Molekularna diagnostika tuberkuloze - upanje ali iluzija? Molecular diagnosis of tuberculosis - hope or illusion? Manca Žolnir Dovč*, Mario Poljak**, Katja Seme*** Ključne besede tuberkuloza - diagnostika pollmerazna verižna reakcija RNA bakterijska molekularna sonda tehnike Izvleček. Tuberkuloza ponovno postaja velik zdravstveni problem, saj število obolelih v svetu v zadnjih letih narašča, povečuje pa se tudi število sevov Mycobacterium tuberculosis, odpornih proti več antituberkulotikom. Metode molekularne mikrobiologije vzbujajo največ upanja za izboljšanje in odpravo nekaterih pomanjkljivosti klasične laboratorijske diagnostike tuberkuloze. Med molekularnimi metodami so najbolj razvite in raziskane različne tehnike pomnoževanja majhnih (za določen mikroorganizem) značilnih delcev nu-kleinskih kislin in vitro. Te tehnike v primerjavi s klasičnimi mikrobiološkimi metodami skrajšajo čas do postavitve diagnoze z nekaj tednov na le nekaj ur. Žal njihova občutljivost zaenkrat še zaostaja za klasičnimi metodami. Uporaba molekularnih metod ni omejena le na izboljšanje laboratorijske diagnostike tuberkuloze, temveč obeta tudi hitrejšo in zanesljivejšo identifikacijo miko-bakterij in hitrejše odkrivanje sevov M. tuberculosis, odpornih proti antituberkulotikom. Uporabna vrednost molekularnih metod na področju epidemiologije tuberkuloze je že sedaj neprecenljiva. Namen našega prispevka je kratka predstavitev različnih metod pomnoževanja nukleinskih kislin, ki jih uporabljamo za odkrivanje bacilov tuberkuloze, prikaz najpogostejših težav pri uporabi ter predstavitev treh komercialno dostopnih diagnostičnih kompletov, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo ali na pomnoževanju, posredovanem s prepisovanjem RNA. Key words tuberculosis - diagnosis polymerase chain reaction RNA bacterial molecular probe tehniques Abstract. Tuberculosis represents a great world public health problem due to its increased incidence and the advent of multi-drug-resistant strains. Recent developments in molecular microbiology have raised hopes about the possibilities of new strategies for tuberculosis diagnosis. Nucleic acid amplification of target molecules to a detectable level is the best developed and the best analyzed system for detecting mycobacteria. A variety of different amplification techniques has been described recently. Although these techniques promise to reduce the time for diagnosis from weeks to hours, their main drawback is lower sensitivity in comparison to the culture. Besides their potential value in diagnosis, amplification techniques offer the possibility of a rapid identification and drug susceptibility determination. Their application in other fields such as epidemiology, could benefit the control of tuberculosis indirectly. This article presents a brief overview of the principles of molecular diagnosis of tuberculosis, summarizes some of the application problems, and describes three recently developed commercial amplification tests based on polymerase chain reaction or transcription-mediated RNA amplification. *Mag. Manca Žolnir Dovč, dipl. blol., Klinični center Ljubljana, Inštitut za pljučne bolezni In tuberkulozo Golnik, 4204 Golnik **Doc. dr. Mario Poljak, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1000 Ljubljana ***As. dr. Katja Seme, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana Uvod Naraščanje števila obolelih za tuberkulozo v nekaterih državah sveta kakor tudi zaskrbljujoče povečevanje števila sevov bacilov tuberkuloze, odpornih proti več antituberkulotikom, je opozorilo na pomanjkljivosti sedanje laboratorijske diagnostike tuberkuloze (1-3). Klasične mikrobiološke diagnostične metode so namreč dolgotrajne (osamitev bacilov tuberkuloze), premalo občutljive (mikroskopski pregled kužnine, osamitev bacilov) ali premalo specifične (mikroskopski pregled) (4, 5). Zato je razumljivo, da je vsaka nova metoda, ki bi izboljšala mikrobiološko diagnostiko tuberkuloze, zaželena. Napredek molekularne biologije in genetike je prinesel pomembne novosti tudi v laboratorijski diagnostiki nekaterih mikroorganizmov. Najbolj obetavne so metode pomno-ževanja nukleinskih kislin in vitro, s katerimi lahko v nekaj urah pomnožimo značilni manjši odsek DNA ali RNA v velikem številu kopij. Metode so zelo občutljive, saj dajejo pozitiven rezultat že, če je v kužnini le nekaj molekul DNA ali RNA (6). Sedanje izkušnje in predvidevanja kažejo, da bodo te metode pomembno prispevale k hitrejši diagnostiki nekaterih virusnih, bakterijskih in parazitarnih bolezni, predvsem tistih, ki jih s sedanjimi metodami težko dokažemo ali je njihovo dokazovanje dolgotrajno (6, 7). Med omenjene bolezni prav gotovo sodi tudi tuberkuloza. Namen našega prispevka je kratka predstavitev različnih metod pomnoževanja nukleinskih kislin, ki jih uporabljamo za odkrivanje bacilov tuberkuloze, prikaz najpogostejših težav pri uporabi teh metod ter predstavitev treh komercialno dostopnih diagnostičnih kompletov, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo ali na pomnoževanju, posredovanem s prepisovanjem RNA. Klasična laboratorijska diagnostika tuberkuloze Mikroskopski pregled kužnine Mikroskopski pregled kužnine (razmaz) je osnovna in najmanj zahtevna bakteriološka metoda za odkrivanje mikobakterij v kužnini, saj z njo hitro in poceni odkrijemo osebe, ki izločajo velike količine bacilov tuberkuloze in so najpomembnejši vir okužbe. Razmaz lahko pripravimo iz kužnine neposredno ali po predhodnem homogeniziranju in centri-fugiranju. Razmaze najpogosteje barvamo s karbolnim fuksinom po Ziehl-Neelsenu ali po Kinyounu (8). Bolj občutljiva je različica barvanja razmazov z avramin ali rodamin flou-rokromi (8). Glavna pomanjkljivost navedenih metod je slaba občutljivost, saj je rezultat preiskave pozitiven le, če je v 1 ml kužnine prisotnih več kot 5.000-10.000 bacilov (9). Toliko mikobakterij ima v kužnini le približno polovica novoodkritih tuberkuloznih bolnikov v Sloveniji (10). Naslednja pomanjkljivost mikroskopskega pregleda razmaza kužnine je, da je njegova specifičnost odvisna predvsem od epidemioloških razmer na določenem geografskem področju (2). Z mikroskopskim pregledom namreč dokazujemo le prisotnost acido- in alkoholorezistentnih bacilov v kužnini oz. bacilov, ki se s kislinami in alkoholi ne razbarvajo. Na ta način seveda ne moremo določiti mikobakterij-ske vrste. Osamitev bacilov tuberkuloze Poskus osamitve (izolacija, kultivacija) je osnovna metoda laboratorijske diagnostike tuberkuloze, ki je trenutno med vsemi preiskavami najbolj občutljiva in specifična (2, 4, 5, 11). Še vedno velja kot »zlati standard«, po katerem opredeljujemo zanesljivost drugih laboratorijskih metod. Njena edina, a zelo pomembna pomanjkljivost je dolgotrajnost. Za tvorbo makroskopsko vidne bakterijske kolonije namreč potrebujejo bacili tuberkuloze v povprečju 3-8 tednov. Osnovni vzrok za počasno rast bacilov tuberkuloze na gojiščih je posebna zgradba celične stene, ki je zaradi velike vsebnosti maščob slabo prehodna za številne hranljive snovi (5). Za osamitev mikobakterij uporabljamo v laboratoriju različna trdna (jajčna ali agarska) in tekoča gojišča (gojišče po Baniču, gojišče Middlebrook 7H9®) ali gojišča, ki so sestavljena iz obeh faz (Septi-Chek AFB System®, Becton Dickinson, Sparks, ZDA). Trdna in tekoča gojišča, v katera smo zasadili kužnino, inkubiramo pri temperaturi 37 °C do tri mesece, s tem da enkrat tedensko izločamo vsa gojišča z vidno rastjo. Če po 6-te-denskem inkubiranju na gojiščih ni vidnih kolonij, izdamo negativen rezultat. Kljub temu vsa negativna gojišča inkubiramo še nadaljnih 6 tednov, saj nekateri bacili mikobakterij zrastejo šele v 12 tednih. Za osamitev bacilov tuberkuloze je na voljo tudi komercialni avtomatiziran radiometrič-ni sistem BACTEC® (Becton Dickinson, Sparks, ZDA), s katerim je osamitev mikobakterij nekoliko hitrejša kot na klasičnih bakterioloških gojiščih, vendar kljub temu traja najmanj 7-20 dni (2). Glavne pomanjkljivosti tega sistema so radioaktivni reagenti in visoka cena. Vsak sev mikobakterij moramo po osamitvi identificirati. Identifikacija največkrat temelji na mikroskopskih in makroskopskih značilnostih kolonij ter biokemičnih lastnostih posameznih vrst mikobakterij (8). V zadnjem času se v identifikaciji mikobakterij vse bolj uveljavljajo tudi metode, ki temeljijo na hibridizaciji nukleinskih kislin (12). Ponekod v svetu si pri identifikaciji mikobakterij pomagajo s plinsko-tekočinsko kromatografijo (angl. gas-liquid chromatography) ali tekočinsko kromatografijo z visoko ločljivostjo (angl. high-performance liquid chromatography) (13, 14). Dodatne metode za odkrivanje bacilov tuberkuloze Poleg mikroskopskopskega pregleda kužnine in poskusa osamitve bacilov tuberkuloze so v številnih laboratorijih za diagnostično uporabo preizkusili še vrsto drugih metod. Določanje značilne tuberkulostearinske kisline v kužninah s plinsko-tekočinsko kromatografijo ali s tekočinsko kromatografijo z visoko ločljivostjo je primerno predvsem za odkrivanje bacilov tuberkuloze v primarno sterilnih kužninah, kot je na primer likvor (15). Kljub visoki specifičnosti metodi nista dovolj občutljivi za rutinsko neposredno dokazovanje mikobakterij v kužninah iz dihal. Poleg tega sta tehnično zahtevni in precej dragi. Zato se uporabljata le za identifikacijo mikobakterij v nekaterih vrhunskih specializiranih laboratorijih (2, 9). Metode, ki temeljijo na hibridizaciji nukleinskih kislin, so se izkazale kot premalo občutljive za neposredno dokazovanje mikobakterij v kužninah. Zato tudi te uporabljamo izključno za hitrejšo identifikacijo predhodno osamljenih mikobakterij (4, 12). Tudi aglutinacijske in encimsko-imunske metode, s katerimi odkrivamo prisotnost miko-bakterijskih antigenov oz. značilnih antimikobakterijskih protiteles, niso uporabne za rutinsko diagnostiko, saj so se v številnih raziskavah izkazale kot premalo občutljive in specifične (9). Metode pomnoževanja delcev nukleinskih kislin Silovit razvoj molekularne mikrobiologije v preteklem desetletju, predvsem odkritje metod za pomnoževanje delcev nukleinskih kislin, je vneslo pomembne spremembe tudi v laboratorijsko diagnostiko tuberkuloze (5). Dokazovanje bacilov tuberkuloze s temi metodami temelji na treh osnovnih postopkih: osamitvi nukleinskih kislin iz kužnine, in vitro pomnoževanju specifičnega majhnega odseka osamljenega dednega materiala in dokazovanju specifičnosti pomnoženega genomskega odseka (6). Po odkritju verižne reakcije s polimerazo leta 1983 so do danes razvili približno 20 različnih metod za pomnoževanje delcev nukleinskih kislin in vitro ter skoraj dvakrat več njihovih različic. Zaradi obsega zdravstvenega problema tuberkuloze so skoraj vse najprej preizkušali na tem modelu. Med vsemi razvitimi metodami pomnoževanja nukleinskih kislin sta se zaradi določenih prednosti, ugotovljenih s primerjalnimi študijami več različnih metod, ter zaradi razvoja komercialno dostopnih in standardiziranih diagnostičnih kompletov pri odkrivanju bacilov tuberkuloze najbolj uveljavili dve: verižna reakcija s polimerazo in pomnoževanje, posredovano s prepisovanjem RNA, ki ju bomo tudi podrobneje predstavili. Verižna reakcija s polimerazo Verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR) je najstarejša in največkrat uporabljena metoda pomnoževanja nukleinskih kislin in vitro. Glavni predpogoj za uspešno pomnoževanje je poznavanje nukleotidnega zaporedja vsaj dela tarč-nega genoma, ki ga želimo pomnožiti. To nam omogoča pravilno izbiro dveh kratkih značilnih odsekov nukleinskih kislin, t. i. začetnih oligonukleotidov (angl. primers), komplementarnih z mejnima deloma specifičnega odseka tarčnega genoma. Začetna oligonu-kleotida se spajata z nasproti ležečima vijačnicama tarčnega odseka genoma in sta usmerjena tako, da tvorba nove DNA poteka v prostoru med njima. Zato je velikost novo nastalih delcev DNA odvisna od njune medsebojne razdalje. S PCR je mogoče v nekaj urah dobiti več kot milijon kopij določenega odseka tarčnega genoma (6, 7). Za razliko od kasneje razvitih metod za pomnoževanje uporabljamo en sam encim- temperaturno obstojno DNA-polimerazo. Metodo izvajamo tako, da osamljeni DNA dodamo reakcijsko mešanico, ki poleg omenjenega encima vsebuje deoksinukleotidtrifosfa-te, par začetnih oligonukleotidov, soli in detergent v določenih koncentracijah. Mešanico za kratek čas inkubiramo pri treh točno določenih temperaturah, kar pomeni en ci- klus PCR. Pri temperaturi 95 °C dvovijačna molekula vzorca preide v dve enovijačni molekuli DNA. Druga temperatura, ki je največkrat izbrana med 45 in 75 °C, pogojuje spajanje začetnih oligonukleotidov s komplementarnima deloma vzorčne DNA. Podaljševanje začetnih oligonukleotidov oz. tvorba nove komplementarne molekule DNA v smeri od 5'-konca proti 3'-koncu se odvija med tretjo inkubacijo pri temperaturi 72 °C. Novi molekuli DNA sta med seboj komplementarni in sposobni v novem ciklusu s tremi in-kubacijami vezati enake začetne oligonukleotide. Vsak naslednji temperaturni ciklus pod-vojuje količino tarčnega dela DNA. Navadno je PCR sestavljen iz 25- do 40-kratnega zaporednega ponavljanja določenega ciklusa. Končni rezultat dogajanja je eksponentno kopičenje značilnih tarčnih delov DNA (6, 7). V preteklih petih letih so razvili več kot 20 raziskovalnih različic PCR za dokazovanje bacilov tuberkuloze in jih preizkusili v različnih kužninah (sputum, plevralna tekočina, likvor, urin, kri) (2, 16, 17). Podobno kot pri klasičnih laboratorijskih metodah se je za najprimernejšo kužnino izkazal sputum. Pomnoževanje so izvajali na različnih odsekih DNA bacilov tuberkuloze. V začetku devetdesetih let so največkrat pomnoževali odseke genov, ki vsebujejo zapise za mikobakterijske beljakovine: beljakovino 65 kDa (18-20), beljakovino b (21), beljakovino MPB 64 (22) ter beljakovino 32 kDa (23). V zadnjem času pa najpogosteje pomnožujejo odseke DNA mikobakterij, ki so v geno-mu prisotni v več kopijah, oz. odseke t. i. insercijskih zaporedij (angl. insertion sequence), največkrat IS 6110 (24-26) ali IS 986 (27). PCR je v svoji osnovi precej enostavna metoda. Vsaj teoretično je za uspešno pomnoževanje zadostna prisotnost ene same kopije genoma bacila tuberkuloze v kužnini, katere značilni odsek lahko v nekaj urah pomnožimo več kot milijonkrat. Toda v praksi naletimo na številne težave (7). Največja so lažnopozitivni rezultati, ki so največkrat posledica kontaminacije s PCR-pridelki, nastalimi v predhodnih pomnoževanjih. Nič manjša težava niso lažnonegativni rezultati, ki so večinoma pogojeni z nekakovostno osamitvijo nukleinskih kislin, prisotnostjo zaviralcev pomnoževanja v kužninah ter z nepravilno izbiro pogojev pomnoževanja (6, 7, 16, 28-30). Na srečo so za odpravljanje omenjenih problemov razviti številni specifični in nespecifični ukrepi (6, 7). Kljub temu prevladuje splošno mnenje, da je navedene težave mogoče odpraviti šele z uvedbo standardiziranih diagnostičnih kompletov (4, 7, 16, 30). V začetku leta 1994 se je na tržišču končno pojavil tudi prvi komercialno dostopni test za diagnostiko tuberkuloze, ki temelji na uporabi metode PCR - Amplicor M. tuberculosis Complex Test®. Diagnostični komplet je razvila družba Roche Molecular Systems (Branchburg, ZDA). Namenjen je za odkrivanje mikobakterij iz sklopa M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) izključno v kužninah iz dihal (sputum, aspirat iz bronha, bronhoalveolarni izpirek). Test je sestavljen iz več procesov: osamitve DNA iz kužnine, pomnoževanja specifičnega odseka mikobakterijske DNA s pomočjo z bio-tinom označenih začetnih oligonukleotidov, hibridizacije PCR-pridelkov s specifično DNA-lovko, vezano na dno mikrotitracijske ploščice, in biotin-avidin-peroksidaznega testa za dokazovanje nastalega hibridizacijskega kompleksa. Tarčni odsek bakterijske DNA je 584 baznih parov dolg odsek gena, ki vsebuje zapis za 16S rRNA. Začetni oligonu-kleotidi so izbrani tako, da lahko pomnožijo omenjeni genomski odsek vseh mikobak- terij, medtem ko je hibridizacijska lovka specifična le za mikobakterije iz sklopa M. tuberculosis. Test vključuje tudi poseben postopek za zmanjševanje možnosti nastanka lažno-pozitivnih rezultatov zaradi kontaminacije s pridelki predhodnih reakcij PCR (t. i. N-ura-cil-glikozilazni postopek) (31). Pomnoževanje, posredovano s prepisovanjem RNA Pomnoževanje, posredovano s prepisovanjem RNA (angl. transcription-mediated amplification, TMA) je druga najbolj uporabljana metoda v molekularni diagnostiki tuberkuloze (4, 16). Za razliko od PCR ni raziskovalnih različic TMA, ampak obstajata samo standardizirana diagnostična kompleta, ki temeljita na tej metodi. Prvi diagnostični komplet - MTD® (Amplified M. tuberculosis Direct Test) je konec leta 1993 razvila družba Gen-Probe (San Diego, ZDA). Podobno kot test Amplicor® je tudi test MTD® namenjen za dokazovanje mikobakterij iz sklopa M. tuberculosis izključno v kužninah iz dihal (32). Podoben komercialni test kot test MTD® je konec leta 1995 po hudih bojih na evropskih in ameriških sodiščih tržišču ponudila tudi družba Organon Teknika (Boxtel, Nizozemska) pod imenom NASBA® (angl. nucleic acid sequence based amplification) (33, 34). Ker oba diagnostična kompleta temeljita na metodi TMA, si družbi namreč očitata krajo licenčnih pravic. Ker ima test MTD® v ZDA že dovoljenje Food and Drug Administration (FDA) za uporabo v diagnostične namene, je prodaja in uporaba testa NASBA® v diagnostiki tuberkuloze tam prepovedana. Za razliko od ZDA, v Evropi ni tako strogih licenčnih zakonov in se zaenkrat oba testa uporabljata v diagnostične namene. Metoda TMA se v svoji osnovi popolnoma razlikuje od PCR. Osnovne razlike med obema metodama so v tem, da pri TMA pomnožujemo RNA, da pomnoževanje poteka pri eni sami temperaturi (izotermalno) in, da za pomnoževanje uporabljamo več encimov (32-34). Tako so v test NASBA® vključeni trije encimi in sicer T7 RNA-polimeraza (bak-teriofagna DNA-odvisna RNA-polimeraza, ki na dvojnovijačni DNA-matrici, ki vsebuje značilni bakteriofagni promotor, naredi več kopij enovijačne RNA), reverzna transkrip-taza (RNA- ali DNA-odvisna DNA-polimeraza) in RN-aza H (encim, ki razgrajuje vijač-nico RNA v dvojnovijačnem RNA-DNA-kompleksu) (34). Reverzno transkriptazo in RN-azo H v testu MTD® nadomešča posebna reverzna transkriptaza, ki ima poleg osnovne prepisovalne aktivnosti tudi aktivnost RN-aze H. Za pomnoževanje uporabljamo pri obeh testih podobno kot pri PCR dva začetna oligonukleotida: P1 in P2. Medtem ko je P1 povsem navaden začetni oligonukleotid, je P2 prirejen tako, da ima na 5'-koncu zaporedje promotorja T7 RNA-polimeraze. Oba diagnostična kompleta vsebujeta začetna oligonukleotida, komplementarna značilnim odsekom 16S rRNA vseh mikobakterij. Postopek pomnoževanja se začne s prileganjem začetnega oligonukleotida P2 na komplementarno zaporedje vzorčne RNA. Sledi podaljševanje začetnega oligonukleotida z reverzno transkriptazo ter nastanek komplementarne kopije DNA (cDNA) vzorčne RNA. Nato RN-aza H (ali v testu MTD® posebna reverzna transkriptaza) v nastalem dvojnovijačnem cDNA-RNA-kompleksu razgradi verigo RNA. Na enovijačno cDNA nato prileže začetni oligonukleotid P1, ki ga podaljša reverzna transkriptaza. Na ta način nastane dvojnovijačnica DNA-DNA, katere sestavni del je tudi aktivni promotor T7 RNA-polime-raze. T7 RNA-polimeraza nato naredi nekaj sto enovijačnih RNA-kopij tarčne nuklein- ske kisline. Novi ciklus pomnoževanja se spet začne s prileganjem začetnega oligonu-kleotida P2 na vse kopije vzorčne RNA, nastale v predhodnem ciklusu. Na ta način v vsakem naslednjem ciklusu pomnoževanja nastaja vse več in več kopij vzorčne RNA oz. v slabih dveh urah nastane nekaj milijard kopij. Po končanem pomnoževanju specifičnost nastalih produktov pomnoževanja dokazujemo s hibridizacijo z DNA-lovkami, značilnimi za 16S rRNA mikobakterij iz kompleksa M. tuberculosis. Hibridizacijske komplekse v testu NASBA® dokazujemo z elektrokemiluminiscentno metodo in v testu MTD® s ke-miluminiscentno metodo (32-34). Uporabnost metod pomnoževanja delcev nukleinskih kislin Vse do sedaj opravljene primerjalne raziskave več različnih nestandardiziranih metod pomnoževanja delcev nukleinskih kislin so nedvomno pokazale, da le-te zaradi velikega števila lažnopozitivnih in lažnonegativnih rezultatov niso primerne za rutinsko odkrivanje bacilov tuberkuloze (4, 16, 28). Podobne raziskave so pokazale, da so v te namene uporabni le standardizirani komercialno dostopni diagnostični kompleti. V preteklih nekaj letih je bilo objavljenih več kot 30 raziskav uporabnosti standardiziranih diagnostičnih kompletov. Pregled rezultatov najpomembnejših tovrstnih raziskav je prikazan v tabeli 1 (17,26,27, 30, 35-43). Iz tabele je razvidno, da sta trenutni različici obeh diagnostičnih kompletov MTD® in Amplicor® manj občutljivi kot poskus osamitve bacilov tuberkuloze iz kužnine ter da je njuna občutljivost sorazmerna odstotku mikroskopsko pozitivnih vzorcev, vključenih v določeno raziskavo. Manjšo občutljivost molekularnih testov iz mikroskopsko negativnih kužnin v primerjavi z mikroskopsko pozitivnimi kužni-nami pojasnjujejo z relativno majhnim številom bacilov tuberkuloze prisotnih v mikroskopsko negativnih kužninah in z njihovo nehomogeno porazdelitvijo v kliničnem vzorcu. Zato je večina raziskav, ki so trenutno v teku, usmerjena predvsem v izboljšanje metod za osamitev nukleinskih kislin iz kliničnih vzorcev z majhnim številom bacilov tuberkuloze. Specifičnost obeh diagnostičnih kompletov je zelo visoka in zadovoljiva. Iz navedenega sledi, da lahko v primeru bolnika s kliničnim sumom na tuberkulozo, pri katerem z molekularnimi metodami dokažemo prisotnost bacilov tuberkuloze, z zelo veliko verjetnostjo potrdimo klinični sum. Nasprotno je v primeru negativnega rezultata molekularnega testa pri takšnem bolniku treba počakati še na rezultate klasičnih mikrobioloških metod. Kljub naštetim pomanjkljivostim trenutnih različic diagnostičnih kompletov imajo standardizirani molekularni testi tri pomembne prednosti pred poskusom osamitve bacilov tuberkuloze: - so hitri, saj dajejo rezultate v nekaj urah, medtem ko za osamitev potrebujemo vsaj tri do šest tednov; - z njimi neposredno v kužnini ločimo bacile tuberkuloze od netuberkuloznih mikobakterij, kar je pomembno pri bolnikih z veliko možnostjo okužbe z netuberkuloznimi mi-kobakterijami (npr. imunosuprimirani bolniki, bolniki z aidsom); - z njimi lahko nesporno dokažemo prisotnost bacilov tuberkuloze pri nekaterih bolnikih, pri katerih tuberkuloze iz več razlogov ne moremo dokazati z nobeno klasično laboratorijsko metodo (17, 30). Glede na sedanje epidemiološko stanje okužb z mikobakterijami v Sloveniji in na naše izkušnje menimo, da mora ostati mikroskopski pregled kužnine zaradi enostavnosti in nizke cene še vedno prva preiskava, ki jo je treba narediti v primeru kliničnega suma na pljučno tuberkulozo. Tudi poskus osamitve mora doktrinarno ostati osnovna mikrobiološka metoda v diagnostiki tuberkuloze (44). Teste pomnoževanja delcev nukleinskih kislin kot dodatne metode ob klasični mikrobiološki diagnostiki priporočamo v naslednjih primerih: - za potrjevanje pljučne tuberkuloze pri bolnikih z močnim kliničnim sumom na pljučno tuberkulozo, pri katerih je mikroskopski pregled kužnine negativen, rezultatov poskusa osamitve bacilov pa še nimamo; - za potrjevanje pljučne tuberkuloze pri bolnikih s pozitivnim rezultatom mikroskopskega pregleda kužnine in sumom na okužbo z netuberkuloznimi mikobakterijami (imu-nosuprimirani bolniki, bolniki z aidsom, bolniki, pri katerih smo v preteklosti že osamili netuberkulozne mikobakterije); - pri bolnikih, pri katerih zaradi kontaminantov, prisotnih v kužnini, poskus osamitve bacilov tuberkuloze ni mogoč. Na osnovi izkušenj številnih avtorjev in naših lastnih zaenkrat ne priporočamo uporabe molekularnih testov za spremljanje uspešnosti zdravljenja tuberkuloze. Z molekularnimi testi namreč lahko pomnožimo nukleinske kisline mrtvih mikroorganizmov, ki so lahko še prisotni v kužninah tudi po uspešnem zdravljenju. Za spremljanje zdravljenja tuberkuloze je zato še vedno nepogrešljiv poskus osamitve. Zaradi slabe občutljivosti in velike možnosti lažnonegativnih rezultatov zaenkrat posebej odsvetujemo uporabo molekularnih testov za dokazovanje mikobakterij v kužninah, ki ne izvirajo iz dihal, kot so likvor, plevralni, abdominalni in perikardialni izlivi. Z razvojem molekularnih metod je prišlo do velikega napredka tudi na področju identifikacije netuberkuloznih mikobakterij (9) in epidemioloških raziskav tuberkuloze. Inser-cijsko zaporedje IS 6110 se je izkazalo kot najprimernejše področje genoma za tipizacijo bacilov tuberkuloze. Tako je metoda določanja polimorfizma dolžine restrikcijskih odsekov (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP) zaporedja IS 6110 že priznana kot standardna epidemiološka metoda za ugotavljanje sorodnosti posameznih se-vov bacilov tuberkuloze (45). Metodo uporabljamo predvsem za razjasnitev epidemij tuberkuloze ter za ločevanje relapsa in ponovne okužbe pri ozdravljenih tuberkuloznih bolnikih (11). Metode pomnoževanja delcev nukleinskih kislin se postopoma uveljavljajo tudi kot način določanja občutljivosti sevov bacilov tuberkuloze na različne antituberkulotike. Glavna pomanjkljivost uveljavljenih metod za določanje občutljivosti osamljenih sevov na antituberkulotike je namreč dolgotrajnost (4-6 tednov), kar močno otežuje zdravljenje zlasti v primeru sevov, odpornih proti več antituberkulotikom. Zato so napori številnih raziskovalcev usmerjeni v razvoj učinkovitih in hitrih postopkov za odkrivanje sevov bacilov tuberkuloze, odpornih proti antituberkulotikom, ki temeljijo na pomnoževanju delcev nukleinskih kislin (46-48). Rezultati so zaenkrat najboljši pri odkrivanju odpornosti proti rifampicinu (11). s § ^ S cc tO to T T m m to to m m m m m to o tn O) ai m m ai ai d m m ai ai ai m m n cc O) a> a> O) a> a> a> a> O) a> a> a> a> m _1 -v SP Fv Si ^ o 5 £ S - jo o « "U T3 O O £ 2 JO 0 — u >. . o >N Si H ž 'S of (A O ■E ¡S ® -N $0 ci '(3 J a> a> a> a> a> a> a> a> a> a> a> oo a> to T, T T, to o, oo to o, o, o a> I-. i-. a> oo oo a> a> T- o T- o I-. a> a> . . . oo . . . . . . . a> a> . . oo oo . . oo oo i-» o>, o, o 00 i-» uo (O 1 oo l»BBINNi-»i- i-(NO*T(N<0 ntoi-i-i-coi^i- eoooo