Acta agriculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005                                             str. 187 - 197
Agrovoc Descriptors: salmonella, listeria monocytogenes, food safety, microbiological analysis, analytical methods, culture media
Agris Category Codes: Q03
COBISS koda 1.01
Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij rodu Salmonella in vrste Listeria monocytogenes v živilih
Sonja SMOLE MOŽINA1, Anže LENČEK2, Barbara JERŠEK3
Delo je prispelo: 3. oktobra 2005; sprejeto: 11. oktobra 2005 Received: October 3, 2005; accepted: October 11, 2005
IZVLEČEK
Salmoneloza in listerioza sta alimentarni infekciji zato so hitre in zanesljive metode določanja bakterij rodu Salmonella in vrste Listeria monocytogenes pogoj za zagotavljanje varne hrane. Metode na osnovi PCR imajo teoretične prednosti v primerjavi s tradicionalnimi mikrobiološkimi metodami, vendar morajo biti pred rutinsko uporabo ustrezno vrednotene. V prispevku je predstavljeno vrednotenje metode PCR za sočasno določitev bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih kot primer validacije alternativne kvalitativne metode glede na referenčne metode. Ustrezna izvedba metode PCR je hitrejša od standardnih mikrobioloških metod, ima enako relativno točnost, relativno občutljivost in relativno specifičnost ter pomeni dobro osnovo za nadaljnje medlaboratorijsko vrednotenje.
Ključne besede:     Varnost živil, kvalitativne mikrobiološke metode, vrednotenje, PCR, gojišče UPB, Salmonella, Listeria monocytogenes
ABSTRACT
EVALUATION OF PCR METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF Salmonella and
Listeria monocytogenes IN FOODS
Salmonelosis and listeriosis are foodborne illnesses and therefore the rapid and accurate detection of Salmonella and Listeria monocytogenes are important for food safety assurance. PCR-based methods offer theoretically many advantages over traditional microbiological methods but they should be evaluated prior implementation in routine testing. The evaluation of PCR method for simultaneous detection of Salmonella and L. monocytogenes in foods is presented as an example of validation of an alternative qualitative method against the reference   methods.   Appropriate   procedure   of   PCR   method   is   faster   than   standard
1    Izr. prof. dr., Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za živilstvo, Jamnikarjeva 101, 1111 Ljubljana, Slovenija
2    Univ.  dipl.  ing.  živ.  tehnol.,  Univ.  v  Ljubljani,  Biotehniška  fak., Odd.  za živilstvo, Jamnikarjeva 101, 1111 Ljubljana, Slovenija
3    Doc. dr., Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za živilstvo, Jamnikarjeva 101, 1111 Ljubljana, Slovenija
Acta ag 188               riculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005
microbiological methods, it has the same relative accuracy, relative sensitivity and relative specificity and means good basis for further interlaboratoy validation.
Keywords:    Food safety, qualitative microbiological methods, evaluation, PCR, UPB medium, Salmonella, Listeria monocytogenes
1 UVOD
Salmoneloza in listerioza sta bolezni, ki sta lahko posledici uživanja živil, kontaminiranih z bakterijami rodu Salmonella oziroma vrste Listeria monocytogenes. Salmonele so najpogostejši povzročitelj bakterijskih črevesnih obolenj pri nas (v letu 2004 je bila incidenca salmoneloze 169 primerov na 100.000 prebivalcev) (Hočevar Grom in sod., 2005). Tudi po svetu je salmoneloza med najpogostejšimi z živili prenosljivimi obolenji (na primer v ZDA je bila incidenca v letu 2004 14,7 primerov na 100.000 prebivalcev) (Preliminary .., 2005). Humana listerioza je sicer redka bolezen (incidenca v letu 2004 v ZDA 2,7 primerov na 1.000.000 prebivalcev), a je smrtnost zelo velika, med 20 in 60 % (Vazquez-Boland in sod., 2001). Zato je zelo pomembno zgodnje in zanesljivo določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih. Pogoj za to so hitre, specifične in občutljive detekcijske metode.
Klasične metode izolacije in identifikacije bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes vključujejo bolj ali manj selektivno primarno obogatitev, selektivno sekundarno obogatitev, izolacijo ter identifikacijo izolatov z morfološkimi, biokemijskimi in serološkimi testi (Andrews in sod., 2001; Beumer in Hazeleger, 2003). Te metode so delovno in materialno zahtevne, rezultati so znani šele v 3 - 7 dneh. Dolgotrajnost klasičnih metod določanja patogenih bakterij v živilih je glavni vzrok za razvoj novih, hitrejših metod.
Pri uvajanju alternativnih metod je pomembno, da poleg hitrejše izvedbe, visoke občutljivost in specifičnost metode upoštevamo še možnost avtomatizacije metode, neodvisnost izvedbe metode glede na vrsto živila, ceno, enostavno izvedbo, dostopnost potrebnih kemikalij ter možnost standardizacije metode (Mothershed in Whitney, 2005). Te zahteve teoretično dobro izpolnjujejo metode, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo (PCR).
Standard SIST EN ISO 16140:2003 (2003) določa splošna načela in tehnični postopek vrednotenja alternativnih metod mikrobiološke preiskave živil in živalske krme. Alternativno metodo definira z istim objektom preiskave kot pri referenčni metodi, znotraj določene kategorije oziroma skupine živil. Lahko pomeni izboljšavo le dela analitičnega postopka ali izboljšavo celotnega analitičnega postopka od odvzema oziroma priprave vzorcev do končnega vrednotenja rezultatov in poročila. Pri alternativni metodi je važen krajši čas preiskave, enostavnejša izvedba ali večje možnosti avtomatizacije. Izbrana referenčna metoda pa mora biti mednarodno priznana in splošno uporabna metoda, kar velja za metode po standardih ISO.
Postopek vrednotenja kvalitativnih in kvantitativnih alternativnih metod je dvostopenjski; Prvo stopnjo opravi en laboratorij, druga pa vključuje medlaboratorijsko testiranje.Vrednotenje kvalitativne alternativne metode mora biti
SMOLE MOŽINA, S. in sod.: Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij
189
izvedeno na različnih skupinah živil (na primer mesni izdelki, mlečni izdelki, izdelki iz sadja in zelenjave) in na različno obdelanih živilih (na primer surova živila, toplotno obdelana živila, zmrznjena živila). Izbira skupin in stopnje obdelave živil je odvisna od vrste bakterij, ki jih določamo z alternativno metodo. Za vrednotenje alternativne metode so najbolj primerni naravno kontaminirani vzorci živil. Uporabna so tudi umetno kontaminirana živila in referenčni vzorci živil, ki vsebujejo točno določeno koncentracijo iskanih bakterij. Alternativna in referenčna metoda morata biti izvedeni istočasno na istem vzorcu živila. Rezultati primerjanih metod služijo izračunu različnih parametrov, kot so relativna točnost, relativna občutljivost in relativna specifičnost alternativne metode, s katerimi opišemo in vrednotimo alternativno metodo glede na referenčno metodo.
Prispevek prikazuje primer prvostopenjskega vrednotenja alternativne mikrobiološke metode - kvalitativne metode PCR za sočasno določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih. Ovrednotili smo tri različne postopke metode PCR, kot referenčni metodi pa smo uporabili standardni mikrobiološki metodi določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih.
2 MATERIALI IN METODE
2.1 Bakterijski sevi in umetna kontaminacija živil
Za umetno kontaminacijo živil smo uporabili seva Salmonella Enteritidis ŽM 2 in Listeria monocytogenes ŽM 54 (Zbirka Laboratorija za živilsko mikrobiologijo, Oddelek za živilstvo, Biotehniška fakulteta), ki smo ju gojili 24 ur v bujonu BHI (Brain Heart Infusion, Biolife 401230, Italija) pri 37 oC. Čisti kulturi posameznega seva smo 10-kratno serijsko redčili s sterilno fiziološko raztopino in ju uporabili za umetno kontaminacijo živil.
Vsak vzorec živila smo razdelili na 6 delov (6 x 25 g), kot je prikazano na sliki 1. V treh delih vzorca živila smo določali naravno prisotne bakterije rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes in sicer: v prvem delu bakterije rodu Salmonella z metodo po standardu SIST EN ISO 6579:2003/AC:2004 (2004), v drugem delu bakterije vrste L. monocytogenes z metodo po standardu ISO 11290-1 (Anon., 2004) in v tretjem delu sočasno bakterije rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes z metodo PCR. Naslednjim trem delom vzorca živila smo dodali hkrati oba seva bakterij S. Enteritidis ŽM 2 in L. monocytogenes ŽM 54 znanih koncentracij (od 10 do 1000 cfu / 25 g). Posamezne dele umetno kontaminiranega vzorca živila smo nato preiskali z enakimi metodami kot naravno kontaminirane dele vzorca živila (slika 1).
2.2 Živila
V raziskavo smo vključili živila iz različnih skupin: meso in mesni izdelki (mleto svinjsko in goveje meso, n = 2), perutninsko meso (piščančje meso, n=4), mleko in mlečni izdelki (kravje mleko, n = 2, kozje mleko, n = 2), jajca (n = 2) ter sadje, zelenjava oziroma sadno-zelenjavni izdelki (n = 6). Skupno smo preiskali 18 naravno kontaminiranih in 18 umetno kontaminiranih vzorcev živil.
2.3 Postopek sočasnega določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes s PCR v živilih
Postopek sočasnega določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes s PCR v živilih je vseboval naslednje faze (slika 2):
-       homogenizacija živila (25 g) v gojišču UPB (Universal Preenrichment Broth, Becton Dickinson Microbiology Systems 223510, ZDA) (225 ml),
-       24-urna inkubacija in 48-urna inkubacija obogatitvene suspenzije UPB pri 37 oC,
-       priprava bakterijskega lizata iz obogatitvene suspenzije UPB po 24- in 48-urni inkubaciji UPB z alkalno lizo bakterijskih celic (Herman, 1997; Trkov in Jeršek, 2001),
Acta ag 190               riculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005
•J3
.a s
m cd
o
cd
N
'S
U
tac o
S
o g,
O
>
>N
bfl <n CN
(N
M
*-9	
d   en	
(L)  .-h	
n3	
	
.3 -c	
•r1   U	
>   tn	l>3
iN   L	K
>       .	^
w 03	bo
Ö  ._.	0
of	¦S
	^s
N    O	t?
> S cd   cd	mono
:^^>	
inac cijo	
B  E « -s	
¦t;  d	
d   u	
O   u	
* 8	
^	
CN
d ¦1—1	nes
'ff-S	cytoge PCR
3 IM	
Q -is ."3	0  t«
	K
CO	S
	S?      ^
	^    *—1    /----^
	C     '    "*
	aj 0 0
	b0<3>i   O
cf	ocyto 0 112 on., 2
loč	
0 Q	mon (IS< (An
.s	s?
<t>	K
ločanj onella L.	cytoge PCR
X  S ,0	O      CO
	K
&n	S
	S           ^v
	
	e   ¦  <*
	u 0 0
	bo* 0
H	O CN   CN
	
loči	&"    d' 2 0    0
0	g 03  d
tt	i^
	O Ü ^
Dločanje	onella EN IS 003/A (2004)
	Ihflj
0	s«i*o
	MHt^O
	03  10  CN
	^-^VO
U		tT	
"St		O	
fflO«!	ISO	C:20	
,a	Z	<	¦t
^j	w	rn	O
tu	f-	0 0	O CN
c3	03	CN	
>U	03	On	
O	^-^	l>	
O		VI	
Q		^O	
cd
cd o
1
O .0
S
g
C/3
fc
SMOLE MOŽINA, S. in sod.: Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij
191
- mPCR (multipli PCR) (Jeršek in Smole, 2003) in nPCR (zaporedni PCR). Zaporedni PCR smo izvedli tako, da smo kot tarčno DNK v novi encimski reakciji uporabili pomnožke mPCR in mešanico za PCR, ki ni vsebovala oligonukleotidnih začetnikov ST11/ ST15 za določanje bakterij rodu Salmonella.
Primerjali smo tri postopke (A, B, C) metode PCR (slika 2): pri postopku A smo mPCR in nPCR izvedli po 24-urni inkubaciji UPB, pri postopku B pa po 48-urni inkubaciji UPB. Po 24-urni inkubaciji UPB smo izvedli tudi izolacijo listerij iz obogatitvene suspenzije UPB na selektivno gojišče ALOA (Biolife 4016052, Italija) in izolacijo salmonel na selektivno gojišče XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar, Biolife 402206, Italija). Gojišči ALOA in XLD smo inkubirali 24 ur pri 37 oC. Za izvedbo PCR (PCRKOL) smo uporabili lizate iz za bakterije rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes značilnih kolonij, zraslih na gojiščih ALOA in XLD (postopek C, slika 2).
ŽIVILO (25 g) + UPB (225 ml)						
		i				
		INKUBACIJA 24 ur, 37 oC				
						
r			i	'	l	
mPCR			INKUBACIJA 24 ur, 37 oC		IZOLACIJA na ALOA in XLD	
i			i		i	
nPCR			mPCR		INKUBACIJA 24 ur, 37 oC	
			 4		C	l
			B nPCR			PCRKOL
A
Slika 2 :   Določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes z metodo PCR
(postopki A, B in C) Legenda: mPCR: multipli PCR, nPCR: zaporedni PCR, PCRKOL: PCR iz značilnih kolonij
bakterij rodu Salmonella, zraslih na gojišču XLD in značilnih kolonij bakterij L.
monocytogenes, zraslih na gojišču ALOA
Figure 2: Detection of Salmonella and L. monocytogenes strains with PCR (flowcharts A, B
and C) Legend:   mPCR: multiplex PCR, nPCR: nested PCR, PCRKOL: PCR was performed from
typical Salmonella and L. monocytogenes colonies on XLD and ALOA plates
2.3.1 Reagenti in izvedba PCR
PCR smo izvedli v 50 µl mešanici, sestavljeni iz 5 µl lizata bakterijskih celic in 45 µl reakcijske mešanice za PCR. Sestava reakcijskih mešanic za različne PCR je predstavljena v tabeli 1. Za določanje bakterij vrste L. monocytogenes smo uporabili par specifičnih oligonukleotidnih začetnikov LM1/LM2 (Border in sod., 1990), za določanje bakterij rodu Salmonella pa par specifičnih oligonukleotidnih začetnikov ST11/ST15 (Aabo in sod., 1993).
Acta ag 192               riculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005
Tabela 1: Sestavine reakcijskih mešanic za različne PCR Table 1:   Components of reaction mixtures for different PCR
Količina sestavine v različnih PCR mPCR                          nPCR                         PCRKOL
10 µl                             10 µl                            10 µl
Sestavina
Pufer PCR 10x
(Promega 338, ZDA)
0,2 mM vsakega         0,2 mM vsakega        0,2 mM vsakega
dNTP (Promega 303)
dNTP                           dNTP                           dNTP
MgCl2 (Promega A351B)                 2 mM                            2 mM                           2 mM
LM1/LM2 (38-3271-2/34MWG Biotech AG)
100 pmol                       50 pmol                      100 pmol
ST11/ST15 (38-3271-2/34MWG Biotech AG) Tween 20 (Merck 1.09280, Nemčija)
3,125 pmol                           0                          3,125 pmol
2 % (ut.)                       2 % (ut.)                      2 % (ut.)
Taq DNApolimeraza (Promega M1661)
2,5 U                            2,5 U                          1,25 U
Legenda: mPCR: multipli PCR, nPCR: zaporedni PCR, PCRKOL: PCR iz značilnih kolonij bakterij rodu Salmonella, zraslih na gojišču XLD in značilnih kolonij bakterij L. monocytogenes, zraslih na gojišču ALOA; LM1/LM2: par oligonukleotidnih začetnikov za določanje bakterij vrste L. monocytogenes, ST11/ST15: par oligonukleotidnih začetnikov za določanje bakterij rodu Salmonella
Legend: mPCR: multiplex PCR, nPCR: nested PCR, PCRKOL: PCR was performed from typical Salmonella and L. monocytogenes colonies, grown on XLD and ALOA plates, LM1/LM2: primers for detection of L. monocytogenes, ST11/ST15: primers for detection of Salmonella
Encimska reakcija pomnoževanja DNK bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes je potekala po shemi: 5 minutna začetna denaturacija DNK pri 95 oC, sledilo je 30 ciklov (15 sekundna denaturacija DNK, 15 sekundno prileganje oligonukleotidnih začetnikov pri 59 oC, 30 sekundno podaljševanje pri 72 oC) in pet minutno zaključno podaljševanje pri 72 oC. Vse reakcije smo izvedli na cikličnem termostatu Gene Amp DNA Thermal Cycler 2400 (Perkin-Elmer, ZDA).
2.3.2 Dokazovanje pomnožkov in interpretacija rezultatov
Pomnožke smo dokazovali z gelsko elektroforezo v 1,5 % agaroznem gelu (Seakem ME, FMC Bioproducts 50014, ZDA) v pufru TAE 0,5x (pH 8,1) (Tris, ocetna kislina, Na2EDTA) pri 14 V/cm. Kot velikostni standard smo uporabili molekularni označevalec dolžin DNK – 100 bp (100 bp DNA Ladder, Gibco BRL 15628-019, ZDA). Po elektroforezi smo gel 10 minut barvali v raztopini EtBr (1 µg/ml), opazovali pod UV transiluminatorjem in ga računalniško dokumentirali. Kot pozitiven rezultat PCR za določitev bakterij rodu Salmonella smo določili reakcijo s 429 bp velikim pomnožkom, kot pozitiven rezultat za določitev bakterij vrste L. monocytogenes pa reakcijo s 701 bp velikim pomnožkom.
2.4 Določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih s standardnima metodama
Bakterije rodu Salmonella smo v vzorcih živil določali v skladu s standardom SIST EN ISO 6579:2003/AC:2004 (2004), bakterije vrste L. monocytogenes pa v skladu s standardom ISO 11290-1 (Anon., 2004). Obe metodi zajemata primarno in sekundarno selektivno obogatitev živila, izolacijo iskanih bakterij na selektivnih trdnih gojiščih ter vrsto biokemijskih testov za potrditev rodu oziroma vrste. Namesto serološke identifikacije smo izolate potrdili s PCR s specifičnim parom oligonukleotidnih začetnikov (PCRKOL).
SMOLE MOŽINA, S. in sod.: Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij
193
2.5 Vrednotenje metode PCR
Za vrednotenje postopka sočasnega določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih z metodo PCR smo primerjali rezultate preiskav 36 vzorcev živil, ki so bili istočasno kot z metodo PCR (točka 2.3) kot alternativno metodo preiskani tudi s standardnima referenčnima metodama (točka 2.4). Ker smo metodo PCR izvedli s postopki A, B in C, smo izračunali relativno točnost, relativno specifičnost in relativno občutljivost za vsak postopek posebej, kot to predpisuje standard SIST EN ISO 16140:2003 (2003).
Relativna točnost je stopnja skladnosti rezultatov alternativne in referenčne metode za iste
vzorce.
Relativna točnost = ((PU + NU) / N) x 100 [%]
PU: pozitivno ujemanje: je število pozitivnih rezultatov, dobljenih z alternativno in referenčno
metodo,
NU: negativno ujemanje: je število negativnih rezultatov, dobljenih z alternativno in referenčno
metodo,
N: skupno število preiskanih vzorcev.
Relativna občutljivost je zmožnost alternativne metode določiti bakterije, ko so bile le-te
določene z referenčno metodo.
Relativna občutljivost = (PU / N+) x 100 [%]
PU: pozitivno ujemanje: je število pozitivnih rezultatov, dobljenih z alternativno in referenčno
metodo,
N+: število pozitivnih vzorcev, dobljenih z referenčno metodo.
Relativna specifičnost je zmožnost alternativne metode, da ne določi bakterij, ko le-te niso
bile določene z referenčno metodo.
Relativna specifičnost = (NU / N-) x 100 [%]
NU: negativno ujemanje: je število negativnih rezultatov, dobljenih z alternativno in referenčno
metodo,
N-: število negativnih vzorcev, dobljenih z referenčno metodo.
3 REZULTATI IN RAZPRAVA
Namen našega dela je bil vrednotiti metodo PCR za sočasno določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih glede na standardni mikrobiološki metodi (SIST EN ISO 6579:2003/AC:2004 (2004); ISO 11290-1 (Anon., 2004)). Metodo PCR smo uporabili v postopkih A, B in C, za katere smo izračunali relativno točnost, relativno občutljivost in relativno specifičnost izvedbe. Kot zahteva standard SIST EN ISO 16140:2003 (2003) so bili vzorci živil izbrani iz različnih skupin živil (rdeče meso, perutninsko meso, mleko, jajca, sadje in zelenjava) in kontaminirani z različnimi koncentracijami salmonel in listerij (10-1000 cfu/ 25g).
V primerih, ko smo bakterije določali po obogatitvah živil v gojišču UPB (postopek A in B), je bila najšibkejši člen določitev bakterij vrste L. monocytogenes. Kar v 12-ih oziroma 16-ih vzorcih smo jih določili samo z referenčno metodo (tabela 2: Postopek A in B, negativni odklon pri L. monocytogenes).
Acta ag 194               riculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005
Tabela 2: Rezultati sočasnega določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih z metodo PCR s postopki A, B in C, glede na rezultate referenčnih metod
Table 2: Results of simultaneous PCR detection of Salmonella and L. monocytogenes in foods and results of Salmonella and L. monocytogenes detection obtained by reference methods
Stopnja PCR
Rezultati (PCR / ISO)
Število vzorcev / določanje bakterij        PU           NU          NO          PO
(+/+)        (-/-)        (-/+)        (+/-)
36 / L. monocytogenes                               4             16           12            0
Stopnja A      36 / Salmonella                                        13            16            3             0
36 / L. monocytogenes in Salmonella          4             16           12            0
Rezultati (PCR / ISO)
Število vzorcev / določanje bakterij          PU           NU          NO          PO
Stopnja B
Stopnja C
(+/+)         (-/-)         (-/+)        (+/-)
32 / L. monocytogenes                               0             16           16            0
32 / Salmonella                                        12            16            4             0
32 / L. monocytogenes in Salmonella          0             16           16            0
Rezultati (PCR / ISO)
Število vzorcev / določanje bakterij          PU           NU          NO          PO
(+/+)         (-/-)         (-/+)        (+/-)
36 / L. monocytogenes                              18            18            0             0
36 / Salmonella                                        18            18            0             0
36 / L. monocytogenes in Salmonella        36            36            0             0
Legenda: PU: pozitivno ujemanje: št. pozitivnih rezultatov, dobljenih s PCR in s standardno metodo, NU: negativno ujemanje: št. negativnih rezultatov, dobljenih s PCR in s standardno metodo, NO: negativni odklon: št. negativnih rezultatov dobljenih s PCR v primerih, ko so bili rezultati standardne metode pozitivni, PO: št. pozitivnih rezultatov, dobljenih s PCR v primerih, ko so bili rezultati standardne metode negativni, A: PCR po 24-urni inkubaciji obogatitvenega gojišča UPB, B: PCR po 48-urni inkubaciji obogatitvenega gojišča UPB; C: PCR iz značilnih kolonij, zraslih na gojiščih ALOA in XLD
Legend: PU: positive agreement: no. of positive results obtained with PCR and standard methods, NU: negative agreement: no. of negative results obtained with PCR and standard methods, NO: negative deviation: no. of negative results obtained with PCR when results of standard method were positive, PO: positive deviation: no. of positive results obtained with PCR when results of standard method were negative, A: PCR after 24-h incubation of UPB, B: PCR after 48-h incubation of UPB, C: PCR performed from typical Salmonella and L. monocytogenes colonies on XLD and ALOA plates
Rezultati kažejo, da je 24-urna inkubacija obogatitvenega gojišča UPB bolj primerna od 48-urne obogatitve, saj sta bili relativna točnost in občutljivost metode PCR boljši po krajšem času inkubacije (slika 3). Eden od vzrokov za slabe rezultate metode PCR po 48-urni inkubaciji gojišča UPB je slabša rast listerij ob prisotnosti salmonel, ki so se že med prvo 24-urno obogatitvijo namnožile do višje koncentracije kot listerije (Bailey in Cox, 1992).
SMOLE MOŽINA, S. in sod.: Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij
195
100 80 60 % 40 20 0	100                             100            100  100 100									
							¦			Postopek A Postopek B Postopek C
	62,5						1			
							I			
		1		25			1			
		I		^^M   0			I			
	Relativna           Relativna občutljivost          Relativna točnost                                                      specifičnost									
Slika 3 :  Vrednotenje različnih postopkov metode PCR za sočasno določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih
Figure 3: Evaluation of different flowcharts of simultaneous PCR detection of Salmonella and L. monocytogenes in foods
Iz vrednotenja metode PCR glede na določanje listerij in salmonel po 24-urni inkubaciji gojišča UPB (postopek A) je razvidno, kateri del alternativne metode zahteva dodatne raziskave – povečati bi morali občutljivost PCR za določitev bakterij vrste L. monocytogenes v gojišču UPB (slika 4). Rezultati določanja bakterij rodu Salmonella z metodo PCR (relativna točnost 90,63 %) so primerljivi z literaturnimi podatki (relativna točnost 97,3 % (Malorny in sod., 2003) in 93,42 % (Rijpens in sod., 1999)).
Slika 4 :  Vrednotenje metode PCR (postopek A) glede na določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih
Figure 4: Evaluation of PCR procedure A for detection of Salmonella and L. monocytogenes in foods
Visoka relativna specifičnost (100 %) metode PCR v vseh postopkih ne glede na vrsto določitve potrjuje, da metoda ne daje lažno pozitivnih rezultatov. To kaže na ustrezno izbiro oligonukleotidnih začetnikov za specifično določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes.
Acta ag 196               riculturae Slovenica, 85 - 2, november 2005
Popolnoma identične rezultate standardnima metodama določanja bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes smo dobili z metodo PCR za sočasno določanje bakterij rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes v živilih s postopkom C, ki je vključeval 24-urno inkubacijo gojišča UPB, izolacijo bakterij na gojišča XLD in ALOA ter PCRKOL iz za bakterije rodu Salmonella in vrste L. monocytogenes značilnih kolonij. Ti rezultati so obetavni, saj smo skrajšali čas preiskave živil, količino dela in materiala, ob tem pa ohranili 100 % relativno točnost, občutljivost in specifičnost metode (slika 3). Vrednotenje tega dela eksperimenta po standardu SIST EN ISO 16140:2003 (2003) je pokazalo ujemanje vrednotene alternativne metode PCR z referenčnima metodama. Pridobili smo osnovo za drugi del vrednotenja metode PCR, ki obsega vzporedno medlaboratorijsko preiskavo živil.
Rezultati so v skladu z nedavnimi objavami (Mothershed in Whitney, 2005), ki navajajo, da alternativne metode na osnovi PCR ob ustrezni postavitvi in izvedbi postopka, omogočajo izboljšavo klasičnih mikrobioloških metod
4 ZAHVALA
Raziskavo je omogočilo Ministrstvo za šolstvo, znanost in šport ter Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano s financiranjem projektov L4-2275, L4-3188 in V4-0466-01.
5 LITERATURA
Aabo S., Rasmussen O. F., Rossen L., Sorensen P. D., Olsen J. E. 1993. Salmonella identification by the polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes 7: 171-178.
Anonymous. ISO 11290-1. 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1, Detection method. Amandment 1, Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data: 13 p.
Andrews W. H., Flowers R. S., Siliker J., Bailey J. S. 2001. Salmonella. V: Compendium of methods for microbiological examination of foods. 4th ed. Downes F. P., Ito K. (eds.). Washington, American Public Health Association, Inc.: 357-380.
Bailey J. S., Cox N. A. 1999. Universal Preenrichment Broth for the Simultaneous Detection of Salmonella and Listeria in Foods. Journal of Food Protection 55,4: 256–259.
Beumer R. R., Hazeleger W. C. 2003. L. monocytogenes: diagnostic problems. FEMS Immunology and Medical Microbiology 35: 191-197.
Border P. M., Howard J. J., Plastow G. S., Siggens K. W. 1990. Detection of Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction. Letters in Applied Microbiology 11: 158-162.
Herman L. 1997. Detection of viable and dead Listeria monocytogenes by PCR. Food Microbiology 14: 103-110.
Hočevar Grom A., Grgič Vitek M., Klavs I., Pahor L. 2005. Spremljanje gibanja nalezljivih bolezni. V: Zdravstveni statistični letopis, Slovenija 2004. Moravec Berger D., Pribaković Brinovec R., Ulrih Lazar T., Kujundžič B. (ur.). Ljubljana, Inštitut za varovanje zdravja RS: 74-80.
SMOLE MOŽINA, S. in sod.: Vrednotenje metode PCR za sočasno določanje bakterij …197
Jeršek B., Smole Možina S. 2003. Sočasno določanje prisotnosti bakterij rodu Salmonella in vrste Listeria monocytogenes z metodo PCR. V: 1. Interdisciplinarni simpozij »DDD, zdravje in okolje« z mednarodno udeležbo. Dobeic M., Vudrag M., Berger T. (ur.). Ljubljana, Zavod za zdravstveno varstvo Ljubljana: 187-193.
Malorny B., Tassios P. T., Radström P., Cook N., Wagner M., Hoorfar J. 2003.
Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens. International Journal of Food Microbiology 89: 241-249.
Mothershed E., Whitney A. M. 2005. Nucleic acid-based methods for the detection of bacterial pathogens: Present and future considerations for the clinical laboratory. Clinica Chimica Acta (Article in press, available on line at www.sciencedirect.com)
Olsen, J. E. 2000. DNA-based methods for detection of food-borne bacterial pathogens. Food Research International 33: 257-266.
Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food -10 Sites, United States, 2004. 2005. MMWR 54(14);352-356. (21.9.2005: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5414a2.htm)
Rijpens N., Herman L., Vereecken F., Jannes G., de Smedt J., de Zutter L. 1999. Rapid detection of stressed Salmonella spp. in dairy and egg products using immunomagnetic separation and PCR. International Journal of Food Microbiology 46, 1: 37-44.
SIST EN ISO 16140:2003. 2003. Mikrobiologija živil in krme: protokol za validacijo alternativnih metod. Ljubljana, Slovenski inštitut za standardizacijo: 78 str.
SIST EN ISO 6579:2003/AC:2004. 2004. Mikrobiologija živil in krme – Horizontalna metoda za ugotavljanje prisotnosti Salmonella spp. Ljubljana, Slovenski inštitut za standardizacijo: 6 str.
Trkov M., Jeršek B. 2001. The effect of different rapid methods for isolation of Salmonella genomic DNA on PCR sensitivity. Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo, 77: 27-37.
Vazquez-Boland J. A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T., Domínguez-Bernal G., Goebel W., González-Zorn B., Wehland J., Kreft J. 2001. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews 14, 3: 584-640.