Tina Levstek1, Taja Železnik Ramuta2, Mateja Erdani Kreft3 Organoidi ledvic in njihova uporaba v medicini Kidney Organoids and Their Applications in Medicine IZvLEČEK KLJUČNE BESEDE: organoidi, ledvice, matične celice, bioinženiring, personalizirana medicina Terapevtske možnosti pri končni odpovedi ledvic so zelo omejene, zato je težnja po razu- mevanju bolezenskih procesov v ledvicah, ki vodijo v slabšanje ledvične funkcije, zelo veli- ka. Razumevanje teh procesov bi namreč omogočilo razvoj novih terapevtskih pristopov za preprečevanje razvoja ali upočasnitev napredovanja ledvične disfunkcije. V zadnjem deset- letju je prišlo do velikega napredka v razumevanju celično-bioloških procesov med embrio- nalnim razvojem ledvic pri človeku, čemur je sledil tudi razvoj organoidov ledvic, ki sodijo med kompleksne modele in vitro. V organoidih se celice samoorganizirajo v strukture s kom- pleksno zgradbo, ki posnema zgradbo ledvic in vivo. Kljub trenutnim omejitvam organoidov ledvic, kot sta njihova slaba ožiljenost in velika variabilnost, so potenciali njihove upo- rabe v medicini številni. Organoidi ledvic že omogočajo proučevanje razvoja ledvic in dolo- čenih bolezenskih procesov, testiranje nefrotoksičnosti in preizkušanje zdravil, kar povečuje njihovo možnost uporabe v personalizirani in regenerativni medicini. abSTracT KEY WORDS: organoids, kidneys, stem cells, bioengineering, personalized medicine When kidney dysfunction progresses to end-stage kidney disease, therapeutic options are very limited. Therefore, understanding the biological processes in the kidneys that lead to the deterioration of kidney function is very important, because it could allow the development of new therapeutic approaches to prevent the development of kidney dys- function or slow its progression. In the last decade, considerable progress has been made in understanding the cellular biological processes during embryonic kidney development in humans, followed by the development of kidney organoids, which are complex in vitro models. In organoids, cells self-organize into formations with a complex structure that mimics the kidney structure in vivo. Despite the current limitations of kidney organoids, such as lack of vascularity and high variability, the possibilities for their use in medici- ne are numerous. Kidney organoids already enable the study of kidney development and certain disease processes, nephrotoxicity testing, and drug screening, which increases their potential for use in personalized and regenerative medicine. 1 Asist. Tina Levstek, mag. lab. biomed., Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; tina.levstek@mf.uni-lj.si 2 Asist. dr. Taja Železnik Ramuta, mag. mikrobiol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 3 Prof. dr. Mateja Erdani Kreft, univ. dipl. biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 501Med Razgl. 2022; 61 (4): 501–12 • Pregledni članek mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 501 UvOd Ledvice so kompleksen organ, ki sodeluje pri uravnavanju volumna in osmolarnosti telesnih tekočin, uravnavanju acido-baznega ravnovesja, odstranjevanju pre snovnih pro- duktov in tujih snovi ter pri sintezi in izlo- čanju nekaterih hormonov. Funkcionalne enote ledvic so nefroni, ki jih je v zdravi led- vici približno milijon (1). Zaradi slabe rege- nerativne sposobnosti ledvic se s staranjem število nefronov zmanjšuje. Poleg tega lahko pride do propada nefronov zaradi patoloških procesov, kot so sladkorna bole- zen, hipertenzija in srčno-žilne bolezni, redkeje pa tudi zaradi prirojenih okvar led- vic, genetskih bolezni ter vnetja ledvic. Končna odpoved ledvic ima velik vpliv na kakovost življenja bolnikov in je povezana z zgodnejšo umrljivostjo (2). Razumevanje patofizioloških procesov, udeleženih v razvoju in napredovanju led- vičnih bolezni, je zato izredno pomembno za preprečevanje ledvične okvare, upočas- njevanje njenega napredovanja in tudi raz- voj novih terapevtskih možnosti. V ta namen so bile do sedaj izvedene številne temeljne in translacijske raziskave na področju embrionalnega razvoja ledvic, fizioloških ter patofizioloških procesov v ledvicah, ugo- tavljanja nefrotoksičnosti in regenerativ ne sposobnosti ledvic. Tradicionalni pristopi raziskav temeljijo na uporabi živalskih modelov (modeli in vivo) in celičnih kultur, npr. izoliranih primarnih ledvičnih celic oz. nesmrtnih celičnih linij (modeli in vitro) (3). Oba pristopa imata svoje slabosti, ki ome- jujejo prenos znanja v klinično okolje. Uporaba živalskih modelov je običajno zelo draga in dolgotrajna, poleg tega je nepo- sreden prenos znanja v kliniko zaradi razlik v primerjavi s človekom omejen. Pri upo- rabi celičnih kultur pa se običajno omejimo le na en celični tip, pri čemer se zanemari povezave med različnimi tipi celic ter z zunaj- celičnim matriksom, ki so prisotne v raz- merah in vivo in so zelo pomembne tako pri fizioloških kot patofizioloških procesih (3). V zadnjih letih je prišlo do razvoja šte- vilnih tridimenzionalnih (3D) modelov in vitro, ki predstavljajo velik potencial za tran- slacijsko medicino. Med najpogosteje upo- rabljene 3D-modele in vitro sodijo organi na čipih (angl. organ-on-a-chip), 3D-kulture ali kokulture na bioloških (npr. kolagen, matrigel, želatina) ali sintetičnih nosilcih (npr. polietilen glikol, polilaktična kislina), sferoidi in organoidi. Vsak izmed naštetih modelov ima svoje prednosti in slabosti, zato je izbira 3D-modela in vitro odvisna predvsem od predvidenega namena nje- gove uporabe (4). V nadaljevanju prispevka se podrobneje osredotočamo na organoide. Vir celic za organoide so matične celice. V eksperimentalne namene se uporabljajo celične linije embrionalnih matičnih celic (EMC), ki se jih vse pogosteje nadomešča s tkivnimi matičnimi celicami ali induci- ranimi pluripotentnimi matičnimi celica- mi (iPMC). Tkivne matične celice in iPMC so izolirane oz. pridobljene iz tkiv, izolira- nih iz odraslega posameznika. iPMC je z ustreznim protokolom mogoče pripravi- ti iz praktično katere koli somatske celice. Tako je mogoče uporabiti tudi odluščene celice sečil, ki jih lahko popolnoma ne - invazivno pridobimo iz urina, glavno teža- vo pa predstavlja nizka uspešnost priprave iPMC (5). V specifičnih razmerah in vitro se matične celice samoorganizirajo v skupek različnih tipov celic, ki posnema zastopa- nost posameznih tipov celic ter in vivo raz- vojni proces posameznega organa (6). EmbrIONaLNI raZvOJ LEdvIc PrI ČLOvEKU Predpogoj za pripravo organoidov je dobro razumevanje embrionalnega razvoja posa- meznega organa. Nastanek ledvic pri člo- veku je zelo kompleksen, saj so v njihov razvoj vpletene številne signalne poti, ki so časovno in prostorsko ločene. Ledvice se razvijejo iz mezoderma. Med organogene- zo iz intermediarnega mezoderma (IM) nastanejo tri strukture izločal, in sicer pro- 502 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 502 nefros, mezonefros in metanefros. Pronefros je nedelujoč sistem sečil, ki kmalu degene- rira. Od njega ostanejo le pronefrična izvo- dila, ki omogočijo nastanek mezonefrosa. Mezonefrični ledvici sta sestavljeni iz glo- merulov in mezonefričnih tubulov ter propadeta proti koncu prvega trimesečja. Metanefrični ledvici nastaneta v petem tednu embrionalnega razvoja in se razvijeta v stalni ledvici (7, 8). Metanefros nastane zaradi medseboj- nih vplivov metanefričnega mezenhima (MM), ki izvira iz posteriornega inter - mediarnega mezoderma (pIM), in uretro- vega brstiča, ki izvira iz anteriornega inter- mediarnega mezoderma (aIM) (9). MM je sestavljen iz stromalnih, endotelijskih in nefronskih progenitornih celic (NPC), iz katerih nastanejo stroma, krvne žile in nefroni (10). Po gastrulaciji signaliziranje transformirajočega rastnega dejavnika β (angl. transforming growth factor ß, TGF-β) in fibroblastnega rastnega dejavnika (angl. fibroblast growth factor, FGF) omogoči nastanek in ohranjanje niše NPC (11, 12). Uretrov brstič nastane iz Wolffovega voda in se preplete s stromalnimi, endotelijski- mi in nefronskimi progenitornimi celica- mi ter tako tvori razvejan zbiralni sistem ledvic. Za nastanek aIM je potrebno signa- liziranje retinojske kisline, za razvoj ure- trovega brstiča med gastrulacijo pa je klju- čno kratkotrajno signaliziranje beljakovine Wnt (angl. wingless-related integration site) in srednje dolgo signaliziranje kostne morfo - genetične beljakovine 4 (angl. bone morp- hogenetic protein, BMP4) (13–15). Razvoj krvnih žil v ledvicah poteka sočasno z raz- vojem ledvic z dvema glavnima mehaniz- moma: vaskulogenezo in angiogenezo. Krvne žile nastanejo de novo z diferenci acijo endotelijskih progenitorskih celic (16). Za dokončen razvoj ledvic pri človeku je izredno pomembna tudi t. i. vzajemna indukcija med MM in uretrovim brstičem. Signaliziranje uretrovega brstiča je namreč pomembno za nastanek nefronskih struk- tur, medtem ko signaliziranje MM omogoča razvoj posameznih uretrovih brstičev, nji- hovo brstenje in razvejanje (17–20). PrIPrava OrGaNOIdOv LEdvIc Pomanjkljivo razumevanje razvoja ledvic pri človeku je še do nedavnega omejevalo pri- pravo organoidov ledvic. Ledvice odrasle- ga so sestavljene iz nefronov. Vsak nefron je zgrajen iz glomerula, proksimalnega tubula, Henlejeve zanke in distalnega tubu- la ter se na koncu zliva v zbiralce. Zbiralca zbirajo urin iz tubulov in ga izločajo skozi ledvični meh v sečevod (1). Odkritje, da je razvoj zbiralc tako časovno kot prostorsko ločen od razvoja preostanka nefrona, je omogočilo razvijanje protokolov za pri- pravo organoidov ledvic, ki posnemajo raz- voj ledvic in vivo, kot je prikazano na sliki 1. Prvi protokol za pripravo organoidov ledvic je bil objavljen leta 2014, ko je bilo dokazano, da je eden izmed ključnih dejav- nikov za različen nastanek struktur iz pIM in aIM različno dolgo tretiranje s CHIR99021, agonistom Wnt (21). Signalne poti Wnt so evolucijsko močno ohranjene in igrajo pomembno vlogo v zgodnjem razvoju nefro- nov (22). V naslednjem letu so bili objavljeni še trije protokoli za pripravo organoidov ledvic, s katerimi so z natančno določeno koncentracijo različnih transkripcijskih dejavnikov in časovnim sosledjem njiho- vega dodajanja pripravili organoide ledvic iz človeških iPMC (23–25). Primerjava tran- skriptomov posameznih celic iz organoidov ledvic je pokazala, da je bilo prisotnih naj- manj 12 različnih tipov ledvičnih celic, ki so tvorile nefronske strukture, ne pa tudi zbiralc. Poleg ledvičnih celic so organoidi ledvic vsebovali tudi različen delež celic drugega izvora, kot so živčne celice, miši- čne celice in melanociti. To kaže na težav- nost natančnega nadzorovanja diferenci - acije celic, saj je torej v organoidu prišlo tudi do diferenciacije v celične tipe, ki jih sicer v ledvicah ne najdemo. Organoidi ledvic so bili morfološko nezreli, saj so bili bolj 503Med Razgl. 2022; 61 (4): mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 503 po dobni fetalnim kot odraslim ledvicam, čeprav so izražali tudi nekaj označevalcev končne diferenciacije (26). V naslednjih letih je bilo objavljenih še več protokolov, ki temeljijo na diferenciaciji človeških iPMC preko primitivne proge, pIM in MM do nastanka struktur nefrona v 3D-obliki (27–29). Kljub različnim pristopom, ki so jih upora- bili raziskovalci, so stične točke protokolov za pripravo organoidov ledvic z nefronskimi strukturami (30): • podaljšano signaliziranje Wnt za induk- cijo pIM, • natančno regulirana aktivnost BMP4 za posnemanje IM, • dodatek fibroblastnega rastnega dejavnika 9 (angl. fibroblast growth factor 9, FGF9) za nastanek in ohranjanje niše NPC v MM in • dodatek aktivina A za nastanek pIM. Leto 2015 je bilo prelomno pri pripravi organoidov ledvic z nefronskimi struktu- rami, medtem ko je bil prvi protokol, ki je omogočal pripravo organoidov ledvic s strukturami uretrovega brstiča, objavljen šele leta 2017 (31). Prisotnost MM in ure- trovega brstiča je namreč ključna, saj vza- jemna indukcija med njima prispeva k dokončnemu razvoju ledvic in vivo. Protokol, ki je omogočal razvoj MM in uretrovega brstiča iz mišjih EMC, so razvili s pomočjo analize izražanja genov med razvojem uretrovega brstiča pri mišjih zarodkih. V naslednjih letih so bili objavljeni različni protokoli, ki omogočajo nastanek uretrovih brstičev z nastankom primitiv ne proge, aIM in predhodnikov Wolffovega voda (32–34). Skupne točke protokolov za pripravo organoidov ledvic s strukturami uretrovega brstiča so kratka aktivacija signalne poti Wnt za indukcijo aIM, pos- nemanje signaliziranja aIM z dodatkom retinojske kisline in agonistov Wnt in odsotnost aktivina A, ki spodbuja nastanek pIM (30). Pomanjkljivost teh protokolov je, da zaradi prostorsko in časovno ločenega nastanka MM in uretrovega brstiča ne pride do njune vzajemne indukcije, kar omejuje diferenciacijo organoida. Posledično bo ver- jetno optimalen protokol za pripravo orga- noidov ledvic z nefronskimi strukturami in strukturami uretrovega brstiča moral vsebovati ločeno indukcijo človeških pluri - potentnih matičnih celic (PMC) v MM in uretrov brstič, za dokončen razvoj orga- noidov pa bo potrebna še njuna kokultura, 504 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … ledvica glomerul distalni tubul zbiralce Henlejeva zanka distalni tubul zbiralce proksimalni tubul glomerul pripravljen iz embrionalnih matičnih celic ali iz induciranih pluripotentnih matičnih celic organoid ledvic proksimalni tubul Slika 1. Organoidi ledvic posnemajo razvoj in zgradbo ledvic in vivo. Shema je bila narejena s spletnim orodjem BioRender.com. mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 504 da se omogoči medsebojno signaliziranje med MM in uretrovim brstičem (3). Izbira protokola za pripravo organoidov ledvic je odvisna predvsem od predvidenega name- na njihove uporabe (30). UPOraba OrGaNOIdOv LEdvIc v mEdIcINI Organoidi ledvic omogočajo posnemanje okolja in vivo v razmerah in vitro, zato imajo v medicini številne možne aplikacije, ki so prikazane na sliki 2 in natančneje opisane v nadaljevanju. Proučevanje ledvičnih bolezni Organoidi ledvic imajo zelo velik potencial pri modeliranju bolezni, predvsem zaradi odkritja protokola dediferenciacije somat- skih celic v iPMC, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v katero koli celico v tele- su (35). Z uporabo somatskih celic bolnika, ki jih dediferenciramo v iPMC, je možno pri- praviti organoide, ki posnemajo določeno bolezensko stanje in s tem omogočajo razi- skovanje patofizioloških procesov, ki pri- vedejo do zmanjšanja ledvične funkcije ali celo končne odpovedi ledvic. Ker dosegajo do sedaj razviti organoidi ledvic stopnjo zgodnjega razvoja ledvic, so bili uporablje- ni predvsem za proučevanje prirojenih bolezni ledvic (34, 36, 37). Z organoidi ledvic je možno tudi prou- čevanje genetskih bolezni, ki prizadenejo ledvice. Z vnašanjem genskih popravkov s tehnologijo kratkih ponavljajočih se palin- dromskih zaporedij in beljakovine Cas (angl. clustered regularly interspaced short palin- dromic repeats/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas) lahko ugotavljamo vlogo posa- meznih genetskih različic pri razvoju bole- zni, prav tako je možno tudi popravljanje genetskih napak. Tako je bilo kar nekaj razi- skav izvedenih na področju policistične ledvične bolezni, ki je ena najpogostejših prirojenih ledvičnih bolezni. To avtosomno dominantno bolezen, ki je posledica bole- zenskih sprememb v genih PDK1 ali PDK2, ima namreč do 10 % bolnikov s končno odpovedjo ledvic. S pomočjo organoidov led- vic so uspešno pripravili model policistične 505Med Razgl. 2022; 61 (4): uporaba organoidov ledvic v medicini personalizirana medicina regenerativna medicina proučevanje bolezenskih procesov ugotavljanje nefrotoksičnosti in preizkušanje zdravilnih učinkovin Slika 2. Raznolike možnosti uporabe organoidov ledvic v medicini. Shema je bila narejena s spletnim orodjem BioRender.com. mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 505 bolezni in tudi proučevali cistogenezo (24, 38, 39). Ugotovili so, da spreminjanje sesta- ve zunajceličnega matriksa lahko pomem- bno zveča oz. zmanjša nastanek cist, in s tem dokazali njegov pomen pri nastanku poli- cistične ledvične bolezni. Poleg tega so dokazali tudi velik vpliv signaliziranja cAMP, saj so po dodatku njegovega agonista ugo- tovili povečanje organoidov ledvic in pove- čano cistogenezo, po njegovi odstranitvi pa so se organoidi zmanjšali. To bi lahko vpli- valo na razvoj novih terapevtskih pristopov za zdravljenje policistične ledvične bolezni (39). Organoidi ledvic so uporabni tudi pri proučevanju sprememb neznanega pome- na (angl. variant of unknown significance), ki običajno predstavljajo velik izziv v kliniki, saj njihov vpliv na razvoj oz. napredovanje bolezni še ni znan. Odločitev o vodenju bol- nikov in njihovem morebitnem zdravljenju je zato pogosto težavna. Organoidi ledvic bi tako omogočili boljše razumevanje vpli- va teh genetskih sprememb na fenotip, kar bi olajšalo predvidevanja o poteku in optimiziralo zdravljenje bolezni (40). Proučevanje redkih bolezni je običaj- no zelo omejeno zaradi majhnega števila bolnikov, zato bi z organoidi ledvic lahko pomembno izboljšali tudi razumevanje pato- fizioloških procesov pri redkih boleznih. Tako so s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas že pripravili organoide ledvic s prisotno bolezensko spremembo v genu za α-galak- tozidazo (angl. α-galactosidase, GLA) in s tem poustvarili Fabryjevo bolezen. Tako kot v ledvicah bolnikov s Fabryjevo boleznijo so tudi v organoidih ledvic zaznali poškodbe podocitov in epitelijskih celic tubulov ter kopičenje globotriaozilceramida (Gb3). Ugotovili so tudi povečan oksidativni stres in povečano apoptozo. Z encimskim nado- mestnim zdravljenjem se je oksidativni stres in kopičenje Gb3 zmanjšalo, poleg tega je pri- šlo tudi do omilitve ledvičnih poškodb (41). Zmanjšanje ledvične funkcije vodi tudi v okrnjeno izločanje ledvičnih hormonov. Zaradi pomanjkanja ustreznih modelov je raziskovanje endokrine funkcije ledvic zelo oteženo, pri čemer bi lahko bili v pomoč organoidi ledvic. Dokazano je namreč bilo, da imajo organoidi ledvic endokrino funk- cijo, saj izločajo eritropoetin in renin (42, 43). Izločanje renina so spodbudili z dodat- kom forskolina, ki aktivira delovanje cAMP, ali s stimulacijo organoidov s paratiroidnim hormonom. V organoidih ledvic so bili pri- sotni tudi številni receptorji renin-angio- tenzinskega sistema (42). Izločanje eritro- poetina so zaznali samo v hipoksičnih razmerah pri organoidih, ki so bili priprav - ljeni iz prve pasaže celic. Zakaj pri orga- noidih ledvic, pripravljenih iz celic druge ali višje pasaže, ne pride do sinteze in izlo- čanja eritropoetina, še ni znano (43). V orga- noidih ledvic poteka tudi prevzem in pres- nova neaktivne oblike vitamina D3 v aktivno obliko, kar so dokazali z merjenjem izraža- nja genov, ki sodelujejo v teh procesih (44). Organoidi ledvic so zato primerni za razi- skovanje hormonske disfunkcije kot tudi za razvoj novih terapij, ki bi uravnavale endo- krino delovanje ledvic, v prihodnosti pa bi z njimi lahko tudi nadomestili endokrino funkcijo okvarjenih ledvic. Ugotavljanje nefrotoksičnosti in preizkušanje zdravilnih učinkovin Nefrotoksičnost je hitro poslabšanje led- vične funkcije zaradi toksičnega učinka zdravil ali kemikalij, ki jih imenujemo nefrotoksini. Organoidi ledvic omogočajo modeliranje akutne ledvične poškodbe zaradi nefrotoksinov in s tem ugotavljanje nefrotoksičnosti posameznih spojin. Do sedaj so bili pripravljeni različni modeli poškodb epitelijskih celic ledvičnih tubu- lov in modeli poškodb podocitov, ki omo- gočajo proučevanje procesov, ki potekajo po izpostavitvi nefrotoksinom, in vpliv odmer- ka nefrotoksinov na poškodbe ledvic (24, 25, 45, 46). Poleg ugotavljanja nefrotoksično- sti imajo organoidi ledvic tudi potencial pri odkrivanju novih označevalcev ledvičnih poškodb, saj so trenutni označevalci nespe- 506 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 506 cifični in pozni kazalci poškodb ledvic. Pozen začetek zdravljenja zmanjšuje nje- govo učinkovitost in je povezan z dodatni- mi zapleti (47). Poleg ugotavljanja nefrotoksičnosti so organoidi ledvic uporabni tudi pri pre - izkušanju zdravilnih učinkovin, saj je z upo- rabo celičnih linij in živalskih modelov težko natančno predvideti njihov učinek pri človeku. Zato bi lahko organoidi ledvic služili kot presejalna metoda pred upora- bo zdravil v predkliničnih in kliničnih testi- ranjih. Razvit je bil tudi že visokozmogljiv sistem, ki bi omogočil hitro presejanje velikega števila različnih potencialnih zdra- vil in tudi toksinov na mikrotitrskih plo- ščicah s 96 ali 384 vdolbinicami. Za pripravo organoidov ledvic so uporabili 21-dnevni protokol. V vsaki vdolbinici je bilo pribli- žno pet organoidov, poleg tega je uporaba robotov za pipetiranje omogočila popol- noma avtomatiziran proces od nasaditve celic, njihove diferenciacije do končne ana- lize organoidov (38). Personalizirana medicina Namen personalizirane medicine je bolni- ku prilagojeno zdravljenje in izboljšanje izidov zdravljenja. V zadnjem desetletju je personalizirana medicina doživela velik napredek, poleg tega pridobiva vse večji ugled in velja za prihodnost medicine (48). Ker je mogoče organoide ledvic pripraviti tudi iz bolnikovih iPMC, bi lahko v pri- hodnosti imeli pomembno vlogo v perso- nalizirani medicini. Organoidi ledvic, pripravljeni iz iPMC bolnika, namreč omo- gočajo testiranje posameznih spojin ali različnih kombinacij in s tem ugotavljanje njihove učinkovitosti oz. toksičnosti pri posameznem bolniku (3). Organoidi ledvic, pridobljeni iz celic urina bolnikov s cisti- čno fibrozo, se lahko uporabijo za merjenje funkcije transmembranskega regulatorja prevodnosti cistične fibroze (angl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) z znojnim testom s forskolinom, s čimer identificiramo posameznike, ki jih lahko zdravimo z modulatorji CFTR (49). Po drugi strani je za tumorska obolenja zna- čilna izjemna celična heterogenost na ravni molekularne sestave, celične funkcije in občutljivosti na zdravljenje. Prav celična heterogenost lahko vodi v odpornost na zdravljenje in posledično manjšo učinko- vitost zdravljenja. Dandanes je naše razu- mevanje odpornosti in odziv tumorjev na zdravljenje omejeno na raziskave na člo- veških rakavih celičnih linijah, ki ne pos- nemajo heterogenosti tumorjev, s čimer je omejen tudi razvoj novih zdravil (50). Organoidi levic zato ponujajo nov pristop pri odločanju o zdravljenju. Grassi in sode- lavci so pripravili organoide ledvic iz vzor- cev tkiva karcinoma ledvičnih celic in ujemajočih sosednjih zdravih tkiv ter jih uporabili za testiranje različnih zdravil, ki učinkujejo z zaviranjem več različnih tipov kinaz. Uporabili so različne odmerke razli- čnih zdravil in po zdravljenju spremljali raven mRNA, da so ovrednotili toksičnost in učinkovitost zdravljenja (51). Poleg tega organoidi s specifičnim genotipom omo- gočajo tudi raziskovanje molekularnih pro- cesov, ki pomembno prispevajo k raznoliki klinični sliki bolnikov z isto boleznijo (52). regenerativna medicina Terapevtske možnosti pri končni odpove- di ledvic so zelo omejene, saj sta bolnikom na voljo le dializa ali presaditev ledvic. Dializa je povezana s številnimi zapleti in zgodnjo umrljivostjo, pri presaditvi ledvic pa je dolgoročni uspeh za zdaj tudi še dokaj omejen, poleg tega pa velik izziv predstav - lja pomanjkanje darovalcev organov (53). Zato imajo organoidi ledvic velik potencial tudi v regenerativni medicini kot možni nadomestki okvarjenih ledvic (54). V teoriji bi z organoidi ledvic, pripravljenimi iz bol- nikovih lastnih PMC, lahko preprečili pre- tirane imunske odgovore in zavrnitve organov. Vendar se je treba zavedati, da do sedaj še ni bila izvedena nobena raziskava, 507Med Razgl. 2022; 61 (4): mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 507 ki bi proučevala uspešnost zdravljenja bol- nikov s končno odpovedjo ledvic z organoidi ledvic. Kljub temu so začetne raziskave, v katerih so raziskovalci iz PMC pripravi- li organoide ledvic in jih presadili v žival- ske modele, zelo obetavne (55, 56). Pred uporabo organoidov ledvic pri človeku se sicer pojavlja še nekaj varnostnih pomi- slekov, predvsem glede zrelosti organoidov ledvic in prisotnosti celic, ki sicer niso prisotne v ledvičnem tkivu (57). Po presa- ditvi organoidov ledvic, pridobljenih iz iPMC v miši, so ugotovili zmanjšanje šte- vila celic, ki sicer niso prisotne v ledvičnem tkivu (58). Pred samo uporabo organoidov ledvic za zdravljenje končne odpovedi led- vic pri človeku bo zato treba razviti varen in učinkovit postopek za presaditev orga- noidov, prav tako pa bo treba tudi ovred- notiti potencialne kratko- in dolgoročne zaplete. IZZIvI PrI UPOrabI OrGaNOIdOv LEdvIc Kljub velikemu napredku pri pripravi orga- noidov ledvic še vedno precej izzivov osta- ja nerešenih. Eden izmed njih je morfološka in funkcionalna nezrelost organoidov led- vic. Sekvenciranje mRNA je namreč poka- zalo, da so organoidi ledvic podobni fetalnim ledvicam (28, 59–61). Zaradi tega so trenu- tni organoidi ledvic primernejši za razi- skovanje razvoja ledvic in pediatričnih ledvičnih bolezni, medtem ko so manj pri- merni za proučevanje ledvičnih bolezni v odrasli dobi (36). Za zdaj tudi podaljšanje časa gojenja organoidov ne izboljša njiho- ve zrelosti, saj se pri starih organoidih celo zmanjša izražanje označevalcev podocitov ter proksimalnih in distalnih tubulov, poleg tega pride do pojava fibroze in ekspanzije celic, ki sicer niso prisotne v ledvičnem tkivu (8, 62, 63). Eden glavnih razlogov za nezrelost organoidov ledvic je pomanjkljivo ožiljenje, ki vodi v slabo preskrbo s kisikom in hra- nili v sredici organoida, ko ta doseže dolo- čeno velikost (36). S tem je seveda omeje- na največja velikost organoidov, ki jih je tre- nutno mogoče pripraviti, in posledično tudi možnost njihove uporabe v regenerativne namene. S presaditvijo organoidov ledvic v miši z oslabljenim imunskim sistemom so sicer dokazali izboljšano ožiljenje ter večjo zrelost podocitov in tubulov, kar nakazuje na to, da se ožilje prejemnika vsaj delno poveže z organoidom (28, 55, 56, 62). Homan in sodelavci so združili pripravo organo - idov z metodo organov na čipih (angl. organ-on-a-chip) in dokazali, da strižne sile izboljšajo dozorevanje in ožiljenje ledvičnih organoidov, kot je prikazano na sliki 3 (64). Pri laminarnem toku skozi komoro ima namreč hitrost toka paraboličen profil. Največja hitrost toka je v sredini komore, najmanjša pa ob steni. Paraboličen profil nastane, ker se plast tekočine neposredno ob steni prilepi nanjo in se zato ne premi- ka, vsaka naslednja plast proti sredini pa se premika hitreje, saj se manj pritrdi na sosed- njo plast. Zaradi različnih hitrosti plasti teko- čine skozi pretočno komoro nastanejo strižne sile, ki so največje ob steni, kjer je razlika v hitrosti med plastjo, ki se ne pre- mika, in sosednjo plastjo proti sredini, naj- večja (1). Pritrditev organoidov ledvic na zunajcelični matriks na površini pretočne komore omogoči nastanek strižnih sil na njegovi površini in posledično sproži nji- hovo diferenciacijo. V prihodnosti pričakujemo tudi izbolj- šanje protokolov za pripravo organoidov ledvic z uretrovimi brstiči, ki bi vsebovali tako nefrone kot zbiralca (37). Prav tako tre- nutno znani protokoli ne omogočajo vza- jemne indukcije med MM in uretrovim brstičem, ki je zelo pomembna v embrio- nalnem razvoju ledvic in vivo (30, 33). Za zdaj izziv predstavlja tudi velika variabilnost med pripravljenimi organoidi in slaba ponovljivost, k čemur prispevajo različni dejavniki. Glavni vzrok za variabilnost celi- čne sestave organoidov je uporaba iPMC, ki izvirajo iz različnih posameznikov, zaradi 508 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 508 česar so med njimi prisotne genetske in epi- genetske razlike, medtem ko je slaba ponov - ljivost lahko posledica uporabe reagentov iz različnih serij (58, 65). Z nekaterimi novejšimi pristopi, kot so avtomatizirano pipetiranje, 3D-biotiskanje in uporaba bio- reaktorjev, so že izboljšali ponovljivost in zmogljivost priprave organoidov (38, 61, 63, 66, 67). Priprava organoidov ledvic je v pri- merjavi s celičnimi kulturami torej še dokaj kompleksen in dolgotrajen postopek, ki je sestavljen iz veliko zaporednih korakov (pri- dobivanje celic, gojenje, proliferacija, induk- cija v specifičen celični tip, diferenciacija itd.), kjer lahko vsak vodi v napako in izgu- bo celične linije. Poleg tega je sam posto- pek priprave organoidov relativno drag (68). Če bi bili organoidi uporabljeni za zdrav - 509Med Razgl. 2022; 61 (4): ljenje ledvične bolezni in situ, bodo v pri- hodnje nujne tudi raziskave, ki bodo opre- delile, kako organoide tarčiti na/v določeno mesto organa. Tudi to ostaja eden izmed izzivov pri uporabi organoidov ledvic. ZaKLJUČEK V zadnjih letih je prišlo do velikega napred- ka pri razumevanju embrionalnega razvoja ledvic, kar je vodilo tudi v pripravo ustrez- nejših modelov ledvic in vitro, med drugim tudi organoidov. Kljub temu da so tradi- cionalne 2D-kulture še vedno uporabljene pogosteje, menimo, da bodo organoidi led- vic v prihodnosti zagotovo dobili svoje mesto pri določenih vrstah raziskav. Ker se število bolnikov s kronično ledvično boleznijo iz leta v leto povečuje, možnosti organoid zunajcelični matriks Slika 3. Pretok tekočine preko površine organoidov ledvic, pritrjenih na zunajcelični matriks v pretočni komori, izboljša njihovo ožiljenje in diferenciacijo. Debelejše puščice nakazujejo mesta večje hitrosti toka. Shema je bila narejena s spletnim orodjem BioRender.com. mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 509 zdravljenja pa so zelo omejene, organoidi ledvic, kljub številnim še nerešenim iz - zivom, predstavljajo obetavno terapevtsko možnost pri končni odpovedi ledvic. Poleg tega imajo skupaj s tehnologijo CRISPR/Cas velik potencial pri izboljšanju razumevanja ledvičnih bolezni ter pri testiranju nefro- toksičnosti in razvoju novih terapevtskih pristopov z uporabo visokozmogljivih metod, ki omogočajo avtomatizirano pri- pravo organoidov in njihovo končno analizo na mikrotitrskih ploščicah. Organoidi bi skupaj z novejšimi biotehnološkimi meto- dami, kot sta metoda organov na čipih in 3D-biotiskanje, lahko omogočili zelo dobro posnemanje okolja in vivo in s tem pomem- ben preobrat pri razumevanju ter zdrav - ljenju ledvičnih bolezni v prihodnosti. 510 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … LITEraTUra 1. Costanzo LS. Physiology. 5th ed. Philadelphia: Saunders/Elsevier; 2014. p. 121–2, 239–41. 2. Miyoshi T, Hiratsuka K, Saiz EG, et al. Kidney organoids in translational medicine: Disease modeling and regenerative medicine. Dev Dyn. 2020; 249 (1): 34–45. 3. Gupta N, Dilmen E, Morizane R. 3D kidney organoids for bench-to-bedside translation. J Mol Med (Berl). 2021; 99 (4): 477–87. 4. Langhans SA. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Front Pharmacol. 2018; 9: 6. 5. Zhou T, Benda C, Duzinger S, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 2011; 22 (7): 1221–8. 6. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016; 165 (7): 1586–97. 7. Kopač M. Prirojene napake sečil. Slov Pediatr. 2015; 22: 183–91. 8. Little MH, Combes AN. Kidney organoids: Accurate models or fortunate accidents. Genes Dev. 2019; 33 (19–20): 1319–45. 9. Mugford JW, Sipilä P, McMahon JA, et al. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Dev Biol. 2008; 324 (1): 88–98. 10. Hendry C, Rumballe B, Moritz K, et al. Defining and redefining the nephron progenitor population. Pediatr Nephrol. 2011; 26 (9): 1395–406. 11. Dudley AT, Godin RE, Robertson EJ. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 1999; 13 (12): 1601–13. 12. Barak H, Huh SH, Chen S, et al. FGF9 and FGF20 maintain the stemness of nephron progenitors in mice and man. Dev Cell. 2012; 22 (6): 1191–207. 13. Halt K, Vainio S. Coordination of kidney organogenesis by Wnt signaling. Pediatr Nephrol. 2014; 29 (4): 737–44. 14. Mills CG, Lawrence ML, Munro DAD, et al. Asymmetric BMP4 signaling improves the realism of kidney organoids. Sci Rep. 2017; 7 (1): 14824. 15. Hannema SE, Hughes IA. Regulation of Wolffian duct development. Horm Res. 2007; 67 (3): 142–51. 16. Sequeira-Lopez ML, Lin EE, Li M, et al. The earliest metanephric arteriolar progenitors and their role in kidney vascular development. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2015; 308 (2): R138–49. 17. Nagalakshmi VK, Yu J. The ureteric bud epithelium: Morphogenesis and roles in metanephric kidney patterning. Mol Reprod Dev. 2015; 82 (3): 151–66. 18. Stark K, Vainio S, Vassileva G, et al. Epithelial transformation of metanephric mesenchyme in the developing kidney regulated by Wnt-4. Nature. 1994; 372 (6507): 679–83. mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 510 19. Miyazaki Y, Oshima K, Fogo A, et al. Bone morphogenetic protein 4 regulates the budding site and elongation of the mouse ureter. J Clin Invest. 2000; 105 (7): 863–73. 20. Michos O, Cebrian C, Hyink D, et al. Kidney development in the absence of Gdnf and Spry1 requires Fgf10. PLoS Genet. 2010; 6 (1): e1000809. 21. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T, et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2014; 14 (1): 53–67. 22. Wang Y, Zhou CJ, Liu Y. Wnt signaling in kidney development and disease. Prog Mol Biol Transl Sci. 2018; 153: 181–207. 23. Takasato M, Er PX, Chiu HS, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015; 526 (7574): 564–8. 24. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, et al. Modeling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 2015; 6: 8715. 25. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS, et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nat Biotechnol. 2015; 33 (11): 1193–200. 26. Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 2018; 23 (6): 869–81. 27. Garreta E, Prado P, Tarantino C, et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 2019; 18 (4): 397–405. 28. Tran T, Lindström NO, Ransick A, et al. In vivo developmental trajectories of human podocyte inform in vitro differentiation of pluripotent stem cell-derived podocytes. Dev Cell. 2019; 50 (1): 102–16. 29. Low JH, Li P, Chew EGY, et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 2019; 25 (3): 373–87. 30. Gupta N, Morizane R. Kidney development to kidney organoids and back again. Semin Cell Dev Biol. 2022; 127: 468–76. 31. Taguchi A, Nishinakamura R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2017; 21 (6): 730–46. 32. Mae SI, Ryosaka M, Sakamoto S, et al. Expansion of human iPSC-derived ureteric bud organoids with repeated branching potential. Cell Rep. 2020; 32 (4): 107963. 33. Uchimura K, Wu H, Yoshimura Y, et al. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Rep. 2020; 33 (11): 108514. 34. Zeng Z, Huang B, Parvez RK, et al. Generation of patterned kidney organoids that recapitulate the adult kidney collecting duct system from expandable ureteric bud progenitors. Nat Commun. 2021; 12 (1): 3641. 35. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; 131 (5): 861–72. 36. Przepiorski A, Crunk AE, Espiritu EB, et al. The utility of human kidney organoids in modeling kidney disease. Semin Nephrol. 2020; 40 (2): 188–98. 37. Shimizu T, Yamagata K, Osafune K. Kidney organoids: Research in developmental biology and emerging appli- cations. Dev Growth Differ. 2021; 63 (2): 166–77. 38. Czerniecki SM, Cruz NM, Harder JL, et al. High-throughput screening enhances kidney organoid differentiation from human pluripotent stem cells and enables automated multidimensional phenotyping. Cell Stem Cell. 2018; 22 (6): 929–40. 39. Cruz NM, Song X, Czerniecki SM, et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nat Mater. 2017; 16 (11): 1112–9. 40. Huang CY, Ho MC, Lee JJ, et al. Generation of induced pluripotent stem cells derived from an autosomal dominant polycystic kidney disease patient with a p.Ser1457fs mutation in PKD1. Stem Cell Res. 2017; 24: 139–43. 41. Kim JW, Kim HW, Nam SA, et al. Human kidney organoids reveal the role of glutathione in Fabry disease. Exp Mol Med. 2021; 53 (10): 1580–91. 42. Shankar AS, Du Z, Mora HT, et al. Human kidney organoids produce functional renin. Kidney Int. 2021; 99 (1): 134–47. 43. Ding B, Sun G, Liu S, et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplant. 2020; 29: 963689719897066. 44. Shankar AS, van den Berg SAA, Tejeda Mora H, et al. Vitamin D metabolism in human kidney organoids. Nephrol Dial Transplant. 2021; 37 (1): 190–3. 511Med Razgl. 2022; 61 (4): mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 511 45. Morizane R, Bonventre JV. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017; 12 (1): 195–207. 46. Hale LJ, Howden SE, Phipson B, et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalized podocyte disease modeling and drug screening. Nat Commun. 2018; 9 (1): 5167. 47. Nassirpour R, Ramaiah SK, Whiteley LO. Nephron segment specific microRNA biomarkers of pre-clinical drug-induced renal toxicity: Opportunities and challenges. Toxicol Appl Pharmacol. 2016; 312: 34–41. 48. Ginsburg GS, Phillips KA. Precision medicine: From science to value. Health Aff (Millwood). 2018; 37 (5): 694–701. 49. Schutgens F, Rookmaaker MB, Margaritis T, et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 2019; 37 (3): 303–13. 50. Dagogo-Jack I, Shaw AT. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nat Rev Clin Oncol. 2018; 15 (2): 81–94. 51. Grassi L, Alfonsi R, Francescangeli F, et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death Dis. 2019; 10 (3): 201. 52. Romero-Guevara R, Ioannides A, Xinaris C. Kidney organoids as disease models: Strengths, weaknesses and perspectives. Front Physiol. 2020; 11: 563981. 53. Abbasi MA, Chertow GM, Hall YN. End-stage renal disease. BJM Clin Evid. 2010; 2010: 2002. 54. Geuens T, van Blitterswijk CA, LaPointe VLS. Overcoming kidney organoid challenges for regenerative medicine. NPJ Regen Med. 2020; 5: 8. 55. Sharmin S, Taguchi A, Kaku Y, et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. J Am Soc Nephrol. 2016; 27 (6): 1778–91. 56. van den Berg CW, Ritsma L, Avramut MC, et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 2018; 10 (3): 751–65. 57. Nam SA, Seo E, Kim JW, et al. Graft immaturity and safety concerns in transplanted human kidney organoids. Exp Mol Med. 2019; 51 (11): 1–13. 58. Subramanian A, Sidhom EH, Emani M, et al. Single cell census of human kidney organoids shows reproducibility and diminished off-target cells after transplantation. Nat Commun. 2019; 10 (1): 5462. 59. Combes AN, Phipson B, Lawlor KT, et al. Single cell analysis of the developing mouse kidney provides deeper insight into marker gene expression and ligand-receptor crosstalk. Development. 2019; 146 (12): dev178673. 60. Kim YK, Refaeli I, Brooks CR, et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 2017; 35 (12): 2366–78. 61. Kumar SV, Er PX, Lawlor KT, et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 2019; 146 (5): dev172361. 62. Bantounas I, Ranjzad P, Tengku F, et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 2018; 10 (3): 766–79. 63. Przepiorski A, Sander V, Tran T, et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2018; 11 (2): 470–84. 64. Homan KA, Gupta N, Kroll KT, et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 2019; 16 (3): 255–62. 65. Phipson B, Er PX, Combes AN, et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 2019; 16 (1): 79–87. 66. Higgins JW, Chambon A, Bishard K, et al. Bioprinted pluripotent stem cell-derived kidney organoids provide opportunities for high content screening. 2018; bioRxiv: 505396. 67. Lawlor KT, Vanslambrouck JM, Higgins JW, et al. Cellular extrusion bioprinting improves kidney organoid reproducibility and conformation. Nat Mater. 2021; 20 (2): 260–71. 68. Bose S, Clevers H, Shen X. Promises and challenges of organoid-guided precision medicine. Med (N Y). 2021; 2 (9): 1011–26. Prispelo 8. 3. 2022 512 Tina Levstek, Taja Železnik Ramuta, Mateja Erdani Kreft Organoidi ledvic in njihova uporaba … mr22_4_Mr10_2.qxd 22.12.2022 11:06 Page 512