Zdrav Vestn 2008; 77: 615–22 615 Pregledni prispevek/Review article NOVEJŠI BIOOZNAČEVALCI IN SPREMLJANJE ZNOTRAJCELIČNIH SIGNALNIH POTI PRI AVTOIMUNSKIH BOLEZNIH NEW BIOMARKERS AND MONITORING INTRACELLULAR SIGNALING PATHWAYS IN AUTOIMMUNE DISEASES Aleš Goropevšek,1, 3 Evgenija Homšak,2, 3 Maksimiljan Gorenjak,2, 3 Ivan Malešič,2 Ivan Krajnc,1, 4 Avrelija Cencič1 1 Oddelek za biokemijo, Medicinska fakulteta Univerze v Mariboru, Slomškov trg 15, 2000 Maribor 2 Klinična biokemija, Medicinska fakulteta Univerze v Mariboru, Slomškov trg 15, 2000 Maribor 3 Oddelek za laboratorijsko diagnostiko, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor 4 Oddelek za revmatologijo, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor Izvleček Izhodišča Avtoimunske in kronične vnetne bolezni se še vedno pogosto zdravijo le z nespecifično imunosupresijo, ki ne prinaša ozdravitve. Spoznanje, da so citokini TNF in IFN-alfa bistveni v patogenezi bolezni, kot sta revmatoid-ni artritis in sistemski lupus eritematozus, pomeni napredek v razumevanju avtoimun-skih bolezni. Znotrajcelične signalne poti, ki se aktivirajo kot odgovor na te klinično pomembne citokine, prenašajo signale s kinazno fosforilacijo proteinov in so bistvene za delovanje celic imunskega sistema. Malo je znanega o spremembah teh signalnih poti pri avtoimunskih boleznih. Nedavne klinične raziskave so pokazale, da se spoznanja iz živalskih modelov ne morejo neposredno prenesti na človeka. Za spremljanje aktivnosti bolezni in napoved odziva na novejše zdravljenje je potrebno razviti nova orodja za spremljanje humanega imunskega odziva. Obetajoče orodje v prihodnosti so novo odkriti biomarkerji. Še več si obetamo od pristopov, ki temeljijo na spremljanju signalnih poti na celični ravni. Razviti so bili biokemični analizni sistemi, ki temeljijo na pretočni citometriji in omogočajo profiliranje kinaz in fosfoproteinov na ravni posameznih celic. To bo omogočilo študije signalnih poti pri avtoimunskih in kroničnih vnetnih boleznih, saj so analizni sistemi prilagojeni prav celicam imunskega sistema, npr. v periferni krvi. Prvi rezultati kažejo značilne fosfo-signature citokinov (interferonov) v imunskih celicah bolnikov s SLE. Možnost spremljanja signalnih poti na celični ravni lahko prinese razvoj novih diagnostičnih možnosti, predvsem za spremljanje aktivnosti bolezni in vodenja zdravljenja. Rezultati študij pa lahko nakažejo tudi nove tarče, bolj specifičnega in manj toksičnega, zdravljenja z inhibitorji kinaz. Ključne besede SLE; pretočna citometrija; citokinske signalne poti; IFN-alfa Zaključki Abstract Background Almost all current therapeutic concepts in many autoimmune and chronic inflammatory diseases are based on the systemic suppression of immune functions and are not curative. Identification of cytokines TNF and IFN-alpha as major factors in the pathogenesis of Avtor za dopisovanje / Corresponding author: Aleš Goropevšek, dr. med., Oddelek za laboratorijsko diagnostiko, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor, e-mail: ales.goropevsek@ukc-mb.si 616 Zdrav Vestn 2008; 77 diseases such as rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus (SLE) represent a substantial improvement in understanding of autoimmune diseases. Intracellular signalling pathways that are activated in response to those clinically relevant cytokines, mediate signals through kinase phosphorylation of proteins and are at the core of immune cell function. However, little is known about their changes in autoimmune disease states. Recent trials emphasized the importance of directly assessing the human immune responses, and that not all of what we learn for example in the mouse can be directly translated to humans. Thus, there is a need for the development of tools and assays to directly assess the human immune system, and to predict its responses to novel therapeutic entities. Newly discovered biomarkers represent promising tools. Even more promising are approaches, that are based on monitoring immune signaling on the single cell level. Conclusions A series of assay systems for flow cytometric-based biochemical analysis at the single-cell level for kinase and phosphoprotein profiling have been developed.This will give us opportunity to study signal pathways also in autoimmune and chronic inflammatory diseases, as the analysing systems are adapted to immunocytes for example in peripheral blood. First results show characteristic phospho-signature of cytokines (interferons) in immune cells from SLE patients. Monitoring signaling pathways on the single cell level can lead to developments in new diagnostic tools, especially in monitoring of disease activity. Results can also identify new targets of more specific and less toxic therapy with kinase inhibitors. Key words SLE; flow cytometry; cytokine signalling; IFN-alpha IFN-y Uvod , L7%. g~T%, Kronične vnetne bolezni so eno glavnih zdravstvenih bremen človeštva. Njihovo zdravljenje, posebej sistemskih vezivno-tkivnih bolezni, pa še vedno temelji na nespecifični sistemski imunosupresiji (kortiko-steroidi, citostatiki), ki s seboj prinaša številne stranske učinke in resne zaplete. Poleg tega pogosto nimajo zanesljivih kazalcev aktivnosti bolezni, ki bi jih lahko uporabili pri vodenju toksičnega zdravljenja.1 Z razvojem na področju imunologije in s spoznanjem, da so citokini, kot posredniki med imunskimi celicami, bistveni v razvoju avtoimunskih bolezni, se je začelo novo obdobje v zdravljenju teh bolezni. Citokin TNF-alfa je bistven dejavnik v patogenezi revmato-idnega artritisa. Nedavna uvedba blokatorjev-TNF alfa (protiteles in receptorjev) v zdravljenje je pomenila bolj specifično ciljano zaviranje revmatičnega vnetja.2 Za napredek v zdravljenju avtoimunskih bolezni pa bo, razen blokade izločenih molekul, potrebno boljše poznavanje mehanizmov delovanja celic, ki omenjene mediatorje izločajo in se na njih odzivajo. Neravnotežja med regulacijskimi T celicami, Th1, Th2 in Th17 odgovorom, povezana z B-celičnimi nepravilnostmi, najdemo v etiologiji večine avtoimunskih bolezni.35 Vzrok disfunkcij teh imunskih celic pa leži v celičnih signalnih sistemih, ki so osnova za njihovo delovanje. V zadnjih dveh desetletjih so raziskave na tem področju nakazale pomembnost številnih znotrajceličnih signalnih poti, ki vodijo od površinskih receptorjev do genskega uravnavanja.6 Večina teh poti posreduje signale preko fosforilacije in defosforilacije proteinov z encimi-kinazami oz. fosfatazami. Med številnimi signalnimi potmi, pomembnimi za imunsko delovanje, so poti Jak-Stat bistvene v cito- Translokacijavjedro, vezava na zaporedje GAS / dimerizacijaSTATla STATIadimer GAS DNA transkripcija Sl. 1. Model prenosa znotrajceličnega signala po stimulaciji IFN-gama (prirejeno po Darnell et al., 1994; Kotenko et al.,1995). Simboli in okrajšave pomenijo: ?R 1 – IFN-? receptor-ekstracelularna domena, ?R 2 – IFN-? receptor-transmembranska domena, JAK1 – Janus Kinaza 1, JAK2 – Janus Kinaza 2, STAT1? – Sig-nal Transducer and Activator of Trancription. Figure 1. A model of signal transduction cascade after IFN-gamma stimulation (modified from Darnell et al., 1994; Kotenko et al.,1995). Symbols and abbreviations represent: ?R 1 – IFN-g receptor extracellular domain, ?R 2 – IFN-? receptor transmembrane domain, JAK1 – Janus Kinase 1, JAK2 – Janus Kinase 2, STAT1? – Signal Transducer and Activator of Tran-cription. Goropevšek A et al. Novejši biooznačevalci in spremljanje znotrajceličnih signalnih poti pri avtoimunskih boleznih 617 kinskem delovanju. Primer signalne poti Jak-Stat je vezava interferona gama (IFN-gama) na njegov receptor, kar sproži dimerizacijo receptorja, aktiviranje na receptor vezanih kinaz Jak1 in Jak2 in posledično fos-forilacijo proteina Stat1 na značilnem tirozinskem (tyr 701) ostanku (Sl. 1). Proteini STAT so hkrati signalne molekule in trans-kripcijski faktorji. Po fosforilaciji proteini Stat1 dime-rizirajo, sledi prenos-translokacija v jedro, kjer se z vezavo na ustrezno mesto (gama interferon activation site – GAS) aktivira prepisovanje – transkripcija IFN-reguliranih genov, kot je npr. IRF-1(IFN regulatory factor-1) (Sl. 1). Pomen neposrednega spremljanja imunskega odziva pri človeku Živalski modeli, predvsem eksperimenti z genetsko modificiranimi miškami, so v zadnjih desetletjih prinesli bistven napredek v razumevanju kompleksnih funkcij imunskega sistema. Kljub temu pa je še vedno, razen vakcinacij, zelo malo ciljanih imunoloških opcij zdravljenja imunsko pogojenih bolezni. Izjema so, poleg uporabe omenjenih TNF-alfa antagonistov, anti-CD20 monoklonska protitelsa, ki se uporabljajo pri zdravljenju B-celičnih limfomov in v zadnjem času tudi nekaterih avtoimun-skih bolezni. Nedavne klinične raziskave so jasno pokazale, da se spoznanja iz mišjih modelov ne morejo neposredno prenesti na človeka in da je pri razvoju novega imunološkega zdravljenja potrebno ocenjevati in spremljati človeški imunski odziv.7 Mišji modeli pogosto ne zagotavljajo učinkovitosti in varnosti pri prenosu spoznanj bazičnih raziskav v medicino. To se je najbolj jasno pokazalo pri nedavni tragediji v prvi fazi kliničnega testiranja t. i. CD28 superagonistov, anti-CD28 monoklonskih protiteles. Po aplikaciji anti-CD28 protiteles je pri vseh prostovoljcih v omenjenem testiranju nastal hiter sistemski vnetni odgovor, ki je pripeljal do večorganske odpo-vedi.7 CD28 je glavna kostimulacijska molekula, izražena na limfocitih T. V sodobnem razumevanju T-celične ak-tivacije sta za popolno aktivacijo mirujočih – naivnih limfocitov T, potrebna vsaj dva znotrajcelična signala, ki pripeljeta npr. do proliferacije teh celic in izločanja citokinov. Primarni signal vodi od T-celičnega re-ceptorja (TCR) po prepoznavi antigen/MHC-komple-ksov na površini antigensko predstavitvenih celic. Ta signal pa sam po sebi ni dovolj za popolno aktivacijo limfocitov T, dopolniti ga mora sekundarni signal, ki vodi od t. i. kostimulacijskih molekul, kot je CD28 (Sl. 2). Omenjena anti-CD28 protitelesa, ki so usmerjena proti zunajceličnemu epitopu na kostimulacijski molekuli – CD28, pa lahko aktivirajo limfocite T tudi brez zasedenosti TCR/CD3-kompleksa. Tako so jih poimenovali mitogena protitelesa CD28 ali superagonisti CD28. Predhodne raziskave na miših in tudi podganah so kazale celo na to, da omenjeni superagonisti CD28 povzročijo proliferacijo in ekspanzijo predvsem t. i. regulacijskih limfocitov T. Slednji so po zadnjih spoznanjih bistveni v uravnavanju, namreč zaviranju avtoimunosti. Rezultati raziskav na glodalcih so tako nakazovali tudi možnost, da je superagoniste CD28 možno uporabiti tudi pri zdravljenju avtoimunskih bolezni, kot je eksperimentalni avtoimuni encefalomi-elitis in adjuvantni artritis.8 Sl. 2. Shema T-celične aktivacije: za popolno aktivaci-jo sta potrebna vsaj 2 signala: preko T-celičnega re-ceptorja (TCR) in kostimulacijske molekule (CD28). Figure 2. T cell activation: at least 2 signals are needed to fully activate T cells: through T cell receptor (TCR) and costimulation molecules (CD28). Pri ljudeh v omenjeni raziskavi pa je aplikacija super-agonista CD28 pripeljala do izrazitega sistemskega vnetnega odgovora s tvorbo provnetnih citokinov v t. i. citokinskem viharju (cytokine storm). Šele kasnejše in vitro raziskave na človeških limfocitih T so pokazale, da so znotrajcelične signalne poti, ki se aktivirajo po vezavi superagonista CD28 bistveno drugačne kot pri miših ali podganah. Še več, bistvene razlike so tudi v odzivih človeških in limfocitov T primatov, v človeku najbolj sorodnih modelih imunskega siste-ma.9 Za spremljanje aktivnosti imunsko pogojenih bolezni, kot tudi za napoved odziva na novejše zdravljenje, je potrebno razviti nova orodja in teste pri oceni in spremljanju humanega imunskega odziva. Novo odkriti biooznačevalci lahko predstavljajo obetajoče orodje v prihodnosti. Biooznačevalci Biooznačevalce lahko definiramo kot celične, biokemične, molekularne ali genetske dejavnike, s katerimi lahko normalne ali patološke biološke procese prepoznavamo in/ali spremljamo in imajo diagnostično ali prognostično vrednost. Čeprav se izraz zgodovinsko nanaša na analite v bioloških vzorcih (raziskave so še vedno osredotočene na najbolj dostopne vzorce, kot so kri, slina, urin), lahko vsako meritev, ki korelira z bolezenskim stanjem osebe ali odgovorom na zdravljenje, imenujemo biooznačevalec. Biooznače-valci so se razvili od enostavnih, posameznih laboratorijskih parametrov, v multioznačevalske genomske/ proteomske profile. Postgenomsko obdobje označuje porast hitrih tehnologij, kot so genski in proteinski čipi. Danes je večji problem od identifikacije številnih novih biooznačevalcev opredelitev njihovega pravega biološkega pomena. 618 Zdrav Vestn 2008; 77 Sistemski lupus eritematozus (SLE) Sistemski lupus eritematozus (SLE) je prototip sistemske avtoimunske bolezni, pri kateri odlaganje imunskih kompleksov pripelje do vnetja in okvare številnih različnih tkiv in organov. Označuje ga izguba B-celične tolerance in tvorba protiteles proti različnim jedrnim komponentam (histoni, nukleosomi, dsDNK).5 Za bolezen so značilne številne spremembe v imunskem sistemu, v patogenezi bolezni pa so pomembni vplivi okolja in genetski dejavniki. Zaradi pomanjkanja specifičnega zdravljenja za SLE si revmatologi želijo biooznačevalce, ki bi korelirali z aktivnostjo bolezni in bi jih bilo možno uporabiti pri vodenju zdravljenja. Bolniki pa bodo v prihodnosti od svojih zdravnikov morda želeli interpretacijo izvidov genetskih bioozna-čevalcev, s pomočjo katerih bi lahko ocenili tveganje za razvoj SLE pri njihovih potomcih. Genetski biooznačevalci pri SLE: nagnjenost k bolezni Čeprav različne mutacije posameznih genov lahko pripeljejo do lupusu podobnih fenotipov pri eksperimentalnih živalskih modelih, je humani SLE poligen-ska bolezen. Z zaključkom projekta človeškega genoma je znano zaporedje nukleotidov v človeškem genomu. Nedavni tehnološki napredek pa je prinesel še možnost hitre analize milijonov različic – polimorfizmov posameznih nukleotidov (single-nucleotide polymorfism-SNP) v genomu med posamezniki. Uporaba teh tehnologij omogoča odkritje vedno večjega števila genetskih variant, povezanih z nagnjenostjo k avtoimun-skim boleznim. Nedavno so bile zaključene tudi aso-ciacijske študije celotnega genoma (genomewide association studies) pri bolnikih s SLE.10, 11 V teh mednarodnih projektih so milijone genetskih polimorfizmov testirali pri tisočih bolnikov s SLE in še več zdravih preiskovancih. Rezultati teh študij kažejo na vpletenost številnih komponent imunskega sistema v pato-genezo SLE (Razpr. 1). Razpr. 1. Nove in potrjene genetske variante, povezane s pomembnim tveganjem za razvoj SLE v dveh aso-ciacijskih študijah celotnega genoma. Table 1. New and confirmed genetic variants conferring a significant risk of SLE in two genomewide association studies. Gen Opisana funkcija Celična lokacija IRF5 Produkcija interferona alfa (IFN-alfa) (plazmacitoidne) dendritične celice KIAA1542 Povezava z IRF7 – produkcija IFN-alfa (plazmacitoidne) dendritične celice STAT4 Signalna pot v odgovoru na citokine T in NK celice Aktivacija odgovora na IFN-alfa makrofagi PTPN22 Inhibicija limfocitne aktivacije T limfociti BLK Aktivacija – signalna pot v celici B limfociti FCGR2A Odstranjevanje imunskih kompleksov makrofagi ITGAM Adhezija levkocitov na endotel (nevtrofilni) levkociti HLA Prezentacija antigena antigensko predstavitvene celice PXK Neznan učinek serin-treonin kinaze Kažejo tudi na veliko variabilnost v genih, ki kodirajo mediatorje naravne in antigensko specifične imuno-sti, vključno s komponentami signalnih poti, ki uravnavajo limfocitno aktivacijo. Šele kombinacija neugodnih različic – polimorfizmov v teh poteh v različnih celicah imunskega sistema lahko pripelje do bolezni, kot je SLE. Učinek omenjenih polimorfizmov v fenotipu bolezni je v primerjavi z genetskimi učinki pri monogenskih boleznih, ki se dedujejo po Mendlovih zakonih, minimalen. Kljub temu pa je v porastu število podjetij, ki tudi preko spleta ponujajo vpogled v vaš genom in številne variante, ki so bile v dosedanjih raziskavah povezane z nagnjenostjo k boleznim. Na osnovi takšnega vpogleda pa vam v “izvidu” podajo tudi podatek, kolikokrat bolj ste od povprečnega človeka nagnjeni k določenim avtoimunskim boleznim. Z interpretacijo podobnih “izvidov” se bodo verjetno v prihodnosti soočili tudi zdravniki. Iskanje genetskih asociacij je seveda potrebno razumeti kot prvi korak v opredeljevanju zapletenih molekularnih poti, ki prispevajo k bolezni. Asociacijske študije celotnega genoma pri bolnikih s SLE kažejo na pomen T- in B-limfocitnih signalnih poti in poti, ki uravnavajo produkcijo in odziv na citokine (predvsem interferon alfa), v patogenezi bolezni (Razpr. 1). Šele razumevanje teh (signalnih) poti na proteinski in celični ravni lahko pripelje do novejšega zdravljenja in uporabne diagnostike za vse bolnike s SLE. Opredeljevanje mehanizmov bolezni – patogenih signalnih poti v celicah Znotrajcelične signalne poti so osnova vsakega celičnega procesa, od proliferacije, distribucije v celičnem ciklu do programirane celične smrti – apoptoze. Zno-trajcelični signali se prenašajo v kompleksnem procesu proteinsko-proteinskih interakcij, posttranslacij-skih modifikacij (npr. acetilacije in fosforilacije) in pro-teinskih translokacij. Fosforilacijo proteinov, ki jo ka-talizirajo encimi – kinaze in zavirajo fosfataze, najdemo v večini signalnih poti. Proteinske kinaze tako sodelujejo pri prenosu in procesiranju signalov – informacij o dogodkih v notranjosti celice (npr. poškodba DNK) ali dejavnikih iz okolja (npr. interakcije z drugimi celicami, citokini ali rastni faktorji). Kinaze igrajo tako bistveno vlogo pri številnih celičnih in fizioloških procesih: v metabolizmu, proliferaciji in diferenciaciji celic, homeostazi, komunikaciji med celicami in s tem v delovanju imunskega sistema.. Kinaze lahko zato predstavljajo odlično izhodiščno točko v iskanju novih biooznačevalcev in profilov oz. signatur bolezni, ki hkrati daje vpogled v biološke mehanizme bolezni. Pomen fosfosignalnih poti pri boleznih Zaradi pomembne vloge kinaz v normalni fiziologiji najdemo aberantno kinazno aktivnost v patogenezi Goropevšek A et al. Novejši biooznačevalci in spremljanje znotrajceličnih signalnih poti pri avtoimunskih boleznih 619 številnih bolezni. Večina bolezni, kot so malignomi, nevrološke in imunsko pogojene bolezni, je povezana s kinazno disfunkcijo.12–18 Aktivnost kinaze pri boleznih je lahko zmanjšana ali povečana. Pomanjkanje tirozinske kinaze JAK3 povzroča npr. imunsko pomanjkljivost – SCID (severe combined immunodeficiency), povečano konstitutivno kinazno aktivnost fu-zijskega produkta Bcr-Abl pa najdemo v patogenezi kronične mieloične levkemije – KML.16 Skladno z udeležbo kinaz v patogenezi številnih bolezni je tudi zanimanje za razvoj in terapevtsko aplikacijo farmakoloških aktivatorjev in inhibitorjev ki-naz. Številni kinazni inhibitorji se razvijajo in tudi že klinično uporabljajo. Kinaze so tako postale druga največja skupina farmacevtskih tarč. Morda najbolj znan primer tarčne terapije kinaz je imatinib mesilat (Gleevec), ki specifično deluje na omenjeni protein bcr-abl, ki nastane z značilno translokacijo pri večini bolnikov s KML. Gleevec, ki ga je FDA odobrila za klinično uporabo leta 2001, je prvi primer uspešne tarč-ne terapije kinaze in osnova za razvoj novega ciljane-ga molekularnega zdravljenja.18 Raziskave kinaznih signalnih poti in njihovih sprememb, povezanih z določenimi boleznimi tako ne pripeljejo le do novih biooznačevalcev patogeneze, napredovanja bolezni in odpornosti na zdravljenje. Dajejo vpogled v bistvene mehanizme bolezni in lahko nakažejo nove tarče bolj učinkovitega in manj toksičnega zdravljenja. Primeri kinazne signalne disfunkcije pri avtoimunskih boleznih Avtoimunske bolezni, kot sta revmatoidni artritis (RA) in sistemski lupus eritematozus (SLE), označujejo izrazite spremembe ravnotežja Th1 in Th2, čezmerna tvorba avtoprotiteles, deregulacija tvorbe citokinov in neustrezna odzivnost T- in B-limfocitov v splošnem. Znotrajcelične signalne poti pa določajo tudi T- in B-celično funkcijo. Večina udeleženih signalnih poti uporablja fosfopro-teine kot signalne mediatorje. Tako lahko pričakujemo, da bodo ravnotežja fosfoproteinov porušena v B- in T- limfocitih med napredovanjem bolezni.. Primeri kinaznih sprememb v limfocitih B med avtoimu-no progresijo vključujejo nenormalne signalne poti iz B-celičnega receptorja (BcR) preko kinaze Lyn in tirozinske fosfataze CD45.19 Pri SLE je v T-celicah ekspresija zeta verige T-celičnega receptorja zmanjšana, vendar povzroči kostimulacija teh celic nenavadno povečano globalno fosforilacijo.20 Pri 80 % bolnikov s SLE so našli v limfocitih močno znižanje pod-enote RIß proteinske kinaze A.21 Tako obstajajo številni primeri kinazne modulacije med avtoimuno disfunkcijo. Specifični citokinski profili so prav tako povezani s patogenimi imunskimi odzivi.22 Takšni citokinski profili bi imeli še večjo diagnostično oz. napovedno vrednost, če bi jih lahko korelirali s profili aktiviranja njihovih tarčnih kinaz (npr. sistema JAK-STAT) v celicah. Celični biooznačevalci pri SLE: pomen citokinov – interferonov Pretočna citometrija omogoča določanje podvrst limfocitov T, B in drugih celic imunskega sistema z imu-nofenotipizacijo, tj. določanjem površinskih označevalcev celic. Opredelitev podvrst imunskih celic s pretočno citometrijo je pomembna za razumevanje av-toimunskih bolezni in za razvoj njihove diagnostike. Možno je slediti populacijam celic, ki so bistvene v patogenezi bolezni. Taki celični parametri so pogosto boljši kazalci aktivnosti bolezni kot obstoječi klinični in laboratorijski kazalci. Skupaj z novimi parametri humoralne imunosti, npr. profili avtoprotiteles in citokinov, jih uvrščajo med najbolj obetavne bio-označevalce aktivnosti bolezni.1 Bolniki s SLE imajo pogosto limfopenijo, ki zajema tako T- kot B-celični kompartment. Posebej izrazite so spremembe v B-celični homeostazi. Zmanjšana je frekvenca in absolutno število tako naivnih kot spominskih limfocitov B v periferni krvi. Nasprotno pa je močno zvišana frekvenca neobičajnih subpopulacij limfocitov B, ki jih pri zdravih preiskovancih praktično ne najdemo.23, 24 Pri SLE npr. v obdobjih aktivne bolezni naraste število t. i plazmablastov, opredeljenih s površinskimi označevalci kot celice CD19+CD20-CD27++CD38++. Plazmablasti so predhodniki plaz-matk, ki tvorijo avtoprotitelesa pri SLE. V remisiji bolezni se število plazmablastov v periferni krvi normalizira. Kot že omenjeno so takšni celični parametri pogosto boljši kazalci aktivnosti bolezni kot obstoječi laboratorijski in klinični kazalci.24 Spremembe v T-celični vrsti so prav tako za določene avtoimune bolezni značilne in korelirajo z aktivnostjo bolezni. SLE označuje zvišano število CD8 limfocitov T z efektorskim fenotipom.25 Med najbolj obetavne biooznačevalce aktivnosti SLE se uvršča tudi določanje citokinov, posebej interfero-na alfa (IFN-alfa).1 Na povezavo med interferonom alfa in humanim SLE so najprej kazala klinična opažanja: razvoj SLE med zdravljenjem z IFN-alfa in ugotovitev zvišanih serumskih vrednosti IFN-ov tipa 1 pri mnogih bolnikih s SLE.26 Na neposredno vpletenost IFN-alfa v patoge-nezo SLE kaže raziskava Blanca s sod.,27 ki je pokazala, da serum SLE pospeši diferenciacijo monocitov v dendritične celice (DC) na način, odvisen od IFN-alfa. Nezrele dendritične celice (DC), ki nosijo lastne antigene, so bistvene za vzdrževanje periferne tolerance, saj lastne antigene prezentirajo celicam T brez ustrezne kostimulacije, kar pripelje do T-celične aner-gije/deplecije. IFN-alfa bi bil lahko odgovoren za nenadzorovano aktivacijo takih DC, ki nosijo lastne-an-tigene apoptotičnih celic in posledično za izgubo tolerance pri bolnikih z dedno nagnjenostjo k avtoimu-nosti.. Dendritične celice, ki v glavnem tvorijo interferon alfa, imenujemo plazmacitoidne dendritične celice (pDC/IPC). Slednje morda aktivirajo imunski kompleksi, ki vsebujejo protitelesa anti-DNK in DNK iz apoptotičnih celic.28 Tako se lahko vzpostavi začaran krog produkcije IFN-alfa in njenih posledic pri SLE. S povečanim nastajanjem interferona se lahko pojasni tudi poslabšanja bolezni ob (predvsem virusnih) in- 620 Zdrav Vestn 2008; 77 fekcijah. Analize ekspresije genov v krvnih mononu-klearnih celicah so pokazale, da je pri veliki večini bolnikov s SLE izražena t. i. interferonska (IFN) signatu-ra.29, 30 Fosfosignalne signature citokinov in interferonov pri avtoimunskih boleznih Odkritje, da so citokini (TNF) in interferoni (IFN-alfa) bistveni v patogenezi bolezni, kot sta revmato-idni artritis in sistemski lupus eritematozus (SLE), je prineslo napredek v razumevanju avtoimunskih bolezni. Še vedno pa je malo znanega o znotrajceličnih signalnih poteh, ki se aktivirajo kot odgovor na te klinično pomembne citokine. Še manj je znanega o spremembah teh signalnih poti pri avtoimunskih boleznih. Ker do nedavnega ni bilo možno spremljati signalnih poti na ravni posameznih celic, je zelo malo raziskav, ki bi opisovale aktivacijske profile subpopulacij imunskih celic v odgovoru na interferone in citokine. Raziskave signalnih dogodkov v celicah so bile omejene na analize celičnih linij in na metode, ki temeljijo na liziranem materialu velikega števila, tudi funkcionalno, različnih celic. Take analize ne dajejo jasnega vpogleda v fosforilacijo proteinov na celični ravni, posebej ne v subpopulacijah limfocitov in dendritičnih celic, ki so bistvene v imunskem odzivu. Tako tudi ni bilo možno spremljati in razumeti celične signalne dis- 256 K 192 K 128 K 64 K pSTAT-1 Sl. 3. Močnejša fosforilacija STAT1 v odgovoru na IFN-alfa v levkocitih SLE: ravni pSTAT1 po ex vivo stimulaciji z IFN-alfa v levkocitih bolnice SLE (prikazano rdeče) in zdravem preiskovancu (prikazano temno mo-dro) Figure 3. Higher STAT1 phosphorylation in response to IFN-alpha in SLE leukocytes: pSTAT1 levels after ex vivo IFN-alpha stimmulation in leukocytes from SLE patient (shown in red) and healthy control (shown in dark blue). funkcije med bolezenskimi procesi v vzorcih bolnikov. Zato smo z novo razvito multiparametrično tehniko na osnovi pretočne citometrije pričeli s preučevanjem aktivacije proteinov STAT v subpopulacijah celic imunskega sistema.31 S pristopom, ki omogoča analizo polne krvi (brez separacije celic), smo odkrili konstitutivno fosforilacijo STAT5 v subpopulaciji limfocitov T pri testiranih bolnikih s SLE. Pri bolnikih s SLE ista subpopulacija kaže tudi največji odziv na interferon-alfa s fosforilacijo proteina STAT-1.32 Celice v periferni krvi bolnikov SLE nosijo tako podpis oz. signaturo citokinov interferonov, ki so jim med sistemskim vnetnim odgovorom izpostavljene. Taka signatura in odziv celice na citokin, ki je bistven v patoge-nezi bolezni, lahko predstavlja idealen kazalec aktivnosti bolezni. Interferoni tipa 1 so po zadnjih dognanjih bistveni dejavnik v patogenezi SLE in drugih av-toimunskih bolezni (tudi diabetesa-tip I). Dosedanje raziskave so kazale na večjo tvorbo IFN-alfa pri SLE. V levkocitih bolnikov s SLE je spremenjen (višji) tudi odziv na IFN-alfa (Sl. 3), kar verjetno še dodatno prispeva k začaranemu krogu te bolezni in zagonom ob npr. virusnih okužbah. Boljše razumevanje vplivov in-terferonov tipa I na celice imunskega sistema lahko pripelje do bolj specifične terapije SLE in drugih av-toimunskih bolezni. Spremljanje znotrajceličnih signalnih poti v celicah imunskega sistema pa lahko da tudi nova, bolj uporabna orodja v diagnostiki in vodenju bolezni. Zaključki Avtoimunske bolezni, kot je SLE, so izredno heterogene, tako klinično kot serološko. Ob odkritju bolezni ni možno napovedati, kateri bolniki bodo imeli težji potek bolezni ali življenje ogrožujoče pojave. Podobno tudi ni jasno, zakaj se npr. SLE pojavi v različnih obdobjih življenja bolnika, zakaj pride do remisi-je, relapsa in agresivnega poteka bolezni. Prav tako še vedno ni možno napovedati, kateri bolniki bodo odgovorili na različna zdravila in pri katerih se bodo pojavili stranski učinki obstoječega zdravljenja. Z novimi genomskimi in proteomskimi tehnologijami odkriti biomarkerji so lahko kliniku v pomoč. Mora pa se pri tem zavedati, da odkrivanje novih bio-označevalcev bolezni pogosto temelji le na iskanju statističnih razlik med skupinami bolnikov, ki npr. na določeno zdravilo odgovorijo, in tistih, ki ne. Če lahko npr. polimorfizem enega nukleotida (SNP) in statistika loči med slednjima skupinama, pa o biološkem pomenu biooznačevalca ne odloča statistično orodje, uporabljeno v raziskavi. Bistveno je razumevanje, kako nek biooznačevalec zrcali mehanizme v patogenezi bolezni in zavedanje, da zdravimo bolnike, ne biooznačevalcev. Danes je možno s pristopi, ki jih imenujejo proteomi-ka na celični ravni in so bili nedavno prvič uporabljeni na univerzi Stanford, spremljati kinazne signalne poti v redkih podvrstah imunskih celic, bistvenih v imunskih odzivih.33, 34 Kljub nedavnemu razvoju so se novi pristopi v dosedanjih kliničnih raziskavah že iz- Goropevšek A et al. Novejši biooznačevalci in spremljanje znotrajceličnih signalnih poti pri avtoimunskih boleznih 621 kazali v primerih, kjer koncept (klasičnih) bioozna-čevalcev odpove.35–37 Avtoimunske bolezni se kažejo na ravni proteoma in so povezane z nepravilnostmi v kinaznih poteh, citokinski ekspresiji in tvorbi avtoprotiteles. Kinazne poti imajo bistveno vlogo v imunskem reguliranju. Dosedanje raziskave so skušale opredeliti vlogo samo nekaj kinaz pri SLE in še to s pomočjo starejših metod. Možnost globalnega spremljanja kinaznih signalnih poti, npr. v imunskih celicah periferne krvi31, 32 bolnikov, bo poleg odkritja novih biooznačevalcev dala vpogled v mehanizme bolezni, kar bo prispevalo k boljši diagnostiki kot tudi morebitnim novim oblikam zdravljenja avtoimunskih bolezni. Literatura 1. Illei GG, Tackey E, Lapteva L, Lipsky PE. Biomarkers in systemic lupus erythematosus. II. Markers of disease activity. Arthritis Rheum 2004; 50: 2048–65. 2. Singh R, Robinson DB, El-Gabalawy HS. Emerging biologic therapies in rheumatoid arthritis: cell targets and cytokines. Curr Opin Rheumatol 2005; 17: 274–9. 3. Gutcher I, Becher B. APC-derived cytokines and T cell polarization in autoimmune inflammation. J Clin Invest 2007; 117: 1119– 27. 4. Kotzin BL. The role of B cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2005; 32 Suppl 73: 14–8. 5. Shlomchik MJ, Craft JE, Mamula MJ. From T to B and back again: positive feedback in systemic autoimmune disease. Nat Rev Immunol 2001; 1: 147–53. 6. Hunter T. Signaling-2000 and beyond. Cell 2000; 100: 113–27. 7. Suntharalingam G, Perry MR, Ward S, Brett SJ, Castello-Cortes A, Brunner MD, et al. Storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 2006; 355: 1018–28. 8. Rodríguez-Palmero M, Franch A, Castell M, Pelegri C, Perez-Cano FJ, Kleinschnitz C, et al. Effective treatment of adjuvant arthritis with a stimulatory CD28-specific monoclonal antibody. J Rheumatol 2006; 33: 110–8. 9. Müller N, van den Brandt J, Odoardi F, Tischner D, Herath J, Flügel A, Reichardt HM. A CD28 superagonistic antibody elicits 2 functionally distinct waves of T cell activation in rats. J Clin Invest 2008; 118: 1405–16. 10. Hom G, Graham RR, Modrek B, Taylor KE, Ortmann W, Garnier S, et al. Association of systematic lupus erythematosus with C8orf13-BLK and ITGAM-ITGAX. N Engl J Med 2008; 358: 900– 9. 11. International Consortium for Systemic Lupus Erythematosus Genetics (SLEGEN). Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other loci. Nat Genet 2008; 40: 204–10. 12. O’Shea JJ, Husa M, Li D, Hofmann SR, Watford W, Roberts JL, et al. Jak3 and the pathogenesis of severe combined immunodeficiency. Mol Immunol 2004; 41: 727–37. 13. James C, Ugo V, Casadevall N, Constantinescu SN, Vainchenker W. A JAK2 mutation in myeloproliferative disorders: pathoge-nesis and therapeutic and scientific prospects. Trends Mol Med 2005; 11(12): 546–54. 14. Tao J, Van Esch H, Hagedorn-Greiwe M, Hoffmann K, Moser B, Raynaud M, et al. Mutations in the X-linked cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5/STK9) gene are associated with severe neurodevelopmental retardation. Am J Hum Genet 2004; 75: 1149–54. 15. Playford MP, Schaller MD. The interplay between Src and inte-grins in normal and tumor biology. Oncogene 2004; 23: 7928– 46. 16. Wong S, Witte ON. The BCR-ABL story: bench to bedside and back. Annu Rev Immunol 2004; 22: 247–306. 17. Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signalling. Nature 2001; 411: 355–65. 18. Druker BJ. STI571 (Gleevec) as a paradigm for cancer therapy. Trends Mol Med 2002; 8 Suppl 4: 14–8. 19. Liossis SN, Solomou EE, Dimopoulos MA, Panayiotidis P, Mavri-kakis MM, Sfikakis PP. B-cell kinase lyn deficiency in patients with systemic lupus erythematosus. J Investig Med 2001; 49: 157– 65. 20. Liossis SN, Ding XZ, Dennis GJ, Tsokos GC. Altered pattern of TCR/CD3-mediated protein-tyrosyl phosphorylation in T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Deficient expression of the T cell receptor zeta chain. J Clin Invest 1998; 101: 1448–57. 21. Khan IU, Laxminarayana D, Kammer GM. Protein kinase A RI beta subunit deficiency in lupus T lymphocytes: bypassing a block in RI beta translation reconstitutes protein kinase A activity and augments IL-2 production. J. Immunol 2001; 166: 7600–5. 22. Utz PJ. Protein arrays for studying blood cells and their secreted products. Immunol Rev 2005; 204: 264–82. 23. Arce E, Jackson DG, Gill MA, Bennett LB, Banchereau J, Pascual V. Increased frequency of pre-germinal center b cells and plasma cell precursors in the blood of children with systemic lupus erythematosus. J Immunol 2001; 167: 2361–9. 24. Jacobi AM, Odendahl M, Reiter K, Bruns A, Burmester GR, Radbruch A, et al. Correlation between circulating CD27 high plasma cells and disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2003; 48: 1332–42. 25. Blanco P, Pitard V, Viallard JF, Taupin JL, Pellegrin JL, Moreau JF. Increase in activated CD8+ T lymphocytes expressing perforin and granzyme B correlates with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2005; 52: 201– 11. 26. Ronnblom LE, Alm GV, Oberg KE. Autoimmunity after alphainterferon therapy for malignant carcinoid tumors. Ann Intern Med 1991; 115: 178–83. 27. Blanco P, Palucka AK, Gill M, Pascual V, Banchereau J. Induction of dendritic cell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science 2000; 294: 1540–3. 28. Bave U, Vallin H, Alm GV, Ronnblom L. Activation of natural interferon-alpha producing cells by apoptotic U937 cells combined with lupus IgG and its regulation by cytokines. J Autoimmun 2001; 17: 71–80. 29. Baechler EC, Batliwalla FM, Karypis G, Gaffney PM, Ortmann WA, Espe KJ, et al. Interferon-inducible gene expression signature in peripheral blood cells of patients with severe lupus. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 2610–15. 30. Bennett L, Palucka AK, Arce E, Cantrell V, Borvak J, Banchereau J, et al. Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood. J Exp Med 2003; 197: 711–23. 31. Goropevšek A, Gradišnik L, Gorenjak M, Krajnc I, Cencič A. Monitoring intracellular signalling pathways in subsets of immune cells from whole blood in autoimmune diseases. In: Poklar Ul-rih N, Abram V, Cigić B, eds. 7. srečanje Slovenskega biokemijskega društva z mednarodno udeležbo, 26.–29. september 2007. Zbornik povzetkov. Ljubljana: Slovensko biokemijsko društvo; 2007. 32. Goropevšek A, Homšak E, Gorenjak M, Krajnc I, Cencič A. Monitoring anti-apoptotic cytokine signalling in subsets of SLE T cells. In: 15th Euroconference on Apoptosis and 4th Training course on Concepts and methods in programmed cell death, Portoroz, Slovenia, October 26-31, 2007. Programme and book of abstracts. European cell death organization. Ljubljana: »Jožef Stefan« Institute, 2007. 33. Perez OD, Nolan GP. Simultaneous measurement of multiple active kinase states using polychromatic flow cytometry. Nat Biotechnol 2002; 20: 155–62. 34. Irish JM, Kotecha N, Nolan GP. Mapping normal and cancer cell signalling networks: towards single-cell proteomics. Nat Rev Cancer 2006; 6(2): 146–55. 35. Yael Gernez Y, Tirouvanziam R, Nguyen KD, Herzenberg LA, Krensky AM, Nadeau KC. Altered phosphorylated signal transducer and activator of transcription profile of CD4+CD161+ T cells in asthma: Modulation by allergic status and oral cortico-steroids. J Allergy Clin Immunol 2007; 120: 1441–8. 622 Zdrav Vestn 2008; 77 36. West M, Koons A, Crandall M, Skinner R, Worley M, Shapiro MB. Whole blood leukocyte mitogen activated protein kinases activation differentiates intensive care unit patients with systemic inflammatory response syndrome and sepsis. J Trauma 2007; 62: 805–11. 37. Irish JM, Hovland R, Krutzik PR, Perez OD, Bruserud O, Gjertsen BT, Nolan GP. Single cell profiling of potentiated phospho-pro-tein networks in cancer cells. Cell 2004; 118: 217–28. Prispelo 2008-05-09, sprejeto 2008-09-12