Imobilizacija tripsina na površino membrane iz celuloznega acetata
Immobilization of Trypsin on the Surface of Cellulosic Acetate Membranes
A. Bezjak, Č. Stropnik, Tehniška fakulteta, Oddelek za kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru.
Poznana je vrsta metod imobilizacije encimov na trdne nosilce. Opisana metoda temelji na kovalentni vezavi tripsina na površino porozne membrane iz celuloznega acetata. Izvedena je korelacija med pretočnim lastnostmi in debelino membran brez mobiliziranega encima in membran, na katere smo imobilizirali encim. Količino vezanega encima kot beljakovine smo določili z Lowry-jevo metodo, z uporabo Anson-ove metode pa smo poskušali določiti aktivnost mobiliziranega encima.
Ključne besede: membrana, aktivacija, imobilizacija, aktivnost encima
Many methods of the enzyme immobilization have been reported. In this paper described method is based on the formation of covalent linkage between the trypsin and the surface of cellulosic acetate porous membrane. Corelation between the flux properties and thickness of the membranes before and after immobilization of the trypsin was made. For determination of the quantity of the immobilized trypsin Lowry procedure was used; we tried to determine the activity of the immobi-lized trypsin by using the Anson procedure.
Key words: membrane, activation, immobilization, activity of the trypsin
1	Uvod
Imobilizacija je lokalizacija molekul encima v času kon-tinuimega procesa katalize1-2. Uporaba imobiliziranih encimov kaže vrsto prednosti pred uporabo v vodi topnih encimov:
1)	lahko j lh brez ponovnega čiščen ja večkrat uporabimo
2)	ne onesnažujejo produktov bioreakcij
3)	kažejo večjo obstojnost v širšem območju temperature in pH
4)	običajno so manj občutljivi na delovanje aktivatorjev in inhibitorjev.
Poznamo veliko različnih metod imobilizacije encimov, ki jih v splošnem klasificiramo na fizikalne in kemijske.
2	Eksperimentalni del
Pripravili smo homogeno raztopino iz 14,8 gceluloznega acetata (CA) (Aldrich-Chemie, deklarirana vsebnost acetilnih skupmje 39,8%) v 63,0 g acetona (Fluka), po osmih urah mešanja pa smo dodali raztopino 2,3 g Mg(C104)2 (Kemika) v 19,9 ml vode. Membrano smo izdelali s procesom fazne inverzije.
Membrani iz CA smo izmerili pretok deiomzirane vode in debelino: Jv= 28,9 l/m2 h, d = 78,8 um.
fako pripravljeno membrano smo na površini hidrolizirali z uporabo NaOH različnih koncentracij (0,1; 0,5 in 1,0 mol/l).
H,C	I	H,C
C-0 + 0H H3C-C-OH	)c-0 (-Cel.O —»Cel.OH + CH3C00
Cel.O'	iCe, HO
Shema 1: Bazično katalizirana hidroliza celuloznega acetata Scheme 1: Basic catalysed hydrolysis of cellulose acetate.
Hidroliza membrane je povzročila povečanje pretokov de-ionizirane vode in tanj šanje debeline membrane, kar potrjuje, da NaOH delno raztaplja membrano.
Za aktivacijo površinsko hidrolizirane membrane iz CA smo uporabili TCT2-3 (1,3,5-triklortriazin, Merck), kije pogosto uporabljen reagent. Na hidrolizirano membrano smo nalili nasičeno raztopino fCT v benzenu, ki onemogoča hidrolizo TCT. Pri tej nukleofilni aromatski substituciji je potekla zamenjava enega klorovega atoma triazinskega obroča s hidroksilno skupmo na celulozi. Reakcija aktivacije membrane je potekala 1 mm, nato smo (po spiranju z benzenom) imobilizirali tripsin (Difco): 20 ml vodne raz-
Jv (l/ir^h)
debelina (um)
--------- r , *
debelina (km)
tr	'--
80 o(NaOH>-0.1 mol/
* pretok! 40 ~ K 0»belina
10 20 30 40 60 60 70
tas hidrolize v min
c<N«OHM>.1 mol/l -*- po M ar oi lil -+- po Irooblllupclll
10 20 30 40 60 60 cas hidrolize v min
Slika J: Odvisnost pretokov deionizirane vode in debelin membrane od časa hidrolize, C(NaOH)= 0.1 mol/l. Figure 1: The deionised water f!uxes and thicknesses of the membrane as a function of hydrolysis tirne. C(Na()lI)= 0,1 mol/I.
Slika 2: Primerjava debeline membran po hidrolizi in po imobilizaciji.
Figure 2: Comparison of the membranes thickness after the hydrolysis and after the immobilization.
topine tripsina (2,5 g/100 ml) smo nalili na membrano. Reakcija je potekala 10 min, nato smo membrano spirali z deionizirano vodo. Na shemi 2 predstavlja E-NH2 tripsin z aktivno amino skupino na proteinskem delu encima (E), preko katere lahko poteka imobilizacija.
Cel-OH + Cl /N ci
t y ■
CI
Cel.-O
E-NH?
HCI
1 ^11 v. u
rt
ci
Cel-0
lf Y
NH-E
Shema 2: Reakcija aktivacije membrane in imobilizacije tripsina.
Scheme 2: Activation of the membrane surface and trypsin immobilization.
% vezave encima
cinaoh) -* % vej
O »20 30 40 60 60 70
cas hidrolize v min
Imobilizacija encima povzroči povečanje debeline membrane.
Določitev količine vezanega encima kot beljakovine: Uporabili smo Lowiy-jevo metodo 4-5, po kateri količino protema določimo spektrofotometrično. Metoda temelji na določanju količine aminokislin, saj dajeta L-triptofan in L-tirozin s Folin-Ciocalteu-ovim fenolnim reagentom (Kemika) modro obarvane komplekse. Absorbanco smo merili na aparatu Specol 10 pri 600 nm. Količino vezanega encima kot beljakovine smo v odvisnosti od časa hidrolize določili iz umeritvene krivulje.
Določitev aktivnosti imobiliziranega tripsina: Za določitev aktivnosti imobiliziranega tripsina smo uporabili Anson-ovo metodo6-7. Tr ips in ra zgraj uj e ka zein (Merck) na produkte, ki so topni v triklorocetni kislini in absorbirajo svetlobo pri 280 nm. Umeritveno krivuljo smo pripravili tako, da je reakcija med kazeinom (1 g kazeina/100 ml fosfatnega pufra, pH=7,6) in vodno raztopino tripsina
Slika 3: Odstotek vezanega encima kot beljakovine v odvisnosti od časa hidrolize. Figure 3: Per cent of immobilized protein as a function of hydrolysis time.
(različne koncentracije) potekala 20 minut pri temperaturi 35°C in smo jo prekinili z dodatkom triklorocetne kisline S centrifugiranjem smo odstranili nerazgrajen kazein, raztopini pa izmerili absorbanco pri 280 nm; ker so bile vrednosti absorbance za slepi vzorec višje kot za vzorec, smo posneli UV-VIS spekter.
Poskušali smo določiti aktivnost imobiliziranega encima. Pri reakciji med kazeinom m na površino CA membrane imobiliziranim tripsinom, ki smo jo vodili 20 min, so imele izmerjene vrednosti absorbance nižjo vrednost od slepega vzorca. S podaljšanjem časa reakcije na 130 min so se izmerjene vrednosti absorbance povišale,
»l«pl v20r»0 vzorec
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 12 14 16
konc. tripsina v mg/ml
o(N«OH)-tO mol/l
Inkubaoll« 20 mlfi -t- InkubacIJa 130 raln
40	60
caa hldrollze v sek.
Slika 4: Umeritvena krivulja za določitev aktivnosti tripsina, imobiliziranega na površino membrane. Figure 4: The calibration curve for determination the activity of on the membrane surface immobilized trvpsin.
Slika 6: Vpliv podaljšanja časa inkubacije. F'igure 6: Influence ofthe incubating time extension.
30000 ABS
200.0
400.0
500,0
Slika 5: UV-VIS spekter v triklorocetni kislini topnih produktov
reakcije med kazeinom in tripsinom. Figure 5: UV-VIS spectra in trichloracetic acid soluble products of reaction between casein and trypsin.
liziranega encima nismo mogli določiti, zato predpostavljamo, da opisana metoda za naš primer ni dovolj občutij iva.
4 Literatura
' O.Zaborsky: Immobilized Enzymes, CRT Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1973)
2	R. A.Messing: Immobilized Enzymes for Industrial Reac-tors, Academic Press, New York (1975)
3	G.Kay, E.M.Crook: Coupling of enzymes to cellulose using cloro-S-triazines, Nature, 216 (1967) 524
4	O Folin, V.Ciocalteu: On Tyrosine and Tryptophane de-terminations in proteins, J.Biol.Chem., 73 (1927) 627
5	O.H.Lowry, N.J.Rosebrough, A.L.Farr, R.J.Randall: Pro-tein measurment vvith the Folin phenol reagent, J.Biol.Chem. 193 (1951) 265
6	M.L.Anson: Theestimationofpepsin,trypsin,papainand cathepsin vvith hemoglobin, J.Gen.Physiol. 22 (1939) 79,
7	Bergmeyer H.U., Gavvelm K.: Methoden der enzyma-tischen Analyse, VerlagChemie Weinhein, (1975) 1056.
vendar še vedno niso bile primerne za izračun proteolitske aktivnosti encima. Po spiranju z 0,9% raztopino NaCl so bile izmerjene vrednosti absorbance še nižje.
3 Zaključki
Ugotovili smo, da je proces imobilizacije v stopnji hid-rolize povzročil tanjšanje membrane in s tem zmanjšanje njene mehanske odpornosti, kar omejuje uporabnost membrane. Glede na določitev količine vezanega encima kot beljakovine smo ugotovili, da je optimalni čas hidrolize pri uporabi 0,1 M NaOH 30 do 45 mm, 0,5 M NaOH 3 mm m pri 1,0 M NaOH 1,5 min. Iz UV-VIS spektra (slika 5) je razvidno, da je razlika v absorbanci pri 280 nm (ki je v sredini med vrednostjo nič in maksimalno vrednost pri 250 nm) med slepim vzorcem in vzorcem zelo majhna. Ta razlika popolnoma izgme pri 250 nm. Aktivnosti imobi-