ZAKLJUČNO POROČILO O REZULTATIH OPRAVLJENEGA RAZISKOVALNEGA DELA NA PROJEKTU V OKVIRU CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROGRAMA (CRP) »KONKURENČNOST SLOVENIJE 2006 - 2013« L Predstavitev osnovnih podatkov raziskovalnega projekta n «J „ E P u B L l K A s 1. Naziv težišča V okviru CRP:__^ mosuec 5 Povezovanje ukrepov za doseganje trajnostnega 2. Šifra projekta: V4-0328 3. Naslov projekta: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva 3. Naslov projekta 3.1. Naslov projekta v slovenskem jeziku: 3.2. Naslov projekta v angleškem jeziku: 4. Ključne besede projekta 4.1. Ključne besede projekta v slovenskem jeziku: odpornost, škodljivi organizmi, fitofarmacevtska sredstva 4.2. Ključne besede projekta v angleškem jeziku: resistance, plant pests, plant pathogens, pesticides Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 1 od 34 5. vfaziv nosilne raziskovalne organizacije: 0401 Kmetijski inštitut Slovenije, Hacquetova 17, 1001 Ljubljana 5.1. Seznam sodelujočih raziskovalnih organizacij (R0): 416 Inštitut za hmeljarstvo in pivo varstvo Slovenije, Žalec 6. Sofmancer/sofinanceiji: Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano 1. Šifra ter ime in priimek vodje projekta: 5672 Gregor Urek Datum: 5. marec 2009 o^ projekta: Gr< ;gor Urek Vvv , . . v. . . , vi^^lFodpis^m zig izvajalca: ■a.^ LJUBLJANA < ti ^--- ^ U Andrej Simoncič Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 2 od 34 II. Vsebinska struktura zaključnega poročila o rezultatih raziskovalnega projekta v okviru CRP 1. Cilji projekta: 1.1. Ali so bili cilji projekta doseženi? 3 a) v celoti b) delno c) ne 1.2. Ali so se cilji projekta med raziskavo spremenili? a) da K b) ne Če so se, je potrebna utemeljitev: Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 3 od 34 2. Vsebinsko poročilo o realizaciji predloženega programa dela^: glej prilogo 1 ^ Potrebno je napisati vsebinsko raziskovalno poročilo, kjer mora biti na kratko predstavljen program dela z raziskovalno hipotezo in metodološko-teoretičen opis raziskovanja pri njenem preveijanju ali zavračanju vključno s pridobljenimi rezultati projekta. Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 4 od 34 3. Izkoriščanje dobljenih rezultatov: 3.1. Kakšen j e potencialni pomen^ rezultatov vašega raziskovalnega prej ekta za: ^ a) odkritje novih znanstvenih spoznanj; 3 b) izpopolnitev oziroma razširitev metodološkega instrumentarija; c) razvoj svojega temeljnega raziskovanja; _ d) razvoj drugih temeljnih znanosti; 3 e) razvoj novih tehnologij in drugih razvojnih raziskav. 3.2. Označite s katerimi družbeno-ekonomskimi cilji (po metodologiji OECD-ja) sovpadajo rezultati vašega raziskovalnega projekta: a) razvoj kmetijstva, gozdarstva in ribolova - Vključuje RR, ki je v osnovi namenjen razvoju in podpori teh dejavnosti; b) pospeševanje industrijskega razvoja - vključuje RR, ki v osnovi podpira razvoj industrije^ vključno s proizvodnjo, gradbeništvom, prodajo na debelo in drobno, restavracijami in hoteli, bančništvom, zavarovalnicami in drugimi gospodarskimi dejavnostmi; c) proizvodnja in racionalna izraba energije - vključuje RR-dejavnosti, ki so v funkciji dobave, proizvodnje, hranjenja in distribucije vseh oblik energije. V to skupino je treba vključiti tudi RR vodnih virov in nuklearne energije; d) razvoj infrastrukture - Ta skupina vključuje dve podskupini: • transport in telekomimikacije - Vključen je RR, ki je usmeijen v izboljšavo in povečanje varnosti prometnih sistemov, vključno z varnostjo v prometu; • prostorsko planiranje mest in podeželja - Vključen je RR, ki se nanaša na skupno načrtovanje mest in podeželja, boljše pogoje bivanja in izboljšave v okolju; e) nadzor in skrb za okolje - Vključuje RR, ki je usmeijen v ohranjevanje fizičnega okolja. Zajema onesnaževanje zraka, voda, zemlje in spodnjih slojev, onesnaženje zaradi hrupa, odlaganja trdnih odpadkov in sevanja. Razdeljen je v dve skupini: f) zdravstveno varstvo (z izjemo onesnaževanja) - Vključuje RR - programe, ki so usmerjeni v varstvo in izboljšanje človekovega zdravja; g) družbeni razvoj in storitve - Vključuje RR, ki se nanaša na družbene in kulturne probleme; h) splošni napredek znanja - Ta skupina zajema RR, ki prispeva k splošnemu napredku znanja in ga ne moremo pripisati določenim ciljem; i) obramba - Vključuje RR, ki se v osnovi izvaja v vojaške namene, ne glede na njegovo vsebino, ali na možnost posredne civilne uporabe. Vključuje tudi varstvo (obrambo) pred naravnimi nesrečami. Označite lahko več odgovorov. Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 5 od 34 3.3. Kateri so neposredni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje?_ Ugotovili smo odpornost nekaterih škodljivih vrst na uporabljena fitofarmacevtska sredstva (npr. odpornost nekaterih populacij koloradskega hrošča na na organofosfomi insekticid klorpirifos in sintetični piretroid lambda-cihalotrin, odpornost gliv Monilinia finctigena in M. laxa na ciprodonil itn.), pri nekaterih vrstah aktivnih snovi je prišlo do popuščanja učinkovitosti (npr. pri uporabi pimetrozina proti hmeljevi listni uši), pri nekaterih fitofarmacevtskih pripravkih pa odpornosti na testirane škodljive organizme nismo ugotovili. Na temelju navedenih ugotovitev bomo v prihodnje lahko natančneje spremljali oziroma opredeljevali stanje na področju odpornosti različnih škodljivih organizmov na uporabljena fitofarmacevtska sredstva. Rezultati raziskave bodo pomembno prispevali k strokovnemu pristopu reševanja zdravstvenega stanja najpomembnejših gojenih rastlin v Sloveniji. Na podlagi spoznanj se bo mogoče hitreje in ustrezneje odzivati na nastajajoče probleme zdravstvenega varstva rastlin, oblikovati primernejšo strategijo varstva in vplivati na nesmotrno rabo fitofarmacevtskih sredstev, predvsem tistih, za katera smo ugotovili, da so zaradi razvite odpornosti ciljnih organizmov neučinkovita. Vse to bo lahko vodilo k zmanjševanju obremenjevanja okolja in zniževanju stroškov pridelave gojenih rastlin._ 3.4. Kakšni so lahko dolgoročni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje? Rezultati raziskave predstavljajo osnovo za strokoven pristop k reševanju varstva najpomembnejših gojenih rastlin. Na temelju naših spoznanj lahko natančneje opredelimo priporočila v okviru integrirane pridelave gojenih rastlin in integriranega varstva rastlin. Omenjena spoznanja bodo prispevala k dvigu konkurenčnosti pridelave gojenih rastlin pri nas ter k preprečevanju prekomernega obremenjevanja okolja. 3.5. Kje obstaja veijetaost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? 3 a) v domačih znanstvenih krogih; 3 b) v mednarodnih znanstvenih krogih; 3 c) pri domačih uporabnikih; d) pri mednarodnih uporabnikih. 3.6. Kdo (poleg sofmanceijev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih? 3.7. Število diplomantov, magistrov in doktoijev, ki so zaključili študij z vključenostjo v raziskovalni projekt?_ Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 6 od 34 4. Sodelovanje z tujimi partnerji: 4.1. Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujimi raziskovalnimi institucijami._ Exploiting genomics to understand plant - nematode interactions, COST 872; koordinator: Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee, UK, nosilec na KIS: Gerič B., sodelavec: Urek G. Leafy vegetables germplasm, stimulating use (ACRONYM: LEAFYVEG), AGRJ-GEN RES 2006-0262, nosilec: CGN, The Netherlands; nosilec na KIS: Meghč V., sodelavec: Urek G. Molekulska raznolikost faktorjev patogenosti pri krompiijevih ogorčicah Globodera pallida in G. rostochiensis; Bilaterala FRA-SLO: INRA 2007- 08, nosilec na KIS: Gerič B., sodelavec: Urek G. Biogeography and diversity of Bursaphelenchus species associated with pine forests: implications for pine wilt disease caused by the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus - Bilateralni projekt SI-PT-2008-09; sodelujoča organizacija: Dept. Biologia, Universidade de Evora, nosilec na KIS: Urek G. Development of sustainable agriculture in south-eastern europe: risk assessment of virus vector nematodes (fam. Longidoridae) in agricultural and horticultural crops in Slovenia and Bulgaria - Bilateralni projekt SI-BG-2009-10; sodelujoča organizacija: Central Laboratory of General Ecology, BAS, nosilec na KIS: Urek G. 4.2. Kakšni so rezultati tovrstnega sodelovanja? Rezultati tovrstnega sodelovanja se kažejo v hitrejšem prenosu znanja na področju zdravstvenega varstva rastlin, predvsem spoznavanja, detektiranja in identificiranja škodljivih organizmov ter vzpostavljanja ustreznih tehnologij varstva rastlin. 5. Bibliografski rezultati^: Za vodjo projekta in ostale raziskovalce v projektni skupini priložite bibliografske izpise za obdobje zadnjih treh let iz COBISS-a) oz. za medicinske vede iz Inštituta za biomedicinsko informatiko. Na bibliografskih izpisih označite tista dela, ki so nastala v okviru pričujočega projekta. 3 Bibliografijo raziskovalcev si lahko natisnete sami iz spletne strani:http:/www.izum.si/ Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 7 od 34 6. Druge reference'* vodje projekta in ostalih raziskovalcev, ki izhajajo iz raziskovalnega projekta; _ " Navedite tudi druge raziskovalne rezultate iz obdobja financiranja vašega projekta, ki niso zajeti v bibliografske izpise, zlasti pa tiste, ki se nanašajo na prenos znanja in tehnologije. Navedite tudi podatke o vseh javnih in drugih predstavitvah projekta in njegovih rezultatov vključno s predstavitvami, ki so bile organizirane izključno za naročnika/naročnike projekta. Obrazec ARJRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 8 od 34 Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Žalec PREUČEVANJE ODPORNOSTI ŠKODLJIVIH ORGANIZMOV NA NEKATERA FITOFARMACEVTSKA SREDSTVA CRP: V4-0328 Zaključno poročilo PRILOGA 1 Ljubljana, marec 2009 Soizvajaiec: Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije Cesta Žalskega tabora 2 3310 Žalec Raziskovalci: Doc. dr. Gregor Urek, iiniv. dipl. inž. agr. Dr. Alenka Munda, univ. dipl. inž. agr. Doc. dr. Andrej Simončič Marjeta Žemljic Urbančič Vojko Skerlavaj Dr. Hans Josef Schroers Dr. Tatjana Kavar Mag. Špela Modic Dr. Magda Rak Cizej Marko Zmrzlak Podpis od a iy!^ilca pi^ekta Podpis in žig izvajalca: r^r. Andrej Simoncic VSEBINA Stran UVOD 2 MATERIAL IN METODE DELA 2 2.1 Odpornost slovenskih populacij koloradskega hrošča na klorpirifos 2 etil, lambdacihalotrin in imidakloprid 2.2 Odpornost hmeljeve listne uši na imidakloprid, pimetrozin in 4 lambdacihalotrin 2.3 Odpornost gliv Monilinia fructigena in M. laxa na fungicide iz 5 skupine dikarboksimidov, anilinopirimidinov in hidroksianilidov 2.4 Odpornost glive Uncinula necator na 6 2.5 Odpornost plevelov na herbicide iz skupine triazinov in sulfonil 8 sečnin 3 REZULTATI IN KOMENTAR 9 4 SKLEPI 20 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva lUVOD Pojav odpornosti škodljivih organizmov na fitofarmacevtska sredstva se ponavadi kaže kot pojemajoče delovanje nekega pripravka na ciljni organizem. Zaradi tega se pridelovalci oziroma uporabniki fitofarmacevtskih sredstev večkrat zatečejo k povečanim odmerkom in pogostejši uporabi teh sredstev, kar vodi k pretiranemu in nepotrebnemu obremenjevanju okolja. S spremljanjem pojava in razvoja odpornosti lahko zaznamo pojemanje delovanja nekega pripravka in uporabnike pravočasno pripravimo na ustrezen odziv. Odpornost na fitofarmacevtska sredstva je resen problem zdravstvenega varstva rastlin, s katerim smo se v Sloveniji v preteklosti že srečali. Že leta 1967 je bila dokazana odpornost koloradskega hrošča na insekticide iz skupine kloriranih ogljikovodikov, v osemdesetih letih je bila podrobneje raziskana odpornost glive Botrytis cinerea na vinski trti na benomil (Urek, 1985), v devetdesetih letih pa so bili potijeni primeri odpornosti bele metlike ter srhkodlakavega ščira na atrazin. V zadnjih desetih letih pa v Sloveniji skoraj ni bilo raziskav na tem področj u, čeprav so v praksi večkrat opazili slabše delovanj e nekaterih fitofarmacevtskih sredstev pri določenih organizmih. Zaradi naraščajočega zaznavanja pojem^ja učinkovitosti nekaterih aktivnih snovi smo se odločili raziskati stanje in ugotoviti morebiten pojav odpornosti pri nekaterih škodljivih organizmih (insektih, glivah in plevelih) pomembnejših kmetijskih rastlin. S pravočasno detekcijo pojava odpornosti lahko omilimo nepotreben vnos kemičnih snovi v okolje, zmanjšamo izpostavljenost uporabnikov tem snovem, vzporedni učinki pa se kažejo tudi v zmanjševanju količine ostankov škropilne brozge in odpadne embalaže. Program dela je bil zasnovan na več ločenih programskih sklopih v okviru katerih smo preučevali: • morebitno odpornost slovenskih populacij koloradskega hrošča Leptinotarsa decemlineata na klorpirifos etil, lambdacihalotrin in imidakloprid, • morebitni pojav odpornosti hmeljeve listne uši Phorodon humuli na imidakloprid, pimetrozin in lambdacihalotrin, • občutljivost populacij gliv Monilinia fructigena in M laxa na fungicide iz skupine dikarboksimidov, anilinopirimidinov in hidroksianilidov, • stanje odpornosti glive Uncinula necator na izbrane fungicide • odpornost plevelov v koruzi in pšenici na herbicide iz skupine triazinov in sulfonil sečnin. 2 MATERIAL IN METODE DELA 2.1 Odpornost slovenskih populacij koloradskega hrošča na klorpirifos-etil, lambdacihalotrin in imidakloprid V letih 2006 in 2007 smo po različnih območjih Slovenije nabirali populacije koloradskega hrošča, različnih razvojnih stadijev: ličinke v prvem oz. drugem (L1/L2) ter tretjem oz. četrtem larvalnem stadiju (L3/L4) in odrasle hrošče (H). Odpornost na izbrane insekticide smo preučevali v laboratorijskih razmerah. Uporabili smo metodo, kije pri IRAC (Insecticide Resistance Action Comittee) priporočena za ugotavljanje odpornosti grizočih žuželk na insekticide (metoda IRAC št. 7). Preizkušali smo sledeče insekticidne snovi: Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva • organofosfomi insekticid klorpirifos-etil, v komercialnem pripravku dursban E- 48, • sintetični piretroid lambdacihalotrin, v komercialnem pripravku karate-zeon 5CS in • neonikotinoid imidakloprid, pripravek confidor SL 200. • Pripravili smo vodne raztopine pripravkov tako, da smo v poskusu uporabili insekticide v različnih koncentracijah: O %, 16,8 %; 24 %; 34,3; 49 %; 70 %; 100 %; 200 %; 400 % in 800 % poljskega odmerka. 100 % koncentracija je bila enaka priporočenemu poljskemu odmerku pripravka (l/ha) v 400 1 vodne raztopine. Iz teh t.i. 100 % koncentracij smo izračunali vse ostale koncentracije preskušanih insekticidov. Priporočeni odmerek za insekticid dursban E-48 je bil 2,0 l/ha, za confidor SL 200 0,5 l/ha in za karate zeon 5 CS 0,13 l/ha. Tabela 1: Uporabljene koncentracije insekticidov Insekticid Koncentracija (%) glede na priporočeni poljski odmerek Oznaka Količina insekticida v ml za 100 ml vode Ppm im 800 D 800 4 40000 400 D 400 2 20000 200 D 200 1 10000 DURSBAN 100 D 100 0,5 5000 E-48 70 D 70 0,35 3500 (klorpirifos 49 D 49 0,245 2450 480 g/l ) 34,2 D 34,2 0,171 1710 24 D 24 0,120 1200 16,8 D 16,8 0,084 840 0 DO 0 0 800 C 800 1 10000 400 C 400 0,5 5000 200 C 200 0,25 2500 CONFIDOR 100 C !00 0,125 1250 SL 200 70 C 70 0,088 880 (imidakloprid 49 C 49 0,061 610 200 g/l) 34,3 C 34,3 0,043 430 24 C 24 0,030 300 16,8 C 16,8 0,021 210 0 CO 0 0 800 K 800 0,256 2560 400 K 400 0,128 1280 KARATE ZEON 5 CS (lambdacihalotrin 50 g/l) 200 K 200 0,064 640 100 K 100 0,032 320 70 K 70 0,022 220 49 K 49 0,016 160 34,2 K 34,3 0,011 110 24 K 24 0,008 80 16,8 K 16,8 0,005 50 0 KO 0 0 Pred vsakim poskusom smo pripravili po 100 ali 200 ml navedenih insekticidnih raztopin, vanje smo pomakali sveže nabrane krompirjeve liste, jih osušili na zraku in zložili v petrijeve Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva posode, premera 14 cm. V skladu z omenjeno metodo smo na tako pripravljene liste v vsako posodo dodali po 10 osebkov koloradskega hrošča, ločeno ličinke L1/L2, L3/L4 in odrasle hrošče. Petrijeve posode smo postavili v gojitveno komoro (tip RK - 720 VPCH, proizvajalec: Kambič, Semič), kjer je bila 80 % zračna vlaga in režim 16 ur dan in 8 ur noč. Poskus je potekal v štirih ponovitvah, tako je bilo vsaki koncentraciji posamezne aktivne snovi izpostavljenih skupaj 40 osebkov enakega razvojnega stadija. Pri kontrolnih postopkih (koncentracija O %) smo krompiijeve lističe pomakali samo v vodo, brez insekticida. Po 48 in po 72 urah smo za vsako posodo ocenili smrtnost hroščev. Iz dobljenih podatkov smo najprej izračunali korigirano smrtnost žuželk po Abbottovi formuli. Rezultate smo nato statistično obdelali s Probit analizo. Za različne populacije in razvojne stadije koloradskega hrošča smo dobih funkcijsko krivuljo, ki določa razmerje med koncentracijo in učinkovitostjo insekticida. Iz nje smo odčitali dve pomembni vrednosti, LD50 in LD95. Vrednosti nam povesta, pri kateri koncentraciji insekticida smo dosegli 50 % oz. 95 % smrtnost žuželk v poskusu. Čim manjši sta vrednosti, tem boljše je delovanje sredstva. Za ugotavljanje morebitne odpornosti je potrebno primerjati obe vrednosti s priporočenimi poljskimi odmerki insekticidov. Kadar je LD95 enak priporočenemu poljskemu odmerku, lahko, gledano teoretično, izhaja, da majhen del preiskovane populacije hrošča preživi, da torej rezistenca obstaja. Tabela 2: Preskušam insekticidi in razvojni stadiji koloradskega hrošča po lokacijah vzorčenja Lokacija vzorčenja Klorpirifos (dursban E-48) Lamt (karal da-cihalotrin e zeon 5 CS) Imidakloprid (confidor SL 200) Komenda Ll,2 H Ll,2 H Ll,2 H Domžale Ll,2 H Ll,2 H H Dorfarje H H Kranj Ll,2 L3,4 Ll,2 L3,4 Ll,2 L3,4 Lipovci/Beltinci L3,4 L3,4 L3,4 Krasinec Ll,2 Ll,2 L3,4 Cerklje/Krško Ll,2 H Ll,2 H L3,4 H Vrhovo Ll,2 Ll,2 H L3,4 Lipovec/Žužemberk L3,4 L3,4 H L3,4 Ljubljana/BF H H H 2.2 Odpornost hmeijeve listne usi na imidakloprid, pimetrozin in lambdacihalotrin V letih 2007 in 2008 smo konec maja in v juniju izvajali laboratorijsko testiranje odpornosti hmeijeve listne uši Phorodon humuli na sistemična insekticida confidor 200 SL (a.s. imidakloprid) in chess 50 WG (pimetrozin) ter na insekticid s kontaktnim delovanjem - karate Zeon 5 CS (lambda-cihalotrin) po metodi Hardy in Kuldova (1981). Hmeijeve listne uši smo nabrali v hmeljiščih Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS) v Žalcu, na dveh lokacijah v Savinjski dolini (Mozirje, Gomilsko) ter na Koroškem (Šmartno pri Slovenj Gradcu). Mlade hmeijeve listne uši iz različnih krajev, katere smo nanesli na spodnjo stran listov hmelja, smo izpostavili osmim različnim koncentracijam aktivne snovi imidakloprid (0,001 %; 0,00175 %; 0,00359 %; 0,0175 %; 0,12225 %; 0,01 %; 0,02 % - priporočena koncentracija); kot kontrolo smo uporabili vodo. Aktivno snov pimetrozin smo nanesli oziroma preizkusili v šestih različnih koncentracijah (0,0005 %; 0,001 %; 0,003 %; 0,005 %; 0,02 % - priporočena koncentracija; 0,03 %), lambda-cihalotrin pa v treh različnih Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva koncentracijah (0,01 % - priporočena koncentracija; 0,02 % in 0,03 %); kot kontrolo smo vedno uporabili vodo. Lambda-cihalotrin smo uporabili le za primerjavo, saj je znano, daje nanj hmeljeva listna uš v preteklosti že razvila odpornost in ga hmeljaiji zato dlje časa niso uporabljali, danes pa ga ponovno rabijo za začetno zatiranje nizkih populacij uši. Vsa obravnavanja pri preverjanju učinkovitosti omenjenih aktivnih snovi smo opravili v 6 ponovitvah. Po en (1) ml insekticidne raztopine smo nanesli na posamezen list s pomočjo naprave Potter Tower in nanj naselili po 20 mladih uši. Umrljivost uši smo ugotavljali po 5 do 7 dneh. Poskus smo opravili v rastni komori (Kambič), kjer je bila temperatura 23°C, zračna vlažnost pa 70 % pri 16 umi osvetlitvi. Ugotavljali smo odstotek smrtnosti listnih uši in na temelju tega izračunali biološko učinkovitost preizkušanih insekticidov (po formuli Schneider-Orelli) z ozirom na različne koncentracije. Opravili smo primeijavo rezultatov z ozirom na različne lokacije, s katerih so izvirale listne uši, oziroma z ozirom na preizkušane insekticide. 2.3 Odpornost gliv Monilinia fructigena in M, laxa na fungicide iz skupine dikarboksimidovj anilinopirimidinov in hidroksianilidov Ugotavljali smo pojav odpornosti pri izolatih vrst M. laxa in M fructigena na fungicide iz skupine dikarboksimidov, anilinopirimidinov in hidroksianilidov. Za preskus smo izbrali pripravke: kidan z aktivno snovjo iprodion (25 %) iz skupine dikarboksimidov s srednjim do visokim tveganjem za pojav odpornosti, pripravek chorus 75 WG z aktivno snovjo ciprodinil (75 %), ki sodi v skupino anilinopirimidinov in je pri njem tveganje za pojav rezistence srednje ter pripravek teldor WP 50 z aktivno snovjo fenheksamid (50 %), ki je hidroksianilid z nizkim do srednjim tveganjem za pojav odpornosti. V poskusu smo uporabili izolate vrst M laxa in M fructigena, ki povzročata pojav cvetne monilje in sadne gnilobe pri številnih vrstah sadnega drevja. Vrsti sta pri nas endemični in v vlažnih letih, ko so pogoji za razvoj bolezni ugodni, lahko povzročita znaten izpad pridelka. Večino izolatov, ki smo jih uporabili v poskusu, smo izolirali v letih 2007 in 2008, uporabili pa smo tudi nekaj starejših izolatov, ki smo jih pridobili v letih 2003 - 2005 in jih hranimo v mikološki zbirki na Kmetijskem inštitutu. Skupno število testiranih izolatov je 31, od tega 21 izolatov vrste M laxa in 10 izolatov vrste M fructigena. Seznam uporabljenih izolatov s podatki o njihovem izvoru, gostiteljih in starosti je v tabeli 3. Uporabili smo dve koncentraciji fungicidov, priporočen odmerek in polovični odmerek. Poskus smo opravili v štirih ponovitvah. V petrijevke smo nalili 20 ml krompiijevega agarja (Biolife), ki smo mu tik pred strjevanjem dodali ustrezno količino fungicida. V sredino petrijevke smo položili krožce agarja, preraščenega z micelijem izbranih izolatov vrst M. laxa in M. fructigena. Krožci, ki smo jih uporabili za inokulum, so bili premera 10 mm in izrezani iz deset dni starih kultur. Inokulirane petrijevke smo inkubirali v rastni komori, pri temperaturi 22 "^C in 12 umi osvetlitvi. Izmerili smo premer kolonije po petih, osmih in dvanajstih dneh inkubacije. Pri izolatih, ki so priraščali zelo neenakomerno, smo opravili najmanj tri meritve premera kolonije in pri nadaljnjih izračunih upoštevali povprečno vrednost. Inhibicijo micelija gliv M. laxa in M fructigena na gojišču z dodanimi izbranimi fungicidi smo izrazili kot odstotek zmanjšanja radialnega prirasta micelija pri različnih koncentracijah aktivne snovi glede na prirast pri kontroli. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva Tabela 3: Izolati vrst Monilinia laxa in M. fructigena, ki smo jih uporabili v preizkusih Izolat Najdišče Gostitelj Leto izolacije M. laxa 07-458 Bilje, matičnjak breskev 2007 07-259-14 Ajdovščina, sadovnjak breskev 2007 07-257-2 Krško, sadovnjak nektarina 2007 07-259-10 Ajdovščina, sadovnjak breskev 2007 07-457 Ormož, matičnjak češnja 2007 07-259-12 Ajdovščina, sadovnjak breskev 2007 07-259 Ajdovščina, sadovnjak breskev 2007 M 185 Pijava gorica, vrt marelica 2000 M 15/04 Škofja loka, vrt jablana 2004 M 250 Kampel, sadovnjak breskev 2003 M 294/04 Pince, vrt češnja 2004 M 255 Dekani, sadovnjak breskev 2003 M 321 Dobravlje, sadovnjak breskev 2003 08-8526 Prvačina, sadovnjak breskev 2008 08-5141 Zalošče, sadovnjak breskev 2008 08-5146 Batuje, sadovnjak breskev 2008 08-5158 Potoče, sadovnjak breskev 2008 08-5159 Steske, sadovnjak breskev 2008 08-5366 Bije, sadovnjak breskev 2008 08-5148 Prvačina, sadovnjak breskev 2008 08-5365 Brje, sadovnjak breskev 2008 M fructigena 07-389 Kamnik, tržnica sliva 2007 07-259-8 Ajdovščina, sadovnjak breskev 2007 07-258A Izola, sadovnjak breskev 2007 M 287/04 Vodranci, vrt sliva 2004 M 164 Spodnja Braniča, sadovnjak breskev 2004 M 330 Dobravlje, matičnjak breskev 2003 M 317/04 Šalovci, vrt sliva 2004 M 260 Zdole, sadovnjak breskev 2003 08-5367 Prvačina, sadovnjak breskev 2008 M 433 Zgornje Palovče,vrt hruška 2006 2.4. Odpornost glive Uncinula necator na fungicide iz skupine triazolov in strobilurinov Odpornost glive Uncinula necator smo ugotavljali na fungicide iz skupine triazolov in strobilurinov. Uporabili smo triazolni pripravek systhane 12-E (miklobutanil) in topas 100 EC (penkonazol), iz skupine strobilurinov pa quadris (azoksistrobin). Vzorce, na spodnji strani z glivo okužene liste vinske trte, smo nabirali v poletnih mesecih (junij, julij, avgust) v Posavju in na Primorskem. Jemali smo jih iz okuženih vinogradov z različnih sort vinske trte. Posamezen vzorec je bil sestavljen iz 30 okuženih listov, ki so bili pobrani s 30 naključno napadenih trsov. Vzorce smo pred izvedbo poskusa 2-4 dni inkubirali v rastni komori (^-900CH) pri 22° C, 16 umi osvetlitvi in 70 % relativni zračni vlagi. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva Za Ugotavljanje odpornosti obravnavane glive na izbrane fungicide smo v rastlinjaku pri temperaturi nad 35°C vzgajali za oidij občutljive liste na trsnih cepljenkah, sorte Beli burgundec (Chardonnay). Mlade lističe testnih rastlin smo pred testiranjem najprej razkužili z 2 % kalcijevim hipokloridom, izprali s sterilno destilirano vodo in posušili s filter papiijem. Za preprečitev okužb z drugimi vrstami gliv smo liste ponovno namočili v raztopino metirama (Polyram DF), posušili in s sterilnim luknjačem premera 12 mm izrezovali krožce. Štirikrat po pet listnih krožcev za vsak odmerek posameznega fungicida smo namakali in pretresali 30 minut v testni fungicidni raztopini. Obdelane testne krožce smo posušili in postavili na navlažen filter papir v petrijevkah premera 100 mm. Kontrolne krožce smo namakali samo v destilirani vodi. Tretirane testne krožce smo izpostavili fungicidni raztopini pripravka systhane 12 E in sicer koncetracijam, ki so vsebovale 31.25, 3.1, 0.31, 0.031 in O ^g/ml miklobutanila. Enake koncentracije smo uporabili tudi pri preizkušanju sredstva topas 100 EC (penkonazol). Za testiranje odpornosti glive na azoksistrobin smo uporabili pripravek quadris (250, 25, 2.5, 0.25 in O ^g/ml aktivne snovi). S sredstvi obdelane listne krožce smo za 24 ur postavili v rastno komoro (22 °C, 16 uma osvetlitev, 70 % RH). Naslednji dan smo lističe inokulirali s sporami oidija. Na vsakem listnem krožcu je bilo od 6 - 42 konidijev. Kaljivost in razrast spor smo spremljali s pomočjo stereomikroskopa (NIKON SM Z 800). Tabela 4: Vzorci populacije glive Uncinula necator za testiranje odpornosti na miklobutanil, Oznaka vzorca Lokacija vzorčenja Sorta Leto testiranja RF 1/07 Ravnje, vinograd refošk 2007 RF2/07 Ravnj e-Osredek-vino grad refošk 2007 SB 3/07 Ravnj e-Planine-vinograd Sivi burgundec 2007 BB 4/07 Ravnje- Planine-vinograd Beli burgundec 2007 RB5/07 Ravnj e-Planine-vinograd rebula 2007 M 6/07 Ravnj e-Planine-vinograd merlot 2007 G 7/07 Ravnj e-pergola gnjat 2007 M8/07 Ravnje - vinograd merlot 2007 BB 9/07 Ravnj e-vinograd Beli burgundec 2007 RF 10/07 Ankaran - vinograd refošk 2007 RF 11/07 Bertoki - vinograd refošk 2007 M 12/07 Bertoki - vinograd merlot 2007 MF 13/07 Trška gora-vinograd modra fi'ankinja 2007 BB 14/07 Trška gora-vinograd beli burgundec 2007 BB 15/07 Skocj an-vinograd beli burgundec 2007 MF 16/07 Sremič-vinograd modra frankinja 2007 BB 17/07 Sremič-vinograd beli burgundec 2007 RF 1/08 Storj e-vinograd refošk 2008 RF2/08 Avber- vinograd refošk 2008 M 3/08 Spodnja Braniča - vinograd merlot 2008 M 4/08 Krtinovca - vinograd merlot 2008 BB 5/08 Krtinovca - vinograd beli burgundec 2008 BB 6/08 Ravnje - vinograd beli burgundec 2008 RF7/08 Gažon - vinograd refošk 2008 RF8/08 Prade - vinograd refošk 2008 BB 9/08 Izola - vinograd beli burgundec 2008 RF 10/08 Sečovlje - vinograd refošk 2008 M 11/08 Bilje - vinograd merlot 2008 Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva V letu 2007 smo testirali 17 populacij oidija iz dveh vinorodnih območij. Pet vzorcev je bilo odvzetih v Posavju, dvanajst pa v primorskem vinorodnem okolišu. V letu 2008 smo skupaj testirali enajst vzorcev oidija, vsi so bili odvzeti v primorskem vinorodnem okolišu. 2.5. Odpornost plevelov na V okviru poljskih poskusov smo v letih 2007 in 2008, skladno s sprejetim programom opravili po štiri mikro poskuse v koruzi in ozimnih žitih in preveijali učinkovitost herbicidov ter ugotavljali morebiten pojav odpornosti posameznih plevelov na herbicide iz skupine triazinov in sulfonil sečnin (ALS inhibitorji). Poskuse smo zasnovali na lokacijah, kjer so imeli pridelovalci v preteklih letih težave z učinkovitostjo herbicidov in je obstajal sum na odpornost plevelov. V raziskavo smo vključili večino najpogosteje uporabljenih aktivnih snovi iz skupine triazinov (koruza) in ALS inhibitorjev (koruza in žita), ki jih v Sloveniji uporabljamo za zatiranje plevelov. Poleg poljskih poskusov smo opravili testiranja odpornosti plevelov na nekatere herbicide z-lončnimi poskusi v rastlinjaku in mrežniku. Iz sto (50 njiv v letu 2006 in 50 v letu 2007) naključno izbranih njiv iz različnih območij Slovenije smo v mesecu avgustu nabrali seme bele metlike {Chenopodium album) in srhkodlakavega ščira (Amaranthus retroflexus), z istih njiv pa smo pobrali tudi vzorce tal. Nabrano seme smo očistili in shranili ter ga spomladi 2008 posejali v lončke z namenom ugotavljanja odpornosti. Za potrebe uvajanja laboratorijskih metod za detekcijo odpornosti na triazine in ALS inhibitorje smo v rastlinjaku posejali seme treh rastlinskih vrst: bele metlike (Chenopodium album) - (4 različne genotipe, po štiri vzorce na genotip), srhkodlakavega ščira (Amaranthus retroflexux )- (dva različna genotipa, po tri vzorce na genotip) in dodatno še sončnice {Helianthus annus)- (dva različna genotipa, po tri vzorce na genotip). Iz omenjenih vzorcev smo izolirali DNK. Uporabili smo dve različni metodi: z magnetki in uporabo robota za izolacijo DNK (Qiagen, Kingfischer) ter s pomočjo kita za izolacijo DNK (Sigma). Tako pripravljene vzorce smo uporabili za določevanje odpornosti na triazine in ALS inhibitorje. V nadaljevanju smo uporabili PCR metodo za vzorce sončnic (Helianthus annus). Uporabili smo tri različne kombinacije začetnih oligonukleotidov ALS2, ALS3 in ALS5. Za pozitivno kontrolo smo vzeli vzorce vrste Amaranthus retroflexus, ker so bili začetni oligonukleotidi dizajnirani za to vrsto. V letih 2007 ter 2008 smo na različnih območjih Slovenije (Podravje, Pomurje, Krško polje, Koroška, Savinjska dolina in Primorska) nabirali tudi seme na ALS inhibitorje, predvidoma občutljivih in odpornih plevelnih vrst: Setaria glauca, S. viridis, Amaranthus retroflexus, A. hybridus, Echinochloa crus-galli, Chenopodium album, Ch. polyspermum in nekatere druge. Seme smo nabirali na površinah s posevki, na katerih so pridelovalci uporabljali herbicide iz skupine triazinov in ALS inhibitoijev najmanj pet zadnjih let, medtem ko smo v primeru občutljivih populacij semena iskali njive, kjer se ti herbicidi v preteklosti po zagotovilih pridelovalcev niso uporabljali. Zbrano seme nam bo služilo za nadaljevanje preučevanja odpornosti različnih plevelnih vrst na herbicide. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti Škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva 3 REZULTATI IN KOMENTAR Koloradski hrošč Leptinotarsa decemlineata je še vedno najpomembnejši škodljivec krompiija, ki povzroča defoliacijo krompirjevih rastlin in posledično izgube pridelka, zato je kemično zatiranje nujen ukrep. Škodljivec ima izredno veliko sposobnost prilagajanja okoljskim razmeram, kar velja tudi za insekticide in je v območjih z intenzivnim kmetovanjem razvil odpornost proti vsem skupinam sintetičnih insekticidov. O prvih opažanjih glede sprememb v odzivanju koloradskega hrošča na arzenove pripravke so poročali že daljnega leta 1912 v ZDA, čeprav pojma »odpornost« takrat še niso poznali. Pridelovalci so zaradi slabega delovanja že takrat povečevali odmerke. S splošno uveljavitvijo DDT-ja v kmetijstvu v letu 1945 so bile težave začasno odpravljene, vendar so že po nekaj letih ponovno opažali zmanjšano občutljivost škodljivca. Odpornost na DDT se je razvila že po 14 do 24 generacijah. Od takrat naprej so v ZDA za zatiranje koloradskega hrošča uporabljali različne kemične spojine, z različnimi načini delovanja, vendar je hrošč sčasoma razvil odpornost proti vsem sintetičnim insekticidom. Se več, do pojavov odpornosti je prihajalo vedno hitreje. Odpornost koloradskega hrošča na insekticide so ugotavljali tudi v Evropi. Na območju bivše Jugoslavije so leta 1967 v Sloveniji in na Hrvaškem dokazali pojav rezistence proti kloriranim ogljikovodikom. Odpornost seje razvila 16 let po začetku njihove široke uporabe. Maceljski navaja, da je bila po podatkih IRAC (Insect Resistance Action Committee) odpornost koloradskega hrošča na snovi iz skupine organofosfomih insekticidov, karbamatov in piretroidov v letu 1993 velik problem v mnogih državah srednje in vzhodne Evrope (Hrvaška, Romunija, Češka, Slovaška, Poljska, Ukrajina in Rusija). Odpornost na iste skupine insekticidov so potrdili tudi v Nemčiji. V Sloveniji raziskav, ki bi potrdile ali ovrgle razvoj odpornih populacij koloradskega hrošča na omenjene skupine insekticidov ni bilo. S hitrim testom je bila v letih 1997 in 1998 pri populaciji koloradskega hrošča iz okolice Ljubljane nakazana možnost pojava odpornosti na fosalon in kvinalfos iz skupine organofosfomih insekticidov ter alfametrina iz skupine sintetičnih piretroidov. Organofosfomi insekticidi (01) so po kemijski sestavi estri različnih fosforjevih kislin (fosforjeva, tiofosfoijeva, ditiofosforjeva itn.) in so najobšimejša skupina insekticidov. V varstvu rastlin so se začeli uporabljati po letu 1945, pri nas v sedemdesetih letih prejšnjega stoletja. V organizmu škodljivcev motijo prevajanje živčnih dražljajev z oviranjem ali preprečevanjem delovanja encima acetilholin esteraze. Dobro delujejo na sesajoče in grizoče žuželke in tudi na pršice, zato seje njihova raba hitro razširila. Nekateri med njimi se lahko prenašajo po rastlini s transpiracijskim ali asimilacijskim tokom. V okolju se te snovi razmeroma hitro razgradijo, imajo pa večinoma veliko akutno toksičnost. Piretroidi so insekticidi, ki so bili prvotno pridobljeni iz rastlinskih surovin. Zaradi slabe obstojnosti na svetlobi je industrija v sedemdesetih letih minulega stoletja razvila sintetične piretroide. To so živčni strupi, ki sodijo v skupino snovi, ki vplivajo na prenos natrijevih ionov preko celičnih membran. V zelo majhnih odmerkih delujejo proti žuželkam in nekateri tudi proti pršicam. Imajo širok spekter delovanja ter visoko in dolgotrajno učinkovitost. Neonikotinoidi so mlajša skupina insekticidov, katerih prva aktivna snov imidakloprid je prišla na trg leta 1991. Kmalu so mu sledile še druge snovi iz iste skupine in enakim načinom delovanja. Neonikotinoidi delujejo tako, da z blokado transmiteijev impulzov (acetilholina) v sinapsah blokirajo prenos živčnih dražljajev med nevroni in tako povzročijo smrt žuželke. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva Insekticid klorpirifos (pripravek dursban E-48) smo preizkušali na desetih populacijah koloradskega liošča, različnih starosti. V poskusih z mladimi ličinkami (L1/L2) so bile vrednosti LD50 in LD95 med populacijami različne. Na petih lokacijah so bile nižje glede na priporočeni odmerek za faktor 0,2 do 0,8. Pri populacijah z Dolenjske in Posavja pa so bile vrednosti LD95 precej višje od priporočenih koncentracij, in sicer za 1,8 do 2,5 krat (slika 1), kar pomeni, da lahko govorimo o rezistenci. Kranj Komenda Vrhovo Lipovec Cerklje pri Krasinec Krškem Domžale LD50 LD95 •Priporočeni odmerek (100%) Slika 1: Prikaz vrednosti LDsoinLDps za insekticid klorpirifos po lokacijah (ličinke L1/L2) Tudi pri starejših ličinkah (L3/L4) so bile na dveh lokacijah vrednosti LD95 skoraj enake ali višje od priporočene koncentracije in le na eni nižje (faktor 0,7). V Beltincih pa je bila vrednost LD95 kar za 20 krat višja od priporočenega odmerka. Tudi v poskusu z odraslimi hrošči smo ugotovili razmeroma slabo delovanje insekticida pri treh populacijah, v Cerkljah, Ljubljani in v Domžalah. Vrednosti za LD95 so bile v teh krajih od 32 do 126 krat višje od priporočenega odmerka. £ Q. Q. Ü C 8 C o Slika 2: Prikaz vrednosti LD50 in LD95 za insekticid klorpirifos na treh lokacijah (ličinke L3/L4) Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 10 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva E Q. D. 0) O C ž Slika 3: Prikaz vrednosti LD50 in LD95 za insekticid klorpirifos na petih lokacijah (hrošči) Sintetični piretroid lambda-cihalotrin smo preskušali v 16 poskusih na desetih populacijah koloradskega hrošča, različnih starosti. Za razliko od klorpirifosa, ki je pri nekaterih populacijah še nudil dobro učinkovitost, smo za lambda-cihalotrin na vseh preskušanih populacijah in vseh starostih žuželk ugotovili slabo delovanje, kar kaže na visoko stopnjo odpornosti hrošča nanj. Pri poskusu z mladimi ličinkami (L1/L2) so bile vrednosti LD95 od priporočene koncentracije (320 ppm) višje za 5,4 do 12,5 krat, pri ličinkah L3/L4 za 3,6 do 90,7 krat. Pri odraslih hroščih pa je ta faktor znašal od 9,9 (Dorfarje) do 1750 (Cerklje pri Krškem). >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 Kranj Komenda Vrtiow Cerklje pri Krškem Krasinec Domžale 1LD50 LD95 'Priporočeni odmerek Slika 4: Prikaz vrednosti LD50 inLD95 za insekticid lambdacihalotrin pri ličinkah stadija L1/L2 po različnih lokacijah Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 11 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva > 1000 > 1000 > 1000 Kranj Beltinci Lipovec LD50 LD95 •Priporočeni odmerek Slika 5: Prikaz vrednosti LD50 inLD95 za insekticid lambdacihaiotrin pri ličinkah stadija L3/L4 na treh lokacijah >6 000 •6 000 Komenda Cerklje pri Domžale Vrhovo Lipovec Dorfeije Ljubljana Krškem ILD50 LD95 .........-Poljski odmerek | Slika 6: Prikaz vrednosti LD50 in LD95 za insekticid lambdacihaiotrin pri hroščih na različnih lokacijah Insekticid imidakloprid je pri vseh poskusnih populacijah in vseh razvojnih stadijih pokazal odlično delovanje na koloradskega hrošča, tudi pri najnižji koncentraciji uporabljeni v poskusu. Zaradi tako velike smrtnosti žuželk, rezultatov nismo mogli analizirati s Probit analizo in izračunati vrednosti LD50 in LD95. Izračunali smo samo korigirano smrtnost za najnižjo preizkušano koncentracijo, ki je bila 16,8 % priporočenega poljskega odmerka. Za ličinke L1/L2 je bila smrtnost na vseh lokacijah 100 %, za ličinka L2/L3 je bila v Kranju in Beltincih 97,5 %, za hrošče pa v Ljubljani 93,5 %, v Komendi in Cerkljah 95 % in v Domžalah 100 %. Rezultati kažejo na to, da je priporočeni odmerek imidakloprida za zatiranje koloradskega hrošča velik in da bi odlično učinkovitost lahko dosegli že z bistveno nižjim odmerkom. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 12 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva Učinkovitost imidakloprida pri 16,8 % koncentraciji cr 100 % 90 r 85 ^ 80 L1L2 ■ L3L4 n Hrošč Slika 7: Učinkovitost imidakloprida v koncentraciji 210 ppm (16,8 % priporočenega poljskega odmerka) za različne razvojne stadije koloradskega hrošča Ugotovili smo, da obstajajo razlike v občutljivosti slovenskih populacij koloradskega hrošča na insekticide iz skupine organofosfomih insekticidov, sintetičnih piretroidov in neonikotinoidov. Odpornost na organofosfomi insekticid klorpirifos smo dokazali pri večini analiziranih populacij, pri vseh populacijah smo ugotovili tudi visoko stopnjo odpornosti na sintetični piretroid lambda-cihalotrin. Učinkovitost neonikotinskega pripravka imidakioprid pa je bila odlična na vseh lokacijah in pri vseh razvojnih stadijih hrošča. Taki rezultati do bili deloma pričakovani. Organofosfomi insekticidi so se za zatiranje koloradskega hrošča pri nas uporabljali približno trideset let. Pred nekaj leti je bil klorpirifos zaradi toksikoloških lastnosti umaknjen iz prometa. Sintetični piretroidi so v uporabi od konca osemdesetih leti prejšnjega stoletja in so še vedno pomembna skupina insekticidov. Proti koloradskemu hrošču je trenutno registriranih šest insekticidov iz te skupine od skupno dvanajstih pripravkov. V zadnjih letih so proti koloradskemu hrošču najbolj učinkoviti neonikotinski pripravki. Imidakioprid se sicer proti temu škodljivcu več ne uporablja, so pa trenutno pri nas registrirani trije pripravki iz iste skupine, to so actara 25 WG (a.s. tiametoksam), calypso SC 480 (tiakloprid) in mospilan 20 SG (a.s. acetamiprid). Zaradi odlične učinkovitosti jih pridelovalci krompirja zadnja leta tudi najpogosteje uporabljajo. Kljub trenutno dobri učinkovitosti je razvoj rezistence sčasoma neizogiben (v ZDA so že potrdili odporne populacije koloradskega hrošča na imidakioprid), zato sije treba prizadevati za čimbolj dolgo »zadrževanje« pojava odpornosti. Odlična učinkovitost neonikotinskih insekticidov ne sme zavesti pridelovalcev k enostranski uporabi omenjenih sredstev. Eden od poglavitnih ukrepov za preprečevanje (zadrževanje) pojavov odpornosti je izmenična raba insekticidov iz različnih skupin oz. z različnimi mehanizmi delovanja in zatiranje škodljivcev v mladih razvojnih stadijih, ko so le ti najbolj občutljivi. Hmeljeva listna u§ (Phorodon humuli) je poleg navadne (hmeljeve) pršice {Tetranychus urticae) pomemben škodljivec hmelja, ki se pojavlja vsako leto in s svojim sesanjem povzroča neposredno škodo (zmanjšanje pridelka hmelja) kot tudi posredno škodo s prenosom virusa Hop mosaic carlavitus (HMV). Krilate oblike hmeljeve listne uši preletijo iz zimskega gostitelja, domače češplje, običajno konec aprila oziroma v začetku maja (slika 8). Prelet krilatih uši traja v povprečju 46 dni. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 13 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva 12 £ ro U o C 3 £ «S I? "Ž 4 ATI -----leto 2007 -leto 2008 26.29.2. 5. 8. 11.14.17.20.23.26.29. 1. 4. 7. 10.13.16. april maj junij Slika 8: Prelet krilatih uši iz zimskega gostitelja (koščičarji) na letnega gostitelja (Hmelj), Žalec IHPS Hmeljeva listna uš ima v sorazmerno kratkem obdobju (2 meseca) 6-8 generacij/leto. To je tudi eden od razlogov za možen pojav odpornih uši na pogosto uporabljene insekticide. Za zatiranje hmeljeve listne uši se že preko 10 let uporabljata dva insekticida s sistemičnim načinom delovanja na podlagi a.s. pimetrozin (chess 50 WG) in a.s. imidakloprid (confidor 200 SL). Med njima se delno kolobari, običajno pa hmeljarji posegajo bolj po slednjem. V nasadih hmelja, na posameznih rastlinah hmelja, smo večkrat zasledili slabše delovanje insekticida confidor 200 SL za katere smo predpostavljali, daje hmeljeva uš razvila odpornost na njegovo a.s. imidakloprid. To smo želeli preveriti v laboratoriju v nadzorovanih razmerah. Pri preverjanju biološke učinkovitosti različnih koncentracij imidakloprida (confidor) na hmeljevo listno uš smo ugotovili razlike v delovanju na posamezne populacije listnih uši, ki so izvirale iz različnih hmeljarskih območij. Najboljšo učinkovitost imidakloprida smo dosegli na lokaciji Šmartno pri Slovenj Gradcu (zadovoljiva učinkovitost pri vseh preizkušenih koncentracijah) (tabela 5). Omenjena lokacija se ne nahaja v Savinjski dolini, kjer se prideluje največ hmelja. Prav tako se na tej lokaciji že vrsto let dosledno izvaja antirezistenčna strategija, ki temelji na izmenični rabi insekticidnih snovi (imidakloprid in pimetrozin). Najslabše delovanje preizkušanih insekticidnih snovi smo zaznali pri ušeh nabranih v okolici Mozirja, kjer so vrsto let zapovrstjo uporabljali le insekticid confidor. Na temelju predstavljenih rezultatov lahko sklenemo, da hmeljeva listna uš ni odporna na imidakloprid, da pa se v nekaterih hmeljiščih kažejo znamenja pojemanja njegove biološke učinkovitosti. Domnevamo, da je vzrok za to dolgoletna raba imidakloprida na istih površinah, vzroke pa lahko iščemo tudi v napakah pri aplikaciji teh sredstev kot tudi spremenjenih podnebnih razmerah pri nas. Znano je namreč, daje hmelj v stresnih situacijah manj dovzeten za sprejem in nadaljnji transport aktivnih snovi s sistemičnim delovanjem po rastlini. Posledice višjih temperatur se kažejo tudi v hitrejšem prehajanju rastlin hmelja v Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 14 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva generativno fazo - fazo cvetenja, v okviru katere se še dodatno poslabša učinkovitost posameznih aktivnih snovi. Tabela 5: Povprečna biološka učinkovitost imidakloprida (confidor 200 SL) na hmeljevo Lokacija Koncentracije (%)/biološka učinkovitost po Schneider-Orelli (%) 0,001 0,00175 0,00359 0,0175 0,01 0,02 0,12225 Žalec (IHPS) 83,6 86,6 99,2 100,0 100,0 100,0 100,0 Mozirje 65,7 75,3 84,3 92,1 94,6 95,2 100,0 Gomilsko 80,2 81,6 87,5 93,1 100,0 100,0 100,0 v Šmartno pri SG 87,4 89,2 99,1 100,0 100,0 100,0 100,0 Povp. 79,2 83,2 92,5 96,3 98,7 98,8 100,0 Tabela 6: Povprečna biološka učinkovitost pimetrozina (chess 50 WG) na hmeljevo listno liš Lokacija Koncentracije (%)/biološka učinkovitost po Schneider-Orelli [%) 0,0005 0,001 0,003 0,005 0,02 0,03 Žalec (IHPS) 62,1 65,1 69,8 72,8 73,6 87,3 Moziije 58,6 62,1 69,2 69,4 72,9 84,6 Gomilsko 63,4 64,1 70,1 75,4 75,1 87,4 Šmartno pri SG 69,2 72,3 76,2 80,4 85,9 91,5 Povp. 63,3 65,9 71,3 74,5 76,9 87,7 Tudi pri preučevanju morebitne odpornosti hmeljeve listne uši ma pimetrozin izstopa lokacija Šmartno pri Slovenj Gradcu, saj se je zaradi že omenjenega antirezistenčnega programa tudi v tem primeru izkazalo, da preizkušano sredstvo bolje deluje oziroma je učinkovitejše kot na ostalih preučevanih lokacijah (tabela 6). Sicer pa je bil pimetrozin na splošno nekoliko slabši kot imidakloprid, saj z njim v nobenem primeru nismo presegli 90 % učinkovitosti, niti pri najvišji koncentraciji. Insekticid Karate Zeon 5 CS (lambda-cihalotrin) deluje kontaktno. Uporabili smo ga v treh (3) različnih koncentracijah in sicer 0,01; 0,02 in 0,03 %, kot kontrolo smo uporabili vodo. Učinkovitost lambda-cihalotrina smo ugotavljali na ušeh nabranih v Žalcu (Savinjska dolina) in sicer na različnih razvojnih stopnjah uši (na mladih, komaj izleglih in na starejših ušeh). Ugotovili smo, da z višjo koncentracijo preučevanega insekticida dosežemo nižjo učinkovitost. S poskusom smo dokazali, da so starejši osebki hmeljeve listne uši razvili višjo odpornost na omenjen insekticid kot mlajši, pri katerih je bila umrljivost večja. Delovna koncentracija pripravka Confidor (imidakloprid) v nasadih hmelja je 0,2 % oziroma v primeru zmanjšane uporabe vode 0,12 %. Na temelju naših preučevanj lahko sklenemo, da hmeljeva listna uš še pri nobeni navedeni koncentraciji ni razvila odpornosti (preglednica 1). Nekoliko slabšo učinkovitost smo zaznali pri pimetrozinu, pri katerem učinkovitost v nobenem primeru ni presegla 90 % (tabela 5). Z ozirom na predstavljene rezultate in težave naših pridelovalcev, ki se kažejo predvsem v nezadostnem naboru učinkovitih aktivnih snovi za zatiranje hmeljeve listne uši, bomo morali v prihodnje še naprej spremljati dogajanja, --15 Kmetijski inštitut Slovenije institut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva vezana na pojav morebitne odpornosti na uporabljena fitofarmacevtska sredstva. Na temelju rezultatov tovrstnih spremljanj bo mogoče v prihodnje pravočasno zaznati pojemanje učinkovitosti uporabljenih ^tivnih snovi za zatiranje škodljivih organizmov in se ustrezno odzvati. Glivi M. laxa in M.fructigena povzročata propadanje cvetov, razjede na poganjkih in gnitje plodov pri številnih vrstah sadnega drevja. Močne okužbe, povezane s propadanjem cvetov in vej, so pogoste zlasti pri višnjah, marelicah in jablanah. Razvijajoči se plodovi so razmeroma odporni, z zrelostjo pa postajajo vse bolj občutljivi. Pri koščičarjih so pogoste tudi latentne okužbe nedozorelih plodov, ki se pokažejo šele ob zorenju. Tedaj nastane največja gospodarska škoda, gnitje pa se nadaljuje tudi v skladišču. Za preprečevanje bolezni je poleg ustreznih tehnoloških in sanitarnih ukrepov nujna redna uporaba fungicidov. V strokovni literaturi poročajo o pojavu odpornosti vrst iz rodu Monilinia na fungicide iz skupine benzimidazolov že od leta 1976 (Jones, Ehret, 1976). Po daljši dobi intenzivne uporabe so pojav odpornosti zasledili tudi pri fungicidih, ki so derivati triazola (DMI fungicidi), npr. propikonazol (Schnabel et al., 2003). Ker intenzivna in dolgotrajna uporaba ozkega izbora fungicidov slej ko prej vodi do nastanka odpornosti, je potrebno s čim bolj enostavnimi tehnikami stalno spremljati raven odpornosti populacij vrst iz rodu Monilinia na ključne fungicide, kiji uporabljamo za njihovo zatiranje (Amiri in sod., 2008). Rezultate delovanja izbranih fungicidov na prirast micelija gliv M. laxa in M. fructigena povzemamo v tabelah 7 in 8. Predstavljeni so rezultati meritev po osmih dneh inkubacije. Meritve smo sicer opravili v treh časovnih razmikih, vendar je bil prirast micelija po petih dneh zelo majhen in razlike med izolati neizrazite, po dvanajstih dneh pa so nekateri izolati že prerasli celotno površino petrijevke. Rezultati kažejo, da sta tako priporočeni kot polovični odmerek fungicida teidor povsem zavrla rast vseh preizkušenih izolatov. Podobno je bila tudi pri fungicidu kidan inhibicija prirasta micelija od 92,9 do 100 %, razen pri izolatu vrste M laxa 08-5159, kije na gojišču z dodanim fungicidom dosegel približno polovico prirasta kontrolne kolonije. Nasprotno pa je imel fungicid chorus opazno manjši vpliv na prirast micelija preizkušenih izolatov. Inhibicija rasti za 60 ali več odstotkov je bila dosežena le pri osmih izolatih vrste M laxa (40 %) in enem samem izolatu vrste M fructigena (10 %). Pri izolatih vrste M. fructigena je bila ihnibicija prirasta micelija na gojišču z dodanim fungicidom chorus z izjemo enega izolata zelo šibka, pri štirih od desetih izolatov pa je bil prirast celo večji kot pri kontroli, najbolj izrazito pri izolatu 07-389, kjer je bil več kot polovico večji kot pri kontroli. Tabela 7: Inhibicija rasti micelija izolatov glive Monilinia laxa na gojiščih z dodatkom _različnih koncentracij fungicidov teidor, kidan in chorus po osmih dneh inkubacije Inhibicija prirasta micelija (%)® Izolat teidor teidor kidan kidan chorus chorus 1,5 ml/l 0,75 ml/l 3 ml/l 1,5 ml/l 0,2 g/l 0,1 g/l 07-458 100 100 100 98,75 65,0 64,0 07-259-14 100 100 100 100 67,2 57,2 07-257-2 100 100 100 100 67,0 60,0 07-259-10 100 100 100 100 55,0 52,0 Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 16 CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva 07-457 100 100 100 100 47,0 55,0 07-259-12 100 100 100 100 54,5 48,5 07-259 100 100 100 100 67,7 61,8 M 185 100 100 100 97,9 - M 15/04 100 100 100 100 67,7 65,7 M 250 100 100 96,7 95,8 69,8 49,9 M 294/04 100 100 97,4 100 57,5 44,6 M 255 100 100 99,1 92,9 67,4 56,1 M 321 100 100 100 100 14,0 11,1 08-8526 100 100 100 100 -12,2 -4,2 08-5141 100 100 100 100 4,5 1,8 08-5146 100 100 99,4 100 -13,6 0,1 08-5158 100 100 100 98,8 -11,5 5,2 08-5159 100 100 67,5 66,4 0,78 4,5 08-5366 100 100 100 100 -3,8 1,0 08-5148 100 100 100 100 -9,1 -0,7 08-5365 100 100 98,1 99,1 - 4,49 - 3,3 ^ podatki so povprečja štirih ponovitev / izolat Tabela 8: Inhibicija rasti micelija izolatov glive Monilinia fructigena na gojiščih z dodatkom različnih koncentracij fungicidov teldor, kidan in chorus po osmih dneh inkubacije Inhibicija prirasta micelija > {%f Izolat teldor teldor kidan kidan chorus chorus 1,5 ml/l 0,75 ml/l 3 ml/l 1,5 ml/l 0,2 g/l 0.1 g/l 07-389 100 100 100 100 -56,8 -72,7 07-259-8 100 100 100 100 74,4 65,0 07-258A 100 100 100 100 0 -49,1 M 287/04 56,7 59,0 100 94,0 -21,5 -31,2 M 164 100 100 100 100 -15,9 -30,3 M 330 100 100 100 87,3 34,7 -5,0 M 317/04 100 100 100 98,0 2,0 2,0 M 260 100 100 98,8 100 45,8 51,3 08-5367 100 100 99,1 100 13,3 -27,8 M 433 100 100 100 100 -22,1 -6,8 podatki so povprečja štirih ponovitev / izolat V opravljeni raziskavi smo ugotavljali morebiten pojav odpornosti izolatov gliv M. laxa in M. fructicola na fungicide iz skupine dikarboksimidov, anilinopirimidinov in hidroksianilidov (pripravki teldor, kidan in chorus). Aktivnih snovi iz skupine benzimidazolov in DMI fungicidov (inhibitorji demetilacije), ki so se v preteklih letih v Sloveniji veliko uporabljali za varstvo rastlin pred glivami iz rodu Monilinia^ in sodijo v skupino fungicidov z visokim oziroma srednjim tveganjem za pojav rezistence, v poskusu nismo uporabili, ker v letu 2008 v Sloveniji nobena od teh snovi ni več imela dovoljenja za uporabo. Uporabili smo test v petrijevkah, standardno metodo za ugotavljanje odpornosti --17 Kmetijski inštitut Slovenije institut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva patogenih gliv na fungicide (Ann., 1991). Metoda je dolgotrajna in draga, saj zahteva pripravo velikega števila petrijevk. V zadnjem letu so Amiri in sod. (2008) razvili postopke, ki so enostavnejši in hitrejši a primerljivi, saj ravno tako temeljijo na meijenju prirasta glive na gojišču. Uporabljena metoda testiranja je pokazala slabši odziv nekaterih izolatov vrst M laxa in M. fl-uctigena na pripravek chorus, saj je bila inhibicija prirasta micelija za 60 ali več odstotkov dosežena le pri 27 % izolatov, pri 30 % izolatov pa je dodatek priporočenega odmerka tega fungicida celo pospešil rast micelija, kar kaže na morebitno odpornost izolatov. Pri vrsti M. laxa smo slabšo občutljivost na flingicid chorus zasledili predvsem pri izolatih iz nekaterih intenzivnih nasadov breskev na Goriškem, pri vrsti M. fructigena pa ni bilo razlik glede na izvor izolatov (intenzivni / ekstenzivni nasadi oz. vrtovi). Oidij vinske trte Uncinula necator jc gospodarsko izjemno pomembna glivična bolezen, ki se v Sloveniji skoraj redno pojavlja predvsem v primorskih in posavskih vinogradih, v posameznih letih pa tudi v Podravju. Za varstvo vinske trte pred to boleznijo uporabljajo vinogradniki med drugim tudi sistemično delujoče triazolne in strobilurinske pripravke. Na temelju analize tveganja (FRAC), ki se nanaša na možnost pojava odpornosti glive Uncinula necator na strobilurinske oziroma triazolne fungicide je bilo ugotovljeno, da za prve obstaja visoko, za druge pa srednje tveganje. Pri strobilurinskih pripravkih se odpornost lahko pojavi na celotno skupino, pri triazolnih fungicidih pa je možna navzkrižna odpornost. V posameznih letih je oidij vinske trte težko obvladljiv, še posebej v območjih kjer prevladujejo mile zime (Primorska, Posavje) in kjer so v času intenzivne rasti vinske trte pogosta obdobja toplega vremena z močnimi rosami in visoko zračno vlago. Veliko naših pomembnih vinskih sort je občutljivih na to bolezen, posebej občutljivi so različni burgundci (pinoti), refošk in frankinja. V okviru biološkega testiranja učinkovitosti nekaterih aktivnih snovi proti oidiju smo že v letih 1990-1995 ugotovili pojemajoče delovanje triademafona, predvsem na Koprskem. Medtem ko smo s pripravki na osnovi triadimefona takrat dosegali komaj 24 % učinkovitost, pa so bili drugi triazoli učinkovitejši, dosežena je bila okoli 95 % učinkovitost. Po večletni samostojni rabi so vinogradniki začeli triadimefon opuščati in ga nadomeščati z aktivnimi snovmi (pripravki) iz skupine triazolov, pozneje tudi s stobilurinskimi in nekaterimi drugimi pripravki. Domnevamo, da so močnejši pojavi oidija v posameznih letih posledica pomanjkljive tehnologije zatiranja bolezni ali pojava odpornih soje v glive U. necator. V okviru projekta smo ugotavljali stanje odpornosti glive na izbrane fungicide iz omenjenih dveh skupin. Ugotovili smo, daje bil delež kaljivih spor pri vseh uporabljenih koncentracijah fungicidov nižji od kontrole, med koncentracijami pa ni bilo razlik v kaljivosti. Znotraj preučevanih populacij, torej med ponovitvami, je bila zaznana velika variabilnost, zato na temelju naših laboratorijskih testiranj ne moremo z gotovostjo potrditi obstoj odpornih sojev oidija na preskušana fitofarmacevtska sredstva. Testiranja smo opravili na populacijah iz razmeroma majhnega števila okolij, zato je možno, da nismo zajeli odpornih populacij glive. Z ugotavljanjem odpornosti oidija na fungicide iz skupine triazolov in stobilurinov bomo v prihodnje še nadaljevali in se osredotočili predvsem na vinograde, kjer bolezen oidij vinske trte vinogradniki težko obvladujejo. Pleveli: Pri preveijanju učinkovitosti herbicidov iz skupine triazinov in sulfonil sečnin (ALS inhibitorji) v koruzi oziroma ozimnih žitih v okviru poljskih poskusov nismo ugotovili odpornosti preučevanih plevelov (bela metlika, Chenopodium album in srhkodlakavi ščir, - 18 Kmetijski inštitut Slovenije institut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva Amaranthus retroflexus) na preizkušane herbicide. Odpornosti obravnavanih pievelnih vrst na preučevane herbicide nismo ugotovili niti v okviru lončnih poskusov, ki smo jih opravili v nadzorovanih rastnih razmerah v rastlinjaku. Mnenja smo, da je takšen rezultat, predvsem pri preveijanju odpornosti plevelov na atrazin, najverjetneje posledica prenehanja uporabe čistega atrazina v Sloveniji pred več kot 10 leti ter uvajanja Slovenskega kmetijsko okoljskega programa, ki med drugim temelji na uvajanju ustreznega kolobarja. Sklepamo, daje lahko odpornost bele metlike in srhkodlakavega ščira na atrazin v posameznih primerih sicer v Sloveniji še vedno prisotna, vendar pa ne predstavlja pomembnejšega vzroka za preštevilne zapleveljene njive, na katerih pridelujejo koruzo. Odpornost rastlin na herbicide iz skupine triazinov in fenilureae je posledica mutacije nastale na psbA genu, ki je odgovoren (Hirschberg in Maclntosch, 1983) za tilakoidni membranski protein (Di) v kioroplastni DNA. Polipepetid D1 sodeluje pri transportu elektronov v redukcijskem procesu fotosistema II in nanj se veže herbicid. V odpornih organizmih ne prihaja do vezave herbicida na Di protein. Odpornost na triazinske herbicide je posledica točkovne mutacije psbA gena (SNP) na mestu 270, kjer je gvanin namesto adenina. Mutacija povzroči nastanek novega restrikcijskega mesta značilnega za restrikcijsko endonukleazo BstX 1. Analiza prisotnosti restrikcijskega mesta BstX 1 omogoča ločevanje odpornih in neodpornih rastlin na herbicid. Po izolaciji rastlinske DNA (bela metlika - Chenopodium album; srhkodlakavi ščir Amaranthus retrofexus\ smo v polimerazni verižni reakciji s pomočjo specifičnih začetnih nukleotidov namnožili fragment psbA gena dolžine 963 bp (primer Brassica sp.) in ga v naslednjem koraku razrezali z BstX 1 endonukleazo. Glede na prisotnost ali odsotnost dveh fragmentov dolžine 764bp in 199bp, ki sta značilna za odporne vrste rastlin, smo potrdili ali ovrgli odpornost na herbicid iz skupine triazinov in feniluree. V proučevanih vzorcih rastlin odpornosti na omenjene herbicide nismo zasledili. Odpornost na herbicide, ki so inhibitorji ALS, je prav tako kot odpornost na triazine pogojena s točkovnimi mutacijami. Posledica mutacij je sprememba aminokislinske sestave ALS proteina. Na sliki 9 so prikazana mesta, kjer prihaja do mutacij. -N^i ii iii ^ H O -C \122 vm A205 D376 W574 S653 Slika 9: Linearni prikaz ALS proteina in lokacija aminokislin (A, alanin; D, aspartat; P, prolin; S, serin; W, triptofan) - možna mesta mutacij S pomočjo metod na osnovi polimerazne verižne reakcije je možno te mutacije natančno opredeliti. V PCR reakciji se najprej namnoži DNA odsek, ki vključuje ALS gen. Sledi sekveniranje PCR produkta. McNaughton in sod. (2005) so na ta način odkrili rezistentne alele pri vrsti Amaranthus retroflexus in vrsti Amaranthus powelli Wats. Določili so različne mutacije v ALS genu, ki povzročajo odpornost na herbicid. V okviru preučevanja odpornosti na herbicide, ki so inhibitorji ALS, smo uporabili, sončnice {Helianthus annus). Za namnoževanje odsekov DNK, ki so povezani z odpornostjo, smo v PCR reakciji uporabili tri različne kombinacije začetnih oligonukleotidov: ALS2, ALS3 in ALS5 (McNaughton in Tardif, 2005). Za pozitivno kontrolo smo vzeli vzorce vrste Amaranthus, ker so bili začetni oligonukleotidi dizajnirani za to vrsto. Produkte vzorcev --19 Kmetijski inštitut Slovenije institut za limeljarstvo in pivovarstvo Slovenije CRP V4-0328: Preučevanje odpornosti škodljivih organizmov na nekatera fitofarmacevtska sredstva sončnic, dobljene z različnimi začetnimi oligonukleotidi, smo sekvenirali. Nukleotidna zaporedja namnoženih fragmentov smo primeijali s sekvencami objavljenimi v bazah podatkov in ugotovili, daje največja podobnost dobljenih nukleotidnih zaporedij z genom za encim sintetaza acetohidroksi kisline (AHAS2), kije povezan z odpornostjo na herbicide na osnovi imidazolinona ali sulfoniluree. Glede na dobljene rezultate bi bilo potrebno metodo dodatno optimizirati in vključiti večje število rastlin kot tudi večje število začetnih oligonukleotidov, ki bi bili specifični za določeno rastlinsko vrsto. 4 SKLEPI Ugotovili smo večje število populacij koloradskega hrošča, katere so razvile odpornost na preizkušane aktivne snovi: na organofosfomi insekticid klorpirifos in sintetični piretroid lambda-cihalotrin. Učinkovitost neonikotinskega pripravka confidor (imidakloprid) ni bila prizadeta v nobenem primeru oziroma je bila odlična na vseh preizkušanih lokacijah in pri vseh razvojnih stadijih koloradskega hrošča. Pri preučevanju odpornosti hmeljeve listne uši na v praksi uporabljane insekticidne snovi smo ugotovili pojemajoče delovanje pimetrozina (chess 50 WG). Ugotovili smo tudi, da omenjena uš sicer še ni odporna na imidakloprid, da pa se v nekaterih hmeljiščih že kažejo znamenja pojemanja njegove biološke učinkovitosti. Rezultati testiranj fungicidnega delovanja iprodiona (kidan), ciprodinila (chorus 75 WO) in fenheksamida (teldor WP 50) na glivi M fructigena in M. laxa kažejo, da sta priporočeni kot tudi polovični odmerek fungicida teldor povsem zavrla rast preizkušenih izolatov gliv. Tudi pri fiingicidu kidan je bila učinkovitost še sorazmerno dobra, razen pri enem izolatu vrste M laxa. Nasprotno pa lahko na temelju naših testiranj v primeru fungicida chorus že lahko govorimo o odpornosti preučevanih gliv na to sredstvo. Pri preverjanju učinkovitosti herbicidov iz skupine triazinov in sulfonil sečnin (ALS inhibitorji) v koruzi oziroma ozimnih žitih nismo ugotovili odpornosti preučevanih plevelov (bela metlika, Chenopodium album in srhkodlakavi ščir, Amaranthus retroflexus) na preizkušane herbicide. Odpornosti na obravnavane herbicide nismo zasledili niti s pomočjo polimerazne verižne reakcije. Na splošno lahko v prihodnje pričakujemo porast problemov zaradi odpornosti na fitofarmacevtska sredstva. Izbira pripravkov je namreč vse manjša. Mnoga uveljavljena sredstva so bila v zadnjih letih že izločena iz uporabe, s predlagano revizijo evropske direktive 91/414 pa utegne podobna usoda doleteti še cele skupine fitofarmacevtskih sredstev. Tako ne bo na voljo dovolj pripravkov z različnimi mehanizmi delovanja. Posledično lahko pričakujemo hitrejši razvoj odpornosti, kot odgovor na slabšo učinkovitost pa višje uporabljene odmerke ali nelegalno rabo fitofarmacevtskih pripravkov. Kmetijski inštitut Slovenije Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije 20