Nataša Resnik1, Mateja Erdani Kreft2 vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju in (pato)fiziologiji The Role of Tunneling Nanotubes in Intercellular Communication and (Patho)Physiology IZvLEČEK KLJUČNE BESEDE: citoskeletni elementi, kokultura, medcelično sporazumevanje, onkoproteini, tarčno zdravljenje, tunelske nanocevke, urotelijske celice Medcelično sporazumevanje je osnovni proces, ki omogoča normalen razvoj, obnovo in preživetje celic ter tkiv. Med načine medceličnega sprazumevanja uvrščamo tudi nedavno odkrite tunelske nanocevke, ki so tanki cevasti membransko-citoplazemski izrastki, ki in vitro in in vivo med seboj povezujejo različne tipe celic. Tunelske nanocevke delujejo kot sporazumevalni tuneli, saj omogočajo, da se iz donorske celice v tarčno celico pre- nese celični tovor, kot so celični organeli, lipidi, beljakovine, nukleinske kisline in signal- ne molekule, kot tudi necelični material, kot so patogeni in nanodelci. Kadar pride do prenosa škodljivega tovora (poškodovani organeli, onkoproteini, patogeni), imajo tunel- ske nanocevke patofiziološko vlogo, saj sodelujejo tako pri nastanku bolezni kot tudi pri njenem razširjanju. Tunelske nanocevke različnih tipov celic se razlikujejo po dolžini, pre- meru, nastanku ter po sestavi citoskeletnih elementov. Iz strukturne heterogenosti tunel- skih nanocevk najverjetneje izvirajo tudi raznolikosti v njihovi funkciji. Razumevanje strukture in funkcije tunelskih nanocevk je nujno za razumevanje nastanka bolezni in mož- nosti njihovega zdravljenja. Ta prispevek opisuje strukturne in molekularne lastnosti tunel- skih nanocevk, njihov nastanek in njihove funkcije ter predstavlja nekatera najnovejša dognanja o uporabi tunelskih nanocevk v namene zdravljenja. aBSTRaCT KEY WORDS: cytoskeletal elements, coculture, intercellular communication, oncoproteins, targeted therapy, tunneling nanotubes, urothelial cells Intercellular communication is a vital process that enables normal tissue development, cell renewal, and survival. The recently discovered tunneling nanotubes are one of the types of intercellular communication. They are thin tubular membrane-cytoplasmic pro- trusions that connect different cell types in vitro and in vivo. Tunneling nanotubes act as communication tunnels by allowing the transport of cellular cargo such as cell organelles, 1 Doc. dr. Nataša Resnik, univ. dipl. biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 2 Prof. dr. Mateja Erdani Kreft, univ. dipl. biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; mateja.erdani@mf.uni-lj.si 321Med Razgl. 2024; 63 (4): 321–36 • doi: 10.61300/mr6304ccc • Pregledni članek mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 321 lipids, proteins, nucleic acids, as well as non-cellular material such as pathogens and nano- particles from the donor cell to the target cell. When a deleterious cargo (damaged organelles, oncoproteins, and pathogens) is transferred, tunneling nanotubes play a pathophysiological role by participating in both the onset of disease and its spread. Tunneling nanotubes are thus highly heterogeneous in terms of function, and this is like- ly also the origin of their structural heterogeneity. Tunneling nanotubes of different cell types differ in length, diameter, formation, and composition of cytoskeletal elements. Understanding the structure and function of tunneling nanotubes is critical to under- standing disease and treatment options. This review describes the mechanisms of for- mation and the role of tunneling nanotubes known to date and presents some of the latest findings on the use of tunneling nanotubes for therapeutic purposes. Kanalček je prehoden samo za ione in majh- ne vodotopne molekule velikosti < 1 kDa. Sporazumevanje s stikom je možno tudi na daljše razdalje s tunelskimi nanocevkami (angl. tunneling nanotubes, TNT), o katerih so pred 20 leti prvič poročali Rustom in sodelavci (1). Ta način sporazumevanja bomo v prispevku natančneje opisali. TNT so prvič opazili med živimi celi- cami linije PC12, ki izvirajo iz tumorja nadledvične žleze podgane (feokromocito- ma), in med celicami linije normalnih pod- ganjih ledvičnih (angl. normal rat kidney, NRK) celic. V celicah linije PC12 in NRK so TNT s fluorescenčnim mikroskopom opa- zili kot drobne membransko-citoplazemske strukture po označitvi celice s fluorescen- čnim označevalcem plazmaleme. 3D-re- konstrukcija slik je pokazala, da imajo TNT premer 50–200nm, dolžino nekaj premerov celice ter da so TNT redko razvejane in brez povezave s podlago gojilne posode. Vloga TNT v medceličnem sporazumevanju je bila dokazana s snemanjem prenosa lizosomov znotraj TNT z označevalcem LysoTracker™ (Thermo Fisher Scientific Inc.®, Waltham, Massachusetts, ZDA) v živih celicah, vklju- čenost aktivnega prenosa z aktinskimi fila- menti pa z imunooznačevanjem motornega proteina miozina Va (1). TNT so cevasti membransko-citopla- zemski izrastki, ki povezujejo celice in vitro in in vivo. Znotraj TNT se prenašajo celične 322 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … UvOD Sposobnost medsebojnega sporazumevanja celic je predpogoj za fiziološko delovanje celic, tkiv in organizmov. V patofizioloških okoljih lahko medcelično sporazumevanje kot odziv na neugoden okoljski stres pris- peva k nastanku in napredovanju bolezni ter k preživetju celic, tkiv ali organizmov. Sporazumevanje poteka na dolge razdalje s stikom (kontaktno, neposredno) ali brez njega (nekontaktno, posredno). Brez stika poteka s signalnimi molekulami, ki dose- žejo membranske receptorje oddaljenih celic. Primer je endokrino signaliziranje, kjer endokrine celice sproščajo hormone v krvožilje in sprožijo odziv v tarčnih celi- cah v telesu. Po krvožilju se lahko raz- širjajo tudi zunajcelični vezikli. To so vezikli, obdani s fosfolipidnim dvoslojem, ki nasta- jajo z odcepljanjem neposredno iz plazma- leme donorske celice (mikrovezikli ali ektosomi) ali pa z eksocitozo multiveziku- larnih teles (eksosomi). V notranjosti vezik- lov so sestavine donorske celice, kot so npr. beljakovine, lipidi in nukleinske kisline, in ti ob zlivanju veziklov s tarčno celico vpli- vajo na njeno delovanje. Neposredno sporazumevanje oz. spo- razumevanje s stikom poteka na krajše razdalje preko presledkovnih stikov. Gre za medcelične kanalčke, ki jih gradijo beljakovine koneksini in predstavljajo ne- posredno povezavo citoplazme dveh celic. mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 322 sestavine, kot so organeli (mitohondriji, endosomi, ribosomi, vezikli iz Golgijevega aparata), lipidne kaplje, kratkoverižne nukleinske kisline, npr. mikro-RNA (miRNA), omogočajo pa tudi prenos neceličnih sesta- vin, kot so nanodelci, bakterije, virusi in belja- kovinski skupki (2). Raznolikost tovora kaže na fiziološko in patofiziološko vlogo TNT v večceličnih organizmih, sodelujejo namreč tudi pri širjenju nalezljivih in nevro- degenerativnih bolezni ter imajo pomembno vlogo pri razvoju rakavih obolenj (2, 3). Medcelično sporazumevanje je v hetero- genem tumorskem mikrookolju kritičnega pomena pri napredovanju bolezni, saj lahko vodi v razvoj odpornosti na kemoterapevti- ke. Raziskave TNT med rakavimi celicami ter med rakavimi in normalnimi (zdravimi) celicami in vitro, in vivo in na biopsijah bol- nikov z rakom pripomorejo k razumevanju nastanka in napredovanja te bolezni. S tem se odpirajo tudi nove možnosti za razvoj učinkovitejšega zdravljenja raka. Na Inštitutu za biologijo celice Medicin- ske fakultete Univerze v Ljubljani razisku- jemo medcelično sporazumevanje s TNT med rakavimi in normalnimi urotelijskimi celicami (epitelijske celice sečnega mehur- ja) (4–7). Raziskave potekajo na rakavih in normalnih urotelijskih celicah in vitro v monokulturah, kjer preučujemo TNT med celicami enega tipa, ter v kokulturah, kjer preučujemo TNT med celicami obeh tipov. Monokulture uporabljamo predvsem za ugotavljanje osnovnih značilnosti TNT, kot so frekvenca pojavljanja, dolžina, debe- lina, citoskeletna in lipidna sestava. Ko- kulture uporabljamo kot model, ki posnema sporazumevanje med normalnimi in raka- vimi celicami in vivo. Ugotoviti namreč želi- mo, ali se v stresnih razmerah poveča tvor- ba TNT in koliko stresne razmere vplivajo na prenos tovora iz rakavih celic v normalne in obratno ter kako s tem vplivajo tudi na napredovanje ali nazadovanje bolezni. Ključni metodi za raziskovanje TNT sta svetlobna in elektronska mikroskopija. MORFOLOšKE IN MOLEKULaRNE LaSTNOSTI TUNELSKIH NaNOCEvK Morfološke in molekularne lastnosti TNT v največji meri poznamo iz raziskovanj v klasičnih dvodimenzionalnih (2D) celičnih kulturah. Od tod tudi izhajajo osnovna merila za določitev TNT. TNT prepoznamo po tem (8): • da povezujejo celice na razdalji, daljši od 10 µm, • da nimajo stika s podlago in imajo aktin- ske filamente kot osnovne citoskeletne gradnike ter tudi • da omogočajo prenos različnega tovora med celicami, kot so ioni, beljakovine, RNA in organeli. Našteta merila morajo biti izpolnjena, da TNT ločimo od celičnih izrastkov – filo- podijev. Filopodiji so dinamični, kratki celič- ni izrastki, običajno dolgi < 5 µm, pritrjeni so na podlago in ne omogočajo izmenjave snovi med celicami, saj niso medcelične povezave. Med celicami v klasični 2D-kul- turi nastajajo bolj ali manj ravne TNT. Ločimo homotipične TNT, ki povezujejo celice istega tipa, ter heterotipične TNT, ki povezujejo različne tipe celic. Nekatere TNT imajo razcepišča in odebelitve, imenovane gondole (9, 10). S korelativno svetlobno- -elektronsko mikroskopijo so ugotovili, da so gondole mesta nahajanja večjih veziklov in organelov (10). Z matematičnim mode- liranjem so ugotovili, da je nastanek gon- dol posledica molekularne heterogenosti v membrani, kar se pojavi bodisi zaradi agre- gacije beljakovin bodisi zaradi sestave mem- brane (11). TNT najdemo tudi v 3D-in vitro modelih, kot so sferoidi in organoidi, ter in vivo v zdravem tkivu in tumorskih tkivih bol- nikov (12–16). V slednjih so našli ravne in ukrivljene TNT ter tudi TNT z odebelitva- mi (gondolami) (15–17). TNT so morfološko (glede na dolžino, premer) in molekularno (glede na cito- skeletno sestavo, tovor) zelo heterogene (tabela 1). Heterogenost se pojavlja znotraj 323Med Razgl. 2024; 63 (4): mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 323 iste celične linije v danih fizioloških razme- rah, dodatno pa k heterogenosti prispevajo stresne razmere, izzvane s fizikalnimi ali kemijskimi dejavniki, kot sta ultravijolično (UV) sevanje in brezserumski hranilni medij (18, 19). Tako celice PC12 tvorijo manj TNT, ki vsebujejo več mikrotubulov, kadar so ob- sevane z UV-sevanjem, kot kadar niso. Gojenje celic v brezserumskem hranilnem mediju je v astrocitih in nevronih sprožilo nastanek več- jega števila TNT, v urotelijskih rakavih celi- cah pa se je število TNT zmanjšalo (19, 20). Dolžina in premer tunelskih nanocevk Dolžina TNT se razlikuje tako med različ- nimi tipi celic kot znotraj istega celičnega tipa (tabela 1). Večina TNT in vitro je dol- gih od 10 do več 100 µm. Dolžina TNT je dinamično uravnana, saj se s premikanjem dveh celic, ki sta povezani s TNT, spremin- ja tudi dolžina TNT. Zanimiva je primerja- va dolžine TNT normalnih in rakavih uro- telijskih celic in vitro (slika 1). Normalne urotelijske celice imajo TNT dolge pov- prečno 105 µm, rakave pa 32 µm (6). Med normalnimi urotelijskimi celicami je bila dolžina najdaljših TNT približno 300 µm. TNT med normalnimi celicami povezuje- jo večje skupine celic (t. i. celične otočke), medtem ko TNT med rakavimi urotelijski- mi celicami povezujejo posamične, sosed- nje celice (slika 1). Tako kot dolžina se tudi premer TNT med različnimi tipi celic razlikuje. TNT celic feo- kromocitoma imajo premer 50–200nm, TNT limfocitov pa 180–380 nm (1, 25). Premer TNT človeških makrofagov je lahko tudi večji od 700 nm (26). Debelina TNT je povezana tudi z vsebnostjo citoskeletnih elementov. V tanjših cevkah (premer < 700 nm) se nahajajo aktinski filamenti, v debelejših (premer > 700 nm) aktinski filamenti in mikrotubuli ter v nekaterih primerih tudi intermediarni filamenti (7). Z njihovo vklju- čitvijo se poveča tudi trdnost TNT (6, 25, 26). 324 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … Tabela 1. Primeri tunelskih nanocevk (angl. tunneling nanotubes, TNT) različnih tipov celic in njihove last- nosti. F-aktin – fibrilarni aktin, ND – ni določeno, NPU – normalne urotelijske celice (angl. normal porcine urothelial). Celični tip Dolžina TNT Citoskeletni Tovor Reference (µm) elementi Celice tumorja nadledvične 6 F-aktin mitohondriji, (1) žleze (feokromocitom, endosomi, lizosomi linija PC12) Limfociti B 22 F-aktin, vezikli, lizosomi, (22) α-tubulin mitohondriji Metastatske celice debelega 100 ND onkoprotein K-Ras (23) črevesa (linija LoVo) Celice mikroglije 10–20 F-aktin, mitohondriji, (24) (linija HMC3) α-tubulin α-sinuklein NPU 105 F-aktin, mitohondriji, lizosomi, (6) α-tubulin, vezikli Golgijevega citokeratin 7 aparata Neinvazivne urotelijske ND F-aktin, ND (9) celice papiloma (linija RT4) citokeratin 7 Mišično invazivne urotelijske 32 F-aktin, mitohondriji, (6) celice (linija T24) citokeratin 7, lizosomi, vezikli α-tubulin Golgijevega aparata mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 324 Citoskeletni elementi v tunelskih nanocevkah Citoskeletni elementi sodelujejo pri izraš- čanju TNT, so oporni elementi TNT ter sku- paj z motornimi proteini omogočajo prenos tovora znotraj TNT. Zastopanost citoskelet- nih elementov v TNT je odvisna od tipa celic (tabela 1). Razlikujemo TNT z enim citoskeletnim elementom (monocitoske- letne TNT), z dvema različnima citoskelet- nima elementoma (bicitoskeletne TNT) in s tremi različnimi citoskeletnimi elemen- ti (tricitoskeletne TNT) (6). Aktinski fila- menti veljajo za glavne gradnike in s tem tudi označevalce TNT. Mikrotubuli se lahko v TNT nahajajo kot posamični citoskeletni gradniki ali skupaj z aktinom oz. z inter- mediarnimi filamenti, npr. s citokeratini v urotelijskih celicah in s kislimi glialnimi fibrilarnimi beljakovinami (angl. glial fibril- lary acidic protein, GFAP) v astrocitih (27). V TNT so prisotni različni α-tubulini kot osnovni gradniki mikrotubulov. Acetiliran in tiroziniran α-tubulin prispevata k sta- bilnejši obliki TNT (26). Tako mikrotubuli kot tudi intermediarni filamenti povečajo togost TNT in s tem podaljšajo njihovo življenjsko dobo (21, 28). Tricitoskeletno sestavo TNT smo prvič odkrili v TNT nor- malnih in rakavih urotelijskih celic (slika 2). V normalnih urotelijskih celicah je bilo 57 %, v rakavih urotelijskih celicah pa 53 % 325Med Razgl. 2024; 63 (4): rakave urotelijske celice T24 normalne urotelijske celice NPU BA C D NPU T24 T24 NPU NPU Slika 1. Tunelske nanocevke (angl. tunneling nanotubes, TNT) med urotelijskimi celicami. TNT v mono- kulturi rakavih (A) in normalnih urotelijskih celic (B) ter kokulturi rakavih in normalnih urotelijskih celic (C, D). TNT med rakavimi celicami so krajše, številčnejše in povezujejo celice na krajših razdaljah kot TNT med normalnimi urotelijskimi celicami (A). TNT med normalnimi celicami so dolge in povezujejo večje skupi- ne celic (t. i. celične otočke) (B) (7). V kokulturi normalnih in rakavih celic nastajajo TNT, ki povezujejo nor- malne in rakave urotelijske celice (glave puščic) (C, D). Slike so posnetki živih celic, posnetih z invertnim mikroskopom. NPU – normalne urotelijske celice (angl. normal porcine urothelial), T24 – linija mišično inva- zivnih urotelijskih celic. mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 325 TNT s tricitoskeletno sestavo. V TNT z bi- citoskeletno sestavo je v normalnih in rakavih urotelijskih celicah prevladovala kombinacija aktinskih filamentov in mikro- tubulov. Monocitoskeletne TNT v normal- nih urotelijskih celicah so vsebovale intermediarne filamente (citokeratin 7), v rakavih urotelijskih celicah pa aktinske filamente (6). Ugotovili smo tudi, da se v nekaterih TNT urotelijskih celic mikro- tubuli razporejajo okoli intermediarnih filamentov v obliki vijačnice (4). Takšna organizacija domnevno pripomore k stabi- lizaciji TNT med njenim raztegovanjem ali krčenjem, ki se pojavi zaradi oddaljevanja ali približevanja celic. Kljub pomanjkanju specifičnega ozna- čevalca lahko TNT prepoznamo tako, da fluorescenčno označimo plazmalemo ali citoskeletne elemente ter tanke povezave med celicami poiščemo s fluorescenčnim mikroskopom. Razumevanje sestave TNT na molekularni ravni je še vedno pomanj- kljivo, saj se soočamo z glavno oviro – osa- mitvijo posameznih TNT. Za raziskovanje TNT sta trenutno poglavitni tehniki svetlo- bna in elektronska mikroskopija ter kom- binacija obeh. Zaradi svoje tanke strukture TNT niso enostavne za raziskovanje, saj so občutljive na mehanski stres, kemijsko fik- sacijo, osvetljevanje in temperaturne spre- membe (25, 29). PRENOS PO TUNELSKIH NaNOCEvKaH Tovor, ki se prenaša po TNT, zajema tako celične kot necelične sestavine, ki se pre- našajo po citoplazmi TNT ali membranski zunajcelični strani TNT (slika 3). Med celi- čnimi sestavinami, ki se prenašajo po cito- plazmi, so bili v TNT dokazani deli endo- plazemskega retikuluma, vezikli Golgijevega aparata, endosomi, lizosomi, mitohondriji, lipidne kaplje in miRNA. Po plazmalemi TNT se prenašajo transmembranske belja- kovine, kot so npr. transferinski receptor, dendritičnim celicam specifična trans- membranska beljakovina (angl. dendritic cell-specific transmembrane protein, DC- -STAMP) in mutirani K-Ras. Po citoplazmi TNT se prenašajo tudi necelične sestavine, kot so patogeni (virusi, prioni, bakterije), amiloidni skupki, nanodelci ter ioni (30–34). Prenos bakterij Mycobacterium bovis bacil- lus Calmette-Guerin (BCG) je prisoten na zunajcelični strani membrane TNT (26). Prenos tovora po citoplazmi TNT zah- teva, tako kot prenos po citoplazmi celice, citoskeletne elemente, motorne proteine in ATP. Motorni proteini so encimi ATPaze, ki hidrolizirajo ATP. Energija, ki se sprosti ob cepitvi vezi med ADP in fosfatom, omogo- či konformacijsko spremembo, zaradi česar se motorni protein premakne vzdolž cito- skeletnega elementa (35). Motorni proteini, 326 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … A B C D Slika 2. Citoskeletni elementi v tunelskih nanocevkah (angl. tunneling nanotubes, TNT) normalnih uro- telijskih celic. Na združeni sliki (A) sta vidni dve TNT (glava puščice in puščica). TNT z bicitoskeletno sesta- vo (glava puščice) vsebujejo intermediarne filamente (C) in mikrotubule (D), TNT s tricitoskeletno sestavo (puščica) pa vse tri citoskeletne elemente (B, C, D). Aktinski filamenti (fibrilarni aktin (F-aktin)) so ozna- čeni s faloidinom, intermediarni filamenti s primarnimi protitelesi proti citokeratinu 7 in mikrotubuli s primarnimi protitelesi proti α-tubulinu. mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 326 kinezini in dineini, omogočajo prenos tovo- ra po mikrotubulih, medtem ko miozini omogočajo prenos tovora po aktinskih fila- mentih. S prisotnostjo miozinov Va in X je bil dokazan prenos po aktinskih filamentih v TNT (1, 36). Tudi v TNT urotelijskih celic smo dokazali miozin Va ter dinein, ki tovor premika proti minus koncu mikrotubulov, in kinezin 5B, ki premika tovor proti plus koncu mikrotubulov. Tako smo potrdili dvosmerni prenos po mikrotubulih po TNT (37). Poleg razpoložljivih motornih protei- nov je prenos tovora v tarčno celico odvi- sen tudi od ultrastrukture področja, kjer se TNT pripenja na tarčno celico. Znano je, da so TNT lahko odprtega tipa (angl. open-ended TNT) ali zaprtega tipa (angl. close-ended TNT) (slika 4). Pri TNT odprtega tipa je med donorsko in tarčno celico neposredna pove- zava citoplazme in plazmaleme TNT ter tar- čne celice, ki omogoča prehod večjim molekulam in celičnim organelom. Pri TNT zaprtega tipa pa je na meji med TNT in plaz- malemo tarčne celice presledkovni stik, ki omogoča le prehod majhnih molekul veli- kosti < 1 kDa ter kalcijevih ionov (slika 4). Le-ti se najverjetneje širijo iz donorske v tarčno celico v smeri koncentracijske- ga gradienta (38). Prenos bakterij BCG po zunanji strani TNT makrofagov poteka tako, da se bakterije najprej ujamejo na površino TNT, nato pa se s konstitutivnim 327Med Razgl. 2024; 63 (4): TNT mitohondrij lipidna kaplja mikrotubuli nanodelec miRNA transmembranska beljakovina citosolna beljakovina skupek beljakovin aktinski filamenti virus bakterija vezikel Slika 3. Shematski prikaz prereza tunelskih nanocevk (angl. tunneling nanotubes, TNT). Prenos po TNT poteka enosmerno ali dvosmerno, z motornimi proteini (niso prikazani) ter po aktinskih filamentih in mikro- tubulih. Po citoplazemskem delu TNT se lahko prenašajo mitohondriji, različne beljakovine in mikro-RNA (miRNA), vezikli, lipidne kapljice ter nanodelci. Nekateri mikroorganizmi izkoriščajo TNT za prenos iz ene celi- ce v drugo, in sicer po citoplazemskem delu TNT ali po zunajcelični površini membrane TNT. TNT – tunel- ske nanocevke (angl. tunneling nanotubes), miRNA – mikro-RNA. mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 327 tokom gradnikov plazmaleme pomikajo proti tarčni celici, ki jih fagocitira (26). Endocitoza je tudi eden od načinov prenosa snovi v TNT zaprtega tipa. Prehod tovora po TNT iz donorske celice v tarčno celico se sproži, pospeši ali poveča zaradi stres- nih razmer (hipoksija, H2O2, pomanjkanje seruma, UV-sevanje) (39). vLOGa TUNELSKIH NaNOCEvK v FIZIOLOšKIH IN PaTO(FIZIOLOšKIH) PROCESIH Čeprav večina raziskav prikazuje vlogo TNT pri nastanku ali razširjanju bolezni, pri- spevajo tudi k ohranjanju funkcij in homeo- staze zdravega tkiva (slika 5). Od narave tovora je odvisno, ali bodo TNT delovale v prid zdravemu ali bolezenskemu stanju. V nadaljevanju bomo osvetlili primere, kjer TNT prispevajo k normalnemu delo- vanju celic, ter njihovo vlogo pri nastanku in poteku različnih bolezni. vloga tunelskih nanocevk v fizioloških procesih Vloga TNT je bila posredno dokazana pri angiogenezi razvijajočih se možganov člo- veka, in sicer na tkivnih rezinah zarodka v 22. tednu gestacije. Errede in sodelavci so 328 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … našli TNT, ki so povezovale pericite krvno- -možganske pregrade s periciti oddaljenih kapilar (40). Nakazana je bila tudi vloga TNT pri hitrejši in boljši predstavitvi antigenov. V tem primeru so ugotovili, da se po mem- branski strani TNT celic raka maternične- ga vratu, imenovanih HeLa (osamitev iz tumorja bolnice Henriette Lacks), prenašajo molekule glavnega kompleksa tkivne sklad- nosti humanega levkocitnega antigena A2 (HLA-A2) (41). V drugem primeru pa so ugo- tovili, da je izražanje beljakovine LST1 (angl. leukocyte-specific transcript 1) spod- budilo sestavljanje molekularnega kom- pleksa, odgovornega za tvorbo TNT, kar je pospešilo prenos HLA-A2 med celicami (42). Tudi pri diferenciaciji osteoklastov, zla- sti v procesu zlivanja predhodnikov osteo- klastov in vitro in in vivo, so se pojavili številni TNT. Po TNT so opazili hiter pre- nos DC-STAMP, transmembranske belja- kovine, ki je bistvena za zlivanje celic pri osteoklastogenezi (43, 44). vloga tunelskih nanocevk v (pato)fizioloških procesih Prispevek TNT v patologiji je, da omogo- čajo prenos in razširjanje za celice škodlji- vega tovora, kot so onkoproteini, poškodo- A B Slika 4. Načina povezovanja celic s tunelskimi nanocevkami (angl. tunneling nanotubes, TNT). Kadar se na mestu povezave plazmalema TNT in plazmalema tarčne celice zlijeta (puščica), nastane TNT odprtega tipa (A). Kadar do zlitja ne pride in ni neposredne povezave med citoplazmama povezanih celic (puščica), nastane TNT zaprtega tipa (B). mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 328 vani organeli, virusi, bakterije, infektivni delci (prioni, serumski amiloid A, α-sinuklein, virioni) (slika 3). Tako črevesne rakave celi- ce LoVo z mutirano različico virusnega onkogenega homologa Kirsten podganjega sarkoma (angl. Kirsten rat sarcoma, KRAS) s pomočjo TNT prenesejo mutiran onko- protein K-Ras v črevesne rakave celice div- jega tipa brez mutirane različice. Med raka- vimi celicami z izraženim KRAS je smer prenosa onkoproteina K-Ras iz bolj agre- sivnih donorskih celic v manj agresivne tarčne črevesne rakave celice (23). Prido- bitev onkoproteina K-Ras poveča fosfori- lacijo kinaze, uravnavane z zunajceličnim signalom (angl. extracellular signal-regulat- ed kinase, ERK), in poveča nastanek TNT v tarčnih celicah brez K-Ras (23). Celice glioblastoma lahko preko TNT pridobijo mitohondrije iz zdravih astrocitov iz tu- morskega mikrookolja, zaradi česar pride do povečane proliferacije celic in sinteze ATP rakavih celic ter ohranitve rakotvor- nosti (45). Tudi toksični beljakovinski skupki, kot so prioni, amiloid β, tau, mutirani hunting- tin (mHTT) in α-sinuklein, ki se kopičijo pri nevrodegenerativnih boleznih, kot so Alzheimerjeva, Parkinsonova in Hunting- tonova bolezen, se prenašajo po TNT. Izpo- stavili bomo α-sinuklein, ki je presinapti- čna beljakovina, katere skupki imajo ključno vlogo pri nastanku Parkinsonove bolezni, saj se kopičijo v nevronih in povzročajo 329Med Razgl. 2024; 63 (4): TUNELSKE NANOCEVKE angiogeneza diferenciacija prenos patogenov prenos signalov nevrodegenerativne bolezni prenos odpornosti na kemoterapevtike prenos nanodelcev imunski odgovor karcinogeneza apoptoza Slika 5. Tunelske nanocevke so vpletene v celične procese, ki lahko vodijo v patološke spremembe, ali pa so del normalne fiziologije celic. mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 329 vnetje ter celično smrt. Izkazalo se je, da TNT, ki nastanejo med celicami mikro- glije, in TNT med nevroni in celicami mikro- glije, omogočajo prenos tako α-sinukleina kot mitohondrijev (24). Po TNT se α-sinu- klein prenaša znotraj lizosomov (46). Skupki α-sinukelina se prenašajo predvsem iz nevronov v celice mikroglije, kar se pred- videva kot mehanizem za razbremenitev nakopičenih skupkov in s tem zmanjšanje vnetja. Še več, v nasprotni smeri celice mikroglije prenašajo mitohondrije, pred- nostno v nevrone, nakopičene z α-sinu- kleinom, kar predstavlja morebitni reševalni mehanizem (24). Celice mikroglije, ki so jih darovali bolniki s Parkinsovo boleznijo, so pokazale slabšo zmožnost za prenos skupkov po TNT, kar je vodilo v povečano vnetje ter celično smrt celic mikroglije (47). Tovrstne ugotovitve govorijo v prid pomenu TNT pri medsebojnih interakcijah nevronov in celic mikroglije. Tudi HIV-1 npr. izkorišča TNT za širi- tev iz žariščne okužene celice v okoliške zdrave celice. Zelo verjetno lahko virusi tudi nadzorujejo nastajanje TNT med okužbo, tako da sprožijo tvorbo TNT in s tem stop- njujejo razširjanje (25, 48). Tudi koronavirus hudega akutnega respiratornega sindroma tipa 2 (angl. severe acute respiratory syn- drome coronavirus 2, SARS-CoV-2) se lahko iz ene celice v drugo širi tako po citoplaz- 330 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … mi znotraj veziklov, obdanih z dvojno mem- brano, kot po zunajcelični strani membra- ne TNT (49). Prenos veziklov znotraj TNT posredujejo aktinski filamenti z miozinom Va (1). Za razširjanje okužbe z BCG je bilo ugotovljeno, da se prenaša po zunajcelični strani TNT in v tarčno celico vstopi s fago- citozo (26). Raziskave torej kažejo na več- plastno vlogo TNT, ki je lahko povezana z različnimi bolezenskimi stanji. Navedeni primeri tako izpostavljajo njeno vlogo pri nastanku in napredovanju raka, nevro- degenerativnih boleznih ter pri širjenju virusnih in bakterijskih okužb. NaSTaNEK TUNELSKIH NaNOCEvK Za ugotovitev načina nastanka TNT je potrebno snemanje živih celic, saj označe- valci, ki bi TNT ločevali po načinu nastan- ka, niso znani. TNT nastanejo na dva načina. Pri prvem načinu nastanejo z oddaljevanjem tesno stikajočih se celic (slika 6), kar je pre- vladujoči način nastajanja TNT in vitro. Pri drugem načinu nastanejo z rastjo filopodiju podobnega izrastka proti tarčni celici oz. s povezovanjem celic (slika 6). Ta način je bolj značilen za relativno negibljive celice (npr. nevrone in epitelijske celice) (50). Za stabilno pritrditev TNT na tarčno celico so pomembne beljakovine adherentnih sti- kov, N-kadherini in β-katenini (7, 9, 51, 52). A I II III I II III B Slika 6. Dva načina nastanka tunelskih nanocevk (angl. tunneling nanotubes, TNT). Nastajanje TNT z od- daljevanjem celic (angl. keeping contact TNT) (A). Pritrjeni celici (I) se ločita (II), z oddaljevanjem pa med njima nastane TNT (III). Nastajanje TNT z rastjo filopodiju podobnega izrastka (angl. making contact TNT) (B). Filopodiju podoben izrastek (I) se izteza proti sosednji celici po podlagi (II). Ko s celico vzpostavi stik, nasta- ne TNT, ki nima več stika s podlago (III). mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 330 TNT se spontano tvorijo v fizioloških razmerah, vendar jih celice pod vplivom stresnih dejavnikov tvorijo več. Nastajanje TNT pospešujejo vnetje, oksidativni stres, hiperglikemični medij, pomanjkanje seru- ma, nizek pH in UV-sevanje (53, 54). Ko so naredili kokulturo s stresiranimi astrociti (celice so predhodno izpostavili brezserum- skemu hranilnemu mediju ali hranilnemu mediju z dodanim H2O2) in nestresiranimi astrociti, so TNT vedno tvorile stresirane celice proti nestresiranim celicam in ne obratno (19). Po TNT so se prenesli nepo- škodovani mitohondriji iz nestresiranih celic v stresirane celice feokromocitoma PC12 in ledvične tubularne celice, s čimer so se stresirane celice izognile apoptozi (43, 44). Primer škodljivega TNT-sporazu- mevanja pa so odkrili med celicami glio- blastoma in netumorskimi astrociti, kjer je zaradi TNT-povezav prišlo do prilagoditve netumorskih astrocitov na hipoksijo in na tumorsko presnovo (55). V naših raziskavah na kokulturah rakavih in normalnih uro- telijskih celic smo ugotovili, da celice, ki jih je številčno manj, tvorijo TNT do celic, ki jih je številčno več. Torej, ko smo nasa- dili rakave in normalne urotelijske celice v razmerju 1 : 40, so rakave celice tvorile približno osemkrat več TNT do normalnih celic kot normalne celice TNT do rakavih celic (37). Kljub poznavanju nekaterih molekul pri nastanku TNT pri posameznih tipih celic so splošni spodbujevalci nastanka TNT in signalne poti, vključene v nastanek TNT, še slabo poznani. Zelo verjetno je, da različni mehanizmi prevladujejo v različnih vrstah celic. Pri začetku nastanka TNT ima pomembno vlogo polimerizacija aktina (56). V astrocitih se TNT oblikujejo med stresiranimi in nestresiranimi celicami. Njihovo tvorbo v glavnem nadzira trans- kripcijski dejavnik p53. V nevronih in astrocitih oksidativni stres povzroči akti- vacijo p53, ki posledično poveča izražanje receptorja epidermalnega rastnega dejav- nika (angl. epidermal growth factor receptor, EGFR), aktivira signalno pot PI3K/Akt/ mTOR in sproži nastanek TNT (19). V makro- fagih in podocitih pa je nastanek TNT spro- žen z izražanjem citosolne beljakovine M-Sec, preko katerega se proži polimeri- zacija globularnega aktina (G-aktin) in ki sproži začetek izvihavanja plazmaleme za tvorbo TNT (57, 58). TUNELSKE NaNOCEvKE IN VIVO Pomembna prelomnica pri raziskovanju TNT je bilo odkritje TNT med celicami imunskega sistema in vivo, in sicer med mieloidnimi celicami v roženici zdrave miši (15). TNT so odkrili tudi med makro- fagi v mišičnem tkivu miši, med osteo- klasti pri podganah ter med periciti v krvno- -možganski pregradi človeškega zarodka (17, 40, 59). V rakavem tkivu so TNT odkri- li v vzorcih tumorjev humanega pljučnega karcinoma in mezotelioma, tumorjih jajčnika in karcinoma grla (16, 60). Funkcionalne raziskave na TNT so bile narejene na miših z gliomi in miših z intrakranialno injekci- jo fluorescenčno označenega α-sinukleina (47, 61). Skupna lastnost TNT v tkivih je, da so pogosto ukrivljene, saj druge celice in gost preplet molekul v medceličnini preprečujejo, da bi se celice povezale z ravnimi TNT na najkrajši razdalji (15, 16). Raziskovanje TNT v tkivih je pomem- bno tako za razumevanje njihove fiziološke vloge kot tudi vloge TNT pri nastanku in razvoju bolezni, vendar je raziskav o TNT v tkivih neprimerljivo manj kot o TNT in vitro. Velik izziv je namreč prepoznava TNT v zapletenem večceličnem okolju z veliko medceličnine, kot so živalski mode- li ali tumorske resekcije. Prav tako še ne poznamo značilnega označevalca TNT, loč- ljivost svetlobne mikroskopije pa ne omo- goča morfološke opredelitve teh povezav v tkivnem okolju. Naslednji korak pri dolo- čanju patofiziološke vloge TNT v boleznih bo tudi povezati nove izsledke z etiologijo, 331Med Razgl. 2024; 63 (4): mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 331 napredovanjem in odzivom teh bolezni na trenutne načine zdravljenja. MOŽNOSTI UPORaBE TUNELSKIH NaNOCEvK v KLINIČNE NaMENE Kljub temu da so raziskave o TNT še vedno zelo bazične, rezultati kažejo na njihov morebiten pomen pri zdravljenju. V razis- kavah so TNT predstavljene predvsem kot strukture, ki jih pri zdravljenju tarčimo, ali kot strukture za tarčno dostavo učinkovin. V prvem primeru TNT predstavljajo možno tarčo za zdravila, ki bi s prekinitvijo TNT prekinila medcelični prenos signalov, onko- genih beljakovin, miRNA in spodbujeval- cev celičnih delitev ter s tem ustavila rast in širitev tumorja (62). Namreč, TNT med rakavimi celicami ter rakavimi in stro- malnimi celicami, ki tvorijo tumorsko mikrookolje, zelo verjetno pripomorejo k razvoju in napredovanju tumorja ter k pripravi na invazijo tumorja in nastanek zasevkov (63, 64). Ker se iz endotelijskih celic v rakave celice po TNT prenašajo mitohondriji in z njimi povezana odpornost na kemoterapevtike, bi tako s tarčenjem TNT lahko preprečili odpornost rakavih celic na kemoterapevtike (63). Tarčna zdra- vila, ki bi porušila TNT, bi bila zlasti korist- na kot pomožno zdravljenje v pooperativ- nem procesu, ko se ostanek posamičnih rakavih celic s pomočjo TNT lahko ponov- no poveže med sabo v maligni tumor (6). Čeprav specifični zaviralci nastajanja TNT še niso bili opisani, se nastajanje TNT in vitro lahko prekine z uporabo toksinov, ki depolarizirajo aktinske filamente, kot sta npr. citohalazin D ali latrunkulin A (39). Po drugi strani bi TNT-povezave lahko uporabili za izboljšanje prenosa med celi- cami in spodbujanje dostave terapevtikov do težko dostopnih populacij celic. Ker se po TNT prenašajo tudi liposomi, nano- in mikrodelci, bi lahko v prihodnosti s konju- gacijo le-teh s terapevtiki lahko izkoristili tarčno dostavo po TNT (17, 31, 32, 65). In vitro so to pokazali s prenašanjem več- funkcijskih liposomov po TNT med celica- mi glioblastoma (32). Zasnovali so tera- pevtske liposome, funkcionalizirane s proti- rakavim zdravilom doksorubicinom, ter s peptidom apolipoprotein E (apoE) in kloro- toksinom kot ligandoma za celice glio- blastoma. S tem so pokazali, da so TNT morebitno uporabne kot kanali za dostavo zdravil pri zdravljenju raka, saj omogoča- jo medcelično prerazporeditev tega zdravila v bližnje in oddaljene celice ter tako dose- žejo izolirane tumorske niše, ki so s pre- prosto difuzijo zdravil v možganskem parenhimu težko dosegljive (32). Predvsem je bilo odkritje prenosa mito- hondrijev po TNT v različnih celičnih modelih monokultur in kokultur tisto, kjer so se TNT pokazali kot osnova za celično zdravljenje, s katerim bi se lahko nado- meščali poškodovani mitohondriji. S pre- nosom zdravih mitohondrijev po TNT bi tako lahko nadomestili mitohondrije v poškodovanih celicah in podprli preživetje celic, kot smo to opisali pri prenosu zdra- vih mitohondrijev iz celic mikroglije po TNT v nevrone, nakopičene s skupki α-sinu- kleina (47). TNT imajo zanimivo dvojno vlogo, saj lahko blažijo ali spodbujajo neko bolezen- sko stanje. Povečanje ali zaviranje nastajan- ja TNT se kaže kot učinkovita strategija zdravljenja več bolezni, pri čemer je potre- ben razvoj učinkovitih in varnih zdravil, usmerjenih proti TNT. ZaKLJUČEK V preglednem članku smo povzeli ključne lastnosti TNT, njihovo vlogo v zdravih in patološko spremenjenih celicah ter možnost uporabe v klinične namene. V dvajsetih letih raziskav predvsem na in vitro modelih je poznavanje strukture, delovanja in vloge TNT v različnih patoloških stanjih napre- dovalo, še vedno pa ostajajo neznanka spe- cifični označevalci TNT ter signalne poti nastajanja TNT. Ne vemo tudi, ali so TNT lastnost vseh vrst rakavih celic, kakšne 332 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 332 spremembe lahko tovor, ki ga celice prej- mejo po TNT, povzroči in ali strukturna raz- nolikost TNT ustreza različnim vlogam v medceličnem sporazumevanju. V nadalj- njem raziskovanju je zato potreben razvoj 3D-in vitro modelov, ki bi bili bolj re- prezentativni pokazatelj bolezenskega okolja (tumorsko, nevrodegenerativno) kot klasični 2D-in vitro modeli. Izziv v razi- 333Med Razgl. 2024; 63 (4): skovanju TNT predstavljajo tudi napredne mikroskopske tehnike za opazovanje TNT v zapletenejšem 3D-okolju. TNT so pomembna celična struktura, ki jo je treba nadalje raziskovati na celično-biološki in molekularno-genetski ravni, da bi te razi- skave v prihodnosti omogočile nova in učinkovitejša zdravljenja. LITERaTURa 1. Rustom A, Saffrich R, Markovic I, et al. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 2004; 303 (5660): 1007–10. doi: 10.1126/science.1093133 2. Lagalwar S. Mechanisms of tunneling nanotube-based propagation of neurodegenerative disease proteins. Front Mol Neurosci. 2022; 15: 957067. doi: 10.3389/fnmol.2022.957067 3. Matejka N, Reindl J. Perspectives of cellular communication through tunneling nanotubes in cancer cells and the connection to radiation effects. Radiat Oncol. 2019; 14 (1): 218. doi: 10.1186/s13014-019-1416-8 4. Resnik N, Prezelj T, De Luca GMR, et al. Helical organization of microtubules occurs in a minority of tunneling membrane nanotubes in normal and cancer urothelial cells. Sci Rep. 2018; 8 (1): 17133. doi: 10.1038/s41598- 018-35370-y 5. Resnik N, Erman A, Veranič P, et al. Triple labelling of actin filaments, intermediate filaments and micro- tubules for broad application in cell biology: Uncovering the cytoskeletal composition in tunneling nanotubes. Histochem Cell Biol. 2019; 152 (4): 311–7. doi: 10.1007/s00418-019-01806-3 6. Resnik N, Baraga D, Glažar P, et al. Molecular, morphological and functional properties of tunnelling nanotubes between normal and cancer urothelial cells: New insights from the in vitro model mimicking the situation after surgical removal of the urothelial tumor. Front Cell Dev Biol. 2022; 10: 934684. doi: 10.3389/fcell.2022.934684 7. Baraga D. Ugotavljanje prisotnosti membranskih nanocevk med rakavimi in normalnimi urotelijskimi celicami [magistrsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2015. 8. Pinto G, Brou C, Zurzolo C. Tunneling nanotubes: The fuel of tumor progression?. Trends Cancer. 2020; 6 (10): 874–88. doi: 10.1016/j.trecan.2020.04.012 9. Veranič P, Lokar M, Schütz GJ, et al. Different types of cell-to-cell connections mediated by nanotubular structures. Biophys J. 2008; 95 (9): 4416–25. doi: 10.1529/biophysj.108.131375 10. Sartori-Rupp A, Cordero Cervantes D, Pepe A, et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of tnts in neuronal cells. Nat Commun. 2019; 10 (1): 342. doi: 10.1038/s41467-018-08178-7 11. Alimohamadi H, Ovryn B, Rangamani P. Modeling membrane nanotube morphology: The role of heterogeneity in composition and material properties. Sci Rep. 2020; 10 (1): 2527. doi: 10.1038/s41598-020-59221-x 12. Pulze L, Congiu T, Brevini TAL, et al. MCF7 spheroid development: New insight about spatio/temporal arrange- ments of TNTs, amyloid fibrils, cell connections, and cellular bridges. Int J Mol Sci. 2020; 21 (15): 5400. doi: 10.3390/ijms21155400 13. Whitehead J, Zhang J, Harvestine JN, et al. Tunneling nanotubes mediate the expression of senescence markers in mesenchymal stem/stromal cell spheroids. Stem Cells. 2020; 38 (1): 80–9. doi: 10.1002/stem.3056 14. Pinto G, Saenz-de-Santa-Maria I, Chastagner P, et al. Patient-derived glioblastoma stem cells transfer mitochondria through tunneling nanotubes in tumor organoids. Biochem J. 2021; 478 (1): 21–39. doi: 10.1042/BCJ20200710 15. Chinnery HR, Pearlman E, McMenamin PG. Cutting edge: Membrane nanotubes in vivo: A feature of MHC class II+ in the mouse cornea. J Immunol. 2008; 180 (9): 5779–83. doi: 10.4049/jimmunol.180.9.5779 mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 333 16. Lou E, Fujisawa S, Morozov A, et al. Tunneling nanotubes provide a unique conduit for intercellular transfer of cellular contents in human malignant pleural mesothelioma. PLoS One. 2012; 7 (3): e33093. doi: 10.1371/ journal.pone.0033093 17. Rehberg M, Nekolla K, Sellner S, et al. Intercellular transport of nanomaterials is mediated by membrane nanotubes in vivo. Small. 2016; 12 (14): 1882–90. doi: 10.1002/smll.201503606 18. Wang X, Gerdes HH. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 2015; 22 (7): 1181–91. doi: 10.1038/cdd.2014.211 19. Wang Y, Cui J, Sun X, et al. Tunneling-nanotube development in astrocytes depends on p53 activation. Cell Death Differ. 2011; 18 (4): 732–42. doi: 10.1038/cdd.2010.147 20. Lokar M, Kabaso D, Resnik N, et al. The role of cholesterol-sphingomyelin membrane nanodomains in the stability of intercellular membrane nanotubes. Int J Nanomedicine. 2012; 7: 1891–902. doi: 10.2147/IJN.S28723 21. Veranič P, Lokar M, Schütz GJ, et al. Different types of cell-to-cell connections mediated by nanotubular struc- tures. Biophys J. 2008; 95 (9): 4416–25. doi: 10.1529/biophysj.108.131375 22. Osteikoetxea-Molnár A, Szabó-Meleg E, Tóth EA, et al. The growth determinants and transport properties of tunneling nanotube networks between B lymphocytes. Cell Mol Life Sci. 2016; 73 (23): 4531–45. doi: 10.1007/ s00018-016-2233-y 23. Desir S, Wong P, Turbyville T, et al. Intercellular transfer of oncogenic KRAS via tunneling nanotubes intro- duces intracellular mutational heterogeneity in colon cancer cells. Cancers (Basel). 2019; 11 (7): 892. doi: 10.3390/ cancers11070892 24. Chakraborty R, Nonaka T, Hasegawa M, et al. Tunnelling nanotubes between neuronal and microglial cells allow bi-directional transfer of α-synuclein and mitochondria. Cell Death Dis. 2023; 14 (5): 329. doi: 10.1038/ s41419-023-05835-8 25. Sowinski S, Jolly C, Berninghausen O, et al. Membrane nanotubes physically connect T cells over long distances presenting a novel route for HIV-1 transmission. Nat Cell Biol. 2008; 10 (2): 211–9. doi: 10.1038/ncb1682 26. Onfelt B, Nedvetzki S, Benninger RK, et al. Structurally distinct membrane nanotubes between human macrophages support long-distance vesicular traffic or surfing of bacteria. J Immunol. 2006; 177 (12): 8476–83. doi: 10.4049/ jimmunol.177.12.8476 27. Lee HJ, Suk JE, Patrick C, et al. Direct transfer of alpha-synuclein from neuron to astroglia causes inflammatory responses in synucleinopathies. J Biol Chem. 2010; 285 (12): 9262–72. doi: 10.1074/jbc.M109.081125 28. Gittes F, Mickey B, Nettleton J, et al. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 1993; 120 (4): 923–34. doi: 10.1083/jcb.120.4.923 29. Kabaso D, Lokar M, Kralj-Iglič V, et al. Temperature and cholera toxin B are factors that influence formation of membrane nanotubes in RT4 and T24 urothelial cancer cell lines. Int J Nanomedicine. 2011; 6: 495–509. doi: 10.2147/IJN.S16982 30. Astanina K, Koch M, Jüngst C, et al. Lipid droplets as a novel cargo of tunnelling nanotubes in endothelial cells. Sci Rep. 2015; 5: 11453. doi: 10.1038/srep11453 31. Kristl J, Plajnšek KT, Kreft ME, et al. Intracellular trafficking of solid lipid nanoparticles and their distribution between cells through tunneling nanotubes. Eur J Pharm Sci. 2013; 50 (1): 139–48. doi: 10.1016/j.ejps.2013.04.013 32. Formicola B, D’Aloia A, Dal Magro R, et al. Differential exchange of multifunctional liposomes between glioblastoma cells and healthy astrocytes via tunneling nanotubes. Front Bioeng Biotechnol. 2019; 7: 403. doi: 10.3389/fbioe.2019.00403 33. Panasiuk M, Rychłowski M, Derewońko N, et al. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. J Virol. 2018; 92 (10): e00090–18. doi: 10.1128/JVI.00090-18 34. Gerdes HH, Bukoreshtliev NV, Barroso JF. Tunneling nanotubes: A new route for the exchange of components between animal cells. FEBS Lett. 2007; 581 (11): 2194–201. doi: 10.1016/j.febslet.2007.03.071 35. Alberts B. Molecular biology of the cell. 6th ed. New York: Garland Science; 2014. 36. Uhl J, Gujarathi S, Waheed AA, et al. Myosin-X? is essential to the intercellular spread of HIV-1 Nef through tunneling nanotubes. J Cell Commun Signal. 2019; 13 (2): 209–24. doi: 10.1007/s12079-018-0493-z 37. Resnik N, Baraga D, Glažar P, et al. Molecular, morphological and functional properties of tunnelling nanotubes between normal and cancer urothelial cells: New insights from the in vitro model mimicking the situa- tion after surgical removal of the urothelial tumor. Front Cell Dev Biol. 2022; 10: 934684. doi: 10.3389/ fcell.2022.934684 38. Wang X, Bukoreshtliev NV, Gerdes HH. Developing neurons form transient nanotubes facilitating elec- trical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 2012; 7 (10): e47429. doi: 10.1371/ journal.pone.0047429 334 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 334 39. Kretschmer A, Zhang F, Somasekharan SP, et al. Stress-induced tunneling nanotubes support treatment adaptation in prostate cancer. Sci Rep. 2019; 9 (1): 7826. doi: 10.1038/s41598-019-44346-5 40. Errede M, Mangieri D, Longo G, et al. Tunneling nanotubes evoke pericyte/endothelial communication during normal and tumoral angiogenesis. Fluids Barriers CNS. 2018; 15 (1): 28. doi: 10.1186/s12987-018-0114-5 41. Schiller C, Huber JE, Diakopoulos KN, et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer of MHC class I molecules. Hum Immunol. 2013; 74 (4): 412–6. doi: 10.1016/j.humimm.2012.11.026 42. Schiller C, Diakopoulos KN, Rohwedder I, et al. LST1 promotes the assembly of a molecular machinery responsible for tunneling nanotube formation. J Cell Sci. 2013; 126 (3): 767–77. doi: 10.1242/jcs.114033 43. Zhang L, Zhang Y. Tunneling nanotubes between rat primary astrocytes and C6 glioma cells alter proliferation potential of glioma cells. Neurosci Bull. 2015; 31 (3): 371–8. doi: 10.1007/s12264-014-1522-4 44. Takahashi A, Kukita A, Li YJ, et al. Tunneling nanotube formation is essential for the regulation of osteo- clastogenesis. J Cell Biochem. 2013; 114 (6): 1238–47. doi: 10.1002/jcb.24433 45. Watson DC, Bayik D, Storevik S, et al. GAP43-dependent mitochondria transfer from astrocytes enhances glioblastoma tumorigenicity. Nat Cancer. 2023; 4 (5): 648–64. doi: 10.1038/s43018-023-00556-5 46. Abounit S, Bousset L, Loria F, et al. Tunneling nanotubes spread fibrillar α-synuclein by intercellular traf- ficking of lysosomes. EMBO J. 2016; 35 (19): 2120–38. doi: 10.15252/embj.201593411 47. Scheiblich H, Dansokho C, Mercan D, et al. Microglia jointly degrade fibrillar alpha-synuclein cargo by distribution through tunneling nanotubes. Cell. 2021; 184 (20): 5089-106.e21. doi: 10.1016/j.cell.2021.09.007 48. Hurtig J, Chiu DT, Onfelt B. Intercellular nanotubes: Insights from imaging studies and beyond. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2010; 2 (3): 260–76. doi: 10.1002/wnan.80 49. Pepe A, Pietropaoli S, Vos M, et al. Tunneling nanotubes provide a route for SARS-CoV-2 spreading. Sci Adv. 2022; 8 (29): eabo0171. doi: 10.1126/sciadv.abo0171 50. Gousset K, Marzo L, Commere PH, et al. Myo10 is a key regulator of TNT formation in neuronal cells. J Cell Sci. 2013; 126 (19): 4424–35. doi: 10.1242/jcs.129239 51. Kimura S, Hase K, Ohno H. Tunneling nanotubes: Emerging view of their molecular components and formation mechanisms. Exp Cell Res. 2012; 318 (14): 1699–706. doi: 10.1016/j.yexcr.2012.05.013 52. Jansens RJJ, Van den Broeck W, De Pelsmaeker S, et al. Pseudorabies virus US3-induced tunneling nanotubes contain stabilized microtubules, interact with neighbouring cells via cadherins and allow intercellular molecular communication. J Virol. 2017; 91 (19): e00749–17. doi: 10.1128/JVI.00749-17 53. Kimura S, Hase K, Ohno H. The molecular basis of induction and formation of tunneling nanotubes. Cell Tissue Res. 2013; 352 (1): 67–76. doi: 10.1007/s00441-012-1518-1 54. Zhu D, Tan KS, Zhang X, et al. Hydrogen peroxide alters membrane and cytoskeleton properties and increases intercellular connections in astrocytes. J Cell Sci. 2005; 118 (16): 3695–703. doi: 10.1242/jcs.02507 55. Valdebenito S, Malik S, Luu R, et al. Tunneling nanotubes, TNT, communicate glioblastoma with surround- ing non-tumor astrocytes to adapt them to hypoxic and metabolic tumor conditions. Sci Rep. 2021; 11 (1): 14556. doi: 10.1038/s41598-021-93775-8 56. Zhang J, Zhang Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 2013; 56 (11): 994–9. doi: 10.1007/s11427-013-4548-3 57. Hase K, Kimura S, Takatsu H, et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 2009; 11 (12): 1427–32. doi: 10.1038/ncb1990 58. Barutta F, Kimura S, Hase K, et al. Protective role of the M-Sec-tunneling nanotube system in podocytes. J Am Soc Nephrol. 2021; 32 (5): 1114–30. doi: 10.1681/ASN.2020071076 59. Zhang JQ, Takahashi A, Gu JY, et al. In vitro and in vivo detection of tunneling nanotubes in normal and patho- logical osteoclastogenesis involving osteoclast fusion. Lab Invest. 2021; 101 (12): 1571–84. doi: 10.1038/s41374- 021-00656-9 60. Lou E, O’Hare P, Subramanian S, et al. Lost in translation: Applying 2D intercellular communication via tunneling nanotubes in cell culture to physiologically relevant 3D microenvironments. FEBS J. 2017; 284 (5): 699–707. doi: 10.1111/febs.13946 61. Osswald M, Jung E, Sahm F, et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 2015; 528 (7580): 93–8. doi: 10.1038/nature16071 62. Thayanithy V, Dickson EL, Steer C, et al. Tumor-stromal cross talk: Direct cell-to-cell transfer of oncogenic microRNAs via tunneling nanotubes. Transl Res. 2014; 164 (5): 359–65. doi: 10.1016/j.trsl.2014.05.011 63. Lou E, Fujisawa S, Barlas A, et al. Tunneling nanotubes: A new paradigm for studying intercellular communication and therapeutics in cancer. Commun Integr Biol. 2012; 5 (4): 399–403. doi: 10.4161/cib.20569 335Med Razgl. 2024; 63 (4): mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 335 64. Roehlecke C, Schmidt MHH. Tunneling nanotubes and tumor microtubes in cancer. Cancers (Basel). 2020; 12 (4): 857. doi: 10.3390/cancers12040857 65. Ferrati S, Shamsudeen S, Summers HD, et al. Inter-endothelial transport of microvectors using cellular shuttles and tunneling nanotubes. Small. 2012; 8 (20): 3151–60. doi: 10.1002/smll.201200472 Prispelo 15. 9. 2023 336 Nataša Resnik, Mateja Erdani Kreft vloga tunelskih nanocevk v medceličnem sporazumevanju … mr24_4_Mr10_2.qxd 17.12.2024 10:55 Page 336