MOLEKULSKI MARKERJI V DIAGNOSTIKI IN GENETSKIH ANALIZAH
FITOPATOGENIH GLIV
Sebastjan RADIŠEK1, Branka JAVORNIK2
UDK / UDC 631.523.55:631.524.86:631.466 (045) pregledni znanstveni članek / review article prispelo / received: 15.09.2009 sprejeto / accepted: 07.12.2009
IZVLEČEK
Molekulski markerji so z razvojem hibridizacijskih tehnik in polimerazne verižne reakcije (PCR) postali osnovno orodje v diagnostiki in genetskih analizah različnih organizmov. Uporabnost molekulskih markerjev je podana s predstavitvijo AFLP (amplified fragment length polymorphism) markerske tehnike, ki v zadnjem desetletju predstavlja najpogostejšo tehniko za vrednotenje genetske variabilnosti fitopatogenih gliv, ter SCAR (sequence characterized amplified region) markerjev, ki so namenjeni predvsem diagnostičnim analizam. Prispevek je usmerjen tudi podrobnejši predstavitvi molekulskih analiz gliv Verticillium albo-atrum in V. dahliae, ki so omogočile razjasnitev odnosov med izolati iz različnih gostiteljskih rastlin, ter razvoj novih diagnostičnih analiz.
Ključne besede: AFLP, SCAR, Verticillium spp.
MOLECULAR MARKERS IN DIAGNOSTICS AND GENETIC ANALYSIS OF
PHYTOPATHOGENIC FUNGI
ABSTRACT
With the development of hybridisation techniques and polymerase chain reaction (PCR), molecular markers became primary tool in diagnostics and genetic analysis of different organisms. The usefulness of molecular markers is presented through the novel molecular technique AFLP (amplified fragment length polymorphism), which is the most frequently used technique for assessing the genetic variability of phytopathogenic fungi in the last decade, and SCAR (sequence characterized amplified region) markers, which are used in diagnostics analysis. The manuscript also presents a detailed review of the molecular analysis of Verticillium albo-atrum and V. dahliae, which has managed to clarify the relationships among different isolates and to develop new diagnostic analysis.
Key words: AFLP, SCAR, Verticillium spp.
T
Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Oddelek za varstvo rastlin, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko, in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana
1 UVOD
Molekulski markerji so z razvojem hibridizacijskih tehnik in in vitro namnoževanja DNA v polimerazni verižni reakciji (PCR) postali osnovna tehnika v diagnostiki in proučevanju variabilnosti organizmov. Veliko taksonomskih in filogenetskih študij pri glivah je bilo usmerjenih predvsem v analizo specifičnih lokusov ali posameznih delov genoma. Tako pomemben delež raziskav predstavljajo analize ribosomske DNA (rDNA), saj ta kompleks genov vsebuje variabilne in ohranjene regije, prav tako pa je prisoten v več ponovitvah in zato lahko določljiv. Kodirajoča 18S podenota ribosomskih genov spada med evolucijsko ohranjene regije, ki se je pri glivah predvsem proučevala pri iskanju razlik med različnimi rodovi, medtem ko so se pri analizi razlik med vrstami analizirale ITS1 in IGS2 regije, ki so lahko zelo variabilne v DNA zaporedju [2]. Pri ločevanju posameznih vrst je bilo veliko raziskav usmerjenih tudi v analizo mitohondrijske DNA, za katero je znano, da ima višjo evolucijsko stopnjo v primerjavi z jedrno DNA [4]. Naslednje specifično tarčno mesto proučevanja predstavljajo ponovljiva DNA zaporedja, kot so mikrosateliti, za katere je značilna visoka stopnja mutacij in so primerni za vrednotenje genetske variabilnosti. Tako so bili različni oligonukleotidi z mikrosatelitno ali minisatelitno ponovitvijo uporabljeni kot multilokusne RFLP sonde pri proučevanju več kot 70 vrst gliv iz taksonomskih razredov Ascomycetes, Zygomycetes in Deuteromycetes [37]. Pomembno je omeniti tudi raziskave iskanja variabilnosti med glivami s ponovljivimi DNA zaporedji pridobljenimi iz bakteriofaga M13 bakterije Esherichia coli in ponovljivimi zaporedji REP3 in ERIC4, ki predstavljata znaten delež nekodirajoče DNA pri bakterijah [33].
V zadnjem desetletju pri identifikaciji in vrednotenju variabilnosti gliv ter ostalih organizmov prevladujejo predvsem RAPD in AFLP markerji, katerih osnovo predstavlja polimerazna verižna reakcija (PCR) in katerih vrednost se izraža v hkratni analizi več lokusov v posamezni reakciji. RAPD tehnika temelji na uporabi enega samega začetnega oligonukleotida s poljubnim za proučevan organizem nespecifičnim zaporedjem, ki ob prileganju na bližnja nasproti si orientirana mesta na DNA molekulah sproži namnoževanje v PCR reakciji. RAPD markerji so izkazali primernost predvsem pri vrednotenju genetske variabilnosti med ozko sorodnimi organizmi, lahko pa jih uporabimo tudi pri taksonomskih in filogenetskih študijah [8]. AFLP predstavlja novejšo molekulsko tehniko in je podrobneje predstavljena v naslednjem poglavju.
2	AFLP MARKERJI PRI ANALIZAH FITOPATOGENIH GLIV
A^LP tehniko so razvili in patentirali leta 1993 ter dve leti kasneje tudi objavili [36]. Metoda temelji na selektivnem PCR namnoževanju restrikcijskih fragmentov, ki so produkt razreza genomske DNA z restrikcij skimi endonukleazami. Stopnja variabilnosti med organizmi je določena z odkrivanjem razlik v prepoznavnih mestih restrikcijskih encimov, ki nastajajo s spremembami v zaporedju nukleotidov. AFLP tehnika tako združuje lastnosti hibridizacijskih tehnik kot je RFLP in možnosti in vitro namnoževanja DNA v PCR reakciji. Prednost AFLP tehnike se izraža v občutljivosti odkrivanja polimorfizma in analizah organizmov ne glede na njihov izvor, kompleksnost ali velikost genoma. AFLP zajame celoten genom organizma in omogoča hkratno analizo večih lokusov v eni analizi. Prav tako omogoča povečanje števila
1	angl. Internal Transcribed Spacer
2	angl. Intergenic Spacer
3	angl. Repetitive extragenic palindromic sequence
4	angl. Enterobacterial repetative intergenic consensus
proučevanih lokusov, saj lahko v analizi spreminjamo restrikcijske encime in povečujemo število kombinacij začetnih oligonukleotidov [36].
Možnost odkrivanja genetske variabilnosti med ozko sorodnimi organizmi, ki jo ponuja AFLP analiza se pri proučevanju fitopatogenih gliv uporablja predvsem pri identifikaciji različno virulentnih izolatov ali patotipov ter populacijskih študijah izolatov določene vrste. Majer in sod. [19] so prvi uporabili AFLP tehniko pri proučevanju gliv, ki povzročajo rastlinske bolezni. V analizi so proučevali izolate glive Cladosporium fulvum in Pyrenopeziza brassicae iz različnih geografskih območij. Pri tem so identificirali visok nivo polimorfizma med izolati obeh gliv, vendar ne poročajo o povezavah polimorfizma z virulenco ali izvorom izolatov. AFLP analiza se je izkazala za zelo učinkovito pri proučevanju sorodnosti izolatov glive Cercospora zeae-maydis iz Združenih držav Amerike in Afrike. Omenjena gliva parazitira koruzo in je že več desetletij razširjena v ZDA, kjer se pojavlja v obliki patotipa I in II, v Afriki pa se je prvič pojavila leta 1988. Z AFLP so primerjali izolate iz obeh kontinentov in v analizi uporabili restrikcij ska encima EcoRI in MseI ter radioaktivno vizualizacijo namnoženih produktov. Ugotovili so razlike med obema patotipoma iz ZDA in visok nivo sorodnosti afriških izolatov s patotipom II [10].
V zadnjih letih se je število raziskav fitopatogenih gliv z AFLP markerji precej povečalo in po zadnjih podatkih (Web of Science®) dosega število več kot 150 znanstvenih člankov v revijah s faktorjem vpliva SCI (Science Citation Index). Kot pregled uporabnosti v preglednici 1 navajamo nekaj vzorčnih primerov prvih raziskav fitopatogenih gliv z AFLP markerji.
Preglednica 1: Pregled nekaterih prvih raziskav fitopatogenih gliv z AFLP markerji Table 1: Review of some of the first AFLP analysis of phytopathogenic fungi
Gliva	Namen analize	Restrikcijski encimi	Vir
Cochliobolus sativus	Določanje razlik med različno virulentnimi izolati	EcoRi/MseI	[39]
Colletotrichum	Določanje razlik med različno virulentnimi izolati	EcoRI/MseI	[11]
lindemuthianum			
Diaporthe/Phomosis	Določanje razlik med izolati iz različnih	EcoRI/MseI	[32]
helianthi	geografskih območij		
Eutypa lata	Določanje razlik med izolati iz različnih	EcoRI/MseI	[9]
Eutypa armeniaceae	geografskih območij		
Fusarium oxysporum	Določanje razlik med različnimi specializiranimi EcoRI/MspI		[1]
	formami (formae specialis)		
Macrophomina phaseolina	Določanje razlik med izolati iz različnih geografskih območij	EcoRI/MseI	[34]
3 SCAR MARKERJI
AFLP in RAPD tehniki se uporabljata predvsem za analize genom ov, vendar metodološko nista primerni za izvajanje rutinskih analiz. Pretvorba specifičnih RAPD ali AFLP markerjev v SCAR markerje pa lahko zelo poveča njihovo uporabnost [38]. SCAR marker (Sequence characterized amplified region) predstavlja DNA fragment določenega lokusa v genomu, ki se lahko identificira s PCR namnoževanjem s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi. Razvoj SCAR markerjev temelji na določitvi nukleotidnih zaporedjih specifičnih RAPD ali AFLP markerjev, katera so nato osnova za izdelavo SCAR začetnih oligonukleotidov. Bistvena prednost pretvorbe RAPD ali AFLP markerjev v SCAR markerje se izraža v identifikaciji samo enega lokusa, manjši občutljivosti PCR namnoževanja na reakcijske pogoje, hitrosti in enostavnosti analize ter potencialu, da postanejo kodominatni markerji [27].
V diagnostiki rastlinskih patogenov SCAR markerji predstavljajo nove možnosti pri identifikaciji povzročiteljev bolezni, saj relativna enostavnost analize omogoča hitro in natančno detekcijo mikroorganizmov v različnih medijih kot so tla, voda in rastline, kar postavlja nove okvire pri proučevanju rastlinskih bolezni. Tako so Manzanares-Dauleux in sod. [20] opravili pomembno delo pri določanju patotipov glive Plasmodiophora brassicae, ki okužujejo križnice in povzročajo bolezen golšavost kapusnic. Omenjena skupina je odkrila RAPD marker, ki je specifičen za zelo virulenten patotip P1 te glive. Odkrit marker so klonirali ter mu določili nukleotidno zaporedje na osnovi katerega so razvili začetne oligonukleotide. Pri testiranju velikega števila izolatov so ugotovili namnoževanje SCAR markerja samo pri izolatih patotipa P1, kar potrjuje njegovo vrednost pri identifikaciji omenjenega patotipa. Razvit SCAR marker so nato optimizirali za identifikacijo v okuženem rastlinskem tkivu. Podobno so Hermosa in sod. [13] na osnovi RAPD analize razvili SCAR marker za določanje patotipa 11 glive Trichoderma atroviride, ki je patentiran za biotično zatiranje različnih talnih gliv. Omenjen marker sedaj omogoča lažje spremljanje dinamike patentiranega patotipa na poskusnih poljih.
4 MOLEKULSKE ANALIZE GLIV VERTICILLIUM ALBO-ATRUM IN V.
DAHLIAE
Angleška raziskovalca Carder in Barbara [5] sta leta 1991 med prvimi uporabila molekulske tehnike pri določanju genetske variabilnosti med različnimi izolati vrst V. albo-atrum, V. dahliae, V. tricorpus, V. nubilum, V. nigrescens in V. lecanii. Pri tem sta v analizo vključila razrez genomske DNA z EcoRI restrikcijskim encimom in RFLP metodo, kjer sta za iskanje polimofizma uporabila hibridizacijo s sondami rDNA iz konoplje, mtDNA iz V. albo-atrum, ter naključnimi genomskimi sondami iz glive V. albo-atrum. Z neposredno vizualizacijo razreza genomske DNA na agaroznem gelu sta opazila razlike med V. albo-atrum in V. dahliae ter med ostalimi vrstami, vendar analiza zaradi prisotnosti velikega števila fragmentov ni bila vedno jasna. Glavno odkritje te raziskave pa predstavljajo rezultati RFLP analize z genomskimi sondami, s katerimi sta pri vrsti V. albo-atrum ugotovila razlike med izolati iz lucerne (skupina L) in izolati iz ostalih gostiteljskih rastlin (skupina NL), kar je potrjevalo predhodne analize o fiziološki specializaciji izolatov iz lucerne [12].
Barbara in njegova skupina so nato nadaljevali raziskave z RFLP metodo v smeri določanja genetskih razlik med izolati glive V. dahliae. Pri tem so v analizo vključili širok spekter izolatov, ki je vključeval tudi fiziološko specializirane izolate iz mete in diploidne izolate V. dahliae var. longisporium, ki večinoma parazitirajo križnice. Hibridizacijo po Southernu so izvedli z 71 naključnimi genomski sondami pridobljenimi iz izolata V. dahliae in ostalimi sondami iz predhodnih raziskav. Rezultati analize so potrdili specifičnost izolatov iz mete (skupina M) in diploidnih izolatov (skupina D). Ostali izolati V. dahliae so se razvrstili v dve osnovni skupini A in B ter v vmesno skupino I (intermediate), ki pa se za razliko od skupin M niso D ujemale s patogenostjo izolatov, njihovim geografskim izvorom in ostalimi lastnostmi [25,26].
Pri določanju genetske variabilnosti je bilo veliko analiz usmerjenih k proučevanju nekodogenih variabilnih regij med rDNA geni. Tako so Nazar in sod. [24] z določitvijo nukleotidnega zaporedja ITS regij med izolatom V. albo-atrum iz lucerne in izolatom V. dahliae iz sončnic odkrili nehomologijo v ITS 1 in ITS 2 regijah. Na osnovi razlik so nato razvili specifični hibridizacijski sondi in PCR začetne oligonukleotide, ki se uporabljajo v diagnostiki obeh vrst. Ista skupina raziskovalcev je uporabila specifične začetne
oligonukleotide pri testiranju kanadskih izolatov gliv V. albo-atrum, V. dahliae in V. tricorpus iz krompirja. Pri tem so odkrili izolat V. albo-atrum, ki ni dal pozitivnega signala po PCR reakciji. Omenjenemu izolatu so določili nukleotidno zaporedje ITS regij in ugotovili razliko v 17 baznih parih v primerjavi z ostalimi izolati V. albo-atrum. Na osnovi teh razlik so nato razvili specifične začetne oligonukleotide in testirali še izolate V. albo-atrum iz Anglije in Nizozemske. Tudi med temi izolati so našli dve skupini izolatov V. albo-atrum iz krompirja, kar je dokazovalo odkritje nove podskupine te glive, ki se sedaj pojavlja pod oznako Grp25, medtem ko skupino Grp1 predstavljajo izolati ostalih gostiteljskih rastlin [31].
Morton in sod., [23] so v analizo ITS regij vključili izolate iz predhodno določenih RFLP skupin gliv V. albo-atrum (L in NL) in V. dahliae (A, B, I, M, D) [5,24,25] ter novo odkrito Grp2 skupino glive V. albo-atrum. Pri tem so z določitvijo nukleotidnega zaporedja ITS regij potrdili razliko med skupino izolatov V. albo-atrum iz lucerne (L) in izolati ostalih gostiteljskih rastlin (NL). Izolati V. albo-atrum so se razlikovali od V. dahliae v 5-6 nukleotidih. Slednji so se na osnovi razlike 6 nukleotidov razdelili na diploidne (D) in haploidne izolate (A, B, I, M). Pri skupini Grp2 V. albo-atrum so potrdili razliko 17 nukleotidov od ostalih izolatov te vrste in presenetljivo ugotovili podobnost z ITS zaporedjem glive V. tricorpus manj pomembne fitopatogene vrste.
Pomembne so tudi raziskave izolatov z RAPD markerji. Barasubiye in sod. [3] so prvi uporabili omenjeno metodo za vrednotenje genetske variabilnosti izolatov V. albo-atrum. V raziskavo so vključili 15 izolatov iz krompirja in 20 lucerne, ki so jih analizirali s petimi začetnimi oligonukleotidi. RAPD analiza je jasno ločila obe patogeni skupini izolatov in potrdila predhodne ugotovitve o različnosti izolatov iz lucerne. Do podobnih rezultatov sta z RAPD analizo prišla tudi Koike in Fujita [15] pri proučevanju japonskih izolatov glive V. dahliae in V. albo-atrum iz različnih gostiteljskih rastlin.
Obsežnejšo raziskavo Grp2 skupine sta opravila Mahuku in Platt [17], ki sta z RAPD metodo in razrezom IGS regije (IGS-RFLP) analizirala 21 izolatov V. tricorpus in 64 različnih izolatov V. albo-atrum, od katerih jih je 21 predstavljalo skupino Grp2. RAPD analiza je jasno določila razlike med vsemi tremi skupinami izolatov in določitev 34% povprečnega koeficienta sorodnosti med Grp2 in V. tricorpus ter 35% med Grp2 in ostalimi izolati V. albo-atrum (Grp1). Variabilnost je izrazila tudi analiza IGS regije, ki je prav tako jasno določila razlike med omenjenimi skupinami. Raziskovalca na osnovi rezultatov navajata možnost potrditve Grp2 skupine kot nove vrste rodu Verticillium, ki je najverjetneje nastala z hibridizacijo izolata V. albo-atrum iz skupine Grp1 in V. tricorpus.
Collins in sod. [7] so z AFLP metodo in analizo ITS regij proučevali izolate V. dahliae, ki parazitirajo križnice. Rezultati so določili dve podskupini diploidnih izolatov V. dahliae var. longisporium, od katerih jih večina predstavlja skupino imenovano a, ostali izolati pa skupino ß. Določeni skupini nimata povezave s patogenostjo ali geografskim izvorom. Molekulska analiza je prav tako ločila haploidne izolate V. dahliae iz križnic od izolatov ostalih gostiteljskih rastlin, kar skupaj kaže na tri skupine izolatov, ki so prilagojeni parazitiranju križnic. Avtorji navajajo, da zaradi visoke variabilnosti skupin a in ß izolatov V. dahliae var. longisporium predlagano ime za vse diploidne V. longisporium ni primerno.
Molekulski markerji so se izkazali tudi pri določanju razlik med različno virulentnimi izolati, ki so največkrat produkt vpliva monokulturnega gojenja poljščin. Tako so španski
5 Grp: kratica angleške besede group (skupina)
raziskovalci z RAPD metodo ugotovili razlike med bolj (D) in manj (ND) virulentnima patotipoma glive V. dahliae, ki parazitirata bombaž in oljke. Identificiranim specifičnim markerjem so določili nukleotidno zaporedje na osnovi katerega so razvili za vsak patotip specifične začetne oligonukleotide (SCAR), s katerimi so nato analizirali več izolatov iz različnih geografskih območij. Analiza s SCAR markerji je identificirala virulentne izolate iz Kalifornije in Kitajske, kar potrjuje hipotezo, da je bil patotip D v Španijo prenesen najverjetneje iz ene od teh dveh držav [28]. Podobno raziskava je bila opravljena tudi v Sloveniji, kjer smo z optimizirano AFLP tehniko odkrili DNA fragmente, ki so specifični različno virulentnima hmeljnima patotipoma PG1 in PG2 glive V. albo-atrum, kar je potrjevalo ugotovitve testiranja virulence o prisotnosti dveh hmeljnih patotipov v slovenskih hmeljiščih in predstavlja prvo tovrstno poročilo o identifikaciji DNA fragmentov, ki so v povezavi z virulenco pri izolatih V. albo-atrum iz hmelja [30].
Z dosedanjimi raziskavami so raziskovalci določili razlike med fitopatogenimi vrstami gliv iz rodu Verticillium in razlike med nekaterimi izolati iz različnih gostiteljev. Na osnovi opisanih raziskav z molekulskimi metodami se tako pri V. albo-atrum priznavata dve osnovni skupini:
•	Grp1, ki vključuje podskupino L (izolati iz lucerne) in NL (izolate ostalih gostiteljskih rastlin, kamor uvršamo tudi izolate iz hmelja) in
•	Grp2, ki predstavlja posebno skupino izolatov iz krompirja.
Izolati glive V. dahliae kažejo višji nivo variabilnosti, ki pa razen diploidnih izolatov V. dahliae var. longisporium in haploidnih izolatov iz mete ter bombaža ne kažejo jasnih fizioloških skupin oz. prilagoditve na določeno skupino gostiteljskih rastlin.
4.1 Uporaba molekulskih metod v diagnostiki gliv V. albo-atrum in V. dahliae
Hitra in zanesljiva identifikacija povzročiteljev bolezni ima velik pomen pri preprečevanju nadaljnjega širjenja bolezni. Klasična diagnostika temelji predvsem na osnovi morfoloških lastnosti, uporabi selektivnih gojišč, patogenih testih, analizah vegetativne kompatibilnosti in razlikah v biokemičnih lastnostih. Omenjene metode so večinoma delovno zahtevne, dolgotrajne in podvržene vplivom okolja, kar otežuje zanesljivost identifikacije. Za določitev vrste na osnovi morfoloških lastnosti je pri glivah V. albo-atrum in V. dahliae potrebna vsaj 2-3 tedenska inkubacija. Prav tako določanje patotipov s patogenimi testi časovno zahteva najmanj 2-3 mesečno analizo. Vpeljava molekulskih metod, s katerimi lahko neposredno analiziramo genom proučevanega organizma in PCR tehnologije, pomeni pomembno dopolnitev obstoječih analitičnih metod.
Prva uporaba PCR metode za identifikacijo izolatov V. albo-atrum in V. dahliae je temeljila na izdelavi specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki zaznajo razlike v ITS regijah rDNA genov [24]. Razviti začetni oligonukleotidi so omogočili širši razvoj diagnostičnih metod predvsem pri določanju prisotnosti omenjenih gliv v rastlinah in tleh. Tako so Hu in sod. [14] s pomočjo različnih standardov DNA razvili kvantitativno metodo določanja prisotnosti V. albo-atrum in V. dahliae v okuženih rastlinah lucerne in sončnic. Volossiouk in sod., [35] so prvi objavili neposredno PCR detekcijo glive V. dahliae v tleh. Pri tem so z namenom povečanja občutljivosti analize uporabili nested-PCR metodo, ki temelji na dveh zaporednih PCR reakcijah. Prvo namnoževanje so izvedli z začetnimi oligonukleotidi, ki so jih razvili iz nukleotidnih zaporedij ITS regij specifičnih za rod Verticillium, analizo pa nato nadaljevali s specifičnimi ITS začetnimi oligonukleotidi za glivo V. dahliae. Enako metodologijo so
Mahuku in sod. [18] uporabili pri določanju krompirjevih izolatov skupin Grp1 in Grp2 glive V. albo-atrum v rastlinah in tleh.
Carder in sod. [6] so razvili drugo skupino specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki so temeljili na nukleotidnih zaporedjih naključnih genomskih sond, katere so uporabljali pri RFLP analizah izolatov V. albo-atrum in V. dahliae [5,24,25]. Pri tem so uspešno razvili specifične začetne oligonukleotide za določanje izolatov glive V. dahliae in izolatov skupine NL glive V. albo-atrum.
Pri V. dahliae so znani tudi začetni oligonukleotidi, ki so razviti na osnovi RAPD analiz. Li in sod. [16] so pri proučevanju izolatov gliv V. albo-atrum, V. dahliae in V. tricorpus odkrili RAPD marker, ki je specifičen samo izolatom V. dahliae. Na osnovi nukleotidnega zaporedja polimorfnega markerja so razvili začetne oligonukleotide, ki so ohranili svojo specifičnost pri testiranju širokega spektra različnih izolatov V. dahliae in nekaterih sorodnih gliv. Znani so tudi začetni oligonukleotidi, ki so specifični za določanje različno virulentnih patotipov D in ND na bombažu in oljki [28]. Omenjene začetne oligonukleotide so Mercado-Blanco in sod. [21,22] uporabili pri razvoju nested-PCR metode za določanje omenjenih patotipov v obeh gostiteljskih vrstah. V povezavi s prej omenjeno AFLP raziskavo različno virulentnih izolatov glive V. albo-atrum iz hmelja (poglavje 4), so bili v Sloveniji na osnovi patotipsko specifičnih AFLP fragmentov izdelani SCAR markerji za določanje zelo viruletnega patotipa PG2. SCAR markerji so omogočili nadaljnji razvoj multipleks in nested PCR diagnostične analize [29], vključeni pa so tudi v diagnostični protokol za določanje gliv V. albo-atrum in V. dahliae na hmelju, ki ga pripravlja EPPO (European Plant Protection Organisation).
Preglednica 2: Najpogosteje uporabljeni začetni oligonukleotidi v diagnostiki gliv V. albo-atrum in V. dahliae Table 2: The most common primers used in diagnostic of V. albo-atrum and V. dahliae
Nukleotidno zaporedje (5'-3')	Specifičnost namnoževanja	Referenca
CCG GTA CAT CAG TCT CTT TA	V. albo-atrum Grp1 (ITS regija)	[24]
ACT CCG ATG CGA GCT GTA AT		
CCG GTA CAT CAG TCT CTA TA	V. albo-atrum Grp2 (ITS regija)	[31]
CAA CCG TTG CCG TACGAG AC		
CCG GTC CAT CAG TCT CTC TG	V. dahliae (ITS regija)	[24]
ACT CCG ATG CGA GCT GTA AC		
CTC ATA ACC CTT TGT GAA CC	Verticillium spp. (ITS regija)	[35]
CCG AGG TCA ACC GTT GCC G		
CAT GGA TAA CCG TGG TAA TT	Verticillium spp. (RFLP sonda)	[6]
CCA TTC AAT CGG TAG TAG CG		
ATG GAC CGA ACA GCT AGG TA	V. albo-atrum skupina NL	[6]
TCT CAG ATA TAT GCT GCT GC	(RFLP sonda)	
CGG TGA CAT AAT ACT GAG AG	V. dahliae (RFLP sonda)	[6]
GAC GAT GCG GAT TGA ACG AA		
CAC ATT CAG TTC AGG AGA CGG A	V. dahliae (RAPD marker)	[16]
CCT TCT ACT GGA GTA TTT CGG		
CAT GTT GCT CTG TTG ACT GG	V. dahliae patotip D	[28]
GAC ACG GTA TCT TTT GCT GAA	(RAPD marker)	
CAG GGG ATA CTG GTA CGA GAC G	V. dahliae patotip ND	[28]
ATG AGT AIT GCC GAT AAG AAC A	(RAPD marker)	
GGTAAGACTCCTTACCGATGCTG	V.albo-atrum hmeljni patotip	[29]
ATTCACACGCTACATATCAAACA	PV1,genotip PG2 (AFLP marker)	
5 ZAKLJUČEK
Pričetek uporabe molekulskih tehnik v genetskih analizah fitopatogenih gliv predstavlja prelomni korak, ki je omogočil pridobiti nova spoznanja pri razumevanju taksonomije, filogenije, razvoja virulence, patogenosti in interakcij med glivami ter rastlinami. Ob tem je prišlo do razvoja novih diagnostičnih analiz, ki so omogočile občutljivejšo, zanesljivejšo in hitrejšo identifikacijo fitopatogenih gliv. Ta napredek je močno obogatil tudi epidemiološke študije, saj sodobne diagnostične analize omogočajo detekcijo v različnih medijih kot so tla, voda in rastline, kar postavlja nove okvire pri proučevanju rastlinskih bolezni. Uporaba molekulskih tehnik bo po eni strani v prihodnosti bolj in bolj omogočala odkrivanje temeljnih spoznanj, po drugi strani pa bo na področju diagnostike vpeljevala nove standarde, ki bodo usmerjeni predvsem v visoko občutljivost, hitrost, enostavnost in zanesljivost analiz.
6 VIRI
1.	Baayen, R.P., O'Donnel, K., Bonants, P.J.M., Cigelnik, E., Kroon, L.P.N.M., Roebroeck, E.J.A., Waalwijk C., Gene genealogies and AFLP analysis in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease.- Phytopathology, 90(2000), p. 891-900.
2.	Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Nucleid acid methods for the identification of fungi producing vascular wilt in agricultural plants, with particular reference to Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f.sp. ciceris.- V: Fungal identification techniques. Proceedings from the Biotechnology workshop, Barcelona 5-8 april 1995. Rossen, L., Rubio, M., Dawson, T. (eds.)., Barcelona, European commision, Science research development. (1995), p. 50-55.
3.	Barasubiye, T., Parent, J., Hamelin, R.C., Laberge, S., Richard, C., Dostaler, D., Discrimination between alfalfa and potato isolates of Verticillium albo-atrum using RAPD markers.- Mycological Research, 12(1995), p. 1507-1512.
4.	Bruns, T.D., Palmer, J.D., Evolution of mushroom mitochondrial DNA: Suillus and related genera.- Journal of Molecular Evolution, 28(1989), p. 349-362.
5.	Carder, J.H., Barbara, D.J., Molecular variation and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) within and between six species of Verticillium.- Mycological Research, 8(1991), p. 935-942.
6.	Carder, J.H., Morton, A., Tabrett, A.M., Barbara, D.J., Detection and differentiation by PCR of subspecific groups within two Verticillium species causing vascular wilts in herbaceous hosts.- V: Modern assays for plant pathogenic fungi, identification, detection and quantification. Schots, A., Dewey, F.M., Oliver, R.P. (eds.)., Oxford, Wallingford, CAB International, (1994), p. 267.
7.	Collins, A., Okoli, C.A.N., Morton, A., Parry, D., Edwards, S.G., Barbara, D.J., Isolates of Verticillium dahliae pathogenic to crucifers are of at least three distinct molecular types.- Phytopathology, 93(2002), p. 364-376.
8.	Demeke, T., Adams, R.P., Chibbar, R., Potential taxonomic use of random amplified polymorphic DNA (RAPD): a case study in Brassicae.- Theoretical and Applied Genetics, 84(1992), p. 990-994.
9.	Descenzo, R.A., Engel, S.R., Gomez, G., Jackson, E.L., Munkvold, G.P., Weller, J., Irelan, N.A., Genetic analysis of eutypa strains from california supports the presence of two pathogenic species.- Phytopathology, 89(1999)10, p. 884-893.
10.	Dunkle, L.D., Levy, M., Genetic relatedness of Afican and United States populations of Cercospora zeae-maydi.- Phytopathology, 5(2000), p. 486-490.
11.	Gonzalez, M., Rodriguez, R., Zavala, M.E., Jacob, J.L., Hernandez, F., Acosta, J., Martinez, O., Simpson, J., Characterization of Mexican isolates of Colletotrichum lindemuthianum by using differential cultivars and molecular markers.-Phytopathology, 88(1998), p.292-299.
12.	Heale, J.B., Verticillium wilt of alfalfa, background and current research.- Canadian Journal of Plant Pathology, 7(1985), p. 191-198.
13.	Hermosa, M.R., Grondona, I., Diaz-Minguez, J.M., Iturriaga, E.A., Monte, E., Development of strain-specific SCAR marker for the detection of Trichoderma atroviridae 11, a biological control agent against soilborne fungal plant pathogens.-Current Genetics, 38(2001), p. 343-350.
14.	Hu, X., Nazar, R.N., Robb, J., Quantification of Verticillium biomass in wilt disease development.- Physiological and Molecular Plant Pathology, 42(1993), p. 23-36.
15.	Koike, M., Fujita, M., Random amplified polymorphic DNA analysis of japanese isolates of Verticillium dahliae and Verticillium albo-atrum.- Plant Disease, 11(1996), p. 1224-1227.
16.	Li, K.N., Rouse, D.I., Eyestone, E.J., German, T.L., The generation of specific DNA primers using random amplified polymorphic DNA and its application to Verticillium dahliae.- Mycological Research, 103(1999), p. 1361-1368.
17.	Mahuku, G.S., Platt, H.W., Molecular evidence that Verticillium albo-atrum Grp2 isolates are distinct from V. albo-atrum Grp1 and V. tricorpus.- Molecular Plant Pathology, 3(2002), p. 71-79.
18.	Mahuku, G.S., Platt, H.W., Maxwell, P., Comparison of polimerase chain reaction based methods with plating on media to detect and identify Verticillium wilt pathogens of potato.- Canadian Journal of Plant Pathology, 21(1999), p. 125-131.
19.	Majer, D., Mithen, R., Lewis, G.B., Vos, P., Oliver, P.R., The use of AFLP fingerprinting for the detection of genetic variation in fungi.- Mycological Research, 100(1996), p. 1107-1111.
20.	Manzanares-Dauleux, M.J., Barret, P., Thomas, G., Development of pathotype specific SCAR marker in Plasmodiophora brassicae.- Europen Journal of Plant Pathology, 106(2000), p. 781-787.
21.	Mercado-Blanco, J., Rodriguez-Jurado, D., Parrilla-Araujo, S., Simultaneous detection of the defoliating and nondefoliating Verticillium dahliae pathotypes in infected olive plants by duplex, nested polimerase chain reaction.- Plant Disease, 87(2003), p. 14871494.
22.	Mercado-Blanco, J., Rodriguez-Jurado, D., Peres-Artes, E., Jimenez-Diaz, R.M., Detection of the defoliating pathotype of Verticillium dahliae in infected olive plants by nested PCR.- European Journal of Plant Pathology, 108(2002), p. 1-13.
23.	Morton, A., Carder, J.H., Barbara, D.J., Sequences of the internal transcribed spacer of the ribosomal RNA genes and relationships between isolates of Verticillium albo-atrum and V. dahliae.- Plant Pathology, 44(1995), p. 183-190.
24.	Nazar, R.N., Hu, X., Schmid,t J., Culham, D., Robb, J., Potential use of PCR-amplified detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens.- Molecular Plant Pathology, 39(1991), p. 1-11.
25.	Okoli, C.A.N., Carder, J.H., Barbara, D.J., Molecular variation and sub-specific groupings within V. dahliae.- Mycological Research, 97(1993), p. 233-239.
26.	Okoli, C.A.N., Carder, J.H., Barbara, D.J., Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) and the relationships of some host adapted isolates of Verticillium dahliae.-Plant Pathology, 43(1994), p. 33-40.
27.	Paran, I., Michelmore, R.W., Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce.- Theoretical Applied Genetics, 85(1993), p. 985-993.
28.	Perez-Artes, E., Garcia-Pedrajas, M.D., Bejarano-Alcazar, J., Jimenez-Diaz, R.M., Differentiation of cotton-defoliating and nondefoliating pathotypes of Verticillium dahliae by RAPD and specific PCR analyses.- European Journal of Plant Pathology, 106(2000), p. 507-517.
29.	Radišek, S., Jakše, J., Javornik, B., Development of pathotype specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop.- Plant Disease, 88(2004), p. 1115-1122.
30.	Radišek, S., Jakše, J., Simončič, A., Javornik, B., Characterization of Verticillium albo-atrum Field Isolates Using Pathogenicity Data and AFLP Analysis.- Plant Disease, 87(2003), p. 633-638.
31.	Robb, J., Moukhamedov, R., Hu, X., Platt, H., Nazar, R.N., Putative subgroups of Verticillium albo-atrum distinguishable by PCR-based assays.- Physiological and Molecular Plant Pathology, 43(1993), p. 423-436.
32.	Says-Lesage, V., Roeckel-Drevet, P., Viguie, A., Tourvieille, J., Nicolas, P., Tourvieille de Labrouhe, D., Molecular variability within Diaporthe/Phomopsis helianthi from France.- Phytopathology, 92(2002), p. 308-313.
33.	Sharples, G.J., Lloyd, R.G.J.M., A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions og bacterial chromosomes.- Nucleic Acids Research, 18(1990), p. 6503-6508.
34.	Vandermark, G., Martinez, O., Pecina, V., Jesus Alvarado, M., Assessment of genetic relationships among isolates of Macrophomina phaseolina using a simplified AFLP technique and two different methods of analysis.- Mycologia, 92(2000), p. 656-664.
35.	Volossiouk, T., Robb, E.J., Nazar, R.N., Direct DNA extraction for PCR mediated assays of soil organisms.- Applied and Environmental Microbiology, 11(1995), p. 3972-3976.
36.	Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, F., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M., AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.-Nucleic Acids Research, 21(1995), p. 4407-4414.
37.	Weising, K., Nybom, H., Wolff, K., Meyer, K., Fingerprinting in Plants and Fungi.-London, CRC Press, Inc., p. 322.
38.	Xu, M., Huaracha, E., Korban, S.S., Development of seguence-characterized amplified regions (SCARs) from amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) markers tightly linked to the Vf gene in apple.- Genome, 44(2001), p. 63-70.
39.	Zhong, S., Steffenson, B.J., Virulence and Molecular Diversity in Cochliobolus sativus.-Phytopathology, 91(2001), p. 469-476.