Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2013/82 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta J4-2154 Naslov projekta Moduliranje medceličnega komuniciranja mikroorganizmov zaradi dejavnikov okolja Vodja projekta 4001 Peter Raspor Tip projekta J Temeljni projekt Obseg raziskovalnih ur 4173 Cenovni razred C Trajanje projekta 05.2009 - 04.2012 Nosilna raziskovalna organizacija 481 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Raziskovalne organizacije -soizvajalke Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 4 BIOTEHNIKA 4.06 Biotehnologija 4.06.04 Mikrobna biotehnologija Družbenoekonomski cilj .3 0. Naravoslovne vede - RiR financiran iz drugih virov (ne iz 13.01 SUF) 2.Raziskovalno področje po šifrantu FOS1 Šifra 1.06 -Veda 1 Naravoslovne vede - Področje 1.06 Biologija B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 3.Povzetek raziskovalnega projekta2 SLO Medcelično komuniciranje pri mikroorganizmih je ključnega pomena za razumevanje mehanizmov patogeneze, razvoj novih zdravil, optimizacijo biotehnoloških procesov (naravnih, industrijskih), trajnost in varnost živil. Najpogosteje je povezano z zaznavanjem celične gostote in posledično s sprožanjem prilagoditvenih odzivov (npr. sinteza virulenčnih dejavnikov, zunajceličnih encimov, tvorba biofilma). Po Gramu negativne bakterije komunicirajo preko acil homoserin laktonov ali preko LuxS sistema, po Gramu pozitivne s kratkimi modificiranimi peptidi, kvasovke uporabljajo aromatske alkohole. Komunikacija in kompleksni odzivi sprožijo različne mehanizme regulacije fizioloških odzivov. Medcelično komuniciranje je ključen mehanizem za koordinacijo odzivov mikrobne populacije, kjer igra pomembno vlogo celična gostota. Ni še raziskano kako ostali okoljski dejavniki (T, slanost) vplivajo na medcelično komunikacijo in na od komunikacije odvisne procese, zato smo v temeljnem raziskovalnem projektu uporabili več modelnih sistemov za določitev vpliva okolja na uspešnost medceličnega komuniciranja. Cilji raziskave so bili razviti štiri modelne sisteme za spremljanje medcelične komunikacije: Vibrio sp. DSM 14379 - produkcija pigmenta, Campylobacter jejuni- izražanje virulenčnih dejavnikov - kot po Gramu negativna predstavnika; Bacillus subtilis - izražanje surfaktina, kompetence - kot po Gram pozitivni modelni sistem, Saccharomyces cerevisiae s spremljanjem invazivnosti - kot evkariontski model. Pri modelnih sistemih smo razvili metode kvantitativne detekcije signalne molekule in spremljali odziv v ustreznih gojiščih. V okviru raziskovalnega projekta smo razvili metode za spremljanje signalnih molekul (TLC, HPLC, reporterski sevi, masna spektometrija) in odziva na komuniciranje (rekombinantni sevi, gfp in lacZ fuzije z znanimi tarčnimi geni, odziv proteoma, metabolni odziv). ANG Intercellular communication is important process for understanding mechanisms of pathogenicity, development of new drugs, optimisation of biotechnological processes (natural and industrial) and food safety. It is a process of sensing cell density and consequently activating different adaptive mechanisms (i.e. synthesis of virulence factors, extracellular enzymes, biofilm formation). Gram negative bacteria communicate via acyl-homoserine lactones or LuxS system, Gram positive bacteria use oligopeptides, while yeasts use aromatic alcohols as signal molecules. Microbial communication and complex responses trigger different regulatory mechanisms of microbial metabolism. Intercellular communication is a mechanism for coordination of microbial responses, where cell density plays an important role. It is not understood how other environmental factors (i.e. T, salinity) influence intercellular communication and related processes. To address this problem, four different model systems have been studied to determine the influence of the environment on intercellular communication. The aim of the study was to develope four model systems to monitor intercellular communication; Vibrio sp. DSM 14379 - pigment production, Campylobacter jejuni - expression of virulence factors, as a Gram negative representative; Bacillus subtilis -expression of surfactin and competence, as a Gram positive model system; Saccharomyces cerevisiae - observation of invasiveness - as an eukaryotic model. For all those models the quantitative methods for signal detection and microbial responses in a proper media has been developed. During the project duration methods for detection of signal molecules (via TLC, HPLC, reporter strains, mass spectrometry) and for physiological responses to communication (recombinant strains, gfp in lacZ fusions with target genes, proteome response, metabolic response) have been developed. 4.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu3 V okviru predloženega programa dela raziskovalnega projekta smo spremljali medcelično komunikacijo pri štirih modelnih organizmih. Pri bakteriji Bacillus subtilis smo v okviru WP1 razvili metodo za določanje koncentracije signalne molekule ComX v izrabljenih gojiščih B. subtilis z biosenzorjem. Poleg tega smo za merjenje vpliva temperature na komunikacijo pri B. subtilis na genetskem nivoju vpeljali kvantitativni PCR (RT-PCR). Znotraj WP2 smo za ugotavljanje fiziološkega odgovora na signalno molekulo poleg uporabe z beta galaktozidazo označenih testerskih sevov, razvili še rekombinantne seve B. subtilis, ki nosijo fluorescenčne poročevalske gene za izražanje surfaktina in postavili metodo za kvantitativno fluorescenčno mikroskopijo. Vzpostavljene ter razvite metode smo uporabili v WP3 za testiranje vpliva temperature na ComX v izrabljenih gojiščih B. subtilis ter merili izražanje surfaktina v odvisnosti od temperature. Čeprav so začetni rezultati kazali, da je količina ComX v izrabljenih gojiščih B. subtilis sorazmerna s temperaturo gojenja, so kontrolne meritve pokazale, da je večina zaznavnega vpliva posledica nekih druge nam neznanih molekul. Te so odvisne od temperature gojenja in skupaj s ComX v izrabljenih gojiščih modulirajo komunikacijski odgovor, vendar le, če so izrabljena gojišča predhodno zamrznjena. V nasprotnem primeru ni velikih razlik v koncentracijah ComX v izrabljenih gojiščih pridobljenih iz različnih temperatur gojenja B. subtilis. Postavljena metoda nam omogoča, da lahko v kompleksnih okoljih izmerimo koncetracije signalnih molekul ComX, ki znašajo pri B. subtilis ~ 10nM. Izražanje komunikacijskih genov (comQ, comX) je obratno sorazmerna s temperaturo in se razlikuje od zunajcelične količine ComX v izrabljenih gojiščih iz česar sklepamo, da obstajajo bodisi postraslacijski regulatorni mehanizmi ali še drugi načini modulacije zunajceličnega ComX. Sledili smo tudi glavnemu fiziološkemu odgovoru na ComX izražanju surfaktina. Ugotovili smo, da se kljub konstanti koncentraciji ComX, izražanje surfaktinskega operona močno spreminja s temperaturo. B. subtilis pri 50 °C ne sintetizira surfaktina, kar kaže na to, da je komunikacija pri teh pogojih motena. V nasprotju s temperaturo, slanost vpliva na količino ComX v izrabljenih gojiščih B. subtilis. Visoka slanost signifikantno zniža koncentracijo ComX, kljub približno enakim celičnim gostotam. Skladno s tem se tudi izražanja surfaktina v tekočih gojiščih zniža z višanjem slanosti, kar kaže, da slanost modulira komunikacijo. Razvite in postavljene metode bodo koristne v nadaljnjih razsikavah, saj kvantitativna fluorescenca skupaj s fluorescečnimi sevi omogoča študij porazdelitve izražanja surfaktina, kar je še posebej zanimivo za biofilme. Kvantitativne meritve ComX nam bodo omogočile še druge meritve kot na primer študij interkacije ComX s surfaktinom ali merjenje hitrosti pojavljanja ComX v gojišču v odvisnosti od faze rasti B. subtilis, za kar obstajajo do sedaj le posredne ocene. Pri bakteriji Campylobacter jejuni smo v okviru WP1 postavili eksperimentalni sistem za zaznavanje signalnih molekul avtoinduktorjev tipa 2 (AI-2) s poročevalskim sevom Vibrio harveyi BB170 (Vilchez in sod., 2007 in Taga, 2005) in ga preizkusili na referenčnem sevu (C.jejuni 11168) in različnih mutantah v ključnih genih za signaliziranje in tvorbo biofilma (npr. C.jejuni 11168 luxS in cmeB) (WP2). Znotraj WP3 smo med okoljskimi dejavniki testirali vpliv temperature (42 °C, 8 °C), medija (mesnega soka v primerjavi z laboratorijskim gojiščem) in dodatka rastlinskega izvlečka Evodia rutaecarpa in njegovih čistih spojin kinolona-A ter evodiamina v gojišče. Sinteza signalnih molekul je bila največja pri referenčnem sevu C. jejuni 11168 pri 42 °C v laboratorijskem gojišču in bistveno zmanjšana pri mutanti C. jejuni 11168 luxS v istih pogojih. Močno inhibicijo sinteze AI-2 molekul je pri referenčnem sevu C. jejuni 11168 povzročila tudi nizka temperatura gojenja ter gojenje bakterij v mesnem soku. Dodatek rastlinskega izvlečka Evodia rutaecarpa in njegovih čistih spojin kinolona-A ter evodiamina v gojišču je upočasnil in delno inhibiral sintezo signalnih molekul. Med testiranimi učinkovinami je bil bolj aktiven kinolon-A kot pa evodiamin. Sinteza AI-2 molekul je bila visoka tudi pri mutantih C. jejuni 11168 cmeB v prisotnosti oz. odsotnosti dodatka rastlinskega izvlečka in njegovih čistih spojin kinolona-A ter evodiamina. Pri bakteriji Vibrio sp. so bile raziskave v okviru WP1 usmerjene v optimizacijo metod za določanje dveh tipov signalnih molekul (acil homoserin lakton (AHL) in avtoinduktor-2 (AI-2)) ter fizioloških odgovorov (sinteze pigmenta). Signalne molekule smo ekstrahirali iz izrabljenega gojišča kulture Vibrio sp. s kislim etil acetatom. Tip AHL molekul smo določili s tankoplastno kromatografijo s poročevalskimi sevi (Agrobacterium tumefaciens NT1 (pDCI41E33), Chromobacterium violaceum CV026, Escherichia coli JM109 (pSB401)). Pokazali smo prisotnost enega tipa AHL molekule s poročevalskim sevom Escherichia coli JM109 (pSB401) s tankoplastne kromatografije. Bakterija Vibrio sp. najverjetneje sintetizira 3-okso heksanoil homoserin lakton (OHHL). Razvili smo tudi metodo kvantifikacije AHL molekul v mikrotitrskih ploščah. Poleg tega smo s poročevalskim sevom Vibrio harveyi BB170 preverjali prisotnost AI-2. V okviru WP2 smo postavili metodo določanja koncentracije pigmenta kot fiziološkega odgovora reguliranega s sistemom zaznavanja celične gostote. Pigment smo iz celic ekstrahirali z acetonom in ga spektrofotometrično določili. Postavljene metode so nam služile za preverjanje vpliva slanosti in temperature na sintezo signalnih molekul in na pigmentacijo (WP3). Bakterijo Vibrio sp. smo gojili pri različnih slanostih (0.3, 3, 5 in 10 % (w/v) NaCl) ter različnih temperaturah (15, 20, 28, 37 in 43 °C). Ugotovili smo, da se tako produkcija pigmenta kot tudi količina proizvedenih signalnih molekul spreminjata s temperaturo in slanostjo. Bakterija Vibrio sp. zmanjša produkcijo signalnih molekul AHL in AI-2 in s tem posledično tudi produkcijo pigmenta v stresnih pogojih (visoka in nizka temperatura ter visoka in nizka slanost), medtem ko je v optimalnih pogojih produkcija signalnih molekul in pigmenta največja (3 % NaCl in 28 °C) in da sta le-ti močno zmanjšani v stresnih pogojih. Pri kvasovki S. cerevisiae je v okviru WP1 potekala postavitev metode merjenja signalnih aromatskih alkoholov (feniletanol, triptofol in tirozol) na osnovi ločevanja z metodo HPLC in detekcije s fluorescenčnim detektorjem. V primerjavi z obstoječimi metodami so pomembni dosežki te metode: i) precejšnja poenostavitev izolacije signalnih molekul - ekstrakcija in koncentriranje vzorca nista potrebna; vzorec se le filtrira in nanese direktno na HPLC kolono, kjer se analit lahko detektira takoj po gojenju; ii) miniaturizacija procesa - gojenje kvasovk poteka v 2 ml centrifugirkah namesto v nekaj deset ml erlenmajericah, kar močno zmanjša porabo kemikalij in potrošnega materiala in omogoča testiranje veliko večjega števila poskusnih vzorcev; iii) zaradi skrajšanja postopka in ker ni potrebno koncentrirati vzorca, se je močno povečala tudi ponovljivost in robustnost metode. S testom invazivne rasti smo pokazali, da se pri povišani koncentraciji feniletanola, ne pa tudi triptofola ali tirozola poveča invazivna rast v medij. Le-ta je še bolj stimulirana pri kombinaciji feniletanol+triptofol. Postavljeno platformo smo testirali v WP3, kjer smo preverili vpliv okoljskih dejavnikov (slanost in temperatura) na medcelično komunikacijo. V poskus smo vključili 3 seve S. cerevisiae različnega izvora (klinični sev YJM311, vinski sev ZIM1927 in laboratorijski sev L6294). Preverjali smo vpliv slanosti (0.5, 1, 2, 5 % NaCl) in temperature (18, 24, 30, 34 °C) na produkcijo signalnih molekul med fermentacijo. Pokazali smo, da je povečana slanost pri vseh treh sevih negativno vplivala na produkcijo feniletanola in triptofola. Kljub temu, da je koncentracija viabilnih celic po 24 urah fermentacije pri 5 % slanosti nižja od tiste pri kontroli (0 %) za približno 20 %, je produkcija obeh signalnih molekul nižja za približno 30-60%. Sprememba temperature ni imela statistično značilnega vpliva na produkcijo signalnih molekul pri vseh treh sevih. Analiza proteinskega profila (SDS-PAGE) je pokazala, da se z zvišano koncentracijo NaCl povečuje delež proteinov na celični površini v primerjavi s kontrolo (0% NaCl). S.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev4 Realizirani so bili vsi cilji raziskovalnega projekta. Razvili oziroma postavili smo metode za spremljanje medcelične komunikacije pri vseh modelnih organizmih. S postavljenimi metodami lahko določamo koncentracijo signalnih molekul kot tudi sledimo izbranim fiziološkim odgovorom. Postavljene metode smo uporabili za testiranje vpliva temperature in slanosti na medcelično komunikacijo. 6.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine5 Sprememb odobrenega in financiranega raziskovalnega programa v zadnjem letu raziskovalnega projekta ni bilo. 7.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine6 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 3565432 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Socialne interakcije in porazdelitev ferotipov Bacillus subtilis na mikroskali ANG Social interactions and distribution of Bacillus subtilis pherotypes at microscale Opis SLO To je prva študija, kjer smo preučevali komunikacijo pri B. subtilis na mikroskali in pokazali, da obstaja pestrost komunikacije pri sevih, ki so v okolju blizu skupaj. Sevi komunicirajo s sistemom ComQXPA, ki je visoko polimorfen na nivoju ozkosorodnih sevov, zato lahko ločimo 4 komunikacijske skupine znotraj vrste. Komunikacija je med sevi znotraj skupine uspešna, medtem ko med skupinami ne. V študiji smo primerjali komunikacijo izolatov iz nabrežnih tal reke Save in izolatov iz puščave. Ugotovili smo, da pestrost jezikov ni odvisna od tipa okolja in je prisotna tako na mikro kot makroskali. ANG This is the first study about communication at the microscale in B. subtilis and showed that remarkable diversity of the comQXPA QS system is present also at the microscale. The comQXPA is highly polymorphic in closely related strains and comprises four communication groups such that strains belonging to the same group exchange information efficiently, but strains from different groups not. In this work, using Bacillus isolates from the bank of the river Sava, we showed that the same number of communication types exists at the microscale (1 cm3) as was found among strains from macroscales. Objavljeno v American Society for Microbiology; Journal of bacteriology; 2009; no. 6, Vol. 191; str. 1756-1764; Impact Factor: 3.940;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.333; A': 1; WoS: QU; Avtorji / Authors: Štefanič Polonca, Mandic-Mulec Ines Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 3709816 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Kvantitativno profiliranje proteinov celične stene invazivnih in neinvazivnih izolatov Saccharomyces cerevisiae. ANG Quantitative cell wall protein profiling of invasive and non-invasive Saccharomyces cerevisiae strains Opis SLO Delo opisuje nov pristop izolacije in kvantitativne analize proteinov celične stene iz invazivno rastočih izolatov S. cerevisiae. Metoda je kompatibilna s testom invazije v agar in je presejalno orodje za hitro analizo proteinov povezanih z adhezijo in invazivnostjo kvasovk. Metodo smo optimizirali za hitro in direktno analizo večproteinskih vzorcev z SDS-PAGE brez predhodnega koncentriranja ali čiščenja ter ohranili visoko ločljivost proteinov. Z njo smo primerjali invazivne in neinvazivne izolate, invazivni in neinvazivni del kolonije in celice gojene pri optimalni in povišani temperaturi. ANG We described new approach for the isolation and quantitative analysis of the cell wall proteins from invasively growing S. cerevisiae. This method is compatible with agar-invasion assays and is a screening tool for rapid analysis of proteins related to yeast adhesion and invasion. The extraction was optimized for fast, direct analysis of multiple protein samples by SDS-PAGE, avoiding preconcentration or purification. We compare protein profile of invasive and non-invasive strains, invasive and non-invasive part of the colony and cells cultivated at optimal and increased growth temperature. Elsevier; Journal of microbiological methods; 2009; Vol. 79; str. 260-265; Impact Factor: 2.427;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Objavljeno v Factor: 2.983; WoS: CO, QU; Avtorji / Authors: Zupan Jure, Mavri Jan, Raspor Peter Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 3772024 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Produkcija pigmenta pri Vibrio sp. DSM 14379 - kompetitvna prednost v okolju ANG Vibrio sp. DSM 14379 pigment production - a competitive advantage in the environment? Opis SLO V tem delu smo študirali produkcijo pigmenta pri Vibrio sp. pri razlicnih fizikalno kemijskih pogojih. Opazili smo, da produkcije pigmenta ni bilo pri visokih in nizkih temperaturah, visokih in nizkih koncentracijah soli v PKE gojišču, nizki koncentraciji glukoze v mineralnem gojišču ali visoki koncentraciji glukoze v PKE gojišču. To nakazuje, da je produkcija pigmenta luksuz, ki ga Vibrio sp. tvori samo pri ugodnih pogojih. Pokazali smo tudi, da je rdeči pigment protibakterijski agens za Vibrio sp. ANG In this study, the pigment production of Vibrio sp. was studied under different physicochemical conditions. There was no pigment production at high or low temperatures, high or low salt concentrations in peptone yeast extract (PYE) medium, low glucose concentration in mineral growth medium or high glucose concentration in PYE medium. This indicates that the red pigment production is a luxurious good that Vibrio sp. makes only under favorable conditions. The red pigment is also a redundant antibacterial agent of Vibrio sp. Objavljeno v Springer-Verlag.; Microbial ecology; 2010; Vol. 60, no. 3; str. 592-598; Impact Factor: 2.875;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 1.51; A': 1; WoS: GU, PI, QU; Avtorji / Authors: Starič Nejc, Danevčič Tjaša, Stopar David Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 4. COBISS ID 3750520 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Invazivna rast kvasovke Saccharomyces cerevisiae je odvisna od zunanjih dejavnikov: kvantitativni model. ANG Invasive growth of Saccharomyces cerevisiae depends on environmental triggers Opis SLO V tem delu smo kvantitativno preučili vpliv različnih fiziko-kemijskih dejavnikov na invazivno rast kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Za in vitro študije invazivnosti S. cerevisiae, fenomena, ki velja za domnevni virulentni faktor te klinično bolj in bolj zaskrbljujoče kvasovke, se navadno uporabljajo testi invazije v agar. A vendar so kvalitativni testi invazije v agar, ki so se uporabljali do sedaj, močno omejevali izvedljivost in interpretacijo analiz, zato so bili potrebni izboljšav. Poleg tega je povezava med invazivno rastjo in stresnimi pogoji, značilnimi za človeški prebavni trakt in živila, izredno slabo proučena in je zato to znanje potrebno razširiti. V ta namen smo kvantitativni test invazije v agar, ki je bil predstavljen v našem predhodnem delu, aplicirali za podrobno proučevanje stresnih dejavnikov, ki kontrolirajo adhezijo in invazijo kvasovke. Deset virulentnih in nevirulentnih sevov S. cerevisiae smo testirali pri različnih temperaturah, pH vrednostih, pri stradanju s hranili, spremenjeni atmosferi in pri različnih koncentracijah NaCl, CaCl2 in konzervansov. Z uporabo specifičnih parametrov, kot je npr. relativna invazija, smo predpostavili osem modelov invazivne rasti, ki so omogočili jasnejšo interpretacijo rezultatov. Močno preferenco do invazivne rasti (oz. visoko relativno invazijo) smo opazili, ko so sevi rasli na gojiščih revnih z dušikom in glukozo. Signifikantno povečanje invazije sevov smo zaznali tudi pri temperaturah, ki so tipične za vročino pri človeku (37-39 °C). Po drugi strani smo določili močan represivni efekt na invazijo v prisotnosti soli, anaerobioze in pri nekaterih ANG konzervansih. In this contribution, the influence of various physicochemical factors on Saccharomyces cerevisiae invasive growth is examined quantitatively. Agar-invasion assays are generally applied for in vitro studies on S. cerevisiae invasiveness, the phenomenon observed as a putative virulence trait in this clinically more and more concerning yeast. However, qualitative agar-invasion assays, used until now, strongly limit the feasibility and interpretation of analyses and therefore needed to be improved. Besides, knowledge in this field concerning the physiology of invasive growth, influ enced by stress conditions related to the human alimentary tract and food, is poor and should be expanded. For this purpose, a quantitative agar-invasion assay, presented in our previous work, was applied in this contribution to clarify the significance of the stress factors controlling the adhesion and invasion of the yeast in greater detail. Ten virulent and nonvirulent S. cerevisiae strains were assayed at various temperatures, pH values, nutrient starvation, modified atmosphere, and different concentrations of NaCl, CaCl2 and preservatives. With the use of specific parameters, like a relative invasion, eight invasive growth models were hypothesized, which enabled intelligible interpretation of the results. A strong preference for invasive growth (meaning high relative invasion) was observed when the strains were grown on nitrogen- and glucose-depleted media. A significant increase in the invasion of the strains was also determined at temperatures typical for human fever (37-39 °C). On the other hand, a strong repressive effect on invasion was found in the presence of salts, anoxia and some preservatives. Objavljeno v Wiley; Yeast; 2010; Issue 4, Vol. 27; str. 217-228; Impact Factor: 1.626;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 1.696; WoS: CQ, DB, QU, RQ; Avtorji / Authors: Zupan Jure, Raspor Peter Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 5. COBISS ID 4215160 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Spremljanje komunikacijskih molekul med mini fermentacijskimi študijami vinskih kvasovk ANG Monitoring of quorum-sensing molecules during mini-fermentation studies in wine yeast Opis SLO Pri visoki celični gostoti in ob pomanjkanju hranil kvasovke kolektivno prilagodijo metabolizem z izločanjem aromatskih alkoholov kar je znano kot »quorum sensing« (QS). Mehanizem in vloga takšne komunikacije sta slabo poznani in metodologija za proučevanje teh procesov slabo razvita. Članek opisuje učinkovit pristop za študij fenomena QS med fermentacijo kvasovk. Ločbo, detekcijo in kvantifikacijo domnevnih QS molekul 2-feniletanol, triptofol in tirozol smo optimizirali na enostavnem sistemu HPLC. Z uporabo fenilne HPLC kolone in fluorescenčnega detektorja smo bistveno povečali občutljivost sistema. To je omogočilo opustitev ekstrakcije in koncentriranja analitov ter zmanjšanje delovnega volumna na nivo 2-ml minifermentacij. Poleg tega smo predstavili inovativno metodo za hitro štetje živih kvasnih celic. Ta študija je osnova za nadaljnje poglobljene študije kinetike in regulacije QS med fermentacijo s kvasovkami. ANG At high cell density or under low nutrient conditions, yeasts collectively adapt their metabolism by secreting aromatic alcohols in what is known as quorum sensing. However, the mechanisms and role of quorum sensing in yeasts are poorly understood, and the methodology behind this process is not well established. In this study, we described an effective approach to study quorum sensing in yeast fermentations. We have optimized the separation, detection and quantification of the putative quorum sensing molecules 2-phenylethanol, tryptophol and tyrosol on a simple HPLC-based system. With the use of a phenyl HPLC column and a fluorescence detector, the sensitivity of the system was significantly increased. This allowed us to eliminate extraction and concentration procedures, and to scale-down the process to 2-ml mini-fermentations. Additionally, we present an innovative method for rapid viable-cell counting. This study forms the basis for detailed studies in kinetics and regulation of quorum sensing in yeast fermentation. Objavljeno v American Chemical Society, Books and Journals Division; Journal of agricultural and food chemistry; 2013; str. [1-10, sprejeto v objavo]; Impact Factor: 2.823;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 0.782; A': 1; WoS: AH, DW, JY; Avtorji / Authors: Zupan Jure, Avbelj Martina, Butinar Bojan, Kosel Janez, Šergan Matej, Raspor Peter Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek S.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine7 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 3812984 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Komunikacija med mikroorganizmi ANG Communication among microorganisms Opis SLO Komunikacija je zaznavanje celične gostote in aktivacija različnih prilagoditvenih mehanizmov, ki vključujejo izmenjavo specifičnih signalnih molekul. Znano je, da igra gostota ključno vlogo pri komunikaciji, medtem ko je vpliv drugih faktorjev (npr. slanost, temperatura) manj poznan. Razpravljali smo o kvantitativnih metodah za zaznavanje signalov in mikrobnih odgovorov na okoljski stres pri štirih modelnih sistemih, ki vključujejo dve po Gramu negativni bakteriji Vibrio sp. in C. jejuni, po Gramu pozitivno bakterijo B. subtilis in kvasovko S. cerevisiae. ANG Communication is a process of sensing cell density and activating different adaptive mechanisms, which involves the exchange of specific signal molecules. It is known that cell density plays a key role in communication, while the influence of other factors (i.e. salinity, temperature) is less understood. We discussed quantitative methods for signal detection and microbial responses to environmental stresses in four model systems that include two Gram negative bacteria Vibrio sp. and C. jejuni, a Gram positive bacterium B. subtilis and a yeast S. cerevisiae. Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v Croatian Microbiological Society; Power of microbes in industry and environment 2010; 2010; Str. 17, IL 2; Avtorji / Authors: Raspor Peter, Avbelj Martina, Čadež Neža, Danevčič Tjaša, Dogša Iztok, Jamnik Polona, Klančnik Anja, Kosel Janez, Mandic-Mulec Ines, Smole Možina Sonja, Stopar David, Zupan Jure Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 2. COBISS ID 3946872 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vpliv okoljskih dejavnikov na produkcijo zunajceličnih signalnih molekul pri naravnem izolatu Vibrio sp. ANG Influence of environmental factors on production of extracellular signalling molecules in a natural isolate Vibrio sp. Opis SLO V diplomskem delu smo pokazali, da temperatura vpliva na produkcijo signalnih molekul. Za detekcijo in karakterizacijo signalnih molekul smo lete ekstrahirali s pomočjo kislega etil acetata iz izrabljenih gojišč kulture divjega tipa Vibrio sp. Tip AHL signalnih molekul smo določili z uporabo TLC in poročevalskega seva E.coli JM109 (pSB401). Za detekcijo AI-2 smo uporabili poročevalski sev Vibrio harveyi BB170. Ugotovili smo, da naravni izolat Vibrio sp. proizvaja le en tip AHL molekul, 3-oksoheksanoil-L-homoserin lakton (OHHL), in dokazali produkcijo AI-2 signalnih molekul. Temperatura vpliva na produkcijo tako AHL kot tudi AI-2 molekul pri divjem sevu Vibrio sp. ANG The effect of temperature on signal molecules production in Vibrio sp. was studied in diploma thesis. Signal molecules isolated from the spent media of the wild type strain Vibrio sp. were extracted with acidified ethyl acetate. AHL molecules present in spent media were determined with TLC and biosensor strain E.coli JM109 (pSB401). For detection of AI-2 molecules a biosensor strain Vibrio harveyi BB170 was used. The results indicate that Vibrio sp. produces one type of AHL molecules, 3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone (OHHL). It also produces AI-2 signal molecule. Production of AHL and AI-2 molecules is temperature sensitive. Šifra D.11 Drugo Objavljeno v [M. Krajnc]; 2011; XI, 39 f., [4] f. pril.; Avtorji / Authors: Krajnc Marko Tipologija 2.11 Diplomsko delo 3. COBISS ID 3920248 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Hitro določanje QS molekul kvasovk med mini fermentacijskimi študijami. ANG Rapid detection of yeast quorum sensing molecules during minifermentation studies Opis SLO Metoda spremljanja QS molekul med fermentacijo, ki je bila postavljena v okviru projekta, je bila predstavljena z vabljenim predavanjem na mednarodnem srečanju strokovnjakov s področja proizvodnje arom kvasovk (2nd European Yeast Flavour Workshop Cost Action FA0907 BIOFLAVOUR). Doprinos metodologije je predvsem v miniaturizaciji, učinkovitosti in hitrosti detekcije aromatskih alkoholov kvasovke, pri čemer metoda ni izgubila občutljivosti in specifičnosti. Proces fermentacije tako lahko poteka v 2 ml bioreaktorjih, detekcija pa je opravljena s HPLC in s fenilno kolono nove generacije. Pri tem ni potrebna izolacija (npr. ekstrakcija) in posebno čiščenje vzorcev. Optimiziran postopek tako močno skrajša, poenostavi in nenazadnje izredno poceni postopek analize (za približno 100 - 1000 krat v primerjavi z obstoječimi metodami). ANG The method for monitoring QS molecules during fermentation, which was developed in the project, was presented with an invited lecture at the international meeting of experts on yeast bioflavour production (2nd European Yeast Flavour Workshop, Cost Action FA0907 BIOFLAVOUR). The main contribution of the presented methodology is miniaturisation, efficacy and rapidness of the detection of yeast aromatic alcohols. Moreover, despite the miniaturisation, the method has still high sensitivity and specificity. The fermentation is processed in 2 ml bioreactors and detection is performed with HPLC and phenyl column of new generation. There is no need for special isolation of analites (e.g. extraction) or purification, therefore the optimized process exceedingly shorten, simplify and last but not the least reduce the cost of analysis (for approx. 100 - 1000 fold when compared with other methods in the field). Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v COST [etc.]; Bioflavour; 2011; str. [1]; Avtorji / Authors: Zupan Jure, Avbelj Martina, Kosel Janez, Čadež Neža, Raspor Peter Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 4. COBISS ID 4114296 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vpliv temperature na izražanje gena comX bakterije Bacillus subtilis ANG The influence of temperature on comX expression in Bacillus subtilis Opis SLO Čeprav je mehanizem zaznavanja celične gostote (kvoruma) pri Bacillus subtilis dobro poznan, vpliv fizikalno-kemijskih dejavnikov na zaznavanje kvoruma še ni v celoti pojasnjen. V diplomskem delu smo preiskovali vpliv temperature (24, 37 in 51 °C) na koncentracijo signalnega peptida ComX ter na transkripcijo njegovega gena comX in gena comQ, ki kodira izoprenil transferazo odgovorno za nastanek zrelega ComX ter na izražanje gena srfA. Rezultati HPLC analize so pokazali, da koncentracija ComX v gojišču narašča s temperaturo gojenja. V nasprotju s tem smo s kvantitativnim PCR ugotovili, da so bile relativne količine kopij mRNA genov comX, comQ in srfA najnižje pri najvišji temperaturi. In sicer je bilo comX in comQ mRNA štiri krat več pri 24 °C kot pri 51 °C. Izražanje vseh treh preučevanih genov v odvisnosti od temperature ni sovpadalo s hitrostjo rasti, s končno gostoto celic v preučevanih kulturah in s količino ComX v izrabljenem gojišču. Zato lahko zaključimo, da negativni vpliv T na izražanje srfA ni povezan s signalnim peptidom ComX, temveč pri tem verjetno igra ključno vlogo druga regulatorna pot. ANG The mechanism of quorum sensing (QS) in Bacillus subtilis is well understood, however the influence of the physico-chemical factors on QS remains to be elucidated. We studied the influence of temperature (24, 37 and 51 °C) on concentration of the major signaling peptide of B. subtilis, ComX, and transcription of its gene comX and the comQ gene, which encodes isoprenyl transferase, ComQ, responsible for the processing and isoprenylation of mature ComX at the triptophane residue and srfA expression. HPLC results suggested that the concentration of ComX in the growth medium increases with temperature of cultivation. In contrast, based on quantitative PCR analyses of mRNA concentrations, transcription of comX, comQ and srfA was negatively regulated by temperature at 51 °C. The ratio of comX mRNA copies at 24 and 51 °C was 4 ±2, which is in contrast to concentrations of ComX in growth media. Therefore, expression of all three studied genes did not coincide with the growth rate and the final cell densities, which were higher at 51 than at 24 °C. Results suggest that ComX is not sufficient to overcome the high temperature induced inhibition of srfA expression. Šifra D.11 Drugo Objavljeno v [M. Vrhar]; 2012; XIV, 64 f., [12] f. pril.; Avtorji / Authors: Vrhar Martina Tipologija 2.11 Diplomsko delo 5. COBISS ID 4201080 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Komunikacijske molekule pri izbranih vinskih kvasovkah ANG Communication molecules among selected wine yeasts Opis SLO Medsebojen vpliv med kvasovkami ter njihov učinek na aromatske snovi, ki določajo aromo vina, ni poznan. Prav tako so v povojih raziskave na področju komunikacije med kvasovkami. Kvasovka Saccharomyces cerevisiae proizvaja komunikacijski molekuli feniletanol in triptofol, vendar ju izloča v mikromolarnih koncentracijah, zaradi česar je nujna uporaba občutljive analitske metode z nizko mejo določljivosti. V nalogi smo razvili enostavno, hitro in za večino laboratorijev dostopno metodo za detekcijo feniletanola, triptofola in tirozola. Temelji na uporabi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti v kombinaciji z visoko specifično fenilno kolono in fluorescenčnim detektorjem. Ker smo predpostavljali, da komunikacijske molekule proizvajajo le žive celice, smo uvedli avtomatsko računalniško štetje živih kvasnih celic s prostodostopnim programom ImageJ. S pomočjo podatka o živih celicah in o koncentraciji proizvedenih aromatskih alkoholov smo uvedli nov parameter - specifično hitrost proizvodnje aromatskih alkoholov. Primernost omenjenega parametra smo preverili tudi na nivoju transkripcije in pokazali, da obstaja sinhronizacija z ANG izražanjem ARO genov, odgovornih za sintezo aromatskih alkoholov. Ugotovili smo, da proizvodnja feniletanola, triptofola in tirozola korelira s celično gostoto in doseže največjo vrednost ob koncu eksponentne faze. Izmed okoljskih dejavnikov, ki so jim kvasovke izpostavljene tekom fermentacije smo preučevali vpliv etanola, dušika, žveplovega dioksida in vpliv prisotnosti kisika ter ugotovili, da dodatek etanola najbolj očitno vpliva na proizvodnjo feniletanola, triptofola in tirozola, saj se z večanjem deleža etanola zmanjšuje specifična hitrost proizvodnje aromatskih alkoholov. Dosedanje objave ne navajajo vpliva feniletanola in triptofola na dinamiko fermentacije in aromo vina. Po dodatku 1000 pM koncentracije feniletanola in triptofola na začetku eno- in večvrstne fermentacije s kvasovkama S. cerevisiae in C. zemplinina smo ugotovili, da dodatek aromatskih alkoholov ne vpliva na živost celic in v večji meri tudi ne na dinamiko fermentacije, ima pa pomemben vpliv na aromatski profil končnega produkta. Mutual interactions between yeasts and their influence on production of aromatic compounds important for wine aroma are not well understood and the research on yeast communication is still in its infancy. Saccharomyces cerevisiae secretes the communication molecules phenylethanol and tryptophol, which have been suggested to play in quorum sensing. They are present in the media in micromolar concentrations and therefore their detection and quantification requires analytical methods with high detection sensitivity. In our experimental work a simple, quick and broadly accessible method for the detection of phenylethanol, tryptophol and tyrosol was developed. The method is based on high pressure liquid chromatography in combination with a highly specific phenyl column and fluorescence detector. We assumed that communication molecules are secreted only by viable cells and by counting them by Image J, a computer based program we were able to obtain the data that were based only on live cells, which lead to implementation of a new parameter named production rate of communication molecules. Using this parameter we observed that production of aromatic alcohols is synchronized with transcription of ARO genes responsible for the synthesis of these communication molecules. Furthermore, the production of communication molecules was found to be dependent on cell density and their concentration was the highest at the end of the exponential phase. Next, the effect of ethanol, nitrogen, sulphur dioxide and oxygen on the production rate of communication molecules was investigated. Results indicated that the production rate of phenylethanol, tryptophol and tyrosol decreases with increasing ethanol concentrations. The addition of 1000 pM concentration of phenylethanol and tryptophol at the start of mixed and single culture fermentation with S. cerevisiae and C. zemplinina had no effect on cell viability or fermentation dynamics but significantly changed the fermentation aromatic profile. This is the first report addressing the effect of phenylethanol and tryptophol on the fermentation process and providing the first evidence on the role of communication molecules in formation of the wine aroma. Šifra D.11 Drugo Objavljeno v [M. Avbelj];[Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in biotehniških znanosti]; 2013; XVII, 194 f., [9] f. pril.; Avtorji / Authors: Avbelj Martina Tipologija 2.08 Doktorska disertacija 9.Drugi pomembni rezultati projetne skupine8 Glede na omejitev v točkah 7 in 8 še ostali pomembnejši dosežki projektne skupine: Komunikacijo pri B.subtilis smo predstavili na mednarodnih konferencah s postri, v doktorski nalogi (Štefanič, Polimorfizem in specifičnost sistema za zaznavanje kvoruma bakterije Bacillus subtilis v talnem mikrohabitatu, COBISS '3691T7T) in v diplomski nalogi (Lukežič, Fenotipska karakterizacija sevov Bacillus subtilis, izoliranih iz talnega mikrookolja, COBISS 3666296). Komunikacijo pri C. jejuni smo predstavili v članku Šikič Pogačar in sod.: Survival of stress exposed Campylobacter jejuni in the murine macrophage J774 cell line. Int.j.food microbiol., 2009, 129, 68-73, COBISS 3532920. Del raziskave pri Vibrio sp. smo predstavili v diplomskem delu (Drčar, Določanje signalnih molekul in vpliv slanosti na njihovo produkcijo pri bakteriji Vibrio sp., COBISS 3763064) in v poglavju v knjigi (Danevčič in Stopar, Environmental quality determines physiological behaviour of bacteria. V: Drury in Pridgen (ur.). Handbook of environmental quality. New York: Nova Science Publishers, 2009, str. 349-364; COBISS 3624568). Raziskave S. cerevisiae smo predstavili s postri in predavanji na mednarodnih konferencah, v doktorski nalogi (Zupan, Opredelitev invazivne rasti v populaciji kliničnih in nekliničnih sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae, COBISS 3756152), magistrski nalogi (Bezek, Vloga signalnih molekul pri alkoholni fermentaciji s čisto in združeno starter kulturo, COBISS 4146040) ter v diplomskem delu (Oketič, Vpliv okoljskih dejavnikov na invazivno rast sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae, COBISS 3656568). Komunikacija je bila predstavljena tudi v intervijuju za dnevni časopis (Raspor, Mikroorganizmi se tudi pogovarjajo : prof. dr. Peter Raspor ob 50. obletnici Slovenskega mikrobiološkega društva. Delo (Ljubl.), 18. nov. 2010, leto 52, št. 268, str. 23, portret; COBISS 253928960). lO.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine9 10.1.Pomen za razvoj znanosti10 SLO Komunikacija med mikroorganizmi je v zadnjih letih hitro razvijajoče se področje v mikrobiologiji in igra ključno vlogo v medicini, veterini, biotehnologiji ter ekologiji. Rezutati projekta omogočajo razumevanje komunikacijskih odnosov med mikroorganizmi, ki so pomembni tako za znotrajvrstno kot tudi medvrstno komunikacijo. Razvoj novih metod za sledenje mikrobne komunikacije v dobro definiranih mikrobnih populacijah omogoča komplementiranje znanj in spoznavanje mehanizmov komunikacije med prokariontskimi in evkariontskimi organizmi. Študij vpliva okoljskih dejavnikov na komuniciranje med mikroorganizmi ni veliko, kljub temu da je znano, da okoljski dejavniki določajo najpomembnejše parametre mikrobne viabilnosti. Zaradi tega so vsi pridobljeni rezultati znotraj tega projekta novi in zanimivi. Fizikalni in kemijski dejavniki okolja pomembno vplivajo na potek komunikacije ali jo celo onemogočajo, zato so rezultati, ki izhajajo iz tega projekta, bistvenega pomena za razumevanje komunikacijskih odnosov v čistih mikrobnih kulturah kot tudi v kompleksnih mikrobnih združbah v okolju. Te informacije tako pripomorejo k boljšemu razumevanju, obvladovanju in vodenju številnih mikrobnih procesov v biotehnologiji. Prav tako je razumevanje vplivov okoljskih dejavnikov na komuniciranje in preživetje ključno pri obvladovanju patogenih mikroorganizmov kot so Campylobacter jejuni, kar je pomembno z vidika medicine in živilske industrije. ANG Microbial communication is rapidly expanding field in microbiology in last few years. It plays an important role in medicine, veterinary medicine, biotechnology and ecology. The project results enable understanding of the communication relations between microorganisms that are important for intraspecies and interspecies communication. The establishment of new methods for discovering communication mechanisms in well-defined microbial populations enables us discovering communication mechanisms among eukaryotic and prokaryotic organisms. In spite of the fact that environmental factors determine the main parameters of microbial viability, the influence of environmental factors on microbial communication is in general not well established. All our results obtained in this project are thus new and interesting. Environmental physico-chemical parameters positively or negatively regulate communication. The results of the project are crucial for understanding the communication relations in the pure microbial cultures as well as in complex microbial communities in the environment. This information contributes to a better understanding and control of many microbial processes in biotechnology. The knowledge about the influence of environmental parameters on communication and microbial survival has further importance in the pathogen control as for example by Campylobacter jejuni, which is important in terms of medicine and food industry. 10.2.Pomen za razvoj Slovenije11 SLO Različni modelni mikroorganizmi in s tem različni metodološki pristopi študija komunikacije omogočajo izmenjavo znanj med raziskovalci znotraj projektne skupine in drugačen pogled na delovanje in obnašanje mikrobne populacije. Prav tako rezultati projekta širijo naše razumevanje mikrobnega komuniciranja in promovirajo našo projektno skupino na atraktivnem raziskovalnem področju medceličnega komuniciranja s predstavitvijo rezultatov širši strokovni javnosti na mednarodnih srečanjih. Del pridobljenega znanja se uporablja tudi pri vzgoji novih kadrov (doktorandov in diplomantov) v okviru programa raziskovalnega projekta. ANG Different model microorganisms and different methodologies for studying microbial communication facilitate the exchange of knowledge between researchers within the project group and give us a different perspective on the mechanism and behaviour of the microbial population. The project results also broader our knowledge about microbial communication and promote our project group in the attractive research field of intercellular communication by presenting the results at international meetings. An important benefit is also the knowledge transfer to new young and perspective researchers (undergraduate and PhD students). ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.35 Drugo Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d Komentar 12.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O O O o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu o o o o G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije o o o o G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih O o o o G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti o o o o G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti o o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave o o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete o o o o G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj o o o o G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura o o o o G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva o o o o G.09. Drugo: o o o o Komentar 13.Pomen raziskovanja za sofinancerje12 Sofinancer 1. Naziv Naslov Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 14.Izjemni dosežek v letu 201213 14.1. Izjemni znanstveni dosežek 14.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba raziskovalne organizacije: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta in vodja raziskovalnega projekta: Peter Raspor Kraj in datum: [Ljubljana ZIG |12.3.2013 Oznaka prijave: ARRS-RPROJ-ZP-2013/82 1 Opredelite raziskovalno področje po klasifikaciji FOS 2007 (Fields of Science). Prevajalna tabela med raziskovalnimi področji po klasifikaciji ARRS ter po klasifikaciji FOS 2007 (Fields of Science) s kategorijami WOS (Web of Science) kot podpodročji je dostopna na spletni strani agencije (http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/sifranti/preslik-vpp-fos-wos.asp). Nazaj 2 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 3 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 4 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 5 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 6 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 7 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta _ - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 8 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 7 in 8 (npr. ker se ga v sistemu COBISS ne vodi). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 9 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 12 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj 13 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2012 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2013 v1.00 BF-EA-DA-EC-C5-C3-4A-59-75-BE-42-BC-02-0F-AC-77-A5-B1-C7-B1