Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin
Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin
Peptide and protein fatty acylation
Nina Koœevar, Samo Kreft
Povzetek: Poveœanje lipofilnosti hidrofilnih peptidov in proteinov z metodami aciliranja predstavlja enega od osnovnih pristopov za izboljøanje prehoda bioloøkih membran in s tem poveœanje bioloøke uporabnosti. V reakciji aciliranja z derivati maøœobnih kislin na reaktivne aminokislinske skupine peptidov in proteinov kovalentno veæemo lipofilne verige derivatov maøœobnih kislin. Œlanek podaja pregled kemijskih metod aciliranja, na kratko pa je predstavljen tudi pomen aciliranih peptidov in proteinov, tako z bioloøkega kot s farmakoloøkega vidika.
Kljuœne besede: aciliranje, peptidi, prepustnost membrane, proteini
Abstract: Fatty acylation represents one of the basic methods for increasing membrane permeability of hydrophilic peptides and proteins for the increase of their bioavailability. In the fatty acylation reaction, lipophilic chains of the fatty acid derivatives are covalently attached to reactive aminoacid residues of peptides and proteins. The article represents a review of chemical fatty acylation methods. Additionally, the importance of fatty acylated peptides and proteins is discussed in its biological as well as pharmacological aspect.
Key words: fatty acylation, membrane permeability, peptides, proteins
1 Uvod
Peptidi in proteini so bioloøke makromolekule, ki so bistvenega pomena za usklajeno potekanje biokemijskih procesov v œloveøkem organizmu. Sprememba v njihovi funkciji ali poruøenje njihovega fizioloøkega ravnovesja sta lahko vzroka za øtevilne patoloøke procese in bolezni.
Po drugi strani so peptidi in proteini tudi skupina bioloøko aktivnih spojin, ki predstavljajo velik potencial kot zdravilne uœinkovine. Njihova terapevtska uporaba je danes øe moœno omejena (vnaøamo jih predvsem parenteralno) zaradi neobstojnosti pri razliœnih fizioloøkih pH-jih, hitre encimske razgradnje in kratkega razpolovnega œasa, potencialne imunogenosti ter slabega prehajanja bioloøkih membran kot posledice hidrofilnosti (1).
Pomembnejøi pristopi za izboljøanje prehajanja membran in s tem poveœanje bioloøke uporabnosti temeljijo na:
• podaljøanju œasa zadræevanja na mestu absorpcije z mukoadhezivnimi farmacevtskimi oblikami,
• poveœanju prepustnosti s pospeøevalci absorpcije, z iontoforezo ali vkljuœevanjem peptidov in proteinov v liposome ali nanodelce in
• poveœanju lipofilnosti s kemijskimi modifikacijami peptidov in proteinov (2).
Prva spoznanja o lipidno-proteinskih konjugatih segajo v leto 1951, ko sta raziskovalca Folch in Lees v moæganskem tkivu odkrila do takrat neznane spojine in jih poimenovala proteolipidi (3). Znanstveno delo
na tem podroœju je dobilo v naslednjih desetletjih intenzivne razseænosti, pri œemer je moœno napredovalo tudi znanje o aciliranju peptidov in proteinov z maøœobnimi kislinami. Gre za biokemijski proces, znaœilen za vse evkariontske celice, ki se odvija kot kotranslacijska ali posttranslacijska sprememba (4). Ker je maøœobnokislinska veriga na peptid oziroma protein vezana preko amidne, estrske ali tioestrske vezi, poznamo tri vrste aciliranja – N-aciliranje, O-aciliranje, ki je najmanj pogosto, in S-aciliranje (5) (slika 1). Med reakcije N-aciliranja uvrøœamo N-miristoiliranje, ki pomeni kovalentno vezavo 14 ogljikovih atomov dolge nasiœene miristinske verige na N-konœni glicin (6) ali e-amino skupino lizina (7), ter N-palmitoiliranje, ki pomeni kovalentno vezavo 16 ogljikovih atomov dolge nasiœene palmitinske verige na N-konœni glicin (6) ali aminsko skupino N-konœnega cisteina (8). S-aciliranje najpogosteje pomeni S-palmitoiliranje, zato v literaturi izraza navadno kar enaœijo. Gre za reverzibilno (proces je dinamiœen, saj in vivo poteka tudi encimsko deaciliranje) kovalentno povezavo med palmitinsko verigo in tiolno skupino cisteina (6). O-aciliranje sreœamo le v redkih primerih, poteœe pa na serinski skupini (9, 10).
2 Aciliranje peptidov in proteinov
Eden izmed pristopov, ki jih uporabljamo za kemijsko modificiranje peptidov in proteinov, so metode aciliranja z reaktivnimi derivati maøœobnih kislin. Gre za reakcije, s katerimi na reaktivne aminokislinske skupine peptidov in proteinov kovalentno pripnemo
Nina Koœevar, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
Izr. prof. dr. Samo Kreft, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
farm vestn 2008; 59 269
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 270
-^-
Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles
lipofilne verige derivatov maøœobnih kislin. Tako modificirani peptidi in proteini imajo zaradi poveœane lipofilnosti izrazito izboljøane transportne lastnosti, hkrati pa v veliki meri ohranijo svojo aktivnost (11-14). Kot so pokazale raziskave z acilirano ribonukleazo A, lahko zadostuje æe ena sama palmitinska (11) oziroma stearinska (15) veriga, da izrazito poveœamo prehod krvno-moæganske pregrade.
Potencialna mesta aciliranja so s povrøine molekule peptida oziroma proteina izstopajoœe reaktivne aminokislinske skupine – aminska, hidroksilna in tiolna. Po reakciji tako nastanejo amidna, estrska in tioestrska vez (slika 1), od katerih je prva najstabilnejøa. V sploønem je zato najbolj zaæelen potek reakcije v smeri selektivnega nastanka N-aciliranega produkta.
Derivati maøœobnih kislin, s katerimi najpogosteje izvajamo reakcije aciliranja, so lipofilni kislinski kloridi in hidrofilnejøi N-hidroksi -sukcinimidni estri maøœobnih kislin (slika 2). Maøœobne kisline naj bi imele od 8 do 18 ogljikovih atomov dolge verige (oktanojska, dekanojska, lavrinska, miristinska, palmitinska in stearinska kislina) pri œemer v sploønem velja, da imajo boljøe transportne lastnosti proteini, modificirani z daljøimi maøœobnimi verigami
O
R-^Cl
Protein
A.
N H
.. Protein
a) iV-aciliranje
Protein.
Protein
b) O-aciliranje
Protein
Af-miristoiliranj e
JV-palmitoiliranje
c) S-palmitoiliranje
O Protein.
Slika 1: Vrste aciliranja in vrste kemijskih vezi, ki nastanejo v reakciji: (a) N-aciliranje z miristinsko in s palmitinsko verigo in amidna vez, (b) O-aciliranje s palmitoleinsko (cis-9-heksadecenojsko) verigo in estrska vez ter (c) S-palmitoiliranje s palmitinsko verigo in tioestrska vez.
Figure 1: Types of fatty acylation and types of chemical bonds
formed in the reaction: (a) N-acylation with myristic and palmitic chain and amide bond, (b) O-acylation with palmitoleic (cis-9-hexadecenoic acid) and ester bond, and (c) S-palmitoylation with palmitic chain and thioester bond.
b    R-O-N
Slika 2: Shematski prikaz reakcije aciliranja s kislinskim kloridom (a) in z N-hidroksisukcinimidnim estrom maøœobne kisline (b), ki poteœe na aminski skupini proteina.
Figure 2: Schematic representation of fatty acylation reaction using fatty acyl chloride (a) and N-hydroxysuccinimide ester of a fatty acid (b), which utilizes the protein’s amino group.
Prva posebnost reakcij aciliranja izvira iz fizikalne narave peptidov oziroma proteinov ter reagentov za aciliranje. Te spojine namreœ v istem mediju – vodnem, ki raztaplja peptid oziroma protein, ter organskem, ki raztaplja reagent za aciliranje – niso topne. V reakcijski zmesi moramo zato zagotoviti øe prisotnost tretjega dejavnika, kot je na primer povrøinsko aktivna snov. Tej teæavi se lahko izognemo z uporabo vodotopnih derivatov N-hidroksisukcinimidnih estrov maøœobnih kislin, vendar pa moramo le-te pripraviti sami, saj komercialno niso dostopni, poleg tega pa je njihova uporaba vezana na specifiœne lastnosti peptida oziroma proteina, kot je na primer prisotnost tiolne skupine (12). Drugo pomembno omejitev predstavlja dejstvo, da peptidov in proteinov ne smemo neposredno izpostavljati veœini organskih topil, saj lahko zaradi denaturiranja izgubijo svojo bioloøko aktivnost (2).
V sploønem sta se tako izoblikovala dva naœina izvedbe reakcij aciliranja z derivati maøœobnih kislin: aciliranje v organskem in aciliranje v vodnem mediju.
2.1 Aciliranje v organskem mediju
Prvo metodo so razvili za O- in S-palmitoiliranje peptidov (4). Temelji na relativno preprosti reakcijski shemi, po kateri reagent za aciliranje (kislinski klorid) dodamo neposredno organskemu topilu (trifluoroocetni kislini), v katerem je raztopljen peptid. Zaradi kislega medija ne pride do reakcije na aminskih skupinah, ki so popolnoma protonirane; taka reakcija lahko poteœe øele po nekaj urah do dnevih. Metoda je primerna za aciliranje manjøih hidrofobnih peptidov.
Drugi pristop je zasnovan na reakciji, ki poteka v kompleksnejøem reverzno micelarnem sistemu. V organskem topilu (na primer 2,2,4-trimetilpentanu) s pomoœjo povrøinsko aktivne snovi (Aerosol OT) dispergiramo baziœno raztopino peptida oziroma proteina (16). Pri
270 farm vestn 2008; 59
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 271
-^-
Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin
tem nastanejo reverzni miceli, v katerih vodno notranjost so vgrajeni peptidi oziroma proteini. Reagent za aciliranje (kislinski klorid), ki ga nato dodamo zunanji organski fazi, kontrolirano prehaja monosloj povrøinsko aktivne snovi in vstopa v reakcijo z aminskimi skupinami na peptidu oziroma proteinu. Metoda je øe posebej uporabna, kadar æelimo prepreœiti agregacijo posameznih molekul peptida oziroma proteina, do katere lahko v veœjem obsegu pride v vodnih raztopinah, in pa kadar v procesu aciliranja nastanejo moœno lipofilni produkti.
2.2  Aciliranje v vodnem mediju
Te metode so z vidika neobstojnosti hidrofilnih peptidov in proteinov v relativno agresivnih organskih topilih za izvajanje aciliranja najprimernejøe.
Prvi pristop predstavlja aciliranje z N-hidroksisukcinimidnimi estri maøœobnih kislin. Reakcija obsega dve stopnji – v prvi pripravimo N-hidroksisukcinimidni ester, v drugi pa izvedemo reakcijo s peptidom ali proteinom. Tako najprej reagirata maøœobna kislina (na primer palmitinska kislina) in N-hidroksisukcinimid, pri œemer moramo uporabiti tudi aktivator dicikloheksilkarbodiimid (slika 3). Nastali aktivni ester (N-hidroksisukcinimidni ester palmitinske kisline) nato dodamo pufrni raztopini peptida ali proteina (17).
Razvili so tudi nekaj zanimivih modifikacij te metode, od katerih uspeøno uporabljajo aciliranje s popolnoma vodotopnim derivatom palmitinske kisline. Pri tej reakciji pride do nastanka reverzibilne disulfidne vezi med tiolno skupino na proteinu in reagentom za aciliranje (palmitoilnim derivatom L-cisteinil-2-piridildisulfida) (12).
Druga metoda vkljuœuje pripravo micelarne disperzije reagenta za aciliranje. V prvi stopnji baziœni pufrni raztopini povrøinsko aktivne snovi (na primer natrijevega holata) dodamo lipofilni reagent za aciliranje (kislinski klorid). Po sonificiranju nastane micelarna disperzija reagenta za aciliranje, ki jo dodamo raztopini peptida oziroma proteina (18). Reagent za aciliranje je torej ujet v micelih homogeno porazdeljene notranje faze in enakomerno prehaja do peptida oziroma proteina.
Preprosto modifikacijo te metode predstavlja aciliranje z in situ pripravljeno disperzijo palmitoilklorida v vodni raztopini acetonitrila
(19). Reakcijo izvedemo tako, da kislinski klorid raztopimo v 100-odstotnem acetonitrilu in ga dodamo baziœni pufrni raztopini proteina, pri œemer vsebuje konœna reakcijska zmes do 30 odstotkov acetonitrila v vodi. Pri tej koncentraciji acetonitrila veœina proteinov øe ne denaturira. Palmitoilklorid je v taki raztopini ravno dovolj topen za uspeøen potek reakcije, preostanek, ki se obori, pa na koncu odstranimo s centrifugiranjem (19).
Kemijske reakcije aciliranja so v sploønem slabo selektivne, saj lahko reagent za aciliranje reagira z razliœnimi reaktivnimi aminokislinskimi skupinami hkrati (z aminsko, s hidroksilno in tiolno), poleg tega pa lahko dobimo tudi zmes monoaciliranih, diaciliranih, triaciliranih molekul itd. Ker ima æeleni bioloøki uœinek pogosto le ena vrsta molekul, je izjemnega pomena, da razvijemo dobre analizne metode za karakterizacijo nastalih heterogenih produktov, kot sta na primer tekoœinska kromatografija in masna spektroskopija.
3 Pomen aciliranja
Aciliranje proteinov z maøœobnimi kislinami izrazito poveœa njihove lipofilne lastnosti ter poslediœno spremeni tudi njihovo fizioloøko vlogo. Acilirani proteini opravljajo v organizmu øtevilne in zelo raznolike naloge. Izmed najbolj raziskanih lahko izpostavimo vezavo oziroma interakcije s celiœnimi membranami, razmeøœanje do celiœnih organelov in drugih struktur znotraj celice, signaliziranje ter vpliv na interakcije z drugimi proteini (20, 21).
Z vidika terapevtske uporabe moramo kot prvo pomembno znaœilnost aciliranih peptidov in proteinov izpostaviti izboljøanje prehodnosti bioloøkih membran zaradi poveœane lipofilnosti (11, 12, 17, 19, 22). V raziskavah so dobro prouœili tudi vplive na farmakokinetiœne lastnosti. Dokazali so, da lahko z aciliranjem podaljøamo razpolovni œas hemoglobina (23) in inzulina (24), saj pride do poveœane vezave na albumin. Œeprav z aciliranjem povzroœimo strukturne spremembe peptidnih in proteinskih molekul, pa s tem ne poveœamo njihove imunogenosti. Celo nasprotno – dokazali so, da lahko z aciliranjem imunogenost zniæamo in tako znaœilno zmanjøamo nastanek protiteles (25). To je pravzaprav razumljivo, saj so maøœobne kisline v organizmu normalno prisotne in jih imunski sistem ne prepozna kot
R-COOH     +
HO-N
DCC
O
R-O-N
O
+      DCS
mašcobna kislina
JV-hidroksisukcinimid
iV-hidroksisukcinimidni ester mašcobne kisline
Slika 3: Shematski prikaz priprave N-hidroksisukcinimidnega estra maøœobne kisline. V reakciji po aktivaciji z dicikloheksilkarbodiimidom
(DCC) reagirata maøœobna kislina in N-hidroksisukcinimid. Nastaneta N-hidroksisukcinimidni ester maøœobne kisline in dicikloseœnina (DCS), ki jo odfiltriramo.
Figure 3: Schematic representation of preparation of N-hydroxysuccinimide ester of a fatty acid. In the reaction, a fatty acid and N-hydroxysuccinimide react after activation with dicyclohexylcarbodiimide (DCC). N-hydroxysuccinimide ester of the fatty acid and dicyclohexylurea (DCS), which is filtered out, are formed.
farm vestn 2008; 59 271
FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 272
Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles
tujke.
Najbolj znan acilirani protein, ki ga uporabljamo v terapevtske namene, je inzulin detemir. Na njegovo lizinsko skupino je vezana 14 ogljikovih atomov dolga veriga miristinske kisline. Posledica te spremembe je zdruæevanje molekul v heksamerne in diheksamerne strukture na mestu injiciranja (podkoæno), kar upoœasni absorpcijo v krvni obtok, poleg tega pa pride tudi do znaœilno poveœane vezave na albumin (tako tkivni kot plazemski). Omenjeni uœinki se odrazijo v podaljøanem in bolj enakomernem plazemskem profilu (26).
4  Sklep
Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin je obetavna kemijska metoda, s katero lahko moœno izboljøamo njihove farmakoloøke lastnosti. Œeprav je ta pristop relativno enostaven s sinteznega vidika, pa ne moremo mimo dejstva, da so reakcije v sploønem slabo selektivne in zato vodijo do nastanka heterogenih produktov. To nakazuje pomen natanœne karakterizacije oziroma uporabe kompleksnih analiznih metod, ki so zelo zahtevne. Vendar pa omenjena problematika predstavlja drugo plat zgodbe, ki presega okvire tega œlanka.
5  Literatura
1.   Frokjaer S, Otzen DE. Protein drug stability: a formulation challenge. Nat Rev Drug Discov 2005; 4: 298–306.
2.   Øegula M, Vreœer F. Nove farmacevtske oblike za peroralno dostavo peptidov in proteinov. Farm Vestn 2003; 54: 25–35.
3.   Folch J, Lees M. Proteolipides, a new type of tissue lipoproteins; their isolation from brain. J Biol Chem 1951; 191: 807–817.
4.   Yousefi-Salakdeh E, Johansson J, Strömberg R. A method for Sand O- palmitoylation of peptides: synthesis of pulmonary surfactant protein-C models. Biochem J 1999; 343: 557–562.
5.   Sachon E, Nielsen PF, Jensen ON. Characterization of N-palmitoylated human growth hormone by in situ liquid-liquid extraction and MALDI tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom 2007; 42: 724–734.
6.   Linder ME, Deschenes RJ. New insights into the mechanisms of protein palmitoylation. Biochemistry 2003; 42: 4311–4320.
7.   Stevenson FT, Bursten SL, Locksley RM, Lovett DH. Myristyl acylation of the tumor necrosis factor alpha precursor on specific lysine residues. J Exp Med 1992; 176: 1053–1062.
8.   Pepinsky RB, Zeng C, Wen D et al. Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog. J Biol Chem 1998; 273: 14037–14045.
9.   Kojima M, Hosoda H, Date Y et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 1999; 402: 656–660.
10.  Takada R, Satomi Y, Kurata T et al. Monounsaturated fatty acid modification of Wnt protein: its role in Wnt secretion. Dev Cell 2006; 11: 791–801.
11. Chopineau J, Robert S, Fénart L e tal. Monoacylation of ribonuclease A enables its transport across an in vitro model of the blood-brain barrier. J Control Release 1998; 56: 231–237.
12. Ekrami HM, Kennedy AR, Shen W-C. Water-soluble fatty acid derivatives as acylating agents for reversible lipidization of polypeptides. FEBS Lett 1995; 371: 283–286.
13. Kabanov AV, Levashov AV, Alakhov VY et al. Fatty acylation of proteins for translocation across cell membranes. Biomed Sci 1990; 1: 33–36.
14. Martins MBF, Jorge JCS, Cruz MEM. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. Biochimie 1990; 72: 671–675.
15. Chopineau J, Robert S, Fénart L et al. Physicochemical characterization and in vitro interaction with brain capillary endothelial cells of artificially monoacylated ribonucleases A. Lett Pept Sci 1997; 4:313–321.
16. Robert S, Domurado D, Thomas D et al. Fatty acid acylation of RNAse A using reversed micelles as microreactors. Biochem Biophys Res Commun 1993; 196: 447–454.
17. Foldvari M, Attah-Poku S, Hu J et al. Palmitoyl derivatives of interferon alpha: potential for cutaneous delivery. J Pharm Sci 1998; 87:1203–1208.
18. Martins MBF, Jorge JCS, Cruz MEM. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. Biochimie 1990;72: 671–675.
19. Kocevar N, Obermajer N, Strukelj B et al. Improved acylation method enables efficient delivery of functional palmitoylated cystatin into epithelial cells. Chem Biol Drug Des 2007; 69: 124–131.
20. Resh MD. Trafficking and signaling by fatty-acylated and prenylated proteins. Nat Chem Biol 2006; 2: 584–590.
21. Nadolski MJ, Linder ME. Protein lipidation. FEBS J 2007; 274: 5202–5210.
22. Slepnev VI, Phalente L, Labrousse H et al. Fatty acid acylated peroxidase as a model for the study of interactions of hydrophobically-modified proteins with mammalian cells. Bioconjug Chem 1995; 6: 608–615.
23. Fowler SA, Andracki M, Hurst G et al. Prolongation of the intravascular retention of hemoglobin modified with a long-chain fatty acid derivative. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 1994; 22: 27–42.
24. Kurtzhals P, Havelund S, Jonassen I et al. Effect of fatty acids and selected drugs on the albumin binding of a long-acting, acylated insulin analogue. J Pharm Sci 1997; 86: 1365–1368.
25. Shi Q, Domurado M, Domurado D. Effect of protein chemical hydrophobization on antiglucose oxidase immunoglobulin production in mouse. Pharmacol Toxicol 1995; 76: 278–285.
26. Havelund S, Plum A, Ribel U et al. The mechanism of protraction of insulin detemir, a long-acting, acylated analog of human insulin. Pharm Res 2004; 21: 1498–1504.
272 farm vestn 2008; 59