1 UVOD Mikrobiološka kakovost je bistveni del celokupne kakovosti vsakega farmacevtskega izdelka. Vanje jo »vgradimo« z upoštevanjem dobre proizvodne prakse (DPP) ter smernic, ki zagotavljajo ustrezno kakovost izdelkov tekom celotnega cikla zdravila, od izdelave do njegove uporabe. Predmet tega prispevka so nesterilne in sterilne farmacevtske oblike z vidika specifičnih zah tev glede mikrobiološke kakovosti in uporabe konzervansov. Kriteriji sprejemljivosti za neste- rilne farmacevtske oblike se razlikujejo glede na način aplikacije zdravila in so podani v Evropski farmakopeji (Eur. Ph .) v poglavjih »Mikrobiološka kakovost nesterilnih farma- 147 farm vestn 2021; 72 MIKROBIOLOšKA ZAšČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV ANTIMICROBIAL PRESERVATION OF PhARMACEUTICALS AVTORICI / AUThORS: doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm. izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: alenka.zvonar-pobirk@ffa.uni-lj.si POVZETEK Mikrobiološka kakovost farmacevtskih izdelkov je eden izmed ključnih aspektov zagotavljanja kako- vostnih , varnih in učinkovitih zdravil. Zaradi strogih standardov zagotavljanja kakovosti v farmacevtski industriji jo lah ko dojemamo kot samoumevno. Pa vendar, kot smo izkusili v letu pandemije, ni nič samoumevno. V prispevku predstavljamo različne pristope mikrobiološke zaščite farmacevtskih iz- delkov z glavnim poudarkom na konzervansih , ki ščitijo izdelek pred sekundarno mikrobiološko kon- taminacijo med sh ranjevanjem, distribucijo in upo- rabo izdelka. Na primeru konzervansov, katerih varnostno vprašanje je bilo izpostavljeno v zadnjih letih in je v primeru benzilalkoh ola, benzalkonije- vega klorida in benzojske kisline oz. benzoatov tudi vodilo v nedavno revizijo označevanja zdravil s strani Evropske agencije za zdravila, želimo skozi prispevek izpostaviti tudi potrebo po neneh nem skrbnem spremljanju in oceni varnostnega tvega- nja, zlasti za najranljivejšo pediatrično skupino bol- nikov. KLJUČNE BESEDE: benzalkonijev klorid, benzilalkoh ol, konzervansi, mi- krobiološka kakovost, parabeni ABSTRACT Th e microbiological quality of ph armaceutical prod- ucts is one of th e key aspects of ensuring quality, safety and effectiveness of medicines. Due to strict quality assurance standards in th e ph armaceutical industry, it can be considered as self-evident. Yet, as we experienced in th e year of th e pandemic, noth ing really is. Th is review presents various ap- proach es to microbiological protection of ph arma- ceutical products with the main emphasis on preservatives posing protection from secondary microbiological contamination of products during th eir storage, distribution and usage. Finally, case studies of preservatives wh ich safety concerns h ave been raised up in recent years, are presented. In th e case of benzyl alcoh ol, benzalkonium ch lo- ride and benzoic acid/benzoates, it resulted in a recent revision of medicine labelling by th e Euro- pean Medicines Agency, wh ich h igh ligh ts th e need for continuous careful monitoring and safety risk PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI snovi in po postopkih , ki zagotavljajo sterilnost in prepre- čujejo vnos in rast kontaminantov v skladu z zah tevami v poglavju »Metode priprave sterilnih izdelkov« (5.1.1.) (1). Do mikrobiološke kontaminacije izdelka lah ko pride bodisi v fazi izbora sestavin, izdelave in polnjenja izdelka v pri- marno ovojnino (primarna kontaminacija) ali v času sh ra- njevanja, transporta in uporabe (sekundarna kontami- nacija) (slika 1). Ker je primarna kontaminacija izdelka posledica uporabe surovin neustrezne mikrobiološke ka- kovosti ali neustrezne proizvodne prakse, je ključno do- sledno upoštevanje kriterijev sprejemljivosti za mikrobiolo- ško kakovost substanc za farmacevtsko uporabo ter proizvodnja v skladu z zah tevami dobre proizvodne prakse. Do sekundarne kontaminacije pa pride zaradi kontaminacije in/ali razraščanja mikroorganizmov med sh ranjevanjem in distribucijo izdelka (npr. zaradi neustreznega konzerviranja/ovojnine) ali v času uporabe. Poznamo razli- čne strategije zaščite izdelkov pred sekundarno kontami- cevtskih izdelkov in substanc za farmacevtsko uporabo« (5.1.4.) ter »Mikrobiološka kakovost zdravil rastlinskega iz- vora za peroralno uporabo in ekstraktov za njih ovo izde- lavo« (5.1.8.). Temeljijo na skupnem številu aerobnih mi- kroorganizmov in skupnem številu kvasovk in plesni ter odsotnosti specifičnih patogenov. Sterilne farmacevtske oblike (vključujoč parenteralne farmacevtske oblike, far- macevtske oblikeza oko in dermalne farmacevtske oblike za uporabo na h udo poškodovani koži) pa izdelujemo iz assessment of preservatives and oth er excipients, especially for th e most vulnerable paediatric group of patients. KEY WORDS: benzalkonium ch loride, benzyl alcoh ol, microbio- logical quality, parabens, preservatives 148 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 Slika 1: Vzroki in posledice kontaminacije izdelkov z mikroorganizmi (MO) ter možni ukrepi za zagotavljanje ustrezne mikrobiološke (MB) kakovosti; prirejeno po (2). Figure 1: Causes, consequences and ways of preventing microbial contamination; adapted from (2). 149 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI nacijo. Medtem ko pri fizikalnem pristopu omejimo mi- krobiološko kontaminacijo v izdelku z izbiro ustrezne ovoj- nine (npr. zrakotesno zaprti vsebniki z aplikatorjem), pri fi- zikalno-kemijskem pristopu zagotovimo vzpostavitev pogojev, ki so neugodni za preživetje mikroorganizmov. Kemijski pristop pa vključuje uporabo konzervansov kot pomožnih snovi, ki preprečujejo rast mikroorganizmov pri normalnih pogojih sh ranjevanja in uporabe (2, 3). 2 FIZIKALNO-KEMIJSKI PRISTOP MIKROBIOLOŠKE ZAŠČITE Poleg razpoložljivih h ranil sta za rast mikroorganizmov nujni tudi ustrezna temperatura in vsebnost vlage. Fizikalno-ke- mijski pristop v veliki meri temelji na znižanju aktivnosti vode v izdelku. Z aktivnostjo vode (a w ) opišemo vsebnost t. i. proste (bulk) vode in se razlikuje od celokupne vsebnosti vode, ki poleg proste vključuje tudi vezano vodo. Ker je mikroorganizmom razpoložljiva le prosta voda, poznavanje a w nesterilnih formulacij poda pomembno informacijo o dovzetnosti izdelka za sekundarno mikrobiološko konta- minacijo. a w opisuje enačba: a w = P/P 0 = n 1 /(n 1 + n 2 ), pri čemer so P delni tlak vodne pare nad izbranim izdelkom in P 0 delni tlak vodne pare nad čisto vodo pri enaki tem- peraturi, n 1 moli topila (vode) in n 2 moli topljenca. Znano je, da različni mikroorganizmi za svojo rast potre- bujejo različne količine proste vode. Na osnovi poznavanja a w izdelka in potrebne minimalne a w za rast posameznih mikroorganizmov (preglednica 1) lah ko bolje načrtujemo ustrezno mikrobiološko zaščito izdelka tako s pristopi za znižanje a w kot tudi z izbiro konzervansa, ki je prilagojena najverjetnejšim kontaminantom izdelka. V formulaciji lah ko znižamo a w z vključitvijo pomožnih snovi, ki vežejo vodo (npr. h idrofilni polimeri, sotopila in soli) ali povečajo osmo- larnost izdelka (npr. sladkorji). Tako pri sirupih visoka vse- bnost sladkorjev bistveno zmanjša a w in s tem tudi potre- bno koncentracijo konzervansa, ki mora izdelek zaščititi predvsem pred osmotolerantnimi kvasovkami. Določene farmacevtske oblike, kot so praški, tablete, svečke in ma- zila, pa že v osnovi izkazujejo zelo nizko a w (tj. < 0,6) (4, 5). Na rast mikroorganizmov v formulaciji vpliva tudi tip emul- zije. Zaradi prisotnosti vode v notranji fazi so emulzije tipa V/O manj dovzetne za kontaminacijo kot emulzije tipa O/V. K boljši mikrobiološki stabilnosti pripomore tudi velikost kapljic, zato so nanoemulzije v prednosti pred klasičnimi emulzijami. Na zaščito izdelka lah ko ugodno vpliva tudi sestava oljne faze (npr. z večjo vsebnostjo fenolnih spojih ). Tako tekoče emulzije kot tudi poltrdne emulzijske gele (tj. kreme) obeh tipov dodatno zaščitimo s konzervansi; izjema so sterilne formulacije, napolnjene v zrakotesnih vsebnikih (pogosto z zaporko z aplikatorjem) (2, 3). Na mikrobiološko odpornost pomembno vpliva tudi ph for- mulacije. Ker je optimalna vrednost ph za proliferacijo glav- nine mikroorganizmov med 5 in 8, predstavljajo izdelki z višjim ali nižjim ph manj ugodno okolje za njih ovo rast in ra- zmnoževanje. To še zlasti velja za formulacije s ph pod 3 ali nad 9; pri ph pod 3 lah ko rastejo le nekatere odporne plesni. ph vrednost izdelka pa pomembno vpliva tudi na izbiro ustreznega konzervansa, tako z vidika njegove učinkovitosti kot tudi stabilnosti, kot predstavljamo v nadaljevanju (6, 7). Preglednica 1: Aktivnosti vode (aw), pri kateri so določeni mikroorganizmi sposobni preživetja; povzeto po (3). Table 1: Proliferation ability of microorganisms in correlation to water activity (aw); adapted from (3). G + – po Gramu pozitivne bakterije, G - – po Gramu negativne bakterije a w Mikroorganizmi, zmožni proliferacije 0,96–0,99 G + in G - bakterije (npr. Pseudomonas species), kvasovke in plesni 0,90–0,95 Nekatere G - in večina G + bakterij (npr. Enterobacter aerogenes, Echericchia coli, Bacillus species), kvasovke (npr. Saccharomyces cerevisiae) in plesni 0,80–0,89 G + bakterije (npr. Staphylococcus aureus), kvasovke in plesni 0,70–0,79 halofilne bakterije (npr. Halobacterium halobium), kvasovke in plesni (npr. Aspergillus niger) 0,62–0,69 Osmotolerantne kvasovke (npr. Zygosaccharomyces rouxii) pod 0,60 / 150 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 3 KEMIJSKI PRISTOP MIKROBIOLOŠKE ZAŠČITE Konzervansi so pomožne snovi, ki v izdelku preprečijo rast mikroorganizmov v času roka njih ove uporabe, tudi po od- prtju. Njih ova uporaba je nujna v večodmernih tekočih in poltrdnih izdelkih . Čeprav mikroorganizmi za svoje razmno- ževanje potrebujejo vodo, je potrebno ustrezno zaščiti tudi lipidne in trdne formulacije, saj se lah ko v slednjih tvorijo po- dročja s prosto vodo, ki omogočajo njih ovo rast in razmno- ževanje (npr. mikrobiološko kvarjenje mazil in različnih stikov). Vsi konzervansi in njih ove koncentracije, dovoljene za upo- rabo v farmaciji, so navedeni v Handbook of Pharmaceutical Excipients in Eur. Ph . Dodatek konzervansov nikoli ne sme nadomestiti postopkov dobre proizvodne prakse, niti jih ne smemo dodajati z namenom, da bi preprečili razraščanje mikroorganizmov v že kontaminiranih surovinah ali izdelkih . Glede na mehanizem delovanja (preglednica 2) ločimo konzervanse, ki poškodujejo celično steno in/ali membrano, s čimer vplivajo na permeabilnost in aktivnost (trans)mem- branskih encimov in ovirajo transport vode in h ranilnih snovi. Tretja tarča je citoplazma mikroorganizmov, kjer ne- kateri konzervansi povzročijo denaturacijo proteinov in en- cimov ali strukturne spremembe pomembnih komponent celic, zavirajo celični metabolizem ali poškodujejo DNK oz. RNK. Pogosto je težko predvideti točno mesto delovanja konzervansov, saj je slednje odvisno tudi od uporabljene koncentracije (6, 8). Pri izbiri primernega konzervansa moramo upoštevati tako vrsto farmacevtske oblike kot način aplikacije zdravila (pre- glednica 3) in starost bolnika. Ker idealen konzervans ne obstaja, v praksi izbiramo takšne, ki imajo čim več nasled- njih lastnosti: 1) delovanje pri čim nižji koncentraciji (pri kateri mora biti tudi netoksičen in nealergen), 2) definirano kemijsko zgradbo, 3) širok spekter delovanja, 4) učinkovi- tost v širokem ph območju, 5) ustrezno stabilnost (tudi pri povišani temperaturi, na svetlobi, pri različnih vrednostih ph, ki jim je lah ko izpostavljen med izdelavo, sh ranjevanjem in uporabo izdelka), 6) primerno vodotopnost in porazde- litveni koeficient, ki omogoča, da ostane prednostno po- razdeljen v vodni fazi, 7) kompatibilnost z drugimi sestavi- nami izdelka in ovojnino, 8) v primeru (per)oralne in nazalne aplikacije pa so pomembne tudi ustrezne organoleptične lastnosti (okus, vonj) (7, 9). Večina konzervansov le delno ustreza navedenim kriterijem, zato pogosto uporabljamo kombinacije konzervansov oz. konzervansov in drugih sestavin s sinergističnim delovanjem, kar nam omogoča uporabo nižje koncentracije posameznega konzervansa. Učinek slednjih podpirajo npr. kelatorji kovinskih ionov, nekatera topila, h igroskopne spojine, zdravilne učin- kovine in eterična olja. V praksi pogosto kombiniramo metil- in propilparaben, saj je protimikrobna aktivnost parabenov obratno sorazmerna z vodotopnostjo in narašča z daljšanjem alkilne verige (butil > propil > etil > metil). Veliko se uporablja tudi kombinacija parabenov in EDTA (7, 10, 11). Pri izbiri konzervansa moramo upoštevati tudi morebitne inkompatibilnosti s sestavinami formulacije (npr. površinsko aktivnimi snovmi) in izbrano ovojnino (možnost adsorpcije konzervansa na nekatere umetne mase in gumijaste za- porke) (preglednica 3). Dodaten izziv predstavlja konzervi- ranje večfaznih sistemov zaradi porazdeljevanja kon- zervansa med oljno in vodno fazo v skladu z njegovim porazdelitvenim koeficientom (v primeru emulzijskih siste- mov) oz. možnosti adsorpcije konzervansa na trdne Preglednica 2: Mesto delovanja izbranih konzervansov v mikrobni celici; povzeto po (8). Table 2: Site of selected preservatives' activity in microbial cell; adapted from (8). Celična stena Citoplazemska membrana Citoplazma Fenoli 2-fenoksietanol 2-fenoksietanol in drugi organski alkoh oli Alifatske in aromatske karboksilne kisline parabeni alifatske in aromatske karboksilne kisline Organske živosrebrove spojine organske živosrebrove spojine h alogenirani konzervansi EDTA EDTA / Klorh eksidin, cetrimid klorh eksidin, h eksaklorofen klorh eksidin (visoke koncentracije) Glutaraldeh id spojine, ki sproščajo formaldeh id (npr. bronopol, imidurea) spojine, ki sproščajo formaldeh id (npr. bronopol, imidurea) Anionske površinsko aktivne snovi benzalkonijev klorid / 151 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI delce (v primeru suspenzij) ali polimere, ki se uporabljajo kot zgoščevala. Na porazdeljevanje v oljno fazo moramo biti pozorni npr. pri bolj lipofilnih analogih parabenov (pro- pil- in butilparaben), medtem ko je za klorh eksidin značilno porazdeljevanje v micele in adsorpcija na polimerna su- spendirajoča sredstva. Oboje vodi v znižanje koncentracije konzervansa v vodni fazi, zato je potrebno ustrezno pove- čati njegovo koncentracijo v formulaciji (slika 2) (7, 9). Od ph formulacije ni odvisna le rast mikroorganizmov, am- pak tudi interakcije konzervansov s komponentami njih ove celične stene in s tem minimalna inh ibitorna koncentracija konzervansa. Učinkovitost slednjih je najboljša, ko je ph formulacije znotraj ph območja njih ove optimalne aktivnosti (preglednica 3). Od ph odvisna aktivnost je povezana s kemijsko strukturo konzervansov. Kadar so slednji aktivni v neionizirani obliki (npr. kisline, alkoh oli ali fenoli), je njih ova učinkovitost najboljša, ko je ph (formulacije) ≤ pKa (konzervansa) . Vpliv ph na aktivnost konzervansov je sicer kompleksen, saj je protibakterijsko delovanje benzojske pa tudi propion- ske in sorbinske kisline veliko bolj odvisno od ph kot njih ova aktivnost proti glivam, ki je oh ranjena tudi pri višjih vredno- stih ph (2, 6, 7). 3.1 VREDNOTENJE UČINKOVITOSTI KONZERVANSOV Za vse konzervirane farmacevtske izdelke moramo dokazati upravičenost uporabe in učinkovitost izbranih konzervansov s farmakopejskim preskusom »Učinkovitost konzervansov« (5.1.3), s katerim vrednotimo celokupno protimikrobno za- ščito izdelka (1). K slednji skupno prispevajo značilnosti formulacije, vgrajeni konzervansi in primarna ovojnina. Os- novni princip testa je masovna in namerna inokulacija iz- delka (najbolje v originalnem vsebniku) s standardnimi mi- kroorganizmi ter spremljanje njih ovega števila skozi predpisano časovno obdobje. Protimikrobna zaščita je ustrezna, v kolikor pride po inokulaciji do značilnega (in trajnega) zmanjšanja števila mikroorganizmov. Eur. Ph . definira inokulacijo testiranih izdelkov s Pseudo- monas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albi- cans ter Aspergillus brasiliensis do končnega inokuluma 10 5 (v primeru gliv) oz. 10 6 (v primeru bakterij) kolonizirajočih enot (CFU) na ml oz. g izdelka. Dodatno lah ko uporabimo tudi verjetne kontaminante kot Escherichia coli za peroralne formuacije ter Zygosaccharomyces rouxii za peroralne far- macevtske oblike z visoko koncentracijo sladkorja (sirupe). Količina dodane suspenzije mikroorganizmov pri tem ne sme presegati 1 % volumna izdelka, s čimer se izognemo redčenju izdelka oz. konzervansa. Inokulirano formulacijo sh ranjujemo zaščiteno pred svetlobo pri 20 do 25 °C in glede na vrsto izdelka spremljamo število mikroorganizmov v časovnem intervalu 0 do 28 dni. Kot rezultat podamo lo- garitem zmanjšanja koncentracije mikroorganizmov (CFU/ml) glede na začetni inokulum, ki mora glede na zah - tevano stopnjo mikrobiološke zaščite farmacevtskih izdel- kov ustrezati kriteriju A ali B. Kriterij A izraža priporočljivo Slika 2: Koncentracija molekule konzervansa v vodni fazi formulacije je odvisna od stopnje ionizacije molekule, porazdeljevanja v oljno fazo ali micele površinsko aktivnih snovi, možna je tudi adsorpcija na suspendirane delce ter adsorpcija/permeacija v plastične zaporke. Prirejeno po (12). Figure 2: The concentration of active form of preservative molecules in an aqueous phase of formulations depends on the state of ionisation of the molecule, partitioning into oil droplets or surfactant micelles, as well as adsorption onto suspended solids or adsorption/permeation of plastic closures. Adapted from (12). 152 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 Preglednica 3: Skupine pogosto uporabljanih konzervansov za različne načine aplikacije s pH-območji, pri katerih so optimalno aktivni, ter nekaterimi substrati oz. adsorbenti, ki jih lahko deaktivirajo. Povzeto po (6–8). Table 3: Common preservatives for pharmaceutical products: pH of optimum activity plus some adsorbents/substrates playing a part in their inactivation. Adapted from (6–8). Način aplikacije Konzervans Kemijska skupina pH Adsorbent / substrat (Per)oralno Metil-, etil-, propilparaben (in kombinacije) estri aromatskih karboksilnih kislin 4–8 nekatere plastike, ionsko izmenjevalne smole, želatina Na-benzoat in benzojska kislina aromatska karboksilna kislina ≤ 4,5 kaolin Sorbinska kislina, K-sorbat propionska kislina alifatske karboksilne kisline 4,5 3,9 polipropilen (PP), PVC, polietilen (PE) Metilparaben + Na-benzoat (kombinacija) - Dermalno (vključno z nazalno) Benzalkonijev klorid, cetrimonijev bromid, benzetonijev klorid, alkiltrimetilamonijev klorid (tudi v kombinaciji z EDTA) kvarterne amonijeve spojine; kelator kovinskih ionov 4–10 hPMC Metil-, etil-, propil-, butilparabeni (in kombinacije) estri aromatskih karboksilnih kislin 4–8 nekatere plastike, ionsko izmenjevalne smole, želatina Benzilalkoh ol, cetil- in stearilalkoh ol aromatski in alifatski alkoh oli ≤ 5 PE, guma Benzojska kislina, sorbinska kislina aromatske in alifatske karboksilne kisline ≤ 4,5 4,5 kaolin PP , PVC, PE Kloroacetamid, triklorokarban alifatski in aromatski amidi - Tiomersal organske živosrebrove spojine Kisel ph PE/druge plastike, guma Imidurea, bronopol spojine, ki sproščajo formaldeh id 3–9 5–8 Klorh eksidin bigvanidi 5–7 Na-karbosimetil celuloza Klorkrezol, klorooksilenol, diklorofen, h eksaklorofen 2-fenoksietanol fenoli 4–9 3–10 PVC, celulozni derivati Parenteralno (vključno s cepivi) Benzilalkoh ol, 2-etoksietanol, klorobutanol aromatski in alifatski alkoh oli ≤ 5 PE, gumaPE Metil-, etil-, propil-, butilparaben (in kombinacije) estri aromatskih karboksilnih kislin 4–8 nekatere plastike, ionsko izmenjevalne smole, želatina Benzojska kislina, sorbinska kislina aromatske in alifatske karboksilne kisline ≤ 4,5 4,5 kaolin PP , PVC, PE Klorh eksidin bigvanidi 5–7 Na-karbosimetil celuloza Fenol, m-krezol, 2-fenoksietanol fenoli 4–9 3–10 PVC, celulozni derivati Tiomersal, fenil živosrebrove soli organske živosrebrove spojine kisel ph 5–8 PE/druge plastike, gumarazlična suspendirajoča sredstva 153 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI učinkovitost, ki jo je potrebno doseči. V utemeljenih pri- merih , kjer kriterija A ne moremo doseči (na primer zaradi večje možnost neželenih reakcij), pa mora biti izpolnjen kriterij B (1). 4 PRIMERI UPORABE IN OZNAČEVANJE DOLOČENIH KONZERVANSOV V ZDRAVILIH V l. 2017 je EMA revidirala navodila za označevanje zdravil v povezavi z nekaterimi pogosto uporabljanimi pomožnimi snovmi, s posebnim poudarkom na njih ovem varnostnem profilu, zlasti za pediatrično populacijo (13). Podrobneje je proučila tudi konzervanse, in sicer benzilalkoh ol, benzal- konijev klorid in benzojsko kislino oz. benzoate, ki so ob tiomersalu in parabenih (slika 3) tudi sicer pod drobnogle- dom zaradi potencialnih škodljivih učinkov na zdravje. 4.1 BENZILALKOhOL IN TIOMERSAL V VEČODMERNIh PARENTERALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Poseben izziv za konzerviranje predstavljajo večodmerne vodne parenteralne farmacevtske oblike, ki morajo zaradi možnosti kontaminacije med večkratnim odvzemom nujno Okularno Kvarterne amonijeve spojine (benzalkonijev klorid in druge); tudi v kombinaciji z EDTA kvarterne amonijeve spojine; kelator kovinskih ionov 4–10 hPMC 2-fenoksietanol fenoli 3–10 PVC, celulozni derivati Tiomersal, fenil živosrebrove soli organske živosrebrove spojine kisel ph 5–8 PE/druge plastike, gumarazlična suspendirajoča sredstva Benzojska kislina, Na- benzoat, sorbinska kislina, K-sorbat aromatske in alifatske karboksilne kisline ≤ 4,5 4,5 kaolin PP , PVC, PE Klorh eksidin, poliaminoproilbigvanid, polih eksametilbigvanid bigvanidi 5–7 Na-karbosimetil celuloza Imidurea spojine, ki sproščajo formaldeh id 3–9 Slika 3: Kemijske strukture izbranih konzervansov. Figure 3: Chemical strukture of selected preservatives. 154 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 vsebovati konzervans (razen če sama farmacevtska oblika izkazuje ustrezne protimikrobne lastnosti). Parenteralne far- macevtske oblike s klasičnimi zdravilnimi učinkovinami, t. i. majh nimi molekulami, so najpogosteje konzervirane z benzilkoh olom ali kombinacijo metil- in propilparabena (raz- merje 9 : 1 do skupno 0,2 %), pogosto se uporabljajo tudi fenol, klorbutanol, m-krezol, fenoksietanol ter tiomersal, večinoma v zelo nizkih koncentracijah od 0,002 do 1 % (14–16). Konzerviranje parenteralnih farmacevtskih oblik s proteinskimi učinkovinami, vključujoč monoklonska proti- telesa, pa je zlasti zah tevno zaradi možnih interakcij s kon- zervansom, ki lah ko vodijo v fizikalno nestabilnost ali oksi- dacijo proteinske molekule. To je problematično tako z vidika učinkovitosti kot dolgoročne (ne)stabilnosti. Zaradi specifičnih lastnosti so ti pripravki v obliki liofilizatov, kjer je v primeru večodmernih farmacevtskih oblik konzervans (najpogosteje m-krezol, fenol, benzilalkoh ol ali benzalkonijev klorid) dodan v medij za rekonstitucijo (17). Benzilalkohol v parenteralnih farmacevtskih oblikah kla- sično uporabljamo v koncentraciji 0,5 do 2 %, v parente- ralnih proteinskih pripravkih pa od 0,9 do 1,1 % (14). Deluje tudi kot lokalni anestetik, zaradi česar je intramuskularna aplikacija manj boleča. Dodajamo ga tudi v peroralne far- macevtske oblike (do 2 %) in kozmetične izdelke (do 1 %). Učinkovit je proti večini po Gramu pozitivnih bakterij, kva- sovk in plesni, manj pa proti po Gramu negativnim bakte- rijam. Izrazito problematičen je za nedonošenčke in novo- rojenčke po intravenski aplikaciji. Zaradi še nerazvitega encimskega sistema pride do akumulacije benzilalkoh ola in njegovega metabolita benzojske kisline, ki ob sočasni metabolni acidozi vodi v življenje ogrožajoče stanje z zna- čilnim »sindromom lovljenja sape« (gasping syndrome), h u- dimi nevrološkimi in h ematološkimi motnjami ter odpovedjo srca (18). Upoštevaje nove smernice EMA za označevanje morajo zato navodila za uporabo tako za zdravila za pa- renteralno pa tudi peroralno dostavo vsebovati opozorilo, da je/se benzilalkoh ol 1) povezan z nevarnostjo pojava resnih neželenih učinkov, vključujoč »sindrom lovljenja sape«, pri mlajših otrocih ; 2) ne uporablja pri novorojenčkih do četrtega tedna starosti, razen po navodilu zdravnika; 3) ne uporablja več kot en teden pri otrocih do tretjega leta starosti, razen po navodilu zdravnika ali farmacevta ter 4) morajo nosečnice in doječe matere ter bolniki z boleznimi ledvic ali jeter posvetovati z zdravnikom ali farmacevtom o uporabi zaradi možnosti akumulacije v telesu in nastanka metabolne acidoze (19). Tiomersal v cepivih je še vedno aktualna tema, tako kot varnost cepiv v celoti, ki še zlasti v luči trenutne epidemio- loške situacije zaradi covid-19 le pridobiva na razsežnosti. Tiomersal je tako še vedno tema različnih polemik, čeprav njegove morebitne vpletenosti v povečano pojavnost avt- izma in ostalih razvojnih motenj niso dokazali v nobeni iz- med raziskav, izvedenih s tiomersalom v koncentracijah , ki se uporabljajo v cepivih (20, 21). Metil živo srebro (metil hg), s katerim najpogosteje pridemo v stik z morsko h rano (npr. tunino), je dejansko nevrotoksična oblika organskega hg, zlasti za nerojene in majh ne otroke. Svetovna zdrav- stvena organizacija je zato določila zgornjo varno vrednost za dnevno izpostavitev metil hg, ki je za majh ne otroke, nosečnice, doječe matere in ženske v rodni dobi še bi- stveno nižja v primerjavi s povprečnim odraslim; v obeh primerih pa so upoštevani veliki varnostni faktorji. Navedene vrednosti se upoštevajo tudi za tiomersal, ki je skupaj s svojim metabolitom etil hg sicer veliko manj toksičen kot metil hg. Za razliko od slednjega, ki se nalaga v telesu, je za etil hg značilna zelo h itra eliminacija. Kljub temu so iz previdnostnih razlogov na začetku 21. stoletja v ZDA umak- nili tiomersal iz večine cepiv, čemur je sledila tudi Evropa. Po trenutno dostopnih podatkih v Sloveniji dostopna cepiva ne vsebujejo tiomersala (22). 4.2 BENZALKONIJEV KLORID V PRIPRAVKIh ZA OKO Za konzerviranje pripravkov za oko priporočajo različne konzervanse (preglednica 3). Po razširjenosti močno iz- stopa benzalkonijev klorid, ki se uporablja že od l. 1950 in je zaradi visoke učinkovitosti, ustreznega varnostnega profila in nizke alergenosti prisoten v treh četrtinah izdelkov. V vlogi konzervansa ga pogosto najdemo tudi v vodnih pripravkih za inh aliranje ali aplikacijo v nos, redko pa v far- macevtskih oblikah za druge poti vnosa (23). Kot konzer- vans se uporablja v koncentracijah 0,004 do 0,025 %. De- luje fungicidno ter baktericidno predvsem na po Gramu pozitivne bakterije, medtem ko se aktivnost proti po Gramu negativnim bakterijam ojača v kombinaciji z EDTA (0,1 %). Zaradi dolge zgodovine uporabe so dobro raziskani tudi neželeni učinki po nanosu benzalkonijevega klorida, pred- vsem v povezavi s kapljicami za zdravljenje glavkoma in uporabo umetnih solz za blaženje sindroma suh ega očesa, kjer kronična in progresivna narava obeh bolezni zah teva večletno uporabo pripravkov za oko. V obširnih kliničnih raziskavah so potrdili koncentracijsko in časovno odvisne neželene učinke benzalkonijevega klorida na površino očesa, ki se odražajo v paleti kliničnih znakov, od občutka povečanega nelagodja, suh ega očesa, ostrega, bolečega ali srbečega občutka in zmanjšane tvorbe ter obstojnosti solznega filma do vnetnih sprememb. Ker lah ko slednji 155 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI zelo poslabšajo sodelovanje bolnikov, so zaželene formu- lacije s podaljšanim delovanjem, ki močno zmanjšajo iz- postavljenost očesa benzalkonijevemu kloridu in omilijo navedene sopojave. Nasprotno pa njegova uporaba ni problematična pri kratkotrajni uporabi, kot je v primeru zdravljenja vnetij ali infekcij (24–26). Težave, ki lah ko spremljajo dolgotrajno uporabo benzal- konijevega klorida v pripravkih za oko, so obšli z enood- mernimi farmacevtskimi oblikami za oko. Slednje imajo iz- boljšan varnostni profil, a so tudi neprimerljivo dražje (za faktor 5–10) in v primerjavi z večodmernimi konzerviranimi farmacevtskimi oblikami tudi bolj obremenjujejo okolje. Vse- bnik vsebuje 0,1 do 1 ml tekočine in naj bi ga po aplikaciji ene do dveh kapljic v posamezno oko ali obe očesi zavrgli skupaj z zaostalo tekočino. V praksi jih ljudje zelo pogosto uporabljajo, dokler ne zmanjka vsebine, kar predstavlja vi- soko mikrobiološko tveganje. Omeniti velja tudi oteženo rokovanje z enoodernimi vsebniki pri starejših ali ljudeh z zmanjšano fino motoriko (npr. nerodno odpiranje pokrovčka ter težavno stiskanje vsebnika zaradi trše plastike). Alter- nativo slednjim predstavljajo inovativni večodmerni vsebniki, ki med uporabo zagotavljajo sterilnost vsebine s pomočjo teh noloških rešitev, ki vključujejo bifunkcionalno membrano s protimikrobnimi lastnostmi, globinski filter ali posebni enosmerni ventil, ki preprečuje vstop mikroorganizmov v notranjost vsebnika po odprtju (26). Zanimivo inovacijo na- menjeno konzerviranim kapljicam pa predstavljajo vsebniki s filtri, na katere se konzervans med aplikacijo adsorbira in tako ne pride v stik z očesno sluznico (24). V večodmernih kapljicah za oko uporabljamo tudi alterna- tivne konzervanse, vendar je nabor relativno majh en zaradi zah tevanih visoke protimikrobne učinkovitosti in netoksi- čnosti (26). Glede na meh anizem delovanja v osnovi ločimo dve skupini: a) Oksidirajoči konzervansi, ki oksidirajo posamezne komponente mikroorganizmov in vplivajo na sintezo nji- h ovih proteinov. Po aplikaciji se pod vplivom svetlobe ali v stiku s solzno tekočino razgradijo ne neškodljive produkte. V uporabi so natrijev perborat (GenAqua ® , Dequest ® ), stabiliziran oksiklorokompleks (Purite ® , Ocu- Pure ® ) ter Sofzia ® , ki je pufrna raztopina cinkovega klo- rida, borata, propilen glikola in sorbitola. Natrijev perborat je eden izmed prvih oksidirajočih konzervansov in v skladu z idejo »disappearing« konzervansov ob stiku z vodo tvori vodikov peroksid, ki ga v očesni sluznici pri- sotne katalaze razgradijo na kisik in vodo. Stabiliziran oksiklorokompleks v raztopini tvori radikale klorovega dioksida, po aplikaciji na oko pa se pod vplivom svetlobe razgradi v natrijev klorid, kisik in vodo. Sicer maloštevilne raziskave potrjujejo značilno manj izražene neželene učinke na očesno površino v primerjavi z benzalkonijevim kloridom (26). b) Polikvarternij-I (polyquaternium-I, Polyquad ® ) kot kon- zervans v tekočinah za leče uporabljamo že več kot 30 let in številne raziskave potrjujejo njegovo učinkovitost ter biokompatibilnost. Čeprav je kvarterna amonijeva spojina, ima v primerjavi z benzalkonijevim kloridom zna- čilno manj izražene neželene učinke na očesni površini. Polikation polikvarternij-I je namreč polimer in kot tak bistveno večja molekula z manjšo sposobnostjo pene- tracije v tkiva (26, 27). Zadnje izdano mnenje EMA z leta 2009 glede uporabe konzervansov v pripravkih za oko sicer ne podaja sploš- nega priporočila o odsotnosti konzervansov, poudarja pa smotrnost uporabe pripravkov brez konzervansov v primeru dolgotrajne terapije ali za ljudi, ki so nanje občutljivi. Ne- konzervirane farmacevtske oblike za oko EMA močno pri- poroča za uporabo pri otrocih , zlasti novorojenčkih . Kon- zervansi se morajo uporabljati v najnižji učinkoviti koncentraciji glede na rezultat preskusa »Učinkovitost kon- zervansov«, izogibati pa se je potrebno hg spojinam (npr. tiomersalu), tudi z vidika zmanjševanja izpostavljenosti oko- lja hg (28). Upoštevaje aktualne smernice EMA je potrebno v primeru zdravil za oči, ki vsebujejo benzalkonijev klorid, označiti, da 1) se le-ta lah ko absorbira v meh ke leče in jih obarva; 2) je potrebno pred aplikacijo zdravila leče odstraniti in jih ponovno vstaviti po 15 minutah ; 3) benzalkonijev klorid lah ko povzroči draženje oči, zlasti v primeru sindroma suh ega očesa ali težav z roženico. V primeru izrazitega neugodja, zbadanja ali bolečine po uporabi zdravila se je potrebno posvetovati z zdravnikom (29). 4.3 BENZOJSKA KISLINA IN BENZOATI V PERORALNIh, PARENTERALNIh IN DERMALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Za konzerviranje navedenih farmacevtskih oblik se ben- zojska kislina in predvsem njene K- ali Na-soli (benzoati) uporabljajo v koncentraciji 0,01 do 0,2 %. Glavno varnostno vprašanje se nanaša na njeno sposobnost sproščanja bi- lirubina z albumina, varnostno tveganje pa je veliko zlasti za novorojenčke, kar je tudi vodilo v revizijo navodil. Fizio- loška zlatenica je pogost pojav pri novorojenčkih , prevelike koncentracije nevezanega oz. prostega bilirubina v serumu pa delujejo nevrotoksično in lah ko povzročijo okvaro osred- njega živčevja (kernikterus). Tveganje je povezano tako s 156 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 peroralno, parenteralno kot tudi dermalno aplikacijo (obseg dermalne absorpcije benzojske kisline je pri novorojenčkih zelo velik) ter tudi s sočasno aplikacijo benzilalkoh ola, ki se metabolizira do benzojske kisline. Na navodilih za upo- rabo zdravil za opisane poti aplikacije je zato potrebno označiti, da lah ko benzojska kislina povzroči zlatenico (pre- poznavno po rumenem obarvanju kože in oči) pri dojenčkih do četrtega tedna starosti. V primeru dermatikov je zah te- vana še navedba dodatnega opozorila o možnosti lokal- nega draženja (30). 4.4 PARABENI V PERORALNIh IN DERMALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Parabeni so estri parah idroksibenzojske kisline in njih ove natrijeve soli in so zadnjih 80 let eni najpogosteje upora- bljanih konzervansov v h rani, kozmetičnih in farmacevtskih izdelkih , ki jih učinkovito zaščitijo proti kvasovkam in ples- nim, manj pa proti po Gramu negativnim bakterijam. Med- tem ko se po peroralni aplikaciji zelo h itro absorbirajo in metabolizirajo v jetrih ter izločijo z urinom, se po dermalnem nanosu absorbirajo le v manjšem obsegu (za izračun meje varnosti se upošteva 3,7-odstotna dermalna absorpcija). Ker h idroliza do parah idroksibenzojske kisline v koži ni po- polna, jih zaradi možnega estrogenega delovanja ne mo- remo obravnavati kot popolnoma varne spojine. V EU tako sistematično zbiramo in proučujemo podatke o njih ovi var- nosti, s čimer je povezano tudi redno posodabljanje pred- pisov, ki urejajo njih ovo uporabo v različnih izdelkih , ki smo jim pogosto sočasno izpostavljeni. Z namenom doseganja sinergističnega učinka in s tem čim nižje vsebnosti kon- zervansov v izdelkih pogosto uporabljamo kombinacijo metil- in propilparabena. V farmaciji je najbolj razširjena v peroralnih farmacevtskih oblikah , kjer je njuna vsebnost največkrat 0,015 do 0,2 % (metilparaben) oz. 0,02 do 0,06 % (propilparaben) (31). EMA sicer maksimalno dovo- ljeno koncentracijo propilparabena omejuje na 100 mg/kg/dan. Etilparben in butilparaben se manj uporabljata, slednji predvsem v dermalnih pripravkih . Parabeni imajo dolgo zgodovino uporabe tudi v kozmetični industriji, kjer so jih povezovali zgolj z možnostjo pojava alergijskih reakcij. Odkar je bila l. 2004 v reviji Journal of Applied Toxicology objavljena raziskava, v kateri so poročali o povečani vsebnosti parabenov v tumorjih dojk onkoloških bolnic, v strokovni in širši javnosti poteka intenzivna diskusija o varnosti njih ove uporabe v kozmetičnih izdelkih (za pod pazduh o) in tveganjem za razvoj raka dojk. Čeprav sta tudi avtorja raziskave dodatno pojasnila, da parabenov nista označila kot vzrok za pojav raka in da nenazadnje niti ni znano, po kateri poti so parabeni prišli v tumorje oz. kaj je bil njih ov izvor, je dvom o varnosti parabenov ostal. Znan- stveni odbor za potrošniške izdelke (Scientific Committee on Consumer products, SCCP) tako že 15 let intenzivno spremlja varnost parabenov v kozmetičnih izdelkih in je od leta 2005 izdal več mnenj (zadnje v l. 2021). V vseh so prišli do zaključka, da ni znanstvenih dokazov, ki bi kazali na po- večano tveganje za razvoj raka dojk ob uporabi konzervira- nih kozmetičnih izdelkov za pod pazduh o. So pa na podlagi teh raziskav uvrstili parabene med morebitne endokrine motilce, čemur so prilagodili njih ove maksimalne dovoljene koncentracije in prepovedali uporabo dolgoverižnih deriva- tov (izopropil- in izbobutil- ter pentil-, fenil- in benzilparabeni niso dovoljeni v kozmetičnih izdelkih , ki so prišli na tržišče po l. 2014). Metil- in etilparaben še naprej veljata kot varna, njuna vsebnost v kozmetičnih izdelkih pa je lah ko do 0,4 % (kot posamezen ester) oz. do 0,8 % (za zmesi parabenov). Od leta 2016 je maksimalna dovoljena koncentracija za propil- in butilparaben znižana na 0,14% (posamezno ali v kombinaciji). SCCS je pred kratkim izdal novo mnenje o varnosti propilparabena, ki je potrdilo izsledke iz leta 2016, za butilparaben pa je ponovna presoja varnosti še v teku. Na predlog SCCS je Evropska komisija leta 2016 tudi pre- povedala uporabo propil- in butilparabena v kozmetičnih izdelkih , ki se ne spirajo in so namenjeni negi pleničnega področja pri otrocih , mlajših od treh let (32–34). Pri proučevanju varnosti parabenov sodeluje tudi Evropska agencija za varnost h rane (EFSA), saj parabene v vlogi konzervansov uporabljamo tudi v živilih (maksimalna do- voljena vsebnost v končnem živilu je do 0,2 % oz. 0,1 % v pijačah ) (35). EFSA maksimalni skupni dnevni vnos metil- in etilparabena (navajana kot E218 in E214) omejuje na do 10 mg/kg telesne mase, medtem ko je uporaba propilpa- rabena v živilih v EU od l. 2006 prepovedana zaradi po- tencialnega vpliva na razvoj moških reproduktivnih organov. Pri metilparabenu tovrstnih učinkov niso zaznali in še naprej velja za varnega tudi za celotno pediatrično populacijo. Na podlagi prepovedi uporabe propilparabena v h rani lah ko utemeljimo tudi prepoved njegove uporabe v zdravilih za novorojenčke, dojenčke in majh ne otroke, tudi v primeru kratkotrajne uporabe (36). 4.5 KONZERVANSI V ZDRAVILIh ZA OTROKE Primeri zgoraj opisanih konzervansov osvetljujejo zah tev- nost in večplastnost oblikovanja zdravil za otroke, kjer sle- 157 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI dimo splošnemu vodilu po čim bolj enostavni končni for- mulaciji z minimalnim številom in vsebnostjo pomožnih snovi, brez nepotrebnih dodatkov. Če je mogoče, se na- mesto konzervansov raje poslužujemo inovativnih teh no- loških rešitev. Kadar to ni možno, mora biti uporaba kon- zervansov teh tna in upravičena ter vedno v najnižjih koncentracijah , ki še zagotavljajo ustrezno zaščito. Po- manjkanje relevantnih kliničnih raziskav postavlja ključno vprašanje, ali so varnostni podatki, pridobljeni na odraslih prostovoljcih , relevantni za pediatrično populacijo. Ali naj bo uporaba konzervansov prepovedana v vseh starostnih skupinah ali le za novorojenčke in dojenčke, morda le v primeru dolgotrajne uporabe? Morebiti so lah ko dovoljeni za starejše otroke, vendar koliko stare? Ali je vprašljiva tudi kratkotrajna uporaba (36)? Nešteto vprašanj, odgovor pa ni en sam in še zdaleč ne enoznačen. V pomoč glede dol- gotrajne izpostavljenosti lah ko služijo podatki EFSA ter na novo vzpostavljena podatkovna baza STEP (Safety and Toxicity of Excipients for Pediatrics (37)), vsekakor pa je prva izbira vedno uporaba pripravkov brez konzervansov. Izpostavljenost konzervansom lah ko zmanjšamo tudi s tem, da tradicionalne večodmerne tekoče pripravke na- domestimo z alternativnimi otrokom prijaznimi farmacevt- skimi oblikami, kot so npr. orodisperzibilne tablete, minita- blete, oralni filmi in slamice, ki jih praviloma ni potrebno konzervirati (38, 39). 5 SKLEP Mikrobiološka kakovost je integralni del vsakega farma- cevtskega izdelka. Ustrezno načrtovanje pomožnih snovi, vključno s konzervansi, je ključnega pomena za razvoj op- timalnega zdravila. Poleg osnovnih informacij o konzer- vansih , katerih poznavanje je pomembno s teh nološkega vidika, moramo redno spremljati tudi informacije o njih ovi varnosti, ki jih z namenom zagotavljanja kakovostnih in varnih zdravil kontinuirano nadgrajujejo. Regulatorni organi namreč neneh no spremljajo varnostni profil pomožnih snovi, vključujoč konzervanse, kar se odraža tudi v prila- gajanju zgornjih varnih mej uporabe in reviziji označevanja zdravil na osnovi najnovejših znanstvenih dognanj. Ključno je, da bodo takšnemu trendu sledili tudi v prih odnje, zato so relevantne znanstvene raziskave, predvsem z vidika ocene varnostnega tveganja za različne načine aplikacije in specifične skupine bolnikov, še kako upravičene. 6 LITERATURA 1. European Pharmacopoeia online 10.0 [Internet]. Council of Europe Edqm 01/2020 [cited 2021 March 15]. 625-27 p. Available from: https://pheur.edqm.eu/home 2. Halla N, Fernandes IP , Heleno SA, Costa P , Boucherit-Otmani Z, Boucherit K, et al. Cosmetics Preservation: A Review on Present Strategies. Molecules. 2018 Jun 28;23(7):1571. 3. Dao H, Lakhani P , Police A, Kallakunta V, Ajjarapu SS, Wu KW, et al. Microbial Stability of Pharmaceutical and Cosmetic Products. AAPS PharmSciTech. 2018 Jan;19(1):60-78. 4. Tapia MS, Alzamora SM, Chirife J. Effects of Water Activity (aw) on Microbial Stability as a Hurdle in Food Preservation. In: Barbosa‐Cánovas GV, Fontana Jr. AJ, Schmidt SJ, Labuza TP , editors. Water Activity in Foods: Fundamentals and Applications, Second Edition [Internet]. John Wiley & Sons, Inc.; 2020 [cited 2021 April 15]. Chapter 14. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/978111876598 2.ch14 5. Cundell T. The role of water activity in the microbial stability of non-sterile drug products. Eur Pharm Rev. 2015 March,20(1):58-63. 6. Anurova MN, Bakhrushina EO, Demina NB, Panteleeva ES. Modern Preservatives of Microbiological Stability (Review). Pharma Chem J. 2019 Sept 53, 564–71. 7. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part Two: Choosing a Preservative [update 2017 October; cited 2021 April 16]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured- Articles/343543-Antimicrobial-Preservatives-Part-Two-Choosing -a-Preservative/ 8. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part One: Choosing a Preservative System [update 2012 January; cited 2021 April 16]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured- Articles/38886-Antimicrobial-Preservatives-Part-One-Choosing- a-Preservative-System/ 9. Baumgartner S., Bajramović N. Varnost in učinkovitost konzervansov v kozmetičnih izdelkih. V: Kočevar Glavač N, Zvonar A (Ur.). Kozmetologija I: trendi na področju kozmetičnih izdelkov: učinkovitost in varnost sestavin: Fakulteta za farmacijo, Ljubljana; 2011. str. 39-52. 10. Fransway AF, Fransway PJ, Belsito DV, Warshaw EM, Sasseville D, Fowler Jr JF, DeKoven JG, et al. Parabens. Dermatitis. Jan/Feb 2019;30(1):3-31. 11. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part Three: Challenges Facing Preservative Systems [update 2012 January; cited 2021 April 17]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured- Articles/38874-Antimicrobial-Preservatives-Part-Three-Challeng es-Facing-Preservative-Systems/ 12. The solubility of drugs. In: Florence T, Attwood D, editors. Physicochemical Principles of Pharmacy. 4th ed. London: Pharmaceutical Press; 2006. p. 139-176. 13. EMA [Internet]. Excipients labelling [cited 2021 May 5]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/human- regulatory/marketing-authorisation/product-information/referenc e-guidelines/excipients-labelling 158 MIKROBIOLOš KA ZAš ČITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV farm vestn 2021; 72 14. Meyer BK, Ni A, Hu B, Shi L. Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J Pharm Sci. 2007 Dec;96(12):3155-67. 15. Moser CL, Meyer BK. Comparison of compendial antimicrobial effectiveness tests: a review. AAPS PharmSciTech. 2011 Mar;12(1):222-6. 16. Nagarsenkar MS, Dhawan VV. Parenteral preparations. In: Adejare A, editor-in-chief. Remington (Twenty-third Edition) The Science and Practice of Pharmacy [Internet]. Academic Press; 2020 [cited 2021 May 10]. Chapter 29. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012820 0070000295?via%3Dihub 17. Gervasi V, Dall Agnol R, Cullen S, McCoy T, Vucen S, Crean A. Parenteral protein formulations: An overview of approved products within the European Union. Eur J Pharm Biopharm. 2018 Oct;131:8-24. 18. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzyl alcohol and benzoic acid group used as excipients [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/benzyl- alcohol-benzoic-acid-group-used-excipients-report-published-s upport-questions-answers-benzyl/chmp/508188/2013-t_en.pdf 19. EMA. Excipients labelling [Internet]. Questions and answers on benzyl alcohol used as an excipient in medicinal products for human use. Adopted [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific- guideline/questions-answers-benzyl-alcohol-used-excipient-me dicinal-products-human-use_en.pdf 20. DeStefano F, Monk Bodenstab H, Offit PA. Principal Controversies in Vaccine Safety in the United States. Clin Infect Dis. 2019 Aug 1;69(4):726-31. 21. Pollard AJ, Bijker EM. A guide to vaccinology: from basic principles to new developments. Nat Rev Immunol. 2021 Feb;21(2):83-100. 22. NIJZ [Internet]. Tiomersal in cepiva [datum dostopa 2021 May 6]. Dostopno na: https://www.nijz.si/sites/www.nijz.si/files/uploaded/tiomersal_in _cepiva.pdf 23. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzalkonium chloride used as an excipient [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/benzalkoniu m-chloride-used-excipient-report-published-support-questions- answers-benzalkonium_en.pdf 24. Baudouin C, Labbé A, Liang H, Pauly A, Brignole-Baudouin F. Preservatives in eyedrops: the good, the bad and the ugly. Prog Retin Eye Res. 2010 Jul;29(4):312-34. 25. Steven DW, Alaghband P , Lim KS. Preservatives in glaucoma medication. Br J Ophthalmol. 2018 Nov;102(11):1497-1503. 26. Walsh K, Jones L. The use of preservatives in dry eye drops. Clin Ophthalmol. 2019 Aug 1;13:1409-25. 27. Rolando M, Crider JY, Kahook MY. Ophthalmic preservatives: focus on polyquaternium-1. Expert Opin Drug Deliv. 2011 Nov;8(11):1425-38. 28. EMEA/622721/2009 [Internet]. EMEA public statement on antimicrobial preservatives in ophthalmic preparations for human use [cited 2021 April 28]. Available from: http://www.techtran.co.jp/reportd/emea091208.pdf 29. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzalkonium Chloride. Adopted questions and answers [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific- guideline/questions-answers-benzalkonium-chloride-used-excip ient-medicinal-products-human-use_en.pdf 30. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzoic acid and benzoates. Adopted questions and answers (Q&A). [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific- guideline/questions-answers-benzoic-acid-benzoates-used-exci pients-medicinal-products-human-use_en.pdf 31. EMA [Internet]. Reflection paper on the use of methyl- and propylparaben as excipients in human medicinal products for oral use [updated 2015 October 22; cited 2021 May 7]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific- guideline/reflection-paper-use-methyl-propylparaben-excipients -human-medicinal-products-oral-use_en.pdf 32. European Commission [Internet]. Call for data on ingredients with potential endocrine-disrupting properties used in cosmetic products [updated 2021 February 15; cited 2021 May 10]. Available from: https://ec.europa.eu/growth/content/call-data- ingredients-potential-endocrine-disrupting-properties-used-cos metic-products-0_en 33. European Comission. SCCS [Internet]. OPINION ON Propylparaben (PP) [updated 2021 March 30-31; cited 2021 May 5]. Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/default/files/scientific_committ ees/consumer_safety/docs/sccs_o_243.pdf 34. European Comission. SCCS [Internet]. The SCCS notes of guidance for the testing of cosmetic ingredients and their safetyevaluation11th revision [updated 2021 March 30-31; cited 2021 May 5]. Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/default/files/scientific_committ ees/consumer_safety/docs/sccs_o_250.pdf 35. EUR-Lex [Internet]. UREDBA KOMISIJE (EU) št. 1130/2011 z dne 11. novembra 2011 o spremembah Priloge III k Uredbi (ES) št. 1333/2008 Evropskega parlamenta in Sveta o aditivih za živila z vzpostavitvijo seznama Unije aditivov za živila, odobrenih za uporabo v aditivih za živila, encimih za živila, aromah za živila in hranilih [cited 2021 May 3]. Available from: https://eur- lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/?uri=CELEX%3A32011R11 30 36. EMA [Internet]. Preservatives. Are they safe? [update 2010 May; cited 2021 April 28]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/presentation/prese ntation-preservatives-are-they-safe_en.pdf 37. EuPfu [Internet]. STEP Database [update 2017 September 19; cited 2021 May 4]. available from: https://step- db.ucl.ac.uk/eupfi/appDirectLink.do?appFlag=login 38. van Riet-Nales DA, Schobben AFAM, Vromans H, Egberts TCG, Rademaker CMA. Safe and effective pharmacotherapy in infants and preschool children: importance of formulation aspects. Arch Dis Child. 2016 Jul;101(7):662-9. 39. Thabet Y, Klingmann V, Breitkreutz J. Drug Formulations: Standards and Novel Strategies for Drug Administration in Pediatrics. J Clin Pharmacol. 2018 Oct;58 Suppl 10:26-35.