Hladnikia 13: 177-181 (2001)
177
Kartiranje tipov ektomikorize po anatomski metodi in s primerjavo s PCR-RFLP vzorci eksikatov gliv iz mikoteke GIS
Mapping of types of ectomycorrhizac by anatomical method and by comparisons of the PCR-RFLP database of exicates of fungal fruitbodies from the Herbarium and Mycotheca of the Slovenian Forestry Institute
Tine Grebenc1, Hojka Kraigher2
j Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana, tinegrebenc@hotmail.com Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana, hojka.kraigher@gozdis.si
Izvleček: Micelij mikoriznili gliv v tleh predstavlja pomembno povezovalno mrežo za prenos vode in hrami ter vpliva na pestrost ostalih živih komponent v ekosistemih. Tlpi ektomikorize se med seho] ločijo po morfoloških, fizioloških in ekoloških značilnostih, prav tako tudi njihov pomen za simbiontske rastline ,n delovanje ekosistema. Kartiranje tipov ektomikorize poteka s klasično morfološko-anatom-sko metodo, katc o dopolnjujemo z analizo polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov specifično pomnožene regije rDNK. Metoda je uporabna tudi kot pomoč pri taksonomskem in filogenetskem razvrščanju gliv - kot primer je naveden rod Hydnum.
Abstract: Mycorrhizal mycelium is the main network in forest soils for translocation of water and nutrients, influencing largely the diversity of all other biotic components in ecosystem. Types of octomy-corrhizae can be distinguished by their morphological, physiological and ecological characteristics and equally so by their impacts on symbiotic plants and ecosystem functioning. Mapping of types of ecio-mycorrhizae is done by classical morpho-anatomical method and complemented bv the analysis of restriction length polymorphism of specifically amplified rDNA. The method can be applied in taxonom-ical and pliylogenetic studies of fungi, as presented on the genus Hydnum.
1. Uvod
Micelij mikoriznih gliv v tleh predstavlja pomembno povezovalno mrežo za prenos vode in hranil ter vpliva na pestrost ostalih živih komponent v ekosistemih (Read 1998). Ključne za pojavljanje in ohranjanje posameznih tipov ektomikorize pri izbranem rastlinskem partnerju so morfološke, fiziološke in ekološke značilnosti glive, ki se med posameznimi vrstami in sevi lahko razlikujejo (Kraigher 1996). Poznavanje vrstne sestave populacije mikoriznih gliv nam olajšuje razumevanje delovanja ekosistema (Kraigher , Batič, Agerer 1996), kot tudi sledenje spremembam, sukcesijam, ki se v preučevanem sistemu dogajajo. Pojavljanje trosnjakov mikoriznih gliv je odvisno
od cele vrste klimatskih in drugih dejavnikov, njihovo pojavljanje tudi ne ustreza pojavljanju mikoriznih korenin in micelija v tleh (ibid.), zato je kartiranje tipov ektomikorize bolj informativno.
Za določevanje glive v ektomikorizi je najbolj razširjena anatomska metoda (Agerer 1987-1999). Vedno bolj se uveljavljajo tudi molekularne metode, predvsem PCR-1TS-RFLP (verižna reakcija s polimerazo, v kombinaciji z analizo polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov notranjega tran-skripcijskega presledka) (Gardes & Bruns 1993, Kraigher, Agerer, Javornik 1996). S to metodo ugotavljamo vrsto glive v ek-tomikorizi s primerjavo restrikcijskih vzorcev izbrane regije DNK mikorize ter ustreznega trosnjaka. Ta metoda seje pokaza-
178
T. Grebenc & H. Kraiger: Kartiranje tipov ektomikorize po anatomski metodi..
la kot hitrejša pri večjem številu vzorcev, ne more pa nadomestiti klasičnih postopkov, kar obravnavamo v nadaljevanju.
2. Material in metode
Vzorci trosnjakov ektomikoriznih giiv in tipov ektomikorize so bih nabrani na raziskovalnih ploskvah Gozdarskega Inštituta Slovenije (GIS) na Pokljuki in Pohorju, dodatni vzorci za rod Hydnum pa tudi na nekaterih drugih lokacijah po Sloveniji, Italiji in na Bavarskem, saj se znotraj vrst tega rodu pojavlja precejšnja variabilnost ITS regije v ri-bosomalni DNK (Agrrer, Kraigher, Ja-vornik 1996). Tipe ektomikorize smo določili in opisali po anatomski metodi (Ager-er 1987-1999) na volumetrično odvzetih vzorcih tal (274 ml, 0-18 cm globoko), v katerih smo analizirali vse korenine oziroma mikorizne korenine in dodatno na vzorcih tal, odvzetih neposredno pod trosnjaki gliv, katerih mikonza še ni bila opisana (podrobnejši opis metode je prikazan v Kraigher 1996). Vsi vzorci so herbarizirani in shranjeni v Herbariju in mikoteki GIS, vzorci iz tujine pa v Herbariju Inštituta za sistematsko botaniko LMU v Miinchnu.
PCR-ITS-RFLP metodo (Gardes & Bruns 1993, Kraigher, Agerer, Javornik 1996), ki obsega ekstrakcijo DNK, pomnožitev ITS regije z začetnimi oligonuk-leotidi, specifičnimi za zaprtotrosnice ali prostotrosnice, encimsko cepljenje produkta pomnoževanja in ločevanje fragmentov z elek-troforezo, smo uporabili za analize vzorcev trosnjakov in shranjenih ektomikoriznih korenin. Elektroferograme smo analizirali z računalniškim programom Taxotron® (Gri-mont 1998). V primerih, ko ta metoda ni dovolj informativna ali če želimo podrobneje študirati filogenetske odnose, je potrebno sek-venciranje celotne ali dela ITS regije, mito-hondrijske DNK idr. (Bruns, White, Taylor 1991, Martin, Diez, Manjon 1999).
3. Rezultati in diskusija
V Sloveniji smo do leta 1999 na ca 100.000 mikoriznih koreninah opisali nekaj več kot 60 tipov ektomikorize (Kraigher 1999), od teh smo lahko do vrste določili ali podrobno opisali 30 tipov, pri nekaj tipih smo lahko določili le skupino ali rod, 20 tipov ektomikorize je potrebno še podrobno karakterizirati. Zaradi velike pestrosti tipov ektomikorize ter njihovega pomena za uspe-vanje simbiontskih rastlinje natančna identifikacija vrste glive v simbiozi pomembna, anatomsko - morfološka metoda identifikacije in karakterizacije pa je izjemno zamudna. Zato od leta 1993 dalje to metodo dopolnjujemo z molekularno metodo identifikacije tipov ektomikorize, od leta 1999 dalje pa tudi s primerjavo z bazo podatkov PCR-ITS-RFLP vzorcev, pridobljenih iz trosnjakov gliv iz istih raziskovalnih ploskev.
Doslej smo DNK ekstrahirali iz več kot dvesto herbariziranih trosnjakov (Grebenc, Kraigher 2000). Pri 199 primerkih je bila verižna reakcija s polimerazo uspešna, produkte pomnoževanja smo nato cepili s tremi restrikcijskimi encimi - flinfi, Taq\ in M bol. Kombinacija restriksijskih vzorcev vseh treh encimov je shranjena v bazi podatkov, ki omogoča stalno dopolnjevanje z novimi znanimi vzorci trosnjakov ali ektomikoriz. kot tudi primerjavo s še ne določenimi oziroma neznanimi tipi ektomikorize. Z izbranimi restrikcijskimi encimi lahko vzorce gliv razlikujemo na nivoju vrst. V nekaterih primerih se dolžine fragmentov razlikujejo tudi med tipom in varieteto znotraj posamezne vrste (Grebenc, Piltaver, Kraigher 2000). Pri primerjavi restrikcijskih vzorcev in pri izdelavi dendrograma smo upoštevali napako metodologije ter odstopanja v dolžini ITS regije znotraj iste vrste (KAren & al. 1997), na primer pri Hydnum spp. nabranih na različnih lokacijah.
Rod Hydnum je po Friesovem konceptu (Ainsworth, Sparrow, Sussman 1973) ob-
Hladnikia 13: 177-181 (2001)
179
segal vse vrste z navzdol usmerjenimi bodicami, tudi vrste, ki danes spadajo v povsem druge družine (tipska vrsta Hydnum imbricatum L. ex Fr.). S.F. Gray (1821) je razdelil Friesov rod Hydnum na šest novih, v rod Hydnum pa je uvrstil le Hydnum imbricatum (danes Sarcodon imbricatus (L.:Fr.) Karst). Leta 1878 je Quelet H. imbricatum uporabil kot tip za rod Sarcodon, zato se še danes lahko obe rodovni imeni pojavita kot sinonima. Po zapisih Zveze gobarskih družin v Sloveniji (Poler 1998) se pri nas pojavljajo vrste oz. oblike H. al-bidum Peck., H. repandum (L.) Fr, H. repandum fo. amarum Vrščaj, H rufescens Schff.: Fr. in H umbilicatum Peck. Makroskopski in mikroskopski znaki za delitev teh vrst niso prepričljivi, saj Moser (Julich 1984) loči samo tri vrste, nekateri drugi av-
torji pa le H. repandum var repandum L.:Fr. m H. repandum var rufescens (Fr.) Barla. (Bon 1987). Predvsem je vprašljiva vrsta H. umbilicatum, katere Moser ne pozna in naj bi se pojavljala predvsem v Severni Ameriki
(www.mykoweb.com/CAF/species/Hyd-num_umbilicatum.html).
Zato smo pri določanju tipov ektomiko-rize od prvega podrobnega opisa dalje (Agerer, Kraigher, Javornik 1996) primerjali tudi PCR-ITS-RFLP vzorce. Pri slednjih smo opisali polimorfizem ITS regije znotraj vrste ter s tem opozorili na možnost napak pri identifikaciji tipov ek-tomikorize zgolj z molekularno metodo, torej sklepanje na večjo pestrost od dejanske ali na napačno identifikacijo tipa ektomiko-rize zgolj z molekularno metodo. Na primeru tipov ektomikorize vrst H. repan-
sl. 1: Vzorčenje ektomikorize in trosnjakov rodu Hydnum (ježki) v Sloveniji za sestavo baze podatkov PCR-ITS-RFLP vzorcev. Na posamezni lokaciji je bilo nabranih več trosnjakov predvidoma iste vrste ježkov, število vzorcev je vpis ano v legendi.
Fig.l: Locations of sampling of ectomycorrhizae and fruitbodtes from genus Hydnum in Slovenia. Samples were used for build up of the PCR-ITS-RFLP database. More than one sample of fniitbodies from the same species of Hydnum were collected on marked locations.
180
T. Grebenc & H. Kraigek: Kartiranje tipov eklomikorize po anatomski metodi.
0.2« Û M0.it 0.12 0.08 D tU
SOObp Il I I
2	K59-H.repandum L.: Fr. || 1 H33-Hrâpandum L.: Fr. ||
3	H3Z-H.repandum L.: Fr. || ♦ Hyi-H.repandimt L.: Fr. ||
7 H26-Hnjfescens SchiT.: Fr. * | | s H47-Rrnfisctns SrhfF.: Fr. * | | i H4Z-H.rußscans SchfT.. Fr. * | | S> H29-H.rufiscm$ SchfT.: Fr. || 6 H69-H.rufiscens SchfT.; Fr. ||
tOObp
soobp 2oobr
II 1 I
HEß
Mbol
Tiql
S1.2: Dendrogram za izbrane vzorce trosnjakov iz rodu Hydnum s pripadajočimi restrikcijskimi vzorci za encime Hm-fi, Mbvl in Taql.
Fig. 2: Dendrograme for selected samples of sporocarps belonging lo genus Hydnum with corresponding resiriction patterns for H'mfl, Mbol and Taql endotiuclease.
dum in H. rufescensuporaba molekularnih metod edini način za ločevanje, saj se tipa samo po anatomskih lastnostih med sabo ne ločita (Agerer, Kraigher, Javornik 1996).
Za razjasnitev stanja pri rodu Hydnum smo začeli z vzorčenjem trosnjakov na več raziskovalnih ploskvah in drugih lokacijah po Sloveniji (Slika 1). Trenutni rezultati molekularnih analiz kažejo, da je vrsta H. repandum homogena, znotraj makroskopsko in mikroskopsko določene vrste H, rufescens pa se pojavljata dva različna re-strikcijska vzorca (Slika 2), od katerih bi vzorci, označeni z zvezdico (*), lahko pripadali vrsti (oziroma drugi taksonomski (pod)enoti) H. umbilicatum, saj so trosnjaki nekoliko manjši od ostalih vzorcev vrste H. rufescens (rezultati meritev niso prikazani).
Sklepamo lahko, daje molekularna metoda identifikacija in karakterizacije tipov ektomikorize s PCR-ITS-RFLP vzorcem
pomemben pripomoček pri določanju tipov ektomikorize, vendar je pri njej potrebno upoštevati polimorfizem ITS regije znotraj vrste, torej je potrebno zasnovati bazo podatkov na vzorcih trosnjakov in tipov ektomikorize iz istih lokacij. Pridobljeni podatki lahko prispevajo tudi k razjasnitvi tak-sonomskega položaja vrst, kot prikazujemo na primeru rodu Hydnum.
Zahvala
Raziskavo sta financirala Ministrstvo za znanost, šolstvo in šport in Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano RS v okviru projekta št. L4-1254 in programa P0-0501-0404-01. Andreju Piltaverju se zahvaljujeva za determinacijo večine trosnjakov mikoriznih gliv v Mikoteki in herbariju GIS, izvedenih v okviru predhodnih projektov.
4. Viri
Agerer, R. (Ed.) 1987-1999: Colour atlas of ectomycorThizae, 1. - 11. izdaja. Einhorn Schwabisch Gmund. Ac.rrer, R., Kraigher, H„ Javornik, B. 1996: Identification of ectomycorrhizae of Hydnum rufescens on Norway spruce and the variability of the ITS region of H. rufescens and H. repandum (Basid-iomycetes). Nova Hedwigia 63 (1-2): 183-194.
Hladnikia 13: 177-181 (2001)
181
Ainswoxth, G. C., Sparrow, F. K., Sussman, A.S. 1973: The fungi, an advanced treatise. Academic Press New York and London.
Bruns, T. D.. White, T. J., Taylor, J. W. 1991: Funga! molecular systematics. Annu. Rev. Ecol. Syst 22: 525-564.
Bon, M. 1987: Mushrooms and toadstools of Britain and north-western Europe. Hooder & Stoughton, London. 361pp.
Gardes, H. & Bruns, T. D. 1993: ITS primers with enhanced specificity for basidiomycctes - application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol Ecol 2: 113-118.
Grebenc, T. & Kraigher, H. 2000: Postavitev baze podatkov PCR ITS-RFLP za mikorizne glive in tipe ektomikorize na smreki iz trajne raziskovalne ploskve GIS na Pokljuki. In: H. Kraigher & I. Smolcj (eds.): Rizosfera. Strokovna in znanstvena dela 118, Gozdarski inštitut Slovenije, Ljubljana pp 179-190.
Grebenc, T., Piltaver, A., Kraigher, H. 2000: Establishment of a PCR-RFLP library for basid-iomycetes, ascomycetes and their ectomycorrhizae on Picea abies (L.) Karst. Phyton (Austria) 40 (4): 79-82.
Grimont, P. A. D. 1998: Taxotron user's manual. Institute Pasteur, Paris. 180 pp.
JÜLICH, W. 1984: Die Nichtblätterpilze, Gallertpilze und Bauchpilze, Aphyllophorales, Heterobasid-iomycetes, Gastromycetes. Band ÜB/1 - Basidiomyceten - 1. Tail, Gustav Fisher Ferlag - Stuttgart, New York.
KAren, O., HöGBERG, N., Dahlberg, A., Jonsson, L., Nylund, J-E- 1997: Inter-and intraspecific variation in the ITS region of rDNA of ectomycorrhizal fungi in Fennoscandia as detected by endonu-clease analysis. New Phytol. 136: 313-325.
Kraigher, H. 1999: Diversity of types of ectomycorrhize on Norway spruce in Slovenia. Phyton (Austria), 39 (3): 199-202.
Kraigher, H. 1996: Tipi mikorize - taksonomija, pomen in aplikacije. Zbornik gozd. in les. 49: 33-66.
Kraigher, H., Agerer, R., Javornik, B. 1996: Ectomycorrhizae of Lactariux lignyoiu.% on Norway spruce, characterised by anatomical and molecular tools. Mycorrhiza 5: 175-180.
Kraigher, H„ BatiC, F., Agerer, R. 1996: Types of ectomycorrhizae and mycobioindication uf forest site pollution. Phyton (Austria) 36 (3): 115-120.
Martin, M. P., Diez, J., Manjon, j. L. 1999: Molecular ecology of ectomycorrhizae. In: COSTE6 EUROSILVA workshop: Root - soil interactions in trees. Gozd Martuljek, September 1999, Abstracts, p. 13, GIS, Ljubljana.
Poler, A. (Ed.), 1998: Seznam gliv Slovenije. Zveza gobarskih društev Slovenije, Ljubljana.
Read, D. J. 1998: Plants on the web. Nature 386: 22-23.
Domača stran namedmrežju: www.mykoweb.com/CAF/species/Hydnum_umbilicatum.html