C:\Users\stvarnikma.VF\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.Outlook\UL52KUU4\UL-Veterinarska-fakulteta800px.jpg UDK 636.4.09:616.36-002:578.835:57.083.2:57.088.7:616-036.22:575.86(043.3) Petra Raspor Lainšcek, dr. vet. med. RAZŠIRJENOST OKUŽBE Z VIRUSOM HEPATITISA E PRI PRAŠICIH OB ZAKOLU Doktorska disertacija PREVALENCE OF HEPATITIS E VIRUS INFECTION IN PIGS AT SLAUGHTER Doctoral dissertation Ljubljana, 2022 Petra Raspor Lainšcek Razširjenost okužbe z virusom hepatitisa E pri prašicih ob zakolu Delo je bilo opravljeno na Inštitutu za varno hrano, krmo in okolje (Enota za varno hrano), na Inštitutu za mikrobiologijo in parazitologijo Veterinarske fakultete v Ljubljani, v klavnicah v Celju (Celjske mesnine, d. o. o.), Šentjurju (Farme Ihan-MPR, d. o. o.), Kamniku (Meso Kamnik, d. d.) in Gornji Radgoni (Panvita MIR, d. d.). Javni zagovor je bil opravljen: _________________________ Mentor: prof. dr. Andrej Kirbiš Somentor: izr. prof. dr. Ivan Toplak Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identicen tiskanemu. Clani strokovne komisije za oceno in zagovor: Predsednica: izr. prof. dr. Ksenija Šinigoj Gacnik (VF) Clan: prof. dr. Tadej Malovrh (VF) Clan: prof. dr. Mario Poljak (MF) Ni pomembno, kako pocasi greš, važno je, da se ne ustaviš. Konfucij IZVLECEK Kljucne besede: Bolezni prašicev – virologija; zoonoze; hepatitis E – epidemiologija; hepatitis E virus – diagnostika – genetika; filogenija; blato – virologija; jetra – virologija; mesni izdelki – virologija; verižna reakcija s polimerazo – metode; encimsko vezani imunosorbentni test – metode; analiza zaporedja DNA; RNA, virusna – analize; prašici Naša raziskava sovpada s porastom zanimanja za »novo porajajoco se« bolezen virusa hepatitisa E (HEV) v svetu in prinaša nove izsledke o razširjenosti okužbe v slovenskih rejah prašicev. Ker gre za zoonozo, smo z raziskavo želeli ugotoviti, kakšno je stanje v slovenskih klavnicah in ali hepatitis E virus ogroža zdravje ljudi. Vzorcenje prašicev je potekalo v štirih klavnicah po Sloveniji med junijem in septembrom 2014. Vzorce blata, jeter in žolca smo odvzeli 811 klinicno zdravim prašicem razlicnih starostnih kategorij. Ob vzorcenju v klavnici smo jemali tudi brise površin na klavni liniji, vzorcili mleto meso in pecenice. Z metodo RT-PCR v realnem casu smo dokazovali prisotnost nukleinske kisline HEV v odvzetih vzorcih. Istim prašicem smo odvzeli tudi vzorec krvi in dolocali prisotnosti protiteles IgG proti HEV. Najvec HEV pozitivnih živali smo ugotovili med 322 odojki, in sicer 17 %. Med 400 pitanci smo ugotovili en pozitiven vzorec jeter in en pozitiven vzorec žolca, kar je bistveno manj, kot smo pricakovali. Med 89 plemenskimi svinjami nismo ugotovili pozitivne živali. Med 63 brisi površin smo odkrili dva pozitivna vzorca. V vzorcih pecenic in mletega mesa prisotnosti HEV nismo ugotovili. Z genetsko tipizacijo 45 HEV pozitivnih vzorcev in filogenetsko primerjavo nukleotidnih zaporedij slovenskih sevov skupaj z zaporedji sevov HEV, ki so dostopni v podatkovni zbirki GenBank, smo ugotovili pojav velike genetske raznolikosti med vzorci ter prisotnost štirih razlicnih podtipov genotipa 3 (3a, 3b, 3e in 3f) HEV v Sloveniji. V izvedeni študiji genotipa 4 nismo ugotovili. V dolocanje nukleotidnega zaporedja smo vkljucili tudi pet humanih vzorcev, pozitivnih na prisotnost HEV. Zaradi premajhne kolicine virusne RNA v HEV pozitivnih humanih vzorcih nam pri nobenem ni uspelo dolociti nukleotidnega zaporedja. Z dvema komercialnima encimskoimunskima testoma (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom) smo pregledali vzorce krvi domacih prašicev na prisotnost protiteles IgG proti HEV. Pregledali smo 351 vzorcev, nakljucno izbranih iz vzorcev odvzetih na celotnem obmocju Slovenije v okviru rednega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014, ter 359 vzorcev, odvzetih v klavnici ob zakolu leta 2014. Primerjava rezultatov obeh testov je pokazala, da je encimskoimunski test proizvajalca Axiom ustreznejši za presejalna testiranja. Za razjasnitev 38 rezultatov, ki se pri vzorcih iz klavnice pri obeh encimskoimunskih testih niso ujemali, smo uporabili modificiran humani imunoblot test recomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen diagnostik). Izvedena raziskava je prva tovrstna študija, ki dokazuje prisotnost HEV pri prašicih na klavni liniji v Sloveniji, prav tako je prva izvedena sistematicna raziskava v tako širokem obsegu v Sloveniji. Rezultati raziskave prispevajo k boljšemu razumevanju stanja okužb prašicev s HEV ob vstopu na klavno linijo, in podajajo natancnejšo sliko o stanju prekuženosti prašicev v rejah. Glede na številcnost pregledanih vzorcev in razpršenost rej po državi, iz katerih so izhajali vzorceni prašici, lahko z gotovostjo trdimo, da rezultati podajajo natancen podatek o razširjenosti okužb s HEV med domacimi prašici v Sloveniji. ABSTRACT Key words: Swine diseases – virology; zoonoses; hepatitis E – epidemiology; hepatitis E virus – diagnosis –genetics; phylogeny; feces – virology; liver – virology; meat products – virology; polymerase chain reaction – methods; encyme-linked immunosorbent assy test – methods; sequence analysis DNA; RNA, viral – analysis; swine Our research coincides with increasing interest in the newly emerging zoonosis, the hepatitis E virus, and provides new information regarding infection distribution in Slovenian pig herds. Since HEV is a zoonosis, our goal was to investigate the existing condition in Slovenian slaughterhouses and to assess associated health risks posed to consumers and personnel. Sampling of pigs was conducted in four Slovenian slaughterhouses, between June and September 2014. Feces, liver and bile samples were collected from 811 healthy pigs (different age categories). At the time of slaughter, swab samples of different surfaces and samples of minced meat and sausages were also taken. All samples were analyzed with real time PCR (RT-PCR) for the presence of HEV. Blood samples taken from the same pigs were analyzed for the presence of IgG HEV antibodies. The highest number of HEV positive animals was found in the 3 month old age group of pigs (322 animals), where 17% of animals were HEV positive. In the age group of 6 month old pigs (400 animals), only one liver sample and one bile sample was positive, which was significantly less than we would have expected. Out of 89 pigs that were older than 1 year, none was HEV positive. Out of 63 surface swabs, two were positive for the presence of HEV. None of the minced meat and sausage samples was positive. A phylogenetic tree, generated combining sequences obtained from Slovenian strains (45 positive samples) and nucleotide sequences of HEV strains derived from GeneBank, revealed high genetic variability between samples, allowing classification of the identified Slovenian strains into four different subtypes of genotype 3 (3a, 3b, 3e and 3f). Genotype 4 was not found. Additionally, five HEV positive human samples were sequenced, although sequencing was unsuccessful due to an insufficient amount of viral RNA. With two commercial ELISA (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species (IDvet) and HEV-IgG ELISA porcine (Axiom)) we analyzed blood samples from domestic pigs for the presence of IgG HEV antibodies. We analyzed 351 randomly selected serum samples collected from pigs located in different parts of Slovenia (these samples were collected within the scope of annual monitoring of infectious diseases in 2013 and 2014) and 359 samples collected from pigs at slaughter in 2014. Comparison of results from both ELISA showed that Axiom ELISA is more suitable as a screening method. A human immunoblot test was optimized and standardized to test 38 serum samples that showed discrepancies in results obtained with Axion and IDvet ELISA kits. The work presented herein represents the first systematic, wide scope analysis on the presence of HEV in pigs at slaughter in Slovenia. Results of the research have contributed to a better understanding of pig HEV infection status at slaughter and have shown a more detailed picture of seroprevalence status in pig farming. Since our research included a great number of samples and dispersion of different farms around the country, we can safely say that the obtained results show accurate information about pig HEV infections in Slovenia. KAZALO VSEBINE IZVLECEK .............................................................................................................................................4 ABSTRACT ............................................................................................................................................5 1 UVOD .................................................................................................................................................16 1.1 Namen raziskave ............................................................................................................ 17 1.2 Hipoteze ......................................................................................................................... 18 2 PREGLED LITERATURE ..............................................................................................................19 2.1 Prvi pojavi izbruhov HEV pri ljudeh in prašicih ........................................................... 19 2.2 Lastnosti virusa .............................................................................................................. 20 2.2.1 Taksonomska uvrstitev ..........................................................................................................20 2.2.2 Zgradba HEV ........................................................................................................................22 2.2.3 Razmnoževanje HEV v celicah .............................................................................................23 2.2.4 Ohranjanje kužnosti virusa na razlicni temperaturi ...............................................................23 2.3 Nacin prenosa virusa in pojavljanje po svetu ................................................................ 25 2.3.1 Osnovne razlike med HEV iz genotipov 1, 2, 3 in 4 .............................................................25 2.3.2 Nacini prenosa HEV genotipov 3 in 4 na cloveka ................................................................27 2.3.3 Pojavnost okužb s HEV po svetu ..........................................................................................29 2.4 Klinicna slika pri ljudeh ................................................................................................. 31 2.4.1 Akutni hepatitis .....................................................................................................................31 2.4.2 Kronicni hepatitis ..................................................................................................................31 2.4.3 Ekstrahepaticni zapleti okužbe s HEV ..................................................................................32 2.5 HEV kot zoonoza ........................................................................................................... 33 2.5.1 Rezervoarji virusa HEV ........................................................................................................33 2.5.2 Potek okužbe in razvoj bolezni pri prašicih ..........................................................................33 2.5.3 Kriticne tocke za prenos virusa .............................................................................................35 2.6 Laboratorijska diagnostika HEV ................................................................................... 37 2.6.1 ELISA ...................................................................................................................................38 2.6.2 Reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) ter verižna reakcija s polimerazo v realnem casu .............................................................................................................39 3 MATERIALI IN METODE .............................................................................................................41 3.1 Vzorcenje ....................................................................................................................... 41 3.1.1 Vzorci blata, jeter, žolca in krvi ter nacin odvzema vzorcev ................................................44 3.1.2 Vzorci brisov površin in nacin odvzema vzorcev .................................................................47 3.1.3 Vzorci mletega mesa in pecenic ter nacin odvzema vzorcev ................................................49 3.2 Metode ........................................................................................................................... 53 3.2.1 ELISA ...................................................................................................................................53 3.2.2 Metoda imunoblot (IB) ..........................................................................................................55 3.2.3 Dokazovanje HEV z molekularnimi metodami ....................................................................57 3.2.4 Statisticne metode .................................................................................................................64 4 REZULTATI .....................................................................................................................................65 4.1 Dokaz prisotnosti protiteles proti HEV ......................................................................... 65 4.1.1 Nakljucno izbrani serumski vzorci domacih prašicev s celotnega obmocja Slovenije (monitoring) ...................................................................................................................................65 4.1.2 Serumski vzorci odvzeti pri prašicih ob zakolu v klavnici ....................................................71 4.1.3 Analiza serološko pozitivnih rezultatov v razlicnih starostnih obdobjih prašicev ................77 4.1.4 Dokaz specificnih protiteles proti HEV z metodo imunoblot ...............................................79 4.1.5 Dolocitev diagnosticne obcutljivosti in specificnosti ............................................................82 4.2 Rezultati dolocanja prisotnosti nukleinske kisline HEV z metodo RT-PCR v realnem casu ...................................................................................................................................... 83 4.2.1 Analiza pozitivnih vzorcev na HEV po starostnih skupinah prašicev ...................................86 4.2.2 Analiza prisotnosti HEV v rejah, iz katerih so izvirali vzorceni prašici ...............................86 4.3 Dolocanje nukleotidnega zaporedija pozitivnih vzorcev HEV v regijah ORF 1 in ORF 2 ........................................................................................................................................... 88 4.3.1 Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij v regijah ORF 1 in ORF 2...............................88 5 RAZPRAVA ......................................................................................................................................94 6 SKLEPI ............................................................................................................................................108 7 POVZETEK .....................................................................................................................................110 8 SUMMARY .....................................................................................................................................112 9 ZAHVALE .......................................................................................................................................114 10 LITERATURA ..............................................................................................................................116 11 PRILOGE ......................................................................................................................................126 KAZALO SLIK Slika 1: Taksonomska razdelitev družine Hepeviridae (z rdeco so obrobljeni genotipi HEV, ki lahko povzrocijo okužbo pri cloveku). ..................................................................................... 21 Figure 1: Taxonomy of the family Hepeviridae (genotypes that are able to infect human are circled in red). ...................................................................................................................... 21 Slika 2: Sestava genoma HEV (Kamar in sod., 2017).............................................................. 22 Figure 2: HEV genome structure (Kamar et al., 2017). ....................................................... 22 Slika 3: Nacini prenosa okužbe s HEV, ki so uvršceni v genotipa 3 in 4 (rdece pušcice - dokazani nacin prenosa, crne pušcice - mocan sum, da je prišlo do prenosa, in crtkane pušcice - potencialni nacin prenosa) (Dalton in sod., 2008). ................................................................ 26 Figure 3: Transmission routes of HEV infection for genotype 3 and 4 (red lines-confirmed routes, black lines-strong evidence and broken lines- potential routes) (Dalton et al., 2008). ............................................................................................................................................. 26 Slika 4: Geografski prikaz pojavljanja sevov HEV iz genotipov 1, 2, 3 in 4 po svetu (Treagus in sod., 2021). ........................................................................................................................... 30 Figure 4: Global geographical distribution of HEV strains from genotypes 1, 2, 3 and 4 (Treagus et al., 2021). .......................................................................................................... 30 Slika 5: Odvzem vzorca blata iz kolona prašicev v klavnici. ................................................... 45 Figure 5: Sampling of feces from porcine colon at the slaughterhouse. .............................. 45 Slika 6: Odvzem vzorca žolca iz žolcnika prašicev v klavnici................................................. 45 Figure 6: Sampling of bile from porcine gall bladder at the slaughterhouse. ...................... 45 Slika 7: Odvzem vzorca jeter prašicev po odstranitvi žolcnika................................................ 46 Figure 7: Sampling of porcine liver after removal of the gall bladder. ............................... 46 Slika 8: Kavelj, na katerem so obešeni notranji organi (pljuca, srce in jetra) prašicev po eksenteraciji. ............................................................................................................................. 47 Figure 8: Metal hook holding pigs' internal organs (lungs, heart and liver) after exenteration. ......................................................................................................................... 47 Slika 9: Kovinski zabojniki, v katere shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu. .. 48 Figure 9: Metal containers where porcine livers are stored after veterinary inspection. ..... 48 Slika 10: Kavlji, na katere obešajo trupe prašicev v hladilnici. ............................................... 48 Figure 10: Metal hooks holding pigs carcases in the cooling room. ................................... 48 Slika 11: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma ), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz monitoringa kužnih bolezni prašicev).................................................................................................................................... 66 Figure 11: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from monitoring of infectious pig diseases). ........................................................................................................................ 66 Slika 12: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih do šest mesecev, skupno pregledanih 25 živali. .............................. 68 Figure 12: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs up to 6 months old, altogether 25 animals tested. ................................................................................................ 68 Slika 13: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih od šest do dvanajst mesecev, skupno pregledanih 74 živali. ........... 69 Figure 13: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs from 6 to 12 months old, altogether 74 animals tested. ................................................................................................ 69 Slika 14: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih nad dvanajst mesecev, skupno pregledanih 189 živali. ................... 70 Figure 14: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs older than 12 months, altogether 189 animals tested. .............................................................................................. 70 Slika 15: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in neopredeljivih rezultatov (neopredeljivi z obema encimskoimunskima testoma) ter rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz klavnice). .................................. 72 Figure 15: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA), doubtful results (doubtful with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from the slaughterhouse). ......................................................................... 72 Slika 16: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starih tri mesece, skupno pregledanih 66 živali. ...................................... 74 Figure 16: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in 3 months old pigs, altogether 66 animals tested. ................................................................................................................. 74 Slika 17: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starih šest mesecev, skupno pregledanih 165 živali. ................................ 75 Figure 17: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in 6 months old pigs, altogether 165 animals tested. ............................................................................................................... 75 Slika 18: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starejših od dvanajst mesecev, skupno pregledanih 40 živali. ................. 76 Figure 18: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs older than 12 months, altogether 40 animals tested. ................................................................................................ 76 Slika 19: Primerjava deleža pozitivnih rezultatov nakljucno izbranih serumskih vzorcev prašicev (vzorci iz monitoringa) v razlicnih starostnih obdobjih. ............................................ 77 Figure 19: Comparisson of positive results percentage from randomly chosen swine serum samples at different ages. ..................................................................................................... 77 Slika 20: Primerjava deleža pozitivnih rezultatov serumskih vzorcev prašicev (vzorci iz klavnice) v razlicnih starostnih obdobjih.................................................................................. 78 Figure 20: Comparisson of positive results percentage from swine serum samples (samples taken at the slaughterhouse) at different ages. ..................................................................... 78 Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 1 (366 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .. ............................................................................................................................................... 90 Figure 21: Phylogenetic tree, ORF 1 (366 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .. ............................................................................... 90 Slika 22: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 2 (300 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .. ............................................................................................................................................... 92 Figure 22: Phylogenetic tree, ORF 2 (300 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .. ............................................................................... 92 Slika 23: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 2 (300 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .; slovenski in italijanski vzorci oznaceni s (SLO) in (IT) (Steyer in sod., 2011; de Sabato in sod., 2018). ............................................................................................................................... 93 Figure 23: Phylogenetic tree, ORF 2 (300 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .; Slovenian and Italian samples are labelled with (SLO) and (IT) (Steyer in sod., 2011; de Sabato in sod., 2018). ........................................ 93 KAZALO TABEL Tabela 1: Razporeditev rej po statisticnih regijah Slovenije, število rej po krajih (mesto/vas) in število prašicev pri katerih smo odvzeli vzorce pri posamezni starostni kategoriji (vzorcenje v klavnicah). ................................................................................................................................ 42 Table 1: Distribution of farms by statistical regions of Slovenia, number of farms per town and number of sampled pigs from different age groups (sampling in slaughterhouses). .... 42 Tabela 2: Razporeditev rej po statisticnih regijah Slovenije, število rej po krajih (mesto/vas) (izbrani serumski vzorci iz nabora vzorcev letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014). ................................................................................................................... 50 Table 2: Distribution of farms by statistical regions of Slovenia, number of farms per town (serum samples picked out of samples collected as a part of annual monitoring of infectious pig diseases during year 2013 and 2014). ........................................................... 50 Tabela 3: Nukleotidna zaporedja oligonukleotidnih zacetnikov regij ORF 1 in ORF 2 in velikost pomnoženega produkta. .............................................................................................. 60 Table 3: Nucleotide sequence for amplification of ORF1 and ORF 2 and amplicon size. . 60 Tabela 4: Nukleotidna zaporedja oligonukleotidnih zacetnikov in sond. ................................ 62 Table 4: Oligonucleotide and probe sequences. .................................................................. 62 Tabela 5: Rezultati opravljenih seroloških preiskav s testom ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom pri 351 nakljucno izbranih vzorcih iz monitoringa kužnih bolezni prašicev. ....................................... 65 Table 5: Test results from both ELISA (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species IDvet in HEV-IgG ELISA porcine Axiom) for 351 randomly chosen samples from monitoring of infectious pig diseases. ................................................................................. 65 Tabela 6: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (serumski vzorci iz monitoringa kužnih bolezni prašicev). ...................................................................................................................... 67 Table 6: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (sera samples from monitoring of infectious pig diseases). ....................................................................................................... 67 Tabela 7: Rezultati opravljenih seroloških preiskav s testoma ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom pri 271 vzorcih iz klavnice. ................................................................................................................... 71 Table 7: Test results from both ELISA (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species IDvet in HEV-IgG ELISA porcine Axiom) for 271 samples collected at slaughter. .......... 71 Tabela 8: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma), neopredeljivih rezultatov (sumljivi z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz klavnice). .............................................. 73 Table 8: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA), doubtful results (doubtful with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from the slaughterhouse). ......................................................................... 73 Tabela 9: Rezultati primerjave treh metod (encimskoimunski test proizvajalcev IDvet in Axiom ter metoda imunoblot) na 17 vzorcih............................................................................ 79 Table 9: Results for 17 samples, comparison of three methods ( ELISA IDvet, ELISA Axiom and immunoblot method). ........................................................................................ 79 Tabela 10: Rezultati primerjave treh metod (encimskoimunski test proizvajalcev IDvet in Axiom ter metoda imunoblot) za 43 vzorcev. .......................................................................... 81 Table 10: Results for 43 samples, comparison of three methods ( ELISA IDvet, ELISA Axiom and immunoblot method). ........................................................................................ 81 Tabela 11: Rezultati preiskav 57 HEV pozitivnih prašicev (rezultati metod RT-qPCR in ELISA/imunoblot). ................................................................................................................... 84 Table 11: 57 HEV positive animals (RT-qPCR and ELISA/immunoblot results). ............. 84 Tabela 12: Podatki o HEV pozitivnih rejah odojkov (razpored po rejah od I do XI): datum vzorcenja odojkov ob prihodu v klavnico, število vzorcenih odojkov in število pozitivnih odojkov na prisotnost HEV. ..................................................................................................... 87 Table 12: Information about HEV positive farms housing 3 month old pigs (farms from number I to XI).: sampling date of 3 month old pigs at slaughter, number of sampled pigs and number od HEV positive pigs. ...................................................................................... 87 SEZNAM KRATIC IN OKRAJŠAV Bp bazni par (ang. base pair) Ct (ang. cycle threshold) DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) dNTP deoksinukleotid (ang. deoxynucleotide triphosphate) EFSA Evropska agencija za varnost hrane ( ang. European Food Safety Authority) ELISA encimskoimunski test (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) GE ekvivalent genoma (ang. genome equivalent) HEV hepatitis E virus HIV virus humane imunske pomankljivosti (ang. human immunodeficiency virus) IB imunoblot (ang. immunoblot) i.v. intravenozno Kb kilobaza; 1000 baznih parov (ang. kilobase) Nt nukleotid (ang. nucleotide) ORF 1 odprt bralni okvir 1 (ang. Open Reading Frame 1) ORF 2 odprt bralni okvir 2 (ang. Open Reading Frame 2) ORF 3 odprt bralni okvir 3 (ang. Open Reading Frame 3) p.o. per os/peroralno PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. Polymerase Chain Reaction) PRRS prašicji reproduktivni in respiratorni sindrom (ang. porcine reproductive and respiratory syndrome) RNA ribonukleinska kislina (ang. ribonucleic acid) RT-PCR reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo RT-qPCR reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo v realnem casu SPF prost specificnih patogenov (ang. specific pathogen free) WHO svetovna zdravstvena organizacija (ang. World Health Organisation) 1 UVOD Hepatitis E je zoonoza, ki jo povzroca virus hepatitisa E (HEV) iz družine Hepeviridae. Trenutno je znanih osem genotipov in 36 podtipov (Smith in sod., 2020). Virusi genotipov 1 in 2 povzrocajo okužbo cloveka in se pojavljajo v manj razvitih državah sveta za katere je znacilen fekalno-oralen prenos HEV med ljudmi. Virusi genotipov 3 in 4 povzrocajo okužbo tako ljudi kot živali, glavni rezervoar virusa predstavljajo domaci in divji prašici, kljub temu da so virus in protitelesa proti HEV dokazali že pri številnih drugih živalskih vrstah (Scobie in Dalton, 2013; Pavio in sod., 2010; Kenney, 2019). Nacinov prenosa HEV genotipov 3 in 4 je vec, najvec raziskav pa se usmerja v prenos s toplotno neobdelanim oziroma premalo obdelanim svinjskim mesom/jetri in izdelki iz svinjskega mesa (Treagus in sod., 2021). S prvim pojavom humane okužbe s HEV v Združenih državah Amerike, je postalo jasno, da ta virus ni vec samo težava nerazvitih držav, temvec da gre za svetovno grožnjo (Kwo in sod., 1997). Mnoge razvite države so zacele zbirati podatke o prekuženosti prašicev na farmah, nekatere so se usmerile predvsem v dokazovanje akutnih okužb z viremijo pri prašicih ob zakolu. Posebna težava pri tej bolezni je, da prašici, okuženi s HEV, ne kažejo nobenih klinicnih znakov bolezni in lahko v casu viremije nemoteno vstopajo v klavnico (Widén, 2016). Virusno RNA dokazujemo z metodo reverzne transkripcije in verižne reakcije s polimerazo (RT-PCR) v realnem casu. Ta metoda je uporabna pri prepoznavanju akutnih okužb pri prašicih. Za nedvoumen dokaz infektivnosti virusa bi potrebovali standardiziran postopek izolacije virusa na celicni kulturi, ki pa žal še vedno ni na voljo. Protitelesa proti virusu dokazujemo z encimskoimunskim testom (ELISA), vendar nam ti rezultati dajo podatek samo o tem, da je bil imunski sistem gostitelja v stiku z virusom HEV, ne pa tudi, ali je gostitelj v fazi izlocanja virusa v okolje. Okužba pri cloveku vecinoma poteka asimptomatsko, lahko pa okužba s HEV privede do hujših zapletov, kot so težave s strjevanjem krvi, zlatenica, hepaticna encefalopatija, ascites, kar lahko vodi v odpoved jeter in smrt (Xin in Xiao, 2016). 1.1 Namen raziskave Namen našega dela je bil izvesti prvo celovito raziskavo o stanju okužb prašicev s HEV v slovenskih klavnicah, ki bi vkljucevala vecje število živali razlicnih starostnih kategorij, vec vrst vzorcev vsake posamezne živali in vecje število rej. Vsaki živali bi odvzeli vzorce blata, jeter in žolca ter z metodo RT-PCR v realnem casu tako ugotovili, kolikšen odstotek prašicev predstavlja potencialni vir okužbe za cloveka, ce v vzorcih dokažemo nukleinsko kislino HEV. Izbrali smo 45 RT-PCR pozitivnih vzorcev, pri katerih smo s sekvenciranjem dveh odsekov virusnega genoma analizirali nukleotidno zaporedje naših, slovenskih sevov in jih primerjali s sevi v podatkovni bazi GenBank. Tako smo ugotovili, kateri genotipi krožijo v rejah s slovenskimi prašici in ali so v sorodu s sevi, ki se pojavljajo v drugih evropskih državah. Za primerjavo humanih in prašicjih sevov HEV smo pridobili tudi humane virusne izolate. Približno polovici prašicev, katerih vzorce blata, jeter in žolca smo odvzeli, smo vzeli tudi vzorce krvi. Serume smo pregledali z dvema encimskoimunskima testoma (ELISA) za ugotavljanje protiteles proti HEV pri prašicih, ki sta bila v casu naše raziskave dostopna na trgu. Na podlagi primerjave rezultatov smo dolocili, kateri encimskoimunski test je primernejši za rutinsko diagnostiko, kot potrditveni test pa smo v laboratoriju uvedli metodo imunoblot. Za razjasnitev, ali obstaja potencialna možnost za okužbo ljudi z izdelki iz svinjskega mesa, smo vzorcili tudi mleto meso in pecenice ter jih testirali z metodo RT-PCR v realnem casu za dokaz prisotnosti RNA HEV. 1.2 Hipoteze V raziskavi smo postavili naslednje hipoteze: 1. Dva komercialna testa ELISA za dokazovanje protiteles proti HEV v serumu prašicev dajeta primerljive rezultate. 2. Nukleinska kislina HEV je prisotna v razlicnih vzorcih na klavni liniji ob zakolu prašicev. 3. Virusi HEV v Sloveniji spadajo v genotip 3 in 4, isti sevi se pojavljajo pri prašicih in cloveku. 2 PREGLED LITERATURE 2.1 Prvi pojavi izbruhov HEV pri ljudeh in prašicih Prvi dokumentirani izbruh epidemije HEV je bil opisan med letoma 1955 in 1956 v New Delhiju v Indiji. Do izbruha je prišlo zaradi fekalnega onesnaženja pitne vode, okužilo se je 29.000 ljudi. Kot vzrok epidemije so takrat navedli virus hepatitisa A, a so retrospektivno, z analiziranjem shranjene plazme okuženih ljudi, ugotovili, da gre za nov virus, ki so ga poimenovali entericno prenesen ne-A, ne-B virus (Kumar in sod., 2013). Podobni izbruhi so se kasneje pojavili še v Nepalu, Burmi, Pakistanu, Mehiki in na Kitajskem. Na mednarodnem srecanju v Tokiu leta 1989 so virus poimenovali hepatitis E virus (Wang in sod., 2016). S crko »E« so ga oznacili zaradi njegovih lastnosti: entericen, epidemicen, endemicen (Kumar in sod., 2013). Do zacetka 90. let prejšnjega stoletja je veljalo, da je hepatitis E bolezen držav v razvoju, do katere prihaja zaradi slabih sanitarnih razmer, ki botrujejo k hitremu širjenju okužbe s fekalno onesnaženo vodo. Ko so se obcasno zaceli pojavljati tudi prvi primeri okužb ljudi v razvitih državah, je veljalo prepricanje, da so se ljudje okužili na potovanjih v nerazvite dele sveta ali s stikom s temi ljudmi. Vendar so kmalu ugotovili, da do okužb prihaja tudi pri ljudeh, ki niso potovali v države, kjer je HEV endemicno prisoten. Prvi konkretnejši dokazi, da se je HEV razširil tudi v druge države in da gre za avtohtone okužbe, so se pojavili leta 1993 med raziskovanjem primerov obolelih za hepatitisom E v Italiji in na Nizozemskem (Zanetti in sod., 2019; Zaaijer in sod., 1993) ter kasneje leta 1995 v Grciji (Psichogiou in sod., 1995). Podrobneje so te in nekatere druge primere iz Združenih držav Amerike obravnavali leta 1998, ko so sekvencirali dele genoma in ugotovili, da se filogenetsko razlikujejo od preostalih do tedaj poznanih sevov in tvorijo nove genotipe (Schlauder in sod., 1999). Leta 1995 so v Nepalu v vzorcih seruma in blata prašicev dokazali prisotnost HEV (Park in sod., 2016). Leta 1997 so odkrili pojav hepatitisa E tudi pri prašicih v ZDA. Ugotovili so nov genotip HEV, katerega nukleotidno zaporedje se je v visokem odstotku ujemalo s tistimi, ki so jih ugotovili pri okužbah ljudi iz ZDA. Tako je bilo leto 1997/98 za HEV prelomno, saj so s tem potrdili zoonoticni potencial HEV (Nan in sod., 2017). 2.2 Lastnosti virusa 2.2.1 Taksonomska uvrstitev Zaradi velikosti viriona, morfoloških lastnosti in koeficienta sedimentacije virusnih delcev se je HEV pred letom 2000 uvršcal v družino Caliciviridae. Med letoma 2000 in 2004 so ga iz družine Caliciviridae umaknili in ga prenesli med »neuvršcene« viruse. Leta 2004 so ga uvrstili v družino Hepeviridae, ta pa se je delila v razlicne genotipe in podtipe. Z leti, ko je prihajalo do odkritij novih sevov pri vse vec živalskih vrstah, takšna razdelitev ni bila vec najprimernejša. Zato so leta 2014 predlagali reklasifikacijo in v družino Hepeviridae uvrstili roda Orthohepevirus in Piscihepevirus. V rod Ortohepevirus so razvršcene vrste od Orthohepevirus A do D, v rod Piscihepevirus je razvršcena le ena vrsta, Piscihepevirus A (Wang in sod., 2016) (Slika 1). Trenutno je znanih osem genotipov HEV, ki spadajo v Ortohepevirus A (Treagus in sod., 2021). HEV, ki so uvršceni v genotipa 1 in 2, imajo med seboj 76% identicnost nukleotidnega zaporedja in povzrocajo okužbo pri ljudeh. HEV iz genotipa 1 delimo v sedem podtipov (1a–1g), sevi podtipa 1a–1f imajo od 88,53- do 94,05% identicnost nukleotidnega zaporedja. HEV, ki spadajo v genotip 2, delimo v dva podtipa (2a in 2b). Ugotovljeni sevi HEV, ki spadajo v genotip 3, so v genski banki najštevilcnejši. Vecina dostopnih nukleotidnih zaporedij HEV 3 izhaja od domacih prašicev, divjih prašicev in ljudi. Znanih je 13 podtipov (3a–3m). Podtipi 3a–3j imajo od 78,74- do 82,46% identicnost nukleotidnega zaporedja. Podtip 3ra se pojavlja pri zajcih. Sevi HEV, uvršceni v genotip 4, se razvršcajo v 9 podtipov (4a–4i), z drugimi genotipi pa si delijo od 71,79- do 77,38% identicnost nukleotidnega zaporedja. Genotipa 5 in 6 si delita vec kot 78% nukleotidnega zaporedja, z drugimi genotipi pa od 71,58- do 77,38%. Genotip 7 si z drugimi genotipi deli od 72,55- do 76,13% nukleotidnega zaporedja. Leta 2020 je bil prvim sedmim genotipom dodan še genotip 8. Vrsta Ortohepevirus B ima z drugimi vrstami od 51,47- do 55,05% identicnost nukleotidnega zaporedja, Ortohepevirus C od 51,68- do 60,57%, Ortohepevirus D pa od 52,8- do 56,06% (Doceul in sod., 2016; Smith in sod., 2020). Iz vrste Orthohepevirus A lahko okužbo pri cloveku povzrocijo sevi HEV, ki so uvršceni v genotipe 1, 2, 3, 4 in genotip 7. Razlika med njimi je v tem, da so HEV, uvršceni v genotipa 1 in 2, ugotovljeni le pri cloveku, sevi genotipov 3, 4 in 7 pa lahko okužijo tako cloveka kot nekatere vrste živali, zato imajo zoonoticni potencial. Do zdaj znani živalski gostitelji HEV iz genotipa 3 so: domaci in divji prašici, opice, zajci, podgane, podlasice, mungi, ovce, koze, delfini, konji in jastrebi. Gostitelji HEV iz genotipa 4 pa so: domaci in divji prašici, opice, skakaci, psi, medvedi, leopardi, krave, koze, jelenjad, žerjavi in fazani. Genotip 5 so do sedaj odkrili pri opicah in prašicih, genotip 6 pri prašicih, genotip 7 in 8 pa pri kamelah (Treagus in sod., 2021). Orthohepevirus B so ugotovili pri kokoših, Orthohepevirus C pri podganah, dihurjih in kunah, Orthohepevirus D pa pri netopirjih (Doceul in sod., 2016). Slika 1: Taksonomska razdelitev družine Hepeviridae (z rdeco so obrobljeni genotipi HEV, ki lahko povzrocijo okužbo pri cloveku). Figure 1: Taxonomy of the family Hepeviridae (genotypes that are able to infect human are circled in red). 2.2.2 Zgradba HEV HEV je majhen virus, genom predstavlja 7,2 kb dolga enojnovijacna pozitivno polarna molekula RNA. V žolcu in blatu ga najdemo brez ovojnice, v krvi pa je obdan z lipidno membrano (Donnely in sod., 2017). Sestavljen je iz 5' nekodirajoce regije, treh odprtih bralnih okvirjev in 3' nekodirajoce regije (Slika 2). Prvi celoten genom je dolocil Tam s sodelavci leta 1991 (Khuro in sod., 2016). Dodatni cetrti odprti bralni okvir so odkrili le pri genotipu 1, njegova funkcija pa za zdaj ni znana (Nan in sod., 2017). Slika 2: Sestava genoma HEV (Kamar in sod., 2017). Figure 2: HEV genome structure (Kamar et al., 2017). Odprt bralni okvir 1 (ORF 1) je dolg 5082 baz, postavljen na 5' koncu genoma HEV in kodira nestrukturne proteine. Funkcionalna domena tega poliproteina je sestavljena iz encima (metiltransferaza in domena Y, ki tvorita kapo RNA), papainu podobne cisteinske proteaze, hipervariabilne regije, makro domene (domena X), helikaze RNA in od RNA odvisne polimeraze RNA. Sumi se, da ORF 1 kodira in doloca patogene lastnosti virusa, saj se pri razlicnih potekih bolezni na tem delu genoma pojavljajo razlicne mutacije (Zhou in sod., 2016). Genotipsko specificne razlike v hipervariabilni regiji kažejo, da ta regija doloca vrstni tropizem HEV in njegovo prilagajanje gostitelju (Nan in sod., 2017). Odprt bralni okvir 2 (ORF 2) je dolg 1983 baz in kodira kapsidni protein, ki ima vlogo pri sestavljanju virusa, inkapsulaciji genoma, stabilizaciji kapsidnih delcev, infekciji in imunskem odzivu gostitelja in je velik del viriona. Študije nakazujejo tudi, da ima ORF 2 pomembno vlogo pri vezavi in vstopu v celico (Donnelly in sod., 2017). Genetska primerjava zaporedij regije ORF 2 je pokazala vec kot 85 % podobnost med genotipi 1–4. Odprti bralni okvir 3 (ORF 3) se delno prekriva z ORF 2 in kodira poseben protein, katerega funkcije še niso popolnoma pojasnjene. Domneva se, da vpliva na odziv gostiteljske celice, tako da ga ta ne prepozna kot sovražnika in vzdržuje preživetje virusa. ORF 2 je nujno potreben za okužbo in vivo in sodeluje pri sprošcanju virionov iz celice. Leta 2017 so odkrili, da so kljucne strukturne lastnosti tega proteina enake kot pri viroporinih in da deluje kot ionski kanal, ki je nujno potreben pri sprošcanju virusnih delcev iz celice (Zhou in sod., 2016). 2.2.3 Razmnoževanje HEV v celicah Razmnoževanje HEV zaradi pomanjkanja primerne celicne kulture, na kateri bi gojili virus HEV, še vedno ni povsem pojasnjeno. Virus v organizem najverjetneje vstopi skozi epitelne celice, se veže na površino hepatocitov prek heparin sulfat proteoglikanov in prek receptorjev vstopi v celico. Znotraj celice pride do slacenja virusa, sprošcanja RNA in prepisovanja nestrukturnih proteinov. Pozitivna RNA se prepiše v negativno s pomocjo od RNA odvisne polimeraze RNA. Negativna RNA postane predloga za 7,2 kb dolgo pozitivno RNA in 2,2 kb dolgo subgenomsko RNA. S pomocjo subgenomske RNA se tvorijo proteini regij ORF 2 in ORF 3. Proteini regije ORF 2 se z RNA sestavijo v virion, proteini regije ORF 3 pa optimizirajo razmnoževanje. Virioni izstopijo iz hepatocitov, obdani s proteini ORF 3 in lipidno plastjo, nato se locijo od viriona (Khuro in sod., 2016). 2.2.4 Ohranjanje kužnosti virusa na razlicni temperaturi Temperaturno stabilnost virusa je težko dolociti kljub številnim do zdaj izvedenim poskusom. Zaradi uporabe razlicnih metod, casa in temperature obdelave, materialov in seveda nacinov dokazovanja virusne RNA rezultati razlicnih poskusov niso popolnoma primerljivi. Dokazali so, da virus na sobni temperaturi ostane infektiven vec tednov. Inaktivacijo virusa povzroci segrevanje kužnega materiala pri 56 oC za 1 h. Toplotna obdelava virusa v albuminu pri 60 oC za 30 min je bila manj uspešna, saj so virusi, ki jih obdajajo tkiva oziroma hranilni matriksi, bolj zašciteni pred vplivom višje temperature. Pri poskusu z jetri, pozitivnimi na HEV, obdelanimi na razlicne nacine pri razlicni temperaturi in intravenozno inokuliranimi zdravim prašicem, so ugotovil naslednje: kuhanje v vreli vodi 5 min in cvrenje, s temperaturo v sredini tkiva 71 oC, pri prašicih ni povzrocilo okužbe, enaka obdelava jeter pri 56 oC za eno uro pa virusa ni unicila. Paštetam podobni pripravki, od 5 do 20 min obdelani s temperaturo od 62 do 71 oC, so povzrocili okužbo prašicev. Obdelava pri temperaturi 71 oC za 20 min je virus popolnoma inaktivirala. HEV je ostal kužen po obdelavi 62 oC/120 min, 68 oC/20 min, 71 oC/10 min (Cook in van der Poel, 2015). 2.3 Nacin prenosa virusa in pojavljanje po svetu Za HEV je znacilno, da se nacin prenosa in razvoj okužbe razlikujeta glede na genotip virusa. 2.3.1 Osnovne razlike med HEV iz genotipov 1, 2, 3 in 4 2.3.1.1 HEV, uvršceni v genotipa 1 in 2 HEV iz genotipov 1 in 2 se prenašajo po fekalno-oralni poti in povzrocajo okužbo pri ljudeh. Pojavljajo se v manj razvitih državah, kjer imajo težave s prenaseljenostjo, slabimi sanitarnimi razmerami in higieno, dodatno pa k izbruhom bolezni prispevajo še deževna obdobja (Azija, Bližnji vzhod, S in Z Afrika, Srednja Amerika). Virusi se izlocajo v okolje s fecesom klinicno ali subklinicno okuženih ljudi, kar ohranja okužbo v populaciji. Najveckrat do okužbe pride prek pitne vode, kontaminirane s fekalijami. Na ta nacin se okužba izredno hitro širi in povzroci epidemije z vec tisoc okuženimi ljudmi hkrati. Smrtnost je od 0,2 do 4 %. V redkih primerih lahko pride do vertikalnega prenosa okužbe iz matere na otroka, ta nacin okužbe je bil do zdaj dokazan samo pri HEV iz genotipa 1 (Donnelly in sod., 2017). Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) ocenjuje, da se vsako leto okuži 20 milijonov ljudi, od tega je približno 3,3 milijona okužb simptomatskih. Zoonotski prenos je malo verjeten, saj HEV iz genotipov 1 in 2 še nikoli niso ugotovili pri živalih, prav tako do okužbe prašicev ni prišlo pri eksperimentalnih poskusih (Nan in sod., 2017). 2.3.1.2 HEV, uvršceni v genotipa 3 in 4 HEV, ki spadajo v genotipa 3 in 4, se pojavljajo povsod po svetu, kjer redijo prašice. Znacilne so obcasne okužbe, pojavljajo pa se tako v razvitih kot nerazvitih državah. Epidemicni izbruhi niso dokumentirani, ker je za varno pitno vodo dobro poskrbljeno. Gre za zoonozo, glaven naravni rezervoar predstavljajo domaci prašici. Poznamo vec nacinov prenosa virusa kot pri genotipih 1 in 2 (Slika 3). Slika 3: Nacini prenosa okužbe s HEV, ki so uvršceni v genotipa 3 in 4 (rdece pušcice - dokazani nacin prenosa, crne pušcice - mocan sum, da je prišlo do prenosa, in crtkane pušcice - potencialni nacin prenosa) (Dalton in sod., 2008). Figure 3: Transmission routes of HEV infection for genotype 3 and 4 (red lines-confirmed routes, black lines-strong evidence and broken lines- potential routes) (Dalton et al., 2008). 2.3.2 Nacini prenosa HEV genotipov 3 in 4 na cloveka 2.3.2.1 Prenos s hrano Do okužbe s HEV iz genotipov 3 in 4 v razvitih državah v vecini primerov pride z uživanjem surovega ali premalo toplotno obdelanega svinjskega mesa, svinjskih jeter ali izdelkov iz svinjine. Prvi neposreden dokaz zoonoticnega prenosa HEV so dokumentirali leta 2003. Okužila se je skupina ljudi, ki so zboleli po uživanju surovega jelenjega mesa, jedi znacilne za Japonsko. V ostankih mesa so dokazali virusno RNA HEV, primerjali nukleotidna zaporedja vzorcev mesa in okuženih pacientov, in ugotovili popolno ujemanje (Tei in sod., 2003). Tej objavi so sledile še druge, kot je prenos HEV z mesom divjega prašica, pecenega na žaru, na Japonskem (Li in sod., 2005), svinjsko meso v Španiji (Riveiro-Barciela in sod., 2015) in okužba s klobaso figatellu na Korziki (Renou in sod., 2014). Obstaja še veliko drugih opisanih primerov okužbe s svinjskim mesom oziroma izdelki, vendar je pogosto težko potrditi izvor okužbe, saj je inkubacijska doba bolezni precej dolga, okužba je pogosto asimptomatska in redko imamo priložnost naknadno vzorciti izdelek, za katerega sumimo, da bi lahko bil vzrok za okužbo (Doceul in sod., 2016). Na Japonskem, v ZDA, Nemciji, na Nizozemskem, v Angliji, Italiji, Španiji in na Ceškem so v trgovinah vzorcili svinjska jetra za prodajo ter dokazali prisotnost RNA HEV (Geng in Wang, 2016). 2.3.2.2 Prenos s transfuzijo Okužba ljudi s HEV prek transfuzije krvi je mogoca. Seroprevalenca med krvodajalci v evropskih državah ima velik razpon, od 5 % na Irskem pa do 52 % v Franciji. Velike razlike so ugotovili tudi med razlicnimi regijami v istih državah. Tipicen primer je Francija, razlaga za ta pojav pa je najverjetneje v razlicnih prehranskih navadah in nekaterih tipicnih jedeh, ki so znacilne za posamezne dele države, na primer klobasa figatellu (Clemente-Casares in sod., 2016). Prevalenca virusne RNA HEV med krvodajalci znaša od 0,007 % do 0,03 %. Primere okužb prek transfuzije so že dokumentirali v Franciji, Angliji in na Japonskem (Geng in Wang, 2016). 2.3.2.3 Prenos z vodo Epidemiologi ugotavljajo, da virusi genotipov 3 in 4 v razvitih državah ne povzrocajo epidemij, saj je higienski standard bistveno višji kot v nerazvitem delu sveta. Vendar to ne pomeni, da prenos z vodo ni mogoc, saj odplake iz prašicjih farm lahko okužijo vodne vire. V Sloveniji je leta 2011 prve podatke objavil Steyer s sod. in ugotovil, da je 3,3 % vzorcev vode rek pozitivnih na virusno RNA HEV (Steyer in sod., 2011), znan pa je tudi primer iz ZDA in Italije (Doceul in sod., 2016). Ob vzorcenju reke Meuse, ki tece iz Francije, skozi Belgijo, do Nizozemske so potrdili 17 % pozitivnih vzorcev (Geng in Wang, 2016). Z eksperimentalnim poskusom so tudi že dokazali, da z odpadki s prašicjih farm lahko okužimo prašice (Kasorndorkbua in sod., 2004; Doceul in sod., 2016). Do okužbe lahko prihaja tudi z uživanjem sadja ali zelenjave, kadar se polja namakajo z vodo, ki je onesnažena z živalskimi odpadki. Virusno RNA so našli na jagodah v Kanadi ter v zamrznjenih malinah, solati in zelišcih v Evropi (Doceul in sod., 2016; Treagus in sod., 2021). Znani so tudi primeri okužbe z morskimi školjkami. Te namrec filtrirajo ogromne kolicine vode, v njih pa lahko pride do koncentriranja virusa, ce se v bližini iztekajo odpadki iz prašicjih farm, ki onesnažujejo vodo (Mesquita in sod., 2016; Crossan in sod., 2012; Song in sod., 2010; Li in sod., 2007; Gao in sod., 2015). HEV iz genotipa 3 so izolirali iz školjk na Japonskem, v Koreji, Italiji, Veliki Britaniji, na Finskem, v Grciji in Španiji (Geng in Wang, 2016; Yugo in sod., 2013). 2.3.2.4 Vertikalni prenos Kljub temu da trdnih dokazov o vertikalnem prenosu HEV genotipov 3 in 4 ni, je bil ta nacin prenosa s HEV genotipa 3 eksperimentalno dokazan pri kuncih, kar potrjuje možnost za vertikalni prenos (Geng in Wang, 2016). 2.3.2.5 Prenos s transplantacijo Okužba s HEV je mogoca tudi pri transplantaciji jeter oziroma drugih organov (Schlosser in sod., 2012; Geng in Wang, 2016). 2.3.2.6 Prenos z mlekom Evropska agencija za varnost hrane (EFSA) je po oceni strokovne skupine podala mnenje, da je mleko lahko potencialni vir okužbe s HEV, vendar v Evropi do zdaj še niso potrdili vzorca mleka, ki bi vseboval virusno RNA HEV. Mleko bi lahko bila težava v državah v razvoju, in sicer na manjših kmetijah, na katerih v tesnem stiku sobivajo razlicne živalske vrste (Ferri in Vergara, 2021). 2.3.3 Pojavnost okužb s HEV po svetu Okužbe s HEV se pojavljajo povsod po svetu (Slika 4). 2.3.3.1 Evropa V evropskih državah so za najvecji delež okužb s HEV pri prašicih odgovorni sevi, ki spadajo v genotip 3. Okužbe se med državami najpogosteje širijo z živimi prašici, ki ne kažejo znakov okužbe. Humane okužbe, ki jih ljudje prinesejo s potovanj, spadajo vecinoma v genotip 1. V zadnjih letih se je v Evropi zacel pojavljati tudi genotip 4. Leta 2008 so ga ugotovili pri pacientu iz Nemcije (Wichmann in sod., 2008), leta 2011 pri prašicih v Belgiji (Hakze-van der Honing in sod., 2011), v Franciji pa so potrdili dva primera okužbe z genotipom 4 s tradicionalno sušeno klobaso figatellu, ki vsebuje prašicja jetra (Colson in sod., 2012; Tessé in sod., 2012). Leta 2011 so pri obolelih v Italiji dokazali okužbo s HEV, ki spada v genotip 4 (Garbuglia in sod., 2011). Kljub temu da se v zadnjih letih tako pri ljudeh kot pri prašicih pojavljajo sevi HEV, ki spadajo v genotip 4, se v Evropi še vedno najveckrat odkrijejo sevi genotipa 3 (Geng in Wang, 2016a). 2.3.3.2 Azija V Indiji, Nepalu, Pakistanu in Bangladešu se v humanih izbruhih HEV vedno pojavlja genotip 1, so pa v vzorcih prašicev iz Indije našli tudi genotip 4. Na Kitajskem so do leta 2000 prevladovali sevi HEV iz genotipa 1, po tem obdobju pa prevladuje genotip 4. Prisoten je tudi genotip 3, za katerega sumijo, da je prišel iz Japonske. Genotipa 3 in 4 sta dominantna na Japonskem, v Južni Koreji in Singapurju, okužbe se pojavljajo obcasno. V Srednji Aziji se pojavljajo tako izbruhi kot tudi obcasni primeri genotipa 1 (Geng in Wang, 2016a). 2.3.3.3 Afrika Obstaja malo podatkov o okužbah s HEV v Afriki. V Srednjeafriški republiki, Sudanu, Cadu, Egiptu in Namibiji so dokazali prisotnost genotipa 1. V Zahodni Afriki, Nigeriji in Namibiji prevladujejo sevi HEV, ki se uvršcajo v genotip 2. Genotip 3 je zelo redek, do zdaj so ga potrdili le pri enem pacientu v Egiptu (Geng in Wang, 2016a). 2.3.3.4 Amerika V Ameriki prevladuje genotip 3, tako med ljudmi kot prašici. V Venezueli, Argentini, Braziliji, Urugvaju in Boliviji kroži genotip 3, medtem ko so na Kubi pri izbruhih in tudi med obcasnimi primeri izolirali genotip 1. Na Karibih so poleg genotipa 3 našli tudi genotip 1. V Mehiki so našli genotip 2 (Geng in Wang, 2016a). 2.3.3.5 Nova Zelandija in Avstralija Na Novi Zelandiji so izolirali genotip 3, iz Avstralije pa prihajajo podatki, da je avtohtonih okužb zelo malo, vecinoma gre za primere, povezane s potovanji (Geng in Wang, 2016a). Slika 4: Geografski prikaz pojavljanja sevov HEV iz genotipov 1, 2, 3 in 4 po svetu (Treagus in sod., 2021). Figure 4: Global geographical distribution of HEV strains from genotypes 1, 2, 3 and 4 (Treagus et al., 2021). 2.4 Klinicna slika pri ljudeh 2.4.1 Akutni hepatitis Okužba s HEV pri cloveku povzroca akutni hepatitis s smrtnostjo od 0,5 % do 3 %. Klinicna slika je pri okuženih podobna drugim virusnim hepatitisom. Epidemiološke študije kažejo, da se vecina okužb pojavi pri mlajši populaciji (15–45 let) (Park in sod., 2016). Inkubacijska doba traja od 2 do 8 tednov, znacilno je, da se najprej pojavijo nespecificni klinicni znaki, podobni prehladu. Po kratki prodormalni fazi se lahko pojavijo bruhanje, svetlo blato, temen urin in zlatenica. Akutna faza traja razlicno dolgo, od nekaj dni pa tudi do nekaj tednov. Pri obolelih so lahko povišani jetrni encimi: jetrne transaminaze, bilirubin, alkalna fosfataza in .-glutamiltransferaza. Bolezen v vecini primerov izzveni sama od sebe, pacient pa popolnoma okreva. V redkih primerih pride do odpovedi jeter, smrtnost pa lahko doseže tudi 50 % v primeru nepravocasne transplantacije jeter. Patološka slika akutnega hepatitisa se kaže z nejasno lobularno strukturo jeter, nekoliko povecanim portalnim delom, infiltracijo limfocitov, proliferacijo Kupferjevih celic, povecanjem kapilar s holestazo, degeneracijo in fokalno nekrozo hepatocitov (Xin in Xiao, 2016). Diagnostika akutnega hepatitisa temelji predvsem na epidemiološki poizvedbi, klinicnih znakih in laboratorijskih rezultatih. Pomembna je dobra anamneza, s katero pridemo do podatkov o morebitnem zaužitju termicno neobdelanih svinjskih izdelkov ali morebitnih potovanjih v endemicne dele sveta. Ker so klinicni znaki enaki pri okužbi z vsemi virusnimi hepatitisi, je na podlagi teh nemogoce vedeti, ali gre za okužbo s HEV. Najbolj zanesljiva je laboratorijska diagnostika, s katero dokažemo prisotnost virusne RNA v vzorcu blata ali dokaz specificnih IgG/IgM v serumu. Virusno RNA lahko z RT-PCR zaznamo že dva tedna pred pojavom klinicnih znakov pa tudi dva meseca po okužbi. IgM lahko zaznamo z encimskoimunskim testom od štiri do pet mesecev po okužbi, IgG pa tudi leta kasneje (Xin in Xiao, 2016). 2.4.2 Kronicni hepatitis Kronicno obliko okužbe definira prisotnost RNA HEV v serumu, ki traja vec kot 6 mesecev. Kronicne oblike okužb s HEV so najprej opazili leta 2008 pri nekaterih pacientih po transplantaciji jeter ali ledvic (Kamar in sod., 2015), kasneje se je takih primerov zacelo pojavljati cedalje vec. Sevi HEV iz genotipa 3 lahko povzrocijo kronicni hepatitis pri imunokomprimiranih pacientih, dokazano pa je bilo, da ga lahko sproži tudi genotip 4. Genotipa HEV 1 in 2 za zdaj nista bila dokazana pri kronicni obliki. Kombinacija okužbe z virusom humane imunske pomankljivosti (HIV) in HEV lahko povzroci stalno prisotnost HEV pri pacientu. Kronicna okužba pri imunokomprimiranih pacientih pogosto vodi do kronicnega hepatitisa, fibroze in ciroze jeter. Pacienti le redko kažejo tipicne klinicne znake (Xin in Xiao, 2016). 2.4.3 Ekstrahepaticni zapleti okužbe s HEV Nevrološki zapleti so redki, kljub vsemu pa so znani primeri pojava Guillain-Barréjevega sindroma, Bell-ove paralize obraza, nevralgicne amiotrofije, akutnega transverznega mielitisa in akutnega meningoencefalitisa. Okužba s HEV se povezuje tudi s trombocitopenijo, hemolizo, akutnim pankreatitisom in nekaterimi avtoimunimi boleznimi (Xin in Xiao, 2016). 2.5 HEV kot zoonoza Leta 1997 so prvic odkrili prisotnost RNA HEV pri prašicih in tako posumili, da gre pravzaprav za zoonozo (Meng in sod., 1997). V letih, ki so sledila, so humane seve HEV iz genotipov 3 in 4 genetsko primerjali s prašicjimi sevi HEV in ugotovili, da so si nukleotidna zaporedja zelo podobna. Dodatno so to hipotezo potrdili tudi s poskusom, pri katerem so SPF (ang. specific pathogen free) prašice intravenozno okužili z vzorci ljudi, okuženih s HEV. Po okužbi so prašici z blatom izlocali HEV, potrdili so viremijo in serokonverzijo (Feagins in sod., 2008). Nadaljevali so s poskusom okužbe med razlicnimi živalskimi vrstami, prašice so uspešno okužili z zajcjim sevom HEV, ne pa tudi s podganjim (Cossaboom in sod., 2012). Kasneje so s poskusom dokazali tudi okužbo pri stiku divjega in domacega prašica (Schlosser in sod., 2014). Vsi dosedanji poskusi okužbe prašicev z genotipoma 1 in 2 so bili neuspešni (Meng in sod., 1998). V razvitih državah je po letu 2000 zaznati porast okužb z genotipoma 3 in 4. Najverjetneje gre vzrok iskati tudi v vecjem zavedanju možnosti okužbe s HEV ter bolj razviti diagnostiki hepatitisnih okužb in ne gre le za dejansko povecevanje števila okuženih ljudi (Geng in Wang, 2016). 2.5.1 Rezervoarji virusa HEV Seznam živalskih vrst, ki so dovzetne za okužbo s HEV, se je v zadnjih letih mocno podaljšal in se še naprej širi. Kljub temu še vedno glavni rezervoar virusa predstavljajo domaci in divji prašici. Pri nekaterih živalskih vrstah so uspeli izolirati RNA HEV, pri drugih so potrdili samo prisotnost specificnih protiteles. RNA HEV so dokazali pri zajcih, nekaterih primatih, petih vrstah netopirjev, podganah, rovkah, jelenih, mungih, losih, podlasicah, kunah, kamelah in postrvih. V skupino morebitnih prenašalcev HEV so do zdaj uvrstili azijskega crnega medveda, dimastega leoparda, psa, macko, lisico, konja, govedo, jaka, ovco in kozo (Widén, 2016; Kenney, 2019). 2.5.2 Potek okužbe in razvoj bolezni pri prašicih 2.5.2.1 Starost pri okužbi Navadno do okužbe prašicev pride pri starosti od osem do dvanajst tednov, ko pasivna imunost, ki jo mladicki dobijo prek matere s kolostrumom, upade. Vendar pa do okužbe lahko pride tudi že veliko prej. Bistveno razliko so dokazali pri svinjah z razlicnim imunskim statusom in njihovih mladicih. Pri seropozitivnih svinjah z visokim nivojem specificnih IgG so pri prašickih potrdili maternalno imunost do devet tednov starosti, pri svinjah s slabo protitelesno imunostjo proti HEV pa le od enega do tri tedne po rojstvu. V vec študijah so tudi že ugotovili RNA HEV v fecesu plemenskih svinj (16–21 % pozitivnih), kar pomeni, da pozitivne živali lahko predstavljajo rezervoar virusa v reji in v periodicnih presledkih izlocajo virus v okolje. Tako lahko do okužbe pride že pred odstavljanjem. Kljub temu velja, da v vecini primerov prihaja do okužb v casu odstavljanja in mešanja razlicnih skupin prašickov (de Deus in sod., 2008; Meester in sod., 2021; Krog in sod., 2019). 2.5.2.2 Poti prenašanja okužbe med prašici Okužba se najveckrat vnese v rejo z nakupom nove živali. Prašici izlocajo virus s fecesom in urinom. Virus se tako akumulira v okolju, zato je vrsta tal v hlevu nadvse pomembna, saj so ob slabših higienskih razmerah v hlevu, živali v stalnem stiku z virusom. Živali izlocijo cez dan bistveno vecjo kolicino urina kot fecesa in obstaja sum, da se z urinom HEV izloca dalj casa. Ce so napajalniki in krmilniki nezašciteni, lahko prihaja do kontaminacije le teh s fecesom in urinom, kar še dodatno poveca možnost za okužbo, saj je virus v okolju stabilen in dolgo casa ohrani kužnost. Najvecjo nevarnost za razširitev in kroženje virusa v reji in med rejami predstavlja mešanje razlicnih skupin prašicev (Meester in sod., 2021). Reprodukcijsko število za HEV, ki nam poda oceno koliko prašicev lahko en prašic okuži med celotno dobo izlocanja virusa, se giblje od 1 pa vse do 8,8, odvisno od študije (Berto in sod., 2012). Višje ko je reprodukcijsko število, lažje se virus prenaša in ostaja ter kroži v populaciji oziroma na farmi. Veliko tveganje predstavlja tudi uvajanje novih prašicev v rejo in s tem potencialeno vnašanje novih sevov HEV od zunaj (Meester in sod., 2021). 2.5.2.3 Kolicina virusa, potrebna za okužbo Minimalna kolicina za okužbo per os (p.o.) pri HEV še vedno ni cisto jasna, v poskusih so ocenili, da bi bilo potrebno uživanje 20 mg fecesa, ki vsebuje 108 GE (ekvivalent genoma, ang. genome equivalent) na dan, 3 dni zapored, za doseganje 50 % uspešnosti okužbe (Bouwknegt in sod., 2011). Poskus, ki so ga izvedli z razlicnimi odmerki virusnih suspenzij, pripravljenih iz jeter eksperimentalno okuženih prašicev, je pokazal, da je za okužbo prašica p.o. in nadaljnje širjenje virusa s fecesom potrebnih najmanj 106 GE. Pri intravenozni (i.v.) okužbi je dovolj že 102 GE (Andraud in sod., 2013). 2.5.2.4 Potek okužbe in imunski odziv Okužbi sledi viremija, ki traja od enega do dveh tednov. Temu sledi izlocanje virusa s fecesom in urinom, kar obicajno traja do osem tednov, lahko pa tudi dlje. Ugotovili so že primer prašica, ki je virus izlocal 3 mesece (Clemente-Casares in sod., 2016). Hkrati z izlocanjem virusa s fecesom se v serumu pojavijo specificni IgM, kasneje pa še IgG (Yugo in sod., 2013). S starostjo živali prevalenca HEV pozitivnih prašicev pada, prevalenca seropozitivnih prašicev pa narašca. Nekatere študije nakazujejo, da je protitelesna zašcita razmeroma kratka in da lahko prihaja do ponovnih okužb (Chandra in sod., 2008). Socasna okužba z virusom prašicjega reprodukcijskega in respiratornega sindroma (PRRS) mocno vpliva na potek okužbe s HEV. Izlocanje HEV z blatom ali urinom se pojavi kasneje (zacetek izlocanja virusa se podaljša za 1,9 kratni faktor), kolicina izlocenega virusa se poveca, podaljša se obdobje izlocanja virusa v okolje z izlocki (v povprecju 48,6 dni pri socasni okužbi s PRRS, pri samostojni okužbi s HEV pa le 9,7 dni), prihaja pa lahko tudi do kronicnih oblik okužbe s HEV, kar seveda poveca možnost vstopa viremicnih prašicev v klavnico v fazi izlocanja virusa (Salines in sod., 2019; Salines in sod., 2015). 2.5.2.5 Klinicni znaki okužbe Naravno ali eksperimentalno okuženi domaci prašici ne kažejo nobenih klinicnih znakov bolezni. To je nevarno iz vidika prepoznavanja okužbe v casu zakola, saj prašici, okuženi s HEV, nemoteno vstopajo v klavnico in tako prek mesnih izdelkov kontaminiranih s HEV, tudi do potrošnika (Yugo in sod., 2013). Pri eksperimentu, ki ga je izvedel Bouwknegt s sodelavci, so pri prašicih, okuženih s stikom z drugimi prašici, s histopatološko preiskavo ugotovili blag multifokalen limfohistiociten hepatitis. Spremembe so našli tudi v žolcniku (subepitelialne infiltracije limfohistiocitnih celic), v ileumu hiperplazijo Payerjevih plošc ter hiperplazijo bezgavk. Kljub temu da se virus razmnožuje v jetrih, ga dokažemo tudi v drugih organih, kot so želodec, ledvica, mišice (Clemente-Casares in sod., 2016). 2.5.3 Kriticne tocke za prenos virusa 2.5.3.1 Reje domacih prašicev Obvladovanja okužb s HEV se je potrebno lotiti na vec ravneh. Kriticnih tock, kjer lahko prihaja do prenosa virusa, je namrec veliko. Izvor HEV je seveda na ravni okužene reje. Kot prej omenjeno se virus izloca s fecesom in urinom, zato se brez težav pojavi in zadržuje v okolju. Potrebni sta sprotno cišcenje boksov ter dezinfekcija prostorov in opreme pred vsako novo naselitvijo živali. Prav tako je zelo pomembno, da se lastniki reje in delavci zavedajo pomena biovarnosti. Kadar se oskrbniki živali gibljejo med razlicnimi starostnimi kategorijami živali, se morajo ob tem preobleci in preobuti, da preprecijo prenos virusa v reji. Najveckrat do okužb prihaja v casu, ko sesne prašicke odstavijo od matere in se živali razlicnih gnezd meša med seboj, zato bi bilo treba mešanje živali, kolikor je to mogoce, zamejiti. Težava je tudi vhlevljanje novih živali v reji, saj tako lahko vnesemo tudi nov sev HEV in pride do izbruha okužbe med prašici, ki bolezni še niso preboleli in/ali nimajo specificnih zašcitnih protiteles. Ce gre za starejšo kategorijo živali, je tveganje še vecje, saj lahko okužene živali, namenjene klanju, s tem v klavnico zanesejo HEV (Meester in sod., 2021; Salines in sod., 2019). Dodaten izziv pri obvladovanju okužb s HEV lahko predstavljajo tudi neozavešceni rejci. Prašici, okuženi s HEV, ne kažejo klinicnih znakov, okužba ne vpliva na prirast in na velikost legla. Zato se hitro lahko zgodi, da rejci niti ne vedo za okužbo prašicev s HEV v reji in niso tako pazljivi pri zajezitvi okužbe, kot bi bili, ce bi se bolezen kazala v klinicni obliki (Teixeira-Costa in sod., 2020). 2.5.3.2 Klavnica HEV spada med zoonoze, zato zakol okuženih prašicev lahko predstavlja doloceno tveganje za potrošnika. V klavnici sta sicer nujna pregleda ante in post mortem, vendar kot že omenjeno klinicnih znakov, po katerih bi okuženega prašica prepoznali, ni. Da ne bi prihajalo do navzkrižnih kontaminacij, je v klavnici in tudi kasneje v mesnopredelovalnem obratu treba slediti dobri praksi. Ce se prašice gara, je verjetnost, da se virus s površine kože prenese na meso, bistveno manjša, saj so temperature v bazenu približno 64 oC. Vecjo nevarnost navzkrižne kontaminacije mesa in notranjih organov prestavlja odstranjevanje prebavil, pri katerem lahko pride do predrtja crevesja in kontaminacije trupa s fecesom, ter odstranjevanje žolcnika, pri katerem ravno tako lahko pride do predrtja in kontaminacije jeter z žolcem, v katerem se pri okuženi živali nahaja izredno velika kolicina virusa. Virus lahko delavci z rokami prenesejo tudi na druge dele prašicjega trupa. 2.5.3.3 Priprava hrane doma Zadnja kriticna tocka so potrošniki in na koncu je edini nacin, da potencialno okužbo s HEV preprecimo ta, da meso oziroma mesne izdelke dovolj termicno obdelamo. Pozorni moramo biti tudi pri pripravi hrane in upoštevati dobre prakse (ne samo zaradi HEV). To pomeni, da kuhinjskih pripomockov, ki so bili v stiku s surovim mesom, jetri ali pripravki, nato ne uporabljamo pri rokovanju s termicno že obdelano hrano. 2.6 Laboratorijska diagnostika HEV Pri diagnostiki okužb s HEV se uporabljajo serološke metode, ELISA in imunoblot (IB), ter molekularne metode, klasicno metodo RT-PCR in RT-PCR v realnem casu. Z encimskoimunskim testom se dokazuje prisotnost specificnih protiteles proti HEV v serumu prašicev oziroma drugih živalskih vrst. Obstaja nekaj komercialnih diagnosticnih encimskoimunskih testov, vsem pa je skupno to, da so slabo specificni. Za dokazovanje specificnih protiteles proti HEV v serumu prašicev lahko uporabljamo tudi metodo imunoblot, vendar komercialnega testa, za uporabo pri prašicjih serumskih vzorcih, na trgu trenutno ni. Za potrebe naše raziskave smo modificirali test, ki je sicer namenjen za dokazovanje specificnih protiteles proti HEV v humani medicini. Molekularne metode so visoko specificne in z njimi lahko ugotavljamo RNA HEV v razlicnih vrstah vzorcev. Pri nekaterih vzorcih ni nikakršnih težav z izolacijo RNA HEV, kot na primer v blatu, jetrih, žolcu in serumu, v katerih jo najveckrat dokazujemo pri prašicih. Veliko vec je težav pri mesnih oziroma jetrnih izdelkih, predvsem tistih pri katerih gre za mešanice in vsebujejo mašcobe (Salines in sod., 2019). Raziskovalci po vsem svetu si že vec let prizadevajo razviti stabilno celicno kulturo za izolacijo in gojenje HEV, vendar do zdaj niso bili uspešni (Meister in sod., 2019). 2.6.1 ELISA Encimskoimunski test so izumili leta 1971, z uporabo mikrotiterskih plošc pa so jo nadgradili leta 1980. Z leti je metoda postala del rutinske diagnostike v laboratorijih kot tudi med raziskovalci. Na dno mikrotiterske plošce je vezan antigen na katerega se vežejo iskana specificna protitelesa iz vzorca ali pa so na dnu vezana specificna protitelesa, s katerimi v preiskovanem vzorcu lovimo dolocen antigen. Za oznacevanje dokazovalnih protiteles (konjugat) se uporabljajo razlicni encimi: beta galaktozidaza, glukooksidaza, peroksidaza ali alkalna fosfataza. Za ustavitev reakcije se dodajo NaOH, HCl ali H2SO4. Rezultat reakcije se odcita s spektrofotometrom na dolžini 400–600 nm. Poznamo vec tipov encimskoimunskih testov, ki s svojo specificnostjo lahko podajo zelo natancne rezultate. 2.6.1.1 Sendvic ELISA Pri tem tipu je na mikrotitersko plošco vezan antigen. Ko dodamo vzorec, se nanj veže protitelo in tvori se antigen protitelo kompleks. Da bi ta postal viden se doda specificen konjugat, ki se veže na kompleks antigen-protitelo. Po dodatku substrata se sproži katalizirana reakcija, ki povzroci obarvanje substrata in nam omogoci odcitavanje rezultata. 2.6.1.1.1 Lovilna ELISA Gre za podtip sendvic ELISA (ang. capture ELISA), pri katerem je na mikrotitersko plošco vezano specificno protitelo, in ko dodamo vzorec z antigenom, nastane kompleks protitelo-antigen. Nato dodamo za antigen specificen konjugat, ki se veže na antigen in tako nastane kompleks protitelo-antigen-protitelo. Rezultat odcitamo iz barvne reakcije. Sendvic ELISA je od dva do petkrat obcutljivejši od drugih tipov ELISA. 2.6.1.2 Kompetitivna ELISA Na mikrotitersko plošco je vezan specificen antigen ali protitelesa, specificna za iskani antigen. V jamico hkrati dodamo preiskovani vzorec in z encimom oznacena protitelesa ali antigen (konjugat), zato v casu inkubacije pride med iskanimi elementi iz vzorca ter konjugatom do kompeticije za vezavna mesta. Ce je v vzorcu prisotno veliko iskanih elementov, bo obarvanost substrata obratno sorazmerna s kolicino iskanih elementov iz preiskovanega vzorca, kar pomeni, da pri negativnem rezultatu nastane mocna obarvanost substrata (Aydin, 2015). 2.6.2 Reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) ter verižna reakcija s polimerazo v realnem casu Verižna reakcija s polimerazo (ang. “polymerase chain reaction”; PCR) je molekularno-biološka metoda, ki omogoca tarcno pomnožitev specificnega zaporedja DNA (Rahman in sod., 2013). PCR je leta 1983 odkril biokemik Kerry Mullis (Saiki in sod., 1985) ob encimsko posredovani amplifikaciji genomskega zaporedja gena beta-globulina v namene diagnoze srpaste anemije. Po letu 2000 je diagnostika v virološkem laboratoriju pri vecini patogenov prešla s klasicnih metod na PCR. Metoda PCR temelji na uporabi encima DNA polimeraze, ki omogoca in vitro pomnožitev specificnega zaporedja DNA. Sledi nastanek vec kot 106–109 kopij dolocene regije genoma (specificna tarcna DNA, bodisi kodirajoce ali nekodirajoce zaporedje DNA). PCR tako omogoca pomnoževanje vzorca DNA (zadostuje minimalna kolicina tarcne specificne DNA) za dolocitev prisotnosti, na rimer patogena v dolocenem vzorcu (kri, slina, celice ipd.), ali pa se uporablja kot metoda izbora pri kloniranju razlicnih genskih konstruktov. PCR se tako uporablja v namene diagnostike, kloniranja, raziskovanja, forenzike ipd. Celotna reakcija PCR poteka v termopomnoževalniku (ciklicnem termostatu), ki omogoca hitro in natancno ogrevanje ter ohlajanje reakcijskega okolja. Obicajno PCR zajema 20–40 ciklov temperaturnih sprememb ali t. i. termicnih ciklov, pri cemer vsak cikel vsebuje dva ali tri razlicne korake. Reakcija PCR se zacne s fazo denaturacije, pri kateri se reakcijska mešanica ogreje na 94–98 °C (20–30 sekund), kar povzroci razcep vodikovih vezi med verigama DNA in nastanek dveh enoverižnih DNA (ang. single-stranded DNA; ssDNA). Pri uporabi dolocenih DNA polimeraz, ki za delovanje potrebujejo visoko temperaturo, se pred fazo denaturacije reakcija ogreje, na primer za 1–10 minut na 94–96 °C ali celo 98 °C; govorimo o fazi inicacije. Fazi denaturacije sledi faza naleganja, pri kateri zacetni oligonukleotidi nalegajo na komplementarno zaporedje DNA. Pri tej fazi je pomembna temperatura naleganja, ki je odvisna od koncentracije posameznih nukleotidov oligonukleotida. Nastanek dvojno verižne DNA (dsDNA) (po naleganju oligonukleotidov na ssDNA) oziroma hibridizacija je kljucna, saj encim DNA polimeraza lahko pomnožuje DNA le ob prisotnosti dsDNA. Prav tako je pomembno, da so oligonukleotidi specificni in prepoznavajo samo zaporedje tarcne DNA. Sledi faza elongacije ali ekstenzije (podaljševanja verige), pri kateri je temperatura pomnoževanja odvisna od uporabljene DNA polimeraze (Rahman in sod., 2013; Zhu in sod., 2020). Denaturacija, naleganje in elongacija predstavljajo en posamezni cikel PCR reakcije. Dolocenim številom ciklov sledi posamezna stopnja koncnega podaljševanja ter koncno ohlajanje reakcijske mešanice na nizko temperaturo. Ucinkovitost PCR dolocamo po formuli 2n, pri cemer je n število ciklov. Ob optimalnem delovanju bi v vsakem ciklu morali nastati dve kopiji molekule DNA iz vsake DNA. Produkti PCR se v glavnem vizualizirajo z uporabo interkalirajocih se DNA barvil (na primer etidijev bromid) ali fluorescencnih oligonukleotidov (Garibyan in Avashia, 2013). Najveckrat se uporablja agarozna gelska elektroforeza, ki omogoca potovanje PCR produktov od katode proti anodi ter posledicno locevanje produktov PCR na podlagi razlicnih velikosti. Glede na razlicne pogoje oziroma lastnost posameznih ciklov ter želenega rezultata locimo vec razlicnih PCR. Ce želimo dolociti kolicino specificne DNA ali gena v vzorcu, se odlocimo za t. i. kvantitativni real-time ali qRT-PCR. Pri tej metodi se kolicina DNA izmeri v danem oziroma realnem casu, torej v casu sinteze novih specificnih verig DNA. Detekcijo DNA v realnem casu omogoca uporaba bodisi fluorescencnih DNA interkalirajocih se barvil (na primer SyberGreen) bodisi specificnih DNA fluorescencnih sond (na primer Taq-man Probes). Uporaba slednjih omogoca dokazovanje DNA po hibridizaciji sonde s komplementarno tarcno DNA. RT-PCR se lahko kombinira z reverzno transkripcijo, reakcijo, pri kateri se mRNA (izolirana iz vzorca, ki ga preiskujemo) prepiše v komplementarno DNA ali cDNA. Kolicina slednje se nato doloca v reakciji qPCR (Garibyan in Avashia, 2013; Kralik in Ricchi, 2017). Fluorescenca nastalega PCR produkta se izmeri na koncu vsakega cikla, s tem da intenzivnost fluorescencnega signala korelira s kolicino tarcnega specificnega DNA pomnožka, kar sovpada s kolicino prisotne preiskovane DNA. Tocka, pri kateri intenziteta fluorescence preide v eksponentno rast se smatra kot vrednost Ct (ang. cycle threshold) vzorca in doloca absolutno vrednost kolicine DNA v preiskovanem vzorcu ob upoštevanju ustrezne kalibracijske krivulje ali standardov. Ce standardov nimamo in se uporabljajo le ustrezne referencne kontrole, govorimo o semi-kvantitativnih rezultatih, pri katerih ugotavljamo, da je kolicina posameznega gena v vzorcu vecja ali manjša od kontrole. RT-PCR v eni stopnji se standardno uporablja tudi v diagnostiki patogenov, saj metoda omogoca hitro in natancno diagnozo, je varna in razmeroma poceni metoda, in po zacetni amplifikaciji ni vec mogoca navzkrižna kontaminacija vzorcev (Kralik in Ricchi, 2017). 3 MATERIALI IN METODE 3.1 Vzorcenje V raziskavo smo vkljucili 811 prašicev ob prihodu v zakol. Razdelili smo jih v tri starostne skupine: 322 odojkov (starost tri mesece), 400 pitancev (starost šest mesecev) in 89 plemenskih svinj (starost od enega do štirih let). Vzorcili smo v štirih razlicnih klavnicah: Celjske mesnine, Meso Kamnik, klavnica farm Ihan v Šentjurju in klavnica Panvita Gornja Radgona. Vzorcenje je potekalo od zacetka junija do konca septembra 2014, v tem obdobju smo vzorcili skupno 29 dni. Pri izboru živali, pri katerih smo nameravali odvzeti vzorce, smo si pomagali s spremno dokumentacijo in sproti spremljali, iz katerih rej živali izvirajo, saj smo želeli dobiti cim bolj reprezentativne vzorce. Iz starostne skupine pitancev smo iz vsake reje odvzeli vzorce petim živalim. Ker odojkov in plemenskih svinj v zakol pripeljejo bistveno manj kot pitancev, smo pri teh dveh kategorijah vzorce odvzeli vecjemu številu živali iz iste reje, saj smo le tako lahko zagotovili zadostno število vzorcev iz teh dveh starostnih kategorij. Živali (811) so izvirale iz 81 razlicnih rej (Tabela 1), iz nekaterih rej smo pri prašicih odvzeli vzorce veckrat, iz drugih rej samo enkrat. Devetnajst rejcev prašicev, od katerih so prašice pripeljali v zakol v klavnico v casu našega vzorcenja, je uvažalo prašice iz Avstrije, Nemcije, Slovaške in Nizozemske. Tabela 1: Razporeditev rej po statisticnih regijah Slovenije, število rej po krajih (mesto/vas) in število prašicev pri katerih smo odvzeli vzorce pri posamezni starostni kategoriji (vzorcenje v klavnicah). Table 1: Distribution of farms by statistical regions of Slovenia, number of farms per town and number of sampled pigs from different age groups (sampling in slaughterhouses). Regija Mesto/vas Število rej Število prašicev odojki pitanci plemenske svinje Jugovzhodna regija Gradac 1 5 Trebnje 1 2 Podturn 1 5 Klinja vas 1 15 49 Osrednje-slovenska regija Kamnik 1 8 10 Dol pri Ljubljani 1 5 1 Podravska regija Race 1 4 Drvanje 1 5 Slov. Bistrica 1 24 Benedikt 1 10 Sv. Ana 3 24 Ormož 1 15 Miklavž 1 30 10 Starše 1 4 Sv. Trojica 1 10 Zg. Duplek 1 12 Destrnik 3 20 Gorišnice 1 5 Cerkvenjak 2 10 Jurovski Dol 2 5 5 Pernica 1 5 Podgorci 2 15 Vitomarci 1 5 Orehova vas 1 26 Markovci 1 5 Cirkovce 2 26 Videm pri Ptuju 1 10 Pomurska regija Sp. Kamenšcak 1 2 Apace 4 20 Sp. Ivanjci 1 5 Križevci 5 29 10 Bakovci 1 35 15 8 Lastomerci 1 5 Mala Nedelja 2 19 Radenci 1 9 Gornja Radgona 5 15 31 Bodonci 2 10 Rakican 1 12 Bogojina 1 5 Tišina 1 10 Murska Sobota 1 3 Šratovci 1 2 Nemšcak 1 8 15 Zbigovci 1 5 Selišci 1 5 Stara nova vas 1 5 Vanca vas 1 5 Plitvica 1 5 Ljutomer 2 75 Gerlinci 1 5 Krašci 1 5 Puconci 1 10 Posavska regija Pristava Krško 1 25 Savinjska regija Žalec 1 1 Štore 1 2 Šoštanj 1 5 Buce 1 2 Celje 1 2 Zasavska regija Trbovlje 1 1 Skupaj 60 vasi/mest 81 322 400 89 3.1.1 Vzorci blata, jeter, žolca in krvi ter nacin odvzema vzorcev Posameznim prašicem smo ob zakolu odvzeli štiri vrste vzorcev: • blato (811 vzorcev), • jetra (811 vzorcev), • žolc (811 vzorcev), • kri (359 vzorcev). Na cistem delu klavne linije smo vzorcili blato, jetra in žolc. Blato smo odvzeli pri posameznem prašicu iz kolona, po odstranitvi crevesja iz telesa. Kolon smo zarezali s sterilnim skalpelom ter odvzeli vzorec blata (30 g) v sterilne 50-mililitrske epruvete (Slika 5). Žolc (2 ml) smo odvzeli iz žolcnika s sterilno iglo (Slika 6). Po odstranitvi žolcnika, pri cemer smo pazili, da ga nismo prebodli, smo s skalpelom odvzeli še vzorec jeter (košcek 5 cm x 3 cm, debeline 1 cm). Jetrno tkivo smo vzorcili vedno na istem mestu, kjer smo odstranili žolcnik (Slika 7). Slika 5: Odvzem vzorca blata iz kolona prašicev v klavnici. Figure 5: Sampling of feces from porcine colon at the slaughterhouse. Slika 6: Odvzem vzorca žolca iz žolcnika prašicev v klavnici. Figure 6: Sampling of bile from porcine gall bladder at the slaughterhouse. Slika 7: Odvzem vzorca jeter prašicev po odstranitvi žolcnika. Figure 7: Sampling of porcine liver after removal of the gall bladder. Pri odvzemu vzorcev smo bili pozorni, da smo za vsako posamezno vzorcenje uporabili nove rokavice, uporabili nov sterilen skalpel in novo sterilno injekcijo z iglo. S tem smo preprecili medsebojno (navzkrižno) kontaminacijo vzorcev med postopkom odvzema. Vzorce smo na Veterinarsko fakulteto transportirali v hladilni torbi in jih do nadaljnje obdelave shranili v zamrzovalniku pri – 70 oC. Ob zakolu prašicev smo skupno odvzeli 359 vzorcev krvi, od tega 101 vzorec krvi odojkov, 205 vzorcev krvi pitancev in 52 vzorcev krvi plemenskih svinj. Kri smo vzorcili na klavni liniji, na tocki izkrvavitve živali po omamljanju. Vzorce smo odvzeli v 15-mililitrske sterilne epruvete brez antikoagulanta (epruvete 15 ml, PP, sterilne; TPP, Švica), jih transportirali na Veterinarsko fakulteto v hladilni torbi ter jih shranili v hladilniku na temperaturi 5 ± 3 oC do naslednjega jutra, ko smo epruvete centrifugirali, odvzeli 1 ml seruma in ga shranili v zamrzovalniku pri temperaturi < – 15 oC. 3.1.2 Vzorci brisov površin in nacin odvzema vzorcev Med odvzemom vzorcev pri prašicih smo na liniji klanja odvzeli tudi brise površin. Na treh mestih na klavni liniji, za katera smo ocenili, da obstaja najvecja nevarnost navzkrižne kontaminacije, smo odvzeli 63 vzorcev brisov. Vzorce brisov smo odvzemali s sterilnimi suhimi vatiranimi palckami (bris) (Golias labortehnika, Slovenija). V vsako epruvetko za shranjevanje suhega brisa smo pred uporabo dodali 2 ml transportnega medija RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Velika Britanija). Dolocili smo tri kriticne tocke na klavni liniji kjer smo odvzemali brise: 1. Kavlji, na katere se obešajo jetra, pljuca in srce živali po eksenteraciji (Slika 8); 2. Zabojniki, kamor po veterinarskem pregledu odlagajo jetra prašicev (Slika 9); 3. Kavlji v hladilnici, na katerih so obešeni trupi prašicev po pregledu (Slika 10). Slika 8: Kavelj, na katerem so obešeni notranji organi (pljuca, srce in jetra) prašicev po eksenteraciji. Figure 8: Metal hook holding pigs' internal organs (lungs, heart and liver) after exenteration. Slika 9: Kovinski zabojniki, v katere shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu. Figure 9: Metal containers where porcine livers are stored after veterinary inspection. Slika 10: Kavlji, na katere obešajo trupe prašicev v hladilnici. Figure 10: Metal hooks holding pigs carcases in the cooling room. Kavlje za obešanje drobovine smo vzorcili vsake pol ure (z isto vatenko smo kavlje pobrisali štirikrat v dveh urah). Zabojnike, v katerih se shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu, smo vzorcili, ko je bil zabojnik poln: z isto vatenko smo obrisali tri zabojnike. Kavlje za obešanje trupov smo vzorcili po koncu klanja, z eno vatenko smo obrisali deset kavljev, ki smo jih izbrali nakljucno. Po koncu vzorcenja smo tako v enem dnevu pridobili tri skupne vzorce brisov, vsakega z ene kriticne tocke. 3.1.3 Vzorci mletega mesa in pecenic ter nacin odvzema vzorcev Poleg individualnih vzorcev, ki smo jih odvzeli prašicem ob zakolu, smo dodatno odvzeli tudi 22 skupnih vzorcev mletega mesa, in sicer tako, da smo sledili serijam prašicev, ki smo jim vzeli tudi vzorce blata, jeter, žolca in krvi. Vzorci mletega mesa so bili odvzeti reprezentativno, iz vsake dnevne serije približno 50 g, ki so jih zbirali delavci v predelovalnem delu klavnice. Ker se mleto meso predeluje samo iz mesa pitancev, v teh vzorcih meso odojkov in plemenskih svinj ni bilo vkljuceno. Odvzeli smo še 30 vzorcev pecenic, vendar je potrebno poudariti, da ti vzorci niso izhajali iz živali, katerim smo ob zakolu odvzeli vzorce blata, jeter, žolca in krvi. V tem primeru je šlo za druge živali, zato so vzorci pecenic popolnoma neodvisni od drugih vzorcev iz klavnice. Vse vzorce mletega mesa in pecenic smo na Veterinarski fakulteti shranili v zamrzovalni skrinji na – 70 oC do nadaljnje obdelave. V našo raziskavo smo poleg vzorcev krvi, odvzetih prašicem ob zakolu v klavnicah, vkljucili tudi 351 nakljucno izbranih serumskih vzorcev prašicev, ki so bili odvzeti na celotnem obmocju Slovenije v okviru letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014 (Tabela 2). Starostne skupine prašicev, katerim smo vzorce krvi odvzeli v klavnici in prašicev, katerim so vzorce krvi jemali v okviru letnega monitoringa kužnih bolezni, so se razlikovale. Prašici ob zakolu v klavnici so bili stari tri mesece (odojki), šest mesecev (pitanci) in vec kot dvanajst mesecev (plemenske svinje). Prašici, katerim so vzorce krvi jemali v okviru letnega monitoringa, so bili stari od dva meseca do osem let. Vzorce serumov, ki smo jih izbrali za našo raziskavo, smo zato razporedili v tri starostne kategorije: živali starosti od dva do šest mesecev, živali starosti od šest do dvanajst mesecev in živali starosti dvanajst mesecev in starejše. Po tako dolocenih starostnih kategorijah smo v nadaljevanju raziskave tudi analizirali rezultate. Tabela 2: Razporeditev rej po statisticnih regijah Slovenije, število rej po krajih (mesto/vas) (izbrani serumski vzorci iz nabora vzorcev letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014). Table 2: Distribution of farms by statistical regions of Slovenia, number of farms per town (serum samples picked out of samples collected as a part of annual monitoring of infectious pig diseases during year 2013 and 2014). Regija Mesto/vas Število Jugovzhodna regija Šmarješke Toplice 1 Novo mesto 1 Crnomelj 1 Straža 1 Kocevje 1 Žužemberk 1 Semic 1 Osrednjeslovenska regija Kamnik 2 Grosuplje 1 Ivancna Gorica 4 Šmartno 3 Litija 3 Podravska regija Hajdina 2 Ptuj 1 Lenart 1 Dornava 2 Gorišnica 1 Pomurska regija Murska 1 Veržej 1 Ljutomer 2 Puconci 2 Cankova 1 Beltinci 1 Tišina 2 Posavska regija Krško 2 Kostanjevica 1 Sevnica 5 Radece 1 Brežice 4 Savinjska regija Braslovce 4 Celje 1 Laško 2 Polzela 1 Šmarje 4 Vransko 1 Podcetrtek 1 Rogaška Slatina 1 Slovenske Konjice 5 Šentjur 3 Zrece 1 Žalec 1 Zasavska regija Zagorje ob Savi 2 Gorenjska regija* Kranj 1 Preddvor 4 Šencur 2 Škofja Loka 1 Železniki 1 Radovljica 1 Žiri 1 Goriška regija* Kanal 1 Nova Gorica 1 Vogrsko 1 Tolmin 1 Ajdovšcina 1 Obalno-kraška* regija Komen 2 Piran 1 Primorsko-notranjska regija* Ilirska Bistrica 1 Skupaj 56 97 *dodatne regije, ki jih ni v Tabeli 1 3.2 Metode 3.2.1 ELISA Za testiranje vzorcev prašicjih serumov na prisotnost specificnih IgG proti HEV smo uporabili dva komercialno dostopna encimskoimunska testa: • ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species (IDvet, Grabels, Francija) in • HEV IgG ELISA porcine (Axiom, Bürstadt, Nemcija) Prisotnost specificnih IgG proti HEV smo dokazovali v serumskih vzorcih, odvzetih v letu 2014 pri prašicih ob zakolu v klavnici (359 vzorcev), in v serumskih vzorcih prašicev, odvzetih v okviru letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014 (351 vzorcev). Testa po navodilih proizvajalcev zagotavljata hitro, enostavno in specificno dokazovanje protiteles proti HEV v serumskih vzorcih prašicev. 3.2.1.1 Izvedba ELISA ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species (IDvet) Test ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species (IDvet) je encimskoimunski test, pri katerem se vzorce nanaša v jamice v dvojniku. V sodih jamicah je na mikrotitersko plošco vezan rekombinantni antigen kapside genotipa 3 HEV, lihe jamice so prazne. Test smo izvedli po navodilih proizvajalca. V vse jamice mikrotiterske plošce smo odpipetirali po 190 µl dilucijskega pufra 2. Nato smo v jamice A1, A2, B1, B2 dodali 10 µl negativne kontrole, v jamice C1, C2, D1, D2 pa 10 µl pozitivne kontrole. V preostale jamice smo odpipetirali po 10 µl preiskovanih vzorcev v dvojnikih, skladno z v naprej pripravljenim protokolom ELISA. Mikroplošco smo inkubirali 45 min ± 4 min na temperaturi 21 oC. Iz jamic smo odstranili vsebino in jih spirali z raztopino za spiranje (300 µl, spiranje smo trikrat ponovili). V vsako jamico smo nato dodali po 100 µl konjugata. Inkubirali smo 30 min ± 3 min na temperaturi 21 oC. Iz jamic smo odstranili vsebino, jamice sprali z raztopino za spiranje (300 µl, spiranje smo trikrat ponovili). Dodali smo 100 µl substrata v vsako jamico. Inkubirali smo 15 min ± 2 min na temperaturi 21 oC v temi. V vsako jamico smo dodali 100 µl stop raztopine. Rezultate OD (ang. optical density) smo odcitali z ELISA citalcem mikrotiterskih plošc (Tecan Sunrise ST, serijska številka 704000044; Švica) pri valovni dolžini 450 nm. Rezultate smo ovrednotili na podlagi enacb za izracun Net OD in S/P (sample/positive control), ki so priložene navodilom proizvajalca in v katere vstavimo odcitane OD vrednosti za posamezni vzorec ali kontrolo: Net OD = OD sode jamice – OD lihe jamice S/P = (net OD vzorca net OD pozitivne kontrole ) x 100 Interpretacijo rezultatov za vzorce smo izvedli po naslednjem kriteriju: • S/P = 60 % … rezultat preiskave je negativen na prisotnost protiteles proti HEV; • 60 % < S/P < 70 % … rezultat preiskave je neopredeljiv na prisotnost protiteles proti HEV; • S/P = 70 % … rezultat preiskave je pozitiven na prisotnost protiteles proti HEV. 3.2.1.2 Izvedba testa HEV-IgG ELISA porcine (Axiom) Test HEV IgG ELISA porcine (Axiom) je encimskoimunski test za dokazovanje specificnih IgG proti HEV. Na mikrotiterski plošci je vezan rekombinantni antigen regije ORF 2 genotipa 1 HEV. Test smo izvedli po navodilih proizvajalca. Tri jamice na mikrotiterski plošci smo uporabljali za negativno kontrolo, dve za pozitivno kontrolo, ena jamica nam je služila kot slepa kontrola (ang. blank). V vsako jamico, razen v jamico za slepo kontrolo, smo dodali 100 µl diluenta. Nato smo v ustrezne jamice v skladu s protokolom ELISA nanesli po 10 µl pozitivne kontrole, 10 µl negativne kontrole in po 10 µl vzorca in premešali. Inkubirali smo 30 min na temperaturi 37 oC. Mikroplošco smo sprali z raztopino za spiranje (500 µl, spiranje smo petkrat ponovili) in jo osušili. Dodali smo po 100 µl HRP-konjugata. Inkubirali smo 30 min na temperaturi 37 oC in po inkubaciji ponovili spiranje (500 µl, spiranje smo petkrat ponovili). V vse jamice smo dodali po 50 µl kromogena A in 50 µl kromogena B. Inkubirali smo v temi na temperaturi 37 oC 15 min. V vsako jamico smo dodali po 50 µl stop raztopine in rezultate odcitali z ELISA citalcem mikrotiterskih plošc (Tecan Sunrise ST, serijska številka 704000044; Švica) pri valovni dolžini 450 nm. Rezultate smo ovrednotili na podlagi enacb, ki so priložene navodilom proizvajalca, v katere smo vstavili dobljene OD vrednosti. »Cut-off« = OD negativne kontrole + 0,16 Interpretacijo rezultatov smo izvedli po naslednjem kriteriju: • OD vzorca cut-off < 1 …rezultat preiskave je negativen na prisotnost protiteles proti HEV; • OD vzorca cut-off = 1 … rezultat preiskave je pozitiven na prisotnost protiteles proti HEV; • OD vzorca cut-off = 0,9 – 1,1… rezultat preiskave je neopredeljiv na prisotnost protiteles proti HEV. 3.2.2 Metoda imunoblot (IB) Serumske vzorce, pri katerih se rezultati obeh encimskoimunskih testov niso ujemali, smo testirali s potrditvenim testom recomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen diagnostik, Neuried, Nemcija), ki omogoca dolocanje specificnih IgG ali IgM proti HEV. Ker je bil ta test razvit za dolocanje protiteles v humanem serumu ali plazmi, smo ga modificirali, da je ustrezal preiskavi dokazovanja protiteles proti HEV v prašicjih serumih. Na nitrocelulozno membrano so fiksirani naslednji precišceni rekombinantni antigeni HEV: • O2N (genotip 1, genotip 3), • O2M (genotip 1), • O2C (genotip 1, genotip 3), • O3 (genotip 1, genotip 3). Testne listice inkubiramo v serumu, specificna protitelesa v vzorcu se (ce so prisotna) vežejo na antigene, vezane na listicih. 3.2.2.1 Izvedba modificiranega testa recomLine HEV IgG/IgM Testne listice smo položili v kadicko za izvajanje testa imunoblot, v vsako jamico odpipetirali 2 ml dilucijskega pufra. Na vsak testni listic smo odpipetirali 20 µl seruma. Inkubirali smo eno uro na sobni temperaturi na stresalniku. Vsebino smo odlili iz kadicke in v vsako jamico odpipetirali 2 ml pufra A za spiranje (priložen testu), pustili 5 min in odlili. Spiranje smo ponovili dvakrat. Pripravili smo 2 % blokirno raztopino mleka v prahu brez mašcob v PBS tako, da smo odtehtali 2 g mleka v prahu in dodali 100 ml PBS (pH 7,2). Na magnetnem mešalniku smo mešali, dokler se mleko ni popolnoma raztopilo. V modifikaciji testa smo namesto anti-humanega IgG/IgM konjugata, ki je reagent v testu, uporabili Protein A peroksidazni konjugat (protein A peroxidaza; kat. št. 110MH029; Sigma-Aldrich, ZDA) in pripadajoci substrat za obarvanje reakcije. Pripravili smo delovno raztopino konjugata v razmerju 1 : 250 v blokirni raztopini (3984 µl blokirne raztopine smo dodali 16 µl Protein A-peroksidaznega konjugata), ki smo jo nanesli po 2 ml na posamezni strip. Inkubirali smo 45 min v inkubatorju pri temperaturi 37 oC na stresalniku. Izvedli smo spiranje z blokirno raztopino in ga ponovili petkrat. Substrat smo pripravili tako, da smo tabletko (30 mg) 4-Cloro-1-naphtol (Sigma-Aldrich, ZDA) raztopili v 10 ml metanola. Pocakali smo, da se tabletka popolnoma raztopi. V cisto steklenico smo odpipetirali 10 ml PBS (pH 7,2–7,4) in med mešanjem v PBS pocasi (po kapljicah) dodajali 2 ml raztopine substrata. Tik pred nanosom substrata na listice smo dodali 4 µl 30 % H2O2 in dobro premešali. Na posamezni listic smo nanesli 2 ml substrata in na stresalniku inkubirali 15 min na sobni temperaturi. Po dolocenem casu so se pri pozitivnih vzorcih na testnih listicih pojavile temno obarvane proge. Reakcijo smo ustavili tako, da smo iz listicev odpipetirali substrat in jih sprali s 5 ml deionizirane vode. Rezultate smo odcitali glede na obarvanost prog na listicu, vsaka proga je prinesla doloceno število tock, na podlagi njihovega seštevka pa smo interpretirali rezultate preiskovanih serumov kot negativne, pozitivne ali neopredeljive. Tockovanje: • O2N o Genotip 1 …1 tocka o Genotip 3 …1 tocka • O2M …1 tocka • O2C o Genotip 1 …4 tocke o Genotip 3 …4 tocke • O3 o Genotip 1…2 tocki o Genotip 3 …2 tocki Interpretacijo rezultatov smo izvedli po naslednjem kriteriju: • število tock = 2 … rezultat preiskave je negativen na protitelesa proti HEV; • število tock 3 … rezultat preiskave je neopredeljiv na protitelesa proti HEV; • število tock = 4 … rezultat preiskave je pozitiven na protitelesa proti HEV. 3.2.3 Dokazovanje HEV z molekularnimi metodami 3.2.3.1 Priprava vzorcev Vzorce blata, jeter, mletega mesa in pecenic smo pred izolacijo virusne RNA homogenizirali. Asepticno smo odvzeli 1 g vzorca ter mu dodali 9 ml RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK). Za pripravo 10% suspenzije smo vzorec in hranilni medij homogenizirali v peristalticnem mešalniku (MiniMix 100 ml Lab Blender, Interscience, Francija), centrifugirali 15 min pri 2500 g in supernatant odpipetirali v sterilno vialo. Suspenzijo smo shranili v zmrzovalniku na –70 oC do zacetka izolacije nukleinske kisline. V laboratoriju smo posamezni vzorec brisa površin v transportnem mediju dobro zmešali na mešalniku Vortex, nato pa tekocino odpipetirali v sterilno vialo in vzorce shranili na –70 oC do zacetka izolacije nukleinske kisline. Vzorcev žolca nismo predhodno obdelovali, ker so v tekocem stanju. V laboratoriju smo po deset vzorcev blata, jeter in žolca združevali v skupni vzorec, ter jih v nadaljevanju vnovic testirali individualno v primeru pozitivnega rezultata skupnega vzorca. 3.2.3.2 Izolacija virusne RNA iz vzorcev blata, jeter, žolca, mletega mesa, pecenic in brisov Za izolacijo virusne RNA smo uporabili komercialni komplet za izolacijo QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Nemcija). Izolacijo smo izvajali po navodilih proizvajalca. Za vsak analizirani vzorec smo v 1,5-mililitrske epruvetke odpipetirali 560 µl pufra AVL s »carrier RNA«. Dodali smo 140 µl preiskovanega vzorca (blata/jeter/žolca/mletega mesa/pecenic/brisa) in 15 sekund mešali na mešalniku Vortex. Vzorce smo inkubirali 10 min na sobni temperaturi (18–25 °C) in nato kratko centrifugirali, da smo odstranili tekocino s pokrovcka epruvetke. V epruvetko smo dodali 560 µl etanola (96%) in 15 sekund mešali na mešalniku Vortex. Ponovili smo kratko centrifugiranje, da smo odstranili tekocino s pokrovcka, in nato prenesli 630 µl raztopine na kolonice QIAamp® Mini (Qiagen, Hilden, Nemcija), vstavljene v dvomililitrske zbirne epruvetke, ter jih centrifugirali na 6000 g eno minuto (centrifuga MIKRO 120 Hettica; tip 1204 D-78532; Tuttlingen, Germany). Kolonice smo vstavili v nove dvomililitrske zbirne epruvetke in zavrgli zbirne epruvetke s filtratom. Previdno smo odprli pokrov kolonice in ponovili celoten prejšnji korak. Po centrifugiranju smo kolonice vstavili v nove dvomililitrske zbirne epruvetke, dodali 500 µl pufra AW1 in zavrgli prejšnje zbirne epruvetke s filtratom. Centrifugirali smo na 6000 g eno minuto. Po centrifugiranju smo kolonice vstavili v nove zbirne epruvetke in zavrgli prejšnje s filtratom. Previdno smo odprli kolonico, dodali 500 µl pufra AW2 in centrifugirali na 20000 g tri minute ter jih vstavili v ciste 1,5-mililitrske epruvetke, pri cemer smo zavrgli prejšnje zbirne epruvetke s filtratom. V kolonico smo dodali 60 µl pufra AVE in inkubirali eno minuto na sobni temperaturi, potem centrifugirali eno minuto na 6000 g in na koncu zbirno epruvetko s filtratom, v kateri se je nahajala izolirana RNA, shranili na –70 °C. V vsak postopek izolacije RNA smo vkljucili tudi znano negativno in pozitivno kontrolo. Za pozitivno kontrolo smo uporabili suspenzijo blata prašica, pozitivnega na HEV, ki smo mu s sekvenciranjem predhodno dolocili nukleotidno zaporedje. Za negativno kontrolo smo uporabili suspenzijo blata prašica, negativnega na HEV. Na ta nacin smo vsakic preverjali uspešnost postopka in morebitno kontaminacijo tekom samega postopka izolacije. 3.2.3.3 Metoda reverzne transkripcije in verižne reakcije s polimerazo (PCR) Klasicno metodo RT-PCR smo uporabili za pomnoževanje dveh odsekov virusnega genoma HEV, ki smo jima nato dolocili nukleotidno zaporedje. Pomnoževali smo 418 nukleotidov dolg odsek na regiji ORF 1 in 348 nukleotidov dolg odsek na regiji ORF 2. Uporabili smo pare oligonukleotidnih zacetnikov opisanih v priznanih znanstvenih objavah in komplet reagentov One-Step RT-PCR (Qiagen, Hilden, Nemcija). Pomnoževanje produktov PCR smo izvedli na termopomnoževalniku T1 (Biometra, ZDA). 3.2.3.3.1 Pomnoževanje odseka na regiji ORF 1 Odsek na regiji ORF 1 smo pomnoževali s parom zacetih nukleotidov HEVConsORF 1-a1 in HEVConsORF 1-s1 (Schlauder in sod., 1999) (Tabela 3). Pomnoževanje odseka ORF1 smo izvedli s kompletom reagentov One-Step RT-PCR (Qiagen, Nemcija) s koncnim volumnom 25 µl reakcijske mešanice, ki je vsebovala: • 14 µl H2O, prosta nukleaz, • 5 µl 5x PCR pufra, • 1 µl dNTP miksa (ki je vseboval 10 nM vsakega dNTP), • 1 µl oligonukleotidnega zacetnika HEV ORF1-a1 s koncentracijo 20 µM, • 1 µl oligonukleotidnega zacetnika HEV ORF1-s1 s koncentracijo 20 µM, • 1 µl RT-PCR Enzyme mix in • 2 µl RNA vzorca ali kontrole. Program PCR je vseboval naslednje stopnje: • reverzna transkripcija pri 50 oC 30 min, • PCR aktivacija pri 94 oC 15 min, • sledilo je 40 ciklov: o denaturacija 94 oC 30s, o prileganje oligonukleotidnih zacetnikov 55 oC 30 s, o podaljševanje verige DNA 72 oC 1 min, • zadnjemu ciklu je sledilo koncno podaljševanje pri 72 oC 10 min, • ohlajanje pri 4 oC. 3.2.3.3.2 Pomnoževanje odseka v regiji ORF 2 Odsek v regiji ORF 2 smo pomnoževali s parom oligonukleotidnih zacetnikov HEV ORF 2 3156N-F in HEV ORF 2 3157N-R ter s parom notranjih oligonukleotidnih zacetnikov HEV ORF 2 3158N-F in HEV ORF 2 3159N-R (Huang in sod., 2002) (Tabela 3). Tabela 3: Nukleotidna zaporedja oligonukleotidnih zacetnikov regij ORF 1 in ORF 2 in velikost pomnoženega produkta. Table 3: Nucleotide sequence for amplification of ORF1 and ORF 2 and amplicon size. Ime Nukleotidno zaporedje v smeri 5'–3' Velikost produkta HEV ORF1-a1 CCA TCR ARR CAG TAA GTG CGG TC 418 nt HEV ORF1-s1 CTG GCA TYA CTA CTG CYA TTG AGC 418 nt 3156N AATTATGCC(T)CAGTAC(T)CGG(A)GTTG 348 bp 3157N CCCTTA(G)TCC(T)TGCTGA(C)GCATTCTC 348 bp 3158N GTT(A)ATGCTT(C)TGCATA(T)CATGGCT 348 bp 3159N AGCCGACGAAATCAATTCTGTC 348 bp Za pomnoževanje specificnih odsekov ORF 2 smo v PCR uporabili komplet reagentov One-Step RT-PCR (Qiagen, Nemcija), reakcijska mešanica s koncnim volumnom 25 µl pa je vsebovala: • 14 µl H2O, prosta nukleaz, • 5 µl 5x PCR pufra, • 1 µl dNTP miksa (ki je vseboval 10 nM vsakega dNTP), • 1 µl vsakega oligonukleotidnega zacetnika s koncentracijo 20 µM, • 1 µl RT-PCR Enzyme mix, • 2 µl RNA vzorca ali kontrole. Program PCR je vseboval naslednje stopnje: • reverzna transkripcija pri 50 oC 30 min, • PCR aktivacija pri 94 oC 15 min, • sledilo je 40 ciklov: o denaturacija 94 oC 60 s, o prileganje oligonukleotidnih zacetnikov 55 oC 60 s, o podaljševanje verige DNA 72 oC 60 s, • zadnjemu ciklu je sledilo koncno podaljševanje pri 72 oC 10 min in • ohlajanje pri 4 oC. Pri prvem PCR smo najprej uporabili oligonukleotidne zacetnike HEV ORF 2 3156N-F in HEV ORF 2 3157N-R. Zaradi pojava nespecificnih produktov PCR smo pri drugem PCR uporabili notranje zacetne oligonukleotide, ki so namenjeni izboljšanju obcutljivosti in specificnosti PCR reakcije (HEV ORF 2 3158N-F in HEV ORF 2 3159N-R), in v mešanico dodali PCR produkt pomnoženega prvega PCR. Na ta nacin smo dobili specificen produkt. Pri nadaljnjih protokolih za analizo preostalih vzorcev smo uporabljali samo notranje zacetne oligonukleotide, pri cemer smo v reakcijsko mešanico dodajali RNA preiskovanih vzorcev. 3.2.3.4 Analiza produktov RT-PCR z elektroforezo v agaroznem gelu Velikost pomnoženih produktov regij ORF 1 in ORF 2 smo dolocali z gelsko elektroforezo v 1,8% agaroznem gelu. Po obarvanju z etidijevim bromidom smo pod UV-svetlobo na podlagi primerjave specificne velikosti produkta, s standardom velikosti 100-bp, vzorce opredelili kot pozitivne ali negativne. Ce smo poleg specificnih produktov dobili še produkte drugih velikosti glede na število bp, smo produkte specificne velikosti izrezali iz gela in jih ocistili. 3.2.3.4.1 Cišcenje produktov PCR PCR produkte smo cistili s pomocjo kompleta QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Nemcija). Iz agaroznega gela smo s sterilnim skalpelom izrezali fragment gela z DNA produktom dolocene velikosti. Izrezan fragment gela smo stehtali in v 1,5-mililitrsko epruvetko dodali pufer QG v trikratni masi izrezanega fragmenta gela (masa:volumen = 1:1) ter inkubirali na temperaturi 50 oC 10 min, oziroma dokler se gel ni raztopil. Raztopini smo dodali izopropanol v kolicini, ki je enaka masi gela. QIAquick spin kolono smo vstavili v 2-mililitrsko epruvetko, v spin kolono nanesli vzorec iz izrezanega fragmenta in centrifugirali 1 min. V spin kolono smo nato dodali 500 µl pufra QG in centrifugirali 1 min. Sprali smo z dodajanjem 750 µl pufra PE. Po 5 min smo spin kolono centrifugirali, jo prestavili v cisto 1,5-mililitrsko epruvetko in DNA eluirali s 30 µl pufra EB. Precišceno DNA vzorca smo ponovno nanesli na agarozni gel in tako preverili uspešnost cišcenja produkta. 3.2.3.5 Dolocanje in analiza nukleotidnih zaporedij Dolocanje nukleotidnega zaporedja smo v obeh smereh izvedli v regijah ORF 1 in ORF 2 iz PCR produktov z istimi oligonukleotidnimi zacetniki, ki smo jih uporabili za PCR. Z racunalniškimi programi paketa LaserGene (DnaStar, ZDA) smo s programoma Seqman in Editseq uredili dobljena nukleotidna zaporedja. Urejena delna nukleotidna zaporedja smo primerjali z nukleotidnimi zaporedji sevov HEV, ki so dostopni v podatkovni zbirki GenBank, ki jo ureja Nacionalni center za informacije s podrocja biotehnologije iz ZDA. Uporabili smo program BLAST. Za analizo nukleotidnih zaporedij smo prav tako uporabili programe paketa LaserGene (DnaStar, ZDA). V analizo nukleotidnih zaporedij naših slovenskih sevov smo vkljucili tudi referencne seve HEV, ki smo jih pridobili iz genske banke. Urejena nukleotidna zaporedja sevov naših vzorcev in sevov, pridobljenih iz genske banke, smo analizirali s programi iz programskega paketa MEGA 6.06 (prosto dostopen na medmrežju na naslovu https://www.megasoftware.net/). 3.2.3.6 Metoda reverzne transkripcije in verižne reakcije s polimerazo v realnem casu Metodo RT-PCR v realnem casu smo uporabili za pomnoževanje kratkega odseka genoma HEV, pozitivnim vzorcem pa smo v nadaljevanju dolocali nukleotidno zaporedje v ORF 1 in ORF 2. Uporabili smo že objavljen protokol metode RT-PCR v realnem casu, ki omogoca dokazovaje nukleinske kisline HEV iz genotipov 1, 2, 3 in 4 (Jothikumar in sod., 2006) v regiji ORF 3 z zacetnima oligonukleotidoma JVHEV-F in JVHEV-R in sondo JVHEV (Tabela 4). Za kontrolo inhibicije PCR reakcij smo uporabili oligonukleotidne zacetnike ß act intronic in ß act reverse ter sondo ß-aktina (Tabela 4). Oligonukleotidi in sonde za zaznavanje izražanja gena ß-aktina so bili nacrtovani na podlagi mRNA zaporedja gena ß-aktina ovce, netopirja, krave, budre, konja, cloveka, miši in podgane (Wakeley in sod., 2005). Tabela 4: Nukleotidna zaporedja oligonukleotidnih zacetnikov in sond. Table 4: Oligonucleotide and probe sequences. Ime Nukleotidno zaporedje v smeri 5'-3' JVHEV-F GGTGGTTTCTGGGGTGAC JVHEV-R AGGGGTTGGTTGGATGAA JVHEV-P TGATTCTCAGCCCTTCGC ß act intronic CGATGAAGATCAAG/ATCATTGC ß act reverse AAGCATTTGCGGTGGAC ß-Actin TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAG Reakcijska mešanica s koncnim volumnom 20 µl je vsebovala: • 1,5 µl H2O, prosta nukleaz, • 10 µl 2x reakcijske mešanice z ROX (Superscript III Platinum One Step RT-PCR z ROX, Invitrogen, ZDA), • 0,5 µl 50 mM MgSO4, • 1 µl zacetnega oligonukleotida 1 (JVHEV-F), 20 pmol/µl, • 1 µl zacetnega oligonukleotida 2 (JVHEV-R), 20 pmol/µl, • 0,5 µl sonde (JVHEVP), 5 pmol/µl, • 0,5 µl zacetnega oligonukleotida (beta act intronic), 20 pmol/µl, • 0,5 µl zacetnega oligonukleotida (beta act reverse), 20 pmol/µl, • 0,5 µl sonde (beta actin), 5 pmol/µl, • 0,5 µl RT-qPCR mix (Superscript III Platinum One Step RT-PCR z ROX, Invitrogen, ZDA), • 5 µl RNA vzorca ali kontrole. Program za pomnoževanje je vseboval naslednje stopnje: • reverzna transkripcija 30 min pri 50 oC, • denaturacija 15 min pri 95 oC, • 50 ciklov: o 10 s pri 95 oC, o 20 s pri 55 oC, o 15 s pri 72 oC. Pri vsaki izvedbi metode smo uporabili RNA pozitivne in negativne kontrole, ki smo jo izolirali v predhodnem postopku izolacije RNA. Vzorce smo interpretirali kot pozitivne, ce smo dobili vrednost Ct, nižjo od 40, in negativne, ce smo dobili vrednost Ct, višjo od 40. Mejo smo postavili na podlagi predhodnih validacij, ki so jih opravili na Inštitutu za mikrobiologijo in parazitologijo Veterinarske fakultete, Univerze v Ljubljani. 3.2.4 Statisticne metode Podatke o vzorcih in rezultate diagnosticnih testov smo zbirali in urejali v programu Microsoft Excel 365. S tem programom smo pripravili tudi osnovno opisno statistiko in grafe ter del izracunov primerjav diagnosticnih testov, za drugi del pa smo uporabili program R 4.1.2 (R Core Team, 2021). Povezavo med rezultati encimskoimunskih testov Axiom in IDvet iz rednega monitoringa in iz vzorcev iz klavnice smo ugotavljali s Fisherjevim eksaktnim testom. Pri tem smo za statisticno znacilnost uporabili mejno vrednost p, nižjo od 0,05. Ujemanje rezultatov med tema dvema diagnosticnima testoma smo preverili tudi z izracunom koeficienta kappa po Cohenu. .................... ..........=................ ...... ..............-............c.... ................š............ .............. -............c.... ................ Interpretacija vrednosti koeficienta kappa je naslednja: . 0,20 - slabo ujemanje; 0,21–0,40 - rahlo ujemanje; 0,41–0,50 - zmerno ujemanje; 0,51–0,60 - sprejemljivo ujemanje; 0,61–0,80 - dobro ujemanje; 0,81–1 - odlicno ujemanje. Na podlagi rezultatov encimskoimunskih testov in imunoblot metode smo za testa proizvajalcev Axiom in IDvet izracunali obcutljivost in specificnost ter pozitivno in negativno napovedno vrednost po naslednjih enacbah: ..................c.... ....c..................=................ .................................. ..................+....ž.... .................. ..................c.... ..............c........=................ .................. ................ ..................+....ž.... .................. .................. .................. ................=................ .................................. ..................+....ž.... .................. .................. .................. ................=................ .................. ................ ..................+....ž.... .................. 4 REZULTATI 4.1 Dokaz prisotnosti protiteles proti HEV Z dvema komercialnima encimskoimunskima testoma (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom) smo pregledali vzorce krvi domacih prašicev na prisotnost specificnih IgG proti HEV. Testirali smo 710 serumskih vzorcev, od tega 351 vzorcev nakljucno izbranih iz vzorcev, ki so bili odvzeti na celotnem obmocju Slovenije v okviru letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014 in 359 vzorcev odvzetih ob zakolu prašicev v klavnicah. 4.1.1 Nakljucno izbrani serumski vzorci domacih prašicev s celotnega obmocja Slovenije (monitoring) Z encimskoimunskim testom proizvajalca IDvet smo pregledali 351 nakljucno izbranih serumskih vzorcev s celotnega obmocja Slovenije in ugotovili 153 (43,60 %) pozitivnih, 192 (54,70 %) negativnih in 6 (1,71 %) neopredeljivih serumskih vzorcev na prisotnost specificnih IgG proti HEV. Z drugim imunskoencimskim testom (proizvajalca Axiom), smo pregledali 351 nakljucno izbranih serumskih vzorcev s celotnega obmocja Slovenije in ugotovili 97 (27,64 %) pozitivnih, 232 (66,10 %) negativnih in 22 (6,27 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost specificnih IgG proti HEV (Tabela 5). Tabela 5: Rezultati opravljenih seroloških preiskav s testom ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom pri 351 nakljucno izbranih vzorcih iz monitoringa kužnih bolezni prašicev. Table 5: Test results from both ELISA (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species IDvet in HEV-IgG ELISA porcine Axiom) for 351 randomly chosen samples from monitoring of infectious pig diseases. ELISA Pozitiven Negativen Neopredeljiv IDvet 153 (43,60 %) 192 (54,70 %) 6 (1,71 %) Axiom 97 (27,64 %) 232 (66,10 %) 22 (6,27 %) IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine Primerjava rezultatov obeh encimskoimunskih testov je pokazala 94 (26,78 %) serumskih vzorcev pozitivnih v obeh testih, 184 (52,42 %) vzorcev negativnih v obeh testih ter 73 (20,80 %) serumskih vzorcev pri katerih se rezultati testov ne ujemajo (Slika 11, Tabela 6). Od teh 73 vzorcev je imelo 42 (57,5 %) vzorcev pozitiven rezultat s testom proizvajalca IDvet in negativen rezultat s testom proizvajalca Axiom. Fisherjev eksaktni test je pokazal, da so rezultati obeh encimskoimunskih testov statisticno znacilno povezani (p < 0,0001). Vrednost koeficienta kappa 0,60 pove, da je ujemanje med testoma z diagnosticnega gledišca sprejemljivo. Idvet+ Axiom+ IDvet- Axiom- Rezultati, ki se med obema testomaELISA ne ujemajo IDvet-Axiom-(52,42 %) IDvet+ Axiom+(26,78 %) Rezultati, ki se med obema testoma ELISA ne ujemajo(20,80 %) Slika 11: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz monitoringa kužnih bolezni prašicev). Figure 11: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from monitoring of infectious pig diseases). Tabela 6: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (serumski vzorci iz monitoringa kužnih bolezni prašicev). Table 6: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (sera samples from monitoring of infectious pig diseases). IDvet Axiom Pozitiven Negativen Neopredeljiv Pozitiven 94 42 17 Negativen 3 184 5 Neopredeljiv 0 6 0 IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine 4.1.1.1 Analiza rezultatov po starostnih skupinah prašicev (monitoring) Od 351 obravnavanih vzorcev prašicev, pri 63 vzorcih nismo mogli pridobiti podatka o starosti živali, zato jih v ta del analize nismo vkljucili. Med ostalimi 288 vzorci, je bilo 25 živali mlajših od šest mesecev (Slika 12), 74 živali je bilo starih od šest do dvanajst mesecev (Slika 13) in 189 živali je bilo starih dvanajst mesecev ali vec (Slika 14). S testom proizvajalca IDvet smo med 25 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine do šest mesecev dokazali 3 (12,00 %) pozitivne, 20 (80,00 %) negativnih in 2 (8,00 %) neopredeljiva vzorca na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 12). S testom proizvajalca Axiom smo med 25 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine do šest mesecev dokazali 2 (8,00 %) pozitivna in 23 (92,00 %) negativnih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 12). 12% 80% 8% 8% 92% 0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 12: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih do šest mesecev, skupno pregledanih 25 živali. Figure 12: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs up to 6 months old, altogether 25 animals tested. S testom proizvajalca IDvet smo med 74 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine od šest do dvanajst mesecev dokazali 38 (51,35 %) pozitivnih in 36 (48,64 %) negativnih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 13). S testom proizvajalca Axiom smo med 74 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine od šest do dvanajst mesecev dokazali 30 (40,54 %) pozitivnih, 37 (50,00 %) negativnih in 7 (9,46 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost protiteles proti HEV (Slika 13). 51,35% 48,64% 0.00% 40,54% 50.00% 9,46% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 13: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih od šest do dvanajst mesecev, skupno pregledanih 74 živali. Figure 13: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs from 6 to 12 months old, altogether 74 animals tested. S testom proizvajalca IDvet smo med 189 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine nad dvanajst mesecev dokazali 88 (46,56 %) pozitivnih, 98 (51,85 %) negativnih in 3 (1,59 %) neopredeljive vzorce na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 14). S testom proizvajalca Axiom smo med 189 pregledanimi serumskimi vzorci starostne skupine nad dvanajst mesecev dokazali 46 (24,34 %) pozitivnih, 128 (67,72 %) negativnih in 15 (7,94 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 14). 46,56% 51,58% 1,59% 24,34% 67,72% 7,94% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 14: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih starih nad dvanajst mesecev, skupno pregledanih 189 živali. Figure 14: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs older than 12 months, altogether 189 animals tested. 4.1.2 Serumski vzorci odvzeti pri prašicih ob zakolu v klavnici Prisotnost specificnih protiteles proti HEV smo z obema encimskoimunskima testoma dolocali tudi v odvzetih serumskih vzorcih prašicev ob zakolu v klavnicah. Pregledali smo 271 vzorcev, od tega 66 odojkov, 165 pitancev in 40 plemenskih svinj. Z encimskoimunskim testom proizvajalca IDvet smo pregledali 271 vzorcev, odvzetih pri prašicih ob zakolu, in ugotovili 133 (49,08 %) pozitivnih, 119 (43,91 %) negativnih in 19 (7,01 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost protiteles proti HEV (Tabela 7). Z encimskoimunskim testom proizvajalca Axiom smo pregledali 271 vzorcev, odvzetih pri prašicih ob zakolu, in ugotovili 144 (53,14 %) pozitivnih, 115 (42,44 %) negativnih in 12 (4,43 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost protiteles proti HEV (Tabela 7). Tabela 7: Rezultati opravljenih seroloških preiskav s testoma ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom pri 271 vzorcih iz klavnice. Table 7: Test results from both ELISA (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species IDvet in HEV-IgG ELISA porcine Axiom) for 271 samples collected at slaughter. ELISA Pozitiven Negativen Neopredeljiv IDvet 133 (49,08 %) 119 (43,91 %) 19 (7,01 %) Axiom 144 (53,14 %) 115 (42,44 %) 12 (4,43 %) IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine Primerjava rezultatov obeh encimskoimunskih testov je pokazala 125 (46,13 %) serumskih vzorcev pozitivnih v obeh testih, 103 (38,01 %) serumske vzorce negativne v obeh testih, 5 (1,85 %) serumskih vzorcev neopredeljivih v obeh testih in 38 (14,02 %) serumskih vzorcev pri katerih se rezultati obeh encimskoimunskih testov ne ujemajo (Slika 15, Tabela 8). Od teh 38 vzorcev je imelo 12 (31,58 %) vzorcev negativen rezultat s testom proizvajalca IDvet in pozitiven s testom proizvajalca Axiom. Fisherjev eksaktni test je pokazal, da so rezultati obeh testov statisticno znacilno povezani (p < 0,0001). Vrednost koeficienta kappa je 0,75, kar pove, da je ujemanje med testoma z diagnosticnega gledišca dobro. IDvet+ Axiom+ IDvet- Axiom- IDvet? Axiom? Rezultati, ki se med obematestoma ELISA ne ujemajo IDvet+ Axiom+(46,13%) IDvet-Axiom-(38,01%) IDvet? Axiom?(1,85 %) Rezultati, ki se med obema testoma ELISA ne ujemajo (14,02 %) Slika 15: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma) in neopredeljivih rezultatov (neopredeljivi z obema encimskoimunskima testoma) ter rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz klavnice). Figure 15: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA), doubtful results (doubtful with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from the slaughterhouse). Tabela 8: Prikaz pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma), neopredeljivih rezultatov (neopredeljivi z obema encimskoimunskima testoma) in rezultatov, ki se med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali (vzorci iz klavnice). Table 8: Positive results (positive with both ELISA), negative results (negative with both ELISA), doubtful results (doubtful with both ELISA) and mismatching results with both ELISA (samples from the slaughterhouse). IDvet Axiom Pozitiven Negativen Neopredeljiv Pozitiven 125 5 3 Negativen 12 103 4 Neopredeljiv 7 7 5 IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine 4.1.2.1 Analiza rezultatov po starostnih skupinah prašicev (klavnica) Pregledali smo 271 serumskih vzorcev, ki smo jih odvzeli prašicem ob zakolu, od tega je bilo 66 živali starih tri mesece, t. i. odojki (Slika 16), 165 živali je bilo starih šest mesecev, t. i. pitanci (Slika 17) in 40 živali je bilo starejših od dvanajst mesecev, t. i. plemenske svinje (Slika 18). S testom proizvajalca IDvet smo med 66 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starih tri mesece, dokazali 15 (22,73 %) pozitivnih in 51 (77,27 %) negativnih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 16). S testom proizvajalca Axiom smo med 66 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starih tri mesece, dokazali 17 (25,76 %) pozitivnih, 48 (72,73 %) negativnih in 1 (1,52 %) neopredeljiv vzorec na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 16). 22,73% 77,27% 0.00% 25,76% 72,73% 1,52% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 16: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starih tri mesece, skupno pregledanih 66 živali. Figure 16: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in 3 months old pigs, altogether 66 animals tested. S testom proizvajalca IDvet smo med 165 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starih šest mesecev, dokazali 97 (58,79 %) pozitivnih, 57 (34,55 %) negativnih in 11 (6,67 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 17). S testom proizvajalca Axiom smo med 165 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starih šest mesecev, dokazali 99 (60,00 %) pozitivnih, 58 (35,15 %) negativnih in 8 (4,85 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost specificnih protiteles proti HEV (Slika 17). 58,79% 34,55% 6,67% 60.00% 35,15% 4,85% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 17: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starih šest mesecev, skupno pregledanih 165 živali. Figure 17: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in 6 months old pigs, altogether 165 animals tested. S testom proizvajalca IDvet smo med 40 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starejših od dvanajst mesecev, dokazali 21 (52,50 %) pozitivnih, 11 (27,50 %) negativnih in 8 (20,00 %) neopredeljivih vzorcev na prisotnost protiteles proti HEV (Slika 18). S testom proizvajalca Axiom smo med 40 pregledanimi serumskimi vzorci prašicev, starejših od dvanajst mesecev, dokazali 28 (70,00 %) pozitivnih, 9 (22,50 %) negativnih in 3 (7,50 %) neopredeljive vzorce na prisotnost protiteles proti HEV (Slika 18). 52,50% 27,50% 20.00% 70.00% 22,50% 7,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pozitivni negativni neopredeljivi ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 18: Rezultati opravljenih preiskav z encimskoimunskima testoma proizvajalcev IDvet in Axiom pri prašicih, starejših od dvanajst mesecev, skupno pregledanih 40 živali. Figure 18: Test results of two ELISA (IDvet and Axiom) in pigs older than 12 months, altogether 40 animals tested. 4.1.3 Analiza serološko pozitivnih rezultatov v razlicnih starostnih obdobjih prašicev Za lažjo predstavo dinamike pojavljanja protiteles v razlicnih starostnih obdobjih smo zbrali pozitivne rezultate obeh encimskoimunskih testov in jih prikazali v dveh locenih grafih glede na skupino vzorcev – pozitivne rezultate nakljucno izbranih serumskih vzorcev prašicev, ki so bili odvzeti na celotnem obmocju Slovenije v okviru letnega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014 (Slika 19), in pozitivne rezultate serumskih vzorcev, ki smo jih odvzeli prašicem ob zakolu v klavnici (Slika 20). 12,00% 51.35% 46.56% 8,00% 40.54% 24.34% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% do 6 mesecev od 6 do 12 mesecev nad 12 mesecev ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 19: Primerjava deleža pozitivnih rezultatov nakljucno izbranih serumskih vzorcev prašicev (vzorci iz monitoringa) v razlicnih starostnih obdobjih. Figure 19: Comparisson of positive results percentage from randomly chosen swine serum samples at different ages. 23.73% 58.79% 25.50% 25.76% 60.00% 70.00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 3 mesece 6 mesecev nad 12 mesecev ID Screen® Hepatitis E Indirect Multispecies (IDvet) HEV-IgG Elisa porcine (Axiom) Slika 20: Primerjava deleža pozitivnih rezultatov serumskih vzorcev prašicev (vzorci iz klavnice) v razlicnih starostnih obdobjih. Figure 20: Comparisson of positive results percentage from swine serum samples (samples taken at the slaughterhouse) at different ages. 4.1.4 Dokaz specificnih protiteles proti HEV z metodo imunoblot Zanesljivost modificirane metode imunoblot za dokazovanje specificnih protiteles smo preverjali na 17 vzorcih (devetih negativnih in osmih pozitivnih), pri katerih so se rezultati obeh encimskoimunskih testov ujemali. Primemerjava encimskoimunske in imunoblot metode je potrdila stoodstotno ujemanje rezultatov (Tabela 9). Tabela 9: Rezultati primerjave treh metod (encimskoimunski test proizvajalcev IDvet in Axiom ter metoda imunoblot) na 17 vzorcih. Table 9: Results for 17 samples, comparison of three methods (ELISA IDvet, ELISA Axiom and immunoblot method). Zaporedna Oznaka ELISA (OD vrednost) Imunoblot IDvet Axiom 1 2/22 0,038 negativno 0,089 negativno 1 negativno 2 2/24 0,018 negativno 0,093 negativno 0 negativno 3 2/26 -0,013 negativno 0,109 negativno 1 negativno 4 4/17 0,212 negativno 0,075 negativno 0 negativno 5 7/17 0,031 negativno 0,164 negativno 0 negativno 6 7/18 0,373 negativno 0,088 negativno 0 negativno 7 7/19 0,605 negativno 0,099 negativno 0 negativno 8 11/29 0,025 negativno 0,101 negativno 0 negativno 9 11/30 0,268 negativno 0,154 negativno 0 negativno 10 4/16 3,282 pozitivno 1,457 pozitivno 5 pozitivno 11 4/18 2,633 pozitivno 0,999 pozitivno 5 pozitivno 12 13/6 2,652 pozitivno 0,53 pozitivno 4 pozitivno 13 16/18 2,251 pozitivno 0,604 pozitivno 4 pozitivno 14 20/26 2,044 pozitivno 0,813 pozitivno 4 pozitivno 15 20/28 2,76 pozitivno 0,931 pozitivno 5 pozitivno 16 20/29 3,365 pozitivno 1,729 pozitivno 5 pozitivno 17 20/30 3,226 pozitivno 1,102 pozitivno 4 pozitivno IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine Imunoblot…recomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen diagnostik) **Oznaka vzorca je sestavljena iz prve številke, ki oznacuje zaporedni dan vzorcenja in druge številke, ki oznacuje zaporedje vzorcenih živali tistega dne. V nadaljevanju smo testirali 43 vzorcev, od tega 38 vzorcev, pri katerih se rezultati med obema encimskoimunskima testoma niso ujemali, in 5 vzorcev, pri katerih sta oba encimskoimunska testa pokazala neopredeljiv rezultat. Z metodo imunoblot smo dokazali prisotnost protiteles proti HEV pri 3 od 5 vzorcev z neopredeljivim rezultatom in pri 32 od 38 vzorcev, pri katerih se rezultati z obema encimskoimunskima testoma niso ujemali. Rezultati vseh treh metod (ELISA IDvet, ELISA Axiom ter metoda imunoblot) preverjenih 43 vzorcev so podrobneje prikazani v Tabeli 10. Tabela 10: Rezultati primerjave treh metod (encimskoimunski test proizvajalcev IDvet in Axiom ter metoda imunoblot) za 43 vzorcev. Table 10: Results for 43 samples, comparison of three methods (ELISA IDvet, ELISA Axiom and immunoblot method). Rezultat ELISA IDvet ELISA Axiom Imunoblot Število vzorcev negativen pozitiven pozitiven 10 neopredeljiv pozitiven pozitiven 7 neopredeljiv negativen pozitiven 5 pozitiven negativen pozitiven 4 negativen neopredeljiv pozitiven 3 pozitiven neopredeljiv pozitiven 3 neopredeljiv neopredeljiv pozitiven 3 negativen pozitiven negativen 2 neopredeljiv neopredeljiv negativen 2 neopredeljiv negativen negativen 2 pozitiven negativen negativen 1 negativen neopredeljiv negativen 1 Skupaj 43 IDvet… ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species Axiom… HEV-IgG ELISA porcine Imunoblot (modificiran postopek)…recomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen diagnostik) Ko smo s potrditveno metodo imunoblot razjasnili rezultate serumskih vzorcev, odvzetih prašicem ob zakolu v klavnici, ki se z obema encimskoimunskima testoma niso ujemali, smo lahko z visoko zanesljivostjo opredelili rezultate kot pozitivne in negativne. S tem smo prišli do koncnega rezultata. V starostni kategoriji odojkov je bila tako potrjena prisotnost specificnih protiteles proti HEV pri 26 % živali, v starostni kategoriji pitancev pri 65 % živali in v starostni kategoriji plemenskih svinj pri 90 % živali. 4.1.5 Dolocitev diagnosticne obcutljivosti in specificnosti Po izvedenem testiranju vzorcev z metodo imunoblot smo lahko serumske vzorce iz klavnic dokoncno opredelili kot pozitivne ali negativne. Od 271 testiranih vzorcev je bilo 160 pozitivnih in 111 negativnih na prisotnost protiteles proti HEV. Pri encimskoimunskem testu proizvajalca IDvet smo ugotovili 13 lažno negativnih vzorcev in 5 lažno pozitivnih, pri encimskoimunskem testu proizvajalca Axiom pa 9 lažno negativnih in 5 lažno pozitivnih. Iz teh podatkov smo lahko izracunali diagnosticno obcutljivost in specificnost obeh encimskoimunskih testov ter pozitivno in negativno napovedno vrednost obeh testov. Diagnosticna obcutljivost encimskoimunskega testa proizvajalca IDvet je 91,88 %, proizvajalca Axiom pa 94,38 %. Diagnosticna specificnost obeh encimskoimunskih testov je 95,50 %. Pozitivna napovedna vrednost encimskoimunskega testa proizvajalca IDvet je 96,71 %, proizvajalca Axiom pa 96,79 %. Negativna napovedna vrednost encimskoimunskega testa proizvajalca IDvet je 89,08 %, proizvajalca Axiom pa 92,17 %. 4.2 Rezultati dolocanja prisotnosti nukleinske kisline HEV z metodo RT-PCR v realnem casu Skupno smo pregledali 2433 vzorcev 811 prašicev (811 vzorcev blata, 811 vzorcev jeter in 811 vzorcev žolca). Nukleinsko kislino HEV smo dokazali v 44 vzorcih blata, 40 vzorcih jeter in 43 vzorcih žolca. Prisotnost HEV smo vsaj v enem izmed vzorcev ugotovili pri 57 živalih (7,03 %). Pri 26 prašicih smo ugotovili prisotnost HEV v vseh treh vrstah vzorcev (žolc, jetra in blato), pri 14 prašicih v dveh vrstah vzorcev (blato in jetra ali jetra in žolc ali blato in žolc). Pri 17 prašicih je bila pozitivna samo ena vrsta vzorca (Tabela 11). Tabela 11: Rezultati preiskav 57 HEV pozitivnih prašicev (rezultati metod RT-qPCR in ELISA/imunoblot). Table 11: 57 HEV positive animals (RT-qPCR and ELISA/immunoblot results). Oznaka Datum Oznaka RT-qPCR (vrednost Ct) ELISA/IB Blato Jetra Žolc 4/16 16.6.2014 I 24,39 24,66 22,70 pozitivno 4/17 negativno 29,66 negativno negativno 4/18 22,92 24,87 22,80 pozitivno 4/19 26,18 33,54 23,81 negativno 4/20 negativno 34,14 negativno pozitivno 4/26 22,67 27,04 19,72 * 4/27 36,19 negativno negativno * 4/28 36,45 30,08 negativno * 4/30 32,58 negativno 25,71 * 11/11 7.7.2014 negativno 29,78 28,34 * 11/12 31,39 31,64 29,56 * 11/15 negativno 31,69 29,83 * 11/16 negativno 29,57 30,07 * 11/17 negativno 30,51 26,91 * 11/19 negativno 20,58 15,33 * 11/20 negativno 31,34 negativno * 16/15 28.7.2014 27,37 23,11 21,94 negativno 16/20 34,81 30,50 31,99 negativno 16/22 36,35 31,55 31,64 * 16/23 28,51 25,25 24,81 * 16/25 35,71 negativno negativno * 11/23 7.7.2014 II 34,46 34,52 31,70 negativno 11/24 36,16 negativno negativno negativno 11/29 24,33 negativno negativno negativno 11/31 35,14 negativno negativno negativno 13/14 16.7.2014 29,74 27,68 27,21 * 13/15 34,93 32,93 27,84 * 13/19 39,33 34,55 34,78 * 25/13 20.8.2014 38,00 33,27 37,10 * 25/17 24,90 22,89 21,15 * 27/59 1.9.2014 III 25,63 21,18 21,78 * 27/60 32,14 26,53 27,19 * 27/63 negativno 37,17 32,31 * 27/52 1.9.2014 IV 34,43 20,00 16,69 * 27/56 negativno 23,57 negativno * 27/57 negativno 36,55 negativno * 27/58 26,33 20,41 20,19 * 29/20 29.9.2014 25,67 22,26 19,25 * 29/21 24,43 22,80 17,46 * 29/22 26,41 21,45 20,88 * 29/23 25,01 24,51 18,63 * 29/13 29.9.2014 V 28,95 26,11 25,72 * 26/41 25.8.2014 VI 29,37 30,94 28,85 * 8/10 ** 27.6.2014 VII negativno 26,40 25,91 * 20/45 11.8.2014 VIII 35,85 negativno 28,05 negativno 20/48 34,96 negativno 29,09 * 20/55 37,59 negativno 31,54 * 26/90 25.8.2014 IX 34,49 33,62 32,19 * 26/91 34,00 35,33 31,40 * 26/93 negativno negativno 30,41 * 26/36 25.8.2014 X negativno negativno 34,28 * 26/37 39,40 negativno 35,06 * 26/38 negativno negativno 33,04 * 27/46 1.9.2014 XI 32,40 negativno negativno * 27/47 32,68 negativno negativno * 27/48 31,74 negativno negativno * 27/49 33,31 negativno negativno * Povprecje 31,36 28,36 26,78 * Ni vzorca krvi. ** Starost živali šest mesecev (pri vseh drugih vzorcih v tabeli gre za prašice, stare tri mesece) Preiskali smo tudi 63 skupnih vzorcev brisov (21 brisov kavljev, na katere se obešajo notranji organi po eksenteraciji, 21 brisov zabojnikov, kamor se shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu, ter 21 brisov kavljev, na katere so obešeni trupi prašicev v hladilnici). Z metodo RT-PCR v realnem casu smo prisotnost RNA HEV ugotovili v dveh vzorcih (3,17 %). V pozitivnem brisu zabojnika z jetri smo ugotovili vrednost Ct 29,31, v pozitivnem brisu kavlja, na katerega se obešajo notranji organi, smo ugotovili vrednost Ct 32,33. V preostalih vzorcih brisov (96,82 %) nismo ugotovili prisotnosti nukleinske kisline HEV. V nobenem od odvzetih 22 vzorcev mletega mesa in 30 vzorcev pecenic nismo ugotovili prisotnosti nukleinskih kislin HEV. 4.2.1 Analiza pozitivnih vzorcev na HEV po starostnih skupinah prašicev Pri odojkih, starih tri mesece, smo od 322 pregledanih živali ugotovili 13,04 % (42) pozitivnih vzorcev blata, 12,11 % (39) pozitivnih vzorcev jeter in 12,42 % (40) pozitivnih vzorcev žolca. Vsaj eno vrsto vzorca, pozitivnega na HEV, smo dokazali pri 17,39 % (56) od 322 odojkov, pri katerih smo odvzeli vzorce. V starostni kategoriji šestmesecnih pitancev smo pregledali 400 živali in prisotnost virusne RNA HEV ugotovili pri 0,25 % (1) vzorcih jeter in 0,25 % (1) vzorcih žolca. Oba pozitivna vzorca smo odvzeli isti živali. Pregledali smo 89 plemenskih svinj in v nobenem vzorcu blata, jeter ali žolca nismo ugotovili prisotnost RNA HEV. 4.2.2 Analiza prisotnosti HEV v rejah, iz katerih so izvirali vzorceni prašici V raziskavo smo vkljucili prašice, pripeljane v zakol iz 81 razlicnih rej. Pri 19 rejah smo beležili uvoz prašicev iz tujine (Nemcije, Slovaške, Nizozemske in Avstrije). Pri 22 rejah (26 %) smo pri prašicih odvzeli vzorce vec kot enkrat. Prisotnost HEV smo z metodo RT-PCR ugotovili pri 11 rejah (13 %), od tega v desetih rejah odojkov in eni reji pitancev. Med 26 rejami odojkov smo pri desetih rejah (38,5 %) ugotovili vzorce, pozitivne na prisotnost HEV, pri cemer je bilo ob prihodu v klavnico iz posamezne reje na HEV pozitivnih od 5 % do 80 % živali (Tabela 12). Pitance so v zakol pripeljali iz 55 rej, prisotnost HEV smo ugotovili v eni reji (1,9 %). Plemenske svinje so v zakol pripeljali iz osmih razlicnih rej, med katerimi v nobeni nismo dokazali RNA HEV. Tabela 12: Podatki o HEV pozitivnih rejah odojkov (razpored po rejah od I do XI): datum vzorcenja odojkov ob prihodu v klavnico, število vzorcenih odojkov in število pozitivnih odojkov na prisotnost HEV. Table 12: Information about HEV positive farms housing 3 month old pigs (farms from number I to XI).: sampling date of 3 month old pigs at slaughter, number of sampled pigs and number od HEV positive pigs. Reja Datum vzorcenja Število vzorcenih Število I 16.6.2014 15 7 (46,67%) I 7.7.2014 11 7(63,64%) I 28.7.2014 11 5 (45,45%) II 7.7.2014 9 4 (44,44%) II 16.7.2014 16 4 (25,00%) II 20.8.2014 13 8 (61,54%) III 1.9.2014 5 3 (60,00%) III 29.9.2014 5 4 (80,00%) IV 1.9.2014 8 4 (50,00%) V 29.9.2014 19 1 (5,26%) VI 25.8.2014 5 1 (20,00%) VIII 11.8.2014 15 7 (46,67%) IX 25.8.2014 5 3 (60,00%) X 25.8.2014 5 3 (60,00%) XI 1.9.2014 5 4 (80,00%) 4.3 Dolocanje nukleotidnega zaporedja pozitivnih vzorcev HEV v regijah ORF 1 in ORF 2 Od 125 vzorcev, pozitivnih na RNA HEV z metodo RT-PCR v realnem casu, odvzetih v klavnici, smo izbrali 45 vzorcev z vrednostmi v razponu Ct od 15,33 do 31,40 in jim dolocili nukleotidno zaporedje v dolžini 366 nt za ORF 1, oziroma 300 nt za ORF 2 ter jih primerjali v genski podatkovni bazi (GenBank) z uporabo spletnega brskalnika BLAST. Nukleotidna zaporedja regije ORF 1 smo poslali v gensko banko in so dostopna s številkami vnosa MG051642- MG051691. 4.3.1 Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij v regijah ORF 1 in ORF 2 Ugotovili smo veliko genetsko heterogenost slovenskih sevov HEV. Na podlagi poravnave dobljenih zaporedij z orodjema Lasergen (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA) smo z uporabo MEGA 6.0 in Clustal W algoritma poravnave (Tamura s sod., 2013) izdelali filogenetsko drevo. Na podlagi modela Kimura 2-parameter (Kimura, 1980) smo dolocili genetsko oddaljenost sevov. Filogenetska drevesa smo izdelali na podlagi metode povezovanja sosedov, ki je temeljila na tisocih samovzorcenjih (Saitou in Nei, 1987). Filogenetski drevesi smo v regijah ORF 1 in ORF 2 izdelali z metodo bootstrap. Poleg naših sevov smo uporabili tudi referencne seve (Smith in sod., 2020). Vsi slovenski sevi iz te študije spadajo v genotip 3. Ugotovili smo, da se naši sevi uvršcajo v štiri razlicne podtipe: 3a (42 sevov), 3b (en sev), 3e (en sev) in 3f (en sev). 4.3.1.1 Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij v regiji ORF1 V fiologenetsko primerjavo smo vkljucili 45 pozitivnih vzorcev iz klavnice iz enajstih razlicnih rej in 47 referencnih sevov genotipa 1 do 8 (Smith in sod., 2020) (Slika 21). Nukleotidna zaporedja 42 slovenskih sevov iz devetih rej, uvršcena v podtip 3a, imajo od 89,3 do stoodstotno identicnost zaporedja nukleotidov v regiji ORF 1. Sev podtipa 3b (8SLO-13-B) ima 86,9- do 89,3-odstotno ujemanje nukleotidnega zaporedja z drugimi slovenskimi sevi. Sev podtipa 3f (4SLO-17-B) ima od 83,1- do 84,2-odstotno ujemanje nukleotidnega zaporedja z drugimi slovenskimi sevi. Sev podtipa 3e (9SLO-16-B) ima od 80,9- do 84,4-odstotno ujemanje nukleotidnega zaporedja z drugimi slovenskimi sevi. Genetska primerjava slovenskih sevov HEV vzorcev iz klavnice, s sevi, objavljenimi v genski banki, je pokazala, da so slovenski sevi podtipa 3a najbolj sorodni (95- oziroma 94-odstotna identicnost zaporedja nukleotidov) madžarskemu sevu HUN-007 (EU718647) in japonskemu sevu HE-JA-10 (AB089842). Sev podtipa 3b (8SLO-13-B) je najbolj soroden (92-odstotna identicnost zaporedja nukleotidov) japonskima sevoma JRC-HE3 (AB630971) in E008-STM04C (AB369689). Sev podtipa 3e (9SLO-16-B) je najbolj soroden (98- oziroma 96-odstotna identicnost nukleotidnega zaporedja) nemškemu sevu WS09-371 (JQ807514) in nizozemskemu sevu NL_patent-107 (KR362735). Sev podtipa 3f (4SLO-17-B) je najbolj soroden singapurskemu sevu Sing-HEV20 (KT447527), danskemu sevu Dk_patent_3 (MN602943) in francoskemu sevu HESQL147 (MW355369), s katerimi ima 92-odstotno identicnost nukleotidnega zaporedja. Primerjava nukleotidnih zaporedij, ugotovljenih v razlicnih tipih vzorca (blato, žolc, jetra) iste živali (vzorci 4SLO-18, 3SLO-24, 3SLO-19, 3SLO-22, 3SLO-23, 3SLO-25, 2SLO-14, 1SLO-12, 1SLO-6, 1SLO-3, 1SLO-8 in 1SLO-11), je pokazala stoodstotno homologijo med vzorci. Ugotovili smo, da se v sedmih razlicnih rejah pojavljajo isti sevi podtipa 3a. Ena od teh rej je bila iz jugovzhodne regije Slovenije, ena iz podravske regije, ostalih pet rej pa iz pomurske regije. Znotraj iste reje smo ugotovili prisotnost istega seva HEV tudi ob veckratnem zaporednem vzorcenju (3SLO-19/22/23/24/25, 2SLO-10/14, 1SLO-1/3/4/6/8/11/12). Le v reji številka IV smo ob veckratnem vzorcenju poleg podtipa 3a našli tudi sev HEV, ki se uvršca v podtip 3f (vzorca 4SLO-18 IN 4SLO-17). Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 1 (366 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .. Figure 21: Phylogenetic tree, ORF 1 (366 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .. 4.3.1.2 Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij v regiji ORF2 V filogenetsko primerjavo nukleotidnih zaporedij regije ORF 2 smo vkljucili 45 pozitivnih vzorcev iz klavnice in 47 referencnih sevov genotipa 1 do 8 (Slika 22) oziroma 45 pozitivnih vzorcev iz klavnice, 41 referencnih sevov genotipa 1 do 8, sev z oznako JF431020 iz Slovenije (Steyer in sod., 2011) ter pet sevov (MG582613, MG582624, MG582617, MG582610, MG582608) iz Italije (de Sabato in sod., 2018) (Slika 23). Na filogenetskem drevesu (Slika 22) smo ugotovili enako razporeditev slovenskih vzorcev kot na filogenetskem drevesu ORF 1 (Slika 21). Slovenski sevi HEV vzorcev iz klavnice, ki se uvršcajo v podtip 3a, imajo od 88,3- do 100-odstotno identicnost zaporedja nukleotidov. Sev podtipa 3b (8SLO-13-B) ima od 86,3- do 89-odstotno identicnost nukleotidnega zaporedja z drugimi sevi. Sev podtipa 3f (4SLO-17-B) ima od 81,7- do 87-odstotno identicnost nukleotidnega zaporedja z drugimi sevi. Sev podtipa 3e (9SLO-16-B) ima od 81,3- do 87-odstotno identicnost nukleotidnega zaporedja z drugimi sevi. Primerjava slovenskih sevov HEV vzorcev iz klavnice z nekaterimi italijanskimi in slovenskimi sevi v genski banki, prikazanimi na filogenetskem drevesu (Slika 23), je pokazala naslednje: sev z oznako JF431020 iz Slovenije (Steyer in sod., 2011) ima z našim sevom 4SLO-17-L 83-odstotno identicnost zaporedja nukleotidov, s sevom z oznako MG582609 iz Italije (de Sabato in sod., 2018) pa kar 99-odstotno; italijanski sev z oznako MG582613 (de Sabato in sod., 2018) ima z našim sevom 8SLO-13-B 88-odstotno identicnost nukleotidnega zaporedja. Primerjava slovenskih sevov HEV vzorcev iz klavnice s sevi, objavljenimi v genski banki je pokazala, da je sev podtipa 3a (4SLO-18-F) najbolj soroden (95- oziroma 94-odstotna identicnost zaporedja nukleotidov) slovaškemu sevu MO17 (MT408280) in madžarskemu sevu SE01 (MT408283). Sev podtipa 3b (8SLO-13-B) je najbolj soroden (91-odstotna identicnost nukleotidnega zaporedja) japonskima sevoma SWJAK-1 (AB194500) in HEV-132-09-1 (HQ591364). Sev podtipa 3e (9SLO-16-B) je najbolj soroden (95- oziroma 94-odstotna identicnost nukleotidnega zaporedja) italijanskemu sevu SwHEVEm11IT00 (KJ174068) in hrvaškemu sevu 22F (KF366517). Sev podtipa 3f (4SLO-17-B) je najbolj soroden (92-odstotna identicnost nukleotidnega zaporedja) francoskemu sevu 703 (KR027222) in švedskemu sevu sw_3_6-Uppsala (KT581444). Slika 22: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 2 (300 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .. Figure 22: Phylogenetic tree, ORF 2 (300 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .. Slika 23: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij v regiji ORF 2 (300 nt); z isto barvo so oznaceni vzorci prašicev iz istih rej; vzorce blata oznacuje ., vzorce jeter ¦, vzorce žolca .; referencni vzorci posameznih genotipov in podtipov HEV (Smith in sod., 2020) so oznaceni z .; slovenski in italijanski vzorci oznaceni s (SLO) in (IT) (Steyer in sod., 2011; de Sabato in sod., 2018). Figure 23: Phylogenetic tree, ORF 2 (300 nt); pig samples originating from the same farm are labelled with the same colour; feces samples are labelled with ., liver samples with ¦, bile samples with .; reference sequences of individual HEV genotypes and subtypes (Smith et al., 2020) are labelled with .; Slovenian and Italian samples are labelled with (SLO) and (IT) (Steyer in sod., 2011; de Sabato in sod., 2018). 5 RAZPRAVA Širjenje okužb HEV iz nerazvitih delov sveta v industrializirane države in prvi neposredni dokazi, da gre za zoonozo, so med raziskovalci vzbudili zanimanje predvsem zaradi možnosti prenosa HEV na ljudi. Od leta 2000 naprej se je zacelo pojavljati vse vec raziskav o potencialnih novih rezervoarjih virusa, o nacinih prenosa, vse vec je bilo tudi dokazov o kroženju okužb med populacijo prašicev v razlicnih državah po svetu. Ker gre za zoonozo, ki pri prašicih ne povzroca klinicnih znakov, nastopi težava, saj okužbe ni mogoce ugotoviti pri rednem ante in post mortem pregledu, ki ga izvajajo veterinarji v klavnicah. Okužena žival, ki je prišla v zakol, lahko neposredno ali s posredno kontaminacijo virus zanese na klavno linijo, v predelovalni obrat ter seveda na koncu tudi na police v trgovini. V Sloveniji smo na prisotnost HEV že opravili nekaj raziskav z manjšim številom vzorcev. Na Veterinarski fakulteti Univerze v Ljubljani smo pregledovali vzorce domacih in divjih prašicev. Pri domacih prašicih smo od 61 pregledanih vzorcev pri 26 % dokazali RNA HEV (Jamnikar Ciglenecki in sod., 2008), pri 566 nakljucno izbranih vzorcih poginulih prašicev med letoma 2011 in 2015 pa smo ugotovili 8,8 % pozitivnih vzorcev na RNA HEV (Toplak in sod., 2016). Primerjava pozitivnih vzorcev 20 razlicnih rej je pokazala veliko genetsko raznolikost slovenskih sevov HEV v regiji ORF 1 (devet razlicnih linij) (Toplak in sod., 2012). Pri pregledu 288 serumskih vzorcev divjih prašicev pa smo z encimskoimunskim testom dokazali prisotnost protiteles proti HEV v 30 % vzorcev, prisotnost virusne RNA HEV pa le pri enem vzorcu divjega prašica (Žele in sod., 2016). Na Biotehniški fakulteti so v okviru diplomske naloge analizirali 85 vzorcev blata prašicev, pozitivnim vzorcem na RNA HEV dolocili nukleotidno zaporedje in ugotovili, da se vsi sevi uvršcajo v genotip 3 HEV ter da tvorijo posebno skupino znotraj genotipa 3, ki se ne more primerjati z drugimi sevi v genski banki. Ugotavljali so tudi prisotnost virusne RNA HEV v površinskih vodah (Steyer in sod., 2011). Naša raziskava je prva tako obsežna sistematicna raziskava v Sloveniji. Rezultati opravljene raziskave prispevajo k boljšemu razumevanju stanja okužb prašicev s HEV ob vstopu na klavno linijo ter podajajo natancnejšo sliko o prekuženosti prašicev na farmah v opazovanem obdobju. Glede na razmeroma veliko število vzorcev in razpršenost izvora prašicev iz številnih farm po državi lahko z veliko verjetnostjo trdimo, da rezultati podajajo natancen podatek o razširjenosti okužb s HEV pri domacih prašicih v Sloveniji za opazovani casovni interval. Za ugotavljanje specificnih protiteles proti HEV se najpogosteje uporablja encimskoimunski test. Ugotovili smo, da se rezultati 351 nakljucno izbranih vzorcev s celotnega obmocja Slovenije, pregledanih z izbranima komercialnima testoma ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV-IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom, ne ujemajo v 20,80 % (73 vzorcev), rezultati 359 vzorcev, odvzetih pri prašicih ob zakolu v klavnicah, pa v 14,02 % (38 vzorcev). S podobnimi dilemami so se srecevali raziskovalci v Nemciji. V raziskavi so na 321 serumskih vzorcih primerjali delovanje in-house encimskoimunskega testa in komercialnega encimskoimunskega testa proizvajalca Axiom. Rezultati slednjega so pokazali 64,8 % pozitivnih vzorcev, in-house encimskoimunski test pa 43,9 %. Rezultati le 56,07 % (180 vzorcev) pregledanih vzorcev so se ujemali. Nato so nakljucno izbrali 23 vzorcev in jih pregledali še z metodo imunoblot RecomBlot (Mikrogen). V primerjavi je imelo samo sedem vzorcev pozitiven rezultat pri vseh treh metodah (Baechlein in sod., 2010). V drugi raziskavi so primerjali pet razlicnih encimskoimunskih testov, od tega tri komercialno dostopne (proizvajalcev PrioCheck, Axiom in IDvet) in dve in-house metodi. Za primerjavo so uporabili 420 serumskih vzorcev prašicev. Kljub temu, da so z encimskoimunskim testom proizvajalca Axiom dokazali najvecjih 65 % pozitivnih vzorcev na prisotnost specificnih IgG proti HEV, se je med rezultati najbolj razlikoval od drugih encimskoimunskih testov, ki so bili med seboj bistveno bolj primerljivi (Krumbholz in sod., 2013). Do podobnih ugotovitev smo prišli tudi v naši raziskavi, saj primerjava pozitivnih, negativnih in neopredeljivih rezultatov obeh testov kaže, da se rezultati ne ujemajo v 14,02 % pri analizi serumskih vzorcev, odvzetih prašicem ob zakolu v klavnici, oziroma v 20,80 % pri analizi nakljucno izbranih serumskih vzorcev s celotnega obmocja Slovenije, vzorcenih v sklopu rednega monitoringa. Vendar pa je statisticna obdelava podatkov s Fisherjevim eksaktnim testom pokazala, da so rezultati encimskoimunskih testov proizvajalcev IDvet in Axiom mocno statisticno znacilno povezani (p < 0,0001). Pri tem je vrednost koeficienta kappa pri vzorcih monitoringa 0,60, kar pove, da je ujemanje med testoma sprejemljivo, medtem ko je pri vzorcih iz klavnice ujemanje dobro, vrednost koeficienta kappa je 0,75. Ker smo v naši raziskavi uporabili le dva encimskoimunska testa, je bilo iz rezultatov nemogoce sklepati, katera metoda je primernejša za rutinsko diagnostiko v laboratoriju. Podatkov o njuni obcutljivosti in specificnosti nam ni uspelo dobiti od proizvajalcev, prav tako jih nismo zasledili v dostopni literaturi. Ker smo v okviru raziskave kot potrditveni test uvedli modificirano metodo imunoblot (recomLine HEV IgG/IgM proizvajalca Mikrogen diagnostik), smo z njo testirali serumske vzorce iz klavnice in jih opredelili kot pozitivne ali negativne ter na podlagi teh rezultatov izracunali diagnosticno obcutljivost in specificnost obeh encimskoimunskih testov kot tudi pozitivno in negativno napovedno vrednost. Diagnosticna specificnost obeh testov je bila 95,50 %, diagnosticna obcutljivost 94,38 % je bila vecja pri testu proizvajalca Axiom v primerjavi z encimskoimunskim testom proizvajalca IDvet, kjer je znašala 91,88 %. Prav tako sta bili pozitivna in negativna napovedna vrednost vecji pri encimskoimunskem testu proizvajalca Axiom, 96,79 % in 92,17 %, medtem ko sta bili ti vrednosti pri encimskoimunskem testu proizvajalca IDvet 96,71 % in 89,08 %. Glede na izracune specificnosti in obcutljivosti obeh encimskoimunskih testov ocenjujemo, da je test proizvajalca Axiom primernejši za testiranje prašicjih serumov na prisotnost specificnih protiteles proti HEV. Metoda imunoblot recomLine HEV IgG/IgM (Mikrogen diagnostik) je v primeru, da jo ustrezno modificiramo in preverimo, zaradi preproste izvedbe in zanesljivosti, lahko uporabljena kot potrditvena metoda. V prašicji populaciji, v kateri je HEV prisoten, prihaja v vecini primerov do okužbe v starosti prašicev od dveh do treh mesecev, ko maternalna imunost izzveni. Po enem do dveh tednih od okužbe se v serumu okužene živali pojavijo specificna protitelesa. Dosedanje raziskave kažejo, da s starostjo živali prevalenca seropozitivnih živali narašca, zato smo rezultate, ki smo jih dobili z encimskoimunskimi testi, razdelili po starostnih skupinah. Tako smo naše rezultate najlažje primerjali s podatki iz literature. Serumske vzorce smo pridobili iz dveh razlicnih virov, ob zakolu v klavnici ter iz monitoringa kužnih bolezni prašicev. Ker se številcna zastopanost živali v posameznih starostnih skupinah in strukturiranost starostnih skupin pri vzorcih, pridobljenih v klavnici, in vzorcih, pridobljenih iz monitoringa, precej razlikuje ter je nabor rej pri vzorcih iz monitoringa kužnih bolezni bistveno vecji kot pri vzorcih iz klavnice, smo se odlocili, da bomo rezultate obravnavali loceno. Rezultate serumskih vzorcev iz klavnice, pridobljene z encimskoimunskima testoma, smo ob pomoci dobljenih rezultatov z metodo imunoblot lahko ovrednotili kot pozitivne in negativne. V starostni skupini odojkov smo tako dobili 26 % pozitivnih vzorcev, v starostni skupini pitancev 65 % pozitivnih vzorcev in v starostni skupini plemenskih svinj kar 90 % pozitivnih vzorcev. Nekoliko drugacni so rezultati pri serumskih vzorcih monitoringa; izstopajo rezultati plemenskih svinj. Z encimskoimunskim testom proizvajalca IDvet smo namrec dokazali 47 % pozitivnih vzorcev, s testom proizvajalca Axiom pa le 24 %. Upoštevati je treba, da vzorcev, pri katerih se rezultati obeh encimskoimunskih testov niso ujemali (teh je 51 od skupno 189), nismo preverjali z metodo imunoblot, zato rezultatov nismo mogli ovrednotiti, kot smo to storili pri rezultatih, pridobljenih na vzorcih iz klavnice. Predvidevamo, da bi se ta dva deleža bolj približala drug drugemu, ce bi neujemajoce se rezultate preverili z metodo imunoblot. Tudi raziskave iz drugih evropskih držav, opravljene na prašicjih serumih, pri katerih se doloca prisotnost specificnih protiteles proti HEV, kažejo raznolike rezultate. V Nemciji so analizirali 1072 serumskih vzorcev iz 142 prašicjih farm in pri odojkih dobili 16,8 %, pri pitancih 31,3 % in pri plemenskih svinjah 50 % pozitivnih vzorcev (Baechlein in sod., 2010). V Bolgariji so v prvi raziskavi pregledali 433 vzorcev prašicjih serumov; pri odojkih niso uspeli dokazati specificnih protiteles proti HEV, pri pitancih so dobili kar 73,6 % pozitivnih vzorcev (Takova in sod., 2020). V drugi preiskavi so med 360 vzorci potrdili 25 % pozitivnih odojkov, 75,8 % pozitivnih pitancev in 80 % pozitivnih plemenskih svinj (Tsachev in sod., 2019). V Srbiji so analizirali 150 serumskih vzorcev z obmocja Beograda, odvzetih na treh vecjih farmah. Pozitivnih na prisotnost specificnih protiteles proti HEV je bilo 53,3 % odojkov, 83,3 % pitancev in 76,6 % plemenskih svinj (Kureljušic in sod., 2020). V Italiji so pregledali 1442 vzorcev seruma iz 39 farm, pri dvo- do trimesecnih prašickih potrdili 30,8 % pozitivnih živali, pri štiri- do šestmesecnih 41,5 % pozitivnih živali, pri prašicih, starejših od šest mesecev, 30,8 % pozitivnih živali in pri plemenskih svinjah 70,6 % pozitivnih živali, (Martinelli in sod., 2011), od 335 seroloških vzorcev, odvzetih pri šestmesecnih prašicih ob zakolu, pa 76,8 % pozitivnih vzorcev (Chelli in sod., 2021). V Španiji so pregledali 439 serumskih vzorcev iz 41 farm in potrdili 35,7 % pozitivnih odojkov ter 60,8 % pozitivnih plemenskih svinj (Seminati in sod., 2008), v drugi raziskavi pa so med 1141 vzorci seruma ugotovili 30,2 % pozitivnih vzorcev živali starejših od šest mesecev, in 15,5 % pozitivnih vzorcev živali, mlajših od šest mesecev (Jiménez de Oya in sod., 2011). V Franciji so vzorce odvzeli prašicem ob zakolu v klavnici in med 6565 serumskimi vzorci prašicev iz 186 razlicnih farm ugotovili prisotnost specificnih protiteles proti HEV pri 31 % vzorcih (Rose in sod., 2011). Na Danskem so pregledali 213 serumskih vzorcev plemenskih svinj in ugotovili 73,2 % pozitivnih živali (Breum in sod., 2010). Ob podrobnejši analizi teh podatkov vidimo, da rezultati, ki smo jih pridobili po testiranju vzorcev iz starostne skupine odojkov in pitancev, ne izstopajo bistveno iz povprecja zgoraj omenjenih raziskav. Nepricakovani so le rezultati pri plemenskih svinjah, saj smo pri pregledovanju vzorcev iz monitoringa, pri katerem smo imeli številcno veliko skupino (189 živali), z encimskoimunskim testom proizvajalca Axiom dobili rezultat 24 % pozitivnih vzorcev oziroma 47 % s testom proizvajalca IDvet, pri vzorcih iz klavnice, kjer je bila številcnost skupine bistveno manjša (le 40 živali), pa kar 90 % pozitivnih vzorcev. Na ta rezultat gotovo vpliva število razlicnih rej, od koder izvirajo živali, pri katerih smo odvzeli vzorce. V klavnici namrec nismo imeli priložnosti vzorciti živali iz veliko razlicnih rej, obravnavanih 40 vzorcev izhaja od živali iz petih razlicnih rej, od tega iz dveh rej samo po ena žival, iz ene reje štiri živali, iz drugih dveh rej pa preostalih 44 živali. Iz tega lahko sklenemo, da smo podrobneje pogledali situacijo na dveh vecjih farmah in ugotovili visoko prekuženost plemenskih svinj. Drugacna je razporeditev seroloških vzorcev iz monitoringa, pri katerem je skoraj vsaka žival izhajala iz svoje reje (vkljucene so bile manjše reje), vec seroloških vzorcev živali smo analizirali le iz treh vecjih farm. Na podlagi razpršenosti izvora seroloških vzorcev iz monitoringa lahko trdimo, da gre v tem primeru za bistveno vecjo reprezentativnost rej po Sloveniji. Rezultati so pridobljeni iz razmeroma velike skupine (189 prašicev, starejših od 12 mesecev) in se ne ujemajo s pricakovano pojavnostjo specificnih protiteles pri tej kategoriji prašicev. Vecina starejših prašicev naj bi namrec tekom življenja prišla v stik s HEV in pri tem razvila specificna protitelesa, zato je rezultat, ki smo ga dobili v tej starostni skupini pri vzorcih iz monitoringa, nepricakovan. Nenavaden padec protiteles vidimo tudi pri prikazu pozitivnih rezultatov na slikah 19 in 20. Ob tem se poraja vprašanje, ali morda specificna protitelesa proti HEV pri prašicih le niso prisotna v krvi dosmrtno. Najvec protiteles proti HEV smo dokazali v skupini pitancev, ki so okužbo najverjetneje preboleli pred približno tremi meseci, zato je pricakovano, da so protitelesa še vedno prisotna. Pri plemenskih svinjah, pri katerih je bila starost zelo razlicna (od enega leta do štirih let), pa je od okužbe nejverjetneje minilo že vec kot deset mesecev, v dolocenih primerih tudi tri leta, zato je mogoce, da specificnih protiteles proti HEV zaradi nizkega nivoja, s testi ne zaznamo. Seveda bi morali, ce bi želeli to trditev neizpodbitno potrditi, plemenskim svinjam v daljšem casovnem obdobju ponavljajoce vzorciti kri in nato v serumu dolociti nivo specificnih protiteles. Le s takim pristopom bi lahko dokazali dinamiko upadanja specificnih protiteles. Pri razlagi je vseeno treba poudariti, da doloceni delež plemenskih živali zaradi specifike plemenske reje nikoli ne pride v stik z virusom in posledicno ne razvije specificnih protiteles. Dejstvo je, da so plemenske svinje obravnavane kot samostojna kategorija že od samega zacetka vzreje. Gre za živali, ki se redijo za razplod in so bistveno bolj biovarnostno previlegirane, zaradi cesar so podvržene znatno manjšemu tveganju za okužbo s HEV. Vsekakor se ob tem postavlja vprašanje zanesljivih primerjav glede seroprevalence HEV med posameznimi državami, saj so v primerljivih raziskavah v razlicnih državah uporabljeni zelo razlicni encimskoimunski testi, pa tudi nacin vzorcenja in nacrtovanje vzorcnih skupin sta se razlikovala. Naštete spremenljivke imajo znacilen vpliv na rezultate, kar smo jasno prikazali tudi v našem primeru. Za zanesljivejši prikaz prekuženosti s HEV v razlicnih starostnih skupinah prašicev v slovenskih rejah bi tako morali s potrditveno metodo imunoblot preveriti še vse serumske vzorce, pri katerih se rezultati obeh encimskoimunskih testov niso ujemali, in ne samo tistih vzorcev, ki smo jih odvzeli v klavnici ob zakolu. Po pricakovanjih smo najvecji delež pozitivnih vzorcev na prisotnost RNA HEV ugotovili pri odojkih, starih tri mesece. Gre sicer za manjši delež prašicev, ki jih pripeljejo na zakol v klavnico, pa vendar se po podatkih Statisticnega urada Republike Slovenije vsako leto v slovenskih klavnicah zakolje okrog dvajset tisoc odojkov (https://pxweb.stat.si/SiStatData/pxweb/sl/Data/-/1505802S.px/table/tableViewLayout2/). Koliko odojkov se zakolje na domu, ne vemo, vendar lahko sklepamo, da ne gre za majhno število, predvsem v južnem delu Slovenije, kjer je navada peci odojke na ražnju. Pri zakolu na domu vcasih razmere niso najprimernejše in tudi dobre prakse se morda ne upoštevajo povsem dosledno, zato obstaja možnost navzkrižne kontaminacije pri obdelavi trupa. Ce nato odojka na ražnju ne prepecemo dovolj, je to lahko za zdravje potrošnika tvegano. Med 322 pregledanimi živalmi smo našli 13 % (42) pozitivnih vzorcev blata, 12,1 % (39) pozitivnih vzorcev jeter in 13,0 % (40) pozitivnih vzorcev žolca. Pri 17 % (56) od 322 testiranih živali v najmlajši starostni skupini smo ugotovili, da je vsaj ena vrsta vzorca (ali blato ali jetra ali žolc) pozitivna na HEV. Delež pozitivnih vzorcev se med razlicnimi vrstami vzorcev ni bistveno razlikoval. Najvecjo kolicino RNK HEV smo sicer našli v vzorcih žolca, vendar menimo, da je blato predvsem zaradi preprostega nacina odvzema vzorca najprimernejši vzorec za odkrivanje okuženih prašicev, pozitivnih na HEV. V starostni kategoriji šestmesecnih prašicev smo sicer pricakovali manjši delež pozitivnih vzorcev kot pri odojkih, a so nas tako nizke vrednosti kljub vsemu presenetile. Prisotnost virusne RNA HEV smo ugotovili le pri 0,25 % (1) vzorcih jeter in 0,25 % (1) vzorcih žolca od 400 pregledanih živali. Sklepamo, da bi lahko bil vzrok za tako nizek delež pozitivnih živali v tem, da se živali v primeru, da se HEV nahaja v reji endemicno, okužijo že v prvih treh mesecih življenja in so v casu prihoda v klavnico bolezen že prebolele ter niso vec v aktivni fazi izlocanja virusa. V Sloveniji vecina prašicerej spada med manjše reje, imamo le še dve veliki farmi (Štukelj in sod., 2019). V manjših rejah se po navadi živali med seboj mešajo, delavci prehajajo med kategorijami, morda se biovarnost ne upošteva tako strogo in se zato virus hitreje širi; živali se okužijo kmalu po upadu maternalne imunosti. V državah z intenzivnim sistemom in bistveno vecjimi rejami z velikim številom prašicev imajo strožji sistem biovarnosti, tehnološko bolj dovršen sistem reje in zato do okužbe verjetno pride kasneje, ko so prašici že starejši, in tako obstaja vecja verjetnost, da žival pride v zakol v casu viremije. V klavnici smo vzorce odvzeli tudi pri 89 plemenskih svinjah, vsi vzorci blata, jeter in žolca so bili negativni na prisotnost HEV, kar smo tudi pricakovali glede na potek okužb v prašicji populaciji. Do okužbe v vecini primerov pride v prvih mesecih življenja, starejše živali imajo specificna protitelesa, zaradi cesar so zašcitena pred vnovicno okužbo. Živali, ki še niso prišle v stik z virusom, pa imajo kasneje bistveno manj možnosti za okužbo, saj se te živali ne mešajo z mlajšimi starostnimi kategorijami prašicev. Da bi ugotovili, kakšne so epidemiološke razmere v slovenskih klavnicah v primerjavi z drugimi klavnicami po svetu, smo na podlagi rezultatov prisotnosti RNA HEV pri vzorcih, odvzetih prašicem ob zakolu, naše podatke primerjali s tistimi iz drugih držav. Pri primerjavi rezultatov moramo upoštevati, da je metaanaliza med razlicnimi raziskavami prakticno nemogoca tako zaradi razlicnih pristopov vzorcenja (razlicne razporeditve starostnih skupin, vzorcenje skupnih ali individualnih vzorcev, razlicno število zbranih vzorcev) kot tudi razlicnih metod ugotavljanja virusa. V literaturi najvec podatkov najdemo za prašice, stare šest mesecev, oziroma primerne za zakol, kar morda lahko v dolocenih primerih pomeni, da gre za starejše živali. V mnogih raziskavah namrec starost prašicev ni tocno dolocena, kar je seveda velika pomanjkljivost pri interpretaciji in primerjavi rezultatov. V tej starostni skupini se delež pozitivnih vzorcev blata giblje od 3 % do 71,9 %, vendar pa sta raziskavi, iz katerih izhajata rezultata, pregledali manjše število vzorcev in te številke težko upoštevamo kot reprezentativne. Na Ceškem so potrdili 3 % RNA HEV pozitivnih vzorcev blata pri 40 pregledanih vzorcih (Di Bartolo in sod., 2010), 71,9 % pozitivnih vzorcev blata od 30 pregledanih vzorcev pa so našli na Danskem (Breum in sod., 2010). Bolj reprezentativne so vsekakor raziskave, v katerih so vzorcili vecje število prašicev. Na Madžarskem so vzorcili blato pri 248 prašicih v starosti od tri do štiri mesece in pri prašicih, starejših od štirih mesecev, ter pri slednjih potrdili 10 % pozitivnih vzorcev na RNA HEV (Forgách in sod., 2010). Na Slovaškem so odvzeli 388 rektalnih brisov prašicev razlicnih starostnih skupin in v vzorcih pri pitancih ugotovili 14,1 % pozitivnih vzorcev (Jackova in sod., 2021). Na Portugalskem so odvzeli 200 vzorcev blata v razlicnih starostnih skupinah in ugotovili 32 % RNA HEV pozitivnih med pitanci in 4 % pozitivnih med plemenskimi svinjami (Berto in sod., 2012). Pri jetrih se je razpon pozitivnih vzorcev na RNA HEV gibal od 1,25 % do 15,6 % (García in sod., 2017; Di Bartolo in sod., 2010; Berto in sod., 2012; Müller in sod., 2017). V vseh raziskavah, v katerih so analizirali vec kot sto vzorcev, so bili deleži RNA HEV pozitivnih vzorcev jeter precej majhni, 1,25 % v Švici (Müller in sod., 2017), 2,8 % (Feurer in sod., 2018) in 4 % (Rose in sod., 2011) v Franciji. V dveh raziskavah iz Brazilije, kjer so analizirali vecje število vzorcev žolca, je bil razpon rezultatov od 2 % do 10 % pozitivnih vzorcev na prisotnost RNA HEV (Dos Santos in sod., 2011; Gardinalli in sod., 2012). V Španiji so med 45 vzorci jeter dokazali 15,6 % RNA HEV pozitivnih vzorcev (García in sod., 2017). Podatkov o prisotnosti RNA HEV v drugih starostnih skupinah je malo. Na Slovaškem so odvzeli 388 rektalnih brisov prašicev razlicnih starostnih skupin in pri odojkih ugotovili 14,9 % vzorcev, pozitivnih na RNA HEV. Pri plemenskih svinjah niso dokazali pozitivnih vzorcev (Jackova in sod., 2021). Na Portugalskem so odvzeli 200 vzorcev blata v razlicnih starostnih skupinah in ugotovili 20 % pozitivnih vzorcev med odojki in 4 % pozitivnih med plemenskimi svinjami (Berto in sod., 2012). Ocenjujemo, da je bistvena prednost naše raziskave v tem, da smo odvzeli vzorce pri velikem številu prašicev, starostne skupine so bile tocno dolocene, tako da ni dvoma o starosti prašicev pri posamezni skupini, kot tudi, da smo vsakemu prašicu odvzeli po tri razlicne vzorce, blato, jetra in žolc. S tako sistematicnim pristopom k vzorcenju smo dobili dober vpogled v dejansko epidemiološko situacijo in s tem stanje okužb prašicev s HEV ob zakolu v slovenskih klavnicah v letu 2014. V našo raziskavo smo za raziskovanje navzkrižne kontaminacije vkljucili tudi brise površin na treh mestih. Brise kavljev, na katere se obešajo notranji organi po eksenteraciji, brise zabojnikov, kamor se shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu, ter brise kavljev, na katere so obešeni trupi prašicev v hladilnici. Prisotnost RNA HEV smo potrdili pri brisu zabojnika z jetri prašicev in brisu kavlja, na katerega se obešajo notranji organi po eksenteraciji. Oba dneva, ko smo dokazali pozitivna brisa površin, smo prašicem odvzeli tudi vzorce jeter, žolca in blata, ki so bili prav tako pozitivni na prisotnost RNA HEV. Ugotovljeni pozitivni brisi z veliko verjetnostjo dopušcajo možnost kontaminacije in prenosa HEV na klavni liniji ter dokazujejo, da se virus vnaša v klavnico z okuženimi živalmi, ki prek procesa klanja kontaminirajo površine. Tako kontaminirane površine predstavljajo potencialno nevarnost okužbe za delavce ter povecujejo tveganje za prenos HEV na izdelke iz svinjine oziroma svinjskih jeter. V zabojniku, kjer se shranjujejo jetra po veterinarskem pregledu, lahko en sam mocno okužen organ kontaminira jetra drugih živali v zabojniku, ta se namrec dotikajo, iztekata se kri in žolc. Glede na nacin uporabe kavljev, le ti predstavljajo manjšo možnost navzkrižne kontaminacije. Ta vrsta kavljev stalno kroži po klavni liniji in v casu dnevnega zakola veckrat obide linijo. Nanje se obešajo še anatomsko povezana pljuca, srce in jetra z žolcnikom tako, da se obesijo v predelu sapnika, ki ni namenjen za prodajo in morebitna kontaminacija ne predstavlja vecjega tveganja za prenos HEV na cloveka. Vecjo skrb vzbuja dejstvo, da je bila v naši raziskavi dokazana kontaminacija kavljev, kar nakazuje, da gre v takem primeru za veliko kolicino HEV in se ta z veliko verjetnostjo prenaša tudi na rokavice delavcev med rokovanjem z organi, ti pa ga lahko prenesejo na druge dele trupov prašicev. V dostopni literaturi smo naleteli na dve raziskavi, pri katerih so poleg drugih vzorcev analizirali tudi brise razlicnih površin. V Angliji so v klavnici, predelavi in v mesnici odvzeli brise rok delavcev, brise orodij (kavljev, nožev, mesoreznic), tal in delovnih površin. V brisih, odvzetih v klavnici, so potrdili RNA HEV pri enem od štirih brisov rok (25 %). V predelavi so od desetih brisov, odvzetih na razlicnih površinah in orodjih, RNA HEV potrdili na konici kavlja za obešanje trupov. V mesnici pa so RNA HEV potrdili v dveh od osmih brisov (25 %), odvzetih na nožih in mesoreznici (Berto in sod., 2012a). Pri preiskavi, v katero so bile vkljucene Ceška, Španija in Italija, so prav tako poleg drugih vzorcev pregledovali brise površin in rok v klavnici, v predelavi in na koncu verige, pri prodaji. Povsod so potrdili tako pozitivne brise rok kot tudi brise površin, najvecji delež v klavnici (60 %), manjši v predelavi (20 % oziroma 30 %) in najmanj RNA HEV pozitivnih vzorcev pri prodaji (10 %) (Di Bartolo in sod., 2010). Med dostopno strokovno literaturo najdemo veliko raziskav tudi o ugotavljanju HEV v izdelkih, ki vsebujejo meso ali jetra prašicev. V švicarski raziskavi so med klobasami, ki vsebujejo jetra in se sušijo na zraku (mortadella di fegato), našli 11,8 % pozitivnih od 102 vzorcev (Gannini in sod., 2018), med 90 vzorci jetrnih klobas in suhih salam pa 18,9 % oziroma 5,7 % pozitivnih na RNA HEV (Moor in sod., 2018). Na Nizozemskem so analizirali vzorce 316 razlicnih mesnih izdelkov (cervelaat, salami, metworst, snijworst, chorizo in sušene salame) in našli 14,6 % pozitivnih (Boxman in sod., 2020). Prav tako so v drugi Nizozemski raziskavi med 99 vzorci jetrnih klobas potrdili 70,7 % pozitivnih, od 106 vzorcev jetrnih paštet pa 68,9 % pozitivnih (Boxman in sod., 2019). V Nemciji so pregledali 131 mesnih izdelkov in ugotovili 13 % pozitivnih vzorcev jetrnih klobas in 15 % pozitivnih vzorcev jetrnih paštet (Pallerla in sod., 2021), v drugi raziskavi pa 20 % pozitivnih vzorcev suhih salam in 22 % pozitivnih vzorcev jetrnih klobas (Szabo in sod., 2015). V Španiji so med zakolom odvzeli tudi vzorce razlicnih mišic, RNA HEV pa so potrdili le v vzorcu diafragme (García in sod., 2017). V Italiji in na Ceškem pozitivnih vzorcev mesa in salam niso potrdili, medtem ko je bilo v Španiji pozitivnih 6 % vzorcev (Di Bartolo in sod., 2010). V Angliji so v raziskavi našli 10 % pozitivnih vzorcev salam (Berto in sod., 2012a). Pri nacrtovanju naše raziskave smo se odlocili, da bomo vzorcili tudi mleto meso in pecenice. V zasnovi raziskave nismo mogli vedeti, da bomo med vzorci pitancev (katerih meso se uporablja za nadaljnjo predelavo) našli le eno pozitivno žival, saj smo se ozirali na podobne študije in rezultate iz drugih držav, ki so nakazovale višjo prevalenco pozitivnih vzorcev na RNA HEV v tej starostni skupini. Opravljene analize, s katerimi smo dokazali majhen delež okužb pri pitancih, posledicno pojasnijo odsotnost RNA HEV v vzorcih mletega mesa in pecenic. Na pobudo Inštituta za varno hrano, krmo in okolje Veterinarske fakultete se je v letu 2018 izvajal tudi redni nacionalni monitoring na prisotnost HEV v svinjskem mesu in izdelkih iz svinjskega mesa. V sklopu monitoringa smo pregledali 150 vzorcev; sveže meso, mleto meso, mesni pripravki, suhe salame, tlacenka in zaseka, vendar pozitivnega vzorca na RNA HEV nismo našli. Ena od mogocih razlag, poleg prej ugotovljene nizke prevalence med pitanci, ki predstavljajo vecino zaklanih živali, je tudi primernost metode odkrivanja RNA HEV. Literatura namrec navaja, da je izolacija virusne RNA v pripravkih, v katerih se poleg mesa ali jeter uporabljajo tudi druge sestavine, predvsem mašcoba, precej težavna. Vecje košcke mašcobe je zato pred izolacijo nukleinske kisline vedno treba rocno odstraniti iz vzorca. Pri postopku izolacije se je za najbolj kriticen korak izkazala ravno homogenizacija vzorca. Pri tem je najboljše rezultate mogoce doseci z mehansko homogenizacijo (na primer FastPrep homogenizator). Pomembno je k boljši izolaciji prispevala tudi uporaba trizola in kloroforma (Hennechart-Collette in sod., 2019; Althof in sod., 2019). V naši raziskavi smo pri izolaciji uporabljali homogenizacijo s sterilnimi nožki (IKA Ultra Turrax), vzorcu smo dodajali transportni medij RPMI. Testirali smo tudi uporabo trizola in kloroforma, vendar pri rezultatih izolacije nukleinske kisline nismo zaznali bistvenih sprememb. Prašice, katerih vzorce smo odvzeli v klavnici, so v zakol pripeljali iz 81 razlicnih rej. Pri 19 rejah smo zabeležili uvoz iz Nemcije, Slovaške, Nizozemske in Avstrije. V raziskavo smo vkljucili odojke iz 26 rej, RNA HEV pozitivne prašice smo potrdili pri 38,46 % rej. Le v eni od pozitivnih rej smo potrdili dva razlicna podtipa virusa, pri drugih smo našli en sev HEV. V rejah, iz katerih so bili živalim v klavnici veckrat v casovno zaporednih intervalih odvzeti vzorci, smo v vseh primerih ugotovili isti sev virusa, kar potrjuje, da HEV v rejah ostaja vec mesecev. Ob tem je sicer treba upoštevati, da ni šlo za daljše obdobje vzorcenja, temvec najvec za obdobje treh mesecev. Od 125 na HEV pozitivnih vzorcev blata, jeter in žolca smo izbrali 45 vzorcev z najnižjo vrednostjo Ct ter jih sekvencirali v regijah ORF 1 in ORF 2. Ob postavitvi hipotez smo sklepali, da bo raznolikost sevov velika in da bomo med pozitivnimi vzorci potrdili tudi genotip 4 (ki se je v zadnjih letih zacel pojavljati v Evropi), saj se z uvozom prašicev iz drugih evropskih držav v naše reje že vec let vnašajo novi sevi HEV. V Sloveniji se v klavnicah letno zakolje blizu 300.000 prašicev, od tega se jih vsako leto iz drugih držav uvozi od 70.000 do 80.000, kar predstavlja kar cetrtino zakola v klavnicah. Zunanji priliv živih prašicev je torej velik in zato je tudi možnost vnosa novih sevov velika. Z uvozom živih prašicev v državo, se novi sevi ob vhlevitvi tujih živali lahko vnesejo v rejo. Ce so uvožene živali namenjene takojšnjemu zakolu, lahko novi sevi prek klavne linije ter predelave svinjskega mesa in organov s kontaminiranimi izdelki iz svinjine okužijo potrošnika. S pomocjo filogenetskih primerjav, v katere smo vkljucili 45 na HEV pozitivnih vzorcev iz slovenskih klavnic in 47 sevov iz genske banke, smo vse slovenske vzorce, pozitivne na HEV, razporedili v genotip 3, znotraj pa v štiri podtipe. Najvecjo skupino tvori podtip 3a (42 sevov iz klavnice), preostali trije sevi spadajo v podtipe 3b, 3e in 3f. Genotipizacija vzorcev, pozitivnih na HEV (tako živalskih kot humanih) v drugih evropskih državah je pokazala, da se je stanje v zadnjih letih malce spremenilo; podtip 3g je spodrinil podtip 3c. Od leta 2015 so najbolj razširjeni podtipi, ki krožijo med prašici in ljudmi, podtipi 3c, 3f in 3e (Adlhoch in sod., 2016). V Nemciji so leta 2020 med vzorci jeter in mesnih izdelkov, pozitivnih na HEV, ugotovili, da prevladuje podtip 3c. Pri enem vzorcu so našli podtip 3f, katerega nukleotidno zaporedje je bilo najbližje belgijskim vzorcem, zavedenim v genetski banki (Pallerla in sod., 2021). Nekaj let pred tem so v mesnih izdelkih prav tako našli podtipa 3c, 3f in tudi podtip 3i (Szabo in sod., 2015). Na Nizozemskem so leta 2009 iz blata prašicev izolirali RNA HEV in poleg podtipov 3a, 3c in 3f, za katere so že iz prejšnjih raziskav vedeli, da se pojavljajo v državi, našli tudi podtip 3e (Rutjes in sod., 2014). V novejši raziskavi iz leta 2020, v kateri so pregledovali mesne izdelke iz svinjskega mesa, so ugotovili le podtip 3c (Boxman in sod., 2020). Clanek iz leta 2018 opisuje raziskavo iz francoskih klavnic, v kateri so med vzorci jeter ugotovili podtipe 3c, 3e, 3f in prvic v Franciji tudi podtip 3j (Feurer in sod., 2018). V Španiji v vzorcih blata in jeter iz klavnice navajajo pojav podtipa 3f (García in sod., 2017). Zbrane informacije o okužbi s HEV med ljudmi v Bolgariji so razkrile pojav podtipov 3e, 3f, 3c in 3i (Baymakova in sod., 2019). Med raziskovanjem literature o stanju v sosednjih državah smo našli relevantne informacije le o Italiji, Hrvaški, tudi o Madžarski, vendar pa so podatki nekoliko starejši (iz leta 2010). Sekvence iz italijanske raziskave (de Sabato in sod., 2018) smo vkljucili v naše filogenetsko drevo (Slika 23), hrvaške in madžarske sekvence pa so bile žal prekratke in jih zato nismo mogli primerjati z našimi. V Italiji so med divjimi prašici potrdili podtipa 3c in 3f (de Sabato in sod., 2018), med domacimi prašici ob zakolu v klavnicah pa podtip 3c (Chelli in sod., 2021). Obširnejša raziskava na Hrvaškem, v kateri so zajeli serumske vzorce ljudi, ter feces in kri domacih prašicev kot tudi kri divjih prašicev, je razkrila štiri podtipe. Najpogosteje sta se pojavljala podtipa 3a (pri ljudeh, domacih in divjih prašicih) in 3c (pri ljudeh in domacih prašicih). Redkeje sta se pojavljala podtipa 3e (pri ljudeh, domacih in divjih prašicih) in 3f (samo pri ljudeh), zato so sklepali, da gre za na novo vnesene okužbe v državo (Jemeršic in sod., 2019). Na Madžarskem so med vzorci blata in jeter domacih in divjih prašicev ugotovili podtip 3a, kamor se je uvršcala vecina vzorcev, drugi pa v podtipa 3e in 3h (Forgách in sod., 2010). O razmerah v Avstriji je znano zelo malo. Edini podatki v dostopni literaturi zajemajo manjše število vzorcev humanega seruma (kri za transfuzijo), v katerih so dolocili podtip 3f (Fischer in sod., 2015). Glede na razmere v drugih evropskih državah nas v osnovi naši rezultati niso presenetili. Podtipa 3e in 3f se pojavljata po vsej Evropi. Naš vzorec, ki smo ga uvrstili v podtip 3e, se je v regiji ORF 1 najbolj ujemal s serumskim vzorcem divjega prašica iz Nemcije s številko vnosa JQ807514, v regiji ORF 2 pa z vzorcem blata domacega prašica iz Italije s številko vnosa KJ174068. Pri obeh primerih smo ugotovili visoko ujemanje nukleotidnih zaporedij (95 % in vec). Vzorec, ki smo ga uvrstili v podtip 3f, se je v regiji ORF 1 najbolj ujemal s humanimi vzorci iz Singapurja, Danske in Francije, v regiji ORF 2 pa s prašicjim vzorcem iz Švedske in Poljske ter humanim vzorcem iz Francije. Pri teh vzorcih je šlo za nekoliko manjše ujemanje nukleotidnih zaporedij (92 %). V naši raziskavi smo v podtipa 3e in 3f uvrstili po en vzorec, kar kaže na to, da najverjetneje podtipa 3e in 3f po državi še nista mocno razširjena, morda gre za novejši vnos teh sevov z okuženimi prašici ob uvozu. Podtip 3a (v katerega je spadala vecina naših vzorcev) sicer ni tako razširjen po Evropi, je pa med najpogosteje ugotovljenimi podtipi v naših sosednjih državah, na Hrvaškem in Madžarskem. Reprezentativni vzorec iz skupine podtipa 3a (4 SLO-18-F) se je v regiji ORF 1 najbolj ujemal z vzorcem jeter divjega prašica iz Madžarske (EU718647), v regiji ORF 2 pa z vzorcem rektalnega brisa prašica iz Slovaške (MT408280). V obeh primerih je bilo ujemanje nukleotidnih zaporedij 95 %. Presenetil pa nas je rezultat vzorca 8 SLO-13-B, ki smo ga na podlagi filogenetskega drevesa in primerjave z referencnimi vzorci uvrstili v podtip 3b. Ta je bil prvic (in edinkrat) opisan pri divjih prašicih v Evropi (vzorci krvi divjih prašicev z južne obale Baltika) leta 2015 (Vina-Rodriguez in sod., 2015), znan je tudi en humani izolat okuženega pacienta iz Francije (Legrand-Abravanel in sod., 2009). Drugace gre za podtip, ki je znacilen za Japonsko (Nakano in sod., 2012), pojavlja pa se tudi v Braziliji (Lopes Dos Santos in sod., 2010). Primerjava našega vzorca z nukleotidnimi zaporedji v genski banki je v regiji ORF 1 pokazala 92-odstotno ujemanje z vzorcem krvi krvodajalca iz Japonske (AB630971), v regiji ORF 2 pa z vzorcem prašicjega seruma iz Japonske (AB194500). V obeh primerih je šlo za manjše ujemanje nukleotidnih zaporedij, 91 %. V enakem odstotku so se nukleotidna zaporedja našega vzorca ujemala z vzorcem žolca prašica iz Hrvaške (HQ591364), kar bi morda lahko pojasnilo izvor in pojav tega podtipa pri nas, ceprav se naceloma pojavlja na Japonskem. Z Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani so nam posredovali pet humanih izolatov, pozitivnih na prisotnost RNA HEV. Vsi vzorci so bili šibko pozitivni na RNA HEV z metodo RT-PCR v realnem casu. Humanim vzorcem smo poskušali dolociti nukleotidno zaporedje, vendar nam zaradi majhne kolicine virusne RNA HEV pri nobenem humanem vzorcu to ni uspelo. Zato nam tudi ni uspelo narediti primerjave nukleotidnih zaporedij humanih vzorcev z našimi prašicjimi vzorci, s cimer bi pridobili dodaten vpogled v razmere v Sloveniji, predvsem v smislu potrditve domnev, da se HEV lahko prenaša med prašici in clovekom prek prehranske verige. Posledicno težko razpravljamo o tem, ali se v Sloveniji enaki sevi pojavljajo pri prašicih in ljudeh in ali je vzrok za pojav okužb s HEV pri ljudeh zoonotski prenos. Možnost za okužbo cloveka prek hrane obstaja, to smo namrec dokazali s potrditvijo pozitivnih vzorcev ob zakolu prašicev, vendar bi dokaz podobnih sevov pri prašicih in ljudeh to domnevo dodatno potrdil. Leta 2019 je bila na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino izvedena študija o prisotnosti okužbe s HEV med slovenskimi krvodajalci (Primc, 2020). Dokazovali so tako virusno RNA kot tudi prisotnost protiteles IgG. Med 8817 krvodajalci so pri petih potrdili prisotnost virusne RNA v krvi. Pri treh so dokazali podtip 3a, pri enem podtip 3f, kar sovpada tudi z našimi rezultati genotipizacije prašicjih vzorcev. Iz teh podatkov lahko z doloceno verjetnostjo sklepamo, da med ljudmi in prašici krožijo nekateri enaki sevi HEV (Štukelj in sod., 2019). 6 SKLEPI Na podlagi zastavljenih hipotez so naši zakljucki naslednji: 1. Z dvema komercialno dostopnima encimsko imunskima testoma (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom) smo na prisotnost protiteles proti HEV pregledali 710 serumskih vzorcev prašicev. Iz serije vzorcev, ki so bili odvzeti na obmocju Slovenije v sklopu rednega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014, smo nakljucno izbrali 351 vzorcev, 359 vzorcev pa smo odvzeli ob zakolu prašicev v klavnicah. Med 351 nakljucno izbranimi vzorci iz monitoringa smo potrdili 94 (26,78 %) pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), 184 (52,42 %) negativnih rezultatov (negativni z obema encimskoimunskima testoma), pri 73 (20,80 %) vzorcih se rezultati niso ujemali. Med 271 vzorci iz klavnice smo potrdili 125 (46,13 %) pozitivnih rezultatov (pozitivni z obema encimskoimunskima testoma), 103 (38,01 %) negativne rezultate (negativni z obema encimskoimunskima testoma), pri 38 (14,02 %) vzorcih se rezultati niso ujemali. Statisticna primerjava rezultatov obeh encimskoimunskih testov vsake posamezne skupine je pokazala, da so rezultati testov mocno statisticno znacilno povezani. Zastavljeno hipotezo, da dva komercialna testa ELISA za dokazovanje protiteles proti HEV v serumu prašicev dajeta primerljive rezultate, smo potrdili. 2. Z metodo RT-PCR v realnem casu smo na prisotnost HEV pregledali 811 prašicev. Pri vsakem prašicu na klavni liniji smo odvzeli tri vrste vzorcev: blato, jetra in žolc ter 63 vzorcev brisov površin (brisi kavljev, na katere se obešajo notranji organi po eksenteraciji, brisi zabojnikov, v katere se shranjujejo jetra prašicev po veterinarskem pregledu ter brisi kavljev, na katere so obešeni trupi prašicev v hladilnici), 22 vzorcev mletega mesa in 30 vzorcev pecenic. RNA HEV smo ugotovili v 44 vzorcih blata, 40 vzorcih jeter, 43 vzorcih žolca in pri dveh brisih površin (pozitiven bris zabojnika z jetri in pozitiven bris kavlja na liniji). V nobenem od odvzetih 22 vzorcev mletega mesa in 30 vzorcev pecenic nismo ugotovili prisotnosti RNA HEV. Najvec na HEV pozitivnih živali smo odkrili med odojki, in sicer 17,39 % (56) od 322 testiranih odojkov. V tej starostni skupini smo namrec ugotovili 42 (13,04 %) pozitivnih vzorcev blata, 39 (12,11 %) pozitivnih vzorcev jeter in 40 (12,42 %) pozitivnih vzorcev žolca. V starostni skupini pitancev smo našli samo eno (0,25 %) pozitivno žival, pri kateri smo ugotovili pozitiven vzorec jeter in pozitiven vzorec žolca. S temi rezultati smo potrdili hipotezo, da je nukleinska kislina HEV prisotna v razlicnih vzorcih na klavni liniji ob zakolu prašicev. 3. Med 125 ugotovljenimi pozitivnimi vzorci na HEV z metodo RT-PCR v realnem casu smo izbrali 45 vzorcev in jim dolocili 366 nt (ORF 1) oziroma 300 nt (ORF 2) dolga nukleotidna zaporedja. S pomocjo filogenetskih primerjav smo ugotovili, da vsi naši sevi spadajo v genotip 3 in se razvršcajo v štiri podtipe: 3a, 3b, 3e in 3f. Genotipa 4 nismo ugotovili. Z Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani smo prejeli pet humanih vzorcev serumov, pozitivnih na prisotnost HEV, pri katerih nam zaradi premajhne kolicine virusne RNA HEV ni uspelo dolociti nukleotidnega zaporedja, zato nam primerjave prašicjih in humanih sevov v tej raziskavi ni uspelo izvesti. V pomoc pri razlagi naših rezultatov in ugotavljanju sorodnosti sevov HEV, ki se pojavljajo pri prašicih in ljudeh v Sloveniji, so nam bili podatki o dokazanih podtipih 3a in 3f (študija o prisotnosti okužbe s HEV med slovenskimi krvodajalci na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino). S temi rezultati smo hipotezo, da virusi HEV v Sloveniji spadajo v genotipa 3 in 4 ter da se isti sevi pojavljajo pri prašicih in cloveku, delno potrdili. 7 POVZETEK V prvem delu izvedene raziskave smo v serumskih vzorcih ugotavljali prisotnost protiteles proti HEV. Poleg 351 serumskih vzorcev prašicev, odvzetih ob zakolu leta 2014, smo pregledali še 359 serumskih vzorcev, nakljucno izbranih iz vzorcev rednega monitoringa kužnih bolezni pri prašicih v letih 2013 in 2014. Prašici za zakol so najveckrat izhajali iz rej podravske in prekmurske regije, medtem ko so bili vzorci iz monitoringa bolj enakomerno porazdeljeni po vsej Sloveniji. Serumske vzorce smo testirali z dvema encimskoimunskima testoma (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species proizvajalca IDvet in HEV IgG ELISA porcine proizvajalca Axiom), vzorce, odvzete ob zakolu v klavnici, smo dodatno preverili še z modificirano metodo imunoblot. Med vzorci prašicev ob prihodu v zakol smo v starostni skupini odojkov potrdili 26 % pozitivnih vzorcev, v starostni skupini pitancev 65 % in v starostni skupini plemenskih svinj kar 90 % pozitivnih vzorcev. Med vzorci iz monitoringa smo pri mlajših od šest mesecev potrdili 12 % (IDvet) oziroma 8 % (Axiom) pozitivnih vzorcev, pri starosti od šest do dvanajst mesecev 51,35 % (IDvet) oziroma 40,54 % (Axiom) pri starejših od dvanajst mesecev pa 46,56 % (IDvet) oziroma 24,34 % (Axiom). Razliko v rezultatih med skupinama vzorcev (klavnica in monitoring) smo pripisali razlicnemu številu živali v posameznih starostnih skupinah in razlicnemu številu rej od koder so izvirali vzorci (pri vzorcih iz monitoringa je šlo za vecje število rej kot pri vzorcih iz klavnice). V drugem delu smo vzorce blata, jeter, žolca, mletega mesa, pecenic in brisov površin, ki smo jih odvzeli v štirih slovenskih klavnicah leta 2014, z metodo RT-PCR v realnem casu preiskali na prisotnost RNA HEV. Testirali smo vzorce 322 odojkov, 400 pitancev in 89 plemenskih svinj. Od 322 pregledanih odojkov smo HEV dokazali pri 56 (17,39 %) prašicih, natancneje v 42 (13,94 %) vzorcih blata, 39 (12,11 %) vzorcih jeter in 40 (12,42 %) vzorcih žolca. V skupini pitancev smo našli samo eno pozitivno žival, pri kateri smo ugotovili pozitiven vzorec jeter in vzorec žolca. Med plemenskimi svinjami nismo našli pozitivne živali na HEV. Med 63 brisi površin smo našli dva (3,18 %) pozitivna brisa, en bris kavljev, na katere se obešajo notranji organi prašicev po veterinarskem pregledu in en bris zabojnika, v katerem se zbirajo jetra prašicev po veterinarskem pregledu. Med vzorci mletega mesa in pecenic nismo našli pozitivnega vzorca, treba pa je poudariti, da se pri njihovi pripravi uporablja le meso pitancev, ne pa tudi odojkov, ki se je izkazala za najbolj tvegano starostno skupino, v kateri smo ugotovili prisotnost HEV. Najdba razlicnih vrst pozitivnih vzorcev je potrdila naš sum, da klinicno zdravi prašici vnašajo HEV v klavnico in so lahko potencialno nevarni za potrošnika in delavce v obratu. V tretjem delu raziskave smo med 125 pozitivnimi vzorci prašicev iz klavnice izbrali 45 tistih z najvecjo kolicino virusne RNA (z najnižjo vrednostjo Ct), jim dolocili nukleotidno zaporedje in jih primerjali z nukleotidnimi zaporedji referencnih sevov vsakega posameznega genotipa v genski banki. Na podlagi filogenetske primerjave v ORF 1 (366 nt) in ORF 2 (300 nt) smo slovenske seve uvrstili v štiri podtipe: 3a (42 vzorcev), 3b (en vzorec), 3e (en vzorec) in 3f (en vzorec). Z Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani so nam posredovali pet humanih vzorcev seruma, pozitivnih na HEV, vendar nam zaradi premajhne kolicine nukleinske kisline HEV v njih ni uspelo dolociti nukleotidnega zaporedja. Na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino izvedena študija o prisotnosti okužbe s HEV med slovenskimi krvodajalci je pokazala prisotnost podtipov 3a in 3f, kar sovpada z ugotovitvami naše študije. V sosednjih državah prevladujejo podtipi 3a, 3e, 3f, ponekod tudi 3c. Pri analiziranju rezultatov nas je najbolj presenetil podtip 3b, ki je znacilen za Japonsko, nekajkrat pa so ga že potrdili tudi v posameznih evropskih državah, med drugim v sosednji Hrvaški. Prednost izvedene raziskave je v sistematicni izvedbi vzorcenja v klavnici, ki je vkljucevalo veliko število in razlicne vrste vzorcev. Z rezultati smo razjasnili do sedaj nepoznane razmere glede okužb s HEV pri prašicih ob vstopu v klavnice v Sloveniji in podali natancnejše podatke o prekuženosti v slovenskih rejah v dolocenem obdobju. 8 SUMMARY In the first part of our research we used two ELISA tests to assess the presence of HEV antibodies in porcine blood samples. We analyzed 351 serum samples collected from pigs at slaughter and 359 serum samples randomly selected from samples of annual monitoring for infectious pig diseases in 2013 and 2014. Pigs at slaughter came mostly from podravska and pomurska regions, while samples from monitoring were more evenly distributed throughout the country. Serum samples were tested with two ELISA tests (ID Screen® Hepatitis E Indirect Multi-species (IDvet) in HEV IgG ELISA porcine (Axiom)). Serum samples from pigs at slaughter showed 26% positive samples in the age group of 3 month old pigs, 65% positive samples in the age group of 6 months old pigs and 90% positive samples in pigs 1 year and older. Samples from monitoring showed 10% positive samples in pigs up to 6 months old, 45% positive samples in pigs from 6 to 12 months old and 47% (IDvet) or 24% (Axiom) in pigs older than 1 year. We assumed that the difference between both groups of samples was a consequence of the different number of animals in each age group and the uneven distribution of pig farms. In the second part of our research feces, liver, bile samples, surface swabs, samples of minced meat and sausages that were collected in four Slovenian slaughterhouses in 2014 were analyzed with real time RT-PCR for the presence of HEV RNA. We analyzed 322 pigs that were 3 months old, 400 pigs that were 6 months old and 89 pigs older than 1 year. Out of 322 3 month old pigs, HEV RNA was present in 56 pigs, that is in 42 feces samples, 39 liver samples and 40 bile samples. In the group of 6 month old pigs we found only 1 pig positive for the presence of HEV RNA (one liver and one bile sample) and none in the group older than 1 year. Out of 63 surface swab samples, 2 were found positive for the presence of HEV RNA (a hook where internal organs are hung after evisceration and a metal container where livers are stored after post mortem inspection). There were no positive samples found in minced meat and sausages, but it should be emphasized that only meat from 6 month old pigs is used in the production of these. 3 month old pigs, that seem to be, on the basis of our results, the age group with the highest risk of harboring an HEV infection, were not used in the production of swine meat products. However, the fact that different positive samples were found during slaughter, confirmed our suspicion that HEV positive pigs do in fact enter into the slaughterhouse and thus present a potential risk for slaughterhouse personnel and consumers. In the third part of our research 45 positive samples obtained from slaughterhouses were selected and two regions of the viral genome, ORF 1 and ORF 2, were amplified. A phylogenetic comparison of the selected samples with nucleotide sequences obtained from GeneBank allowed classification of the obtained samples into four subtypes of genotype 3: 3a (42 samples), 3b (1 sample), 3e (1 sample) and 3f (1 sample). We obtained 5 HEV positive human samples from the Institute for microbiology and immunology of Medical faculty of University of Ljubljana, however, the amount of viral RNA was insufficient for efficient sequencing and we were therefor not able to compare sequences to those found in analyzed porcine samples. Interestingly, research conducted on serum samples of Slovenian blood donors showed the presence of subtypes 3a and 3f in selected blood samples, which is in concordance with our results. In our neighboring countries the prevalent subtypes are 3a, 3e, 3f, in some parts even 3c. We were surprised to find the subtype 3b, which is typical for Japan, although it has been found a few times in Europe, even in neighboring Croatia. We believe that systematical and broad sampling of porcine samples has helped to clarify the status of HEV infection of pigs entering slaughterhouses, which has not been systemically addressed to date, and also the serological situation regarding HEV in pig farms in Slovenia in general. 9 ZAHVALE Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Andreju Kirbišu za vso pomoc, da je verjel vame tudi takrat, ko sama nisem, kot tudi somentorju izr. prof. dr. Ivanu Toplaku za vso strokovno pomoc, usmerjanje in cas, ki si ga je vzel zame, kadarkoli sem ga potrebovala. Clanom komisije izr. prof. dr. Kseniji Šinigoj Gacnik, prof. dr. Tadeju Malovrhu in prof. dr. Mariu Poljaku se zahvaljujem za podroben pregled doktorske naloge ter vso konstruktivno kritiko zaradi katere je naloga postala boljša. Zahvaljujem se vsem mojim sodelavcem, ki so me poslušali, ko mi je bilo že vsega dovolj, me spodbujali in prevzeli moje delo v laboratoriju, da sem lahko v miru sedela za racunalnikom. Manja, tebi posebna zahvala za pomoc pri vzorcenju, zbiranju slikovnega materiala in klavniške debate, ki jih le redki razumejo. Za pomoc pri statisticni obdelavi podatkov se zahvaljujem cimri Tanji Knific. Na tem mestu bi omenila še mojo drugo cimro Urško Henigman, hvala da si me poslušala in poslušala in bodrila. Za vso nepogrešljivo pomoc pri zbiranju vzorcev v klavnicah se iz srca zahvaljujem kolegu Zoranu Žlabravcu, ki se je kljub temu, da je vedel, da bo moral dneve zaceti zelo zgodaj, odlocil pomagati. Za pomoc pri zbiranju vzorcev se zahvaljujem tudi vsem uradnim veterinarjem ter preostalim delavcem v klavnicah. Hvala puncam iz virologije, Danijeli, Nataliji in Poloni, za vso pomoc v podtlaku, kadar se mi je kaj zataknilo in nisem vedela kako naprej. Hvala Biljani Grubšic in dr. Mateji Stvarnik za vse odgovore na moja neskoncna vprašanja, za opominjanje na roke in pomoc pri lovljenju le teh. Mateja, letos na Loparju nazdravimo name! Za hiter pregled literature in vse napotke se zahvaljujem mag. Giti Grecs-Smole, za lektoriranje Saši Kozarov. Za to, da sem danes kjer sem, se zahvaljujem mojima staršema, ki sta me vedno spodbujala, da se potrudim in naredim najvec kar lahko. Kljub temu, da je trajalo nekoliko dlje kot je bilo sprva nacrtovano, mi je uspelo. Ati, hvala za vso tvojo pomoc. Mami, želim si, da bi bila tukaj z nami. Hvala tudi vsem ostalim clanom moje družine, mojim navijacem, Sari, Tjašu, Mariji, mami. Za vso ljubezen, podporo, animiranje otrok, medtem ko sem pisala oziroma vcasih samo poskušala pisati, za vse izrecene in neizrecene besede ob pravih trenutkih, se zahvaljujem mojemu cudovitemu možu. Mojima hcerkama, Emi in Tinkari, hvala za vso brezpogojno ljubezen, ki mi vedno polepša še tako sive dni. Življenje se vcasih obrne v nepricakovano smer. Brez vas treh tega doktorata gotovo ne bi zakljucila. 10 LITERATURA 1. Adlhoch C, Avellon A, Baylis SA et al. Hepatitis E virus: assessment of the epidemiological situation in humans in Europe, 2014/15. J Clin Virol 2016; 82: 9–16. 2. Althof N, Trojnar E, Böhm T, et al. Interlaboratory validation of a method for hepatitis E virus RNA detection in meat and meat products. Food Environ Virol 2019; 11(1): 1–8. doi: 10.1007/s12560-018-9360-6 3. Andraud M, Dumarest M, Cariolet R, et al. Direct contact and environmental contaminations are responsible for HEV transmission in pigs. Vet Res 2013; 44(1): e102. doi: 10.1186/1297-9716-44-102 4. Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides 2015; 72: 4–15. 5. Baechlein C, Schielke A, Johne R, Ulrich RG, Baumgaertner W, Grummer B. Prevalence of hepatitis E virus-specific antibodies in sera of German domestic pigs estimated by using different assays. Vet Microbiol 2010; 144(1/2): 187–91. 6. Bartlett JM, Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol 2003; 226: 3–6. doi: 10.1385/1-59259-384-4:3. 7. Baymakova M, Popov GT, Pepovich R, Tsachev I. Hepatitis E virus infection in Bulgaria: a brief analysis of the situation in the country. Open Access Maced J Med Sci 2019; 7(3): 458–60. 8. Berto A, Backer JA, Mesquita JR, et al. Prevalence and transmission of hepatitis E virus in domestic swine populations in different European countries. BMC Res Notes 2012; 5: e190. doi: 10.1186/1756-0500-5-190 9. Berto A, Martelli F, Grierson S, Banks M. Hepatitis E virus in pork food chain, United Kingdom, 2009–2010. Emerg Infect Dis 2012a; 18(8): 1358–60. 10. Bouwknegt M, Teunis PF, Frankena K, de Jong MC, de Roda Husman AM. Estimation of the likelihood of fecal-oral HEV transmission among pigs. Risk Anal 2011; 31(6): 940–50. 11. Boxman ILA, Jansen CCC, Hägele G, Zwartkruis-Nahuis A, Tijsma ASL, Vennema H. Monitoring of pork liver and meat products on the Dutch market for the presence of HEV RNA. Int J Food Microbiol 2019; 296: 58–64. 12. Boxman ILA, Jansen CCC, Zwartkruis-Nahuis AJT, Hägele G, Sosef NP, Dirks RAM. Detection and quantification of hepatitis E virus RNA in ready to eat raw pork sausages in the Netherlands. Int J Food Microbiol 2020; 333: e108791. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108791 13. Breum SŘ, Hjulsager CK, de Deus N, Segalés J, Larsen LE. Hepatitis E virus is highly prevalent in the Danish pig population. Vet Microbiol 2010; 146(1/2): 144–9. 14. Chandra V, Taneja S, Kalia M, Jameel S. Molecular biology and pathogenesis of hepatitis E virus. J Biosci 2008; 33(4): 451–64. 15. Chelli E, Suffredini E, De Santis P, et al. Hepatitis E virus occurrence in pigs slaughtered in Italy. Animals (Basel) 2021; 11(2): e277. doi: 10.3390/ani11020277. 16. Clemente-Casares P, Ramos-Romero C, Ramirez-Gonzalez E, Mas A. Hepatitis E virus in industrialized countries: the silent threat. Biomed Res Int 2016; 2016: e9838041. doi: 10.1155/2016/9838041 17. Colson P, Romanet P, Moal V, et al. Autochthonous infections with hepatitis E virus genotype 4, France. Emerg Infect Dis 2012; 18(8): 1361–4. 18. Cook N, van der Poel WH. Survival and elimination of hepatitis E virus: a review. Food Environ Virol 2015; 7(3): 189–94. 19. Cossaboom CM, Córdoba L, Sanford BJ, et al. Cross-species infection of pigs with a novel rabbit, but not rat, strain of hepatitis E virus isolated in the United States. J Gen Virol 2012; 93(Pt 8): 1687–95. 20. Crossan C, Baker PJ, Craft J, Takeuchi Y, Dalton HR, Scobie L. Hepatitis E virus genotype 3 in shellfish, United Kingdom. Emerg Infect Dis 2012; 18(12): 2085–7. 21. Dalton HR, Bendall R, Ijaz S, Banks M. Hepatitis E: an emerging infection in developed countries. Lancet Infect Dis 2008; 8(11): 698–709. 22. de Deus N, Casas M, Peralta B, et al. Hepatitis E virus infection dynamics and organic distribution in naturally infected pigs in a farrow-to-finish farm. Vet Microbiol 2008; 132(1/2): 19–28. doi: 10.1016/j.vetmic.2008.04.036. 23. De Sabato L, Ostanello F, De Grossi L, et al. Molecular survey of HEV infection in wild boar population in Italy. Transbound Emerg Dis 2018; 65(6): 1749–56. 24. Di Bartolo I, Diez-Valcarce M, Vasickova P, et al. Hepatitis E virus in pork production chain in Czech Republic, Italy, and Spain, 2010. Emerg Infect Dis 2012; 18(8): 1282–9. 25. Doceul V, Bagdassarian E, Demange A, Pavio N. Zoonotic hepatitis E virus: classi.cation, animal reservoirs and transmission routes. Viruses 2016; 8(10): 270. doi: 10.3390/v8100270 26. Donnelly MC, Scobie L, Crossan CL, Dalton H, Hayes PC, Simpson KJ. Review article: hepatitis E-a concise review of virology, epidemiology, clinical presentation and therapy. Aliment Pharmacol Ther 2017; 46(2): 126–41. 27. dos Santos DR, de Paula VS, de Oliveira JM, Marchevsky RS, Pinto MA. Hepatitis E virus in swine and effluent samples from slaughterhouses in Brazil. Vet Microbiol 2011; 149(1/2): 236–41. 28. Feagins AR, Opriessnig T, Huang YW, Halbur PG, Meng XJ. Cross-species infection of specific-pathogen-free pigs by a genotype 4 strain of human hepatitis E virus. J Med Virol 2008; 80(8): 1379–86. 29. Ferri G, Vergara A. Hepatitis E virus in the food of animal origin: a review. Foodborne Pathog Dis 2021; 18(6): 368–77. 30. Feurer C, Le Roux A, Rossel R, et al. High load of hepatitis E viral RNA in pork livers but absence in pork muscle at French slaughterhouses. Int J Food Microbiol 2018; 264: 25–30. 31. Fischer C, Hofmann M, Danzer M, Hofer K, Kaar J, Gabriel C. Seroprevalence and Incidence of hepatitis E in blood donors in Upper Austria. PLoS One 2015; 10(3): e0119576. doi: 10.1371/journal.pone.0119576 32. Forgách P, Nowotny N, Erdélyi K, et al. Detection of hepatitis E virus in samples of animal origin collected in Hungary. Vet Microbiol 2010; 143(2/4): 106–16. 33. Gao S, Li D, Zha E, Zhou T, Wang S, Yue X. Surveillance of hepatitis E virus contamination in shellfish in China. Int J Environ Res Public Health 2015; 12(2): 2026–36. 34. Garbuglia AR, Scognamiglio P, Petrosillo N, et al. Hepatitis E virus genotype 4 outbreak, Italy, 2011. Emerg Infect Dis 2013; 19(1): 110–4. 35. García N, Hernández M, Gutierrez-Boada M, et al. Occurrence of hepatitis E virus in pigs and pork cuts and organs at the time of slaughter, Spain, 2017. Front Microbiol 2020; 10: e2990. doi: 10.3389/fmicb.2019.02990 36. Gardinali NR, Barry AF, Otonel RA, Alfieri AF, Alfieri AA. Hepatitis E virus in liver and bile samples from slaughtered pigs of Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2012; 107(7): 935–9. 37. Garibyan L, Avashia N. Polymerase chain reaction. J Invest Dermatol 2013; 133(3): 1–4. doi: 10.1038/jid.2013.1. 38. Geng Y, Wang Y. Epidemiology of hepatitis E. Adv Exp Med Biol 2016a; 948: 39–59. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_3 39. Geng Y, Wang Y. Transmission of hepatitis E virus. Adv Exp Med Biol 2016; 948: 89–112. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_6 40. Giannini P, Jermini M, Leggeri L, Nüesch-Inderbinen M, Stephan R. Detection of hepatitis E virus RNA in raw cured sausages and raw cured sausages containing pig liver at retail stores in Switzerland. J Food Prot 2018; 81(1): 43–5. 41. Hakze-van der Honing RW, van Coillie E, Antonis AF, van der Poel WH. First isolation of hepatitis E virus genotype 4 in Europe through swine surveillance in the Netherlands and Belgium. PLoS One 2011; 6(8): e22673. doi: 10.1371/journal.pone.0022673. 42. Hennechart-Collette C, Fraisse A, Guillier L, Perelle S, Martin-Latil S. Evaluation of methods for elution of HEV particles in naturally contaminated sausage, figatellu and pig liver. Food Microbiol 2019; 84: e103235. doi: 10.1016/j.fm.2019.05.019 43. Huang FF, Haqshenas G, Guenette DK, et al. Detection by reverse transcription-PCR and genetic characterization of field isolates of swine hepatitis E virus from pigs in different geographic regions of the United States. J Clin Microbiol 2002; 40(4): 1326–32. 44. Jackova A, Dudasova K, Salamunova S, Mandelik R, Novotny J, Vilcek S. Identification and genetic diversity of hepatitis E virus in domestic swine from Slovakia. BMC Vet Res 2021; 17(1): e232. doi: 10.1186/s12917-021-02936-4 45. Jamnikar Ciglenecki U, Mankoc Ramuš S, Barlic Maganja D. Detection of hepatitis E virus in Slovenian pig herds. Int J Infect Dis 2008; 12(1): 138–9. 46. Jemeršic L, Prpic J, Brnic D, Keros T, Pandak N, Đakovic Rode O. Genetic diversity of hepatitis E virus (HEV) strains derived from humans, swine and wild boars in Croatia from 2010 to 2017. BMC Infect Dis 2019; 19(1): e269. doi: 10.1186/s12879-019-3906-6 47. Jiménez de Oya N, de Blas I, Blázquez AB et al. Widespread distribution of hepatitis E virus in Spanish pig herds. BMC Res Notes 2011; 4: e412. doi: 10.1186/1756-0500-4-412 48. Jothikumar N, Cromeans TL, Robertson BH, Meng XJ, Hill VR. A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus. J Virol Methods 2006; 131(1): 65–71. 49. Kamar N, Abravanel F, Lhomme S, Rostaing L, Izopet J. Hepatitis E virus: chronic infection, extra-hepatic manifestations, and treatment. Clin Res Hepatol Gastroenterol 2015; 39(1): 20–7. 50. Kamar N, Izopet J, Pavio N, et al. Hepatitis E virus infection. Nat Rev Dis Primers 2017; 3: e17086. doi: 10.1038/nrdp.2017.86 51. Kasorndorkbua C, Guenette DK, Huang FF, Thomas PJ, Meng XJ, Halbur PG. Routes of transmission of swine hepatitis E virus in pigs. J Clin Microbiol 2004; 42(11): 5047–52. 52. Kenney SP. The current host range of hepatitis E viruses. Viruses 2019; 11(5): e452. doi: 10.3390/v11050452. 53. Khuroo MS, Khuroo MS, Khuroo NS. Hepatitis E: discovery, global impact, control and cure. World J Gastroenterol 2016; 22(31): 7030–45. 54. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 1980; 16(2): 111–20. 55. Kralik P, Ricchi M. A basic guide to real time PCR in microbial diagnostics: definitions, parameters, and everything. Front Microbiol 2017; 8: e108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108. 56. Krog JS, Larsen LE, Breum SŘ. Tracing hepatitis E virus in pigs from birth to slaughter. Front Vet Sci 2019; 6: e50. doi: 10.3389/fvets.2019.00050. 57. Krumbholz A, Joel S, Neubert A, et al. Age-related and regional differences in the prevalence of hepatitis E virus-specific antibodies in pigs in Germany. Vet Microbiol 2013; 167(3/4): 394–402. 58. Kumar S, Subhadra S, Singh B, Panda BK. Hepatitis E virus: the current scenario. Int J Infect Dis 2013; 17(4): e228–33. doi: 10.1016/j.ijid.2012.11.026 59. Kureljušic B, Savic B, Jezdimirovic N, et al. Seroprevalence of hepatitis E in pigs and wild boars in the region of the city Belgrade. J Infect Dev Ctries 2020; 14(6): 669–73. 60. Kwo PY, Schlauder GG, Carpenter HA, et al. Acute hepatitis E by a new isolate acquired in the United States. Mayo Clin Proc 1997; 72(12): 1133–6. 61. Leblanc D, Poitras E, Gagné MJ, Ward P, Houde A. Hepatitis E virus load in swine organs and tissues at slaughterhouse determined by real-time RT-PCR. Int J Food Microbiol 2010; 139(3): 206–9. 62. Legrand-Abravanel F, Mansuy J, Dubois M, et al. Hepatitis E virus genotype 3 diversity, France. Emerg Infect Dis 2009; 15(1): 110–4. 63. Li TC, Chijiwa K, Sera N, et al. Hepatitis E virus transmission from wild boar meat. Emerg Infect Dis 2005; 11(12): 1958–60. 64. Lopes Dos Santos DR, Lewis-Ximenez LL, da Silva MF, de Sousa PS, Gaspar AM, Pinto MA. First report of a human autochthonous hepatitis E virus infection in Brazil. J Clin Virol 2010; 47(3): 276–9. 65. Martinelli N, Luppi A, Cordioli P, Lombardi G, Lavazza A. Prevalence of hepatitis E virus antibodies in pigs in Northern Italy. Infect Ecol Epidemiol 2011; 1: e7331. doi: 10.3402/iee.v1i0.7331 66. Meester M, Tobias TJ, Bouwknegt M, Kusters NE, Stegeman JA, van der Poel WHM. Infection dynamics and persistence of hepatitis E virus on pig farms: a review. Porcine Health Manag 2021; 7(1): e16. https://doi.org/10.1186/s40813-021-00189-z 67. Meister TL, Bruening J, Todt D, Steinmann E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res 2019; 163: 34–49. 68. Meng XJ, Halbur PG, Haynes JS, et al. Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus (swine HEV), but not with human strains of HEV. Arch Virol 1998; 143(7): 1405–15. 69. Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG, et al. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94(18): 9860–5. 70. Mesquita JR, Oliveira D, Rivadulla E, et al. Hepatitis E virus genotype 3 in mussels (Mytilus galloprovinciallis), Spain. Food Microbiol 2016; 58: 13–5. 71. Moor D, Liniger M, Baumgartner A, Felleisen R. Screening of ready-to-eat meat products for hepatitis E virus in Switzerland. Food Environ Virol 2018; 10(3): 263–71. 72. Müller A, Collineau L, Stephan R, Müller A, Stärk KDC. Assessment of the risk of foodborne transmission and burden of hepatitis E in Switzerland. Int J Food Microbiol 2017; 242: 107–15. 73. Primc, A. Pojavnost in razširjenost okužbe z virusom hepatitisa E med krvodajalci v Republiki Sloveniji. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2020. Magistrska naloga 74. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 1987; 4(4): 406–25. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454 75. Nakano T, Takahashi K, Pybus OG, et al. New findings regarding the epidemic history and population dynamics of Japan-indigenous genotype 3 hepatitis E virus inferred by molecular evolution. Liver Int 2012; 32(4): 675–88. 76. Nan Y, Wu C, Zhao Q, Zhou EM. Zoonotic hepatitis E virus: an ignored risk for public health. Front Microbiol 2017; 8: e2396. doi: 10.3389/fmicb.2017.02396 77. Pallerla SR, Schembecker S, Meyer CG, et al. Hepatitis E virus genome detection in commercial pork livers and pork meat products in Germany. J Viral Hepat 2021; 28(1): 196–204. 78. Park WJ, Park BJ, Ahn HS, et al. Hepatitis E virus as an emerging zoonotic pathogen. J Vet Sci 2016; 17(1): e1–11. doi: 10.4142/jvs.2016.17.1.1. 79. Pavio N, Meng XJ, Renou C. Zoonotic hepatitis E: animal reservoirs and emerging risks. Vet Res 2010; 41(6): e46. doi: 10.1051/vetres/2010018. 80. Psichogiou MA, Tassopoulos NC, Papatheodoridis GV, et al. Hepatitis E virus infection in a cohort of patients with acute non-A, non-B hepatitis. J Hepatol 1995; 23(6): 668–73. 81. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing, Vienna: R Foundation for statistical computing, 2021. https://www.R-project.org/ (24. 11. 2021) 82. Rahman MT, Uddin MS, Sultana R, Moue A, Setu M. Polymerase chain reaction (PCR): a short review. Anwer Khan Modern Med Coll J 2013; 4(1): 30–6. 83. Renou C, Roque-Afonso AM, Pavio N. Foodborne transmission of hepatitis E virus from raw pork liver sausage, France. Emerg Infect Dis 2014; 20(11): 1945–7. 84. Riveiro-Barciela M, Mínguez B, Gironés R, Rodriguez-Frías F, Quer J, Buti M. Phylogenetic demonstration of hepatitis E infection transmitted by pork meat ingestion. J Clin Gastroenterol 2015; 49(2): 165–8. 85. Rose N, Lunazzi A, Dorenlor V, et al. High prevalence of hepatitis E virus in French domestic pigs. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2011; 34(5): 419–27. 86. Rutjes SA, Bouwknegt M, van der Giessen JW, de Roda Husman AM, Reusken CB. Seroprevalence of hepatitis E virus in pigs from different farming systems in the Netherlands. J Food Prot 2014; 77(4): 640–2. 87. Saiki RK, Scharf S, Faloona F et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230(4732): 1350–4. doi: 10.1126/science.2999980. 88. Salines M, Dumarest M, Andraud M, et al. Natural viral co-infections in pig herds affect hepatitis E virus (HEV) infection dynamics and increase the risk of contaminated livers at slaughter. Transbound Emerg Dis 2019; 66(5): 1930–45. 89. Salines M, Barnaud E, Andraud M, et al. Hepatitis E virus chronic infection of swine co-infected with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. Vet Res 2015; 46(55): e1-10. https://doi.org/10.1186/s13567-015-0207-y 90. Schlauder GG, Desai SM, Zanetti AR, Tassopoulos NC, Mushahwar IK. Novel hepatitis E virus (HEV) isolates from Europe: evidence for additional genotypes of HEV. J Med Virol 1999; 57(3): 243–51. 91. Schlosser B, Stein A, Neuhaus R, et al. Liver transplant from a donor with occult HEV infection induced chronic hepatitis and cirrhosis in the recipient. J Hepatol 2012; 56(2): 500–2. 92. Schlosser J, Eiden M, Vina-Rodriguez A, et al. Natural and experimental hepatitis E virus genotype 3-infection in European wild boar is transmissible to domestic pigs. Vet Res 2014; 45(1): e121. doi: 10.1186/s13567-014-0121-8. 93. Scobie L, Dalton HR. Hepatitis E: source and route of infection, clinical manifestations and new developments. J Viral Hepat 2013; 20(1): 1–11. doi: 10.1111/jvh.12024. 94. Seminati C, Mateu E, Peralta B, de Deus N, Martin M. Distribution of hepatitis E virus infection and its prevalence in pigs on commercial farms in Spain. Vet J 2008; 175(1): 130–2. 95. SI-STAT Podatkovna baza. Zakol odojkov v klavnici (število), Slovenija, Letno: Odojki, 2014 (online). Ljubljana: Statisticni urad Republike Slovenije https://pxweb.stat.si/SiStatData/pxweb/sl/Data/-/1505802S.px/table/tableViewLayout2/ (2. sept. 2021) 96. Smith DB, Izopet J, Nicot F, et al. Update: proposed reference sequences for subtypes of hepatitis E virus (species Orthohepevirus A). J Gen Virol 2020; 101(7): 692–8. 97. Song YJ, Jeong HJ, Kim YJ, et al. Analysis of complete genome sequences of swine hepatitis E virus and possible risk factors for transmission of HEV to humans in Korea. J Med Virol 2010; 82(4): 583–91. 98. Steyer A, Naglic T, Mocilnik T, Poljšak-Prijatelj M, Poljak M. Hepatitis E virus in domestic pigs and surface waters in Slovenia: prevalence and molecular characterization of a novel genotype 3 lineage. Infect Genet Evol 2011; 11(7): 1732–7. 99. Szabo K, Trojnar E, Anheyer-Behmenburg H, et al. Detection of hepatitis E virus RNA in raw sausages and liver sausages from retail in Germany using an optimized method. Int J Food Microbiol 2015; 215: 149–56. 100. Štukelj M, Toplak I, Raspor Lainšcek P, et al. Hepatitis E v Sloveniji. In: One health = Eno zdravje: zbornik prispevkov. Ljubljana : UL Veterinarska fakulteta, 2019: 23–30. 101. Takova K, Koynarski T, Minkov I, Ivanova Z, Toneva V, Zahmanova G. Increasing hepatitis E virus seroprevalence in domestic pigs and wild boar in Bulgaria. Animals (Basel) 2020; 10(9): e1521. doi: 10.3390/ani10091521 102. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol 2013; 30(12): 2725–9. 103. Tei S, Kitajima N, Takahashi K, Mishiro S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. Lancet 2003; 362(9381): 371–3. 104. Teixeira-Costa C, Andraud M, Rose N, Salines M. Controlling hepatitis E virus in the pig production sector: assessment of the technical and behavioural feasibility of on-farm risk mitigation strategies. Prev Vet Med 2020; 175: e104866. doi: 10.1016/j.prevetmed.2019.104866. 105. Tessé S, Lioure B, Fornecker L, et al. Circulation of genotype 4 hepatitis E virus in Europe: first autochthonous hepatitis E infection in France. J Clin Virol 2012; 54(2): 197–200. 106. Toplak I, Rihtaric D, Barlovic S, Raspor Lainšcek P, Kirbiš A. Ugotavljanje prisotnosti virusa hepatitisa E v vzorcih blata poginjenih prašicev v letih od 2011 do 2015 v Sloveniji. Slo Vet Res 2016; 53(17): 186–9. 107. Toplak I, Rihtaric D, Jamnikar Ciglenecki U, Hostnik P, Grom J. High diversity of hepatitis E virus detected in pig fecal samples in Slovenia. In: 9th International Congress of Veterinary Virology. ESVV 2012 ; One world, one health, one virology. Madrid : European Society for Veterinary Virology, 2012: 163–4. 108. Treagus S, Wright C, Baker-Austin C, Longdon B, Lowther J. The foodborne transmission of hepatitis E virus to humans. Food Environ Virol 2021; 13(2): 127–45. 109. Tsachev I, Baymakova M, Ciccozzi M, et al. Seroprevalence of hepatitis E virus infection in pigs from southern Bulgaria. Vector Borne Zoonotic Dis 2019; 19(10): 767–72. 110. Vina-Rodriguez A, Schlosser J, Becher D, Kaden V, Groschup MH, Eiden M. Hepatitis E virus genotype 3 diversity: phylogenetic analysis and presence of subtype 3b in wild boar in Europe. Viruses 2015; 7(5): 2704–26. 111. Wakeley PR, Johnson N, McElhinney LM, Marston D, Sawyer J, Fooks AR. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. J Clin Microbiol 2005; 43(6): 2786–92. 112. Wang Y, Zhao C, Qi Y, Geng Y. Hepatitis E virus. Adv Exp Med Biol 2016; 948: 1–16. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_1 113. Wichmann O, Schimanski S, Koch J, et al. Phylogenetic and case-control study on hepatitis E virus infection in Germany. J Infect Dis 2008; 198(12): 1732–41. 114. Widén F. Hepatitis E as a zoonosis. Adv Exp Med Biol 2016; 948: 61–71. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_4. 115. Xin S, Xiao L. Clinical manifestations of hepatitis E. Adv Exp Med Biol 2016; 948: 175–89. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_10. 116. Yugo DM, Meng XJ. Hepatitis E virus: foodborne, waterborne and zoonotic transmission. Int J Environ Res Public Health 2013; 10(10): 4507–33. 117. Zaaijer HL, Kok M, Lelie PN, Timmerman RJ, Chau K, van der Pal HJ. Hepatitis E in the Netherlands: imported and endemic. Lancet 1993; 341(8848): 826. doi: 10.1016/0140-6736(93)90599-c. 118. Zanetti AR, Schlauder GG, Romanň L, et al. Identification of a novel variant of hepatitis E virus in Italy. J Med Virol 1999; 57(4): 356–60. 119. Zhou Y, Zhao C, Tian Y, Xu N, Wang Y. Characteristics and functions of HEV proteins. Adv Exp Med Biol 2016; 948: 17–38. doi: 10.1007/978-94-024-0942-0_2. 120. Zhu H, Zhang H, Xu Y, Laššáková S, Korabecná M, Neužil P. PCR past, present and future. Biotechniques 2020; 69(4): 317–25. 121. Žele D, Barry AF, Hakze-van der Honing RW, Vengušt G, van der Poel WH. Prevalence of anti-hepatitis E virus antibodies and first detection of hepatitis E virus in wild boar in Slovenia. Vector Borne Zoonotic Dis 2016; 16(1): 71–4. 11 PRILOGE