celic in zarodkov in s tem zvišali stopnjo nosečnosti. Ta način spodbujanja jajčnikov je dobil dodaten pomen z uvedbo zamrzovanja nadštevilnih zarodkov in vračanja v naslednjih menstruacijskih ciklusih. Trenutno najbolj pogosto izvajamo dolg protokol spodbujanja jajčnikov s kombinacijo agonistov gonadoliberinov in sorazmerno visokih odmerkov gonadotropinov, od 150 do 450 IU dnevno.2 Ti protokoli spodbujanja jajčnikov imajo številne slabosti. So dragi, trajajo dolgo in so za bolnice obremenjujoči zaradi ponavljajočega se vnašanja zdravil in številnih obiskov, ki so potrebni za nadzorovanje samega postopka. Največja slabost klasičnih protokolov pa je večja možnost, da se razvije sindrom čezmernega odziva jačnikov, ki je resna bolezen za žensko in se lahko konča tudi s smrtjo.3 Prav tako je velik problem shranjevanje nadštevilnih zarodkov, ki se jim pari odrečejo in jih ne želijo uporabiti. Možni pomisleki glede uvajanja modificiranih spontanih postopkov ZTO in postopkov z zmernim spodbujanjem jajčnikov temeljijo predvsem na bojazni, da bi se znižala stopnja nosečnosti. Vendar je v današnjem času veliko več znanja tako na področju spodbujanja jajčnikov, predvsem v kombinaciji gonadotropinov z antagonisti gonadoliberinov, ki učinkovito zavirajo nastanek prezgodnjega vrha luteinizirajočega hormona (LH) 4 kot na področju laboratorijskih tehnik. Torej so prednosti zmernega spodbujanja dobro definirane in opravičujejo vključitev v programe ZTO.
Terminologija spodbujanja jajčnikov v postopku zunajtelesne oploditve 5
Glede na številne strokovne publikacije, v katerih uporabljajo različno terminologijo, in glede na ponovno oživitev spontanega in zmerno spodbujenega postopka v klinično prakso, se je izkazalo za potrebno, da se
ta terminologija na novo opredeli in poenoti. Skupina strokovnjakov iz International Society for Mild Aproa-ches in Assisted Reproduction (ISMAAR) je pregledala razpoložljivo literaturo in sprejela novo terminologijo, ki je razvidna iz Tabele 1.
Tab. 1. Terminologija postopkov zunajtelesne oploditve.
Table 1. Terminology of in-vitro fertilization cycles.
Priporočljiva terminologija Zamenjana terminologija Recommended terminology Replaced terminology
Naravni postopek ZTO Natural cycle IVF
Modificiran naravni postopek ZTO
Modified natural cycle IVF Zmerna oblika ZTO
Mild IVF
Konvencionalna oblika ZTO Conventional IVF
Nespodbujen, spontan postopek ZTO Unstimulated, spontaneous cycle IVF
Polovično naraven, kontrolirano naraven postopek ZTO
Semi-natural, controlled natural cycle IVF
Mehko, minimalno spodbujanje, prijazna ZTO
Soft, minimal stimulation, »friendly« IVF
Standardna, rutinska ZTO, kontrolirano spodbujanje jajčnikov ZTO Standard, routine IVF, controlled ovarian
stimulation IVF
Kratek opis različnih pristopov ZTO
Naravni postopek ZTO
Naravni postopek ZTO je postopek, pri katerem ne uporabljamo nobenih zdravil in zasledujemo naravni menstruacijski ciklus s pomočjo ultrazvoka, serumske koncentracije estradiola in urinskega LH z namenom, da pridobimo eno samo jajčno celico. Slabost omenjenega pristopa je, da veliko postopkov odpade. Prav tako s tem postopkom ne dosegamo primerne stopnje nosečnosti, zato se praktično ne uporablja.6
Modificiran naravni postopek ZTO
To je najpogosteje uporabljena metoda naravnega postopka ZTO. Uporabljamo ga pri ženskah, ki ne želijo vnašati hormonov, da bi pridobile več jajčnih celic.7 Prav tako nekateri avtorji priporočajo omenjeni protokol za ženske, ki se slabo odzivajo na spodbujanje z gonadotropini.810 Postopek, ki ga izvajamo med spontanim menstruacijskim ciklusom, nadzorujemo
s ponavljajočimi se ultrazvočnimi preiskavami in/ ali s serumskimi koncentracijami estradiola in LH. V območju optimalnih koncentracij estradiola in LH ter ultrazvočne meritve folikla in endometrija dnevno vnašamo antagoniste gonadoliberinov vse do vnosa humanega horionskega gonadotropina (HCG) za zorenje jajčne celice. Hkrati z antagonisti gonadoliberinov lahko vnašamo tudi gonadotropine v nizkih odmerkih (do 150 IE na dan) kot podporno zdravljenje zaradi padca FSH in za vzdrževanje folikla.11 Pri tem postopku je potrebna lutealna podpora s HCG ali progesteronom.
Tudi pri tem postopku, če ne uporabimo antagonistov gonadoliberinov, odpade veliko število začetih postopkov. Na Ginekološki kliniki v Ljubljani je Tomaževič uvedel protokol, po katerem se HCG za zorenje jajčnih celic vnaša sorazmerno zgodaj v folikularni fazi, ko dominantni folikel meri 16 mm in več v premeru in ko je pripadajoča serumska koncentracija estradiola > 0.49 nmol/L ob odsotnosti vrha LH.12, 13 Na ta način se je zmanjšalo število prekinjenih postopkov, kar je kasneje potrdila tudi mariborska skupina IVF.14 Problem pa še vedno ostaja v nizki stopnji nosečnosti. Nadaljnje raziskave ljubljanske skupine1517 so nazorno pokazale, da je kakovost jajčnih celic in zgodnjih zarodkov, pridobljena v modificiranih naravnih postopkih, v primerjavi s spodbujenimi postopki popolnoma enaka. Torej je problem po vsej verjetnosti v vsaditvi. Ugotovili smo, da kljub zgodnjemu vnašanju HCG nismo preprečili nastanka vrha LH, ki je nastopil v času aspiriranja folikla. Predvidevamo, da je do spontanega vrha LH prišlo zaradi predhodne senzibilizacije dominantnega folikla na FSH in LH, ki je neovirano tekla dalje. Po vsej verjetnosti pa je vnos HCG in kasneje spontani vrh LH negativno vplival na strukturo endometrija in posledično na slabo vgnezdenje.
Zmerna ZTO
Zmerna ZTO je metoda, pri kateri gonadotropine vnašamo v nizkih odmerkih in ali krajše obdobje v postopkih, kjer sočasno uporabljamo antagoniste gonadoliberinov ali ko uporabljamo oralne učinkovine (anti-estrogene, aromatazne inhibitorje) same ali v kombinaciji z gonadotropini. Za zorenje jajčnih celic vnašamo HCG, za lutealno podporo pa HCG ali progesteron. Pri zmerni ZTO pridobimo od 2-7 jajčnih celic.18 V prihodnosti pričakujemo večje izvajanje omenjenega protokola ali pa bo popolnoma nadomestil konvencionalne protokole, seveda ob dejstvu, da je samo rojstvo enojčka uspešen izid ZTO.
Konvencionalna ZTO
Ta protokol uporabljamo najpogosteje. Agoniste go-nadoliberinov vnašamo v dolgih ali kratkih protokolih s konvencionalnimi odmerki gonadotropinov za spodbujanje jajčnikov. Med konvencionalne postopke sodijo tudi postopki z antagonisti gonadoliberinov s konvencionalnimi odmerki gonadotropinov od 2. dneva menstruacijskega ciklusa dalje.2 Celotni odmerek gonadotropinov na postopek je višji, prav tako trajanje spodbujanja v primerjavi z zmernim spodbujanjem.18
Fiziološka utemeljitev protokola zmerne ZTO
Uvedna antagonistov gonadoliberinov v klinično prakso je omogočila, da poteka spodbujanje jajčnikov bolj fiziološko v aktualnem menstruacijskem ciklusu. Prav to pa je je temelj za izvajanje zmerne ZTO. V vsakem ciklusu se v povprečju rekrutira 11 foliklov v vsakem jajčniku. Število je zelo odvisno od starosti bolnice.19 Znano je, da je folikel stimulirajoči hormon (FSH) tisti dejavnik, ki vpliva na preživetje antralnih foliklov. V zgodnji folikularni fazi FSH rahlo narašča in doseže plato, nato pa prične padati v srednji in pozni folikularni fazi zaradi inhibina B in negativne ovarij-ske steroidne zanke.20 Kljub temu koncentracija FSH zadošča za vzdrževanje dominantnega folikla, prav tako pa tudi za rast zrelih foliklov zaradi pridobljene povečane občutljivosti na FSH in LH.21 Pri vseh ostalih rekrutiranih foliklih pa zaradi pomanjkanja spodbujanja s FSH pride do atrezije.22
Ko smo dobili v uporabo gonadotropine, se je pričelo uvajanje spodbujanja jajčnikov z visokimi odmerki gonadotropinov znotraj cele folikularne faze, kar je imelo za posledico razvoj številnih dominantnih foliklov.23 Študije na primatih so pokazale, da zmerno spodbujanje v času zniževanja FSH v sredini folikularne faze zadošča, da prepreči selekcijo dominantnega folikla.24 Sedaj je ta koncept potrjen tudi pri človeku. Zmerno, vendar kontinuirano vnašanje gonadotropinov v času srednje in kasne folikularne faze zadošča, da se vmešajo v selekcijo in preprečijo rast samo enega folikla, spodbudijo pa nadaljnjo rast zrelih, na FSH senzibili-ziranih foliklov.25
Prednost zmernega spodbujanja je dokazana tudi na genetski ravni zgodnjih zarodkov. Pri zmerni ZTO v primerjavi s konvencionalnim dolgim protokolom agonistov gonadoliberinov v kombinaciji z gonadotropini so ugotovili, da so pridobili manj jajčnih celic in manj zarodkov, vendar je bila stopnja kromosomsko normalnih zarodkov bistveno višja. Kljub večjemu številu jajčnih celic in zarodkov pri konvencionalni ZTO je bilo absolutno število kromosomsko normalnih zarodkov v obeh skupinah na koncu popolnoma enako (1,8 zarodka), prav tako pa tudi stopnja nosečnosti.26 Vsa navedena dejstva kažejo na to, da zmerna ZTO najmanj moti ovarijsko fiziologijo.
Izhodišča za uvedbo zmernega spodbujanja jajčnikov v Sloveniji
Zakaj je uvedba zmernega spodbujanja jajčnikov še posebno primerna za izvajanje v slovenskem programu postopkov ZTO. ZZZS povrne stroške zdravljenja za 6 postopkov za prvo nosečnost in nato še štiri za vsako nadaljnjo nosečnost.27 Podatki iz literature kažejo, da je stopnja nosečnosti najvišja po prvem postopku, nato pa se s ponavljajočimi se postopki niža.28, 29 Kljub temu, da po zmernemu spodbujanju jajčnikov odpade večje število bolnic za aspiriranje foliklov v primerjavi s konvencionalnimi protokoli, pa je kumulativna stopnja nosečnosti, s ponavljajočimi se postopki na koncu enaka.18 Tudi morebitni neuspeh v prvem in drugem postopku za par tako ne bi bil problematičen, saj bi v preostalih štirih postopkih še vedno lahko opravili konvencionalno spodbujanje jajčnikov. Vse skupaj pa po-
meni bistveno manjšo obremenitev za par v postopku, nižjo ceno postopka, predvsem pa pomembno varnejši postopek, kajti na ta način način se praktično v celoti izognemo sindromu čezmernega odziva jajčnikov, ki je resen zaplet in se lahko konča tudi s smrtjo. Drugi razlog za uvedbo zmernega spodbujanja jajčnikov je, da približno četrtine zamrznjenih zgodnjih zarodkov pari ne želijo uporabili.30 Zakon o zdravljenju neplodnosti in postopkih oploditve z biomedicinsko pomočjo (ZZnPoB) nalaga, da se neuporabljeni zgodnji zarodki hranijo toliko časa, kolikor želita ženska in moški, katerima se pomaga s postopki oploditve z biomedicinsko pomočjo (OBMP), vendar ne več kot pet let. Iz zdravstveno utemeljenih razlogov se lahko z dovoljenjem Državne komisije za OBMP čas hranjenja podaljša za največ pet let. Podaljšanje lahko zahteva oseba, od katere zarodki izvirajo. Po preteku rokov je treba zgodnje zarodke zavreči.31 Naslednji razlog za uvedbo zmernega spodbujanja jajčnikov je ta, da je samo aspiriranje manjštevilnih foliklov bolj prijazno in manj boleče za bolnico, hkrati pa se tudi zmanjšuje možnost krvavitve, poškodbe sosednih organov in vnetnih reakcij. Predvidevamo, da bo uvedba zmernega protokola ZTO v slovenski prostor sorazmerno težavna in za tisti center, ki ga bo pričel uvajati, zelo tvegana. V neprestanem prizadevanju za doseganje čimvišje stopnje nosečnosti na postopek se bo le-ta znižala, kajti filozofija zmernega spodbujanja je, da pridemo do zdravega otroka na najbolj varen način s ponavljajočimi se, varnimi postopki. Številni strokovnjaki vse bolj poudarjajo, kako nepomembna in celo moteča je markentiško, populistična in brezkompromisna tekma za doseganje in prikazovanje čim višje stopnje nosečnosti.32 Tako morajo neplodni pari, strokovnjaki in tudi država, ki plačuje postopke, zasledovati en in edini cilj: roditi se mora zdrav otrok. Z uvedbo zmernega spodbujanja in prenosa samo enega zarodka bi naredili pomemben korak k zmanjšanju števila dvojčkov in prezgodaj rojenih otrok in številu bolnic s sindromom čezmerno spodbujenih jajčnikov. Dolžnost strokovnjakov s področja neplodnosti pa je, da paru natančno obrazložijo, kakšen je njihov problem in podajo objektivno oceno glede njihovih pričakovanj. Uvajanje strategije zmerne ZTO bo povezano tako s skrbnim svetovanjem parom kot tudi izvajalcem ZTO. Prav tako naj bi pri tem uvajanju poleg strokovnjakov sodelovali tudi predstavniki zdravstvene politike, ki nadzorujejo izvajanje programov ZTO.
Zaključki
Odkritje in uvedba antagonistov gonadoliberinov v klinično prakso je omogočilo ponovno uvedbo naravnega modificiranega in zmernega postopka ZTO, kajti na ta način lahko odpravimo najpogostejši problem, to je nastanek spontanega vrha LH, kar je imelo za posledico prekinitev številnih postopkov. Kljub temu, da bo lahko na začetku stopnja nosečnosti na ciklus nižja v primerjavi s konvencionalnimi postopki ZTO, nas to ne bi smelo ustaviti, kajti kumulativna stopnja nosečnosti ob bistveno manjši porabi gonadotropi-nov bo enaka, približno 50 %, zagotovo pa bo manj
večplodnih nosečnosti in prezgodnjih porodov. Prav tako je to tudi pravi pristop k odpravljanju sindroma čezmernega spodbujanja jajčnikov, ki trenutno predstavlja resen problem pri uporabi gonadotropinov v visokih odmerkih. V Sloveniji smo naredili korak naprej z uvedbo selektivnega prenosa enega zarodka, ki ga je omogočila tudi ZZZS s povrnitvijo stroškov za 6 postopkov, in ne več samo za 4 postopke. Narediti je potrebno še naslednjega in uvesti zmerno spodbujanje v postopkih ZTO. Poleg vseh naštetih prednosti zmerne ZTO je tudi ta, da npr. v enem letu lahko naredimo 4 zmerne ali samo 3 konvencionalne ZTO za enak rezultat in z veliko manjšim angažiranjem para. Nenazadnje je pomembno tudi to, da par pride do otroka takrat, ko ga planira. Eno leto je tisto obdobje, ki je sprejemljivo, da vsaj polovico parov pride do rezultata.
Literatura
1.	Steptoe PC, Edwards RG. Birth after the preimolantation of a human embryo. Lancet 1978; 2: 366.
2.	Maclon NS, Stouffer RL, Giudice LC, Fauser BC. The science behind 25 years of ovarian stimulation for in vitro fertilization. Endocrinol Rev 2006; 27: 170-207.
3.	Aboulghar MA, Mansour RT. Ovarian hyperstimulation syndrome: classifications and critical analysis of preventive measures. Hum Reprod Update 2003; 9: 275-89.
4.	Tarlatzis BC, Fauser BC, Kolibianakis EM, Diedrich K, Rombauts L, Devroey P. GnRH antagonists in ovarian stimulation for IVF. Hum Reprod Update 2006; 12: 333-40.
5.	Nargund G, Fauser BC, Macklon NS, Ombelet W, Nygren K, Frydman R. The ISMAAR proposal on terminology for ovarian stimulation for IVF. Hum Reprod 2007; 23: 2801-4.
6.	Pelinck MJ, Hoek A, Simons AMH, Heineman MJ. Efficacy of natural cycle IVF: a review of the literature. Hum Reprod Update 2002; 8: 129-39.
7.	Nargund G, Waterstone J, Bland J, Parson J, Camphell S. Cumulative conception and live birth rates in natural (unstimulated) IVF cycles. Hum Reprod 2001; 16: 259-62.
8.	Feldman B, Seidman DS, Levron J, Bider D, Shulman A, Shine S, et al. In vitro fertilization following natural cycles in poor responders. Gynecol Endocrinol 2001; 15: 328-34.
9.	Elizur SE, Aslan D, Shulman A, Wisc B, Bider D, Dor J. Modified natural cycle using GnRH antagonist can be an optimal treatment in poor responders undrgoing IVF. J Assisted Reprod Genet 2005; 22: 75-9.
10.	Papaleo E, De Santis L, Fusi F, Doldi N, Brigante C, Marelli G, et al. Natural cycle as first approach in aged patients with elevated follicle-stimulating hormone undergoing intracytoplasmic sperm injection: A pilot study. Gyn Endocrin 2006; 22: 351-4.
11.	Rongieres-Bertrand C, Olivennes F, Righini C, Fanchin R, Taieb J, Hamamah S, et al. Revival of the natural cycles in in-vitro fertilization with the use of a new gonadotrophin-releasing hormone antagonist (Cetrorelix): a pilot study with minimal stimulation. Hum Reprod 1999; 14: 683-8.
12.	Tomaževič T, Geršak K, Meden Vrtovec H. Clinical parameters to predict the success of in vitro fertilization-embryo transfer in the natural cycle. Assist Reprod 1999; 9: 149-56.
13.	Tomazevic T, Korosec S, Virant Klun I, Drobnic S, Verdenik I. Age, oestradiol and blastocysts can predict success in natural cycle IVF-embryo transfer. Reprod Biomed Online 2007; 15: 220-6.
14.	Vlaisavljević V, Kovačič B, Reljič M, Gavrič Lovrec V. Three protocols for monitoring follicle development in 587 unstimulated cycles of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. J Reprod Med 2001; 892-8.
15.	Jancar N, Kopitar AN, Ihan A, Virant Klun I, Bokal EV. Effect of apoptosis and reactive oxygen species production in human granulosa cells on oocyte fertilization and blastocyst development. J Assist Reprod Genet. 2007; 24: 91-7.
16.	Jancar N, Virant-Klun I, Osredkar J, Vrtacnik Bokal E. Apoptosis, reactive oxygen species and follicular anti-Müllerian hormone in natural versus stimulated cycles. Reprod Biomed Online. 2008; 16: 640-8.
17.	Vrtačnik Bokal E, Jančar N, Virant Klun I. Follicular and serum anti-mullerian hormone in natural and stimulated cycles. Hum Reprod 2008; 23: i27-i28.
18.	Heijnen E, Marinus JC, De Klerk C, Polinder S, Beckers NGM, Klinkert ER, et al. A mild treatment strategy for in-vitro fertilisation: a randomised non-inferiority trial. Lancet 2007; 369: 743-9.
19.	Pache TD, Wladimiroff JW, de Jong FH, Hop WC, Fauser BC. Growth patterns of nondominant ovarian follicles during the normal menstrual cycle. Fertil Steril 1990; 54: 638-42.
20.	Schipper I, Hop WC, Fauser BC. The follicle-stimulating hormone (FSH) threshold/window concept examined by different interventions with exogenous FSH during the follicular phase of the normal menstrual cycle: duration, rather than magnitude, of FSH increase affects follicle development. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 1292-8.
21.	McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev 2000; 21: 200-14.
22.	Fauser BC, Donderwinkel P, Schoot DC. The step-down priciple in gonadotrophin treatment and the role of GnRH analogues. Bailliers Clin Obstet Gynaecol 1993; 7: 309-30.
23.	Oehninger S, Hodgen GD. Induction of ovulation for assisted reproduction programmes. Bailliers Clin Obstet Gynaecol 1990; 4: 541-73.
24.	Zeleznik AJ, Hutchison JS, Schuler HM. Interfrence with the gonadotropin-suppressing actions of estradiol in macaques overrides the selection of a single preovulatory follicle. Endocrinology 1985; 117: 991-9.
25.	Hohmann FP, Laven JS, de Jong FH, Ejkemans MJ, Fauser BC. Low-dose exogenous FSH initiated during the early, mid or late follicular phase can induce multiple dominant follicle development. Hum Reprod 2001; 16: 846-54.
26.	Baart EB, Martini E, Eijkemans MJ, Van Opstal D, Beckers NG, Verhoeff A, et al. Milder ovarian stimulation for in-vitro fertilization reduces aneuploidy in the human preimplatation embryo: a randomized controlled trial. Hum Reprod 2007; 22: 980-88.
27.	Spremembe in dopolnitve pravil obveznega zdravstvenega zavarovanja. Ur l RS 33/08.
28.	Silberstein T, Timarchi JR, Gonzales L et al. Pregnancy outcome in in vitro fertilization decreases to plateau with repeated cycles. Fertil Steril 2005; 84: 1043-5.
29.	Wang JG, Douglas NC, Dicken E, Nakhuda GS, Guarnaccia MM, Sauer MV. Cryopersevation of supernumerary high quality embryos predicts favorable outcomes for patients undergoing repeated embryos predicts favorable outcomes for patients undergoing repeated cycles of in vitro fertilization. Fertil Steril 2008; 89: 368-74.
30.	Bangsboll S, Pinborg A, Yding Andersen C, Nyboe Andersen A. Patients' attitudes towards donation of surplus crypreserved embryos for treatment or research. Hum Reprod 2004; 19: 2415-9.
31.	Zakon o zdravljenju neplodnosti in postopkih oploditve z biomedicinsko pomočjo (ZZNPOB). Ur l RS 70/00.
32.	Jones HW, Cohen J, Cooke I. Kempers R. IFFS Surveillance 07.
Fertil Steril 2007; 87 Suppl 1: S1-S61.
Prispelo 2009-09-03, sprejeto 2009-10-01