1 UBIKVITIN-PROTEASOMSKI SISTEM Za vzdrževanje homeostaze so celice razvile dinamičen si- stem samouravnavanja, s pomočjo katerega se prilagajajo na spremembe okolja in preprečujejo okvare. Kakovost proteinov med drugim uravnava sistem ubikvitin-protea- TARČNA RAZGRADNJA PROTEINOV Z UPORABO HIMERNIH MOLEKUL UTILIZING PROTEOLYSIS- TARGETING CHIMERAS f OR TARGETED PROTEIN DEGRADATION AVTORJI / AUTHORS: asist. Aleša Bricelj, mag. farm. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm. doc. dr. Izidor Sosič, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva cesta 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: izidor.sosic@ffa.uni-lj.si POVZETEK V zadnjih letih se je razvoj himernih molekul, ki izko- riščajo ubikvitin-proteasomski sistem za proteolitično razgradnjo tarčnih proteinov, izkazal za izjemno obe- taven pristop v farmacevtski kemiji. Tovrstne himerne razgrajevalce imenujemo molekule PROTAC (pro- teolysis-targeting chimeras), sestavljeni pa so iz treh delov: liganda za izbrano ubikvitin ligazo E3, ustrez- nega distančnika oz. vmesnika in liganda, ki se veže na tarčni protein. Zaradi svojega mehanizma delo- vanja lahko te molekule v nizkih koncentracijah in z visoko selektivnostjo dosežejo razgradnjo tarčnega proteina. Tovrsten farmakološki pristop se je že iz- kazal za boljšo alternativo klasičnemu farmakolo- škemu modelu zasedenosti receptorjev ali encimov predvsem pri patoloških stanjih, pri katerih se po- gosto razvije odpornost na klasične zaviralce pro- teinov, bodisi zaradi kompenzatornega povečanja izražanja ali mutacije tarčnega proteina. KLJUČNE BESEDE: himerni razgrajevalci, ligaze E3, proteasom, raz- gradnja proteinov ABSTRACT A novel approach using chimeric molecules that utilise the ubiquitin-proteasome system to induce proteolytic degradation of targeted proteins has been discovered recently. These bifunctional com- pounds are termed proteolysis-targeting chimeras or PROTACs and are comprised of three elements: a ligand for the E3 ligase, a ligand binding to the protein of interest and a linker connecting the two. The mechanism of action allows PROTACs to in- duce the degradation of a targeted protein in low concentrations and with high selectivity. This event- driven pharmacological approach represents a bet- ter alternative to the occupancy-driven strategy, particularly in diseases, in which resistance to clas- sical protein inhibitors or their compensatory over- expression often develop. KEY WORDS: proteolysis-targeting chimeras, E3 ligases, protea- some, protein degradation 100 TARČNA RAZGRADNJA PROTEINOV Z UPORABO HIMERNIH MOLEKUL farm vestn 2021; 72 2 MOLEKULE PROTAC: SESTAVA IN MEh ANIZEM DELOVANJA Bifunkcionalne molekule, ki za svoje farmakološko delova- nje izkoriščajo ubikvitin-proteasomski sistem, so t. i. hi- merne molekule, ki povzročajo razgradnjo tarčnega pro- teina (PROTACs, proteolysis-targeting chimeras'). Vsaka molekula PROTAC je sestavljena iz treh delov: liganda za izbrano ubikvitin ligazo E3, ustreznega distančnika oz. vmesnika in liganda, ki se veže na tarčni protein (slika 2). Učinkovita molekula PROTAC je sposobna namestiti tarčni protein na ustrezni razdalji in v pravilni orientaciji glede na ligazo E3, da lahko potečeta njegova ubikvitinacija in na- daljnja razgradnja s proteasomom (3). 3 PREDNOSTI STRATEGIJE PROTAC Tako dedne kot tudi pridobljene bolezni so pogosto posle- dica abnormalnega delovanja proteinov (npr. ko pride do som, preko katerega v največjem obsegu poteka odstra- njevanje poškodovanih, nefunkcionalnih in odsluženih zno- trajceličnih proteinov. Veliki cilindrični proteinski kompleksi, imenovani proteasomi, so zadolženi za razgradnjo z ubi- kvitinom kovalentno označenih proteinov. Pripenjanje 76 aminokislin dolgih ubikvitinskih oznak poteka v treh stop- njah (slika 1): 1. encim E1 tvori tioestersko vez z ubikvitinom, 2. konjugacija z encimom E2, ki katalizira prenos ubi- kvitina z E1 na aktivno mesto E2 s trans(tio)esterifi- kacijo, 3. ubikvitin ligaza E3 tvori izopeptidno vez med C-ter- minalnim glicinom ubikvitina in lizinom tarčnega pro- teina. Zadnji korak se lahko večkrat ponovi, tako da nastane po- liubikvitinska veriga (več zaporedno vezanih ubikvitinskih enot preko lizinskih ostankov predhodno vezanih ubikviti- nov) na ε-amino stranski skupini lizina tarčnega proteina. Proteasom tako označene proteine prepozna in jih pro- teolitično razgradi na manjše fragmente (1, 2). Humani ge- nom kodira za dva encima E1 in za okoli 50 encimov E2, medtem ko poznamo več kot 600 različnih ubikvitin ligaz E3. Slednje narekujejo tudi substratno specifičnost ter tako odločilno vplivajo na prepoznavanje ustreznih tarčnih pro- teinov (1). 101 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI Slika 1: Razgradnja proteinov preko poti ubikvitin-proteasom (2). Figure 1: The ubiquitin-proteasome system's involvement in protein degradation (2). 102 TARČNA RAZGRADNJA PROTEINOV Z UPORABO HIMERNIH MOLEKUL farm vestn 2021; 72 njihovega prekomernega izražanja). Tradicionalen pristop načrtovanja učinkovin se v večji meri poslužuje uporabe klasičnih zaviralcev, ki delujejo po principu farmakološkega modela zasedenosti (occupancy-driven model). Za zado- sten farmakološki učinek tovrstni zaviralci zahtevajo kon- stantno vzdrževanje visokih lokalnih koncentracij učinko- vine, visoki odmerki pa pogosto vodijo v pojavnost učinkov na netarčne makromolekule (off-target effects). Spojine PROTAC delujejo po alternativnem pristopu, in sicer po farmakološkemu modelu dogodka (event-driven model), pri katerem se delovanje patoloških proteinov obvladuje z zniževanjem njihove koncentracije (5). Mehanizem delovanja spojin PROTAC ima številne pred- nosti, in sicer je ena izmed bistvenih predvsem ta, da se po ubikvitinaciji tarče molekula PROTAC sprosti z obeh vezavnih mest in je zmožna cikel svojega delovanja večkrat ponoviti. Na ta način deluje kot katalizator in je sposobna tudi v substehiometričnih količinah doseči skoraj popolno razgradnjo tarčnega proteina. Ko se ta začne ponovno iz- ražati, mora PROTAC razgraditi le majhno število novona- stalih proteinov. Tudi po neizogibnem metabolizmu spojine PROTAC se bo njen učinek obdržal tako dolgo, dokler ce- lice ne sintetizirajo patološko relevantnih količin proteina. V teoriji bi tako za doseganje farmakološkega učinka po- trebovali mnogo nižje odmerke zdravilne učinkovine v pri- merjavi s klasičnimi nizkomolekularnimi učinkovinami (3). Spojine PROTAC lahko ustrezno učinkovitost dosežejo tudi ob majhni zasedenosti tarče, zato je mogoče pri načrto- vanju uporabiti ligande z nižjo afiniteto, ki bi jih sicer opustili v razvoju klasičnih nizkomolekularnih učinkovin. Ker mo- ramo želeno tarčo le pripeljati do ligaze E3, se lahko ligand veže na kateri koli del proteina in ne nujno na mesto, ki bo zaviralo njegovo delovanje. Pristop je zato uporaben za del proteoma, kjer aktivno mesto makromolekul ni ustrezno definirano ali pa je težko načrtovati molekule, ki bi se nanje vezale z visoko afiniteto, na primer transkripcijski faktorji in ogrodni proteini (3). Zaradi možnosti vezave liganda na kateri koli del proteina si lahko pri načrtovanju spojin izberemo tako mesto, ki se pojavlja le na izbrani tarči, ne pa tudi na sorodnih pro- teinih. Učinkovitost spojin PROTAC je odvisna od interakcij protein-protein med ligazo E3 in tarčnim proteinom, te pa večinoma narekujejo aminokislinski ostanki na površini proteina, zato lahko molekula PROTAC deluje z večjo se- lektivnostjo med sorodnimi proteini kot klasične nizko- molekularne učinkovine. Številne raziskave so pokazale, da selektivnost razgradnje celo presega selektivnost ve- zave izbranega proteinskega liganda, tako da netarčna vezava molekule PROTAC ne povzroči nujno tudi raz- gradnje vezanega proteina. Ta dodaten nivo specifičnosti lahko uravnavamo tudi z izbiro ligaze E3 in distančnika (3). Pristop tarčne razgradnje proteinov obeta možnost izogi- banja fiziološkim kompenzacijskim mehanizmom, pri katerih pride do pojava pridobljene odpornosti ob redni uporabi zaviralcev patogenih proteinov, bodisi preko prekomernega izražanja tarčnega proteina ali pa njegove mutacije (6). 4 LIGAZE E3 IN LIGANDI ZANJE Humani genom kodira za več kot 600 različnih ligaz E3, vendar so do sedaj s spojinami PROTAC ciljali le peščico Slika 2: Princip delovanja molekul PROTAC (4). Figure 2: PROTAC-mediated protein degradation (4). 103 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI teh encimov. Obstaja velika verjetnost, da je na voljo veliko alternativnih, še neraziskanih ligaz E3, ki delujejo mnogo bolje od že raziskanih (7). Najpogosteje izkoriščeni ligazi E3 sta von Hippel-Lindau (VHL) in cereblon, saj sta oba sposobna ubikvitinirati citosolne, membranske ter jedrne proteine in omogočata izkoriščanje te metodologije pri širokem naboru potencialnih tarč, poleg tega pa so zanju specifični ligandi v literaturi dobro opisani (slika 3) (8). Cereblon je primarna tarča imunomodulatornih učinkovin iz skupine imidov, kot so talidomid, lenalidomid in pomali- domid. Njihova vezava ojača interakcijo med cereblonom in dvema limfoidnima transkripcijskima faktorjema, IKZf 1 (Ikaros) in IKZf 3 (Aiolos), kar vodi v njuno ubikvitinacijo in razgradnjo. Omenjena interakcija ponuja možnost posred- nega vrednotenja prehajanja molekul PROTAC skozi celično membrano in vezave na cereblon preko razgradnje IKZf 1 in IKZf 3 (8, 10). Pri načrtovanju molekul PROTAC ne smemo spregledati dejstva, da v nekaterih primerih ni sočasne ekspresije li- gaze E3 in tarčnega proteina v istem tkivu, kar lahko ra- ziskovalcem predstavlja pomembno oviro in izziv. Upo- števati je potrebno tudi značilnosti uporabljenih ligandov za ligazo E3: njihovo metabolno stabilnost, fizikalno-ke- mijske lastnosti (v primeru, da je ligand za tarčni protein zelo lipofilen, lahko hidrofilen ligand za cereblon uravnovesi lastnosti končne molekule PROTAC), varnostni profil, tki- vno in tumorsko specifičnost ter morebitne vplive na neo- substrate, tj. makromolekule, ki lahko postanejo tarča li- gaze E3 po tem, ko se nanjo veže kakršenkoli ligand (11, 12). Čas zasedanja in afiniteta vezave obeh ligandov do ligaze E3 ter tarčnega proteina imata pomemben vpliv na raz- gradnjo. Ob zelo močni afiniteti in posledični vezavi s po- časno disociacijo lahko pride do zmanjšanja učinkovitosti, saj spojina PROTAC ne more delovati katalitično. Na- sprotno ob prekratkem času vezave in nizki afiniteti vezave ligaza E3 nima dovolj časa, da bi katalizirala prenos ubi- kvitina na tarčni protein (3). Kot pri ostalih trikomponentnih sistemih pa lahko tudi pri spojinah PROTAC pride do po- java t. i. Hookovega efekta, ki je oblika negativne interfe- rence. Pri koncentracijah spojine PROTAC, ki bistveno presegajo koncentracijo, pri kateri je dosežena 50-od- stotna razgradnja tarče (DC 50 ), pride do avtoinhibicije tvorbe kompleksov ligaza E3-PROTAC-tarčni protein za- radi povečanih nivojev binarnih kompleksov PROTAC-li- gaza E3 in PROTAC-tarčni protein (slika 4). Posledica tega je, da se z naraščajočo koncentracijo spojine PRO- TAC količina stabilnih ternarnih kompleksov zmanjšuje, namesto da bi se povečevala (4). O N H O N NH O N S A HN O O N H O N OH N H O N S OH B NH N O O NH O O NH N O NH O O C D O N O N H H N O O HN E Slika 3: Kemijske strukture ligandov za VHL-1 (A) in VHL-2 (B) (9), cereblon (pomalidomid (C) in lenalidomid (D)) in IAP (angl. ‘inhibitor of apoptosis’; apoptozo zavirajoči protein) (E) (3). Figure 3: Chemical structures of ligands for VHL-1 (A) and VHL-2 (B) (9), cereblon (pomalidomide (C) and lenalidomide (D)) and IAP (E) (3). 104 TARČNA RAZGRADNJA PROTEINOV Z UPORABO HIMERNIH MOLEKUL farm vestn 2021; 72 5 IZBIRA VMESNIKA Premišljena izbira distančnika oz. vmesnika je eden izmed najpomembnejših aspektov načrtovanja himernih molekul in lahko pomeni razliko med zelo dobro ali neuporabno spojino PROTAC. Poleg njegove dolžine in sestave sta odločilna tudi mesto in način vezave na oba liganda (12). Sterične omejitve so eden izmed glavnih dejavnikov, ki pre- prečijo razgradnjo tarče. Stabilni ternarni kompleksi ligaza E3-PROTAC-tarča so odvisni od ugodnih interakcij pro- tein-protein, te pa dosežemo le z idealno orientacijo ligaze E3 napram tarčnemu proteinu, ki jo omogočajo ustrezni distančniki. Crews in sodelavci so ob testiranju selektivnih razgrajevalcev androgenih receptorjev opazili 50-odstotni padec razgradnje receptorja ob podaljšanju pegiliranega distančnika z 8 na 13 ogljikovih atomov, kar dokazuje, da struktura in dolžina distančnika narekujeta aktivnost končne molekule (13). Pri seriji spojin PROTAC, ki so bile sestavljene iz identičnega liganda za tarčni protein in distančnika ter so se razlikovale le v afiniteti liganda do ligaze E3 VHL, so ugotovili, da je ustrezen distančnik vseeno omogočil tvorbo ugodnih interakcij protein-protein, ki so lahko kompenzirale zmanjšano afiniteto do ligaze E3 in povzročile tvorbo ter- narnih kompleksov z zadostno stabilnostjo za potek ubi- kvitinacije (8). Poleg vpliva na moč in selektivnost delovanja imajo struk- turne značilnosti distančnika vpliv tudi na fizikalno-kemijske lastnosti celotne molekule ter posledično na njeno celično permeabilnost, vodotopnost, metabolno stabilnost in po- razdeljevanje. Racionalno načrtovanje trenutno še ni mo- goče, saj pravil za izbiro distančnikov, ki bi zagotovili opti- malno orientacijo, še ni na voljo (3). 6 f IZIKALNO-KEMIJSKE LASTNOSTI SPOJIN PROTAC Z vidika fizikalno-kemijskih lastnosti je očitno, da himerne molekule krepko presegajo pravila po Lipinskem, ki za do- seganje peroralne aplikacije preferirajo spojine z molekulsko maso med okoli 300 in 500 Da. V splošnem se molska masa molekul PROTAC giblje med 700 in 1000 Da in več, zaradi česar bi pričakovali manjšo verjetnost peroralne apli- kacije ter vprašljive metabolno stabilnost, vodotopnost in sposobnost prehajanja bioloških membran (14). Kljub temu veliko avtorjev opisuje uspešno prehajanje teh spojin v ce- lice, zelo spodbudna so tudi objavljena testiranja na miših, podganah, prašičih Bama in opicah rezus in vivo, pri katerih so razgradnjo preiskovanega proteina f KBP12 po peroralni aplikaciji dosegli v večini organov in tkiv, razen v možganih, kjer je bilo za učinek potrebno molekulo injicirati intracere- broventrikularno (15). 7 RAZVOJ IN PERSPEKTIVNOST TARČNE RAZGRADNJE S SPOJINAMI PROTAC Področje se je začelo razvijati leta 2001, ko so Sakamoto, Crews in Deshaies s sodelavci opisali prvi primer, pri ka- terem so izkoristili aktivnost ligaze E3 za razgradnjo me- tionin aminopeptidaze 2, katere funkcija je med drugim spodbujanje angiogeneze pri nekaterih vrstah raka (16). Do sedaj so molekule PROTAC opisali že na več kot 30 proteinskih tarčah, ki so kritične za razvoj bolezni, med katere spadajo jedrni receptorji (estrogenski in androgenski receptorji (slika 5), receptorji retinojske kisline), protein ki- naze (anaplastična limfomna kinaza, Brutonova tirozin ki- naza, protein kinaza B), regulatorji transkripcije (BRD4, sirtuin 2, histon deacetilaza 6), regulatorni proteini (celični vezavni protein za retinojsko kislino I/II, estrogenu soroden Slika 4: Pojavnost Hookovega efekta v odvisnosti od koncentracije PROTAC spojine in posledičen vpliv na delež razgradnje tarčnega proteina (4). Figure 4: A high concentration of PROTAC results in a Hook effect, where the formation of ternary complexes is precluded, thus reducing the degradation of the target protein (4). 105 farm vestn 2021; 72 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANKI receptor α), proteini, ki so povezani z nevrodegenerativnimi boleznimi (Huntingtin, Tau, alfa sinuklein), fuzijski proteini in mnogi drugi (17). Strnjen pregled relevantnih molekul PROTAC skupaj z njihovo potencialno uporabo je pred- stavljen v referenci 18. Ugodni rezultati testiranj in vivo so potisnili metodologijo PROTAC v središče pozornosti razvoja novih zdravilnih učinkovin. Trenutno vodilno biotehnološko podjetje na tem področju, Arvinas, je v začetku leta 2019 omogočilo zače- tek prve faze kliničnih testiranj z molekulo PROTAC ARV- 110 (slika 5) za razgradnjo androgenskih receptorjev pri metastatskem, na kastracijo odpornem raku prostate, kas- neje istega leta pa so v prvo fazo kliničnih preizkušanj vpe- ljali še molekulo PROTAC ARV-471 za razgradnjo estro- genskih receptorjev pri raku dojke (20). Zaenkrat dostopni podatki o klinični varnosti in farmakokinetiki za obe testirani spojini kažejo, da so pacienti učinkovini dobro prenašali in sta primerni za nadaljnji razvoj zdravil (21). 8 SKLEP Tarčna razgradnja proteinov z uporabo molekul PROTAC predstavlja izjemno obetaven pristop na področju načrto- vanja novih učinkovin, predvsem zaradi katalitičnega me- hanizma delovanja in možnosti doseganja visoke selektiv- nosti razgradnje želene tarče. Metoda ima velik potencial tudi v terapiji bolezni, katerih patogeneza vključuje proteine in encime, ki jih težko ciljamo in zaviramo s klasičnimi niz- komolekularnimi zaviralci, ter v primerih, kjer je ob uporabi nizkomolekularnih učinkovin prišlo do razvoja neodzivnosti, kar se pogosto pojavi pri številnih rakavih obolenjih. 9 LITERATURA 1. Pohl C, Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin- proteasome system and autophagy. Science. 2019 Nov 15;366(6467):818-22. 2. Eldridge AG, O’Brien T. Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome system. Cell Death Differ. 2010 Jan;17(1):4-13. 3. Scheepstra M, Hekking KFW, van Hijfte L, Folmer RHA. Bivalent Ligands for Protein Degradation in Drug Discovery. Comput Struct Biotechnol J. 2019;17:160-76. 4. An S, Fu L. Small-molecule PROTACs: An emerging and promising approach for the development of targeted therapy drugs. EBioMedicine. 2018 Oct;36:553-62. 5. Cromm PM, Crews CM. Targeted Protein Degradation: from Chemical Biology to Drug Discovery. Cell Chem Biol. 2017 Sep;24(9):1181-90. Slika 5: Primera struktur delujočih spojin PROTAC. ARV-110 povzroči s cereblonom inducirano razgradnjo androgenega receptorja, PROTAC_ERRα pa preko VHL ligaze E3 povzroči razgradnjo receptorja ERRα. Liganda za vezavo na tarčni protein sta obarvana z modro, liganda za izbrano ligazo E3 pa z oranžno barvo (18, 19). Figure 5: Examples of active PROTACs. ARV-110 induces the degradation of the androgen receptor by hijacking cereblon for its E3 ligase activity, while PROTAC_ERRα causes the degradation of the estrogen-related receptor alpha by recruiting VHL. Ligands, binding to the protein of interest, are marked in blue, whereas the ligands for E3 ligase are coloured orange (18, 19). 106 TARČNA RAZGRADNJA PROTEINOV Z UPORABO HIMERNIH MOLEKUL farm vestn 2021; 72 6. Wang P , Zhou J. Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC): A Paradigm-Shifting Approach in Small Molecule Drug Discovery. Curr Top Med Chem. 2018 Nov 26;18(16):1354-6. 7. Chamberlain PP , Hamann LG. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nat Chem Biol. 2019 Oct;15(10):937-44. 8. Bondeson DP , Smith BE, Burslem GM, Buhimschi AD, Hines J, Jaime-Figueroa S, et al. Lessons in PROTAC Design from Selective Degradation with a Promiscuous Warhead. Cell Chem Biol. 2018 Jan;25(1):78-87.e5. 9. Zengerle M, Chan K-H, Ciulli A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chem Biol. 2015 Aug 21;10(8):1770-7. 10. Krönke J, Fink EC, Hollenbach PW, MacBeth KJ, Hurst SN, Udeshi ND, et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1α in del(5q) MDS. Nature. 2015 Jul;523(7559):183-8. 11. Moon S, Lee B-H. Chemically Induced Cellular Proteolysis: An Emerging Therapeutic Strategy for Undruggable Targets. Mol Cells [Internet]. 2018 Nov 30 [cited 2020 Mar 17];41(11). Available from: https://doi.org/10.14348/MOLCELLS.2018.0372 12. Churcher I. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? J Med Chem. 2018 Jan 25;61(2):444-52. 13. Toure M, Crews CM. Small-Molecule PROTACS: New Approaches to Protein Degradation. Angew Chem Int Ed. 2016 Feb 5;55(6):1966-73. 14. Neklesa TK, Winkler JD, Crews CM. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacol Ther. 2017 Jun;174:138- 44. 15. Guo J, Liu J, Wei W. Degrading proteins in animals: “PROTAC”tion goes in vivo. Cell Res. 2019 Mar;29(3):179-80. 16. Sakamoto KM, Kim KB, Kumagai A, Mercurio F, Crews CM, Deshaies RJ. Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc Natl Acad Sci. 2001 Jul 17;98(15):8554-9. 17. Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development: The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019 Jan;37(1):21-30. 18. Sun X, Gao H, Yang Y, He M, Wu Y, Song Y, et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry. Signal Transduct Target Ther. 2019 Dec;4(1):64. 19. Halford B. Arvinas unveils PROTAC structures. Chemical & Engineering News 2021 Apr;99(14) 20. Protein-slaying drugs could be the next blockbuster therapies [Internet]. Nature: news feature; 2019 [updated 2019 March 20; cited 2020 Mar 17]. Available from: https://www.nature.com/articles/d41586-019-00879-3#ref- CR4 21. Arvinas Reports Fourth Quarter and Full Year 2019 Financial Results and Provides Corporate Update [Internet]. Arvinas: press release; [updated 2019 March 16; cited 2020 Mar 20]. Available from: https://ir.arvinas.com/news-releases/news- release-details/arvinas-reports-fourth-quarter-and-full-year-2019 -financial