Acta agriculturae Slovenica, 121/2, 1–15, Ljubljana 2025 doi:10.14720/aas.2025.121.2.21981 Review article / pregledni znanstveni članek Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin Sabina BERNE 1, 2 Received March 03, 2025, accepted March 30, 2025 Delo je prispelo 3. marec 2025, sprejeto 30. marec 2025 1 University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Agronomy Department, Ljubljana, Slovenia 2 korespondenčni avtor: sabina.berne@bf.uni-lj.si Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin Izvleček: Podnebne spremembe, nove bolezni ter ome- jeni viri vplivajo na trajnostno pridelavo zadostne količine kakovostne hrane, kar zahteva stalno prilagajanje sort kme- tijskih rastlin obstoječim in prihodnjim sistemom pridelave. Sorte kmetijskih rastlin morajo biti v prihodnosti odpornejše na biotske in abiotske dejavnike, prav tako pa morajo prejeto energijo in hranila učinkoviteje pretvoriti v kakovostne sesta- vine, pri čemer je veliko prostora za inovacije. Z razvojem ra- stlinske biotehnologije in genetike, uporabo znanj pridobljenih z visokozmogljivimi omskimi pristopi in naprednimi statistič- nimi analizami ter z metodami strojnega učenja se je močno pospešilo doseganje specifičnih žlahtniteljskih ciljev, ki lahko pomembno prispevajo k trajnostnemu kmetijstvu in varni pre- skrbi s hrano. S pregledom znanstvene literature pojasnjujemo, kako delujejo nove genomske tehnike, v čem se razlikujejo od splošno sprejetih metod žlahtnjenja in kakšne prednosti imajo v primerjavi s klasičnimi tehnikami žlahtnjenja rastlin. V na- daljevanju obravnavamo, katere rastline in njihove lastnosti so bile spremenjene z novimi tehnikami, kako je oblikovana ustre- zna zakonodaja, tudi z vidika gensko spremenjenih organiz- mov, ter povzemamo zaključke javne razprave o njihovi potrebi in možnih tveganjih. Ključne besede: preurejanje genoma, nove genomske tehnike, NGT, žlahtnjenje rastlin, agronomske lastnosti, GSO, zakonska ureditev New genomic techniques for precision plant breeding Abstract: Climate change, new diseases and resource constraints are affecting the sustainable production of sufficient and quality food, requiring the continuous adaptation of plant varieties to existing and future production systems. Crop vari- eties of the future must be more resilient to biotic and abiotic stresses, and able to convert the energy and nutrients they re- ceive into food more efficiently, presenting significant oppor- tunities for innovation. The development of plant biotechnol- ogy and genetics, the application of knowledge gained from high-throughput omics approaches, and advanced statistical analysis and machine learning methods have greatly acceler- ated the identification of specific breeding targets that can make an important contribution to sustainable agriculture and food security. We review the scientific literature to explain how new genomic techniques work, how they differ from commonly ac- cepted breeding methods and what advantages they have over traditional techniques. We then discuss which plants, and their traits have been modified, the intricacies of relevant legislation, particularly from the perspective of GMOs, and summarise the conclusions drawn from the public debate concerning the ne- cessity and potential risks of these techniques. Key words: genome editing, new genomic techniques, NGT, plant breeding, agronomic traits, GMO, legislation Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 20252 S. BERNE 1 OD UDOMAČITVE DO MOLEKULARNE- GA ŽLAHTNJENJA RASTLIN Žlahtnjenje rastlin je starodavna dejavnost, ki sovpada z začetki kmetijstva okrog 12.000 let pred na- šim štetjem. Nedavni genetski in arheobotanični dokazi kažejo na obstoj vsaj petih neodvisnih središč udoma- čitve gojenih rastlin: riža na Kitajskem, žit in stročnic na Bližnjem vzhodu, koruze, fižola in buč v Srednji Ameriki, krompirja in kvinoje v Andih ter koruze, manioke, buč, sladkega krompirja in maranta v jugozahodni Amazoniji (Iriarte in sod., 2020; G. Larson in sod., 2014). Ljudje so na svojih poljih pridelovali rastline in izbirali lastnosti kot so večji plodovi, semena in boljši okus. Semena naj- boljših rastlin so shranjevali za setev v naslednji rastni sezoni. Takšne poskusne selekcijske metode so bile pred- hodnice zgodnjih postopkov žlahtnjenja rastlin (Slika 1). S pojavom Mendelove genetike v 19. stoletju ter boljšim razumevanjem principov dedovanja so se razvili sistematični pristopi križanja rastlin, ki so vključevali ro- dovnike in linijsko selekcijo ter se osredotočali na pred- vidljivo dedovanje lastnosti (Louwaars, 2018; Mittelsten Scheid, 2022). Pomemben mejnik v žlahtnjenju rastlin v začetku 20. stoletja je dosegel George Shull s poskusi kri- žanja linij koruze in opisom pojava heteroze. Ugotovil je, da sta pridelek in vitalnost pri inbridiranih linijah koruze na splošno slabša, medtem ko je pridelek hibridov (nji- hovih potomcev) pogosto presegal pridelek inbridiranih starševskih linij. Poleg tega so imeli hibridi zelo zažele- no lastnost, bili so uniformni (Crow, 1998).Velik uspeh hibridov koruze na trgu je prispeval k hitremu prenosu tehnologije tudi na druge kmetijske rastline, predvsem tujeprašne poljščine. Temelj sedanjemu molekularnemu žlahtnjenju rastlin zagotovo predstavlja odkritje strukture DNK (Watson in Crick, 1953), ki je omogočilo pripisovanje genotipa fenotipu ter oblikovanje centralne dogme mole- kularne biologije. Poleg osnovnih molekularnih tehnolo- gij razvitih v osemdesetih in devetdesetih letih prejšnjega Slika 1: Zgodovinski mejniki v žlahtnjenju rastlin Figure 1: Historical milestones of plant breeding Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 3 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin stoletja, kot so kloniranje, določanje nukleotidnega za- poredja (sekvenciranje) in tehnologija rekombinantne DNK (Berg in Mertz, 2010; Duffin in Mach, 2022; Shen- dure in sod., 2017), je bil za sodobno žlahtnjenje rastlin ključen tudi napredek na področju rastlinske biotehnolo- gije, ki je zagotovil gojenje rastlinskih celic in tkiv in vitro ter regeneracijo in klonsko razmnoževanje novih rastlin (Thorpe, 2007). Osnovno načelo žlahtnjenja rastlin je ne glede na vrsto pridelka vedno enako: temelji na genetski raznoli- kosti, ki je nastala naravno z mutacijami in spolnim raz- množevanjem, ali pa jo je z različnimi metodami ustvaril človek. Hermann J. Muller je prvi opisal induciranje mu- tacij z rentgenskimi žarki pri vinskih mušicah (Muller, 1928). Njegove ugotovitve je kmalu zatem potrdil Lewis J. Stadler z obsevanjem semen ječmena z rentgenskimi žarki ali obdelavo z radijem (Stadler, 1928). Tretirane rastline so imele recesivne mutacije povezane s klorofi- lom, ki naj bi bile posledica kromosomske aberacije, ali uničenja gena. Povzročanje mutacij z ionizirajočim se- vanjem ali kemijskimi mutageni je še vedno pomemb- no orodje za žlahtnjenje rastlin, kot tudi za rastlinsko genetiko in funkcijsko genomiko (Jankowicz-Cieslak in sod., 2016; Sikora in sod., 2012). Čeprav so z mutacijskim žlahtnjenjem v zadnjih osemdesetih letih pridobili že več kot 3.000 novih sort (Maluszynski, 2001), se na regula- torni ravni ne razlikuje med rastlinami, ki so nove last- nosti pridobile z mutacijskim žlahtnjenjem in rastlinami, ki so nove lastnosti pridobile s klasičnim žlahtnjenjem s križanji; potrebni niso nobeni postopki presoje tveganja in odobritve pred dajanjem na trg, prav tako zanje ni po- trebno posebno označevanje. Mutacije pogosto ne prinašajo nobenih koristi, ven- dar se občasno lahko pojavijo nove in dragocene lastno- sti. S klasičnim genskim inženiringom je mogoče gene za želene lastnosti vnesti v genom rastlinskih celic. Naključ- no vgrajena zaporedja DNK so lahko natančna kopija zaporedij, ki so že prisotna v vrsti, lahko pa izvirajo iz druge vrste. Tako so leta 1983 v celice tobaka prvič vnesli bakterijska gena, ki sta se pod rastlinskim promotorjem funkcionalno izrazila in tobaku zagotovila odpornost na antibiotik kanamicin (Herrera-Estrella in sod., 1983). Produkt klasičnega genskega inženiringa so gensko spre- menjeni organizmi (GSO) oziroma gensko spremenjene (GS) rastline ali transgene rastline. Sledili so prvi poljski poskusi s transgenimi rastlinami odpornimi na herbicide leta 1986, medtem ko je bila prva vrsta transgene rastline, ki je prišla na trg leta 1994, paradižnik z upočasnjenim zorenjem (Herrera-Estrella in sod., 2005). Po podatkih iz leta 2023 je bilo z GS rastlinami zasajenih 206,3 milijona hektarjev, kar predstavlja 13,4 % celotne svetovne kme- tijske površine, pri čimer prevladujejo GS soja, koruza in bombaž z odpornostjo na herbicide in insekte (X. Cheng in sod., 2024). Od objave prvega rastlinskega genoma navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) leta 2000 (Kaul in sod., 2000) je bilo javno razkritih več kot 700 genomov zelenih rastlin Viridiplantae (O’Leary in sod., 2024), pri čemer prevladujejo gojene rastline (Marks in sod., 2021). Dostopnost genomskih podatkov za asoci- acijske raziskave po celotnem genomu (angl. genome- -wide association study, GWAS) in analize pangenoma ter razvoj novih tehnik sekvenciranja, kot je na primer genotipizacija s sekvenciranjem (angl. genotyping by sequencing, GBS), so privedli do odkritja velikega šte- vila molekularnih označevalcev (angl. marker) ter loku- sov kvantitativnih lastnosti (angl. quantitative trait loci, QTL), ki so povezani z različnimi agronomsko zaželeni- mi lastnostmi (He in sod., 2014; Nadeem in sod., 2018). V zadnjem času se v žlahtniteljskih programih, poleg selekcije na podlagi genomov, uporabljajo visoko zmogljivi pristopi fenotipizacije, metabolomike, prote- omike in transkriptomike, ki so v kombinaciji z napre- dnimi statističnimi orodji in metodami strojnega učenja močno pospešili realizacijo specifičnih žlahtniteljskih ciljev (Sun in sod., 2024). Z najnovejšim sklopom orodij za preurejanje genoma (angl. genome editing) je mogoče izvesti usmerjene spremembe na točno določenem me- stu v genomu rastlinske vrste in v relativno kratkem času izboljšati izbrane lastnosti (Pixley in sod., 2022). Poleg teh orodij so v nadaljevanju predstavljene posamezne nove genomske tehnike, mehanizmi njihovega delovanja in predlagano zakonsko (ne)urejanje področja v EU. 2 KAJ SO NOVE GENOMSKE TEHNIKE? Nove genomske tehnike (NGT) so po definiciji „tehnike, ki lahko spremenijo genski material organizma in so bile razvite po objavi Direktive EU 2001/18/ES o namernem sproščanju gensko spremenjenih organizmov v okolje “ (Direktiva - 2001/18 - EN - EUR-Lex, b. d.). Z uporabo nekaterih NGT lahko na ravni zaporedja DNK povzročijo komaj zaznavne spremembe v obliki variacij posameznih nukleotidov (zamenjave (substitucije), krat- ke vstavitve (insercije) ali izbrise (delecije)), s pomočjo drugih pa lahko uvedejo daljše vstavitve ali izbrise od- sekov DNK. Te spremembe lahko ustvarijo celični po- pravljalni mehanizmi DNK, ki so nagnjeni k naključnim napakam, ali pa nastanejo namerno s kopiranjem iz do- norske matrice DNK. Le-ta lahko vsebuje i) homologna zaporedja, ki so prisotna pri drugem posamezniku iste vrste (npr. divjem tipu rastline, ki je prednik gojene ra- stline) ali ii) heterologna zaporedja iz drugih vrst, ki se v naravi ne morejo križati (transgene rastline). Kopira- Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 20254 S. BERNE na zaporedja se nato mestno specifično integrirajo v genom ciljnega organizma, pri čemer nastane produkt, podoben tistemu, ki ga dobimo s klasičnim genskim in- ženirstvom. Na ravni zaporedja RNK lahko z NGT uve- demo spremembe, kot so variacije posameznih nukle- otidov, modulacije spajanja pre-mRNK in razgradnje RNK, vključno z nekodirajočimi RNK, ki imajo regula- torne učinke na druge gene (Broothaerts in sod., 2021). NGT vključujejo naslednje štiri skupine tehnik (Slika 2), kot so jih razložili (Broothaerts in sod., 2021): • tehnike, ki povzročijo dvoverižne prelome DNK, vključno z RNK usmerjanimi nukleazami (kot so na primer Cas9 in Cpf1) povezanimi z gručami enakomerno prekinjenih kratkih palindromskih ponovitev (angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR), nukleaze TAL efektorjev (angl. transcription activator-li- ke effector nucleases, TALEN), nukleaze z motivi cinkovih prstov (angl, zinc finger nucleases, ZNF) ter ‘prenašalne’ endonukleaze (angl. homing nu- clease); • tehnike, ki povzročijo enoverižne prekinitve DNK ali ne vključujejo prekinitve DNK, kot so mutageneza posredovana z oligonukleotidi (angl. oligonucleotide-directed mutagenesis, ODM), urejevalci baz (angl. base editors, BE) ali sistem urejanja z vnosom (prime editing, PE); • epigenetske tehnike, kot so z RNK usmerjana me- tilacija DNK (RNA-directed DNA methylation, RdDM) in interferenca CRISPR (CRISPRi); • tehnike, ki preurejajo RNK. Kot je razvidno iz Slike 2, lahko načrtno povzro- čimo specifične spremembe, ki so usmerjene v točno določeno regijo v genomu, vplivamo na epigenom ali na RNK, zato imajo NGT velik potencial v žlahtnjenju rastlin. Rezultati NGT so tudi bolj predvidljivi, čeprav obstaja majhna verjetnost za uvedbo nenačrtovane spremembe drugod v genomu (angl. ‘off-target’ effect) (Anderson in sod., 2015). Določene NGT so bile razvite, da se odpravi tve- ganja (npr. nevarnost za okolje in vpliv na zdravje), ki omejujejo uporabo transgenih rastlin. Cisgeneza tako vključuje gensko spreminjanje z uporabo popolne ko- pije naravnih genov, vključno z izvornimi regulatorni- mi zaporedji, ki pripadajo spolno združljivim vrstam, medtem ko se intrageneza nanaša na prenos edinstve- nih kombinacij genov in regulatornih zaporedij znotraj iste vrste (Vasudevan in sod., 2023). 3 DOSTAVNI SISTEMI ZA VNOS MOLE- KULARNIH ORODIJ NGT Najpogosteje uporabljena metoda za vnos in sta- bilno integracijo transgenov v rastline je transformaci- ja posredovana z bakterijo Agrobacterium tumefaciens (ATMT) (Altpeter in sod., 2016). Drug način vnosa ge- nov je obstreljevanje s tako imenovano ‚gensko pištolo‘, pri čemer je DNK vezana na kovinske delce, ki se v ce- lice izstrelijo z veliko hitrostjo. Čeprav na ta način lah- ko transformiramo širši nabor genotipov kot z ATMT, je velika pomanjkljivost te metode slabša regeneracija rastlin, kot tudi majhno število kopij in integracija na številna mesta v genomu (Wu in sod., 2015). Neposre- den vnos rekombinantne DNK iz gojišča v protoplaste, s pomočjo elektroporacije, polietilenglikola (PEG) ali lipofekcije se zaradi zahtevne priprave protoplastov in njihove regeneracije uporablja le pri določenih rastli- nah (Altpeter in sod., 2016). Virusni vektorji pripravlje- ni iz geminivirusov (krožnih enoverižnih DNK virusov s širokim naborom rastlinskih gostiteljev) imajo števil- ne prednosti pri vnosu tuje DNK ali RNK v rastline: preprosta manipulacija, veliko število kopij na celico, sistemsko širjenje po rastlini in učinkovita ekspresija genov (Cody in Scholthof, 2019). Omejitve te tehnike so majhen genom virusov, prehodna ekspresija genov, spre- memba se ne deduje, stranski učinki na gostitelja ter mož- nost prenosa na druge rastline. Trenutno je v ospredju razvoj naprednih dostavnih sistemov iz nanomaterialov, kot so karbonske nanocevke, polporozni silikatni nano- delci, nanokompoziti iz gline (angl. clay nanosheets), ce- lice penetrirajoči peptidi (angl. cell penetrating peptides, CPP), nanostrukture DNK in kvantne točke (Demirer in sod., 2021; Li in sod., 2024). Poleg ciljne dostave, nadzo- rovanega izražanja in zaščite pred razgradnjo, nekateri nanodelci na podlagi fluorescence omogočajo sledenje dedni spremembi in izražanja v rastlini. Na podlagi integrirane transgene DNK se v tarčnih celicah izrazijo aktivne komponente za NGT, ki povzro- čijo spremenjeno zaporedje DNK, epigenomski učinek Slika 2: Delitev novih genomskih tehnik Figure 2: Classification of new genomic techniques Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 5 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin ali učinek na ravni RNK. Po opravljeni modifikaciji se ta integriran sistem lahko odstrani s križanjem v naslednji generaciji rastlin, ali z uporabo mestno specifične rekom- binacije, kot je na primer sistem Cre-LoxP (Broothaerts in sod., 2021). Alternativa integraciji transgenov je spreminjanje genoma ob prehodni ekspresiji aktivnih komponent za NGT (proteinov in/ ali RNK) iz rekombinantnih plaz- midnih ali virusnih vektorjev, ki se po določenem času razgradijo z endogeno nukleazno aktivnostjo (Veillet in sod., 2019). Poleg tega so opisani tudi pristopi NGT, kjer se z biolistiko ali s transformacijo protoplastov s PEG v rastlinske celice vnesejo zgolj proteini, ribonukleoprote- inski delci ali mRNK (Broothaerts in sod., 2021). 4 MOLEKULARNI MEHANIZMI UREJANJA GENOMA 4.1 SKUPINA 1 – NGT, KI POVZROČIJO DVOVERIŽNE PRELOME DNK Nastanek dvoverižnih prelomov DNK je naravni fe- nomen, ki nastane pri podvojevanju DNK, rekombinaciji DNK, transpoziciji DNK, po delovanju produktov meta- bolizma (reaktivne kisikove zvrsti) ali eksogenih dejavni- kov (UV, ionizirajoče sevanje, kemijski mutageni) (Meh- ta in Haber, 2014). Prelomi DNK so nevarni, saj lahko vodijo v celično smrt, če jih popravljalni mehanizmi ne odpravijo dovolj hitro. Preurejanje genomov pri tej skupini tehnik poteka v dveh korakih in sicer se začne s prepoznavo tarčnega zaporedja in vezavo endonukleaze, ki povzroči dvove- rižni prelom DNK, ter nadaljuje s popravilom preloma DNK s celičnimi popravljalnimi mehanizmi. Prva gene- racija nukleaz, ki se je uporabljala za mestno specifično preurejanje genomov, je temeljila na prepoznavi DNK po interakciji s proteini, kot so nukleaze TAL efektorjev (angl. transcription activator-like effector nucleases, TA- LEN), nukleaze z motivi cinkovih prstov (angl, zinc fin- ger nucleases, ZNF) ter ‚prenašalne‘ endonukleaze (angl. homing endonuclease ali tudi meganuclease) (Slika 3). Nova generacija nukleaz, kot so sistemi CRISPR/Cas, pa tarčna mesta DNK prepozna po interakciji z RNK (Bro- othaerts in sod., 2021). Kriterij* Klasično žlahtnjenje Mutacijsko žlahtnjenje Genski inženiring Nove genomske tehnike Način uvedbe genske spremembe Križanje starševskih linij Ionizirajoče sevanje ali mutagene kemikalije Tehnologija rekom- binantne DNK Preurejanje genoma Število genskih spre- memb Nekaj genov do celoten genom Nekaj 100 do nekaj 1000 1-8 1 ali več Rezultat žlahtnjenja Zaželene spremembe genoma skupaj z drugim haploidnim genomom Naključne spremembe genoma Naključna integracija transgena Načrtne mestno specifične spremembe Povratno križanje 5-7 generacij Več generacij Ni potrebno Ni potrebno Na trgu 8-10 let 8-10 let 8-12 let 2-5 let Uredba Varnostno testiranje ni zahtevano Varnostno testiranje ni zahtevano Potrebno varnostno testiranje, močno regu- lirano Potrebno varnostno testiranje, mešana regu- lacija Preglednica 1: Primerjava novih genomskih tehnik (NGT) in uveljavljenih žlahtniteljskih metod Table 1: Comparison of new (NGT) genomic techniques and conventional breeding methods *Povzeto po (Chen in sod., 2019; Gao, 2021) Slika 3: Splošen mehanizem delovanja različnih tipov mestno specifičnih nukleaz Figure 3: General mode of action of different types of site- directed nucleases Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 20256 S. BERNE 4.1.1 'Prenašalne' endonukleaze V naravi zapise za ‚prenašalne‘ endonukleaze najde- mo ali v intronih ali v inteinih (Marcaida in sod., 2009). Funkcija ‚prenašalnih‘ endonukleaz je iniciacija rekom- binacije z uvedbo dvoverižnih prelomov DNK, ki so asi- metrični. Za razliko od običajnih restrikcijskih encimov so njihova prepoznavna mesta zelo dolga (12-40 bp) in izjemno redka. Poleg tega pri prepoznavi tarčnega zapo- redja lahko tolerirajo manjše spremembe zaporedja nu- kleotidov. Za preurejanje genomov so te encime priredili z mutagenezo in presejalnim testiranjem, da so domeno za prepoznavo DNK ločili od katalitičnega mesta in s kom- biniranjem različnih ‚prenašalnih‘ nukleaz razširili nabor vezavnih mest (Arnould in sod., 2011). Ker je inženiring teh encimov neučinkovit, časovno potraten in zahteven, se jih danes le redko uporablja za preurejanje genomov. 4.1.2 Nukleaze z motivi cinkovih prstov (ZFN) ZFN so hibridni encimi, ki so jih ustvarili z združe- vanjem endonukleaze, kot je bakterijski encim FokI, in proteinov s cinkovimi prsti, ki prepoznajo in se vežejo na različna zaporedja DNK (Osakabe in Osakabe, 2015). V domeni za vezavo DNK najdemo 3-4 cinkove prste, pri čemer je vsak sestavljen iz tripleta baz. Nukleazna do- mena FokI za cepitev DNK potrebuje dimerizacijo, zato se morata dve ZFN vezati na nasprotni verigi DNK. To pomeni, da je prepoznavno zaporedje dolgo 18 bp, kar je dovolj za določitev edinstvenega tarčnega mesta znotraj genoma. Omejitve ZFN, kot so zahteven inženiring tarčnih mest, aktivnost ter občasna citotoksičnost (verjetno po- vezana z nenačrtovanim delovanjem na drugih tarčnih mestih), so prispevale k manjši uporabi ZFN za preureja- nje genomov rastlin (Broothaerts in sod., 2021). 4.1.3 Nukleaze TAL efektorjev (TALEN) Efektorji TAL so transkripcijski aktivatorji, ki so jih odkrili pri bakterijah rodu Xanthomonas (Mak in sod., 2012). Ko so jih po vzoru ZFN načrtno združili z endo- nukleazami, kot je encim FokI, so ustvarili mestno speci- fične nukleaze TALEN (Becker in Boch, 2021). Domena za vezavo na DNK je sestavljena iz motivov tandemskih ponovitev 33-35 aminokislin. Vsak motiv prepozna po- samezno bazo v zaporedju DNK, pri čemer sta pomemb- ni predvsem aminokislini v motivu na mestih 12 in 13. Motive lahko med seboj poljubno kombiniramo, da za- gotovimo bolj specifično prepoznavo tarčnih mest. Tako kot pri ZFN je tudi pri TALEN za cepitev DNK potrebna vezava nukleaze na nasprotnih verigah DNK in dimeri- zacija. Inženiring domene za vezavo DNK zahteva veliko truda in nekaj poskusnega testiranja, poleg tega je sama velikost konstruktov omejitev za številne dostavne siste- me (Broothaerts in sod., 2021). 4.1.4 Sistem CRISPR-Cas Sistem CRISPR-Cas je vsestransko in najpogosteje uporabljeno orodje za preurejanje genoma. Tehnologija izvira iz prokariontskega imunskega sistema tipa II, ki je prilagodljiv obrambni sistem odvisen od RNK, ki bakte- rije in arheje ščiti pred fagnimi okužbami ter drugimi in- vazivnimi genskimi elementi (Barrangou in sod., 2007). Lokusi CRISPR-Cas vsebujejo nekaj sto kratkih odsekov DNK (30-40 bp), ostankov predhodnih okužb, tako ime- novanih protovmesnikov, ki so ločeni s ponovitvami dol- gimi 25-35 bp. Ti protovmesniki se prepišejo v CRISPR RNK (crRNA) in povežejo v kompleks s trans-aktivno CRISPR RNK (tracrRNA), na katerega se veže nukleaza Cas. Nastane aktiven ribonukleoproteinski kompleks, ki je namenjen razgradnji tujih nukleinskih kislin. Z inženiringom so združili crRNK in tracrRNK v usmerjevalno RNK (angl. single-guide RNA, sgRNA) ter obdržali ključne lastnosti: 20 nukleotidov dolgo za- poredje na 5‘ koncu sgRNK, ki se veže na komplemen- tarna mesta tarčne DNK, ter dvoverižno strukturo na 3‘ koncu, kamor se veže Cas (Jinek in sod., 2012). Tako je nastal preprost dvokomponentni sistem, v katerem lahko s spremembami 20 nukleotidov v sgRNK programiramo sistem CRISPR-Cas, da se usmeri na katerokoli zapored- je DKA, če le meji na PAM (angl. protospacer adjacent motif), 2-6 nukleotidov dolgo zaporedje takoj za tarčnim mestom. V primeru najpogosteje uporabljane nuklea- ze Cas9 iz bakterije Streptococcus pyogenes Rosenbach 1884 je to zaporedje 5‘-NGG-3‘, pri čemer je prvi nukle- otid poljuben, sledita pa mu dva zaporedna gvaninska nukleotida (Doudna in Charpentier, 2014). Od leta 2012 so odkrili številne ortologe Cas9 in jih razdelili v dva razreda ter 6 tipov glede na število podenot in njihovo arhitekturo (Makarova in sod., 2019). Sistemi CRISPR- -Cas razreda 1 imajo efektorske module, sestavljene iz več proteinov Cas, ki tvorijo kompleks za vezavo crRNK in delujejo skupaj pri vezavi in procesiranju tarče. Siste- mi razreda 2 imajo en sam večdomenski protein, ki veže crRNK in je funkcionalno podoben celotnemu efektor- skemu kompleksu razreda 1. Tehnologija CRISPR-Cas se še naprej razvija, vključno z izboljšavami ter novimi načini uporabe. Po- sebna pozornost je namenjena zmanjševanju vplivov na nenačrtovana tarčna mesta, predvsem z natančnim izbo- rom tarčnih mest in načrtovanjem sgRNK, zmanjšanjem izražanja Cas9 z uporabo šibkih promotorjev, uvedbo Cas-mRNKK ali ribonukleoproteinskih kompleksov na- mesto DNK vektorjev ter uporabo delno ali popolnoma Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 7 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin inaktivne različice Cas (nikaze ali dCas) (Broothaerts in sod., 2021). 4.1.5 Popravilo dvoverižnega preloma DNK Drug korak pri urejanju genoma je popravilo dvo- verižnih prelomov DNK. V evkariontskih celicah obsta- jata dva mehanizma: povezovanje nehomolognih koncev (angl. non-homologous end joining, NHEJ) in popra- vljanje na podlagi homologije (angl. homology-directed repair, HDR) (Osakabe in Osakabe, 2015). Popravilo z NHEJ je pogostejše in se običajno zgodi že po nekaj minutah po prelomu DNK z neposrednim zlepljanjem koncev DNK, pri katerem sodeluje kopica proteinov. Po- stopek NHEJ je podvržen napakam, predvsem nastanku majhnih insercij in delecij (indel), kar vodi do mutacij (zamikov bralnih okvirjev in nesmiselnih mutacij). Če so mesta preloma DNK blizu skupaj, lahko nastanejo delecije, inverzije ali duplikacije. S sistemom CRISPR- -Cas lahko ustvarimo tudi daljše delecije, če uporabimo dve sgRNK, ki ciljata zaporedji okrog regije, ki jo želimo izbrisati. Tako lahko določen gen v celoti izbijemo. Me- hanizem popravila s HDR je počasnejši, a natančen, in poleg številnih encimov zahteva določeno mero homo- logije z donorsko matrico, ki je lahko endogenega ali ek- sogenega izvora. V takem primeru lahko s CRISPR-Cas popravimo okvarjen gen ali ga zamenjamo. Poleg tega je možno multipleksiranje, oziroma ciljanje več genov hkrati (Broothaerts in sod., 2021). 4.2 SKUPINA 2 – NGT, KI POVZROČIJO ENOVERIŽNE PREKINITVE DNK ALI BREZ PREKINITVE DNK Popravilo dvoverižnih prelomov DNK s celičnimi popravljalnimi mehanizmi, ki so podvrženi napakam, je težko nadzorovati in ima lahko neželene posledice. Zato so z mutagenezo mestno specifičnih nukleaz razvili manj škodljive encime za preurejanje genoma, tako imenova- ne nikaze (nCas), ki imajo inaktivirano eno katalitično domeno ter povzročijo enoverižne prekinitve DNK, ki se v celicah običajno popravijo na zelo zanesljiv način s popravljanjem z izrezom baze (angl. base excision repair) (Komor in sod., 2016). 4.2.1 Tarčna mutageneza z oligonukleotidi Ta tehnika je bila razvita že v osemdesetih letih prej- šnjega stoletja za spreminjanje kratkih zaporedij (nekaj baznih parov) v genomih bakterij in kvasovk, kasneje pa so jo izkoristili tudi za rastline in živali (Sauer in sod., 2016). Temelji na uporabi homolognih kratkih enove- rižnih oligonukleotidov DNK, himernih RNK/DNK oligonukleotidov, ali dvoverižnih DNK molekul, ki se s tarčnim zaporedjem ne ujemajo na enem ali več mestih. Preurejanje genoma se začne s prileganjem oligonukleo- tida na tarčno zaporedje po principu komplementarnega parjenja baz. Zaradi neujemanja baznih parov, se aktivi- rajo celični popravljalni mehanizmi, ki vključujejo nepo- sredno popravilo neujemanja (angl. mismatch repair), ali vključitev v verigo v prisotnosti ali odsotnosti aktivnosti povezane z replikacijo DNK (Broothaerts in sod., 2021). 4.2.2 Urejevalci baz Urejanje baz (angl. base editing, BE) je novejši pri- stop k preurejanju genoma, ki omogoča uvedbo točkov- nih mutacij brez prekinitve dvoverižne DNK. Urejevalci baz so sestavljeni iz katalitično neaktivne dCas (angl. dead Cas), ki je spojena s citozin ali adenin deaminazno domeno (Gaudelli in sod., 2017; Komor in sod., 2016). Urejevalca baze na tarčno mesto vodi usmerjevalna sgRNK. Ob vezavi nastane tako imenovana ‚R‘ zanka, ki vsebuje kratek enoverižen odsek DNK, na katerega deluje deaminaza, ki odstrani amino skupino iz citozi- na (angl. cytosine base editor, CBE). Nastane uracil, ki ga polimeraze DNK prepoznajo kot timin. V celicah je prisoten tudi encim uracil DNK glikozilaza, ki lahko par U:G zamenja nazaj v par C:G (Komor in sod., 2016). Zato so za povečanje učinkovitosti urejevalcem CBE na C- ter- minalni del dodali dve domeni inhibitorja uracil DNK glikozilaze. V primeru ABE (angl. adenine base editor) z deaminacijo adenina nastane inozin, ki ga polimeraze DNK prepoznajo kot gvanin. Z uporabo različic Cas, de- aminaz in povezovalnih molekul so razvili urejevalce baz naslednje generacije, ki imajo boljšo učinkovitost in spe- cifičnost uvedenih sprememb (Anzalone in sod., 2020). 4.2.3 Sistem urejanja z vnosom Urejanje z vnosom (angl. prime editing, PE) je vse- stranska in natančna metoda urejanja genoma, ki ne- posredno zapisuje novo genetsko informacijo na točno določeno mesto DNK. Pri tem uporablja nikazo (nCas) spojeno z reverzno transkriptazo ter pegRNK, ki vodi sistem PE do tarčnega mesta in nosi genetsko informa- cijo za želeno preurejanje (Anzalone in sod., 2019). Kjer pegRNK prepozna tarčno zaporedje DNK, nikaza uvede enoverižno prekinitev DNK s prostim 3‘ koncem, ki služi reverzni transkriptazi kot začetnik za prepisovanje infor- macije iz pegRNK v DNK. Nastane razvejan intermedi- at DNK, ki ga popravijo celični popravljalni mehanizmi tako, da odstranijo nespremenjeno (staro) zaporedje DNK, ki štrli na 5‘ koncu. Urejanje z vnosom omogoča uvedbo substitucij po- sameznih nukleotidov, insercij in delecij do 100 baznih parov. Pomembna prednost te tehnike je, da ob urejanju Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 20258 S. BERNE ne nastanejo neželeni indeli, omejitev pa je vnos v celice zaradi same velikosti sistema (Broothaerts in sod., 2021). 4.3 SKUPINA 3 - NGT, KI TEMELJIJO NA SPREM- INJANJU EPIGENOMA Epigenom je skupek dednih modifikacij kromatina, ki uravnavajo izražanje genov v diferenciranih celicah brez spreminjanja nukleotidnega zaporedja v DNK. Epi- genetske modifikacije so lahko neposredne, kot na pri- mer vezava metilnih skupin na DNK ter vezava metilnih ali acetilnih skupin na lizin v histonih, ali posredne, ki vplivajo na regulacijo transkripcije z aktivatorji ali repre- sorji (McCutcheon in sod., 2024). 4.3.1 Neposredne modifikacije kromatina Metilacija DNK poteka z encimi DNK metiltrasfera- zami, ki uvedejo metilno skupino na mesto C5 v citozinu. Pri rastlinah je večina citozinov v odsekih CpG, CpHpG ali CpHpH (pri čemer je H lahko A , C ali T), ki so del promotorskih regij ali zaporedij DNK, ki se aktivno pre- pisujejo, nemetiliranih (Gallego-Bartolomé, 2020). Med- tem ko je metilacija teh mest povezana s kondenzacijo kromatina in represijo transkripcije. Poleg citozina lahko metilno skupino v nekaterih primerih najdemo tudi na adeninu na mestu N6. Za uvedbo metilne skupine na tarčno mesto v DKA so katalitično domeno metiltransferaze spojili z mestno specifičnim proteinom za vezavo na DNK (npr. proteini s cinkovimi prsti, efektorji TAL, dCas). Za odstranitev me- tilne skupine iz tarčne DNK, pa so proteine za vezavo na DNK spojili z demetilazo (Kungulovski in Jeltsch, 2016). Najpogostejši modifikaciji histonov pri rastlinah sta metilacija histona H3 na mestu lizina 4 ali 27 ter acetila- cija histona H3 na mestu lizina 27. Metilacija histonov pri rastlinah je povezana s številnimi razvojnimi procesi (K. Cheng in sod., 2020), medtem ko je acetilacija histo- nov povezana s prilagajanjem rastlin na abiotski stres (Wang in sod., 2024). Zaenkrat so mestno specifični modifikatorji kro- matina slabše raziskani in v uporabi zgolj pri modelnih rastlinah (Ueda in Seki, 2020). 4.3.2 Posredne epigenetske modifikacije S številnimi transkripcijskimi faktorji, ki delujejo kot aktivatorji ali represorji lahko uravnavamo prepi- sovanje genov. Katalitično neaktivna nukleaza dCas se lahko specifično veže na mesta pred promotorjem ter onemogoči vezavo polimeraze RNK ali transkripcijskih faktorjev na promotor. S tem inhibira izražanje določe- nega gena brez spreminjanja genoma. To strategijo urav- navanja izražanja genov so poimenovali CRISPR interfe- renca (CRISPRi) (M. H. Larson in sod., 2013). S kombinacijo usmerjevalne sgRNK, katalitično ne- aktivne dCas in efektorskih domen, ki lahko delujejo kot represorji (CRISPRi) ali aktivatorji (CRISPRa) izražanja genov, so dosegli tarčne spremembe kromatinskih oznak na izbranih mestih v genomu (Kungulovski in Jeltsch, 2016). Transkripcijski aktivatorji delujejo tako, da priva- bijo modulatorje kromatina, ki povzročijo dekondenza- cijo kromatina, kopičenje histonskih oznak (npr. acetila- cija histona H3 na mestu lizina 27 ali trimetilacija histona H3 na mestu lizina 4) ter vezavo polimeraze RNK II, da se začne prepisovanje mRNK. Transkripcijski represorji delujejo tako, da vežejo inhibitorne transkripcijske fak- torje ali encime za modifikacijo histonov (npr. histonske metiltransferaze, ki povečajo trimetilacijo histona H3 na mestu lizina 9), kar povzroči lokalno kondenzacijo kro- matina (Pei in sod., 2020). 4.4 SKUPINA 4 – NGT, KI PREUREJAJO RNK 4.4.1 Od PAM neodvisna RNK-intereferenca posre- dovana s CRISPR-Cas Čeprav so v zadnjih letih razvili številna orodja CRISPR, ki ciljajo in cepijo RNK, se pri rastlinah uporabljata zgolj CRISPR-Cas13a in CRISPR-Cas13d (Broothaerts in sod., 2021). Cas13a potrebuje CRISPR-RNK (crRNA) s sekundarno strukturo RNK v obliki lasnične zanke ter vmesnikom dolžine 22-28 nukleotidov za prepoznavo tarčne RNK (Abudayyeh in sod., 2017). Cepitev tarčne RNK je izven mesta vezave crRNK, pri tem pa imajo različne variante Cas13a različne preference za cepitev za določenimi nukleotidi. Cas13d je najmanjša in za preurejanje RNK naj- učinkovitejša ribonukleaza iz družine Cas13 (Zhang in sod., 2018). Tudi Cas13d je sestavljena iz dveh režnjev, prvi (angl. recognition, REC) je namenjen prepoznavi in vezavi crRNK, drugi (angl. nuclease, NUC) pa cepitvi RNK. Kompleks Cas13-crRNK je katalitično neaktiven, dokler ne veže tarčne enove- rižne RNK (Gupta in sod., 2022). Poleg majhnosti je prednost tega sistema tudi to, da ne potrebuje motiva ob protovmesniku ter da ni opisanih neželenih učin- kov izven tarčne RNK ali toksičnosti. Pri rastlinah se na primer uporablja za razvoj odpornosti proti RNK virusom (Zhan in sod., 2023). 5 Z NGT SPREMENJENE LASTNOSTI RAS- Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 9 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin TLIN IN NJIHOVA UPORABA EU-SAGE je mreža znanstvenikov iz 134 evrop- skih inštitutov in društev povezanih z rastlinami, ki so združili moči, da bi zagotovili ustrezne informacije o preurejanju genomov rastlin ter spodbujali razvoj evropskih politik in politik držav članic EU, ki omo- gočajo uporabo NGT za trajnostno kmetijstvo in pri- delavo hrane (Dima in sod., 2020). Objavili so prosto dostopno interaktivno podatkovno zbirko o genomsko preurejenih rastlinah (Dima in sod., 2022). Glede na razdelitev NGT v štiri skupine (slika 2 in (Broothaerts in sod., 2021)), pri preurejanju geno- mov rastlin prevladujejo NGT iz skupine 1 in 2. Ker je preurejanje genomov s sistemom CRISPR-Cas poce- ni, hitro in učinkovito, je tudi daleč najpogostejše in v uporabi pri kar 92 % rastlin (Slika 4, zgoraj). S pri- bližno 3 % ji sledita tehniki TALEN in BE. Epigenet- ske tehnike (skupina 3) in tehnike za preurejanje RNK (skupina 4) so bile do sedaj uporabljene le v začetnih fazah raziskav in razvoja (za dokazovanje koncepta) (Parisi in Rodriguez, 2021). NGT so bile uporabljene za preurejanje genomov pri 72 različnih rastlinskih vrstah (https://www.eu-sa- ge.eu/genome-search, Februar 2025). Največ raziskav in razvoja NGT je bilo narejenih na rižu (Oryza sati- va L.), paradižniku (Solanum lycopersicum L.), koruzi (Zea mays L.), soji (Glycine max (L.) Merr.) in pšenici (Triticum aestivum L.) (Slika 4, sredina). Izboljšave z NGT so uvedli tudi pri manj pomembnih poljščinah, sadju in širokem spektru zelenjadnic, kot tudi pri in- dustrijsko pomembnih in okrasnih rastlinah (Parisi in Rodriguez, 2021). Večino rastlin s preurejenim ge- nomom so požlahtnili na Kitajskem in v ZDA, čeprav tovrstne raziskave potekajo po vsem svetu (Dima in sod., 2022). V Evropi največ primerov uporabe NGT pri rastlinah prihaja iz Nemčije in Francije. Leta 2021 je bilo za poljske poskuse odobrenih 117 primerov rastlin s preurejenim genomom, ki se lahko pojavijo na trgu do leta 2030 ter 292 primerov v zgodnji fazi razvoja (za dokazovanje koncepta) (Pa- risi in Rodriguez, 2021). Spekter uporabe NGT glede lastnosti in vrste rastline je zelo raznolik (Slika 4, spo- daj). Najpogosteje so bile izboljšane: (i) agronomske pomembne lastnosti (22 %), kot so večji pridelek (bolj- ša fotosintetska aktivnost, več cvetov, semen, plodov in/ali večja masa) in rast rastlin (izboljšana oblika -ha- bitus, rastni vzorec), da se poveča produktivnost in iz- ogne izgubam pred spravilom pridelka; (ii) odpornost na bolezni in škodljivce (22 %), da se zmanjša potreba po uporabi fitofarmacevtskih sredstev; (iii) kakovost rastlin za pridelavo hrane in krme (20 %) (na primer vsebnost vitaminov, toksičnih snovi, škroba, olja, pro- teinov, vlaknin, alergenov); (iv) ter lastnosti poveza- ne z industrijsko rabo (12  %) (proizvodnja biogoriv, učinkovitejša raba dušika) (Dima in sod., 2022) Poleg tega se NGT uporabljajo tudi kot orodje za žlahtnjenje in sicer za spreminjanje reproduktivnih lastnosti (ste- rilnost, samoinkompatibilnost, apomiksis), zgodnejše cvetenje, povečanje ali zmanjšanje genetske rekombi- nacije, indukcijo haploidov in podvojenih haploidov (Parisi in Rodriguez, 2021). V preglednici 2 je seznam rastlin s preurejenim genomom, ki so že na trgu ali so prejele vse potrebne odobritve, vendar še niso na voljo potrošnikom, saj strategija trženja takih rastlin še ni izdelana (Polidoros in sod., 2024). Slika 4: Podatkovna zbirka rastlin s preurejenim genomom EU- SAGE (Dima in sod., 2022), spremenjene lastnosti in upora- bljene NGT Podatki pridobljeni na: https://www.eu-sage.eu/genome-search (Februar 2025) Figure 4: EU-SAGE Database of genome-edited crop plants (Dima in sod., 2022), modified traits and NGT used Data retrieved from: https://www.eu-sage.eu/genome-search (February 2025) Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 202510 S. BERNE 6 ZAKONODAJNA UREDITEV Z NGT PRIDELANIH RASTLIN IN NJIHOVIH PRODUKTOV V EU Evropska unija ima vzpostavljen strog pravni okvir, ki zagotavlja, da razvoj moderne biotehnologije in zlasti GSO poteka pod varnimi pogoji. Namenjen je: (i) zaščiti zdravja ljudi in živali ter okolja z uvedbo ocene varnosti po najvišjih možnih standardih na ravni EU, preden se kateri koli GSO da na trg; (ii) uvedbi usklajenih postop- kov za oceno tveganja in odobritev GSO, ki bodo učin- koviti, časovno omejeni in pregledni; (iii) zagotavljanju jasnega označevanja GSO, ki se dajejo na trg, da bi po- trošnikom in strokovnjakom (npr. kmetom in upravljav- cem prehranske verige) omogočili ozaveščeno izbiro; ter (iv) zagotavljanju sledljivost GSO, danih na trg. Trenutno veljavni pravni akti o GSO, ki uresničujejo te cilje so: (i) Direktiva EU o namernem sproščanju gensko spremen- jenih organizmov v okolje (Directive 2001/18/EC); (ii) Uredba EU o gensko spremenjenih živilih in krmi (Re- gulation (EC) 1829/2003); (iii) Direktiva EU o spremem- bi Direktive 2001/18/ES glede možnosti držav članic, da omejijo ali prepovejo gojenje gensko spremenjenih organizmov (GSO) na svojem ozemlju (Directive (EU) 2015/412); (iv) Uredba EU o sledljivosti in označevanju gensko spremenjenih organizmov ter sledljivosti živil in krme, proizvedenih iz gensko spremenjenih organizmov (Regulation (EC) 1830/2003); (v) Direktiva EU o uporabi gensko spremenjenih mikroorganizmov v zaprtih siste- mih (prenovitev) (Directive 2009/41/EC); ter (vi) Zakon o gensko spremenjenih organizmih in dajanju izdelkov na trg, ki ureja področje GSO v Sloveniji (in implementi- ra Direktivo 2001/18). Po Direktivi 2001/18/EC (Direktiva - 2001/18 - EN - EUR-Lex, b. d.) je GSO definiran kot “organizem, razen človeka, pri katerem je bil genski material spremenjen na način, ki ne nastane naravno s križanjem in/ali naravno rekombinacijo”. Ali se rastline pridelane z NGT obrav- Lastnost Opis (NGT) Država (leto) Podjetje Voščena koruza Koruza z veliko vsebnostjo škroba (CRISPR) Japonska (2024) Corteva Agriscience Solata, ki ne porjavi ‘GreenVenus’, romanska solata, ki ne porjavi ZDA (2024) Intrexon Pšenica odporna na glive Pšenica odporna na pepelasto plesen (Blumer- ia graminins Speer.) Kitajska (2024) Suzhou, Chinese Acad- emy of Sciences Zelena gorčica ‘Conscious Greens’, blažja in manj grenka ze- lena gorčica (CRISPR-Cas12a) ZDA (2023) dostopno na trgu Pairwise Banana, ki ne porjavi Banana z upočasnjenim rjavenjem za podaljšanje roka uporabnosti (CRISPR) Filipini (2023) Tropic Biosciences GABA paradižnik ‘Sicilian Rouge’, paradižnik z večjo vsebnostjo GABA, znižuje krvni tlak (CRISPR) Japonska (2021) dosto- pno na trgu Sanantech Seed Sojino olje z visoko vseb- nostjo oleina ‘Calyno’, Sojino olje z manj nasičenimi maščobami in brez trans maščob (TALEN) ZDA (2019) dostopno na trgu Calyxt Jabolka, ki ne porjavijo ‘ArticApple’, jabolka, ki ne porjavijo (sorte Golden, Granny, Fuji, Gala, Honey) (RNKi) Kanada (2017) dosto- pno na trgu ZDA (2015) dostopno na trgu Okanagan Speciality Fruits Krompir, ki ne porjavi ‘White Russet Potato’, krompir, ki ne por- javi, odporen na plesni, z manj sladkorji in akrilamida (RNKi) ZDA (2015) dostopno na trgu Kanada (2015) dosto- pno na trgu Simplot Oljna ogrščica Oljna ogrščica odporna na herbicide (ODM) ZDA (2014) Kanada (2013) Cibus Preglednica 2: Seznam rastlin s preurejenim genomom odobrenih za prodajo Podatki pridobljeni na: https://crispr-gene-editing-regs-tracker.geneticliteracyproject.org/united-states-crops-food (Februar 2025) Table 2: The list of genome-edited crops approved for sale Data retrieved from: https://crispr-gene-editing-regs-tracker.geneticliteracyproject.org/united-states-crops-food (February 2025) Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 11 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin navajo kot GSO, je odvisno od interpretacije te definicije (Katsarova, 2024). Pri običajni razlagi te opredelitve kot procesa, torej zadostuje že sama uporaba tehnike genske- ga spreminjanja, da se dobljeni organizem šteje za GSO. Pri razlagi, ki temelji na produktu, pa mora nastali orga- nizem vsebovati novo kombinacijo genskega materiala, da se šteje za GSO. Tretja možna razlaga združuje obe merili. V aneksih te direktive so opredeljene tehnike, ki povzročijo genske spremembe (Aneks IA, 1. del), tehni- ke, za katere se ne šteje, da lahko povzročijo genske spre- membe (Aneks IA, 2. del) ter tehnike, ki povzročijo gen- ske spremembe, vendar je nastali organizem izključen iz te direktive (Člen 3 in Aneks IB). Taki tehniki sta muta- geneza in celična fuzija. Poleg tega je v direktivi zapisano (preambula 17), da se direktiva ne bi smela uporabljati za organizme, pridobljene z nekaterimi tehnikami genskega spreminjanja, ki se običajno uporabljajo v številnih apli- kacijah in imajo dolgo zgodovino varnosti. Leta 2018 je Sodišče EU razsodilo, da so organizmi, pridobljeni z usmerjeno mutagenezo, GSO - ker mutage- neza spremeni genski material organizma na način, ki se ne pojavi v naravi - in zato za take organizme veljajo pra- vila EU o odobritvi, sledljivosti in označevanju (EUR-Lex - 62016CJ0528 - EN - EUR-Lex, b. d.). Glede vprašanja, ali se zakonodaja EU o GSO uporablja za organizme, pri- dobljene z NGT, je Sodišče EU menilo, da so tveganja, povezana z uporabo teh tehnik, podobna tveganjem pri transgenezi – vnosu tujega gena v organizem -, saj ne- posredna sprememba genskega materiala organizma z mutagenezo omogoča doseganje enakih učinkov. Pri tem je izvzelo sorte, ki so bile pridobljene s „tehnikami muta- geneze, ki se običajno uporabljajo v številnih aplikacijah in imajo dolgo zgodovino varnosti“. Evropska komisija je nato leta 2021 objavila študijo o statusu novih genomskih tehnik v skladu s pravom EU, ki je ugotovila, da so or- ganizmi, pridobljeni z NGT, zlasti z usmerjeno mutage- nezo, cisgenezo in intragenezo, GSO (EC study…, 2025.) Na podlagi opravljenih strokovnih študij in poročil Evropske agencije za varnost hrane (EFSA) (Mullins in sod., 2022) ter Skupnega raziskovalnega središča (JRC) (Broothaerts in sod., 2021) je Evropska komisija leta 2023 predložila predlog Uredbe o rastlinah, pridobljenih z nekaterimi novimi genomskimi tehnikami, ter hrani in krmi iz njih (COM (2023) 411) (Polfjärd, 2025), katere cilj je ohraniti visoko raven varovanja zdravja ljudi in hkrati spodbujati razvoj sort uspešnih v boju proti podnebnim spremembam in zmanjšujejo uporabo pesticidov. V pre- dlogu uredbe in njenih dopolnitvah sta opredeljeni dve kategoriji rastlin (Kahrmann in Leggewie, 2024): (i) rastline NGT kategorije 1 vključujejo rastline, ki so enakovredne rastlinam, ki jih je možno pridobiti s kla- sičnim žlahtnjenjem, pod pogojem, da se od starševskih rastlin ne razlikujejo za več kot 20 nukleotidnih spre- memb, kot so tarčne substitucije in insercije nukleotidov, ali delecije poljubnega števila nukleotidov. Mutacije v intronih in regulatornih zaporedjih so izključene iz tega obsega. Med te spremembe sodijo tudi insercije, substi- tucije, inverzije ali translokacije zaporedja DNK, ne glede na velikost, če ta zaporedja že obstajajo v genskih virih žlahtniteljev in pod pogojem, da ne povzročijo prekini- tve endogenih genov ter da ne nastane himeren protein. Za te rastline zakonodaja o GSO ne velja, zato postopek odobritve z oceno tveganja ni potreben. Toda namerno sproščanje in dajanje takih rastlin na trg je dovoljeno šele po uradni potrditvi statusa kategorije 1. V primeru namernega sproščanja je za to pristojen ustrezen organ članice EU, medtem ko dajanje na trg potrdi EFSA (angl. European Food Safety Authority). Zaradi zagotavljanja transparentnosti so uradno priznane rastline NGT kate- gorije 1 navedene v javno dostopni zbirki EU-SAGE, po- trebno pa je tudi označevanje vseh izdelkov iz teh rastlin, vključno z razmnoževalnim materialom. Poleg tega se v ekološki pridelavi teh rastline ne sme uporabljati. (ii) rastline NGT kategorije 2 so vse ostale rastline pridobljene z NGT, za katere velja zakonodaja o GSO. Zanje je potrebno izdelati oceno tveganja za zdravje ljudi, živali in okolje, pred dajanjem na trg je potrebno pozi- tivno mnenje EFSA, prav tako mora biti zagotovljeno us- trezno sledenje in označevanje kot GSO. To velja tudi za hrano ali krmo pridelano iz teh rastlin. Predlog nove uredbe je 7. februarja 2024 v Evrop- skem parlamentu podprlo 307 poslancev, proti jih je bilo 263 in 41 se jih je vzdržalo (Katsarova, 2024) in je tre- nutno v javni razpravi. 7 KAKŠNA JE PERSPEKTIVA RASTLIN PRIDELANIH Z NGT? Osnutek uredbe o NGT je sprožil veliko razprav (Kahrmann in Leggewie, 2024). Negativne kritike priha- jajo predvsem iz okoljskih nevladnih organizacij in delov živilskega sektorja: Friends of the Earth v Evropi menijo, da je ogrožena narava, podobno tudi IFOAM Organics Europe meni, da je osnutek „korak nazaj za biološko var- nost, svobodo izbire in obveščenost potrošnikov“, med- tem ko Evropsko združenje industrije brez GSO poudar- ja tveganja za proizvodnjo brez GSO. Pesticide Action Network Europe meni, da predlog „krši previdnostno načelo“ in „ni v skladu z obljubami evropskega zelenega dogovora“, saj bodo nove tehnike „koristile le semenski industriji, kmetje, državljani in okolje pa bodo ostali ne- zaščiteni“. Priznane znanstvene organizacije in semenarska podjetja imajo do osnutka uredbe zelo pozitiven odnos: Evropska organizacija za znanost o rastlinah pozdravlja Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 202512 S. BERNE osnutek predloga kot „uravnotežen kompromis“ in pod- pira večino njegove vsebine (Feedback …, 2025.). Podob- no Euroseeds meni, da sta predlog in NGT priložnost za večjo odpornost in trajnost pri varni proizvodnji hrane (Planting …, 2025). Evropski parlament je predlagal, da se v predlog uredbe uvede tudi člen, v skladu s katerim rastline NGT ne bodo patentirane (New Genomic Techniques…, 2024). Ta pristop naj bi bil nujen, saj bi v nasprotnem prime- ru multinacionalna semenarska podjetja lahko imela še večjo moč in monopol nad dostopom do semen. Z druž- beno-ekonomskega vidika je predlog smiseln, vendar ga je potrebno obravnavati v okviru Evropske patentne kon- vencije in upoštevati, da patentiranje izdelka ni odvisno od tega, ali je njegova uporaba dovoljena. Po drugi strani patentni strokovnjaki opozarjajo, da brez ustreznega var- stva podjetja morda ne bodo mogla vlagati v razvoj NGT (European Parliamant …, 2025). 8 ZAKLJUČEK Prilagajanje rastlin zahtevam ljudi je nekaj, kar poč- nemo že od začetka kmetijstva. Še naprej se bodo razvi- jale nove tehnike žlahtnjenja in gojenja rastlin, zato je le vprašanje časa, kdaj bo tehnologija, s katero je rastlina pridobila določeno lastnost, postala drugotnega pomena glede na pomen same lastnosti, ki jo je rastlina pridobi- la (New report…, 2023.). Napredne NGT na eni strani prinašajo številne koristi za potrošnike, saj naslavljajo nekatere ključne izzive kmetijstva povezane s prilagaja- njem na podnebne spremembe, z zdravjem in prehran- sko varnostjo, ter okoljsko trajnostjo in diverzifikacijo kmetijstva. Tveganja nove tehnologije so znanstveno dokazano primerljiva s tistimi, ki jih prinašajo že uve- ljavljene metode žlahtnjenja (Mullins in sod., 2024). Po drugi strani se potencialne koristi tehnologije zapravljajo zaradi neuspešnega obravnavanja regulativnega, pravne- ga in trgovinskega okvira ter večinoma negativnega spre- jemanja družbe, verjetno predvsem na račun strahu in nerazumevanja. 9 LITERATURA Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Essletzbichler, P., Han, S., Joung, J., Belanto, J. J., Verdine, V., Cox, D. B. T., Kellner, M. J., Regev, A., Lander, E. S., Voytas, D. F., Ting, A. Y., & Zhang, F. (2017). RNA targeting with CRISPR–Cas13. Na- ture, , 550(7675), 280–284. https://doi.org/10.1038/natu- re24049 Altpeter, F., Springer, N. M., Bartley, L. E., Blechl, A. E., Bru- tnell, T. P., Citovsky, V., Conrad, L. J., Gelvin, S. B., Jackson, D. P., Kausch, A. P., Lemaux, P. G., Medford, J. I., Orozco- -Cárdenas, M. L., Tricoli, D. M., Van Eck, J., Voytas, D. F., Walbot, V., Wang, K., Zhang, Z. J., & Neal Stewart, C. (2016). Advancing Crop Transformation in the Era of Ge- nome Editing. The Plant Cell, 28(7), 1510–1520. https://doi. org/10.1105/TPC.16.00196 Anderson, E. M., Haupt, A., Schiel, J. A., Chou, E., Machado, H. B., Strezoska, Ž., Lenger, S., McClelland, S., Birmingham, A., Vermeulen, A., & Smith, A. V. B. (2015). Systematic analysis of CRISPR-Cas9 mismatch tolerance reveals low levels of off-target activity. Journal of Biotechnology, 211, 56–65. https://doi.org/10.1016/J.JBIOTEC.2015.06.427 Anzalone, A. V., Koblan, L. W., & Liu, D. R. (2020). Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transpo- sases and prime editors. Nature Biotechnology, 38(7), 824– 844. https://doi.org/10.1038/S41587-020-0561-9 Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Ko- blan, L. W., Levy, J. M., Chen, P. J., Wilson, C., Newby, G. A., Raguram, A., & Liu, D. R. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149–157. https://doi.org/10.1038/ s41586-019-1711-4 Arnould, S., Delenda, C., Grizot, S., Desseaux, C., Pâques, F., Silva, G. H., & Smith, J. (2011). The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell mo- dification to gene therapy. Protein Engineering, Design and Selection, 24(1–2), 27–31. https://doi.org/10.1093/PROTE- IN/GZQ083 Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRI- SPR provides acquired resistance against viruses in pro- karyotes. Science (New York, N.Y.), 315(5819), 1709–1712. https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1138140 Becker, S., & Boch, J. (2021). TALE and TALEN genome editing technologies. Gene and Genome Editing, 2, 100007. https:// doi.org/10.1016/J.GGEDIT.2021.100007 Berg, P., & Mertz, J. E. (2010). Personal reflections on the origins and emergence of recombinant DNA technology. Genetics, 184(1), 9. https://doi.org/10.1534/GENETICS.109.112144 Broothaerts, W., Jacchia, S., Angers, A., Petrillo, M., Querci, M., Savini, C., Van den Eede, G., & Emons, H. (2021). New Genomic Techniques: State-of-the-Art Review. https://doi. org/10.2760/710056 Chen, K., Wang, Y., Zhang, R., Zhang, H., & Gao, C. (2019). CRI- SPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture. Annual Review of Plant Biology, 70(1), 667–697. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050718-100049 Cheng, K., Xu, Y., Yang, C., Ouellette, L., Niu, L., Zhou, X., Chu, L., Zhuang, F., Liu, J., Wu, H., Charron, J. B., & Luo, M. (2020). Histone tales: lysine methylation, a protagonist in Arabidopsis development. Journal of Experimental Botany, 71(3), 793–807. https://doi.org/10.1093/JXB/ERZ435 Cheng, X., Li, H., Tang, Q., Zhang, H., Liu, T., & Wang, Y. (2024). Trends in the global commercialization of ge- netically modified crops in 2023. Journal of Integrative Agriculture, 23(12), 3943–3952. https://doi.org/10.1016/j. jia.2024.09.012 Cody, W. B., & Scholthof, H. B. (2019). Plant Virus Vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 13 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin Phytopathology, 57, 211–230. https://doi.org/10.1146/an- nurev-phyto-082718-100301 Crow, J. F. (1998). 90 Years Ago: The beginning of hybrid maize. Genetics, 148(3), 923–928. https://doi.org/10.1093/geneti- cs/148.3.923 Demirer, G. S., Silva, T. N., Jackson, C. T., Thomas, J. B., W. Ehrhardt, D., Rhee, S. Y., Mortimer, J. C., & Landry, M. P. (2021). Nanotechnology to advance CRISPR–Cas genetic engineering of plants. Nature Nanotechnology,, 16(3), 243– 250. https://doi.org/10.1038/s41565-021-00854-y Dima, O., Bocken, H., Custers, R., Inzé, D., & Puigdomenech, P. (2020). Genome Editing for Crop Improvement. Symposium summary. https://doi.org/10.26356/gen-editing-crop Dima, O., Heyvaert, Y., & Inzé, D. (2022). Interactive database of genome editing applications in crops and future policy ma- king in the European Union. Trends in Plant Science, 27(8), 746–748. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2022.05.002 Direktiva - 2001/18 - EN - EUR-Lex. (b. d.). Pridobljeno 29. ma- rec 2025, s https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT /?uri=CELEX:32001L0018&qid=1743268939349 Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2014). The new frontier of ge- nome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 346(6213). https://doi.org/10.1126/science.1258096 Duffin, J., & Mach, B. (2022). A brief history of the discovery of gene cloning in 1975. Perspectives in Biology and Medicine, 65(3), 442–457. https://doi.org/10.1353/PBM.2022.0036 EC study on new genomic techniques - European Commissi- on. (b. d.). Pridobljeno 28. februar 2025, s https://food. ec.europa.eu/plants/genetically-modified-organisms/new- -techniques-biotechnology/ec-study-new-genomic-tech- niques_en EUR-Lex - 62016CJ0528 - EN - EUR-Lex. (b. d.). Pridobljeno 29. marec 2025, s https://eur-lex.europa.eu/legal-content/ en/TXT/?uri=CELEX:62016CJ0528 European Parliamant votes for a regulation on NGT plants su- pporting the ban on plant patents. (b. d.). Pridobljeno 28. fe- bruar 2025, s https://patentepi.org/en/epi/news/3a640142- -e6c7-4f73-ae7b-5aaff964b1cb Feedback from: European Plant Science Organisation. (b. d.). Pridobljeno 28. februar 2025, s https://ec.europa.eu/info/ law/better-regulation/have-your-say/initiatives/13119-Le- gislation-for-plants-produced-by-certain-new-genomic- -techniques/F3442539_en Gallego-Bartolomé, J. (2020). DNA methylation in plants: me- chanisms and tools for targeted manipulation. New Phyto- logist, 227(1), 38–44. https://doi.org/10.1111/nph.16529 Gao, C. (2021). Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell, 184(6), 1621–1635. https:// doi.org/10.1016/J.CELL.2021.01.005/ASSET/E6F75B4F- -FF29-4C98-9BC4-B6968A427ECA/MAIN.ASSETS/GR4. JPG Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Ba- dran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programma- ble base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464–471. https://doi. org/10.1038/nature24644 Gupta, R., Ghosh, A., Chakravarti, R., Singh, R., Ravichandi- ran, V., Swarnakar, S., & Ghosh, D. (2022). Cas13d: A new molecular scissor for transcriptome engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 10, 866800. https://doi. org/10.3389/FCELL.2022.866800/PDF He, J., Zhao, X., Laroche, A., Lu, Z. X., Liu, H. K., & Li, Z. (2014). Genotyping-by-sequencing (GBS), An ultimate marker-assisted selection (MAS) tool to accelerate plant breeding. Frontiers in Plant Science, 5(SEP), 107179. https:// doi.org/10.3389/FPLS.2014.00484/BIBTEX Herrera-Estrella, L., De Block, M., Messens, E., Hernalste- ens, J.-P., Van Montagu, M., & Schell, J. (1983). Chi- meric genes as dominant selectable markers in plant cells. The EMBO Journal, 2(6), 987–995. https://doi. org/10.1002/j.1460-2075.1983.tb01532.x Herrera-Estrella, L., Simpson, J., & Martínez-Trujillo, M. (2005). Transgenic Plants: An Historical Perspective. V Transgenic Plants (Let. 286, str. 003–032). Humana Press. https://doi.org/10.1385/1-59259-827-7:003 Iriarte, J., Elliott, S., Maezumi, S. Y., Alves, D., Gonda, R., Ro- binson, M., Gregorio de Souza, J., Watling, J., & Handley, J. (2020). The origins of Amazonian landscapes: Plant cultivation, domestication and the spread of food pro- duction in tropical South America. Quaternary Science Reviews, 248, 106582. https://doi.org/10.1016/J.QUASCI- REV.2020.106582 Jankowicz-Cieslak, J., Mba, C., & Till, B. J. (2016). Mutagenesis for crop breeding and functional genomics. Biotechnologi- es for Plant Mutation Breeding: Protocols, 3–18. https://doi. org/10.1007/978-3-319-45021-6_1/TABLES/1 Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-gu- ided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816–821. https://doi.org/10.1126/SCI- ENCE.1225829/SUPPL_FILE/JINEK.SM.PDF Kahrmann, J., & Leggewie, G. (2024). European commission’s plans for a special regulation of plants created by new ge- nomic techniques. European Papers - A Journal on Law and Integration, 9(1), 21–38. https://doi.org/10.15166/2499- 8249/740 Katsarova, I. (2024). Plants obtained by certain new genomic te- chniques. http://www.europarl.europa.eu/thinktank Kaul, S., Koo, H. L., Jenkins, J., Rizzo, M., Rooney, T., Tallon, L. J., Feldblyum, T., Nierman, W., Benito, M. I., Lin, X., Town, C. D., Venter, J. C., Fraser, C. M., Tabata, S., Nakamura, Y., Kaneko, T., Sato, S., Asamizu, E., Kato, T., … Somerville, C. (2000). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 408(6814), 796–815. https://doi.org/10.1038/35048692 Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in geno- mic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature,, 533(7603), 420–424. https://doi.org/10.1038/nature17946 Kungulovski, G., & Jeltsch, A. (2016). Epigenome editing: State of the art, concepts, and perspectives. Trends in Genetics, 32(2), 101–113. https://doi.org/10.1016/J.TIG.2015.12.001/ ASSET/F135D4A1-9922-4F04-BAB8-E7F1F01CB15A/ MAIN.ASSETS/GR4.SML Larson, G., Piperno, D. R., Allaby, R. G., Purugganan, M. D., Andersson, L., Arroyo-Kalin, M., Barton, L., Vigueira, C. C., Denham, T., Dobney, K., Doust, A. N., Gepts, P., Gilbert, M. T. P., Gremillion, K. J., Lucas, L., Lukens, L., Marshall, F. Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 202514 S. BERNE B., Olsen, K. M., Pires, J. C., … Fuller, D. Q. (2014). Current perspectives and the future of domestication studies. Proce- edings of the National Academy of Sciences of the United Sta- tes of America, 111(17), 6139–6146. https://doi.org/10.1073/ PNAS.1323964111/SUPPL_FILE/PNAS.201323964SI.PDF Larson, M. H., Gilbert, L. A., Wang, X., Lim, W. A., Weissman, J. S., & Qi, L. S. (2013). CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Natu- re Protocols, 8(11), 2180–2196. https://doi.org/10.1038/ nprot.2013.132 Li, B., Sun, C., Li, J., & Gao, C. (2024). Targeted genome-modi- fication tools and their advanced applications in crop bree- ding. Nature Reviews Genetics, 25(9), 603–622. https://doi. org/10.1038/s41576-024-00720-2 Louwaars, N. P. (2018). Plant breeding and diversity: A tro- ubled relationship? Euphytica, 214(7), 114. https://doi. org/10.1007/S10681-018-2192-5 Mak, A. N. S., Bradley, P., Bogdanove, A. J., & Stoddard, B. L. (2012). TAL effectors: function, structure, engineering and applications. Current opinion in structural biology, 23(1), 93. https://doi.org/10.1016/J.SBI.2012.11.001 Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Iranzo, J., Shmakov, S. A., Alkhnba- shi, O. S., Brouns, S. J. J., Charpentier, E., Cheng, D., Haft, D. H., Horvath, P., Moineau, S., Mojica, F. J. M., Scott, D., Shah, S. A., Siksnys, V., Terns, M. P., Venclovas, Č., White, M. F., Yakunin, A. F., … Koonin, E. V. (2019). Evolutiona- ry classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nature Reviews Microbiology, 18(2), 67–83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x Maluszynski, M. (2001). Officially released mutant varieties - The FAO/IAEA database. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65(3), 175–177. https://doi.org/10.1023/A:1010652523463/ METRICS Marcaida, M. J., Muñoz, I. G., Blanco, F. J., Prieto, J., & Montoya, G. (2009). Homing endonucleases: from basics to therapeu- tic applications. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS, 67(5), 727. https://doi.org/10.1007/S00018-009-0188-Y Marks, R. A., Hotaling, S., Frandsen, P. B., & VanBuren, R. (2021). Representation and participation across 20 years of plant genome sequencing. Nature Plants,., 7(12), 1571– 1578. https://doi.org/10.1038/s41477-021-01031-8 McCutcheon, S. R., Rohm, D., Iglesias, N., & Gersbach, C. A. (2024). Epigenome editing technologies for discovery and medicine. Nature Biotechnology, 42(8), 1199–1217. https:// doi.org/10.1038/s41587-024-02320-1 Mehta, A., & Haber, J. E. (2014). Sources of DNA double- -strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 6(9), a016428– a016428. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016428 Mittelsten Scheid, O. (2022). Mendelian and non-Mendeli- an genetics in model plants. The Plant Cell, 34(7), 2455. https://doi.org/10.1093/PLCELL/KOAC070 Muller, H. J. (1928). The Production of Mutations by X-Rays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 14(9), 714–726. https://doi.org/10.1073/ PNAS.14.9.714 Mullins, E., Bresson, J., Dalmay, T., Dewhurst, I. C., Epstein, M. M., Firbank, L. G., Guerche, P., Hejatko, J., Moreno, F. J., Naegeli, H., Nogué, F., Serrano, J. J. S., Savoini, G., Vero- mann, E., Veronesi, F., Casacuberta, J., Dumont, A. F., Gen- naro, A., Lenzi, P., … Rostoks, N. (2022). Updated scientific opinion on plants developed through cisgenesis and intra- genesis. EFSA Journal, 20(10). https://doi.org/10.2903/j. efsa.2022.7621 Mullins, E., Bresson, J. L., Dalmay, T., Dewhurst, I. C., Epstein, M. M., Firbank, L. G., Guerche, P., Hejatko, J., Moreno, F. J., Naegeli, H., Nogué, F., Rostoks, N., Sanchez Serrano, J. J., Savoini, G., Veromann, E., Veronesi, F., Casacuberta, J., Afonso, A., Lenzi, P., … Raffaello, T. (2024). Scientific opi- nion on the ANSES analysis of Annex I of the EC proposal COM (2023) 411 (EFSA-Q-2024-00178). EFSA Journal, 22(7). https://doi.org/10.2903/J.EFSA.2024.8894 Nadeem, M. A., Nawaz, M. A., Shahid, M. Q., Doğan, Y., Co- mertpay, G., Yıldız, M., Hatipoğlu, R., Ahmad, F., Alsaleh, A., Labhane, N., Özkan, H., Chung, G., & Baloch, F. S. (2018). DNA molecular markers in plant breeding: cur- rent status and recent advancements in genomic selecti- on and genome editing. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 32(2), 261–285. https://doi.org/10.1080/13102 818.2017.1400401 New Genomic Techniques: MEPs want to ban all patents for NGT plants | News | European Parliament. (b. d.). Pridobljeno 28. februar 2025, s https://www.europarl.europa.eu/news/ en/press-room/20240122IPR17027/new-genomic-tech- niques-meps-want-to-ban-all-patents-for-ngt-plants New report details the €3 trillion cost of Europe saying „no to science“ on gene editing - Alliance for Science. (b. d.). Pri- dobljeno 28. februar 2025, s https://allianceforscience.org/ blog/2023/10/new-report-details-the-e3-trillion-cost-of- -europe-saying-no-to-science-on-gene-editing/ O’Leary, N. A., Cox, E., Holmes, J. B., Anderson, W. R., Falk, R., Hem, V., Tsuchiya, M. T. N., Schuler, G. D., Zhang, X., Torcivia, J., Ketter, A., Breen, L., Cothran, J., Bajwa, H., Tin- ne, J., Meric, P. A., Hlavina, W., & Schneider, V. A. (2024). Exploring and retrieving sequence and metadata for species across the tree of life with NCBI Datasets. Scientific Data,, 11(1), 1–10. https://doi.org/10.1038/s41597-024-03571-y Osakabe, Y., & Osakabe, K. (2015). Genome editing with engi- neered nucleases in plants. Plant and Cell Physiology, 56(3), 389–400. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu170 Parisi, C., & Rodriguez, C. E. (2021). Current and future market applications of new genomic techniques. Office of the …, 49. https://doi.org/10.2760/02472(online) Pei, W. Di, Zhang, Y., Yin, T. L., & Yu, Y. (2020). Epigenome editing by CRISPR/Cas9 in clinical settings: possibilities and challenges. Briefings in Functional Genomics, 19(3), 215–228. https://doi.org/10.1093/BFGP/ELZ035 Pixley, K. V., Falck-Zepeda, J. B., Paarlberg, R. L., Phillips, P. W. B., Slamet-Loedin, I. H., Dhugga, K. S., Campos, H., & Gut- terson, N. (2022). Genome-edited crops for improved food security of smallholder farmers. Nature Genetics,, 54(4), 364–367. https://doi.org/10.1038/s41588-022-01046-7 Planting the seeds of tomorrow: European Commission unveils game-changing proposals for plant breeding innovation - Euroseeds. (b. d.). Pridobljeno 28. februar 2025, s https:// euroseeds.eu/news/planting-the-seeds-of-tomorrow-euro- pean-commission-unveils-game-changing-proposals-for- -plant-breeding-innovation/ Acta agriculturae Slovenica, 121/2 – 2025 15 Nove genomske tehnike za natančno žlahtnjenje rastlin Polidoros, A., Nianiou-Obeidat, I., Tsakirpaloglou, N., Petrou, N., Deligiannidou, E., & Makri, N. M. (2024). Genome-edi- ting products line up for the market: Will Europe harvest the benefits from science and innovation? Genes, 15(8), 1014. https://doi.org/10.3390/GENES15081014/S1 Polfjärd, J. (2025, januar 29). Poročilo o predlogu uredbe Evrop- skega parlamenta in Sveta o rastlinah, pridobljenih z neka- terimi novimi genomskimi tehnikami, ter hrani in krmi iz njih ter o spremembi Uredbe (EU) 2017/625 | A9-0014/2024 | Evropski parlament. https://www.europarl.europa.eu/do- ceo/document/A-9-2024-0014_SL.html Sauer, N. J., Mozoruk, J., Miller, R. B., Warburg, Z. J., Walker, K. A., Beetham, P. R., Schöpke, C. R., & Gocal, G. F. W. (2016). Oligonucleotide-directed mutagenesis for precision gene editing. Plant Biotechnology Journal, 14(2), 496–502. https://doi.org/10.1111/pbi.12496 Shendure, J., Balasubramanian, S., Church, G. M., Gilbert, W., Rogers, J., Schloss, J. A., & Waterston, R. H. (2017). DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature,, 550(7676), 345–353. https://doi.org/10.1038/nature24286 Sikora, P., Chawade, A., Larsson, M., Olsson, J., & Olsson, O. (2012). Mutagenesis as a tool in plant genetics, functional genomics, and breeding. International Journal of Plant Ge- nomics, 2011, 314829. https://doi.org/10.1155/2011/314829 Stadler, L. J. (1928). Mutations in barley induced by X-rays and radium. Science, 68(1756), 186–187. https://doi. org/10.1126/SCIENCE.68.1756.186/ASSET/EDED47C6- -CE8A-4246-AFCE-8CA501699FA8/ASSETS/SCIEN- CE.68.1756.186.FP.PNG Sun, L., Lai, M., Ghouri, F., Nawaz, M. A., Ali, F., Baloch, F. S., Nadeem, M. A., Aasim, M., & Shahid, M. Q. (2024). Mo- dern plantbreeding techniques in crop improvement and genetic diversity: From molecular markers and gene editing to artificial intelligence—A critical review. Plants, 13(19), 2676. https://doi.org/10.3390/PLANTS13192676 Thorpe, T. A. (2007). History of plant tissue culture. Molecu- lar Biotechnology, 37(2), 169–180. https://doi.org/10.1007/ S12033-007-0031-3/METRICS Ueda, M., & Seki, M. (2020). Histone modifications form epige- netic regulatory networks to regulate abiotic stress respon- se. Plant Physiology, 182(1), 15–26. https://doi.org/10.1104/ PP.19.00988 Vasudevan, S. N., Pooja, S. K., Raju, T. J., & Damini, C. S. (2023). Cisgenics and intragenics: boon or bane for crop improve- ment. Frontiers in Plant Science, 14, 1275145. https://doi. org/10.3389/FPLS.2023.1275145/BIBTEX Veillet, F., Perrot, L., Chauvin, L., Kermarrec, M. P., Guy- on-Debast, A., Chauvin, J. E., Nogué, F., & Mazier, M. (2019). Transgene-Free Genome Editing in Tomato and Potato Plants Using Agrobacterium-Mediated Delivery of a CRISPR/Cas9 Cytidine Base Editor. International Jour- nal ofMmolecularSciences, 20(2). https://doi.org/10.3390/ IJMS20020402 Wang, F., Li, C. H., Liu, Y., He, L. F., Li, P., Guo, J. X., Zhang, N., Zhao, B., & Guo, Y. D. (2024). Plant responses to abi- otic stress regulated by histone acetylation. Frontiers in Plant Science, 15, 1404977. https://doi.org/10.3389/ FPLS.2024.1404977/PDF Watson, J. D., & Crick, F. H. C. (1953). Molecular structure of nu- cleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Natu- re,, 171(4356), 737–738. https://doi.org/10.1038/171737a0 Wu, H., Awan, F. S., Vilarinho, A., Zeng, Q., Kannan, B., Phi- pps, T., McCuiston, J., Wang, W., Caffall, K., & Altpeter, F. (2015). Transgene integration complexity and expression stability following biolistic or Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane. In Vitro Cellular and De- velopmental Biology - Plant, 51(6), 603–611. https://doi. org/10.1007/S11627-015-9710-0/TABLES/4 Zhan, X., Liu, W., Nie, B., Zhang, F., & Zhang, J. (2023). Ca- s13d-mediated multiplex RNA targeting confers a broad- -spectrum resistance against RNA viruses in potato. Com- munications Biology,, 6(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/ s42003-023-05205-2 Zhang, C., Konermann, S., Brideau, N. J., Lotfy, P., Wu, X., Novick, S. J., Strutzenberg, T., Griffin, P. R., Hsu, P. D., & Lyumkis, D. (2018). Structural basis for the RNA-guided ribonuclease activity of CRISPR-Cas13d. Cell, 175(1), 212- 223.e17. https://doi.org/10.1016/J.CELL.2018.09.001