180 NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO farm vestn 2021; 72 1 UVOD Na področju zdravil se v zadnjem času pojavlja vse več na- prednih dostavnih sistemov, ki pogosto omogočajo dose- ganje boljše biološke uporabnosti in nadzorovano sproš- čanje učinkovin ter imajo nekatere druge prednosti v primerjavi s tradicionalnimi farmacevtskimi oblikami. Med napredne dostavne sisteme sodijo poleg različnih nano- delcev tudi nanovlakna, ki so jih prvič opisali leta 1934, ko NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO NANOFIBERS FOR DRUG DELIVERY AND TISSUE ENGINEERING AVTORJI / AUThORS: Anže Zidar, mag. farm. prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm. izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: alenka.zvonar-pobirk@ffa.uni-lj.si POVZETEK Nanovlakna so edinstven inovativen sistem za do- stavo zdravilnih učinkovin in za tkivno inženirstvo. V zadnjih letih so doživela izjemen razvoj, kar bo omo- gočilo izdelavo novodobnih zdravil in tkivnih nado- mestkov za zdravljenje mnogih bolezni in poškodb. Nanovlakna so izdelana z elektrostatskim sukanjem iz naravnih in/ali sinteznih polimerov z različno se- stavo in strukturo (enoslojna, večslojna in večplastna) ter izkazujejo edinstveno kombinacijo strukturnih , funkcionalnih in meh anskih lastnosti. Prilagodljivost nanovlaken je privedla do razvoja širokega nabora dostavnih sistemov za različne učinkovine in pod- pornih struktur za obnovo tkiv. V preglednem članku predstavljamo pripravo nanovlaken z elektrostatskim sukanjem, doseganje različnih profilov sproščanja vgrajenih majh nih molekul in biofarmacevtikov za zdravljenje ter obnovo tkiv. Polimerna nanovlakna v tkivnem inženirstvu podpirajo razmnoževanje in rast celic ter na ta način spodbudijo obnovo tkiva. Na- novlakna kljub mnogim prednostim predvsem zaradi nezadostnih podatkov o njih ovi varnosti in omejitev v industrijski proizvodnji še niso v klinični uporabi, jih pa lah ko pričakujemo kmalu. KLJUČNE BESEDE: dostavni sistemi, elektrostatsko sukanje, nanov- lakna, polimer, sproščanje učinkovin, tkivno inže- nirstvo ABSTRACT Nanofibers provide unique systems for drug delivery and tissue engineering. In recent years, major ad- vances h ave been made towards th e formulation of innovative medicines and tissue replacements for th e treatment of disease and injury. Nanofibers are made by electrospinning of natural and/or syn- th etic polymers, and as such , th ey can h ave a range of different compositions and structures (e.g., monolayers, multilayers, ‘sandwich ’). Th ey also sh ow unique combinations of structural, functional and mech anical properties. Th is flexibility h as led to th e development of a wide assortment of nanofibers as drug-delivery systems and tissue-re- generation structures. Th is review covers th e prepa- ration of nanofibers by electrospinning and provides th e details on th eir release kinetics for small 181 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI so patentirali postopek njih ove izdelave. Zaradi pomanjkanja ustrezne teh nologije je razvoj na tem področju v večji meri zastal do konca dvajsetega stoletja, ko so se možnosti za izdelavo in posledično tudi interes industrije močno povečali (1). Nanovlakna so zelo tanka in teoretično neomejeno dolga. Premer nanovlaken je največkrat od 10 do 1000 nm, imajo veliko specifično površino glede na maso in raz- novrstne površinske lastnosti. Za njih ovo uporabo so zelo pomembne ustrezne strukturne, funkcionalne in meh anske lastnosti, kot sta visok Youngov modul in posledično visoka natezna trdnost (2–4). Za biomedicinske namene danes raziskujejo nanovlakna za uporabo v dostavnih sistemih učinkovin in tkivnem inženirstvu, za izdelavo filtrov za filtracijo zraka in preprečevanje okužb (kot del obraznih mask), kot sestavine pametnih ovojnin za sh ranjevanje živil, sestavine gradbenih materialov, pa tudi v sistemih za pridobivanje, prenos in sh ranjevanje električne energije (3, 5–7). Nanov- lakna z zdravilno učinkovino lah ko vgradimo v farmacevtske oblike z različnimi profili sproščanja učinkovin ali pa jih upo- rabimo pri tkivnem inženirstvu za spodbujanje obnove tkiv (8–10). V nanovlakna lah ko vgrajujemo male molekule učin- kovin, peptide in proteine, nukleinske kisline in celice (11, 12). V literaturi tako zasledimo raziskave o nanovlaknih kot dostavnih sistemih za učinkovine z raznovrstnim farmako- loškim delovanjem (protivnetnim, protimikrobnim, antineo- plastičnim, analgetičnim, antialergijskim ali kontracepcijskim učinkom). Ena izmed aktualnih teh nologij za inženirstvo in izdelavo nanovlaken je elektrostatsko sukanje, ki omogoča preoblikovanje izbrane koloidne raztopine pod vplivom elek- trostatskih sil v tanek curek in nastanek nanovlaken z žele- nima debelino in morfologijo. V prispevku predstavljamo iz- delavo in uporabo nanovlaken za dostavo zdravilnih učinkovin ali pripravo tkivnih nadomestkov (slika 1). 2 ELEKTROSTATSKO SUKANJE Najpomembnejša metoda za izdelavo nanovlaken za bio- medicinske namene je elektrostatsko sukanje, ki omogoča izdelavo vlaken farmacevtske kakovosti (4, 13). To je proces, pri katerem se curek raztopine polimera zaradi močnega električnega polja na poti od šobe do zbirala podaljša, stanjša, posuši in posledično naloži na zbiralu (slika 2). Zna- čilnosti slednjih so odvisne od lastnosti koloidne raztopine polimera (viskoznost, električna prevodnost in površinska molecules and bioph armaceuticals, and th eir use for treatment and tissue engineering. Polymeric nanofibers in tissue engineering support proliferation and growth of cells, h ence encouraging tissue re- generation. Despite th e many advantages of nanofibers, th ey are not yet in clinical use. Th is is mainly due to insufficient data on th eir safety and limitations in th eir industrial production, but th ese aspects are expected to be overcome soon. KEY WORDS: drug delivery, drug release, electrospinning, nanofibers, polymer, tissue engineering Slika 1. Videz nanovlaken v različnih merilnih skalah: a) množica plasti nanovlaken tvori belo membrano, kot jo vidimo s prostim očesom; b) posnetek nekaj plasti nanovlaken s keratinocitom, pritrjenim na površini, v mikrometrskem območju; c) posnetek nanovlaken z vrstičnim elektronskim mikroskopom v nanometrskem območju. Figure 1. Appearance of nanofibers on different scales a) many layers of nanofibers form white membrane that is seen with a naked eye, b) a few layers of nanofibers with an attached keratinocyte in a micrometre scale c) nanofibers captured with an electron microscope in a nanometre scale. 182 NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO farm vestn 2021; 72 napetost), procesnih (velikost in oblika šobe, napetost in razdalja med šobo in zbiralom ter vrsta zbirala) in okoljskih parametrov (relativna zračna vlaga in temperatura) (3, 14, 15). Nanovlakna izdelamo bodisi iz koloidne raztopine ali taline enega ali več polimerov (t. i. kompozitna nanovlakna) bodisi iz taline lipidov (v tem primeru mora biti sistem za dovajanje tekočine skozi šobo opremljen z dodatno grelno enoto). V nadaljevanju bomo podrobneje prikazali elektro- statsko sukanje koloidne raztopine polimera (2, 4, 7, 9). Medtem ko je naprava za elektrostatsko sukanje na videz enostavna (slika 2), je izdelava nanovlaken zah teven in od številnih zgoraj omenjenih parametrov odvisen proces. Na- pravo sestavljajo rezervoar s šobo, vir visoke napetosti, črpalka za uravnavanje pretoka raztopine in zbiralna elek- troda (zbiralo). Napetost med šobo in zbiralom je lah ko enosmerna (stalna) ali izmenična (običajno nastavimo med 10 in 100 kV) (13). Poznamo tudi več izvedb šobe, ki je lah ko enokanalna (enostavna), dvokanalna (koaksialna) ali večkanalna; iz nje izh aja eden ali več curkov h krati. Prav tako so razpoložljiva različna zbirala (ravna ploskev, vrteč valj, mrežasto zbiralo). Vrsta zbirala vpliva na nastanek na- ključno ali vzporedno urejenih nanovlaken (3, 4). Elektrostatsko sukanje temelji na ionizaciji koloidne raztopine v električnem polju. Na izh odu šobe se nastajajoča kapljica pod vplivom tlaka, električne sile, površinske napetosti te- kočine in njene viskoznosti oblikuje v t. i. Taylorjev stožec, ki se nadaljuje v vse tanjši polimerni curek. V prvi fazi gibanja potuje curek naravnost proti zbiralu in se medtem podaljšuje in tanjša. Ko se curek tanjša, se na površini povečuje go- stota naboja in s tem odbojne sile, zaradi katerih se začne curek vrtinčiti proti zbiralu. To vodi še v nadaljnje tanjšanje curka in povečanje njegove specifične površine, kar še po- speši izh lapevanje topila. Proces izdelave se zaključi z na- laganjem posušenega nanovlakna na zbiralo (3, 4, 7). Ena glavnih značilnosti elektrostatskega sukanja je možnost vgradnje najrazličnejših učinkovin v vlakna z namenom, da se jim izboljša biološka uporabnost, pospeši raztapljanje ali doseže nadzorovano sproščanje. Poleg tega je mogoča neprekinjena proizvodnja z nizko porabo energije, zaradi česar je lah ko alternativa široko uporabljanemu zamrzo- valnemu sušenju in sušenju z razprševanjem (16). Doslej je nizka stopnja proizvodnje laboratorijsko prilagojenih na- prav omejevala industrijsko uporabo te teh nologije, a danes so na trgu že različne rešitve, razvite za razširjeno proiz- vodnjo vlaken s poudarkom na farmacevtskih izdelkih (12, 16). 3 NANOVLAKNA KOT DOSTAVNI SISTEMI 3.1 VRSTE NANOVLAKEN Glede na morfologijo in mesto vgradnje učinkovine ločimo tri glavne kategorije nanovlaken: enoslojna, večslojna ter večplastna nanovlakna (slika 3). V enoslojnih nanovlaknih je učinkovina enakomerno raz- porejena po celotnem vlaknu, ki ga sestavlja en polimer (enokomponentna vlakna) ali mešanica več polimerov (večkomponentna ali kompozitna nanovlakna), ki za- gotavljajo načrtovano sproščanje učinkovine, meh ansko trdnost in elastičnost vlaken. Obnašanje enoslojnih nanovla- ken v telesu je odvisno od topnosti polimera. Nanovlakna iz h idrofilnih polimerov se v bioloških tekočinah h itro raztopijo in omogočajo takojšnje sproščanje učinkovine. Pri nanov- laknih s podaljšanim sproščanjem pa je sproščanje učinkovine odvisno od erodiranja ali razgradnje uporabljenih polimerov v biološkem okolju oziroma difuzije učinkovine. Za izdelavo nanovlaken lah ko uporabimo tudi mukoadh ezivne polimere, ki omogočajo daljši stik s sluznico ali tkivom (4, 17). Večslojna nanovlakna so zgrajena iz dveh ali več slojev (jedro in zunanji sloj/i) z učinkovino v enem ali več slojih (18). Izdelamo jih s pomočjo koaksialne šobe, ki ima več kanalov in omogoča nastanek več slojev h krati. Pri takšnem načinu izdelave lah ko za notranjo plast nanovlakna upora- bimo tudi polimere, ki sami po sebi niso zmožni tvoriti na- novlaken, a s svojimi značilnostmi pomembno prispevajo k lastnostim izdelanih nanovlaken (npr. vpliv na stabilnost in profil sproščanja učinkovine). Glede na strukturo so več- slojna nanovlakna lah ko ogrodna ali rezervoarna. Pri ogrodnih večslojnih nanovlaknih nadzoruje sproščanje Slika 2: Shema naprave za elektrostatsko sukanje z glavnimi elementi. Figure 2: Schematic representation of a nanofiber electrospinning set-up. 183 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI polimerno ogrodje, v katerem je učinkovina enakomerno porazdeljena. V odvisnosti od ogrodnega polimera lah ko dosežemo takojšnje ali prirejeno sproščanje učinkovine. Z ustrezno kombinacijo polimerov lah ko dosežemo dvojni profil sproščanja, pri čemer se učinkovina iz zunanjega sloja sprosti takoj, iz notranjega pa počasneje (4, 19). Več- slojna nanovlakna lah ko oblikujemo tudi v obliki rezer- voarnih nanovlaken, kjer zunanji sloj tvori prepustno pre- grado, ki nadzoruje sproščanje učinkovine, vgrajene v notranjem sloju. Rezervoarni tip nanovlaken je primeren predvsem za podaljšano sproščanje učinkovin (4, 19, 20). Večplastna nanovlakna dobimo z zaporednim elektrostat- skim sukanjem plasti raztopin polimera ali polimera z učin- kovino na zbiralo. Pri tem nastane sistem, v katerem spodnja in zgornja plast nanovlaken predstavljata pregrado za sproš- čanje učinkovine, ki je vgrajena v sredinski plasti nanovlaken (t. i. »sendvič tip« nanovlaken). Za izdelavo tovrstnih sistemov so primerni predvsem nabrekajoči h idrofilni polimeri (21). 3.2 POLIMERI Za izdelavo nanovlaken uporabljamo številne biokompati- bilne naravne in sintezne polimere, ki se razlikujejo po vrsti, številu in ureditvi monomernih enot, ki določajo fizikalno- kemijske lastnosti (molekulska masa, polarnost, vodotop- nost in prisotnosti različnih funkcionalnih skupin) (3). V pre- glednici 1 so zbrani najpomembnejši polimeri za oblikovanje različnih vrst nanovlaken. 3.3 VGRAJEVANJE UČINKOVIN Učinkovino dodamo v raztopino polimera in jo tako nepo- sredno vgradimo v nanovlakna med samim procesom elek- trostatskega sukanja ali pa jo adsorbiramo na že oblikovana nanovlakna (slika 4) (8, 17). V obeh primerih je lah ko učin- Slika 3: Prečni prerez različnih vrst nanovlaken z vgrajeno učinkovino. Različni odtenki sive predstavljajo različne polimere oz. različne sloje/plasti, učinkovina pa je označena s črnimi pikami. Figure 3: Cross section of different types of nanofibers with incorporated drugs. Different shades of grey represent different polymers or layers of nanofibers, and drug is represented by black dots. Slika 4: Načini vgrajevanja učinkovine v nanovlakna. Barva raztopine pred sukanjem se ujema s slojem nanovlakna po sukanju. Barve predstavljajo različne polimere. Figure 4: Different drug loading techniques in nanofibers. Colours of original dispersions correlate with nanofiber layers after electrospinning. Colours represent different polymers. kovina v tekoči disperziji (raztopina, emulzija ali suspenzija) raztopljena, emulgirana ali suspendirana. Učinkovino (samo ali vgrajeno v nanodelce) lah ko tudi adsorbiramo na na- novlakna (slika 4). Z adsorpcijo specifičnih ligandov (npr. protitelesa, folna kislina) lah ko povečamo funkcionalnost nanovlaken. V nanovlakna lah ko vgrajujemo male molekule učinkovin, peptide in proteine, nukleinske kisline in celice (11, 12, 34). Aktualno je vgrajevanje celic in bakterijskih spor v nanovlakna za namen obnove in podpore mikrobiote na mestu delovanja (34). Nanovlakna izdelujemo z name- nom doseganja lokalnega ali sistemskega delovanja vgra- jene učinkovine (4). 3.4 PROFILI SPROš ČANJA UČINKOVIN IZ NANOVLAKEN Poleg morfoloških lastnosti je zelo pomembna lastnost na- novlaken tudi sposobnost dostave učinkovine z izbrano kinetiko sproščanja. Sproščanje učinkovin iz nanovlaken je lah ko takojšnje ali prirejeno (slika 5), kar je odvisno od vrste polimera oz. njih ovih zmesi ter od strukture nanovla- ken (4). Primeri polimerov in struktur nanovlaken za dose- ganje določene kinetike sproščanja so navedeni v pregled- nici 1. Iz nanovlaken s takojšnjim sproščanjem se učinkovina sprosti zelo h itro. Pri učinkovinah z dobro vodotopnostjo in h itro absorpcijo lah ko s takšnimi nanovlakni h itro dose- žemo terapevtski učinek (npr. v nekaj minutah ). K h itremu sproščanju učinkovin pomembno prispeva tudi velika spe- cifična površina nanovlaken. Ob ustrezni izbiri polimera lah ko takojšnje sproščanje dosežemo z enoslojnimi ali več- slojnimi nanovlakni z učinkovino le v zunanjem sloju (8, 28). Pri slabo vodotopnih učinkovinah je izziv večji; h itrost raztapljanja slednjih lah ko med drugim izboljšamo s pri- pravo stabilne amorfne oblike učinkovine v nanovlaknu (11). Za pripravo slednjih je pomembno, da za raztapljanje 184 NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO farm vestn 2021; 72 Preglednica 1: Pregled nanovlaken glede na kinetiko sproščanja in primeri polimerov za njihovo izdelavo. Table 1: Summary of nanofibers with different release kinetics and polymers for their formulation. Nanovlakna s takojšnjim sproščanjem Enokomponentna nanovlakna • Sintezni polimeri: polietilenglikol (PEG) (22), polivinilalkoh ol (PVA) (23), polimlečna kislina (PLA), polivinilpirolidon (PVP) (24), poliakrilati, Soluplus ® (polivinil kaprolaktam- polivinil acetat-polietilenglikol razvejan kopolimer) (8, 23, 24) • Naravni in polsintezni polimeri: h itosan, alginat, dekstran, kolagen, želatina, fibroin (protein svile) (25) Večkomponentna nanovlakna • Soluplus ® in PVA; poloksameri in PEG; alginat in PEG (15); h itosan in PEG (26); PVP in PVA (27) Nanovlakna s podaljšanim sproščanjem Enoslojna ogrodna nanovlakna • Polikaprolakton (PCL) (28), h idroksipropilmetilceluloza, kopolimer mlečne in glikolne kisline (PLGA) (3) • Polikaprolakton in želatina, polikaprolakton in h itosan, PVA in etilh idroksietilceluloza, natrijev alginat in gelan (8) Večslojna ogrodna nanovlakna • Polikaprolakton (zunanji sloj) in PVA (jedro) (20), PMMA (zunanji sloj) in PVA (jedro) (18); PLGA (zunanji sloj) in PVP (jedro) (19) Večslojna rezervoarna nanovlakna • Polimlečna kislina (PLA) in tioh itosan (zunanji sloj) in PEG (jedro) (8, 29) • Glicerol monostearat (zunanji sloj) in etilceluloza (jedro) (30) Večplastna nanovlakna • želatina (zunanji plasti) in želatina z učinkovino (notranja plast) (21) Nanovlakna z večfaznim sproščanjem Večslojna ogrodna nanovlakna • PEG (zunanji sloj) in PLA (jedro) (31) Nanovlakna z zakasnelim sproščanjem Temperaturno odzivna nanovlakna • Poli(N-izopropilakrilamid) in etilceluloza (32) ph odzivna nanovlakna • Eudragit RS100, Eudragit S100 (derivata polimetilakrilne kisline) (33) 185 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI polimera in učinkovine izberemo topilo, ki zelo h itro in v celoti izh lapi. Sam proces elektrostatskega sukanja mora biti dovolj h iter, da preprečimo kristalizacijo učinkovine med oblikovanjem nanovlakna (8). Farmacevtske oblike s prirejenim sproščanjem, ki vklju- čujejo podaljšano, večfazno in zakasnelo sproščanje, se od oblik s takojšnjim sproščanjem razlikujejo v h itrosti in/ali mestu sproščanja učinkovine. V primerjavi s takojšnjim sproščanjem je za tovrstne sisteme značilno počasnejše sproščanje učinkovine ali z določenim časovnim zamikom, možno pa je tudi podaljšano sproščanje učinkovine skozi daljše časovno obdobje. Ti sistemi so primerni za nadzo- rovano dostavo učinkovine na izbrano mesto aplikacije (4, 8). Za podaljšano sproščanje je značilna počasna kinetika sproščanja učinkovine skozi določen čas (več dni, tednov ali mesecev), bolj konstantna koncentracija učinkovine v krvi in s tem povezana manjša možnost neželenih učinkov (8). Primerna so predvsem enoslojna nanovlakna iz h idrof- obnih polimerov, pa tudi rezervoarna ter večplastna na- novlakna (slika 3). Torej je poleg strukture nanovlaken bi- stvena tudi izbira primernega polimera (preglednica 1). Sproščanje učinkovine iz takšnih nanovlaken je nadzoro- vano z difuzijo učinkovine skozi polimerno ogrodje (PCL), erozijo (h itosan) ali razgradnjo polimernega ogrodja (PLGA) (4, 8, 35). Za farmacevtske oblike z večfaznim sproščanjem je značilno sproščanje učinkovine z različnimi kinetikami sproščanja v različnih časovnih intervalih . To najlažje do- sežemo z večslojnimi nanovlakni, pri katerih zunanji sloj zagotovi takojšnje sproščanje, notranji pa zakasnelo ali po- daljšano sproščanje. Tudi v tem primeru velja, da je poleg strukture nanovlaken bistvena izbira primernih polimerov, ki omogočajo različne kinetike sproščanja (31). Zakasnelo sproščanje lah ko dosežemo z večslojnimi nanovlakni ali z nanovlakni iz polimerov, odzivnih na dra- žljaje (t. i. inteligentni polimeri). Slednji vsebujejo funkcio- nalne skupine, ki se odzivajo na določene dejavnike v okolju (npr. na majh ne spremembe vrednosti temperature, ph, ionske moči ali elektromagnetnega polja) in na ta način spreminjajo lastnosti polimera. S tem uravnavajo sproščanje vgrajene učinkovine iz nanovlaken. Takšni po- limeri so zelo aktualni za načrtovanje dostavnih sistemov, namenjenih ciljani dostavi učinkovine in sproščanju na to- čno določenem mestu v prebavnem traktu ali drugje v te- lesu (4, 8, 32). Temperaturno odzivna nanovlakna se spremenijo in sprostijo učinkovino ob spremembi temperature zaradi segrevanja pod vplivom telesne temperature ali pa zaradi umetnega povišanja s segrevanjem z infrardečo svetlobo (32). pH odzivna nanovlakna uporabljamo za dostavo učinkovine na določeno mesto v prebavnem traktu. Primer tovrstnega sistema so gastrorezistentna nanovlakna, ki sprostijo učinkovino v dvanajstniku, ter nanovlakna, ki sprostijo učinkovino na začetku debelega črevesja (33). Velika prednost nanovlaken, ki sicer prestavljajo relativno novo obliko dostavnih sistemov, je njih ova vsestranska uporabnost. Z izbiro ustreznih polimerov, strukture nanov- laken ter parametrov elektrostatskega sukanja lah ko do- sežemo praktično vse uveljavljene kinetike sproščanja učin- Slika 5: Različni profili sproščanja učinkovine iz nanovlaken: neprirejeno oz. takojšnje sproščanje in prirejeno (podaljšano, večfazno in zakasnelo) sproščanje. Figure 5: Different profiles of drug release from nanofibers: immediate release and modified release (prolonged release, multiphase release and delayed release). kovine. Omogočajo tudi vgradnjo učinkovine v amorfni obliki in njeno stabilnost skozi daljše časovno obdobje. Končne farmacevtske oblike za nanovlakna so tablete, kapsule in orodisperzibilne farmacevtske oblike (nanovlakna pred polnjenjem ali stiskanjem zmeljejo) ter vsadki in zdra- vilni obliži (4, 8, 12). 4 TKIVNO INžENIRSTVO Tkivno inženirstvo je del regenerativne medicine, ki celicam zagotavlja umetno zunajcelično ogrodje (scaffold). Omo- goča pritrjevanje, naseljevanje, diferenciacijo, rast in ra- zmnoževanje celic. Tako pripravljen tkivni nadomestek pre- nesemo na poškodovano tkivo, kjer spodbuja njegovo obnovo. Tkivni nadomestek sestavljajo ogrodje iz polimer- nih nanovlaken, tkivno specifične celice in rastni dejavniki ali učinkovine (9). Za izdelavo takšnih nanovlaken pogosto uporabljamo naravno pridobljene polimere zaradi dobre tkivne biokompatibilnosti, podobnosti z zunajceličnim ogrodjem in možnostjo pristnih interakcij s celicami (6). Tudi sintezne polimere lah ko zasnujemo tako, da posne- majo zunajcelično ogrodje in dostavijo ter sproščajo rastne dejavnike in sorodne spojine kot odziv na fiziološke signale. S tem posnemajo naravni proces celjenja, spodbujanja obnove tkiva in zmanjšujejo brazgotinjenje. Tkivni nado- mestki služijo kot opora za razrast celic in obnovo tkiva. Nadomestki morajo posnemati specifične biokemijske, strukturne in meh anske lastnosti biološkega tkiva, a ne smejo povzročati negativnega imunskega odgovora (36, 37). Nanovlakna morajo zagotavljati podporo in spodbujati naseljevanje ter razmnoževanje celic toliko časa, dokler se tkivo ne obnovi. Poleg intrinzičnih lastnosti nanovlaken pa lah ko obnovo tkiva izboljšamo z vgrajevanjem rastnih de- javnikov v nanovlakna, ki spodbujajo deljenje celic in njih ovo naseljevanje na območje poškodbe (38). Z vidika odstra- nitve tkivnega nadomestka z mesta obnove tkiva je pri na- črtovanju zelo pomembno, da se h itrost razgradnje na- novlaken ujema s h itrostjo obnove tkiva (39). Raziskave kažejo boljše rezultate tkivnih nadomestkov iz naravnih materialov (40). Na možnost infiltracije celic in njih ovo ra- zrast imata velik vpliv debelina nanovlaken in velikost por, zato je priprava tridimenzionalne zgradbe podpornega ogrodja zelo pomembna. S pripravo slednjega z elektro- statskim sukanjem lah ko dosežemo primerne strukturne lastnosti in h krati nadzorovano sproščanje vgrajene učin- kovine. Nanovlakna kot tkivni nadomestki so v obliki razli- čno velikih poroznih membran ali vsadkov in služijo kot podlaga za gojenje tkivnih celic in omogočajo njih ov prenos z gojišča v kliniko in samo aplikacijo (41, 42). 4.1 KOžA IN CELJENJE RAN Tkivni nadomestki sodelujejo pri celjenju ran in nadomeš- čajo fiziološke funkcije kože. Omogočati morajo dostop kisika ter spodbujati keratinocite k naseljevanju in razmno- ževanju ter strukturiranju posameznih kožnih plasti. Po drugi strani pa imajo tudi zaščitno vlogo, saj preprečujejo vdor mikroorganizmov v poškodovano tkivo. Glavne celice, ki sodelujejo pri obnovi kože, so keratinociti. Na membrano naselimo keratinocite, ki se pritrdijo in razmnožujejo na na- novlaknih . Če tkivni nadomestek s keratinociti dodamo na poškodovani del kože, ti pospešijo njeno obnovo s sproš- čanjem rastnih dejavnikov. Podporna membrana iz nanov- laken keratinocitom nudi tudi ustrezno zaščito pred zuna- njim okoljem. Polimeri, ki jih uporabljamo za izdelavo kožnih tkivnih nadomestkov na osnovi nanovlaken, so poliuretani, kopolimer mlečne in glikolne kisline in derivati ter polika- prolakton (6, 9, 38, 43). 4.2 PODPORNA MEMBRANA žILNE STENE žile so sestavljene iz več tkivnih plasti. Takšni morajo biti tudi žilni nadomestki na osnovi nanovlaken, saj želimo, da je obnovljena žila primerljiva ostalim. Poleg strukturne pod- obnosti z žilno steno mora žilni nadomestek vzdržati tudi pulziranje krvnega tlaka zaradi bitja srca. Sh ema izdelave podporne membrane žilne stene je prikazana na sliki 6. Podporna membrana iz nanovlaken za žilno steno je se- stavljena iz več plasti, ki vključujejo različne kombinacije polimerov glede na funkcijo plasti: protein svile fibroin, že- latino, kolagen, polikaprolakton, polimlečno kislino in po- liuretane (9, 43). 4.3 DRUGE MOžNOSTI UPORABE Nanovlakna uporabljamo tudi za obnovo in delno nado- mestitev funkcije v kostnem tkivu, h rustancu, ligamentih , tetivah in za gojenje perifernih nevronov. Za nadomestitev oporne funkcije kostnega tkiva morajo imeti tkivni nado- mestki ustrezno meh ansko trdnost, kar bolnikom omogoča 186 NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO farm vestn 2021; 72 187 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI povrnitev fiziološke funkcije. Glavne celice za obnovo kost- nega tkiva so osteoblasti in h ondrociti, ki jih nasadimo na podporno ogrodje iz nanovlaken. Ogrodje mora omogočati infiltracijo h ondrocitov in osteoblastov, ki po določenem času nadomestijo organski del kostnine in spodbujajo kal- cifikacijo kosti (26, 41, 44). Za izdelavo kostnih vsadkov uporabljamo kombinacije biološko razgradljivih naravnih in sinteznih polimerov, najpogosteje polimlečno kislino, ko- polimer mlečne in glikolne kisline, polikaprolakton in kolagen (9). Nevronov trenutno še ne moremo nadomestiti z nanovlakni, lah ko pa izdelamo podlago za njih ovo rast in obnovo. Pod- laga iz nanovlaken mora omogočati rast celic v isto smer, kot so nevroni usmerjeni v perifernem živcu. Za to upora- bljamo vzporedno urejena nanovlakna iz polianilina in poli- kaprolaktona, izdelana z elektrostatskim sukanjem na zbi- ralo v obliki vrtečega valja. Za spodbujanje rasti vgradimo v nanovlakna nevrotrofične in rastne dejavnike glia celic, ki usmerjajo rast in pospešujejo delitev (9). Za obnovo h rustanca potrebujemo porozen, meh ansko stabilen vsadek, ki omogoča infiltracijo in pritrjevanje h on- drocitov (45). Za obnovo ligamentov in tetiv so potrebne podobne lastnosti, vendar je treba zagotoviti tudi vzporedno usmerjenost nanovlaken, ki zagotavlja dobro natezno trdnost. Nanovlakna iz polikaprolaktona, kolagena tipa 2 in h itosana ustrezajo lastnostim za obnovo navedenih tkiv (9). 5 POGLED V PRIHODNOST Kljub velikim prednostim, ki jih prinašajo nanovlakna, jih na evropskem in ameriškem trgu regulatorni organi še niso odobrili za uporabo v zdravilih . Prve materiale z nanovlakni je odobrila ameriška Agencija za h rano in zdravila (FDA) za zobne zalivke (46). Zaradi nanovelikosti so regulatorni or- gani previdni pri odobritvi nanomaterialov, saj ima vsak material nanovelikosti specifične lastnosti, zato je treba iz- vesti več biokompatibilnostnih raziskav kot za delce iz ena- kega materiala večjih velikosti. Sestava in teh nološki po- stopek odločilno vplivata na fizikalno-kemijske lastnosti nanovlaken in sproščanje učinkovine v primeru dostavnega sistema, poleg tega v primeru tkivnih nadomestkov tudi na strukturne in meh anske lastnosti. Razvoj in izdelava kompozitnih nanovlaken, ki temeljijo na združevanju razli- čnih polimerov, obetata zelo natančno prilagajanje lastnosti nanovlaken določenemu namenu uporabe in širita nabor dostavnih sistemov in tkivnih nadomestkov za zdravljenje raznih bolezni. Kljub velikemu znanstvenemu napredku na tem področju pa razvoj industrijske proizvodnje takšnih dostavnih sistemov le počasi napreduje. Potrebno je še več kliničnih raziskav in razvoj novih pristopov za izdelavo in vrednotenje dostavnih sistemov in vsadkov iz nanovla- ken. V bližnji prih odnosti pričakujemo uspešnejši prenos izsledkov iz raziskovalnih in razvojnih laboratorijev v proiz- vodnjo in klinično uporabo. 6 ZAHVALA Avtorji se zah valjujemo Javni agenciji za raziskovalno de- javnost RS za finančno podporo programa P1-0189 in projekta J1-9194. Slika 6: Prikaz izdelave podporne membrane za žilno steno; PDSM (polidimetilsiloksan). Figure 6: Illustrative scheme of preparation method for supportive tubular scaffold membrane; PDSM (polydimethylsiloxane). 7 LITERATURA 1. Barhoum A, Bechelany M, Makhlouf ASH. Handbook of Nanofibers: Springer International Publishing; 2019. 1170 p. 2. Rošic R, Pelipenko J, Kristl J, Kocbek P , Bešter-Rogač M, Baumgartner S. Physical characteristics of poly (vinyl alcohol) solutions in relation to electrospun nanofiber formation. Eur Polym J. 2013;49(2):290-8. 3. Barhoum A, Pal K, Rahier H, Uludag H, Kim IS, Bechelany M. Nanofibers as new-generation materials: From spinning and nano-spinning fabrication techniques to emerging applications. Appl Mater Today. 2019;17:1-35. 4. Pelipenko J, Kocbek P , Kristl J. Critical attributes of nanofibers: Preparation, drug loading, and tissue regeneration. Int J Pharm. 2015;484(1-2):57-74. 5. Szentivanyi A, Chakradeo T, Zernetsch H, Glasmacher B. Electrospun cellular microenvironments: Understanding controlled release and scaffold structure. Adv Drug Del Rev. 2011;63(4):209-20. 6. Pelipenko J, Kocbek P , Govedarica B, Rošic R, Baumgartner S, Kristl J. The topography of electrospun nanofibers and its impact on the growth and mobility of keratinocytes. Eur J Pharm Biopharm. 2013;84(2):401-11. 7. Wei Q, Tao D, Xu Y. Functional Nanofibers and Their Applications - 1. Nanofibers: Principles and Manufacture: Woodhead Publishing Limited; 2012. 1-21 p. 8. Kajdič S, Planinšek O, Gašperlin M, Kocbek P . Electrospun nanofibers for customized drug-delivery systems. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:672-81. 9. Rodriguez IA, McCool JM, Bowlin GL. Functional nanofibers for tissue engineering applications: Woodhead Publishing Limited; 2012. 171-96 p. 10. Zupančič Š, Casula L, Rijavec T, Lapanje A, Luštrik M, Fadda AM, et al. Sustained release of antimicrobials from double-layer nanofiber mats for local treatment of periodontal disease, evaluated using a new micro flow-through apparatus. Journal of Controlled Release. 2019;316:223-35. 11. Yu DG, Li JJ, Williams GR, Zhao M. Electrospun amorphous solid dispersions of poorly water-soluble drugs: A review. Journal of Controlled Release. 2018;292:91-110. 12. Casian T, Borbás E, Ilyés K, Démuth B, Farkas A, Rapi Z, et al. Electrospun amorphous solid dispersions of meloxicam: Influence of polymer type and downstream processing to orodispersible dosage forms. Int J Pharm. 2019;569:118593. 13. Farkas B, Balogh A, Cselkó R, Molnár K, Farkas A, Borbás E, et al. Corona alternating current electrospinning: A combined approach for increasing the productivity of electrospinning. Int J Pharm. 2019;561:219-27. 14. Rošic R, Pelipenko J, Kristl J, Kocbek P , Baumgartner S. Properties, engineering and applications of polymeric nanofibers: Current research and future advances. Chem Biochem Eng Q. 2012;26(4):417-25. 15. Mirtič J, Balažic H, Zupančič Š, Kristl J. Effect of solution composition variables on electrospun alginate nanofibers: Response surface analysis. Polymers. 2019;11(4). 16. Vass P , Szabó E, Domokos A, Hirsch E, Galata D, Farkas B, et al. Scale-up of electrospinning technology: Applications in the pharmaceutical industry. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2020;12(4):e1611. 17. Wei Q, Wei A. Functional nanofibers for drug delivery applications: Woodhead Publishing Limited; 2012. 153-70 p. 18. Zupančič Š, Sinha-Ray S, Sinha-Ray S, Kristl J, Yarin AL. Controlled Release of Ciprofloxacin from Core-Shell Nanofibers with Monolithic or Blended Core. Mol Pharm. 2016;13(4):1393- 404. 19. He P , Zhong Q, Ge Y, Guo Z, Tian J, Zhou Y, et al. Dual drug loaded coaxial electrospun PLGA/PVP fiber for guided tissue regeneration under control of infection. Mater Sci Eng, C. 2018;90:549-56. 20. Song W, Seta J, Chen L, Bergum C, Zhou Z, Kanneganti P , et al. Doxycycline-loaded coaxial nanofiber coating of titanium implants enhances osseointegration and inhibits Staphylococcus aureus infection. Biomed Mater. 2017;12(4):045008. 21. Laha A, Sharma CS, Majumdar S. Sustained drug release from multi-layered sequentially crosslinked electrospun gelatin nanofiber mesh. Mater Sci Eng, C. 2017;76:782-6. 22. Krstić M, Radojević M, Stojanović D, Radojević V, Uskoković P , Ibrić S. Formulation and characterization of nanofibers and films with carvedilol prepared by electrospinning and solution casting method. Eur J Pharm Sci. 2017;101:160-6. 23. Nam S, Lee J-J, Lee SY, Jeong JY, Kang W-S, Cho H-J. Angelica gigas Nakai extract-loaded fast-dissolving nanofiber based on poly(vinyl alcohol) and Soluplus for oral cancer therapy. Int J Pharm. 2017;526(1):225-34. 24. Poller B, Strachan C, Broadbent R, Walker GF. A minitablet formulation made from electrospun nanofibers. Eur J Pharm Biopharm. 2017;114:213-20. 25. Lancina MG, 3rd, Shankar RK, Yang H. Chitosan nanofibers for transbuccal insulin delivery. J Biomed Mater Res A. 2017;105(5):1252-9. 26. Singh YP , Dasgupta S, Nayar S, Bhaskar R. Optimization of electrospinning process & parameters for producing defect-free chitosan/polyethylene oxide nanofibers for bone tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2020;31(6):781-803. 27. Sebe I, Szabó B, Nagy ZK, Szabó D, Zsidai L, Kocsis B, et al. Polymer structure and antimicrobial activity of polyvinylpyrrolidone-based iodine nanofibers prepared with high-speed rotary spinning technique. Int J Pharm. 2013;458(1):99-103. 28. Potrč T, Baumgartner S, Roškar R, Planinšek O, Lavrič Z, Kristl J, et al. Electrospun polycaprolactone nanofibers as a potential oromucosal delivery system for poorly water-soluble drugs. Eur J Pharm Sci. 2015;75:101-13. 29. Meng J, Agrahari V, Ezoulin MJ, Zhang C, Purohit SS, Molteni A, et al. Tenofovir Containing Thiolated Chitosan Core/Shell Nanofibers: In Vitro and in Vivo Evaluations. Mol Pharm. 2016;13(12):4129-40. 30. Hai T, Wan X, Yu D-G, Wang K, Yang Y, Liu Z-P . Electrospun lipid-coated medicated nanocomposites for an improved drug sustained-release profile. Mater Des. 2019;162:70-9. 31. Kuang G, Zhang Z, Liu S, Zhou D, Lu X, Jing X, et al. Biphasic drug release from electrospun polyblend nanofibers for optimized local cancer treatment. Biomaterials Science. 2018;6(2):324-31. 32. Elashnikov R, Slepička P , Rimpelova S, Ulbrich P , Švorčík V, Lyutakov O. Temperature-responsive PLLA/PNIPAM nanofibers for switchable release. Mater Sci Eng, C. 2017;72:293-300. 33. Akhgari A, Heshmati Z, Afrasiabi Garekani H, Sadeghi F, Sabbagh A, Sharif Makhmalzadeh B, et al. Indomethacin electrospun nanofibers for colonic drug delivery: In vitro dissolution studies. Colloids Surf B Biointerfaces. 2017;152:29- 35. 188 NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UČINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO farm vestn 2021; 72 189 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI 34. Zupančič Š, Rijavec T, Lapanje A, Petelin M, Kristl J, Kocbek P . Nanofibers with Incorporated Autochthonous Bacteria as Potential Probiotics for Local Treatment of Periodontal Disease. Biomacromolecules. 2018;19(11):4299-306. 35. Zupančič Š, Baumgartner S, Lavrič Z, Petelin M, Kristl J. Local delivery of resveratrol using polycaprolactone nanofibers for treatment of periodontal disease. J Drug Deliv Sci Technol. 2015;30:408-16. 36. Da Silva GR, Lima TH, Fernandes-Cunha GM, Oréfice RL, Da Silva-Cunha A, Zhao M, et al. Ocular biocompatibility of dexamethasone acetate loaded poly(ε-caprolactone) nanofibers. Eur J Pharm Biopharm. 2019;142:20-30. 37. Balusamy B, Senthamizhan A, Uyar T. 6 - In vivo safety evaluations of electrospun nanofibers for biomedical applications. In: Uyar T, Kny E, editors. Electrospun Materials for Tissue Engineering and Biomedical Applications: Woodhead Publishing; 2017. p. 101-13. 38. Bertoncelj V, Pelipenko J, Kristl J, Jeras M, Cukjati M, Kocbek P . Development and bioevaluation of nanofibers with blood- derived growth factors for dermal wound healing. Eur J Pharm Biopharm. 2014;88(1):64-74. 39. Pelipenko J, Kocbek P , Kristl J. Nanofiber diameter as a critical parameter affecting skin cell response. Eur J Pharm Sci. 2015;66:29-35. 40. Huang S, Fu X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. J Control Release. 2010;142(2):149-59. 41. R Z, P .X M. Poly(alpha-hydroxyl acids)/hydroxyapatite porous composites for bone-tissue engineering. I. Preparation and morphology. J Biomed Mater Res. 1999;44:446-55. 42. Janković B, Pelipenko J, Škarabot M, Muševič I, Kristl J. The design trend in tissue-engineering scaffolds based on nanomechanical properties of individual electrospun nanofibers. Int J Pharm. 2013;455(1-2):338-47. 43. Al-Enizi AM, Zagho MM, Elzatahry AA. Polymer-based electrospun nanofibers for biomedical applications. Nanomaterials. 2018;8(4):1-22. 44. De Witte TM, Fratila-Apachitei LE, Zadpoor AA, Peppas NA. Bone tissue engineering via growth factor delivery: from scaffolds to complex matrices. Regen Biomater. 2018;5(4):197- 211. 45. Fu L, Yang Z, Gao C, Li H, Yuan Z, Wang F, et al. Advances and prospects in biomimetic multilayered scaffolds for articular cartilage regeneration. Regenerative Biomaterials. 2020;7(6):527-42. 46. Gawel R. FDA Approves Nanofiber Flowable Composite 2015 [cited 2020 28.12.2020]. Available from: https://www.dentistrytoday.com/news/industrynews/item/477- fda-approves-nanofiber-flowable-composite.