74 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 1 Inštitut za biomedicinske vede, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija 2 Katedra za farmakologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija 3 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Korespondenca/ Correspondence: Marko Milojević, e: marko. milojevic1@um.si Ključne besede: modeli in vitro; trebušna slinavka; bionosilci; 3D tisk; metoda tkivne rezine Key words: in vitro models; pancreas; bioscaffolds; 3D printing; tissue slice method Prispelo: 18. 10. 2019 Sprejeto: 12. 5. 2020 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn.3001 doi 18.10.2019 date-received 12.5.2020 date-accepted Metabolic and hormonal disorders Metabolne in hormonske motnje discipline Review article Pregledni znanstveni članek article-type In vitro models of the endocrine pancreas Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke article-title In vitro models of the endocrine pancreas Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke alt-title in vitro models, pancreas, bioscaffolds, 3D printing, tissue slice method modeli in vitro, trebušna slinavka, bionosilci, 3D tisk, metoda tkivne rezine kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2021 90 1 2 74 90 name surname aff email Marko Milojević 1,2 marko.milojevic1@um.si name surname aff Andraž Stožer 3 Uroš Maver 1,2 eng slo aff-id Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, Maribor, Slovenia Inštitut za biomedicinske vede, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija 1 Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor, Maribor, Slovenia Katedra za farmakologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija 2 Institute for physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, Maribor, Slovenia Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija 3 Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke In vitro models of the endocrine pancreas Marko Milojević,1,2 Andraž Stožer,3 Uroš Maver1,2 Izvleček Želja po razvoju tkivnih nadomestkov, potrebe po preučevanju mehanizmov bolezni v kontroli- ranih pogojih, pomanjkljivosti živalskih modelov in etične omejitve so bile povod za razvoj pod- ročja naprednih modelov in vitro. Te definiramo kot alternativne eksperimentalne sisteme, ki z uporabo modernih tehnik tkivnega inženirstva in aditivne proizvodnje posnemajo strukturo in funkcionalnost tkiv ali organov in vitro. Enostavni modeli in vitro se že uporabljajo v številne namene, vendar zaradi mnogih pomanjkljivosti ne posnemajo dovolj dinamičnih odzivov izvor- nih tkiv. Za izgradnjo funkcionalno kompleksnejših modelov in vitro je celice potrebno gojiti v tridimenzionalnem (3D) okolju ali bioloških nosilcih. Splošno morajo biološki nosilci posnemati mikroarhitekturo, hierarhično strukturo, fizikalne lastnosti in sestavo izvornega tkiva. Toda na- predek k izgradnji kompleksnejših modelov omejuje predvsem difuzija plinov in hranil v notra- njost konstrukta. Tehnika 3D tiska je trenutno najobetavnejša rešitev za proizvodnjo naprednih bioloških nosilcev, ki odpravljajo te pomanjkljivosti. 3D tisk poleg zmožnosti sočasne uporabe več biološko kompatibilnih materialov omogoča nalaganje materiala z mikrometrsko prostorsko ločljivostjo pri pogojih, primernih celicam. Vse od zasnove področja modelov in vitro je zaradi že- lje po preučevanju nastanka sladkorne bolezni razvoj funkcionalnega modela trebušne slinavke eden od osrednjih, a še nedoseženih ciljev. Zlati standard za bazične in translacijske raziskave trebušne slinavke pa je kljub nekaterim pomanjkljivostim metoda tkivne rezine, medtem ko tre- nutni najnaprednejši 3D zgrajeni modeli trebušne slinavke in vitro posnemajo le osnovne funkci- je organa. Namen tega članka je predstavitev modelov in vitro s poudarkom na modelih trebušne slinavke. Predstavil bo tipe modelov in ključne elemente, ki jih je treba pri izgradnji upoštevati. Poudarek bo na kompleksnejših 3D zgrajenih modelih in vitro in tkivnih rezinah, materialnih la- stnostih bioloških nosilcev ter tehniki 3D tiska za izgradnjo naprednih bioloških nosilcev. Meni- mo, da je sočasni razvoj znanosti o materialih, mikroproizvodni tehnologiji in celičnih kulturah izjemno obetavna pot k izgradnji funkcionalnega modela trebušne slinavke in vitro. Abstract Ambitions to develop artificial tissue substitutes, combined with the need to study underlying mechanisms of disease under controlled conditions, shortcomings of animal models, as well as ethical constraints were the main driving forces behind the development of advanced in vitro models. These are defined as alternative experimental systems made by leveraging recent ad- vances in tissue engineering and additive manufacturing that mimic tissue or organ level physi- ology in vitro. Simple in vitro models are already being used in many applications, however due to their many drawbacks, they incompletely mimic dynamic responses of native tissues. In order to construct functionally more relevant in vitro models, cells need to be grown in three-dimen- sional (3D) environments or bioscaffolds. Generally, bioscaffolds must recapitulate the microar- chitecture, hierarchical structure, physical properties, and composition of native tissues. None- theless, progress towards building more complex models is hindered primarily by the diffusion of gases and nutrients into the constructs´ interior. Currently, 3D printing presents the most promising solution for the production of advanced bioscaffolds which resolve the above men- tioned limitations. In addition to the technique´s ability to simultaneously use multiple biocom- 75 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke 1 Uvod Poglavitni namen večine biomedi- cinskih raziskav je razvozlati izvor in molekularne mehanizme človekovih bo- lezni s ciljem razviti nove ali izboljšane preventivne, diagnostične in terapevtske pristope. Zaradi očitnih razlogov samih temeljnih raziskav ni mogoče izvajati na ljudeh, živalski modeli pa se anatomsko, fiziološko in genetsko preveč razlikujejo od človeka, tako da pogosto ne posnema- jo kritičnih vidikov človeških zdravih ali patološko spremenjenih tkiv in organov, še posebej ne z želeno molekulsko ločlji- vostjo (1). Razvoj alternativnih modelov, ki posnemajo človeško anatomijo in fizi- ologijo in vitro, je zato nujno potreben. Vzporedno je končni cilj področja tkiv- nega inženirstva (TI) proizvodnja funk- cionalnih tkiv in organov in vitro, ki bi lahko služili kot nadomestki za obnovo ali zamenjavo poškodovanih in obolelih humanih delov telesa (2-4). Posamezne raziskave TI se osredinjajo predvsem na patible materials, 3D printing enables material deposition with micrometer spatial resolution under cell-friendly conditions. The development of a functional in vitro pancreas model is gov- erned by the desire to study diabetes aetiology and is one of the main goals of the in vitro mod- elling domain, which to-date remains unfulfilled. The tissue slice method, despite having some drawbacks, presents the gold standard for basic and translational studies of the pancreas, while current most advanced 3D fabricated in vitro pancreas models mimic only basic functions of the organ. The purpose of this review is to provide an overview of in vitro models with a focus on in vitro models of the endocrine pancreas. We will highlight different model types and fundamental elements which need to be considered when constructing a model. Emphasis will be placed on more complex 3D fabricated in vitro models, tissue slices, bioscaffold material properties, and use of 3D printing for the fabrication of advanced bioscaffolds. We believe that simultaneous de- velopment of advanced materials, micro-manufacturing technologies, and advanced cell culture methods presents a very promising approach towards the construction of a functional in vitro pancreas model. Citirajte kot/Cite as: Milojević M, Stožer A, Maver U. Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke. Zdrav Vestn. 2021;90(1–2):74–90. DOI: https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 Avtorske pravice (c) 2021 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. razvoj individualnih mejnikov tega pro- cesa za doseganje končnega cilja (npr. razvoj naprednih materialov, metod pro- izvodnje in celičnih virov itn.) (5,6) ter tudi na izgradnjo enostavnih modelov in vitro, ki posnemajo osnovne funkci- je tkiv in organov in vivo. Da bi dosegli načela 3R – zamenjava, zmanjšanje in izboljšava (angl. replacement, reducti- on, refinement) ob etičnih omejitvah in pomanjkljivostih živalskih modelov in zastavljene cilje tkivnega inženirstva za- radi preučevanja mehanizmov bolezni v nadzorovanih pogojih, so bili povod za razvoj kompleksnih modelov in vitro. Področje naprednih modelov in vitro leži na presečišču TI, regenerativne medici- ne, patofiziologije, znanosti o naprednih materialih in aditivne proizvodnje ter se osredinja na posnemanje tridimenzio- nalne (3D) strukture in funkcionalnosti tkiv ali organov in vitro. 76 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 2. Modeli in vitro 2.1 Enostavni modeli in vitro Enostavni dvodimenzionalni (2D) modeli in vitro se že uporabljajo za šte- vilne namene (Slika 1), kot sta razvoj in testiranje novih zdravilnih učinkovin ter za farmakološke in toksikološke študije. V ta namen se najpogosteje uporabljajo transformirane ali nesmrtne komercial- no dostopne celične linije, ki pa se med dolgotrajnejšim gojenjem (večanje šte- vila celičnih delitev) večinoma pričnejo genetsko, epigenetsko in fiziološko zna- čilno razlikovati od izvornih celic. Za iz- gradnjo modelov in vitro so komercialne celične linije zato najslabša izbira (7,8). V nasprotju z njimi so izolirane primar- ne celične kulture najboljši kandidati za uporabo v modelih in vitro, saj najbolje predstavljajo funkcionalne enote izvor- nega tkiva. Izgradnja modelov in vitro na osnovi primarnih celičnih kultur je predvsem omejena zaradi težavne dosto- pnosti in izoliranja celic, ki poleg tega v standardnih 2D celičnih kulturah težko proliferirajo in imajo kratko življenjsko dobo (t. i. Hayflickova meja) (9). Nedav- no so te težave premostili z uporabo in- duciranih pluripotentnih matičnih celic (angl. induced pluripotent stem cells, iPSCs), ki jih lahko pridobimo iz somat- skih celic s postopkom dediferenciacije (10). iPSCs imajo zmožnost samoobnav- ljanja in diferenciacije v številne zrele ce- lične tipe, zaradi česar so izredno zani- mive za uporabo v modelih in vitro, kjer preučujemo nastanek in potek razvoja bolezni. Razlog za redko uporabo iPSCs je dejstvo, da pa je nadzor nad diferenci- acijo v zrele tipe celic izjemno komple- ksen, poleg tega pa so v celični kulturi vselej prisotni tudi nezreli celični feno- tipi (11,12). Ne glede na vir in tip celic štejemo med enostavne modele in vitro standar- dne 2D enocelične kulture (sestavljene iz enega tipa celic, gojenih v celičnih po- sodah) in njihove nadgrajene izvedenke, kot so 2D kokulture, 2D kulture, gojene v posodah, ki so prevlečene s kompo- nentami zunajceličnega matriksa (angl. extracellular matrix, ECM), in kulture, gojene na vložkih Transwell®. To pa so enostavne 2D celične kokulture, gojene na vložkih, ki posnemajo kompleksnejšo tridimenzionalno (3D) medcelično si- gnalizacijo (13,14). Dejstvo je, da imajo takšni 2D modeli in vitro veliko pomanj- kljivosti. Poleg tega, da se celične poso- de po strukturi, mehanskih lastnostih, topografiji in sestavi statistično značilno razlikujejo od izvornega tkiva, te celice ne morejo medsebojno avto- in parakri- no komunicirati v vseh prostorskih raz- sežnostih. Prav tako so celice neenako- merno izpostavljene koncentracijskim gradientom kisika, hranilnih snovi in biološko aktivnih molekul. To vodi do Slika 1: Področja uporabe modelov in vitro. Modeli in vitro Regenerativna medicina Modeliranje bolezni Farmakološke in toksikoliške študije Personalizirana terapija Odkrivanje in testiranje zdravilnih učinkovin Testiranje živil in nutricevtika Tkivno inženirstvo Temeljne raziskave 77 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke dejstva, da celice, gojene v 2D kulturah, ne izkazujejo pravilne morfologije ter pogosto ne izražajo ustreznega fenotipa dovolj dolgo. Zato ne omogočajo izvesti kompleksnejših in dolgotrajnejših ekspe- rimentov. Posledica tega je, da enostavni modeli in vitro ne posnemajo ključnih značilnosti in funkcij izvornega tkiva (15,16). V nasprotju z 2D kulturami pa celice, gojene v 3D kulturah, vzpostav- ljajo kompleksne interakcije z ECM in sosednjimi celicami v treh prostorskih dimenzijah, zato bolje posnemajo bioke- mijo in mehaniko izvornega mikrooko- lja. Torej je za izgradnjo funkcionalno kompleksnejših modelov in vitro celice treba gojiti v 3D okolju oziroma na 3D celičnih nosilcih, tj. bioloških nosilcih (angl. bioscaffolds), ki posnemajo izvor- ni ECM, v katerem celice rastejo, se dife- rencirajo, razmnožujejo in komunicirajo v vseh prostorskih dimenzijah (17). 2.2 Napredni modeli in vitro Napredne modele in vitro definiramo kot sintetične alternativne eksperimen- talne sisteme, ki z uporabo modernih pristopov TI in mikroaditivne proizvo- dnje na osnovi živih humanih celic po- snemajo fiziologijo tkiva ali organa in vitro. V sklopu te definicije ni mišljeno, da se kompleksna arhitektura in funkci- ja tkiva ali organa posnemata do popol- nosti, ampak model vsaj reprezentativno posnema samo tiste ključne funkcije, ki jih želimo posnemati in vitro. Napredni 3D modeli in vitro so uporabni predvsem takrat, kadar konvencionalne 2D celične kulture ne posnemajo dovolj dobro di- namičnih odzivov izvornih tkiv (16,18). Temeljne prvine (Slika 2), ki jih moramo pri izgradnji modela in vitro upoštevati, so vir in tip celic (9), fizikalno-kemijski dražljaji (19) ter biološko aktivne mo- lekule (biokemijski dražljaji) (20,21), ki spodbujajo želeni celični fenotip. Med najenostavnejše 3D modele in vitro uvrščamo sferoide in organoide, ki jih gojimo v posebnih celičnih poso- dah, na katere se celice ne pritrjujejo. Z ustreznimi biokemijskimi dražljaji se ce- lice same organizirajo v enostavno krog- lasto 3D obliko. Pri tem se najpogosteje uporabljajo iPSCs. Kot namiguje ime, organoidi ex vivo posnemajo osnovno hierarhično strukturo in fiziologijo or- ganov, medtem ko sferoidi nimajo jasno opredeljene notranje strukture in celič- ne organizacije (22). Organoidi se upo- rabljajo predvsem za temeljne raziskave in vitro, ki se ukvarjajo z organogenezo in s potekom nastanka bolezni (23). Po- leg tega, da se organoidi med seboj bi- stveno razlikujejo po velikosti in obliki, je poglavitna omejitev obeh modelov velikost, saj celice v notranjosti 3D kon- strukta zaradi omejene difuzije hitro nekrotizirajo (24). Za izgradnjo večjih in kompleksnejših 3D konstruktov je tako izrednega pomena izgradnja celičnih bi- oloških nosilcev z ustrezno poroznostjo, ki olajšajo dostop kisika in hranil do ce- lic (17,25). Pri izgradnji naprednih 3D mode- lov in vitro je zato treba dodatno izbrati ustrezne gradnike za proizvodnjo celič- nih nosilcev z ustreznimi strukturnimi in mehanskimi lastnostmi. Nano-, mi- kro- in makrolastnosti modelov in vitro je treba prilagoditi tako, da te posnema- jo značilnosti izvornega ali bolezensko spremenjenega tkiva. Poudarek mora bi- ti tudi na posnemanju mehanskih pogo- jev, v katerih celice rastejo. Zato je treba izbrati primerne biološke kompatibilne materiale z ustreznimi mehanskimi la- stnostmi. Pomemben del modeliranja vključuje tudi posnemanje koncentra- cijskih gradientov hranil, plinov, pH in presnovkov (9). 78 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 3 Trebušna slinavka Vse od zasnove področja modelov in vitro je zaradi želje po preučevanju nastanka sladkorne bolezni tipa 1 in 2 (lat. diabetes mellitus, DM) eden od primarnih ciljev razviti funkcionalni model trebušne slinavke in vitro ter zlas- ti Langerhansovih otočkov. Normalno delovanje človeškega telesa je odvisno od natančnega uravnavanja koncen- tracije glukoze v krvi. Osrednje mesto pri vzdrževanju dinamičnega ravno- vesja glukoze ima trebušna slinavka, natančneje celice beta, ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih. Te ob zvišanju koncentracije energijsko bogatih mole- kul v krvi (predvsem glukoze) in neka- terih hormonov (npr. inkretinov GIP in GLP-1) ter pod vplivom nevrotransmi- torjev (npr. CCK in acetilholina) izločajo inzulin (26,27). Trebušna slinavka (pan- kreas) je približno 14–18 cm velik retro- peritonealni organ, sestavljen iz treh poglavitnih anatomskih delov: glave, te- lesa in repa. Je žleza, ki jo tako struktur- no kot funkcionalno razdelimo na večji (~95 %), eksokrini del, sestavljen pred- vsem iz duktalnih in acinarnih celic, in manjši (~5 %), endokrini del, sestavljen iz Langerhansovih otočkov. Acinarne celice posredno v dvanajstnik izloča- jo prebavne encime, ki so odgovorni za razgradnjo proteinov, lipidov in oglji- kovih hidratov. Duktalne celice pa izlo- čajo tekočino, bogato z bikarbonatnimi anioni (28). Endokrina tkiva predstavlja pri človeku približno milijon 50–500 µm velikih endokrinih mikroorganov, imenovanih Langerhansovi otočki. Vsak otoček (tudi pri različnih vrstah) vsebuje približno 1.000 celic. Najštevilčnejše so Slika 2: Ključni elementi, ki jih je treba upoštevati pri izgradnji naprednih 3D modelov in vitro. Po izbiri ustreznega vira in tipa celic je treba posnemati pomembne biokemijske in fizikalno-kemijske dražljaje in vivo, ki zagotavljajo ohranjanje želenega celičnega fenotipa. Nujno je tudi, da 3D biološki nosilci posnemajo ključne fizikalnstrukturne lastnosti izvornega ECM. Napredni 3D modeli in vitro Komercialno dostopne celične linije Primarne celične kulture Inducirane pluripotentne matične celice Vir in tip celic Biokemijski dražljaji Fizikalno-strukturne lastnosti bionosilcev Fizikalno-kemijski dražljaji Rastni faktorji Citokini Hormoni Steroidi Peptidi Geometrija Poroznost Topografija Trdota Visokoelastične lastnosti Koncentracijski gradienti pH Temperatura Naboj 79 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke celice beta (50–60 %), ki izločajo inzu- lin, sledijo jim celice alfa (35–40 %), ki izločajo glukagon, ter celice delta (10–15 %), ki izločajo somatostatin. Manj zasto- pane so celice PP ali gama, ki izločajo pankreasni polipeptid, in celice epsilon, ki izločajo grelin (29). Med najpomemb- nejše motnje v delovanju endokrinega dela trebušne slinavke štejemo DM tipa 1 in 2. Sladkorna bolezen je presnovna bolezen, za katero je značilna nezmo- žnost uravnavanja homeostaze glukoze v krvi. Predvsem (avto)imunsko pogo- jena sladkorna bolezen tipa 1 je posle- dica absolutnega pomanjkanja inzulina zaradi uničenja celic beta (30). DM ti- pa 2 je kompleksna poligenska bolezen, na katero vplivajo tudi številni okoljski in epigenetski dejavniki. Povzroči jo zmanjšana občutljivost tarčnih tkiv za inzulin s sprva kompenzacijsko abso- lutno zvečanim, a sorazmerno nezado- stnim izločanjem inzulina. To končno vodi do nedelovanja sekrecije, propada celic beta in absolutnega pomanjka- nja inzulina (31-33). Oba tipa bolezni lahko vodita do akutnih in kroničnih zapletov, med katerimi so srčno-žilne težave, ledvična odpoved, nevrološke poškodbe, izguba vida in splošno po- večana umrljivost bolnikov (34,35). V večini temeljnih raziskav o nastanku in razvoju sladkorne bolezni se uporabljajo številni različni živalski modeli (prete- žno glodavci, predvsem miši) (36). Kljub številnim podobnostim pa obstaja med ljudmi in glodavci veliko strukturnih in fizioloških razlik med Langerhansovimi otočki , kar vodi do razlik v funkcional- ni sklopljenosti med celicami in končno tudi do razlik v kompleksni dinamiki iz- ločanja inzulina (26,28). To pomeni, da rezultatov, pridobljenih na živalskih mo- delih, ne moremo vselej v vseh pogledih zanesljivo prenesti na človeka. 4 Modeli trebušne slinavke in vitro Razvoj funkcionalnega človeške- ga modela trebušne slinavke in vitro bi pomenil preboj v temeljnih raziskavah sladkorne bolezni in vodil k razvoju novih zdravilnih učinkovin za zdravlje- nje sladkorne bolezni. Hkrati bi močno zmanjšal potrebo po uporabi živalskih modelov. Kljub dolgoletnemu razvija- nju modelov in vitro pa na področju trebušne slinavke ostajajo številne teža- ve. Prva težava pri gojenju celic trebu- šne slinavke in vitro nastane že z zah- tevnim procesom osamitve in čiščenja viabilnih pankreasnih otočkov in celic znotraj otočka. Celice Langerhansovih otočkov kmalu po osamitvi, ko izgube homo- in heterotipične medcelične sti- ke, niso več sposobne za avto- in parak- rino komuniciranje. Poleg tega izgubijo kritične stike z ECM in stike z bazalno membrano, kar navsezadnje vodi do zmanjšanja viabilnosti in izgube delo- vanja celic. Dodatno visoke presnovne zahteve in velikost otočkov omejujejo razpolaganje in dostop kisika ter hra- nil do celic v notranjosti otočka. Zaradi omejene difuzije se hitro prične nekro- tično propadanje celic. Vse to botruje dejstvu, da trenutni 2D celični modeli in vitro trebušne slinavke ob stimuliranju z glukozo ne posnemajo kritične dinami- ke izločanja inzulina (37). 2D substrati torej omejujejo rast pankreasnih celic, preprečujejo nastanek kompleksne 3D morfologije in vivo in ne posnemajo stikov tipa celice ECM, ki so kritični za normalno delovanje endokrinih celic. Še bolj v prid pomembnosti 3D okolja za diferenciacijo, rast in funkcionalnost Langerhansovih otočkov govori dejstvo, da so nedavno potrdili neposredno po- vezanost med morfologijo pankreasnega 80 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 otočka in endokrino diferenciacijo. Pri diferenciaciji endokrinih progenitornih celic namreč celice alfa, ki se prve raz- vijejo, migrirajo na zunanjost otočka in tvorijo plašč, medtem ko celice beta, ki nastanejo kasneje, ostanejo v jedru otočka. Takšna časovno-prostorska so- razmernost vodi do tipične sferične 3D arhitekture človeškega pankreasnega otočka (plašč iz celic alfa in jedro iz celic beta), ki je nujno potrebna za normalno delovanje otočka (38). 4.1 3D biomimetični nosilci posnemajo ECM izvornega tkiva V najelementarnejšem smislu je ECM naravni biološko aktivni celični nosilec, sestavljen iz strukturnih (kolageni, lami- nini, fibronektini) in signalnih proteinov, polisaharidov, glikoproteinov, proteogli- kanov, biološko aktivnih molekul, elek- trolitov in vode (39). ECM v razmerah in vivo ustvari kompleksno 3D ogrodje, ta- ko da celicam zagotavlja mehansko pod- poro in poleg medcelične komunikacije v vseh prostorskih dimenzijah omogoča ključne celične procese, kot so adhezija, migracija, proliferacija in diferenciacija (40). ECM igra v mikrookolju pankreas- nih celic ključno vlogo (41), zato je pri izgradnji naprednega modela trebušne slinavke in vitro izrednega pomena, da z uporabo 3D celičnih nosilcev posnema- mo osnovne lastnosti izvornega ECM (42,43). Splošno morajo celični nosilci posne- mati kompleksno 3D mikroarhitekturo, hierarhično strukturo in sestavo ECM izvornega tkiva, ki ga želimo posnemati in vitro. Osnovne gradnike, 3D strukturo in sestavo pankreasnega ECM najbolje posnemajo nosilci, zgrajeni iz naravnih polimerov (predvsem polisaharidov). Ti tvorijo hidrogele ter pozitivno vplivajo na rast in viabilnost celic trebušne sli- navke (44). Zato se za izgradnjo napre- dnih modelov trebušne slinavke in vitro (Langerhansovih otočkov) vlaga velik trud v razvoj 3D biomimetičnih celičnih nosilcev, ki posnemajo osnovne grad- nike izvornega mikrookolja (ECM), s katerim so pankreasne celice obdane. Ključno merilo pri izgradnji nosilca je izbira ustreznega materiala. Temeljiti mora na mehanskih lastnostih tkiva, saj igra predvsem površina materiala po- membno vlogo pri usmerjanju rasti in razvoja celic, poleg tega pa je osrednji vmesnik za medcelične interakcije (45). Trebušna slinavka je nelinearno visko- zno-elastično mehko tkivo z nizko striž- no togostjo (46). Zato so naravni po- limerni hidrogeli, ki imajo visok delež vode in izkazujejo podobne strukturne ter mehanske lastnosti kot pankreasni ECM, najboljši materiali za izgradnjo celičnih nosilcev (47). Poleg biološke kompatibilnosti sta osnovne lastnosti, ki ju moramo še upoštevati pri izgradnji bionosilca, struktura in elementarni gra- dniki nosilca. Topografske, materialne in fizikalne značilnosti vseh velikostnih razredov (npr. makro-, nano- in mikro- topografija, makro- in mikroporoznost) so strukturni dražljaji, ki usmerjajo ob- našanje celic. Izbira biološko kompati- bilnih materialov mora temeljiti na dej- stvu, da tako mikro- kot makrolastnosti nosilcev posnemajo značilnosti izvor- nega ali patološko spremenjenega tkiva trebušne slinavke. Površinske lastnosti nosilcev (npr. hrapavost), njihove me- hanske lastnosti, mikrostrukutra (npr. velikost in oblika por) in druge značil- nosti (npr. nabrekanje in biološka raz- gradljivost nosilca) značilno vplivajo na rast in fenotip celic (48). Celice trebušne slinavke, ki so jih gojili in vitro na 3D ce- ličnih nosilcih, so se lahko diferencirale v fiziološko primerno tkivo, hkrati pa 81 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke se je njihova morfologija značilno raz- likovala od celic, gojenih v 2D celičnih kulturah. V primerjavi z 2D substrati so s 3D nosilci, zgrajeni iz polisaharidov, spodbujali tudi boljšo adhezijo, prolife- racijo in preživetje celic (49-51). Čeprav materiali naravnega izvora predstavljajo dobro izbiro za izgradnjo 3D biološko mimetičnih nosilcev, pa ne morejo posnemati kompleksnosti ECM izvornega tkiva povsem do potankosti. Nedavno razvite tehnike tkivne dece- lularizacije (angl. decellularised extra- cellular matrices, dECM) obljubljajo možnost izgradnje celičnih nosilcev dECM, ki skoraj popolnoma posnemajo kompleksnost izvornega tkiva. Celične nosilce dECM lahko pridobimo iz raz- ličnih tkiv z metodo decelularizacije, ki ponavadi zajema lizo in odstranitev celic iz tkiva s perfuzijo z deionizirano vodo ali z detergenti (52,53). Tako po procesu ostane samo tkivnospecifični ECM, ki ponavadi zajema makromolekule, kot so kolageni, laminini, fibronektin, elastin in druge tkivnospecifične glikozaminogli- kane, citokine in rastne dejavnike. Ne- davno je skupina znanstvenikov doka- zala, da takšni specifični nosilci dECM značilno vplivajo tudi na delovanje celic trebušne slinavke. Z metodo decelula- rizacije so iz trebušne slinavke uspeš- no pripravili celične nosilce z unikatno sestavo, fizikalno strukturo in biološko aktivnostjo. Celice iPSCs, gojene na spe- cifičnih nosilcih za trebušno slinavko, so se spontano diferencirale v celice, po- dobne celicam trebušne slinavke, ki so pri tem tudi začele izražati ustrezne gene (54). Iz tkiva trebušne slinavke priprav- ljen dECM so uspešno uporabili tudi že za 3D tisk biološko mimetičnih celičnih nosilcev. Takšni 3D tiskani nosilci dECM so spodbujali diferenciranje iPSCs pro- ti pankreasnemu fenotipu, hkrati pa so ohranjali dolgoročno viabilnost in funk- cijo izoliranih Langerhansovih otočkov (55). Največja težava pri uporabi dECM ostaja dejstvo, da se med procesom de- celulariziranja poruši visoko specifična prostorska razporeditev proteinov in drugih molekul. Zato trenutni cilj pri razvoju ostaja iskanje ravnotežja med popolno odstranitvijo celičnih kompo- nent in ohranitvijo malih žil (kapilar) in drugih tkivnih struktur. Prav tako so na celicah, gojenih na nosilcih dECM, opa- zili toksične učinke, ki so najverjetneje posledica preostanka detergentov, upo- rabljenih med procesom (56). Trenutno največjo omejitev na podro- čju izgradnje 3D nosilcev, ki dolgoročno podpirajo rast celic trebušne slinavke, predstavljajo neustrezne mehanske last- nosti materialov, še posebej hidrogelov. Za izboljšanje mehanske stabilnosti hi- drogelov se uporabljajo različne tehnike zamreženja (npr. ionsko zamreženje), anorganski/organski dodatki (celulozna vlakna, različni nanodelci) (57,58) ali drugi sintetični materiali (polikaprolak- ton). Ti nosilcu izboljšajo mehanske last- nosti oziroma nudijo primerno osnovno ogrodje (57,59). Dodatna težava pa je dejstvo, da je izjemno težko tako prila- gajati prej omenjene ključne značilnosti nosilcev (poroznost, topografija, mehan- ske lastnosti, hitrost razpada in privze- ma vode, reološke lastnosti materialov), da bi ti popolnoma posnemali lastnosti izvornega tkiva. Razvoj hidrogelnih for- mulacij, na podlagi katerih bi bilo mož- no izdelati dolgoročno stabilne celične nosilce in katerim bi lahko dodatno po- ljubno prilagajali želene lastnosti (npr. viskozno-elastične, mehanske, površin- ske), bi pomenil izjemen napredek na področju izgradnje naprednih modelov in vitro (60). 82 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 5 3D tisk za izgradnjo in vitro modelov Kljub vsem tehnološkim napredkom na področju TI pa ostaja razvoj fiziolo- ško relevantnih tkiv, posebej trebušne slinavke, še naprej težaven. Zaradi ome- jitve v difuziji kisika in hranil je izgradnja konstruktov, večjih od 200 µm, izredno problematična (25). Napredovanje k iz- gradnji večjih tkivnih konstruktov zavi- ra dejstvo, da je treba v nosilec vključiti funkcionalnost žilja za zagotavljanje in izboljšanje prenosa kisika in hranil do celic, hkrati pa spodbujati odstranjeva- nje njihovih odpadnih snovi. Izgradnja 3D mrež žilja znotraj tkivnih konstruk- tov igra ključno vlogo pri dolgoročnem preživetju in ohranjanju viabilnosti celic v modelih in vitro (61,62). Do danes raz- iskovalcem še ni uspelo razviti celičnih nosilcev za izgradnjo modelov mehkih tkiv in vitro, ki bi izkazovali hkrati ustre- zno ločljivost, strukturno integriteto in zahtevano biološko kompatibilnost (63). Več TI pristopov (64-67) so razvili zato, da bi te težave odpravili, vendar se jih večina omejuje na indiciranje angioge- neze in vitro. Poleg tega, da takšni pris- topi zahtevajo dolgotrajno inkubacijo za formiranje žilja in tudi uporabo dragih rastnih dejavnikov (npr. angl. vascular endothelial growth factor, VEGF), je nji- hova osrednja pomanjkljivost omejena ponovljivost ter nezmožnost prostorske- ga nadziranja razporeditve žilja znotraj konstrukta, ki pogosto sploh ne omogo- či perfuzije. Zadnja leta se pogosteje za proizvodnjo celičnih nosilcev na osnovi biološko kompatibilnih materialov, na- prednih modelov in vitro in tkivnih kon- struktov z vključenim žiljem uporabljajo aditivni pristopi, kot je 3D tisk (68). Pri tem se različne tehnike aditivne proi- zvodnje razvijajo in uporabljajo hkrati (npr. litografske tehnike, t.i. tisk ink-jet, mikroekstruzijske metode) za izgradnjo 3D celičnih nosilcev, ki bolje posnemajo arhitekturo, biokemijo in funkcional- nost izvornih tkiv. Posamezne tehnike izkazujejo določene prednosti in slabosti (52). Med njimi 3D biotisk predstavlja novo in najobetavnejšo uporabljeno me- todo, za katero se pričakuje, da bo narav- nost revolucionalizirala področje izgra- dnje naprednih modelov in vitro. Poleg zmožnosti hkratne uporabe velikega nabora biološko kompatibilnih materia- lov in izjemne vsestranskosti apliciranja (69,70) 3D biološki tiskalnik omogo- ča nalaganje materiala z mikrometrsko prostorsko ločljivostjo (71) pri pogojih, ki so celicam prijazni, kot so npr. nizke strižne sile (72,73). To daje 3D tiskalniku veliko prednost pred ostalimi konvenci- onalnimi tehnikami za pripravo celičnih nosilcev, ki jih pogosto omejuje prav nadziranje 3D oblike, prostorska posta- vitev posameznih komponent materiala in s tem lokalna porazdelitev gostote na- nosa materiala in celic (74). 5.1 Tehnika 3D tiska core/ shell za izgradnjo naprednih modelov in vitro Kot smo že omenili, je za razvoj več- jih in fiziološko kompleksnejših mode- lov in vitro izrednega pomena izgradnja celičnih nosilcev, ki omogočajo nemoten pretok celičnega medija ali celo posne- majo osnovno funkcionalnost svetline žile. Verjetno najboljši in najenostav- nejši pristop k izgradnji 3D tiskanega pretočnega modela in vitro je vključitev povezane mreže votlih kanalov v notran- josti tkivnega nosilca. Izgradnja takšne- ga biološkega nosilca bi zmanjšala verje- tnost za nastajanje nekrotičnih območij v konstruktu in rešila tudi številne druge že omenjene pomanjkljivosti dosedanjih modelov (73). V votle kanale nosilcev 83 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke lahko dodatno naselimo endotelne ce- lice, s čimer dobe zmožnost posnema- ti sintetične žile v 3D tkivnih modelih (75). Poleg že omenjene olajšane difu- zije kisika, dotoka hranil, nemotene- ga odstranjevanja CO2 in presnovkov lahko takšne svetline kanalov glede na specifiko in vitro gojenega tkiva izpol- njujejo tudi druge pomembne fiziološke naloge. Pri modelih endokrinih tkiv in vitro omogočajo zbiranje sekreta in oce- no sekrecijske funkcije konstrukta, pri eksokrinih tkivih pa odvajanje sekreta in njegovo zbiranje za kvantificiranje. Za izgradnjo naprednega 3D modela in vitro celotne trebušne slinavke, ki bi vključeval tako endokrini kot eksokrini del, je treba v biološki nosilec poleg svet- lin, kamor endokrine celice izločajo svoj sekret, dodatno vključiti tudi duktuse za odvajanje encimov, ker bi aktiviranje le-teh lahko vodilo v avtodigestijo ozi- roma sprožilo celo pankreatitis in vitro gojenega tkiva. Nedavno je veliko pozornosti pri- tegnila nova različica metode 3D tiska votlih kanalov (t. i. tisk core/shell) (76- 79), saj obljublja hitro, enostavno in ponovljivo izgradnjo stabilnih celičnih nosilcev z vgrajenimi pretočnimi kanali. Z uporabo koaksialne šobe omogoča t.i. tisk core/shell sočasno 3D tiskanje dveh materialov, pri čemer se eden iztisne kot jedrni filament (angl. core), drugi pa kot ovoj okoli prvega (angl. shell). Tehnika odpira možnost, da z izbiro bioloških materialov z različnimi mehanskimi la- stnostmi trši material med tiskom in po njem strukturno podpira mehkejšega. Če za izgradnjo nosilca uporabimo ma- terial, ki ga je možno kemijsko zamrežiti (npr. alginat) ter ga iztisnemo kot ovoj, v jedro pa hkrati iztisnemo zamreževalec (npr. CaCl2), se potem v enem samem procesnem koraku lahko izgradi celo sta- bilen biološki nosilec z votlimi filamenti (80). Koaksialni tisk so že uporabili za izgradnjo nosilcev s čvrstimi (81), t.i. core/shell (82) in votlimi filamenti (83). Toda uporabljenih materialov še niso optimizirali za sočasno celično viabil- nost in celo mehansko robustnost kon- struktov. Ne glede na vse prednosti tako navadnega 3D tiska kot t.i. core/shell še vedno predstavlja velik izziv, kako razvi- ti ustrezne materialne formulacije (angl. ink), ki izkazujejo hkrati vse potrebne lastnosti, primerne za 3D tiskanje, in iz- polnjujejo vse biološke zahteve (84). 6 Tkivna rezina kot model trebušne slinavke in vitro Zaradi doslej prikazanih številnih omejitev in zahtevnosti izgradnje dobrih 3D modelov trebušne slinavke, ker ima ta organ kompleksno zgradbo in delova- nja (28,85), se za bazične in translacijske študije trebušne slinavke še vedno veči- noma uporabljajo izolirane endokrine celice, predvsem celice beta, izolirane acinarne celice, izolirani Langerhanso- vi otočki in izolirani duktusi in acinusi (86,87). Rezultati teh raziskav se pogosto dopolnjujejo z različnimi meritvami in vivo na ravni celotnega organizma (88). Pomemben korak k čim boljšemu 3D modelu za tkivo trebušne slinavke, ki je alternativen v številnih pogledih, deloma pa tudi dopolnjuje razvoj 3D modelov s pomočjo različnih nosilcev in 3D tiska, so pred kratkim razvili in vedno pogo- steje uporabljajo metodo tkivne rezine trebušne slinavke (86,89). Pri tej metodi se z mikrotomom nare- že tkivo trebušne slinavke različnih vrst modelnih organizmov (najpogosteje mi- ši, lahko tudi podgane ali prašiča) ali člo- veka na tkivne rezine, debeline približno 100 mikrometrov. Ob tem se za razliko od izoliranja celic in otočkov ne uporabljajo encimi, ampak le minimalni mehanski 84 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 stres zaradi rezanja. Tkivne rezine vse- bujejo brezhibne Langerhansove otočke, prerezane Langerhansove otočke, velika področja brezhibnih acinusov in dolge odseke duktusov različnih velikostnih redov. Ena najpomembnejših lastnosti tako pridobljenih tkivnih rezin je, da so celice znotraj Langerhansovih otočkov in znotraj acinusov med seboj povezane z različnimi medceličnimi stiki, hkrati pa je ohranjeno parakrino medseboj- no delovanje znotraj endokrinega dela, znotraj eksokrinega dela in med obema deloma. V večji meri kot pri izoliranju otočkov in acinusov so tudi ohranjene žile, bazalna membrana, vezivne ovoj- nice, imunske celice in drugi elementi mezenhima, s tem pa 3D zgradba tkiva (86,87,90,91). Akutna rezina trebušne slinavke je tako posebna oblika primar- ne celične kulture, ki se lahko brez po- sebnih dodatnih nosilcev uporablja vsaj 24–48 ur (87,92). V kombinaciji z elektrofiziološkimi meritvami, meritvami koncentracije znotrajceličnih kalcijevih ionov, meritva- mi sekrecije in različnimi morfološkimi meritvami se je pokazalo, da je metoda tkivne rezine po rezultatih in ponovlji- vosti vsaj enakovredna metodam izoli- ranja celic in otočkov oziroma acinusov (93-99). V številnih pogledih pa tkivna rezina omogoča bolj fiziološke podatke, predvsem ko gre za oceno komunikacije med različnimi celicami (37,100-102). Dodatna pomembna prednost metode tkivne rezine je, da je dobro združljiva s številnimi različnimi modelnimi or- ganizmi s fluorescenčno označenimi celicami, ki nas zanimajo, hkrati pa tudi z modeli za sladkorno bolezen, ki vodi- jo v propadanje večine celic beta (npr. streptozotocinski model) in tako niso združljivi z izoliranjem celic ali otočkov, saj v teh primerih dobimo premalo izo- lata (103,104). Rezultati morfoloških in funkcionalnih meritev v rezini postajajo zlati standard na tem področju, hkrati pa tudi pomembna referenca za meritve v drugih 3D modelih. Končno naj poudarimo, da se v zad- njem času tkivne rezine uporabljajo tudi v kombinaciji s posebnimi nosilci, ki po- daljšajo življenjsko dobo rezine ex vivo in njeno uporabnost za študije vsaj do enega tedna (87). Pri uporabi človeškega tkiva se predvideva, da bodo nosilci mo- rali omogočiti prenos tkiva v trajanju več dni, da se le-to lahko uporabi v študijah v tistih delih sveta, kjer ni lokalnega vi- ra človeškega tkiva oziroma za meritve v specializiranih laboratorijih z metoda- mi, ki niso na voljo na mestu vira člo- veškega tkiva. Predvidevamo, da se bo večji ali manjši del tkiva iz rezine lahko v prihodnje uporabil tudi za izgradnjo 3D modelov s pomočjo že omenjenih naprednih materialov in tehnik kombi- niranja celic s temi materiali (60). 7 Pogled v prihodnost Kljub izjemnim napredkom tako v širši interdisciplinarni domeni tkivnega inženirstva kot na ožjem področju mo- delov in vitro trebušne slinavke čakajo obe področji še vedno številni problemi, ki jih je potrebno premostiti. Trenutni najnaprednejši modeli 3D in vitro posne- majo le osnovne funkcije posameznih tkiv in organov, zato se kljub pomanj- kljivostim kot zlati standard za izvajanje bazičnih študij (še posebej pri trebušni slinavki) uporabljajo tkivne rezine. Ko- rak v pravo smer pomeni razvoj dveh na videz nepovezanih področij mikrofluidi- ke in proizvodnje računalniških mikro- čipov. T. i. organi-na-čipu so celične kul- ture, gojene na naprednih mikrofluidnih napravah (105). S tehnikami proizvo- dnje mikročipov (npr. mehke litografije) (106) je mogoče z visoko natančnostjo 85 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke izdelati pretočne nosilce, ki bolje posne- majo fizikalno-kemijske (koncentracij- ski gradienti plinov in hranilnih snovi), strukturne (nano-topologija) in bioke- mijske dražljaje (koncentracijski gra- dienti biološko aktivnih molekul) tkiv, ki jih posnemajo. Poleg tega se celice v takšnih napravah ne gojijo v statičnem okolju celičnih posod ali 3D bionosil- cev, ampak so neprekinjeno izpostavlje- ne pretoku celičnega medija. Perfuzija medija posnema ključne fizikalno-ke- mijske dražljaje (nastanek strižnih sil in koncentracijskih gradientov), ki so jim celice izpostavljene v izvornem okolju. Hkrati pa olajša difuzijo kisika in hranil ter omogoča odstranjevanje odpadnih produktov (107). Celice Langerhansove- ga otočka, gojene v takšnem mikroflui- dnem okolju, so npr. pokazale pravilnej- šo morfologijo in izboljšano viabilnost v primerjavi s statičnimi kulturami. Do- datno pa so celice beta ob stimuliranju z glukozo dlje časa ohranile ustrezno dinamiko izločanja inzulina (108,109). Prihodnje raziskave na področju or- ganov-na-čipu se bodo osredinjale na funkcionalno povezavo posameznih or- ganov in na razvoj t. i. telesa-na-čipu ter dodatno sklopitev sistema z mikrosen- zorji. To ne bo omogočalo zgolj vpog- leda v delovanje in odzive posameznih celic, ampak tudi v kompleksno signali- ziranje in komuniciranje med različnimi tkivi in organi v stvarnem času. S tem se bodo med drugim odprle številne nove možnosti v farmakoloških in toksiko- loških študijah, omogočal naprednejši in ciljni razvoj zdravilnih učinkovin, pa tudi razvoj modelov bolezni z vplivom na več organov hkrati (110). Trenuten razvoj nakazuje, da bodo sočasni razvoj (1) naprednih materialov z dinamično prilagodljivimi mehanskimi, fizikalno- -kemijskimi in strukturnimi lastnostmi, (2) natančnejših metod mikroaditivne proizvodnje za izgradnjo kompleksnej- ših bionosilcev (3) ter uporaba novih celičnih virov in (4) optimiziranje po- gojev gojenja celičnih kultur, vodili do izgradnje naprednih modelov in vitro, ki bodo popolnoma in reprezentativno po- snemali hierarhično strukturo in funkci- onalnost tkiv ali organov in vivo. 8 Zahvala Avtorji se zahvaljujemo Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slo- venije za finančno pomoč v okviru pro- grama Mladih raziskovalcev in v okviru pogodb P-0036, P3-0396, I0-0029, N3- 0048, N3-0133, J3-9289 ter J3-1762. Literatura 1. Seok J, Warren HS, Cuenca AG, Mindrinos MN, Baker HV, Xu W, et al.; Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(9):3507-12. DOI: 10.1073/ pnas.1222878110 PMID: 23401516 2. Langer R, Vacanti J. Advances in tissue engineering. J Pediatr Surg. 2016;51(1):8-12. DOI: 10.1016/j. jpedsurg.2015.10.022 PMID: 26711689 3. Atala A, Kasper FK, Mikos AG. Engineering complex tissues. Sci Transl Med. 2012;4(160):160rv12. DOI: 10.1126/scitranslmed.3004890 PMID: 23152327 4. Khademhosseini A, Vacanti JP, Langer R. Progress in tissue engineering. Sci Am. 2009;300(5):64-71. DOI: 10.1038/scientificamerican0509-64 PMID: 19438051 5. Wobma H, Vunjak-Novakovic G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Eng Part B Rev. 2016;22(2):101-13. DOI: 10.1089/ten.teb.2015.0535 PMID: 26714410 86 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 6. Park KM, Shin YM, Kim K, Shin H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Eng Part B Rev. 2018;24(5):327-44. DOI: 10.1089/ten.teb.2018.0027 PMID: 29652594 7. Skelin M, Rupnik M, Cencic A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 2010;27(2):105-13. DOI: 10.14573/altex.2010.2.105 PMID: 20686743 8. Nestor CE, Ottaviano R, Reinhardt D, Cruickshanks HA, Mjoseng HK, McPherson RC, et al. Rapid reprogramming of epigenetic and transcriptional profiles in mammalian culture systems. Genome Biol. 2015;16(1):11. DOI: 10.1186/s13059-014-0576-y PMID: 25648825 9. Horvath P, Aulner N, Bickle M, Davies AM, Nery ED, Ebner D, et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(11):751-69. DOI: 10.1038/nrd.2016.175 PMID: 27616293 10. Singh VK, Kumar N, Kalsan M, Saini A, Chandra R. Mechanism of induction: induced pluripotent stem cells (iPSCs). J Stem Cells. 2015;10(1):43-62. PMID: 26665937 11. Wills QF, Boothe T, Asadi A, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ, et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 2016;8(2):48-56. DOI: 10.1080/19382014.2016.1150664 PMID: 26909740 12. de Lázaro I, Yilmazer A, Kostarelos K. Induced pluripotent stem (iPS) cells: a new source for cell-based therapeutics? J Control Release. 2014;185:37-44. DOI: 10.1016/j.jconrel.2014.04.011 PMID: 24746625 13. Elliott NT, Yuan F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. J Pharm Sci. 2011;100(1):59-74. DOI: 10.1002/jps.22257 PMID: 20533556 14. Breslin S, O’Driscoll L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 2013;18(5-6):240-9. DOI: 10.1016/j.drudis.2012.10.003 PMID: 23073387 15. Knight E, Przyborski S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. J Anat. 2015;227(6):746-56. DOI: 10.1111/joa.12257 PMID: 25411113 16. Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 2014;12(4):207-18. DOI: 10.1089/adt.2014.573 PMID: 24831787 17. Caddeo S, Boffito M, Sartori S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Front Bioeng Biotechnol. 2017;5:40. DOI: 10.3389/fbioe.2017.00040 PMID: 28798911 18. Mattei G, Giusti S, Ahluwalia A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes (Basel). 2014;2(3):548-69. DOI: 10.3390/pr2030548 19. Di Nardo P, Minieri M, Ahluwalia A. Engineering the Stem Cell Niche and the Differentiative Micro-and Macroenvironment: Technologies and Tools for Applying Biochemical, Physical and Structural Stimuli and Their Effects on Stem Cells. In: Artmann GM, Minter S, Hescheler J, eds. Stem Cell Engineering. Berlin: Heidelberg: Springer; 2011. pp. 41-59. 20. Lee K, Silva EA, Mooney DJ. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 2011;8(55):153-70. DOI: 10.1098/rsif.2010.0223 PMID: 20719768 21. Tayalia P, Mooney DJ. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Adv Mater. 2009;21(32- 33):3269-85. DOI: 10.1002/adma.200900241 PMID: 20882497 22. Huch M, Koo BK. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 2015;142(18):3113-25. DOI: 10.1242/dev.118570 PMID: 26395140 23. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165(7):1586-97. DOI: 10.1016/j. cell.2016.05.082 PMID: 27315476 24. Dutta D, Heo I, Clevers H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends Mol Med. 2017;23(5):393-410. DOI: 10.1016/j.molmed.2017.02.007 PMID: 28341301 25. Lovett M, Lee K, Edwards A, Kaplan DL. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 2009;15(3):353-70. DOI: 10.1089/ten.teb.2009.0085 PMID: 19496677 26. Skelin Klemen M, Dolenšek J, Slak Rupnik M, Stožer A. The triggering pathway to insulin secretion: functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 2017;9(6):109-39. DOI: 10.1080/19382014.2017.1342022 PMID: 28662366 27. Röder PV, Wu B, Liu Y, Han W. Pancreatic regulation of glucose homeostasis. Exp Mol Med. 2016;48(3):e219. DOI: 10.1038/emm.2016.6 PMID: 26964835 28. Dolenšek J, Rupnik MS, Stožer A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 2015;7(1):e1024405. DOI: 10.1080/19382014.2015.1024405 PMID: 26030186 29. Stožer A. Pancreas Physiology and Pathophysiology in Tissue Slices. Gastroenterolog. 2017;21(Suppl 3):68-73. 30. Tuomi T, Santoro N, Caprio S, Cai M, Weng J, Groop L. The many faces of diabetes: a disease with increasing heterogeneity. Lancet. 2014;383(9922):1084-94. DOI: 10.1016/S0140-6736(13)62219-9 PMID: 24315621 31. Stožer A, Hojs R, Dolenšek J. Beta Cell Functional Adaptation and Dysfunction in Insulin Resistance and the Role of Chronic Kidney Disease. Nephron. 2019;143(1):33-7. DOI: 10.1159/000495665 PMID: 30650405 87 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke 32. Drong AW, Lindgren CM, McCarthy MI. The genetic and epigenetic basis of type 2 diabetes and obesity. Clin Pharmacol Ther. 2012;92(6):707-15. DOI: 10.1038/clpt.2012.149 PMID: 23047653 33. Gupta D, Krueger CB, Lastra G. Over-nutrition, obesity and insulin resistance in the development of β-cell dysfunction. Curr Diabetes Rev. 2012;8(2):76-83. DOI: 10.2174/157339912799424564 PMID: 22229253 34. King A, Bowe J. Animal models for diabetes: understanding the pathogenesis and finding new treatments. Biochem Pharmacol. 2016;99:1-10. DOI: 10.1016/j.bcp.2015.08.108 PMID: 26432954 35. Harcourt BE, Penfold SA, Forbes JM. Coming full circle in diabetes mellitus: from complications to initiation. Nat Rev Endocrinol. 2013;9(2):113-23. DOI: 10.1038/nrendo.2012.236 PMID: 23296171 36. Rees DA, Alcolado JC. Animal models of diabetes mellitus. Diabet Med. 2005;22(4):359-70. DOI: 10.1111/j.1464-5491.2005.01499.x PMID: 15787657 37. Gosak M, Markovič R, Dolenšek J, Rupnik MS, Marhl M, Stožer A, et al. Network science of biological systems at different scales: a review. Phys Life Rev. 2018;24:118-35. DOI: 10.1016/j.plrev.2017.11.003 PMID: 29150402 38. Sharon N, Chawla R, Mueller J, Vanderhooft J, Whitehorn LJ, Rosenthal B, et al. A Peninsular Structure Coordinates Asynchronous Differentiation with Morphogenesis to Generate Pancreatic Islets. Cell. 2019;176(4):790-804.e13. DOI: 10.1016/j.cell.2018.12.003 PMID: 30661759 39. Bonnans C, Chou J, Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(12):786-801. DOI: 10.1038/nrm3904 PMID: 25415508 40. Petersen OW, Rønnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(19):9064-8. DOI: 10.1073/pnas.89.19.9064 PMID: 1384042 41. Ilieva A, Yuan S, Wang RN, Agapitos D, Hill DJ, Rosenberg L. Pancreatic islet cell survival following islet isolation: the role of cellular interactions in the pancreas. J Endocrinol. 1999;161(3):357-64. DOI: 10.1677/ joe.0.1610357 PMID: 10333538 42. Li W, Lee S, Ma M, Kim SM, Guye P, Pancoast JR, et al. Microbead-based biomimetic synthetic neighbors enhance survival and function of rat pancreatic β-cells. Sci Rep. 2013;3(1):2863. DOI: 10.1038/srep02863 PMID: 24091640 43. Mao GH, Chen GA, Bai HY, Song TR, Wang YX. The reversal of hyperglycaemia in diabetic mice using PLGA scaffolds seeded with islet-like cells derived from human embryonic stem cells. Biomaterials. 2009;30(9):1706-14. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2008.12.030 PMID: 19135250 44. Nagata N, Gu Y, Hori H, Balamurugan AN, Touma M, Kawakami Y, et al. Evaluation of insulin secretion of isolated rat islets cultured in extracellular matrix. Cell Transplant. 2001;10(4-5):447-51. DOI: 10.3727/000000001783986549 PMID: 11549070 45. Maver T, Gradišnik L, Kurečič M, Hribernik S, Smrke DM, Maver U, et al. Layering of different materials to achieve optimal conditions for treatment of painful wounds. Int J Pharm. 2017;529(1-2):576-88. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2017.07.043 PMID: 28723409 46. Wex C, Fröhlich M, Brandstädter K, Bruns C, Stoll A. Experimental analysis of the mechanical behavior of the viscoelastic porcine pancreas and preliminary case study on the human pancreas. J Mech Behav Biomed Mater. 2015;41:199-207. DOI: 10.1016/j.jmbbm.2014.10.013 PMID: 25460416 47. Tibbitt MW, Anseth KS. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 2009;103(4):655-63. DOI: 10.1002/bit.22361 PMID: 19472329 48. Chang H-I, Wang Y. Cell responses to surface and architecture of tissue engineering scaffolds. London: IntechOpen Limited; 2011. DOI: 10.5772/21983 49. Tuch BE, Gao SY, Lees JG. Scaffolds for islets and stem cells differentiated into insulin-secreting cells. Front Biosci. 2014;19(1):126-38. DOI: 10.2741/4199 PMID: 24389176 50. Khorsandi L, Khodadadi A, Nejad-Dehbashi F, Saremy S. Three-dimensional differentiation of adipose- derived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 2015;361(3):745-53. DOI: 10.1007/s00441-015-2140-9 PMID: 25795142 51. Aloysious N, Nair PD. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Eng Part A. 2014;20(9-10):1508-22. DOI: 10.1089/ten.tea.2012.0615 PMID: 24359126 52. Murphy SV, Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 2014;32(8):773-85. DOI: 10.1038/ nbt.2958 PMID: 25093879 53. Baptista PM, Orlando G, Mirmalek-Sani SH, Siddiqui M, Atala A, Soker S. Whole organ decellularization - a tool for bioscaffold fabrication and organ bioengineering. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2009;2009:6526-9. DOI: 10.1109/IEMBS.2009.5333145 PMID: 19964173 54. Berger C, Bjørlykke Y, Hahn L, Mühlemann M, Kress S, Walles H, et al. Matrix decoded - A pancreatic extracellular matrix with organ specific cues guiding human iPSC differentiation. Biomaterials. 2020;244:119766. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2020.119766 PMID: 32199284 88 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 55. Kim J, Shim IK, Hwang DG, Lee YN, Kim M, Kim H, et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue- derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. J Mater Chem B Mater Biol Med. 2019;7(10):1773-81. DOI: 10.1039/C8TB02787K PMID: 32254919 56. Sullivan DC, Mirmalek-Sani SH, Deegan DB, Baptista PM, Aboushwareb T, Atala A, et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 2012;33(31):7756-64. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2012.07.023 PMID: 22841923 57. Lee VK, Dai G. Printing of Three-Dimensional Tissue Analogs for Regenerative Medicine. Ann Biomed Eng. 2017;45(1):115-31. DOI: 10.1007/s10439-016-1613-7 PMID: 27066784 58. Utech S, Boccaccini AR. A review of hydrogel-based composites for biomedical applications: enhancement of hydrogel properties by addition of rigid inorganic fillers. J Mater Sci. 2016;51(1):271-310. DOI: 10.1007/s10853-015-9382-5 59. Do AV, Khorsand B, Geary SM, Salem AK. 3D Printing of Scaffolds for Tissue Regeneration Applications. Adv Healthc Mater. 2015;4(12):1742-62. DOI: 10.1002/adhm.201500168 PMID: 26097108 60. Milojević M, Gradišnik L, Stergar J, Skelin Klemen M, Stožer A, Vesenjak M, et al. Development of multifunctional 3D printed bioscaffolds from polysaccharides and NiCu nanoparticles and their application. Appl Surf Sci. 2019;488:836-52. DOI: 10.1016/j.apsusc.2019.05.283 61. Rouwkema J, Rivron NC, van Blitterswijk CA. Vascularization in tissue engineering. Trends Biotechnol. 2008;26(8):434-41. DOI: 10.1016/j.tibtech.2008.04.009 PMID: 18585808 62. Bae H, Puranik AS, Gauvin R, Edalat F, Carrillo-Conde B, Peppas NA, et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 2012;4(160). DOI: 10.1126/scitranslmed.3003688 PMID: 23152325 63. Štumberger G, Vihar B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials (Basel). 2018;11(12):2529. DOI: 10.3390/ma11122529 PMID: 30545119 64. Ibrahim M, Richardson MK. Beyond organoids: in vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reprod Toxicol. 2017;73:292-311. DOI: 10.1016/j.reprotox.2017.07.002 PMID: 28697965 65. Sorrell JM, Baber MA, Caplan AI. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Eng Part A. 2009;15(7):1751-61. DOI: 10.1089/ten.tea.2008.0254 PMID: 19196139 66. Davies NH, Schmidt C, Bezuidenhout D, Zilla P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Eng Part A. 2012;18(1-2):26-34. DOI: 10.1089/ten.tea.2011.0192 PMID: 21895488 67. Li X, He J, Zhang W, Jiang N, Li D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials (Basel). 2016;9(11):909. DOI: 10.3390/ma9110909 PMID: 28774030 68. Maver T, Smrke D, Kurečič M, Gradišnik L, Maver U, Kleinschek KS. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. J Sol-Gel Sci Technol. 2018;88(1):1-16. DOI: 10.1007/s10971-018-4630-1 69. Hinton TJ, Jallerat Q, Palchesko RN, Park JH, Grodzicki MS, Shue HJ, et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 2015;1(9):e1500758. DOI: 10.1126/sciadv.1500758 PMID: 26601312 70. Rocca M, Fragasso A, Liu W, Heinrich MA, Zhang YS. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technol. 2018;23(2):154-63. DOI: 10.1177/2472630317742071 PMID: 29132232 71. Derby B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 2012;338(6109):921-6. DOI: 10.1126/ science.1226340 PMID: 23161993 72. Kolesky DB, Truby RL, Gladman AS, Busbee TA, Homan KA, Lewis JA. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-30. DOI: 10.1002/ adma.201305506 PMID: 24550124 ; 2014. 73. Huang Y, Zhang XF, Gao G, Yonezawa T, Cui X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnol J. 2017;12(8):1600734. DOI: 10.1002/biot.201600734 PMID: 28675678 74. Nakamura M, Iwanaga S, Henmi C, Arai K, Nishiyama Y. Biomatrices and biomaterials for future developments of bioprinting and biofabrication. Biofabrication. 2010;2(1):014110. DOI: 10.1088/1758- 5082/2/1/014110 PMID: 20811125 75. Hoch E, Tovar GE, Borchers K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. Eur J Cardiothorac Surg. 2014;46(5):767-78. DOI: 10.1093/ejcts/ezu242 PMID: 24970571 76. Yeo M, Lee JS, Chun W, Kim GH. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 2016;17(4):1365-75. DOI: 10.1021/acs.biomac.5b01764 PMID: 26998966 77. Liu W, Zhong Z, Hu N, Zhou Y, Maggio L, Miri AK, et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 2018;10(2):024102. DOI: 10.1088/1758-5090/aa9d44 PMID: 29176035 78. Gao Q, He Y, Fu JZ, Liu A, Ma L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 2015;61:203-15. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2015.05.031 PMID: 26004235 89 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke 79. Akkineni AR, Ahlfeld T, Lode A, Gelinsky M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 2016;8(4):045001. DOI: 10.1088/1758-5090/8/4/045001 PMID: 27716641 80. Milojević M, Vihar B, Banović L, Miško M, Gradišnik L, Zidarič T, et al. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J Vis Exp. 2019(151):e59951. DOI: 10.3791/59951 PMID: 31609306 81. Colosi C, Shin SR, Manoharan V, Massa S, Costantini M, Barbetta A, et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 2016(28):677,84. DOI: 10.1002/adma.201503310 PMID: 26606883 82. Kim G, Ahn S, Kim Y, Cho Y, Chun W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. J Mater Chem. 2011;21(17):6165-72. DOI: 10.1039/c0jm03452e 83. Luo Y, Lode A, Gelinsky M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2013;2(6):777-83. DOI: 10.1002/ adhm.201200303 PMID: 23184455 84. Markstedt K, Mantas A, Tournier I, Martínez Ávila H, Hägg D, Gatenholm P. Martínez Ávila Hc, Hägg D, Gatenholm P. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose–alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules. 2015;16(5):1489-96. DOI: 10.1021/acs.biomac.5b00188 PMID: 25806996 85. Dolenšek J, Pohorec V, Rupnik MS, Stožer A. Pancreas Physiology. In: Seicean A, ed. Challenges in Pancreatic Pathology. London: IntechOpen Limited; 20017. DOI: 10.5772/65895 86. Marciniak A, Cohrs CM, Tsata V, Chouinard JA, Selck C, Stertmann J, et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 2014;9(12):2809-22. DOI: 10.1038/ nprot.2014.195 PMID: 25393778 87. Marciniak A, Selck C, Friedrich B, Speier S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 2013;8(11):e78706. DOI: 10.1371/journal. pone.0078706 PMID: 24223842 88. Speier S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Curr Diab Rep. 2011;11(5):420-5. DOI: 10.1007/s11892-011-0207-x PMID: 21701794 89. Speier S, Rupnik M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 2003;446(5):553-8. DOI: 10.1007/s00424-003-1097-9 PMID: 12774232 90. Cohrs CM, Chen C, Jahn SR, Stertmann J, Chmelova H, Weitz J, et al. Vessel Network Architecture of Adult Human Islets Promotes Distinct Cell-Cell Interactions In Situ and Is Altered After Transplantation. Endocrinology. 2017;158(5):1373-85. DOI: 10.1210/en.2016-1184 PMID: 28324008 91. Weitz JR, Makhmutova M, Almaça J, Stertmann J, Aamodt K, Brissova M, et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 2017. PMID: 28884198 92. Meneghel-Rozzo T, Rozzo A, Poppi L, Rupnik M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic beta-cells in organotypic slices. Cell Tissue Res. 2004;316(3):295-303. DOI: 10.1007/s00441-004-0886-6 PMID: 15085425 93. Dolenšek J, Stožer A, Skelin Klemen M, Miller EW, Slak Rupnik M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 2013;8(12):e82374. DOI: 10.1371/journal.pone.0082374 PMID: 24324777 94. Stožer A, Dolenšek J, Rupnik MS. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 2013;8(1):e54638. DOI: 10.1371/journal.pone.0054638 PMID: 23358454 95. Dolenšek J, Špelič D, Klemen MS, Žalik B, Gosak M, Rupnik MS, et al. Membrane Potential and Calcium Dynamics in Beta Cells from Mouse Pancreas Tissue Slices: Theory, Experimentation, and Analysis. Sensors (Basel). 2015;15(11):27393-419. DOI: 10.3390/s151127393 PMID: 26516866 96. Skelin Klemen M, Dolenšek J, Stožer A, Rupnik M. Measuring Exocytosis in Endocrine Tissue Slices. In: Thorn P, ed. Exocytosis Methods. Humana Press; pp. 127-46. DOI: 10.1007/978-1-62703-676-4_7 97. Skelin M, Rupnik M. cAMP increases the sensitivity of exocytosis to Ca²+ primarily through protein kinase A in mouse pancreatic beta cells. Cell Calcium. 2011;49(2):89-99. DOI: 10.1016/j.ceca.2010.12.005 PMID: 21242000 98. Dolenšek J, Skelin M, Rupnik MS. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiol Res. 2011;60:S29-38. DOI: 10.33549/physiolres.932176 PMID: 21777026 99. Stozer A, Dolensek J, Skelin M, Rupnik M. Cell physiology in tissue slices: studying beta cells in the islets of Langerhans = Celicna fiziologija v tkivnih rezinah: preucevanje celic beta v Langerhansovih otockih. Acta medico-biotechnica. 2013;6(1):20-32. 100. Markovič R, Stožer A, Gosak M, Dolenšek J, Marhl M, Rupnik MS. Progressive glucose stimulation of islet beta cells reveals a transition from segregated to integrated modular functional connectivity patterns. Sci Rep. 2015;5(1):7845. DOI: 10.1038/srep07845 PMID: 25598507 90 METABOLNE IN HORMONSKE MOTNJE Zdrav Vestn | januar – februar 2021 | Letnik 90 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3001 101. Gosak M, Stožer A, Markovič R, Dolenšek J, Perc M, Rupnik MS, et al. Critical and Supercritical Spatiotemporal Calcium Dynamics in Beta Cells. Front Physiol. 2017;8(1106):1106. DOI: 10.3389/ fphys.2017.01106 PMID: 29312008 102. Stožer A, Gosak M, Dolenšek J, Perc M, Marhl M, Rupnik MS, et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLOS Comput Biol. 2013;9(2):e1002923. DOI: 10.1371/ journal.pcbi.1002923 PMID: 23468610 103. Huang YC, Rupnik M, Gaisano HY. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. J Physiol. 2011;589(Pt 2):395-408. DOI: 10.1113/jphysiol.2010.200345 PMID: 21078586 104. Huang YC, Rupnik MS, Karimian N, Herrera PL, Gilon P, Feng ZP, et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 2013;62(2):519-30. DOI: 10.2337/db11-0786 PMID: 23043159 105. Low LA, Tagle DA. Tissue chips - innovative tools for drug development and disease modeling. Lab Chip. 2017;17(18):3026-36. DOI: 10.1039/C7LC00462A PMID: 28795174 106. Duffy DC, McDonald JC, Schueller OJ, Whitesides GM. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly (dimethylsiloxane). Anal Chem. 1998;70(23):4974-84. DOI: 10.1021/ac980656z PMID: 21644679 107. Takebe T, Zhang B, Radisic M. Synergistic engineering: organoids meet organs-on-a-chip. Cell Stem Cell. 2017;21(3):297-300. DOI: 10.1016/j.stem.2017.08.016 PMID: 28886364 108. Sankar KS, Green BJ, Crocker AR, Verity JE, Altamentova SM, Rocheleau JV. Culturing pancreatic islets in microfluidic flow enhances morphology of the associated endothelial cells. PLoS One. 2011;6(9):e24904. DOI: 10.1371/journal.pone.0024904 PMID: 21961048 109. Silva PN, Green BJ, Altamentova SM, Rocheleau JV. A microfluidic device designed to induce media flow throughout pancreatic islets while limiting shear-induced damage. Lab Chip. 2013;13(22):4374-84. DOI: 10.1039/c3lc50680k PMID: 24056576 110. Bhatia SN, Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 2014;32(8):760-72. DOI: 10.1038/ nbt.2989 PMID: 25093883