Farm Vestn 2008; 59: 113-164 UDK 615 CODEN FMVTA, SLO ISSN 0014-8229 H mUSf ! tr^ iKZll ^¦B» ~ Pot do zdravja Mat ali so zdravi m irecm hud». Smo vatodiogeriia ki prodajo zdravil z noiSirio ponudbo izaslkov m humana In veterinarsko medicina v Moveni|i OdHkuJe|o nas hltrml. varnost In zaneal|lvoit. Svoje delo opravljamo areno In predano. Prav ratod loga nam zaupajo irovHne ietome in bafnrinica ter druge tdiavjtuene m vetenrorsk« ujtanai« 2ov«Jomo ». tfo nom pnrvxinosl ponuw nejtelo B»«Ou Premogoma jir-i IQhko I rkertennim wpupoJrifHvtn"4ftni Ł kakovostnimi slrnilvumi in i ih 1.1*0 wtjlro /druvil ler diuglh lalefkov borno zaupanje svo|jh kupcev opravicevali (udi v prihodnje! 01 4?Q °fl 0O I vvvvw.kernotarmaciia.si K KEMO FARMACIJA Farmacevtski vestnik STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE • PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA ŘT JULIJ 2008 LETNIK 59 Odgovorni urednik Borut Řtrukelj Śastni glavni urednik Aleř Krbavśiś Glavna urednica Andrijana Tivadar Uredniřki odbor Tajda Gala Miharija Stanko Gobec Katja Gombaś Aver Iztok Grabnar Janja Marc Franc Vreśer Izdajateljski svet Stane Srśiś Simona Cencelj Bořtjan Debelak Mirjana Gařperlin Lili Grosek Mirjam Hośevar Korořec Anamarija Zega Naslov uredniřtva / Adress of the Editorial Office Slovensko farmacevtsko druřtvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana, Telefon (01) 569 26 01 Transakcijski raśun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010-0016686585. Izhaja řestkrat letno Letna narośnina je 70 EUR Za tuje narośnike 100 US$ Avtor fotografije na naslovnici, Maj Klemenśiś Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Naklada: 3.200 izvodov Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published 6 times a year by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 70 EUR other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik is regulary abstracted in BIOLOGICAL ABSTRACTS, CHEMICAL ABSTRACTS, PHARMACEUTICAL ABSTRACTS, MEDICAL & AROMATIC PLANTS ABSTRACTS AND INBASE / Excerpta Medica Letnik 2008 sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS. UVODNIK Tretjo številko Farmacevtskega vestnika boste nekateri že brali na dopustu, drugi pa tik pred zasluženimi pocitnicami, zato je tudi del vsebine namenjen novim strokovnim spoznanjem v povezavi s poletjem: dva sestavka opisujeta vpliv svetlobe in radikalov na cloveški organizem, kakor tudi uporabo varovalnih kozmeticnih izdelkov. Dva prispevka sta namenjena uporabi bioloških dostavnih sistemov za lajšanje in preprecevanje bolezni. Tako lahko v clankih dr. Berleca in dr. Bratkovica s sodelavci beremo o probioticnih gensko spremenjenih mlecnokislinskih bakterijah s sposobnostjo dostave bioloških zdravil ali cepiv, kakor tudi o virusih iz skupine bakteriofagov, ki jih kot biološki dostavni sistem lahko uporabimo pri zdravljenju nekaterih bakterijskih okužb. V sestavku o interpolimernih kompleksih bomo spoznali nove tehnološke pristope, dr. Šuškovic pa nas v clanku seznanja z obravnavo astme v Sloveniji. Upam, da se boste z navedenimi patološkimi pojavi in boleznimi seznanjali le v teoriji, z branjem Farmacevtskega vestnika in v miru uživali v dopustniških dnevih in si tako nabrali sveže moci za nove kvalitetne premike v celostnem razvoju slovenske farmacije. Prof. dr. Borut Štrukelj Odgovorni urednik farm vestn 2008; 59 113 3 • • Vsebina Pregledni znanstveni clanki - Reviwe scientific articles Aleš Berlec, Borut Štrukelj Gensko spremenjene mleśnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biolořka zdravila Genetically modified lactic acid bacteria as delivery systems for biopharmaceuticals 115 Matej Pavli, Franc Vrecer, Saša Baumgartner Interpolimerni kompleksi Interpolymer complexes 121 Tomaž Bratkovic, Andrej Preželj Zdravljenje bakterijskih okućb z bakteriofag Bacteriophage therapy 129 Slavko Pecar Svetloba, radikali in fotodinamiśna terapija 135 Matejka Kumperšcak Duh Uporaba in vrednotenje varovalnih kozmetiśnih izdelkov za zařśito pred soncem 138 Raziskovalni clanek - Research article Nadja Plazar, Barbara Ostanek Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina med vzorci Slovencev in drugih narodov Allele frequency of mutations of homocysteine metabolism key enzymes in Slovene population in comparison to that in other populations 143 Stanislav Šuškovic Obravnava astme v Sloveniji - prospektivna opazovalna raziskava Managing of asthma in Slovenia - prospective observational study 151 Novice iz sveta farmacije 155 Iz društvenega življenja 33. skupřśina SFD 157 10. jubilejni FarmaSki 161 Osebne vesti In memoriam Vladu Vebletu, mag. farm. 163 114 farm vestn 2008; 59 Gensko spremenjene mlecnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila Gensko spremenjene mleśnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biolořka zdravila Genetically modified lactic acid bacteria as delivery systems for biopharmaceuticals Aleš Berlec, Borut Štrukelj Povzetek: Mleśnokislinske bakterije so će stoletja sestavni del śloveřke prehrane, zato je njihova varnost splořno priznana. Poleg tega so se v novejřem śasu visoko razvile tehnike, ki omogośajo rekombinantno izraćanje proteinov tudi v mleśnokislinskih bakterijah. Zaradi teh razlogov imajo velik potencial kot poceni in uśinkoviti dostavni sistemi za dostavo rekombinantnih proteinov na telesne sluznice, predvsem v prebavnem traktu. V razvoju in řtudijah na ćivalih so sistemi za dostavo antigenov (cepiv), dostavo proteinov s fiziolořko funkcijo in dostavo DNA z namenom cepljenja. Dostava interlevkina IL-10 pri kroniśni vnetni śrevesni bolezni se je izkazala za najbolj obetavno in je bila uspeřno testirana v 1. fazi kliniśne řtudije na ljudeh. Pred splořno uporabo bo potrebno odgovoriti na vprařanja o varnosti vnosa genskega materiala, ker gre za gensko spremenjene organizme, ki ne ućivajo podpore javnosti Kljuśne besede: mlecnokislinske bakterije, Lactooccus lactis, rekombinantno izražanje, dostavni sistem, cepivo, IL-10, gensko spremenjeni organizmi Abstract: Lactic acid bacteria have been a part of human diet for centuries and their safety is therefore generally recognised. Apart from that, the techniques that enable recombinant protein expression in lactic acid bacteria have recently developed. This is why lactic acid bacteria could serve as a cheap and efficient delivery system for recombinant protein delivery to body mucosa, especially in gastrointestinal tract. Systems for antigen (vaccine) delivery, delivery of proteins with physiological function and for DNA delivery are under development and in animal testing. The delivery of interleukin IL-10 in inflammatory bowel disease is the most promising and was successfully tested in phase I human clinical trial. Before the widespread use, questions regarding safety of genetic material introduction will have to be answered, since these are genetically modified organisms, which are not well accepted by the general public. Key words: lactic acid bacteria, Lactococcus lactis, recombinant expression, delivery system, vaccine, IL-10, genetically modified organisms. 1 Mleśnokislinske bakterije in rekombinantno izraćanje proteinov Mleśnokislinske bakterije v fermentiranih mleśnih, rastlinskih in mesnih izdelkih će stoletja predstavljajo normalno sestavino śloveřke prehrane in so poleg kvasovk (Saccharomyces cerevisiae) industrijsko najpomembnejři mikroorganizmi (1). Zaradi dolgotrajne dokumentirane varne uporabe imajo status GRAS (»splořno priznani kot varni«). Poleg tega řtevilna porośila potrjujejo njihovo dobrodejno delovanje v prebavnem traktu, zato se pogosto dodajajo hrani kot pro-biotiki. Med mleśnokislinske bakterije uvrřśamo rodove Lactobacillus, Leuco nostoc, Pediococcus, Lactococcus in Streptococcus ter neko-iko bolj obrobne Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus in Weisella (2). Po fiziolořkih znaśilnostih lahko mednje uvrstimo tudi rod Bifidobacterium, ki je sicer genetsko nesoroden. V naravi jih pogosto najdemo na razpadajośih rastlinah ali v prebavilih ćivali. Mleśnokislinske bakterije spadajo v skupino gram pozitivnih bakterij So anaerobni ali mikroaerofilni koki ali bacili in ne tvorijo spor. Ker zasedajo isto ekolořko niřo, so razvile nekatere skupne metabolne in fiziolořke znaśilnosti. Pomembna znaśilnost, po kateri so dobile ime je, da kot konśni produkt fermentacije ogljikovih hidratov tvorijo mleśno kislino. Glede na konśni produkt metabolizma jih razdelimo v dve skupini. Homofermentativne mleśnokislinske bakterije tvorijo mleśno kislino kot edini ali glavni produkt metabolizma glukoze. Heterofermentativne tvorijo enako mnoćino mleśne kisline, ogljikovega dioksida in etanola. Med fermentacijo pH gojiřśa zaradi tvorbe mleśne kisline pada. Mleśnokislinske bakterije so relativno odporne dr. Aleš Berlec,/nag. farm., Institut »Jožef Stefan«, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija Prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija; Institut »Jožef Stefan«, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2008; 59 115 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles na rast v gojišcu s kislim pH. Pri vecini vrst se rast ustavi pri pH 4,5. Imajo tudi podobno temperaturno toleranco in ne preživijo pri temperaturi višji od 45 °C. So avksotrofne za številne aminokisline, ki jih morajo zato pridobiti iz okolja. Mlecnokislinske bakterije pogosto proizvajajo antibakterijske peptide bakteriocine, ki predstavljajo prednost pred ostalimi mikroorganizmi, saj so bakterije proizvajalke nanje imune, hkrati pa so toksicni za kompetitivne bakterije. Skupna znacilnost je tudi, da imajo v nukleotidnem zaporedju genomov nizek delež gvaninov in citozinov (GC), za razliko od nekaterih gram negativnih bakterij (E. coli), kar je pomembno pri heterolognem izražanju genov. Lactococcus lactis je splošno priznan kot modelna mlecnokislinska bakterija. Zanj obstajajo dobro razvita orodja za gensko manipulacijo (3). V laboratoriju se najpogosteje uporabljata seva L. lactis subsp. cremoris MG1363 in L. lactis subsp. lactis IL1403, ki imata tudi dolocen genom (4, 5). L. lactis je tudi industrijsko pomemben mikroorganizem, zlasti je pomemben v sirarstvu Za rekombinantno izražanje proteinov v mlecnokislinskih bakterijah se uporabljajo razlicni sistemi. Heterologni geni se nahajajo bodisi na plazmidih bodisi so vstavljeni v bakterijski kromosom in so pod nadzorom konstitutivnih ali inducibilnih promotorjev. Konstitutivni promo-torji zagotavljajo enakomerno izražanje daljši cas, a obicajno v manjših kolicinah. Pri inducibilnih promotorjih lahko izražanje nadzorujemo in je obicajno mocnejše. Izražanje lahko sprožimo z ogljikovimi hidrati, fagno infekcijo, bakteriocini, toplotno ali pH- spremembo (1) Najpogosteje uporabljan in najbolj proucen sistem je z nizinom nadzorovan ekspresijski sistem NICE (6), kjer se izražanje inducira z dodatkom bakteriocina nižina. Razviti so tudi sistemi, ki omogocajo usmerjanje proteinov v bakterijah (ciljanje). Za izlocanje proteinov v gojišce se tako najpogosteje uporablja zaporedje Usp45, za pritrditev proteinov na površino bakterij (celicno steno) pa C-terminalno zaporedje avtolizina AcmA (1). 2 Dostava biološko aktivnih makromolekul Zaradi varnega statusa in zaupanja, ki ga uživajo mlecnokislinske bakterije, predstavljajo privlacen vektor za dostavo bioloških makromolekul v organizem. Cilji njihovega delovanja so sluznice, najpogosteje v prebavnem traktu, kot je shematsko prikazano na sliki 1 Delujejo lokalno, lahko pa povzrocijo tudi sistemske ucinke. Nacin aplikacije je ponavadi peroralni ali nazalni, možen pa je tudi vaginalni. Laktokoki in laktobacili preživijo prehod skozi prebavni trakt, nekateri laktobacili pa so ga sposobni tudi kolonizirati. Sposobnost preživetja v prebavnem traktu je pomemben dejavnik, saj peroralna aplikacija proteina ni mogoca predvsem zaradi razgradnje v kislem želodcnem okolju. Dodatna prednost dostave s pomocjo bakterij je, da nista potrebni draga izolacija in cišcenje proteinov. Sistemi dostave biološko aktivnih makromolekul se zaenkrat vecinoma testirajo na živalskih modelih, kjer se dosegajo spodbudni rezultati. Znan je en primer klinicne študije na ljudeh, ki bo opisan v nadaljevanju Dostavo biološko aktivnih makromolekul lahko po nacinu uporabe razdelimo na dostavo cepiv (antigenov), dostavo proteinov s fiziološko vlogo in dostavo DNA. 116 farm vestn 2008; 59 Slika 1: Gensko spremenjene mleśnokislinske bakterije v prebavnem traktu lahko izlośajo heterologne proteine ali pa jih predstavljajo na povrřini. Figure 1: Genetically modified lactic acid bacteria can secrete heterologous proteins or present them on the surface in the instestinal tract. 2.1 Dostava cepiv Peroralna dostava cepiv (antigenov) je zaželena zaradi prijetnejšega nacina aplikacije v primerjavi s parenteralnim. Poleg tega bi peroralna dostava poceni cepiv pomenila veliko prednost zlasti v manj razvitih deželah. Mlecnokislinske bakterije predstavljajo ugoden vektor za dostavo cepiv, ker (7): • imajo status GRAS, • lahko delujejo kot adjuvans, • so sposobne adhezije na mukozo, • imajo nizko intrinzicno imunogenost. Zaradi velikosti se proteinske molekule naceloma ne absorbirajo in ne prehajajo v krvni obtok. Vendar pa crevesno limfoidno tkivo, ki je del mukoznega imunskega sistema, omogoca prehod preko specializiranih M celic na Peyerjevih plošcah in predstavitev antigenov bazalno ležecim imunskim celicam. To posledicno sproži izlocanje IgA, glavnega razreda protiteles iz epitelija, v lumen prebavnega trakta in s tem lokalni imunski odziv (8). Hkrati lahko takšen vnos antigenov sproži tudi sistemski imunski odziv in pojav IgG v krvi. Razlicne vrste antigenov, ki so bili predstavljeni s pomocjo mlecnokislinskih bakterij, so predstavljeni v preglednici 1 Cepiva so usmerjena proti bakterijskim in virusnim patogenom, pa tudi praživalim (Plasmodium falciparum). Najvec študij je bilo opravljenih na fragmentu C tetanus toksina (10), ki zaradi mocne imunogenosti služi tudi kot modelni antigen. Vecina študij je bila opravljenih na miših. Obicajno so opazili zvecan lokalni imunski odziv in izlocanje IgA, pa tudi zvecan sistemski imunski odziv. Kar nekaj študij je uspelo dokazati klinicno uspešnost cepljenja, saj se po izpostavitvi patogenu bolezen ni razvila npr. v primeru cepiva proti cloveškemu papilomavirusu, ki povzroca raka maternicnega vratu (19) ali v primeru cepiva proti enterotoksigeni E. coli (7). Ucinkovitost Gensko spremenjene mlecnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila Preglednica 1: Primeri uporabe mlecnokislinskih bakterij pri dostavi antigenov. Table 1: Example of usage of lactic acid bacteria in antigen delivery. PATOGEN DOSTAVLJENI ANTIGEN MLEŚNOKISLINSKA BAKTERIJA REF. Bakterije Streptococcus mutans (karies) Površinski protein PAc L. lactis (9) Clostridium tetani (tetanus) Fragment C tetanus toksina L. lactis, Lb. plantarum (10), (11) Streptococccus pneumoniae Kapsulami polisaharid tipa 3 PsaA, PspA L. lactis, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. helcveticus (12) Helicobacter pylori UreB, Cag12 L. lactis, Lb. plantarum (13) Brucella abortus L7/L12 ribosomalni protein GroEL protein topotnega šoka L. lactis (14) Streptococcus pyrogenes (faringealna infekcija) Obmocje C-ponovitve M proteina L. lactis (15) Proteus mirabilis MrpA fimbrijski protein L. lactis (16) enterotoksigena Escherichia coll Toplotno stabilni enterotoksin in toplotno labilni enterotoksin B Lb. reuteri (17) streptokoki (širokospektralno) GBS pilus (iz skupine B streptokokov) L. lactis (18) Virusi cloveški papilomavirus tip 16 (rak maternicnega vratu) Protein E7, protein L1 L. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei (19), (20) HIV Ovojni protein L. lactis (21) SARS-koronavirus Nukleokapsidni protein peplomerni protein - segmenta SA and SB L. lactis, Lb. casei (22) Rotavirus VP7 protein iz zunanjega plašca L. lactis (23) Koronavirus (prenosni gastroenteritis) Peplomerni glikoprotein S Lb. casei (24) Praživali Plasmodium falciparium (malarija) Fuzijski protein GLURP-MSP3, MSP1 MSA2 L. lactis (25) Preglednica 2: Primeri uporabe mlecnokislinkih bakterij pri dostavi proteinov s fiziološko vlogo. Table 2: Example of usage of lactic acid bacteria in delivery of proteins with physiological function. OBOLENJE / MOTNJA DOSTAVLJENI PROTEIN MLEŚNOKISLINSKA BAKTERIJA REF. Kronicna vnetna crevesna bolezen (KVCB) IL-10 L. lactis (27), (28) Ulcerozni kolitis mTFF (triperesni (trefoil) faktor) L. lactis (29) Ulcerozni kolitis LcrV iz Yersinia pseudotuberculosis -stimulacija izlocanja IL-10 L. lactis (30) Ulcerozni kolitis MnSOD iz Streptococcus thermophilus Lb. gasseri (31) HIV Cianovirin iz Nostoc elipsosporum L. lactis, Lb. plantarum, Lb. jensenii (32) Modulacija alergijskega imunskega odziva Bet v 1 antigen iz brezovega peloda L. lactis, Lb. plantarum (33) Modulacija alergijskega imunskega odziva Anti-idiotipski scFv ali IgE mimotop Lb. johnsonii (34) Karies scFv proti S. mutans (antigen l/ll) Lb. zeae (35) Pomanjkanje lipaze pri pankreasni insuficienc Lipaza iz Staphylococcus hyicus L. lactis (36) farm vestn 2008; 59 117 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles predstavitve antigena so v nekaj primerih povecali s hkratno dostavo interlevkinov (IL-2, IL-6) (26). Mlecnokislinske bakterije, ki predstavljajo antigene, naj ne bi kolonizirale prebavnega trakta, saj bi to lahko vodilo k toleranci do antigena. L. lactis je zato najugodnejši in najpogostejši kandidat za peroralno cepivo, ceprav so se laktobacil nekajkrat izkazali za ucinkovitejše (11). Klinicne študije na ljudeh še niso bile opravljene. 2.2 Dostava proteinov s fiziolořko vlogo Poleg dostave antigenov je mlecnokislinske bakterije moc uporabiti tudi kot vektor za dostavo proteinov, ki delujejo lokalno v prebavnem traktu. Na ta nacin dostavljeni proteini so predstavljeni v preglednici 2. Iz preglednice 2 je razvidno, da je najpogostejša tarca dostave proteinov v prebavni trakt kronicna vnetna crevesna bolezen (KVCB), kamor uvršcamo ulcerozni kolitis in Crohnovo bolezen. Dokazano je, da interlevkin IL-10 igra pomembno vlogo pri regulaciji vnetnih kaskad in da njegovo pomanjkanje vodi v razvoj kolitisa. Dostava IL-10 lahko omili simptome in predstavlja najuspešnejši primer dostave proteinov z mlecnokislinskimi bakterijami. Uspešno so jo testirali na mišjem modelu kolitisa (27). Sledil je razvoj seva L. lactis z okvarjeno timidilat sintazo, ki je zato odvisen od zunanjih virov timidina ali timi-na, kar preprecuje preživetje gensko spremenjenega seva v naravi (37). To je omogocilo uporabo v 1. fazi klinicne študije na 10 ljudeh za zdravljenje Crohnove bolezni (28). Študija je bila uspešna z minimalnimi stranskimi ucinki in z olajšanjem simptomov bolezni. Podobne ucinke so na živalskih študijah dosegli z uporabo triperesnih faktorjev (29) in dostavo proteina LcrV (30) iz Y. pseudotuberculosis, ki stimulira izlocanje IL-10. Drugacen pristop predstavlja intestinalno izlocanje superoksidne dismutaze (MnSOD), ki nastopa kot lovilec reaktivnih kisikovih spojin, ki prispevajo k vnetnemu delovanju (31). Mlecnokislinske bakterije bi se lahko uporabljale za dostavo prebavnih encimov pri dolocenih anomalijah npr. pankreasni insuficienci. Tako je bil razvit sistem za dostavo lipaze (36). Na podoben nacin, kot je bilo v prejšnjem poglavju opisano za dostavo antigenov z namenom spodbujanja imunskega odziv, bi se mlecnokislinske bakterije lahko uporabljale tudi za modulacijo imunskega odziva. Tako so s senzitizacijo zmanjšali imunski odziv na antigen iz brezovega peloda (33). Drugacen pristop predstavlja dostava fragmenta variabilne regije protitelesa (scFv) proti IgE, ki so odgovorni za pretiran imunski odziv, ali IgE mimotopov, ki stimulirajo tvorbo IgG proti IgE (34). Tudi fragmenti variabilne regije protitelesa scFv, usmerjeni proti S. mutans, so bili dostavljeni s pomocjo mlecnokislinskih bakterij in uporabljeni za oralno zdravljenje kariesa (35) Poleg uporabe v prebavnem traktu, je mlecnokislinske bakterije mogoce uporabiti tudi na drugih sluznicah, npr. vaginalni. Razvit je sistem izražanja mocnega protivirusnega proteina cianovirina v mlecnokislinskih bakterijah, ki kolonizirajo vagino, kar predstavlja nacin za zmanjšanje možnosti okužbe s HIV predvsem na ogroženih manj razvitih obmocjih. 2.3 Dostava DNA Dostava DNA z namenom cepljenja (DNA cepivo) je najnovejši nacin uporabe mlecnokislinskih bakterij in zato zaenkrat najmanj razvit. Dostavljena DNA izkoristi celicne mehanizme za prepis v protein, ki potem služi kot antigen. Prednost DNA cepiva je zmožnost aktivacije celicne imunosti in ne samo humoralne, kar posledicno omogoca tudi zdravljenje kronicnih bolezni in zahtevnih virusnih infekcij, težava pa je uspešen vnos DNA v celice. Z mlecnokislinskimi bakterijami so uspeli dokazati vnos DNA v sesalske celice s pomocjo proteina inter-nalina (38, 39), ki poveca prepustnost celic za L. lactis. Dosegli so tudi aktivacijo imunskega odziva pri miših po vnosu gena Vp1 virusa slinavke in parkljevke (40). Primeri so prikazani v preglednici 3. 3 Prednosti in slabosti Mlecnokislinske bakterije so že stoletja sestavni del cloveške prehrane, zato njihova varnost ni vprašljiva. Možnost sistemske okužbe z mlecnokislinskimi bakterijami obstaja le pri mocno imunokomprimitiranih posameznikih. Dostava rekombinantnih proteinov na sluznice oz. predvsem v prebavni trakt s pomocjo mlecnokislinskih bakterij pomeni relativno poceni nacin dostave biološko aktivnih makromolekul v organizem, saj odpade potreba po nadaljnji izolaciji in cišcenju. To je pomembno predvsem v manj razvitih deželah, kjer je cena glavna ovira za npr. množicno cepljenje. Prednost mlecnokislinskih bakterij pri dostavi cepiv je tudi, da posnemajo pot vnosa številnih patogenov v organizem in imajo lahko intrinzicne lastnosti adjuvansa. Vnos fiziološko aktivnih proteinov v npr. prebavni trakt pomeni prednost predvsem pri lokalnih obolenjih, saj pri sistemski aplikaciji proteinov le majhen del dospe do želenega mesta delovanja, povecana pa je tudi možnost stranskih ucinkov. Med slabosti lahko uvrstimo težave z natancnim odmerjanjem, v primeru da prihaja do izražanja proteina na mestu delovanja (in ne že pred vnosom v organizem) in pa nejasne posledice ob morebitni kolonizaciji prebavnega trakta. Glavna šibka tocka uporabe mlecnokislinskih bakterij pa je v tem, da gre za gensko spremenjene orga- Preglednica 3: Primeri uporabe mleśnokislinkih bakterij pri dostavi DNA. Table 3: : Example of usage of lactic acid bacteria in DNA delivery. CILJ TERAPIJE DOSTAVLJENI GEN MLEŚNOKISL. BAKTERIJA REF. Vnos gena proti modelnemu proteinu gfp (zeleni fluorescentni protein) L. lactis (38) Vnos gena proti modelnemu proteinu blg (beta-laktoglobulin) L. lactis (39) Cepivo proti virusu slinavke in parkljevke (FMDV) vp1 Lb. acidophilus (40) 118 farm vestn 2008; 59 Gensko spremenjene mlecnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila nizme, ki so v javnosti delećni izrazito odklonilnega odnosa. Pred dejansko uporabo bi bilo zato potrebno odgovoriti na řtevilna vprařanja, povezana s sprořśanjem rekombinantnih organizmov v okolje (41, 42). Prvi sklop vprařanj je povezan s samim rekombinant-nim sevom in moćnostjo njegovega prećivetja v naravi. To je v veliki meri moś odpraviti z uporabo metabolnih mutant, ki onemogośajo prećivetje brez dolośenih hranil, kar je bilo će uspeřno prikazano na primeru seva L. lactis z odstranjenim genom za timidilat sintazo (37). Drugi sklop vprařanj je povezan z vnesenim proteinom in njegovo potencialno alergenostjo in toksiśnostjo. Tretji sklop vprařanj pa se nanařa na sam genski material. Potrebno je prepreśiti horizontalen prenos genskega materiala v ostale, komenzalne bakterije. To je zlasti pomembno pri uporabi plazmidov, pri śemer je potrebno uporabljati replikacijske elemente, ki so omejeni na gostitelja. Popolnoma se je potrebno izogniti antibiotiśnim oznaśevalcem. Potrebno je tudi izkljuśiti vkljuśevanje DNA v genom gostitelja in morebitno onkogeno delovanje. Mleśnokislinske bakterije imajo velik potencial kot vektorji za dostavo biolořko aktivnih makromolekul. Pred uporabo bo potrebno razreřiti odnos do gensko spremenjenih organizmov, katerim javno mnenje ni naklonjeno in zaradi katerega je tudi odnos industrije zadrćan. Res pa je, da je uporaba gensko spremenjenih organizmov v terapevtske namene sprejemljivejřa od npr. uporabe v prehrani. Tveganje, ki smo ga namreś pripravljeni sprejeti, je povezano s koristjo, ki jo dobimo. Ta pa je veśja v primeru resne ali tećko ozdravljive bolezni 4 Literatura 1. de Vos WM. Gene expression systems for lactic acid bacteria. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 289-295. 2. Stiles ME, Holzapfel WH. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int J Food Microbiol 1997; 36: 1-29. 3. van Hylckama Vlieg JE, Rademaker JL, Bachmann H et al. Natural diversity and adaptive responses of Lactococcus lactis. Curr Opin Biotechnol 2006; 17: 183-190. 4. Bolotin A, Wincker P, Mauger S et al. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res 2001; 11: 731-753. 5. Wegmann U, O'Connell-Motherway M, Zomer A et al. Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J Bacteriol 2007; 189: 3256-3270. 6. Mierau I, Kleerebezem M. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 68: 705-717. 7. Pouwels PH, Leer RJ, Shaw M et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. International Journal of Food Microbiology 1998; 41: 155-167. 8. Nouaille S, Ribeiro LA, Miyoshi A et al. Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis. Genet Mol Res 2003; 2: 102-111 9. Iwaki M, Okahashi N, Takahashi I et al. Oral immunization with recombinant Streptococcus lactis carrying the Streptococcus mutans surface protein antigen gene. Infect Immun 1990; 58: 2929-2934. 10. Robinson K, Chamberlain LM, Schofield KM et al. Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis. Nat Biotechnol 1997; 15: 653-657. 11. Grangette C, Muller-Alouf H, Geoffroy M et al. Protection against tetanus toxin after intragastric administration of two recombinant lactic acid bacteria: impact of strain viability and in vivo persistence. Vaccine 2002; 20: 3304-3309. 12. Oliveira ML, Areas AP, Campos IB et al. Induction of systemic and mucosal immune response and decrease in Streptococcus pneumoniae colonization by nasal inoculation of mice with recombinant lactic acid bacteria expressing pneumococcal surface antigen A. Microbes Infect 2006; 8: 1016-1024. 13. Lee MH, Roussel Y, Wilks M et al. Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H. pylori infection in mice. Vaccine 2001; 19: 3927-3935. 14. Pontes DS, Dorella FA, Ribeiro LA et al. Induction of partial protection in mice after oral administration of Lactococcus lactis producing Brucella abortus L7/L12 antigen. J Drug Target 2003; 11: 489-493. 15. Mannam P, Jones KF, Geller BL. Mucosal vaccine made from ive, recombinant Lactococcus lactis protects mice against pharyngeal infection with Streptococcus pyogenes. Infect Immun 2004; 72: 3444-3450. 16. Scavone P, Miyoshi A, Rial A et al. Intranasal immunisation with recombinant Lactococcus lactis displaying either anchored or secreted forms of Proteus mirabilis MrpA fimbrial protein confers specific immune response and induces a significant reduction of kidney bacterial colonisation in mice. Microbes Infect 2007; 9: 821-828. 17. Wu CM, Chung TC. Mice protected by oral immunization with Lactobacillus reuteri secreting fusion protein of Escherichia col enterotoxin subunit protein. FEMS Immunol Med Microbiol 2007; 50: 354-365. 18. Buccato S, Maione D, Rinaudo CD et al. Use of Lactococcus lactis expressing pili from group B Streptococcus as a broad-coverage vaccine against streptococcal disease. J Infect Dis 2006; 194: 331-340. 19. Bermudez-Humaran LG, Cortes-Perez NG, Lefevre F et al. A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL-12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J Immunol 2005; 175: 7297-7302. 20. Poo H, Pyo HM, Lee TY et al. Oral administration of human papillomavirus type 16 E7 displayed on Lactobacillus casei induces E7-specific antitumor effects in C57/BL6 mice. Int J Cancer 2006; 119: 1702-1709. 21. Xin KQ, Hoshino Y, Toda Y et al. Immunogenicity and protective efficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactis expressing surface-bound HIV Env. Blood 2003; 102: 223-228. 22. Lee JS, Poo H, Han DP et al. Mucosal immunization with surface-displayed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein on Lactobacillus casei induces neutralizing antibodies in mice. J Virol 2006; 80: 4079-4087. farm vestn 2008; 59 1191 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles 23. Perez CA, Eichwald C, Burrone O et al. Rotavirus vp7 antigen produced by Lactococcus lactis induces neutralizing antibodies in mice. J Appl Microbiol 2005; 99: 1158-1164. 24. Ho PS, Kwang J, Lee YK. Intragastric administration of Lactobacillus casei expressing transmissible gastroentritis coronavirus spike glycoprotein induced specific antibody production. Vaccine 2005; 23: 1335-1342. 25. Ramasamy R, Yasawardena S, Zomer A et al. Immunogenicity of a malaria parasite antigen displayed by Lactococcus lactis in oral immunisations. Vaccine 2006; 24: 3900-3908. 26. Steidler L, Robinson K, Chamberlain L et al. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect Immun 1998; 66: 3183-3189. 27. Steidler L, Hans W, Schotte L et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science 2000; 289: 1352-1355. 28. Braat H, Rottiers P, Hommes DW et al. A phase I trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn's disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4: 754-759. 29. Vandenbroucke K, Hans W, Van Huysse J et al. Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice. Gastroenterology 2004; 127: 502-513. 30. Foligne B, Dessein R, Marceau M et al. Prevention and treatment of colitis with Lactococcus lactis secreting the immunomodulatory Yersinia LcrV protein. Gastroenterology 2007; 133: 862-874. 31. Carroll IM, Andrus JM, Bruno-Barcena JM et al. Anti-inflammatory properties of Lactobacillus gasseri expressing manganese superoxide dismutase using the interleukin 10-deficient mouse model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 293: G729-738. 32. Liu X, Lagenaur LA, Simpson DA et al. Engineered vaginal lactobacillus strain for mucosal delivery of the human immunodeficiency virus inhibitor cyanovirin-N. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 3250-3259. 33. Daniel C, Repa A, Wild C et al. Modulation of allergic immune responses by mucosal application of recombinant lactic acid bacteria producing the major birch pollen allergen Bet v 1 Allergy 2006; 61: 812-819. 34. Scheppler L, Vogel M, Marti P et al. Intranasal immunisation using recombinant Lactobacillus johnsonii as a new strategy to prevent allergic disease. Vaccine 2005; 23: 1126-1134. 35. Kruger C, Hultberg A, van Dollenweerd C et al. Passive immunization by lactobacilli expressing single-chain antibodies against Streptococcus mutans. Mol Biotechnol 2005; 31: 221-231 36. Drouault S, Juste C, Marteau P et al. Oral treatment with Lactococcus lactis expressing Staphylococcus hyicus lipase enhances lipid digestion in pigs with induced pancreatic insufficiency. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 3166-3168. 37. Steidler L, Neirynck S, Huyghebaert N et al. Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10. Nat Biotechnol 2003; 21: 785-789. 38. Guimaraes VD, Gabriel JE, Lefevre F et al. Internalin-expressing Lactococcus lactis is able to invade small intestine of guinea pigs and deliver DNA into mammalian epithelial cells. Microbes nfect 2005; 7: 836-844. 39. Guimaraes VD, Innocentin S, Lefevre F et al. Use of native lactococci as vehicles for delivery of DNA into mammalian epithelial cells. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 7091-7097. 40. Li YG, Tian FL, Gao FS et al. Immune responses generated by Lactobacillus as a carrier in DNA immunization against foot-and-mouth disease virus. Vaccine 2007; 25: 902-911 41. Detmer A, Glenting J. Live bacterial vaccines--a review and identification of potential hazards. Microb Cell Fact 2006; 5: 23. 42. Renault P. Genetically modified lactic acid bacteria: applications to food or health and risk assessment. Biochimie 2002; 84: 1073-1087. 120 farm vestn 2008; 59 Interpolimerni kompleksi Interpolimerni kompleksi Interpolymer complexes Matej Pavli, Franc Vrecer, Saša Baumgartner Povzetek: Razvoj novih pomoćnih snovi poteka sośasno z razvojem novih uśinkovin. Namen razvoja novih pomoćnih snovi je doseganje ćelenih lastnosti farmacevtskih oblik, kot so: nadzorovano sprořśanje, izboljřanje biolořke uporabnosti, poveśana stabilnost idr. Primer novih pomoćnih snovi so interpolimerni kompleksi (IPC), ki lahko izkazujejo povsem drugaśne lastnosti od posameznih izhodiřśnih polimerov. Na nastanek in lastnosti IPC imajo kljuśen vpliv parametri izdelave. V ślanku poleg kljuśnih parametrov izdelave obravnavamo tudi nekaj konkretnih primerov uporabe IPC v farmacevtski tehnologiji. Nakazane so tudi moćnosti uporabe raśunalniřkih modelov za naśrtovanje optimalnih pogojev za nastanek IPC Zakljuśimo lahko, da so raziskave vpliva in uporabnosti IPC pri oblikovanju farmacevtskih oblik danes v farmacevtski tehnologiji zelo aktualne. Kljuśne besede: nadzorovano sprořśanje, pomoćne snovi, polimeri, kompleksi Abstract: The developement of new pharmaceutical excipients is proceeding simultaneously with developement of new active pharmaceutical ingredients. The purpose of the developement of new pharmaceutical excipients is to achieve desirable properties in dosage forms like controlled release, improved bioavailabilty, enhanced stability etc. An example of new excipients are interpolymer complexes (IPC), which can obtain completely different properties compared to separate original polymers. The developement and properties of IPC are essentially influenced by manufacturing parameters. In this article we also present some experimental cases of the usage of IPC in pharmaceutical technology beside important manufacturing parameters. The feasibilities of the usage of computer models for developement of optimal conditions for PC assembly are also pointed out. We can conclude that the research of influence and applications of IPC on formulation of dosage forms are nowadays the topic of great interest in pharmaceutical techology. Key words: controlled release, excipients, polymers, complexes 1 Uvod Izraz interpolimerna kompleksacija opisuje nekovalentno povezovanje med posameznimi skupinami na razliśnih polimernih verigah (slika 1) (1). Rezultat tovrstnega povezovanja so interpolimerni kompleksi (IPC). Interpolimerni kompleksi nastajajo pod pogoji, v katerih so polimeri med seboj termodinamsko kompatibilni. Polimerni kompleksi se tvorijo zaradi van der Waalsovih interkacij, ionskih vezi ali vodikovih vezi (1). Interakcije, kot so vodikove vezi, dipol-dipol interakcije, prenos naboja in kislinsko-baziśna kompleksacija so nujne, da pride do meřanja polimerov v raztopinah (2). Kadar so polimer-polimer interakcije mośnejře kot interakcije polimer-topilo, tvorita polimera pri meřanju raztopin teh dveh polimerov v skupnem topilu interpolimerne komplekse (precipitate) (3). Parametrov, ki lahko vplivajo na tvorbo interpolimernega kompleksa, je veś: struktura, molekulska masa polimerov, temperatura, pH, vrsta topila ipd. Tvorba kompleksa je reverzibilna (4). Slika 1. Primer interpolimerne kompleksacije med poliakrilno kislino (PAA) in poli N,N - dietilakrilamidom (PDEA) (2). Polimerna kompleksacija je termodinamsko ugodna. Pospeřena je z Figure 1. Example of interpolymer complexation of poly(acrylic acid) negativno prosto energijo zdrućevanja med ponavljajośimi enotami. (PAA) with poly(N,N - diethylacrylamide) (PDEA) (2). Matej Pavli, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana; Krka, d.d., Novo mesto, Šmarješka cesta 6, 7000 Novo mesto izr. prof. dr. Franc Vrecer, mag. farm., Krka, d.d., Novo mesto, Šmarješka cesta 6, 7000 Novo mesto doc. dr. Saša Baumgartner, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 121 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles To zdrućevanje pospeřuje tudi eksotermna reakcija med funkcionalnimi skupinami ter velika pozitivna entropijska sprememba zaradi tvorbe kompleksa. Interpolimerni kompleksi so stabilizirani s kooperativno naravo njihovih vezi, kar pomeni, da je z nastankom prvih vezi v IPC tvorba naslednjih zaradi prostorskega priblićevanja sosednjih aktivnih mest (funkcionalnih skupin) ře pospeřena. Zaradi kooperativne narave vezi obstaja kritiśna dolćina polimerne verige za kompleksacijo, kar je v veśini primerov povezano z molekulsko maso polimera (1). Ko je molekulska masa majhna, je kljub prisotnosti lokalnih interakcijskih mest tećko povzrośiti konformacijske spremembe polimerov, saj je kooperativni uśinek majhen, zato je tudi kompleksacija majhna. Kooperativni uśinek se torej poveśuje s poveśanjem molekulske mase (poveśevanjem polimerne verige), na ta naśin se poveśa stopnja tvorbe kompleksa (5). Poleg kooperativnega efekta igrajo zelo pomembno vlogo tudi hidrofobne interakcije. Interpolimerna kompleksacija lahko bistveno vpliva na strukturo polimerne mreće. Rezultat tega so lahko povsem spremenjene fizikalne lastnosti polimerov, kot so nabrekanje, mehanske lastnosti in mehanizem transporta topljenca skozi IPC. Zaradi takega obnařanja imajo interpolimerni kompleksi moćnost uporabe na razliśnih podrośjih. Uporabimo jih lahko kot pomoćne snovi za izdelavo farmacevtskih oblik z nadzorovanim sprořśanjem, kot mehanske senzorje, biosenzorje, peptidne stabilizatorje ipd. (1). Na trćiřśu će obstaja dostavni sistem na osnovi ksantana in semenske sluzi roćiśevca imenovan TIMERx, ki je namenjen nadzorovanemu sprořśanju (6). 3 Delitev interpolimernih kompleksov (IPC-jev) 3.1 IPC-ji na osnovi vodikovih interakcij Interpolimerni kompleksi, ki so stabilizirani z vodikovimi vezmi, se tvorijo med polimeri, ki imajo funkcionalne skupine s pomanjkanjem Slika 2. Primer interpolimernega kompleksa na osnovi vodikovih interakcij med poliviniletrom dietilenglikola (PVEDEG) in poliakrilno kislino (PAA) v neioniziranem stanju (7). Figure 2. Example of interpolymer complex based on hydrogen interactions between poly (vinyl ether) of diethylene glycol (PVEDEG) with poly(acrylic acid) (PAA) in unionized state (7). 122 farm vestn 2008; 59 elektronov (polikisline) v neioniziranem stanju, ter polimeri s funkcionalnimi skupinami, ki vsebujejo podrośja z visoko elektronsko gostoto (etri, alkoholi, pirolidoni) (slika 2) (1). Ti kompleksi se ponavadi tvorijo v vodnem mediju v ozkem obmośju sestave topila, pH-ja in ionske mośi (4). Dodatno je kompleksacija stabilizirana s kooperativno naravo vezi kot tudi s hidrofobnimi interakcijami. Nekateri primeri polimernih sistemov, kjer pride do kompleksacije zaradi vodikovih vezi: poliakrilna kislina in poliakrilamid, poliakrilna kislina in polivinilalkohol, poliakrilna kislina in polietilenglikol polimetakrilna kislina in polietilenglikol, polimetakrilna kislina in polivinilpirolidon. Kompleksi med polimetakrilno kislino in polivinil -pirolidonom so najstabilnejři med kompleksi z vodikovimi vezmi Njihovo stabilnost pripisujejo mośnemu intermolekularnemu privlaku med polimernimi verigami ter hidrofobne stabilizacije vodikovih vezi z a-metilno skupino (1). 3.2 IPC-ji na osnovi elektrostatskih interakcij Do tvorbe IPC v tem primeru pride preko ionskih interakcij med kationskimi in anionskimi polimeri (enostaven primer: kompleks kislina-baza) (slika 3). IPC-ji na osnovi elektrostatskih interakcij nastanejo lahko tudi med ionskim in ionizabilnim polimerom. Hitosan se kot ionski polimer pogostokrat uporablja za pripravo IPC z ionizirajośimi akrilnimi polimeri, kot so akrilna kislina, metakrilna kislina in akrilamid. Najzanimivejřa lastnost teh sistemov je zmoćnost akrilnih polimerov, da tvorijo ionske komplekse preko interakcije karboksilne funkcionalne skupine z baziśno aminsko skupino deacetiliranih piranskih obrośev hitosanskih verig (8). Slika 3. Shematski prikaz ionske interakcije. Figure 3. Schematic presentation of ionic interaction. Interpolimerni kompleksi 4 Dejavniki, ki vplivajo na nastanek IPC 4.1 Vpliv dolćine verige, molekulske mase ter koncentracije polimera V splořnem velja, da je za tvorbo stabilnega kompleksa potrebna kritiśna dolćina polimerne verige. Kritiśna dolćina verige je odvisna od afinitete med dvema komplementarnima skupinama in sicer se zmanjřa, śe se so interakcije veśje (2). Dolćina verige polimera je ponavadi v sorazmerju z molekulsko maso polimera. V primeru interakcije razvejanega kopolimera polimetakrilne kisline (MAA) s polietilenglikolom (PEG) so avtorji (1) ugotovili, da veśja kot je bila molekulska masa uporabljenega PEG (daljře, razvejane verige), veśja je bila stopnja kompleksacije. Stopnja kompleksacije pa je bila mośno odvisna od pH medija, saj je kompleksacija narařśala z daljřanjem verige le v kislem. Nad pH 4,2 pa je priřlo do veśje interpolimerne kompleksacije v primeru najkrajřih razvejanih PEG (najmanjřa molekulska masa). Lowman in soavtorji (1) vzrok pripisujejo mośnejři ionizaciji kislinskih skupin MAA pri viřjem pH-ju kar naj bi v primeru veśjih PEG enot vodilo do veśjega nabrekanja in poslediśno moćne manjře kompleksacije. V drugi řtudiji (9) so preuśevali vpliv koncentracije in molekulske mase polimera na kritiśno pH-vrednost, pri kateri se tvorijo kompleksi. Preuśevali so kompleksacijo med poliakrilno kislino (PAA) in polivinileter etilenglikolom (PVEEG). Nastanek kompleksov so spremljali z merjenjem motnosti - turbidimetrijo. Ugotovili so, da je kritiśna pH-vrednost, ko pride do nastanka kompleksa takrat, ko pride do mośnega poveśanja motnosti. Pod to vrednostjo so zmesi kompleksov polimerov motne in pride do oboritve kompleksov iz disperzije. Poveśanje polimerne koncentracije pa premakne kritiśne pH k viřjim pH-vrednostim. Ta pojav pojasnjujejo (9) z zmanjřanjem ionizacije PAA s poveśanjem njene koncentracije v raztopini Molekulska masa PAA ni vplivala na kritiśno pH-vrednost tvorbe kompleksa PVEEG-PAA. Slednje avtorji (9) razlagajo z dejstvom, da so bile vse razliśne preiskovane PAA verige će dovolj velike, da je bila moćna popolna tvorba kompleksa. 4.2 Vpliv pH in temperature V sistemu, ki vsebuje řibko polibazo (npr. polietilenimin (PEI)), polikislino (npr. poliakrilno kislino (PAA)) in proton akceptorski neionski polimer (npr. polietilenoksid (PEO)), je selektivnost tvorbe makromolekularnega kompleksa z razliśnimi pari polimerov odvisna od pH-sistema. V tem trokomponentnem sistemu je v kislih medijih (PEI povsem protoniran, PAA skoraj niś) prvenstveno favorizirana tvorba kompleksa preko vodikovih vezi med PAA in PEO, v nevtralnem pH (PAA in PEI oba delno ionizirana) je favoriziran nastanek polielektrolitnega kompleksa med PAA in PEI. V baziśnem pH-okolju (PAA popolnoma disocirana, PEI skoraj niś) pa ne pride do tvorbe ne polielektrolitnega kompleksa, in ne kompleksa, ki bi bi posledica vodikovih vezi. V tem primeru je torej pH-sistema bistven za selektivnost tvorbe kompleksa med razliśnimi pari polimerov, saj vpliva na interakcijske lastnosti med komponentami (10). Na tvorbo IPC vpliva tudi temperatura medija preko vpliva na jakost vezi, ki većejo polimere med seboj. Pri poviřanih temperaturah pride le do rahlih sprememb v mośi kolumbovih (elektrostatskih) vezi medtem ko se vodikove vezi prekinejo pri dovolj visoki temperaturi Potrebno je upořtevati ře hidrofobni efekt, saj le-ta igra pomembno vlogo pri stabilizaciji IPC. Znano je, da se hidrofobne interakcije poveśajo z narařśujośo temperaturo v vodnem mediju. Verjetno pa je efekt hidrofobnih interakcij na stabilizacijo vodikovih vezi v kompleksu mośnejři kot v primeru stabilizacije kolumbovih sil v polielektrolitnem kompleksu (10). 4.3 Vpliv dodanih ionov in ionske mośi Vpliv anorganskih soli na kompleksacijo z vodikovimi vezmi je odvisen od dveh nasprotujośih si dejavnikov. Po eni strani poveśanje ionske mośi raztopine vodi v delno disociacijo poli (karboksilnih kislin), kar je lahko neugodno za kompleksacijo. Po drugi strani dodatek anorganskih soli poslabřa termodinamsko kakovost topila z ozirom na polimere, saj njihova prisotnost vodi do ojaśanja hidrofobnih interakcij, ki so ugodne za kompleksacijo. Ravnotećje med tema dvema nasprotujośima si vplivoma bo dolośalo, kako se bo polimerni sistem v raztopini odzval na prisotnost ionov z majhno molekulsko maso. Budtova s sodelavci (4) je porośal, da poveśanje ionske mośi medija zaustavi kompleksacijo poliakrilne kisline (PAA) s polivinilalkoholom (PVA) in hidroksietilcelulozo (HEC) (4). Chen in Morawetz (4) sta demonstrirala, da dodatek NaCl zmanjřa intenziteto interakcij med PAA in polivinilpirolidonom (PVP) in polietilenoksidom (PEO) Sivadasan in sodelavci (4) so odkrili, da poveśanje ionske mośi vodi do znićanja pH-ja, pri katerem pride do interpolimernih interakcij med PAA in poliakrilamidom z modificiranimi pireni. Staikos in sodelavci (4) pa so pokazali, da prisotnost NaBr v raztopini pospeřuje tvorbo polikompleksa med PAA in PEO. Śe povzamemo, v literaturi lahko najdemo precej nasprotujośa si mnenja o vplivu ionske mośi oziroma ionov na interpolimerno kompleksacijo (4). 4.4 Vpliv medija Tekmovanje polimer-polimer interakcij z interakcijami polimer-topilo je odlośilni dejavnik, ki vpliva na kompleksacijo v raztopinah. V řtudiji avtorjev (9) so preuśevali vpliv medija za kompleksacijo PVEEG-PAA (polivinileter etilenglikola - poliakrilna kislina). Preskuřali so vodo, etanol in njuni meřanici. Ugotovili so, da je v vodnih raztopinah konformacija molekul IPC stabilizirana z hidrofobnimi interakcijami nepolarnih skupin (slika 4(A)). Nasprotno pa so v alkoholnih raztopinah hidrofilni IPC fragmenti povezani z intermolekularnimi vodikovimi vezmi in alkoholne molekule solvatirajo hidrofobne dele polimerov (slika 4(B)). Zato lahko kompleksi nastanejo tako v vodi kot v etanolu, imajo pa seveda razliśne povrřinske lastnosti. V zmeseh vode in alkohola pa naj bi sośasna solvatacija hidrofilnih skupin z vodo in hidrofobnih skupin z alkoholom vodila do razvitja IPC (slika 4(C)). V dolośenih razmerjih vode in etanola se kompleksi ne tvorijo, ker so interakcije polimer-topilo mośnejře od polimer-polimer interakcij (9). farm vestn 2008; 59 1231 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles Slika 4. Moćne IPC strukture PVEEG-PAA IPC v vodi (A), alkoholu (B) in njihovih meřanicah (C). Molekule vode in alkohola so oznaśene z W oziroma A. Śrni krogci predstavljajo hidrofilne skupine. Obarvano obmośje oznaśuje hidrofobne interakcije (A) (9). Figure 4. Possible IPC structures of PVEEG-PAA IPCs in water (A), alcohol (B) and their mixture (C). Molecules of water and alcohol are indicated as W and A respectively. Black circles indicate the hydrophillic groups. The field area indicates the hydrophobic interactions (A) (9). 5 Parametri karakterizacije IPC-jev Kot smo će omenili se lahko IPC-ji bistveno razlikujejo v svojih lastnostih od izhodnih (osnovnih) polimerov. Parametri s katerimi lahko vrednotimo oziroma dokazujemo nastanek interpolimernega kompleksa so lahko naslednji • Viskoznost in motnost (2); • Temperatura steklastega prehoda (11); • Sila nabrekanja (12) • Natezna trdnost (1); • Slike elektronskega mikroskopa (13); • ATR-FTIR spekter (14); • NMR (13) • Povrřinska energija (15); • Sprořśanje zdravilnih uśinkovine iz ogrodja interpolimernga kompleksa (16) • Stabilnost (10) 6 Primeri IPC v farmacevtskih oblikah 6.1 Trdne disperzije z vgrajenim fenacetinom Prouśevali so vpliv vgradnje fenacetina (FEN) v IPC na sprořśanje iz zrnc, narejenih iz trdnih disperzij. Za izdelavo trdnih disperzij so uporabili śist PEO (polietilenoksid) razliśnih molekulskih mas ter CP (karboksivinil polimer). Med njima lahko v ustreznih pogojih pride do nastanka IPC zaradi tvorbe vodikovih vezi med etersko skupino PEO in karboksilno skupino CP. Profil sprořśanja śistega fenacetina in fenacetina iz zrnc trdnih disperzij (IPC) z razliśnimi molekulskimi masami PEO je prikazan na sliki 5. Iz slike je razvidno, da je sprořśanje iz trdnih disperzij in kompleksov pośasnejře kot sprořśanje samega śistega fenacetina. Razvidno je tudi, da je sprořśanje iz trdnih disperzij odvisno od molekulske mase uporabljenega PEO v IPC, s śimer lahko uravnavamo kinetiko sprořśanja. Vpliv molekulske mase PEO na sprořśanje fenacetina iz PC lahko vidimo na sliki 6. T50 fenacetina iz trdnih disperzij se je poviřeval s poveśevanjem molekulske mase PEO do MM 35000. Z nadaljnim veśanjem molekulske mase se je T50 znićeval. Moćen vzrok, da se z nadaljnim poveśevanjem mase PEO sprořśanje ni dodatno upośasnjevalo je v manjři stopnji kompleksacije. S poveśevanjem molekulske mase PEO nad 35000 se je namreś efektivna specifiśna povrřina PEO, ki je zmoćna tvorbe vodikovih vezi s CP, zmanjřala zaradi sośasnega navijanja in zapletanja verig PEO (5). Slika 5. Vpliv molekulske mase PEO na profile sprořśanja fenacetina (FEN) iz PEO-CP trdnih disperzij (IPC). Śrtkana śrta oznaśuje profil raztapljanja śistega FEN. Trdne disperzije (molekulska masa PEO: , 2000; 0, 3000; ?, 8200; V, 10 750; ?, 20 000; D, 35 000; , 135 000; A, 700 000; ?, 4 500 000) (n = 3) (3). Figure 5. Effect of molecular weight of PEO on release profiles of phenacetine (FEN) from PEO-CP solid dispersions (IPC). The dotted line: dissolution profile of pure FEN. Solid dispersions (the molecular weight of PEO: •, 2000; 0, 3000; ?, 8200; V, 10 750; ?, 20 000; ?, 35 000; , 135 000; A, 700 000; ?, 4 500 000) (n = 3) (3). 124 farm vestn 2008; 59 Interpolimerni kompleksi Slika 6. Vpliv molekulske mase PEO na T50 fenacetina (FEN) iz IPC med PEO in CP (n = 3) (5). Figure 6. Effect of molecular weight of PEO on T50 phenacetine (FEN) from IPC of PEO and CP (n = 3) (5). 6.2 Mukoadhezivne mikrosfere z vgrajenim klarilromicinom ali amoksicilinom Ugotovljeno je bilo, da ima poliakrilna kislina (PAA) dobre mukoadhezivne lastnosti. Le-te ohrani tudi v IPC, ki ga tvori s polivinilpirolidonom (PVP) preko vodikovih vezi. Topnost PAA-PVP kompleksa se v raztopinah zmanjřa in pride do oboritve. Preko tvorbe IPC je moćna tudi izdelava mikrosfer. Vanje so vgrajeval klaritromicin in amoksicilin, da bi dosegli podaljřano sprořśanje. Uśinkovitost vgradnje klaritromicina v IPC mikrosfere je bila viřja kot v primeru amoksicilina (17). Hitrost sprořśanja amoksicilina, vgrajenega v kompleksne mikrosfere, je bila veśja od hitrosti sprořśanja vgrajenega klaritromicina pri vseh preuśevanih pH-jih (slika 7). Sprořśanje amoksicilina je bilo skoraj povsem pH neodvisno, medtem ko je bila hitrost sprořśanja klaritromicina od pH odvisna (pri pH 4,0 je bilo sprořśanje Slika 7. Sprořśanje amoksicilina (A) in klaritromicina (B) iz PAA/PVP IPC mikrosfer pri pH: O, 2,0;», 2.0 (podatki popravljeni zaradi degradacije uśinkovine); A, 4,0; ?, 6,8 pri 37 °C (n=3) (17). Figure 7. Release of amoxicillin (A) and clarithromycin (B) from the PAA/PVP complex at pH: O, 2,0; •, 2.0 (data corrected for degradation of active substance); ?, 4,0; ?, 6,8 at 37°C (n=3) (17). pośasnejře v primerjavi s pH 2,0, pri pH 6.8 pa hitrejře, kar avtorji (17) razlagajo z veśjim vplivom ogrodja). V vseh primerih je bilo sprořśanje uśinkovin iz kompleksnih mikrosfer PAA-PVP pośasnejře glede na sprořśanje iz mikrosfer, narejenih le iz PVP, kar pa na grafih (slika 7) ni prikazano (17). 6.3 Žvecljive tablete z vgrajenim ibuprofenom Za ćveśljive tablete je zelo pomembno, da so dobrega okusa. S tem namenom so pripravili ćveśljive tablete iz IPC med PVAP in PVP. Vanj so s koprecepiatcijo vkljuśili ibuprofen kot modelno uśinkovino ter tako dobili zrnca. Slike posnete z elektronskim mikroskopom (slika 8) kaćejo, da se śist buprofen nahaja v obliki podolgovatih kristalov, zrnca polimernega kompleksa z ibuprofenom pa so v obliki agregatov. Zrnca ibuprofena v IPC so nato stisnili v tablete. Izkazalo se je, da je trdnost teh tablet nekoliko nićja kot trdnost tablet z ibuprofenom, (B) Slika 8. SEM slike śistega ibuprofena (A) ter ibuprofena v zrncih polimernega kompleksa (B) (18). Figure 8. SEM pictures of pure ibuprofene (A) and ibuprofene in granules of polymer complex (B) (18). farm vestn 2008; 59 125 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles Tabela 1. Sestava žvecljivih tablet z ibuprofenom (18). Table 1. Compositions of chewable ibuprofen tablets (18). Sestava tablet Sestavina r II III IV V Ibuprofen 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg - PVP-PVAP kompleks - - - - 512 mg" PVP - 312 mg - - - PVAP - - 312 mg - - PVAP:PVP***(2:1) - - - 312 mg - Aroma višnje 156 mg 156 mg 156 mg 156 mg 156 mg Laktoza 162 mg - Koruzni škrob 150 mg - Masa tablete 668 mg 668 mg 668 mg 668 mg 668 mg Trdnost (kp) 5,7 >20 18 >20 7,1 * Pripravljeno z metodo vlažne granulacije, " Vsebnost ibuprofena bila 200 mg, "" Fizikalna zmes vgrajenim v druge pomoćne snovi (tabela 1), vendar ře venomer ustrezna. Izdelane tablete so imele poleg ostalih ustreznih tehnolořkih parametrov tudi dober okus v ustih, kar je bil namen řtudije. Pri preuśevanju sprořśanja ibuprofena iz tako dobljenih tablet so ugotovili, da je pri pH 1,2 sprořśanje minimalno (2 % v 3 urah), pri pH 7,4 pa je bilo sprořśanje nekoliko pośasnejře kot pri ostalih preskuřanih tabletah. To pomeni, da je uporaba IPC med PVAP in PVP potencialno ustrezna za pripravo zrnc z dobrim okusom za izdelavo ćveśljivih tablet (18). 7 Prihodnost IPC-jev? Interpolimerni kompleksi predstavljajo alternativne pomoćne snovi za farmacevtske oblike z nadzorovanim sprořśanjem. Njihov pomen bo v prihodnosti zagotovo narařśal. Za zdaj je pri njihovem uveljavljanju omejujośe ugotavljanje vseh dejavnikov, ki na interpolimerno kompleksacijo vplivajo ter iskanje najugodnejřih kombinacij polimerov in njihovih razmerij Prav tako je relativno slabo raziskano njihovo obnařanje v fiziolořkih (in vivo) pogojih, kjer imamo sośasen vpliv veśih dejavnikov (temperatura, ioni, povrřinsko aktivne snovi, …). Ker stabilnost kompleksov vpliva na sprořśanje, bi potencialno lahko priřlo tudi do t.i. dose dumpinga v primeru prehitrega sprořśanja. Danes obstajajo tudi će raśunalniřki modeli napovedovanja optimalnih interakcij med polimeri z namenom ugotavljanja ćelene kombinacije zmesi polimerov za tvorbo ustreznega interpolimernega kompleksa. Eksperimentalni modeli in molekulski (raśunalniřki) modeli se zaenkrat razlikujejo v enem bistvenem aspektu: v molekulskem modelu se polimerne verige nahajajo v »suhem« okolju, medtem ko eksperimentalni model vkljuśuje tudi vpliv topila. Zavedati se moramo, da bi vkljuśitev molekul topila v simulacijo precej poveśala strořke in śas izraśunavanja. Pomembna razlika med simulacijo in eksperimentalnim modelom je tudi v dolćini verig polimerov. V raśunalniřki simulaciji ne uporabljajo zelo dolgih polimernih verig, saj ćelijo obdrćati śas raśunanja na sprejemljivem nivoju, hkrati pa ćelijo zagotoviti ustrezno mobilnost verig znotraj dolośenega śasovnega okvirja. Seveda bi lahko uporabili tudi daljře polimerne verige posameznega polimera vendar bi bilo teh verig zato ustrezno manj, s tem pa bi postal sistem manj realen (19). Za razmahnitev uporabe IPC bo torej nujna uporaba raśunalniřkih modelov. Za zdaj pa se bolj ali manj zanařamo na eksperimentiranje. 8 Literatura 1. Lowman AM, Peppas NA: Molecular analysis of interpolymer complexation in graft copolymer networks. Polymer 2000; 41: 73-80. 2. Bian F, Liu M: Complexation between poly(N,N-diethylacrylamide) and poly(acrylic acid) in aqueous solution. Eur Polym J 2003; 39: 1867-1874. 3. Luo X, Goh SH, Lee SY, Tan KL: Interpolymer complexation between poly(N-methyl-4-piperidinyl methacrylate) and acidic polymers. Macromolecules 1998; 31: 3251-3254. 4. Khutoryanskiy VV, Mun GA, Nurkeeva ZS, Dubolazov AV: pH and salt effects on interpolymer complexation via hydrogen bonding in aqueous solutions. Polym Int 2004; 53: 1382-1387. 5. Ozeki T, Yuasa H, Kanaya Y: Control of medicine release from solid dispersion composed of the poly(ethylene oxide)-carboxyvinylpolymer interpolymer complex by varying molecular weight of poly(ethylene oxide). J Controlled Release 1999; 58: 87-95. 6. McCall TW, Baichwal AR, Staniforth JN: TIMERx Oral Controlled-Release Drug Delivery System, v: Rathbone MJ, Hadgraft J Roberts MC (Eds.), Modified-Release Drug Delivery Technology. Marcel Dekker, NY, Basel, 2003, 11-19. 7. Nurkeeva ZS, Mun GA, Khutoryanskiy VV, Sergaziyev AD: Complex formation of polyvinyl of diethylene glycol with polyacrylic acid II. Effect of molecular weight of polyacrylic acid and solvent nature. Eur Polymer J 2002; 38: 313-316. 126 farm vestn 2008; 59 Interpolimerni kompleksi 8. Peniche C, Argüelles-Monal W, Davidenko N, Sastre R, Gallardo A, Roman JS: Self-curing membranes of chitosan/PAA IPNs obtained by radical polymerization: preparation, characterization and interpolymer complexation. Biomaterials 1999; 20: 1869-1878. 9. Nurkeeva ZS, Mun GA, Khutoryanskiy VV, Zotov AA, Mangazbaeva RA: Interpolymer complexes of polyvinyl ether) of ethylene glycol with poly(carboxylic acids) in aqueous, alcohol and mixed solutions. Polymer 2000; 41: 7647-7651 10. Vasheghani BF, Rajabi FH, Ahmadi MH, Nouhi S: Stability and thermodynamic parameters of some selective intermacromolecular complexation. Polym Bull 2006; 56: 395-404. 11. Zhou X, Goh SH, Lee SY, Tan KL: Interpolymer complexation between poly(vinylphosphonic acid) and poly(vinylpyridine)s. Polymer 1997; 38: 5333-5338. 12. Bell CL, Peppas NA: Measurement of the swelling force ionic polymer networks. III. Swelling force of interpolymer complexes. J Controlled Release 1995; 37: 277-280. 13. Kumar V, Yang T, Yang Y: Interpolymer complexation. I Preparation and characterization of a polyvinyl acetate phthalate-polyvinylpyrolidone (PVAP-PVP) complex. Int J Pharm 1999; 188: 221-232. 14. Dumitriu S, Magny P, Montane D, Vidal PF, Chornet E: Polyionic hydrogels obtained by complexation between xanthan and chitosan: their properties as supports for enzyme immobilization. J Bioactive and Comp Polym 1994; 9: 184-209. 15. Liu S, Jiang M, Chan CM, Weng LT: Elimination of surface enrichment in polymer blends via interpolymer complexation. Macromolecules 2001; 34: 3802-3804. 16. Fukuda M, Peppas NA, McGinity JW: Properties of sustained release hot-melt extruded tablets containing chitosan and xanthan gum. Int J Pharm 2006; 310: 90-100. 17. Chun MK, Sah H, Ckoi HK: Preparation of mucoadhesive microspheres containing antimicrobial agents for eradication of H. pylori. Int J Pharm 2005; 297: 172-179. 18. Kumar V, Yang T, Yang Y: Interpolymer complexation. II. Entrapment of ibuprofen by in-situ complexation between polyvinyl acetate phthalate (PVAP) and polyvinylpyrrolidone (PVP) and development of a chewable tablet formulation. Pharm Dev Tech 2001; 6: 71-81 19. Moolman FS, Meunier M, Labuschagne PW, Truter PA: Compatibility of polyvinyl alcohol and poly(methyl ether-co-maleic acid) blends estimated by molecular dynamics. Polymer 2005; 46: 6192-6200. farm vestn 2008; 59 127 Zaposleni v zdravstvu ste na dobri poti v prijetno starost. Kot clani sklada ZVPSJU ste že vkljuceni v kolektivno dodatno pokojninsko zavarovanje, kamor vas delodajalec mesecno vplacuje sredstva za vas. Vendar pa boste za še bolj udobno starost morali varcevati tudi sami. Ker je višina pokojninske rente odvisna od višine vplacil, boste s samostojnim vplacevanjem premij v že obstojece varcevanje poskrbeli, da bo višina rente zadostila vašim pricakovanjem. Odlocite se in poskrbite za svojo aktivno starost! Brezplacna telefonska številka; 080 23 45 wfo.zvpsju@kapiiahka-druzba.si y,vw\v.kapitalska-druzba.si KAPITALSKA DRUŽBA Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi Zdravljenje bakterijskih okućb z bakteriofagi Bacteriophage therapy Tomaž Bratkovic, Andrej Preželj Povzetek: Ideja o uporabi bakteriofagov za zdravljenje okućb, povzrośenih z bakterijskimi patogeni, je stara će skoraj stoletje. Nerazumevanje biologije bakteriofagov in pomanjkanje nadzorovanih kliniśnih raziskav, predvsem pa odkritje antibiotikov, so bakteriofagno terapijo po zaśetnem zagonu v zahodnih drćavah pahnile v pozabo. Vse bolj pereś problem odpornosti bakterijskih patogenov proti kliniśno pomembnim antibiotikom je v zadnjem desetletju obudil zanimanje za bakteriofagna zdravila. Znanje, ki je rezultat sodobnih raziskav, ponuja realno moćnost novih terapevtskih pristopov in odpira tudi nekatera povsem nova podrośja uporabe bakteriofagov. Kljuśne besede: bakterijske okužbe, bakteriofagi, antibiotiki, encibiotiki Abstract: The use of bacteriophage for combating bacterial infections was proposed almost a century ago. However, after the initial enthusiasm the idea quickly faded in the West with the discovery of antibiotics, accompanied by lack of phage biology understanding and insufficient proof of therapeutic efficacy of bacteriophage medicines due to inappropriately designed clinical trials. Today, as we are faced with accelerating emergence of bacterial resistance to antibiotics, the idea of bacteriophage-based drugs was brought back to life. Knowledge gathered over all these years offers a solid foundation on which to build new therapeutic approaches and develop alternative areas of bacteriophage application Keywords: bacterial infections, bacteriophages, antibiotics, enzybiotics 1 Bakterijski virusi Bakteriofagi (krajře: fagi) so preprosti virusi, ki se razmnoćujejo izkljuśno v bakterijskih celicah. Odkril jih je francosko-kanadski mikrobiolog Félix d’Herelle. Pri svojih raziskavah je opazil, da so v nekaterih bakterijskih kolonijah na agarnem gojiřśu prisotna drobna podrośja, kjer bakterije ne uspevajo. Pri prenosu takih kolonij v bakterijsko kulturo v tekośem gojiřśu je će v nekaj urah opazil, da je priřlo do odmrtja vseh bakterij in poslediśno do zbistritve gojiřśa. Sklepal je, da je vzrok mikroorganizem, ki se kot zajedalec »hrani« z bakterijami - od tod izhaja tudi ime bakteriofag (grřko »tisti, ki jé bakterije«). Enak pojav (naknadno poimenovan Twort-d’Herelle-ov fenomen) je pred d’Herelle-om opisal angleřki bakteriolog Frederick Twort, a je delovanje zmotno pripisal za bakterije toksiśnemu proteinskem dejavniku (1, 2). Fagi so v naravi prisotni skoraj povsod. Najdemo jih v slanih in sladkih vodah, v prsti, v hrani in tudi v pitni vodi. V prebavnem traktu ćivali in śloveka predstavljajo pomemben del normalne gastrointestinalne flore. Ocenjujejo, da je njihovo celokupno řtevilo reda velikosti 1031 kar je priblićno desetkrat veś, kot je velikost celokupne svetovne bakterijske populacije (3, 4) Genetsko so bakteriofagi izjemno heterogena skupina. Pri najmanjřih tvorijo genom vsega řtirje geni, dedni material najveśjih pa gradi tudi do řtiristo genov. Genska informacija je prisotna bodisi v obliki enoverićne ali dvoverićne RNA oziroma DNA, v linearni ali cikliśnimi obliki. Ne glede na morfolořko pestrost oblik je vsak virusni delec (virion) zgrajen iz osrednje nukleinske kisline, ki jo obdaja proteinski plařś (3). Praviloma so bakteriofagi glede na gostitelja ne le vrstno, temveś pogosto celo sevno visoko specifiśni. Primarni dejavnik, ki dolośa gostiteljsko specifiśnost, so povrřinske strukture na bakterijskih celicah, po svoji naravi proteini ali ogljikovi hidrati. Le-te bakteriofag izkoriřśa kot receptorje za pritrditev na bakterijo (3, 5) Skladno s heterogenostjo bakteriofagov imajo ti tudi nadvse razliśne ćivljenjske cikle. V splořnem lośimo liticne (virulentne) in lizogene (temperatne) bakteriofage (slika 1). 2 Zgodovina zdravljenja bakterijskih okućb z bakteriofagi d’Herelle je svoje poskuse iz laboratorija kmalu prenesel na ćivali Glede na njegova navajanja mu je uspelo mośno omejiti epidemijo bakterijskega gastroenteritisa med kokořmi, tako da jim je v hrano dodajal bakteriofage, specifiśne za bakterijo Salmonella gallinarum. Uspeřen naj bi bil tudi pri zajezitvi epidemije hemoragiśne septikemije pri vodnih bivolih, katerim je bakteriofage, specifiśne za bakterijo Pasteurella multocida, injiciral intravensko (7). Poskuse je nato nadaljeval ře na sebi, ślanih drućine in sodelavcih. Opogumljen z rezultati je d’Herelle poskusil tudi z zdravljenjem okućb pri bolnikih Řtevilna porośila priśajo, da je bilo mogośe v dobi pred odkritjem antibiotikov z d’Herelle-ovo metodo odpraviti prej neozdravljive bolezni bakterijskega vzroka, kakrřne so bubonska kuga, krvave griće dr. Tomaž Bratkovic, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, UL, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija dr. Andrej Preželj, mag. farm., Lek farmacevtska družba d.d., Verovškova 57, 1526 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2008; 59 129 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles bakteriofagov genom proteinski plašc C^D i vstop bakteriofagovega genoma v gostiteljsko celico J izstop bakteriofagove DNA iz bakterijskega genoma celicna delitev O LIZOGENI CIKEL pomnozevanje bakteriofagovega genoma vgraditev bakteriofagove DNAvbakterijsk genom ŁSB liza bakterijske celice in sprostitev bakteriofagov (S) profag sestavljenje novih virusnih delcev Slika 1. Primerjava liticnega (levo) in lizogenega cikla (desno) (prirejeno po 6). Nekateri bakteriofagi so stabilno liticni in svoje DNA ne vgrajujejo v genom gostiteljske bakterije. Bakteriofag po okućbi bakterije izkoriřśa celiśne mehanizme za pomnoćevanje lastnega genoma in sintezo strukturnih proteinov ovojnice. Nazadnje bakteriofag izzove smrt celice in pomnoćeni virusni delci se sprostijo iz lizirane bakterije. Lizogeni bakteriofagi svoj dedni material vgradijo v genom gostiteljske celice (tak latentni bakteriofag imenujemo profag), ki se tako prenařa na vse hśerinske bakterije, nastale z vegetativno delitvijo okućene celice. Ob indukciji profag izstopi iz bakterijskega genoma (obśasno »odnese« s seboj tudi del bakterijskega genoma in ga naknadno vgradi v genom nove gostiteljske celice; proces imenujemo transdukcija). Bakteriofag nato vstopi v t. i. litiśni cikel, pri tem nastajajo novi bakteriofagi. Figure 1. Comparison of lytic (left) and lysogenic cycle (right) (6). Some phages are stably lytic and do not integrate their DNA into hosts’ genomes. Upon infecting the bacterium phage uses the cell’s mechanisms to replicate the viral genome and produce capsid proteins. Multiplied virions are released from bacterium through cell lysis. Lysogenic phages, on the other hand, integrate their genetic material into host cells’ genomes (such dormant phages are called prophages) and are thus transferred to all daughter cells (bacterial clones). Following induction, prophage enters the lytic cycle, forming new virions. Sometimes a lysogenic phage transfers parts of old host genome to newly infected bacteria in a process known as transduction. in kolera (1, 7). Tako imenovana bakteriofagna terapija je postala v dvajsetih letih prejřnjega stoletja zelo popularna, sam d’Herelle pa naj bi si prislućil celo nominacijo za Nobelovo nagrado za medicino (8). Do řtiridesetih let prejřnjega stoletja je veś farmacevtskih podjetij v Franciji in Zdrućenih drćavah Amerike trćilo zdravila, ki so vsebovala bakteriofage, vendar pa je splet okoliřśin (odkritje betalaktamskih antibiotikov), kot tudi nepoznavanje rokovanja s pripravki botrovalo negativnim odzivom Sveta za farmacijo in kemijo (Council on Pharmacy and Chemistry) uglednega Ameriřkega zdravniřkega zdrućenja (American Medical Association). Ośitki novi tehnologiji so leteli predvsem na pomanjkanje ustrezno izvedenih kliniśnih raziskav, ki bi nedvoumno potrjevale uśinkovitost bakteriofagnih zdravil (2, 7). V nasprotju z Zahodom se je uporaba bakteriofagov v Vzhodni Evropi ohranila vse do devetdesetih let prejřnjega stoletja. Najveśja centra bakteriofagne terapije sta aktivna ře danes. V Wroclawu deluje Hirszfeldov inřtitut za imunologijo in eksperimentalno terapijo, v Tbilisiju pa Eliavin inřtitut za bakteriofage, mikrobiologijo in virologijo (slednjega je soustanovil sam d’Herelle). Sovjetski in poljski zdravniki so porośali o 80-90 % uspeřnosti v boju s trdovratnimi bakterijskimi patogeni, pogosto odpornimi proti razliśnim skupinam antibiotikov. Zahodni svet je obdrćal znanstveno sporno, politiśno motivirano odklonilno staliřśe do bakteriofagne terapije, verjetno tudi zaradi nedostopnosti novejře znanstvene literature in naśelnem zavraśanju vsega sovjetskega (1, 5, 7). Kot zanimivost naj omeniva, da so ře v sedemdesetih letih prejřnjega stoletja pod pokroviteljstvom Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) v Pakistanu potekale kliniśne raziskave, v okviru katerih so potrdili primerljivo uśinkovitost zdravljenja kolere s tetraciklinskimi antibiotiki in visokimi odmerki bakteriofagov, danim per os (7) 130 farm vestn 2008; 59 Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi 3 Sodoben pogled na bakteriofagno terapijo Bakteriofagna terapija, v svojih zacetkih skrajno revolucionarna tehnologija, je bila za tedanji svet pred svojim casom. Takratno znanje s podrocja mikrobiologije in medicine je ni dohajalo, zato je bila njena terapevtska vloga in tržna uveljavitev vnaprej obsojena na neuspeh Poleg tega je ob uvedbi antibiotikov v klinicno prakso sprva kazalo na dokoncno zmago cloveštva nad patogenimi bakterijami in o alternativnih metodah zdravljenja bakterijskih okužb niso razmišljali Danes je potreba po alternativnih zdravljenjih okužb velika. Ena od možnih rešitev je identifikacija novih tarc in razvoj protimikrobnih ucinkovin z novimi mehanizmi delovanja, torej kemoterapevtikov, proti katerim bakterije še niso odporne. Še vedno veliko vlagajo tudi v razvoj zaviralcev bakterijskih proteinov, ki so nosilci odpornosti. Nekatere takšne ucinkovine so že ucinkovita podpora uveljavljenim antibiotikom. Na drugi strani sta napredek v poznavanju biologije bakteriofagov ter razvoj biomedicinskih tehnologij v zadnjem desetletju omogocila ponovno znanstveno ovrednotenje bakteriofagne terapije. Primerjavo lastnosti antibiotikov in bakteriofagov kot protibakterijskih zdravil podaja preglednica 1 Trenutno je v svetu le nekaj deset manjših in srednje velikih biotehnoloških podjetij, ki predstavljajo prvi val razvoja tehnologij za uporabo bakteriofagov v humani in veterinarski medicini, poljedelstvu in prehrambeni industriji (9). V nadaljevanju predstavljava pogled na bakteriofagno terapijo skozi oci sodobne znanosti vkljucno z nekaterimi novimi koncepti in biotehnološkimi pristopi v nacrtovanju protimikrobnih (bakteriofagnih) zdravil prihodnosti. 3.1 Klasiśna bakteriofagna terapija Eticni standardi biomedicinskih raziskav v današnjem casu so neprimerljivi s tistimi z zacetka 20. stoletja, ko je d’Herelle pricel z uvajanjem bakteriofagne terapije. Takó zavedanje o podrobnem dogajanju med bakteriofagovim življenjskim ciklom in potencialnim imunskim odzivom, ki bi utegnil spremljati vnos bakteriofagov v organizem, vzbuja številne tehtne pomisleke o varnosti bakteriofagnih zdravil. A z današnjim znanjem zagovorniki bakteriofagne terapije lahko kritikom in skeptikom ponudijo sprejemljive rešitve. Osnovna zahteva za zagotovitev varnosti bakteriofaga kot zdravila je, da izberemo vrsto, ki je stabilno liticna in ne prenaša genetskega materiala s transdukcijo med bakterijami (glej tudi sliko 1). Lizogen bakteriofagi niso zgolj manj ucinkoviti, temvec ob njihovi uporabi obstaja tudi nevarnost horizontalnega prenosa antibioticne odpornosti, bakterijskih toksinov in virulentnih dejavnikov. Pri tem se lahko prej nenevarni bakterijski sevi pretvorijo v patogene. Transdukcija je sicer možna tudi pri liticnih bakteriofagih, a je precej manj verjetna (3, 10). Z dolocitvijo nukleotidnega zaporedja fagnega genoma in naknadno bioinformaticno analizo je pred nacrtovano uporabo dolocenega bakteriofaga smiselno preveriti, ali so v genomu prisotni geni, ki kodirajo znane alergene, toksine in virulentne dejavnike (3). Endotoksine, ki izvirajo iz liziranih gostiteljskih celic, v katerih pomnožujejo bakteriofage v bioreaktorjih, je z modernimi separacijskimi tehnikami, kot sta ultracentrifugiranje in ionsko-izmenjevalna kromatografija, mogoce ucinkovito odstraniti (3). Pri sterilizaciji bakteriofagnega zdravila je potrebno izbrati metode, ki zagotavljajo ohranitev infektivnosti bakteriofagov, in validirati pogoje shranjevanja (6). Vsekakor pa je najpomembneje preveriti ucinkovitost bakteriofaga kot bakteriolitika na živalskem modelu bakterijske okužbe, saj se posamezne bakteriofagne vrste v pogojih in vivo obnašajo razlicno (6). Skurnik in sod. (6, 11, 12) so ugotovili, da bakteriofaga PY100 in f Ye03-12, dana mišim per os (v neodvisnih raziskavah), ne zašcitita živali pred naknadno izzvano okužbo z bakterijo Yersinia enterocolitica, ceprav so v kulturah in vitro opazili popolno lizo bakterij. Drugi raziskovalci porocajo o visoki ucinkovitosti svojih bakteriofagov, ki so statisticno znacilno zmanjšali umrljivost pri miših po intraperitonealnem injiciranju v casu do 5 ur po okužbi z virulentnima bakterijama Enterococcus faecium (13) in Staphylococcus aureus (14). Farmakokineticne lastnosti bakteriofagov niso primerljive s klasicnimi ucinkovinami. Praviloma se zadržujejo in pomnožujejo na samem mestu okužbe le v prisotnosti gostiteljske bakterije, kar je s terapevtskega in toksikološkega vidika ugodno, znižuje pa tudi potrebo po veckratnem odmerjanju (1, 7). Po intravenskem dajanju se bakteriofagi razporedijo v vecino organov, kar omogoca njihovo uporabo za razlicne tipe infekcij. Zanimivo je, da se (vsaj nekatere vrste) kljub precejšnji velikosti ucinkovito absorbirajo iz prebavnega trakta in prehajajo celo v urin (4). Iz organizma se pospešeno odstranjujejo, za kar je pretežno odgovoren retikuloendotelijski sistem. Nekateri bakteriofagi so dokazano imunogeni in izzovejo tvorbo nevtralizacijskih protiteles (4). Slednja za uspešnost bakteriofagne terapije naj ne bi bila omejujoc dejavnik, saj je kinetika bakterijske liže veliko hitrejša kot humoralni imunski odziv (1), vendar so poskusi zdravljenja ponovne okužbe z isto vrsto bakteriofaga manj uspešni. O zanimivem odkritju porocajo Merrill in sod. (15). Razvili so metodo za izolacijo razlicic bakteriofagov, ki jih imunski sistem ne prepozna. Mišim so intraperitonealno injicirali enterofag l, ga po dolocenem casu izolirali iz odvzetih vzorcev krvi, pomnožili in vitro v kulturah mutatorske bakterije Escherichia coli in ocišcene ponovno injicirali poskusnim živalim. Po desetih krogih takšne selekcije in vivo (cas pred odvzemom vzorcev krvi so postopoma podaljševali) in pomnoževanja in vitro so uspeli izolirati bakteriofagni klon, na katerega se mišji imunski sistem ni odzival in je bil zato uspešnejši pri odpravljanju ponovno povzrocenih okužb. Rezultat pojasnjujejo z mutacijo antigenskih determinant na bakteriofagni ovojnici Težave pri prakticni uporabi bakteriofagnih zdravil bi zarad gostiteljske specificnosti utegnila povzrocati potreba po hitri in tocni etiološki diagnostiki - identifikaciji vrste in seva patogena. To nekdaj zamudno in pogosto nemogoco nalogo je mogoce premagati s sodobnimi tehnologijami, kakšni sta DNA-mikromreže ali verižna reakcija s polimerazo (PCR) (3). V preteklosti so poskušali doseci širši spekter delovanja bakteriofagnih zdravil s pripravo kombinacije razlicnih bakteriofagov, ki so lizirali vecino sevov nekega patogena, t. i. fagnih koktejlov Po drugi strani so smiselne tudi kombinacije razlicnih bakteriofagov, ki imajo skupnega gostitelja, saj je verjetnost, da bi patogen razvil odpornost proti vsem, zanemarljiva. Pri razvoju potencialnih bakteriofagnih zdravil se bo potrebno omejiti le na tiste patogene, ki predstavljajo najvecje težave in izzive za sodobno zdravljenje (multirezistentne bakterije kot so MRSA (Staphylococcus aureus odporen proti meticilinu), VRE (enterokoki odporni proti vankomicinu) in Pseudomonas aeruginosa). Z vidika regulatornih farm vestn 2008; 59 1311 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles Preglednica 1. Primerjava protibakterijskih lastnosti bakteriofagov in antibiotikov (zgornji del tabele) ter nekaterih razvojnih znaśilnosti obeh vrst zdravil (spodnji del tabele) (prirejeno po 1, 3). Table 1. Comparison of antibacterial properties of phages and antibiotics (upper part) and some specific development issues concerning both types of drugs (lower part of table) (1, 3). Bakteriofagi Antibiotiki Opomba So glede na gostitelja vrstno/sevno specifiśni, zato je verjetnost sekundarnih okućb manjřa. Vplivajo tudi na normalno bakterijsko floro, kar lahko vodi v sekundarne (npr. gliviśne) okućbe. Hitra mikrobiolořka diagnostika je predpogoj za uspeřno izbiro protimikrobnega zdravila, kar v primeru visoko specifiśnih bakteriofagov lahko obravnavamo tudi kot pomanjkljivost. Se pomnoćujejo na mestu okućbe in se sicer hitro odstranijo iz organizma. Telo jih presnavlja in izlośa. Ne zadrćujejo se samo na mestu okućbe. Teoretiśno zadostuje en sam odmerek bakteriofagnega zdravila. Po preboleni bolezni fagi hitro zapustijo organizem. Novejře raziskave opravljene na poskusnih ćivalih in zdravih prostovoljcih niso odkrile resnejřih stranskih uśinkov pri dajanju bakteriofagnih zdravil Řtevilni antibiotiki imajo stranske uśinke, npr. so alergogeni, ototoksiśni, nefrotoksiśni izzovejo sekundarne okućbe ipd. Litiśni bakteriofagi bi lahko izzvali septiśni řok zaradi obsećne lize bakterijskih celic, pri śemer se sprostijo endotoksini. Bakteriofagi sicer so imunogeni, vendar se praviloma ře pred pojavom nevtralizacijskih protiteles odstranijo iz organizma. Ob ponovni okućbi je bakteriofagna terapija z isto vrsto bakteriofaga manj uśinkovita. Razvoj odpornosti patogene bakterije proti eni vrsti bakteriofaga ne predstavlja nevarnosti, saj ostane bakterija obśutljiva na druge bakteriofage. Razvoj odpornosti proti antibiotiku ni omejen na patogene bakterije in se lahko prenařa med razliśnimi bakterijskimi vrstami Antibiotiki vrřijo selekcijski pritisk na řirok spekter bakterijskih vrst, tako patogene kot tiste, ki so del normalne flore. Odkrivanje oz. izolacija novih baktreiofagov je relativno hiter (nekaj tedenski) in cenovno ugoden proces. Razvoj novega antibiotika je zamuden in predvsem finanśno izjemno zahteven proces (10-12 let). Bakteriofagi so se veś kot tri in pol milijarde let razvijali skupaj z gostiteljskimi bakterijami, zato je zelo verjetno, da je mogośe odkriti oz. izolirati »nove« bakteriofage, ki napadajo bakterijske celice, odporne proti dolośenim vrstam bakteriofagov ali antibiotikov. Priśakovane so tećave pri poskusu registracije bakteriofagnih zdravil, posebej pri zmeseh veś bakteriofagov z razliśno specifiśnostjo, ki bi uśinkovali proti řirřemu spektru bakterij (bakteriofagni koktejli), in potrebnih zamenjavah aktivnih bakteriofagov pri nastopu bakterijske odpornosti Smernice/pogoji za registracijo novih antibiotiśnih zdravil so dobro definirani. Regulatorni organi (ře) ne ponujajo smernic za registracijo bakteriofagnih zdravil. Bakteriofagna zdravila so problematiśna Zařśita intelektualne lastnine v primeru z vidika intelektualne lastnine in patentne zařśite. antibiotikov in antibiotiśnih zdravil naśeloma ni sporna. V Vzhodni Evropi je bakteriofagna terapija neprekinjeno v uporabi veś kot 80 let, kar onemogośa patentiranje zaradi pomanjkanja novosti (prior art). Patentna zařśita gensko spremenjenih bakteriofagov in terapevtskih pripravkov z bakteriofagi ni sporna. Pripravki z bakteriofagi zahtevajo posebne pogoje shranjevanja za ohranitev infektivnosti bakteriofagov. Antibiotiki so fizikalno-kemijsko stabilni zdravila imajo zato relativno dolg rok uporabe. Nekatere vrste bakteriofagov so obśutljive na nizko, druge na visoko temperaturo. Nekatere vrste izkazujejo dobro stabilnost kot liofilizati (> 1 leto pri sobni temperaturi). 132 farm vestn 2008; 59 Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi organov je uporaba variabilnih bakteriofagnih meřanic nesprejemljiva, saj za vsako kombinirano zdravilo zahtevajo lośeno izvedbo kliniśnih řtudij za posamezne uśinkovine (10). S tem povezani astronomski strořki razvoja bakteriofagnih zdravil in problematiśna zařśita intelektualne lastnine vsaj zaenkrat odvraśata veśja farmacevtska podjetja od vlaganj v razvoj te skupine zdravil. 3.2 Gensko spremenjeni bakteriofagi Baktriofagi imajo kot bakteriolitiśne uśinkovine řtevilne pomanjkljivosti. Razvoj omnipotentnega oz. řirokospektralnega bakteriofaga s tehnologijo rekombinantne DNA je le malo verjeten (3). Kljub temu ostaja nakaj upanja za razvoj bakteriofaga, ki bi uspeřno prepoznal veśino sevov nekega patogena. Dolośeni bakteriofag namreś svoj genom v gostiteljsko bakterijo vnesejo tako, da s posebnimi encimi vanjo »zvrtajo« luknjo (6). Bakteriofag, ki bi v genomu vseboval zapise za veś hidrolaz, ki bi bile sposobne razgraditi razliśne povrřinske strukture na bakteriji, bi tako izkazoval řirři antibakterijski spekter delovanja. Řtevilni kritiki bakteriofagne terapije se bojijo septiśnega řoka, ki bi utegnil nastopiti ob sprostitvi endotoksinov pri obsećni bakterijski lizi (pojav je dokumentiran tudi pri uporabi antibiotikov). Poleg tega bi visoka lokalna koncentracija novonastalih bakteriofagov sama lahko sproćila imunsko reakcijo (10). Matsuda in sod. (16) so zato razvil bakteriofag z okvarjenim litiśnim sistemom. Bakteriofag je v miřjem modelu sepse okućil bakterije E. coli, se v njih pomnoćeval in povzrośil bakterijsko smrt, a ni izzval lize. Uśinkovitost bakteriofagne terapije je bila celo viřja kot pri uporabi betalaktamskega antibiotika. Hagens in Bläsi (17) sta pripravila dve razliśici gensko spremenjenega nitastega bakteriofaga M13 (vrste, ki sicer ni baktericidna). V genom matiśnega bakteriofaga sta vgradila gen za endonukleazo (encim, ki prepozna dolośena nukleotidna zaporedja in cepi dvoverićno DNA) ali holin (protein, ki z umestitvijo v membrano bakterij v njej tvori pore). Ugotovila sta, da bakteriofaga in vitro delujeta baktericidno, a je sprořśanje endotoksinov v gojiřśe v primerjavi s kulturami, okućenimi z litiśnimi bakteriofagi, zanemarljivo majhno. Na podoben naśin so Westwater in sod. (18) kot dostavni sistem za vnos genov, kodirajośih specifiśne antibakterijske toksine, uporabili fagmidni sistem M13, a so uspeli uśinkovitost protibakterijskega delovanja dokazati tudi in vivo v miřjem modelu bakteriemije. Nenazadnje so gensko spremenjeni bakteriofagi zanimivi tudi z vidika patentne zařśite, kar bi k razvoju bakteriofagnih zdravil utegnilo privabiti podjetja, sposobna v raziskave vloćiti veś finanśnih sredstev. 3.3 Encibiotiki Z izrazom encibiotik (skovanko iz besed »encim« in »antibiotik«) oznaśujemo rekombinantne proteinske produkte bakteriofagnih genov (t. i. lizine), ki sproćijo lizo bakterijske celice. Lizini so hidrolitiśni encimi (glikozidaze ali amidaze), ki po translokaciji v periplazemski prostor razgrajujejo peptidoglikansko celiśno steno. Ugotovili so, da encibiotiki delujejo baktericidno tudi z zunaje stran celice (vsaj pri po Gramu pozitivnih bakterijah). Ćal je litiśni spekter lizinov ozek, saj je pogojen s prisotnostjo specifiśnih ligandov (obiśajno ogljikovih hidratov; ki predstavljajo vezavne epitope), vezanih na peptidoglikansko mrećo. Lizini so dvodomenski proteini aktivnost obeh domen - encimske (hidrolitiśne) in vezavne - pa je neodvisna. Tako je mogośe s kombiniranjem razliśnih domen pripraviti encibiotike z novo specifiśnostjo delovanja (19). Encibiotiki so izjemno zanimivi kot protimikrobne uśinkovine, saj (vsaj zaenkrat) v laboratorijskih poskusih zaporednih pasać ře niso zaznali razvoja bakterijske odpornosti, niti niso opazili, da bi se nanje imunski sistem poskusnih ćivali odzval s tvorbo nevtralizacijskih protiteles (19). Fischetti in sod. so dokazali visoko uśinkovitost razliśnih encibiotikov proti razliśnim vrstam streptokokov in bakteriji Bacillus antracis v pogojih in vitro in in vivo (20-23). Poseben izziv predstavljajo bakterijski biofilmi in metabolno manj aktivne bakterijske celice (24), ki pomembno prispevajo h kroniśnemu poteku infekcij in so naravno odporni proti zdravljenju z antibiotiki in bakteriofagnimi terapevtiki. 3.4 Bakteriofagi kot orodje za identifikacijo novih protimikrobnih tarś Bakteriofagi so obligativni znotrajceliśni patogeni evbakterij in so kot taki razvili sposobnost izkoriřśati gostiteljeve mehanizme za lastno pomnoćevanje. To vkljuśuje tudi oviranje řtevilnih bakterijskih presnovnih poti, s śimer se veśina energije usmeri v izraćanje bakteriofagovih genov in replikacijo bakteriofagovega genoma. Bakteriofagne proteine, ki na razliśnih nivojih delujejo kot inhibitorji delitve bakterijske celice, je mogośe uporabiti pri identifikaciji in validaciji novih protimikrobnih tarś ali celo pri razvoju presejalnih testov za identifikacijo nizkomolekularnih protimikrobnih spojin s povsem novimi mehanizmi delovanja (25, 26). 3.5 Će uveljavljeni bakteriofagni profilaktiki Redki izdelki, ki kot aktivno komponento vsebujejo bakteriofage, so se na nekaterih manj strogo nadzorovanih podrośjih uveljavili će tudi na Zahodu. V Zdrućenih drćavah Amerike je od leta 2005 poljedelcem na voljo pesticid za prepreśevanje in zatiranje bakterijskih bolezni paradićnika in paprike, povzrośenih z bakterijama Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Pseudomonas syringae pv. tomato (27) Isti proizvajalec ponuja ćivinorejcem tudi prřilo, ki vsebuje bakteriofage, specifiśne za salmonelo (28). Namenjeno je omejevanju prisotnosti te bakterije na koći goveda, kar znića verjetnost kontaminacije mesa pri klanju. FDA je v lanskem letu odobrila celo uporabo fagnega koktejla v obliki prřila za zařśito pripravljenih mesnih jedi pred kontaminacijo z nevarno bakterijo Listeria monocytogenes (29). Edini avtorjema poznani primer uradno registriranega bakteriofagnega zdravila je oblić iz biorazgradljivih polimerov, impregniran z razliśnimi bakteriofagi, ki je bil nedavno v Gruziji odobren za zdravljenje trdovratnih koćnih okućb in okućb odprtih ran (2). 4 Zakljuśek Napredki na podrośju biotehnologije, mikrobiologije in infektologije omogośajo ponovno znanstveno ovrednotenje sicer skoraj stoletje stare ideje o uporabi bakteriofagov za prepreśevanje in zdravljenje bakterijskih okućb. Bakteriofagna terapija - śetudi se nekoś uveljavi farm vestn 2008; 59 1331 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles kot del moderne medicine - ne bo nikoli zamenjala uporabe antibiotikov. Slednji ostajajo preveś pomembni, uspeřni in potrebni da bi popolnoma opustili njihovo uporabo. Bakteriofagi ponujajo kveśjemu potencialno dopolnitev antibiotiśnega arzenala, namenjeno zlasti uniśevanju multirezistentnih bakterijskih patogenov, ki predstavljajo narařśajośo groćnjo ślovekovemu zdravju (5, 19). 5 Literatura 1. Sulakvelidze A, Alavidze Z, Moriss Jr. JG. Bacteriophage therapy. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(3): 649-659. 2. Stone R. Stalin’ forgotten cure. Science 2002; 298: 728-731 3. Skurnik M, Pajunen M, Kiljunen S. Biotechnological challenges of phage therapy. Biotechnol Lett 2007; 29: 995-1003. 4. Dabrowska K, Switała-Jelen K, Opolski A et al. Bacteriophage penetration in vertebrates. J Appl Microbiol 2005; 98: 7-13. 5. Pirisi A. Phage therapy - advantage over antibiotics? Lancet 2000; 356: 1418. 6. Skurnik M, Strauch E. Phage therapy: facts and fiction. Int J Med Micobiol 2006; 296: 5-14. 7. Summers WC. Bacteriophage therapy. Annu Rev Microbiol 2001 55: 437-451 8. Häusler T. Viruses vs. superbugs. A solution to the antibiotic crisis? Macmillan, 2006. 9. Projan SJ. New (and not so new) antibacterial targets - from where and when will the novel drugs come? Curr Opin Pharmacol 2002; 2: 513-522. 10. Thiel K. Old dogma, new tricks - 21st Century phage therapy. Nat Biotechnol 2004; 22(1): 31-36. 11. Pajunen M, Kiljunen S, Skurnik M. Bacteriophage YeO3-12, specific for Yersinia enterocolitica serotype O:3, is related to coliphages T3 and T7. J Bacteriol 2000; 182: 5114-5120. 12. Pajunen M, Kiljunen SJ, Soderholm ME et al. Complete genomic sequence of the lytic bacteriophage YeO3-12 of Yersinia enterocolitica serotype O:3. J Bacteriol 2001; 183: 1928-1937. 13. Biswas B, Adhya S, Washart P et al. Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin resistant Enterococcus faecium. Infect Immun 2002; 70: 2004-210. 14. Matsuzaki S, Yasuda M, Nishikawa H et al. Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage MR11. J Infect Dis 2003; 187: 613-624. 15. Merril Cr, Biswas B, Carlton R et al. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3188-3192. 16. Matsuda T, Freeman TA, Hilbert DW et al. Lysis-deficient bacteriophage therapy decreases endotoxin and inflammatory mediator release and improves survival in a murine peritonitis model. Surgery 2005; 137(6): 639-646. 17. Hagens S, Blasi U. Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study. Lett Appl Microbiol 2003; 37(4): 318-323. 18. Westwater C, kasman LM, Schofield DA et al. Use of genetically engineered phage to deliver antimicrobial agents to bacteria: an alternative therapy for treatment of bacterial infections. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(4): 1301-1307. 19. Fischetti VA, Nelson D, Schuch R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nat Biotechnol 2006; 24(12): 1508-1511 20. Loeffler JM, Nelson D, Fischetti VA. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wal hydrolase. Science 2001; 294: 2170-2172. 21. Nelson D, Loomis L, Fischetti VA. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 4107-4112. 22. Schuch R, Nelson D, Fischetti VA. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 2002; 418: 884-889. 23. Loeffler JM, Fischetti VA. Synergistic lethal effect of a combination of phage lytic enzymes with different activities on penicillin-sensitive and -resistant Streptococcus pneumoniae strains. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(1): 375-377. 24. Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol 2007; 5(1): 48-56. 25. Liu J, Dehbi M, Moeck G et al. Antimicrobial drug discovery through bacteriophage genomics. Nat Biotechnol 2004; 22(2): 185-191 26. Projan S. Phage-inspired antibiotics? Nat Biotechnol 2004; 22(2) 167-168. 27. OmniLytics obtains landmark EPA registration for bacteriophage usage; revolutionary AgriPhage products approved for use on tomato and pepper crops. Business Wire, February 15, 2006. 28. OmniLytics announces USDA/FSIS allowance of bacteriophage treatment of salmonella on livestock. Business Wire, March 29, 2007. 29. Bren L. Bacteria-eating virus approved as food additive. FDA Consumer 2007; January-February Issue. 134 farm vestn 2008; 59 Svetloba, radikali in fotodinamiśna terapija Svetloba, radikali in fotodinamiśna terapija Razřirjen povzetek predavanja na simpoziju: Fotobiologija in bolezni ven Slavko Pecar 1 Svetloba in nastajanje reaktivnih snovi v koći Svetloba je elektromagnetno valovanje, katerega energijo opiřemo bodisi z valovno dolćino (X) ali s frekvenco (v). Energija (E) fotona svetlobe je opredeljena z enaśbo: E = hv ali E= hc/A,, kje je h Planckova konstanta (6,62 x 10-34Js) in c hitrost svetlobe v vakuumu (c=2,997 x 108 m/s). Fotoni svetlobe ali krajře svetloba se na povrřini koće lahko odbije, lahko se v koći absorbira ali pa potuje skozi koćo. Kateri dogodek je prevladujoś je odvisno od valovne dolćine (X) svetlobe in od lastnosti koće. Elektromagnetna valovanje s kratkimi valovnimi dolćinami (fotoni z visoko energijo) prodirajo v in skozi koćo, valovanja z dolgimi valovnimi dolćinami pa se odbijajo in le deloma absorbirajo. V tem prispevku se bomo omejili le na ozek del spektra elektromagnetnega valovanja: na svetlobo z valovnimi dolćinami med 200 nm in 700 nm. To podrośje razdelimo na podrośje ultravijoliśne (UV) svetlobe (od 200 do 400 nm) in na podrośje vidne svetlobe (od 400 (vijoliśna) do 700 (rdeśa) nm). Samo UV podrośje ře naprej delimo na UVA (400 - 320 nm), UVB (320 - 280 nm) in UVC podrośje (280 -200 nm). Fotoni UVA svetlobe imajo energijo: 71 - 89 kcal/mol, UVB: 89 - 101 kcal/mol in UVC: 101 - 141 kcal/mol. Navedene energije UV svetlobe postanejo pomembne ob dejstvu, da so energetske vrednosti enojnih kovalentnih vezi veśine organskih spojin v obmośju: 70 - 105 kcal/mol. To pomeni, da imajo UV fotoni, ře zlasti UVB in UVC, dovolj energije, da prekinjajo kovalentne vezi v molekulah vode, proteinov, lipidov, nukleinskih kislin ali v drugih sestavinah koće. UV svetloba v koći povzrośa biokemiśne pořkodbe zaradi nastajanja radikalov in poslediśno najrazliśnejřih sekundarnih, vendar ře vedno kemiśno reaktivnih spojin. Poleg takojřnje vnetne reakcije so nadaljnje posledice delovanja UV svetlobe na koćo lahko zelo razliśne: od pospeřenega staranja do mutacij in nastajanja rakavih celic v koći (1). Fotoni vidne svetlobe imajo manj energije: od 71 kcal/mol (vijoliśna svetloba) do 40 kcal/mol (rdeśa svetloba). Vidna svetloba pri veśin organskih spojin ne more neposredno prekiniti enojne vezi, lahko pa po absorpciji povzrośa prehod posameznih komponent v koći v razliśna vzbujena stanja. Lep dokaz za vpliv svetlobe na ćivo snov je fotosinteza v zelenih rastlinah in proces gledanja pri ćivalih. V veśini primerov absorpcija vidne svetlobe nima řkodljivih posledic, ker se veśina absorbirane svetlobe pretvori v toplotno energijo. Samo v posebnih pogojih se lahko lahko zgodi, da tudi vidna svetloba lahko povzrośa lokalne okvare, kar z uspehom izkoriřśajo pri fotodinamiśni terapiji 2 Radikali in singletni kisik (2,5) Homolitska cepitev /1/ kovalentne vezi (skupen elektronski par), ki jo povzrośi foton UV svetlobe z ustrezno energijo, vodi v nastanek radikalskega para, od katerih ima vsak fragment po en (nesparjen) elektron A - B + UV-svetloba -»A• + •B /1/ Atomi, ioni, molekule in kompleksi, ki imajo vsaj en nesparjen elektron se imenujejo radikali (angleřko: free radical). Stanje snovi z nesparjenim elektronom je neobiśajno, kemiśno reaktivno in zaradi tega kratkoćivo. Radikal poskuřa manjkajośi elektron pridobiti iz svoje okolice. Omenjena tećnja se uresniśuje v treh tipih kemiśnih reakcij znaśilnih za radikale: 1. odvzem vodikovega atoma /2/ neradikalski spojini, ki jo sreśa radikal. Pri tem nastane nov radikal. Tovrstne reakcije postopoma pripeljejo do vse stabilnejřih radikalov: R + R1-H -> R-H + R1 /2/ 2. adicija radikala /3/ na dvojno vez. Tudi pri tej reakciji nastane nov radikal: R• + CH2=CH-R1 -» R-CH2-CH•-R1 /3/ 3. Sreśanje in reagiranje dveh radikalov - obratna reakcija nastajanju radikalskega para - povzrośi nastanek neradikalske spojine /4/, ki v veśini primerov ni veś kemiśno reaktivna: A• + •B -» A-B /4/ Na tem mestu moramo v radikalske reakcije vpeljati ře kisik (O2), ki je sicer normalna sestavina atmosfere in ki se v razliśnih koncentracijah pojavlja tudi v tkivih. Koća je v primerjavi z drugimi tkivi v nekoliko posebni situaciji, ker je na svoji povrřini izpostavljena kar atmosferski koncentraciji kisika (21%), ki difundira tudi v globje plasti koće, v spodnjih plasteh pa je oksigenacija odvisna tudi od prekrvavitve. V molekuli kisika je energetsko ugodnejřa takřna razporeditev elektronov, da sta v molekuli dva nesparjena elektrona (biradikal) s spinom usmerjenim v isto smer. Stanje, kjer sta elektrona v paru pa je energetsko bogatejře. Molekuli kisika z dvema nesparjenima elektronoma pravimo tudi tripletni kisik (3O2) za razliko od kisika, ki ima vse elektrone v parih in ga imenujemo singletni (1O2) kisik. Singletnega kisika obiśajno ni, nastaja le v posebnih pogojih in po razliśnih poteh Zaradi razliśne razporeditve in orientacije spinov se 3O2 in 1O2 mośno prof. dr. Slavko Pecar, UL, Fakuteta za farmacijo, Aškerceva 7, Ljubljana, pecars@ffa.uni-lj.si farm vestn 2008; 59 135 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles razlikujeta tako v kemicni reaktivnosti kot v samih reakcijah v katere sta vpletena. Pri reakcijah oksidacije se kisik spaja z najrazlicnejšimi snovmi Nastajajo nove kovalentne vezi, ki so pravzaprav novi pari elektronov z nasprotnim spinom. V primeru 302 je nastanek kovalentne vezi povezan z obratom spina elektrona. Ker je ta proces malo verjeten obrat spina preprecuje (spinska restrikcija), da bi se 302 brez težav spajal z razlicnimi organskimi spojinami. To je tudi glavni razlog, da kljub relativno visoki koncentraciji kisika v atmosferei, v tej atmosferi živijo bitja sestavljena iz organskih snovi, ki se samo pod dolocenimi pogoji lahko oksidirajo. V primeru 102 ni spinske restrikcije, ki bi preprecevala 102 spajanje z drugimi snovmi in 102 lahko brez težav reagira z organskimi spojinami. Tripletni kisik brez ustrezne aktivacije težko reagira z organskimi pojinami v singletnem stanju. Cisto drugace je, ce se 302 sreca z radikalom. V tem primeru ni spinske restrikcije in reakcija radikala s 302 /5/ je zelo hitra. Ker se 302 obnaša kot biradikal, nastane v smislu reakcije /4/ peroksilni radikal /5/, ki vstopa v nadaljne pretvorbe /6/ in /7/: A* + 302 -» A-O-O* /5/ A-O-O* + R-H -» A-O-O-H + R* /6/ R* + 302 -» R-O-O* itd. /7/ Vidimo, da je teoreticno dovolj že en sam radikal, da se sproži radikalska reakcija oksidacije. UV fotoni (reakcija /1/) zagotove radikale za sprožitev oksidacije, ki se nadaljuje in širi zaradi biradikalske narave 302. Obseg in vrsta poškodb je odvisna od sposobnosti posameznih plasti kože, kako ucinkovito in kako hitro lahko nastale radikale odstrani. Ce omenjeni proces oksidacije poteka v celicni membrani, govorimo o lipidni peroksidaciji. Koncni produkti lipidne peroksidacije so razlicn aldehidi in dialdehidi (malon dialdehid), ketoni, alkoholi, alkani, alkeni, epoksidi, itd in posledicna sprememba ali porušitev membranske strukture. Za nekatere od teh produktov so ugotovili (nenasicen aldehidi, malon dialdehid itd.), da so mutageni in tudi kancerogeni Pri izpostavljanju kože UV sevanju nastajajo primarni radikali nakljucno in povsod tam, kjer UV foton homolitsko prekine kovalentno vez. Reakcije oksidacije s 302 lahko potekajo ne samo v membrani, kjer je koncetracija kisika najvecja, ampak tudi v jedru (poškodbe DNK molekule, mutacije, kancerogenost) ali kjerkoli drugje v celicah kože. Z UV svetlobo povzroceno nastajanje radikalov je v koži uvod v oksidacijo sestavin celic z najrazlicnejšimi koncnimi razpleti. Premik ravnotežja redoks reakcij v smeri oksidativnih procesov imenujemo oksidativni stres. Oksidativni stres sproži na eni strani bodisi nenadna pojava radikalov (UV obsevanje) ali povecanje koncentracije reaktivnih kisikovih (ROS) oziroma dušikovih (RNS) zvrsti. Med ROS in RNS uvršcajo tako radikale kot spojine, ki so bodisi nastale iz radikalov in so kemicno še reaktivne, oziroma pod dolocenimi pogoji lahko iz njih nastanejo novi radikali. Tipicni predstavniki ROS so: • radikali: superoksid (02*~), hidroksil (HO*), peroksil (ROO*); hidroperoksil (HOO*), alkoksil (RO*): • neradikalske spojine: vodikov peroksid (H202), hipoklorid (CIO-), 102, peroksinitrit (ONOO-), ozon (03), itd. 136 farm vestn 2008; 59 in RNS: • radikali: dušikov oksid f NO), dušikov dioksid (*N02) • neradikalske spojine: peroksinitrit (ONOO"), didušikov trioksid (N203), didušikov tetraoksid (N204), nitrozil kation (ON+), nitrozil anion (ON"), itd. Do oksidativnega stresa pride tudi, ce se zmanjša celicna zašcita, ki sloni na antioksidantih (2,6). Ti po razlicnih mehanizmih in na razlicnih ravneh preprecujejo oksidativni stres oziroma skrbijo, da ostaja koncentracija posameznih predstavnikov ROS in RNS na obvladljivi ravni. V primeru obsevanja kože z UV svetlobo nastali radikali sprožijo oksidativni stres, ki je intenzivnejši ter obsežnejši tudi zaradi neposrednih in škodljivih vplivov UV svetlobe na encime, ki so nosilci antioksidativnega delovanja v celici. Ko je proces lipidne peroksidacije v razmahu (verižna radikalska reakcija) zacne kemicno nastajati še 102 predvsem v reakciji med dvema peroksilnima radikaloma: R.,-0-0* + *0-0-R2 -» R^O-O-Rj + 102 /8/ Neugodna situacija (radikalsko sprožene oksidacije) se s pojavom 102 še poslabša. Nastali 102 ne potrebuje vec »radikalske« aktivacije ampak oksidira celicne sestavine v svoji neposredni okolici po neradikalskih poteh. Primarno nastajajo hidroperoksidi in ciklicni endoperoksidi (Slika 1). Oboji se lahko ob prisotnosti ionov železa ali bakra (Fe2+, Cu+) pretvorijo v hidroksilne in alkoksilne radikale, ki sprožijo nov val oksidacij s 302. A B Slika 1. Oksidacija s 1O2 do cikliśnega endoperoksida (A) in hidroperoksida (B) Vsako nenadzorovano nastajanje radikalov v koži, ki preseže celicno antioksidativno kapaciteto, pahne celico v oksidativni stres, kjer potekajo najprej radikalske reakcije s 302, v kasnejši fazi pa se v oksidacije vmeša tudi 102. Od množine absorbirane UV svetlobe je odvisno, kakšen obseg biokemicnih poškodb bo UV svetloba povzrocila. Koža je v evolucijskem razvoju razvila mnoge obrambne sisteme (pigmentacija, antioksidanti) pred UV sevanjem in ceprav cloveštvo proizvaja zašcitne pripravke, ki UV svetlobi preprecijo prodor v živa podrocja kože, se ljudje še premalo zavedamo vseh nevarnosti pri izpostavljanju kože UV sevanjem. 3 Fotodinamiśna terapija (7, 8) Singletni kisik nastaja v celici po razlicnih poteh. Poleg nastajanja iz peroksilnih radikalov /8/ je pomembno še fotokemicno nastajanje, kjer se v proces vkljuci posrednik: fotosenzibilizator. Vidna svetloba (400 do 700 nm) lahko po absorpciji v snovi povzroca prehod molekul v razlicna vzbujena stanja. Ponavadi se iz vzbujenega stanja molekula vrne v osnovno stanje z izsevanjem fotona svetlobe (fluorescenca) ali pa se energija vzbujenega stanja pretvori v toploto. V nekaterih posebnih primerih se energije vzbujenega stanja lahko uporabi za obrat enega izmed spinov eletronov. Slednje se v razlicnem obsegu dogaja pri spojinah, ki jih imenujemo fotosenzibilizatorji. Iz osnovnega Svetloba, radikali in fotodinamiśna terapija singletnega stanja molekula fotosenzibilizatorja po absorpciji vidne svetlobe preide v vzbujeno stanje, to stanje pa lahko preide v osnovno tripletno stanje, ki je stabilneše in se pocasneje vraca (fosforescenca) nazaj. Obstaja pa še možnost, da fotosenzibilizator v tripletnem stanju izmenja usmeritve spinov z okolišnim 302 pri cemer nastane 102 in molekula fotosenzibilizatorja v osnovnem singletnem stanju (Shema 1). Fotokemicno nastajanje 102 si predstavljamo kot proces, ki poteka v treh stopnjah: 1. fotoekscitacija B B(T4-) + hv <-> B*(T4-) 2. prehod B v tripletno stanje B*(T4-) -» B*(TT) 3. rakcija s 302 B*(TT) + 302 (4-4-) -» B(T4-) + 102 (4-T) Shema 1. Fotokemiśno nastajanje singletnega kisika (1O2), kjer je B fotosenzibilizator, B* vzbujeno stanje fotosenzibilizatorja, M je singletno stanje, in TT tripletno stanje. Vidna svetloba lahko ob posredovanju molekule fotosenzibilizatorja preskrbi dovolj energije (22,5 kcal/mol), ki je potrebna za obrat spina elektrona tripletnega kisika in prehod v singletno stanje, ki je pri kisiku (izjema) energetsko višje kot tripletno stanje. Ce v topilu raztopimo fotosenzibilizator in tako raztopino obsevamo z vidno svetlobo, potem bo v raztopini fotokemicno nastajal 102. Ugotovili so, da v tkivu molekula 102 zaradi velike reaktivnosti zreagira z okolišnimi organskmi snovmi v kroglici s polmerom 0,1 mm od mesta svojega nastanka. Fotokemicno nastajanja 102 in njegova velika kemicna reaktivnost sta osnova za fotodinamicno terapijo, ki izkorišca možnost lokaliziranega nastajanja 102 za doseganje terapevtskega ucinka. Nastali 102 namrec poškoduje samo molekule v neposredni bližini svojega nastanka, kar pomeni, da lahko z usmerjenim obsevanjem pricakujemo zelo lokalizirane ucinke. Znani so številni fotosenzibilizatorji za lokalno ali sistemsko aplikacijo. Po aplikaciji fotosenzibilizatorja z lokaliziranim obsevanjem z ozkimi snopi koherentne (laserske) ali nekoherentne svetlobe dosežemo nastajanje 102 samo v tanki plasti podrocja obsevanja in s tem zelo lokalizirane ucinke. Današnja fotodinamicna terapija je primerna za posege na koži in sluznicah povsod tam, kjer je možna osvetlitev z žarki svetlobe iz vidnega podrocja spektra. Pogoj za uspešnost fotodinamicne terapije je zadostna prisotnost 302 v tkivu. Uspeh je nadalje odvisen od uporabljenega fotosenzibilizatorja in od svetlobnega vira. Fotosenzibilizator mora biti farmakološko inertna spojina z ustezno farmakokinetiko, porazdeljevanjem po tarcnih tkivih in s primerno visokim izkoristkom tvorbe 102. Zelo pomembna lastnost fotosenzibilizatorja je, da absorbira svetlobo v podrocju valovnih dolžin, ki jih tkivo ne absorbira. Temu morajo biti prilagojeni tudi viri svetlobe Slika 2. Struktura fotosenzibilizatorja protoporfirina IX tako po valovni dolžini, kot po možnosti obsevanja samo dolocenih predelov kože ali sluznice. Najvec se uporabljajo laserski viri koherentne svetlobe z valovno dolžino iz vidnega obmocja (valovne dolžine nad 600 nm) in z mocjo od 1 do 4 W. Taka svetloba prodira v tkivo nekaj mm globoko in pozroca nastajanje 102. V uporabni je vec fotosenzibilizatorjev, razvijajo pa številne nove z boljšimi lastnostmi. Najpogostejši so derivati porfirina. Uporabljajo pa tudi 5-aminolevulinsko kislino, ki sama sicer ni fotosenzibilizator, vendar celica lahko iz nje sintetizira protoporfirin IX (Slika 2), ki po osvetlitvi pretvarja 302 v 102. Trenutno se s fotodinamicno terapijo zdravijo vsa tista lokalizirana rakava in druga obolenja kože ter sluznic, ki jih lahko dosežemo z sistemi za obsevanje z vidno svetlobo. Izkorišca se tudi protibakterijski ucinek 102, še zlasti v dentalni medicini 4 Zakljuśek UV in vidna svetloba povzrocata v koži razlicne ucinke. UV svetloba je energetsko dovolj bogata, da povzroci nastanek radikalov na posameznih sestavinah celic kože. Primarni radikali sprožijo oksidativne procese in s tem pojav oksidativnega stresa, ki v koži v procesih lipidne peroksidacije, poškodbe proteinov in nukleinskih kislin vodi bodisi v pospešeno staranje, v degenerativne spremembe, v nastanek raka ali neposredno v celicno smrt. Od kolicine absorbirane UV svetlobe ter od zašcitne kapacitete kože (antioksidanti) je odvisno, kakšen bo razplet dogodkov po obsevanju Vidna svetloba neposredno ne more povzrociti nastajanje radikalov, lahko pa preko vzbujenih stanj fotosenzibilizatorjev povzroca nastajanje singletnega kisika v obsevanem tkivu. Singletni kisik kot zelo reaktiven oksidant prav tako povzroca prostorsko omejene oksidativne poškodbe in smrt celice. Z uporabo primernih fotosenzibilizatorjev in sistema za lokalilzirano obsevanje dosežemo, da singletni kisik nastaja samo v podrocju, kjer želimo doseci terapevtski ucinek. V tem primeru omenjeno lokalizirano nastajanje izrabljamo za fotodinamicno terapijo, ki je uporabna pri obravnavi površinskih patoloških sprememb na dostopni površini kože ali sluznic. 5 Literatura 1. Fossel M. B.: Cells, Aging, and Human Disease, Oxford University Press, 2004, 140-160 (The Skin): 2. Halliwell B., Gutteridge J. M. O: Free Radicals in Biology and Medicine, 4th Ed. Oxford, 2007. 3. Pecar S.: Radikali v nařem okolju, Kemija v šoli: (2006), 18(2), 1-5: 4. Pecar S.: Radikali v nařem ćivljenju, Kemija v šoli: (2006), 18(3), 13-19: 5. Byrne-Habic B., Mravljak J., Pecar S.: Duřikov oksid I: lastnosti, kemiśna reaktivnost 6. Jurkovic P., Šentjurc M., Gašperlin M., Kristl J., Pecar S.: Skin protection against ultraviolet induced free radicals with ascorbyl palmitate in microemulsions, Eur. J. Pharm & Biopharm: (2003), 56, 59-66; in nastajanje NO v organizmu,. Farm Vest. (2004), 55, 469-478: 7. Bonnett R.: Chemical Aspects of Photodynamic Therapy, Gordon and Brech Science Publishers, Amsterdam 2000: 8. Japelj B., Pecar S.: Osnove in moćnosti fotodinamiśnega zdravljenja. Farm Vest (2006), 57, 131-139. farm vestn 2008; 59 1371 98 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles Uporaba in vrednotenje varovalnih kozmetiśnih izdelkov za zařśito pred soncem Matejka Kumperšcak Duh Povzetek: Podrocje varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem se zelo hitro razvija. Uporaba izdelkov, ki vsebujejo UV filtre, se je v zadnjih desetih letih zelo povecala. Vzrok je predvsem osvešcanje ljudi o porastu števila primerov kožnega raka, opeklin, alergij in tanjšanju ozonske plasti. Povpraševanju seveda sledijo tudi proizvajalci kozmeticnih izdelkov, ki dajejo na tržišce vedno nove tehnološke oblike varovalnih pripravkov za zašcito pred soncem z vedno višjimi vrednostmi zašcitnih faktorjev. V prispevku je podan pregled UV filtrov, ki so dovoljeni za uporabo v kozmeticnih izdelkih v Evropski skupnosti. Opisane so metode, ki jih je za dolocanje soncnega zašcitnega faktorja in UV A zašcitnega faktorja sprejela COLIPA (Evropsko kozmeticno združenje). Podane so smernice za vrednotenje ucinkovitosti, oznacevanje in uporabo varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem. 1 Ultravijoliśna svetloba in njeni uśinki Elektromagnetno valovanje zajema rentgenske valove (valovna dolžina A,<200nm), ultravijolicne žarke (A,=200-400nm), vidno svetlobo (A,=400-800nm) in infrardece, radijske valove (A,>800nm). Ultravijolicn žarki so žarki valovne dolžine 200-400nm. Razdelimo jih na UV C žarke, ki zajemajo valovno dolžino 200-290nm, UV B žarke, ki zajemajo valovno dolžino 290-320nm in UV A žarke z valovno dolžino 320-400nm. UV A žarki se delijo še na UVA I (340-400nm) in UVA II (320-340nm)[1,2] Tabela 1: Spekter UVžarkov Ultravijolicni žarki (UV) Valovna dolžina (X) UV C 200-290nm UV B 290-320nm UV A I 320-340nm UV A 340-400nm UV C žarki so žarki z najkrajšo valovno dolžino in zato najvecjo energijo. So zelo nevarni, saj so smrtni za rastline in mikroorganizme, za ljudi pa karcinogeni, vendar jih ozonska plast absorbira in tako ne dosežejo površine zemlje. UV B žarki zajemajo 18% soncnega UV spektra, vendar jih velik del filtrira ozonska plast. UV B žarki so tisti, ki so v najvecji meri odgovorn za soncne opekline in nastanek kožnega raka. Prehajajo skozi roženo plast kože in povrhnjico. UV A žarki zajemajo 75% soncnega UV spektra, prehajajo pa prakticno v celoti skozi ozonsko plast. Imajo najnižjo energijo, vendar prehajajo globlje v kožo. V vecjih kolicinah prav tako povzrocijo rdecino. UV A žarki so pomemben dejavnik pri nastanku kožnega raka, ob daljšem izpostavljanju pa povzrocajo staranje kože (photo-aging) UV A žarki -AGEING UA B žarki - SUNBURN V zadnjih letih se veliko poudarja pomen UV A žarkov pri nastanku kožnega raka, predvsem UVA I, ne le UV B žarkov. Sodobni varovalni pripravki za soncenje zato vsebujejo UV filtre, ki absorbirajo oz. odbijajo ne le UV B in UVA II, ampak tudi UVA I žarke [3] 2 UV filtri Da bi lahko cas bivanja na soncu podaljšali, po drugi strani pa zmanjšali škodljive ucinke soncnih žarkov, uporabljamo pri soncenju varovalne kozmeticne izdelke za zašcito pred soncem, ki vsebujejo UV filtre. Naloga UV filtra je, da absorbira oz. odbije UV žarke, preden dosežejo kožo. Lahko so organskega ali anorganskega izvora [16] Uporaba in s tem tudi izdelava izdelkov, ki vsebujejo UV filtre, se je v zadnjih desetletjih izredno povecala. Vzrokov za to je vec: tanjšanje ozonske plasti, spremenjen življenjski slog in s tem vecja izpostavljenost UV žarkom, vsesplošno osvešcanje ljudi o porastu kožnega raka in alergij, nove tehnološke oblike varovalnih pripravkov za zašcito pred soncem. UV filtrov ne vsebujejo le varovalni pripravki ampak vedno pogosteje tudi drugi kozmeticni izdelki, na primer dnevne negovalne kreme. Matejka Kumperšcak Duh, mag. farm., spec, Mariborske lekarne Maribor 138 farm vestn 2008; 59 Uporaba in vrednotenje varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem 2.1 Organski UV filtri Organski UV filtri so organske sintezne spojine, ki se veśinoma uporabljajo sami ali v kombinaciji z anorganskimi. Kemijske vezi nekaterih molekul lahko absorbirajo UV ćarke in jih oddajo ali reabsorbirajo v neřkodljivi obliki. Take so aromatske spojine s karbonilno skupino oz. spojine z elektrondonorsko skupino, npr. amino skupino, metoksi skupino na orto ali para mestu glede na aromatski obroś. Ko taka spojina absorbira UV ćarke, pride do fotokemijske ekscitacije, molekula preide v viřji energijski nivo. Pri vrnitvi v prvotno stanje se odveśna absorbirana energija odda. Veśina UV filtrov odda energijo v obliki IR svetlobe [4] Po kemizmu organske UV filtre delimo na [4,5,16] 1. derivate p-aminobenzojske kisline (PABA, oktildimetil PABA) 2. salicilate (oktilsalicilat, homosalat) 3. cinamate (oktilmetoksicinamat) 4. benzofenone (oksibenzon, sulisobenzon) 5. derivate kafre 6. derivate dibenzoilmetana. 1. PABA in njeni derivati se uporabljajo kot UV filtri će od leta 1950 in so na seznamu dovoljenih filtrov v ZDA in Evropski skupnosti. Absorbirajo v obmośju UV B ćarkov. Slika 1: PABA in oktildimetil p-aminobenzoat (Padimat O) 2. Salicilati so prve spojine, ki so se uporabljale kot UV filtri in so popularni ře danes. Absorbirajo v obmośju UV B ćarkov. Śe jih primerjamo z ostalimi UV filtri so slabři absorberji, vendar pa je njihova uporaba bolj varna (manj stranskih reakcij). aOOOCH,CHaH8 OH CH Slika 2: Oktilsalicilat 3. Cinamati, predvsem oktilmetoksicinamat, so najbolj uporabljani UV filtri. Oktilmetoksicinamat absorbira v obmośju UV B ćarkov, je relativno varen, kar pomeni, da ne povzrośa fotoalergiśnih in fototoksiśnih reakcij, ker je v tekośem stanju, ga laćje vgradimo v varovalne emulzije, dobro je topen v oljnih komponentah, netopen pa je v vodi, kar omogośa pripravo vodoodpornih pripravkov. CHiO^^ J— CH=CH—COOCH.CHC.Hu C, H, Slika 3: 2-etilheksil p-metoksicinamat 4. Benzofenoni so prav tako na seznamu dovoljenih UV filtrov v ZDA in EU. Absorbirajo predvsem v obmośju UV A ćarkov. Ker so v prařkasti obliki, je oblikovanje varovalnih pripravkov tećje. Znaśilna predstavnika sta benzofenon-3 (oksibenzon) in benzofenon-5. Śe pripravek vsebuje oksibenzon, mora biti po evropski zakonodaji oznaśeno na etiketi opozorilo zaradi veśje moćnosti alergij. HO \ C^f_0 0CHs o Slika 4: Oksibenzon 5,6. Derivati kafre in dibenzoilmetana so na seznamu dovoljenih UV filtrov v EU. Absorbirajo predvsem v obmośju UV A ćarkov So precej dragi, netopni v nekaterih topilih, slabře stabilni pod vplivom UV ćarkov, posledica razpada pod vplivom svetlobe je ponavadi slabřa uśinkovitost pripravka, fotokemijski produkti pa lahko povzrośijo fotoalergiśne ali fototoksiśne reakcije. 2.2 Anorganski UV filtri Varovalni pripravki za zařśito pred soncem vedno pogosteje vsebujejo anorganske UV filtre (pogosto jim reśemo tudi fizikalni UV filtri - physical sunscreens). Lośimo dve vrsti anorganskih UV filtrov: tiste, ki sevanje le odbijajo in tiste, ki poleg odboja ćarkov ćarke dolośenih valovnih dolćin tudi absorbirajo. V prvo skupino spadata barijev sulfat BaSO4 in smukec, v drugo pa titanov dioksid TiO2 in cinkov oksid ZnO, ki se v mikronizirani obliki uporabljata v varovalnih pripravkih za zařśito pred soncem. Velika prednost anorganskih UV filtrov pred organskimi je, da v koćo ne prodirajo, zato ne povzrośajo alergiśnih reakcij, delujejo pa v celotnem delu UV spektra [6,7,16] 2.3 Stranski uśinki UV filtrov in varovalnih pripravkov za zařśito pred soncem Zaradi poveśane uporabe UV filtrov se je poveśalo tudi řtevilo stranskih reakcij. Vzrok za to ni le vedno veśje řtevilo varovalnih pripravkov z vedno viřjimi zařśitnimi faktorji, ampak tudi vgrajevanje UV filtrov v kozmetiśne izdelke za prepreśevanje nastanka gub in staranja in za podaljřanje roka uporabe, saj poveśajo fotostabilnost izdelka [8,9,16] Stranske reakcije na UV filtre se kaćejo kot preobśutljivostne reakcije na svetlobo, zato UV filtre uvrřśamo med topikalne fotoalergene. To pomeni, da pri lokalnem nanosu na koćo, ki je izpostavljena svetlobi, izzovejo alergiśno reakcijo. Prav vsi UV filtri so moćni fotoalergeni Med najpogostejřimi povzrośitelji fotoalergij so derivati p-aminobenzojske kisline (PABA), benzofenoni (oksibenzon) in derivati dibenzoilmetana (avobenzon). Derivati dibenzoilmetana so med novejřimi UV filtri, ki absorbirajo v obmośju UV A ćarkov. Vzrok za fotoalergiśno reakcijo na varovalni kozmetiśni izdelek ni vedno le UV filter, ampak mnogokrat tudi druge uporabljene sestavine v pripravku. Kontaktni alergeni, ki po obsevanju v UV ćarki povzrośijo alergiśno reakcijo, so tudi konzervansi, diřave, antioksidanti emulgatorji. farm vestn 2008; 59 1391 46 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles ćarkov za nastanek eritema na koći (Minimum Erythemal Dose -minimalni eritemski odmerek - MED), ki jo řśiti izdelek za zařśito pred soncem, in minimalnim odmerkom UV ćarkov za nastanek eritema na isti nezařśiteni koći (enaśba 1) [12] MED zavarovan- SPF = ________ _ _ _ _ _ _ _ _ ___ nezavarovana Enaśba 1: Definicija sonśnega zařśitnega faktorja (SPF) MED je izraćen kot energija UV sevanja (izraćeno v J/m2 ), ki je potrebna za prvo opazno rdeśino na koći z jasno izraćenimi mejami Śe ima pripravek SPF 8 pomeni, da smo po njegovi uporabi lahko izpostavljeni sonśnim ćarkom osem krat dlje, da se pojavi prva opazna rdeśina, śe ne bi bili zavarovani. Princip dolośanja zařśitnega faktorja je opazovanje rdecine na koži, kar pomeni, da metoda zajame predvsem vpliv UV B žarkov na kožo, ne pa tudi UV A žarkov. Ćarki UV B so namreś dosti mośnejři povzrośitelji rdeśine. Pripravek z visokim zařśitnim faktorjem torej dobro varuje koćo pred UV B ćarki, ne pa tudi pred UV A ćarki, ki Tabela 2: UV filtri dovoljeni v Evropski skupnosti Spojina (ime) Najvišja dovoljena konc. (%) 1. p-aminobenzojska kislina 5 2. benzalkonijev metasulfat kafra 6 3. homosalat 10 4. benzofenon-3 (oksibenzon) 10 5. fenilbenzimidazol sulfonska kislina in njene soli 8 (preraś. na kislino) 6. tereftaliden dikafra sulfonska kislina in njene soli 10 (preraś. na kislino) 7. butilmetoksi dibenzoilmetan (avobenzon) 5 8. benziliden kafra sulfonska kislina in njene sol 6 (preraś. na kislino) 9. oktokrilen 10 (preraś. na kislino) 10. poliakrilamidometil benziliden kafra 6 11. etilheksil metoksicinamat 10 12. PEG-25 PABA (etoksiliran etil-4-aminobenzoat) 10 13. izoamil p-metoksicinamat 10 14. etilheksil triazon 5 15. drometrizol trisiloksan 15 16. dietilheksil butamidotriazon 10 17. 4-metilbenziliden kafra 4 18. 3-benziliden kafra 2 19. etilheksil salicilat 5 20. benzofenon-5 in njegove soli 5 (preraś. na kislino) 21. etilheksildimetil p-aminobenzojska kisl. (Padimat O) 8 22. bisoktitriazol 10 23. bisimidazilat 10 24. anisotriazin 10 25. dimetikodietil benzalmalonat 10 26. titanov dioksid 25 27. dietilamino hidroksibenzoil heksilbenzoat 10 Opomba: uradno veljavnega INCI poimenovanja v slovenskem jeziku ni na razpolago. 140 farm vestn 2008; 59 Zakonodaja v Evropski skupnosti V Evropski skupnosti ureja podrośje varovalnih pripravkov za zařśito pred soncem Kozmetiśna direktiva Evropske skupnosti (Cosmetics Directive), ki jo je pripravila in izdala Komisija Evropske skupnosti v sodelovanju z Evropskim kozmetiśnim zdrućenjem (COLIPA) Dovoljeni UV filtri so na listi, znani kot Aneks VII (Annex VII). Slovenska zakonodaja je popolnoma usklajena z evropsko, zato Pravilnik o sestavi kozmetiśnih proizvodov v 3. ślenu navaja, da lahko kozmetiśn proizvodi vsebujejo le ultravijoliśne filtre iz Priloge VII Direktive 76/768/ EGS [10] V Evropski skupnosti dovoljene UV filtre prikazuje tabela 2 [10,11] 3 Vrednotenje uśinkovitosti varovalnih kozmetiśnih izdelkov za zařśito pred soncem Za vrednotenje uśinkovitosti varovalnih pripravkov za zařśito pred soncem uporabljamo soncni zašcitni faktor SPF (Sun Protection Factor). Definiran je kot razmerje med minimalnim odmerkom UV 46 Uporaba in vrednotenje varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem povzrocajo prehitro staranje kože, vplivajo na imunski sistem in nastanek kožnega raka. V varovalne pripravke za zašcito pred soncem zato poleg UV B filtrov vgrajujemo tudi UV A filtre, ucinkovitost pa dolocimo z UV A zašcitnim faktorjem [13] UV A zašcitni faktor (UV A PF) je razmerje med minimalnim odmerkom UV A, potrebnim za obstojno pigmentacijo na koži, ki jo šciti izdelek za zašcito pred soncem, in minimalnim odmerkom UV A, potrebnim za minimalni ucinek pigmentacije na isti nezašciteni koži [14] Zašcitnih faktorjev za varovalni pripravek ni mogoce kar enostavno dolociti oz. izracunati glede na uporabljane UV filtre in njihove koncentracije, ampak ga moramo po predpisanem postopku ( in vivo, in vitro) dolociti za vsak pripravek posebej. Zašcitni faktor namrec ni odvisen le od vrste, koncentracije in kombinacije uporabljenih UV filtrov, ampak tudi od vehikla (podlage, emulgatorjev) in debeline plasti varovalnega pripravka [15,16] 3.1 Dolocanje zašcitnega faktorja SPF z mednarodno preskusno metodo za zašcitni faktor (2006) (International Sun Protection Factor test Method) (2006)) Metodo so leta 2006 posodobile in prevzele evropska, japonska, južnoafriška industrija in industrija ZDA. Gre za in vivo dolocitev zašcitnega faktorja za testni pripravek za zašcito pred soncem [12] Z dolocanjem soncnega zašcitnega faktorja SPF oznacimo nivo zašcite varovalnega pripravka pred soncnimi žarki. Vendar vrednosti SPF ne smemo jemati kot natancno število, ampak kot informacijo, v katero kategorijo varovalne sposobnosti spada izdelek (nizka, srednja, visoka ali zelo visoka zašcita). Izdelek z zašcitnim faktorjem 15 absorbira 93% sevanja UV B, izdelek z zašcitnim faktorjem 30 pa 97% sevanja UV B. Zveza med vrednostmi SPF in zmanjšanjem sevanja torej ni linearna, zato pripravki z zašcitnimi faktorji nad 50 prakticno ne povecajo vec zašcite pred UV sevanjem in zato tudi niso smiselni [16] Ker je in vivo metoda za dolocanje zašcitnega faktorja casovno in materialno zahtevna, pa tudi eticno vprašljiva, predvsem proizvajalci varovalnih pripravkov za soncenje preizkušajo številne metode in vitro. V Sloveniji izvaja in vitro merjenje SPF v izdelkih za soncenje Inštitut za varovanje zdravja v Ljubljani. Metoda je interna, v bodoce pa razmišljajo o podizvajalcih, ki bi dolocali SPF in UV A PF. 3.2 Metode za dolocanje ucinkovitosti zašcite pred UV A žarki Danes se od varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem pricakuje, da nas ne bodo zašcitili le pred nastankom opeklin, ampak nas bodo varovali tudi pred poznimi ucinki UV žarkov (pred kožnim rakom, prehitrim staranjem kože, povecano pigmentacijo). To pomeni, da postajajo UV A filtri vedno bolj pomembni, sodobni pripravki za zašcito pred soncem zato poudarjajo UV A zašcito. Še pred nekaj leti v Evropski skupnosti ni bilo enotne standardizirane metode za dolocanje ucinkovitosti zašcite pred UV A žarki Proizvajalci so uporabljali razlicne metode (najbolj znan Avstralski standard, sistem oznacevanja zašcite z zvezdicami) [16] V letu 2006 in 2007 je COLIPA metode za dolocanje UV A zašcitnega faktorja standardizirala in tako imamo na voljo 3 metode za merjenje UV A zašcite [13,14]. 1. in vivo metoda merjenja obstojne pigmentacije (PPD Method -Persistent Pigment Darkening) 2. in vitro dolocanje UV A PF, kot ga je predpisala COLIPA 3. preskus kriticne valovne dolžine, ko mora biti enaka ali vecja od 370 nm. Zaradi eticnih pomislekov je potrebno dajati prednost metodam in vitro COLIPA doloca tudi razmerje med UV A zašcitnim faktorjem in soncnim zašcitnim faktorjem (SPF). Da ima lahko izdelek za zašcito pred soncem oznako, da nas varuje pred UV A žarki, mora biti vrednost UV A zašcitnega faktorja, izmerjenega z metodo obstojne pigmentacije ali in vitro metodo vsaj 1/3 soncnega zašcitnega faktorja (SPF). Kriticna valovna dolžina mora biti vsaj 370 nm. 4 Oznacevanje in uporaba varovalnih kozmeticnih izdelkov za zašcito pred soncem V Uradnem listu Evropske unije so septembra 2006 izdali "Priporocila o ucinkovitosti izdelkov za zašcito pred soncem in s tem povezanimi trditvami proizvajalca", ki so prevedena tudi v slovenšcino. Poleg osnovnih pojmov o UV žarkih, ucinkih UV žarkov, metodah za vrednotenje ucinkovitosti izdelkov za zašcito pred soncem, so v priporocilih tudi zahteve proizvajalcem, kako morajo biti varovalni izdelki za soncenje oznaceni, da ne zavajajo potrošnikov [14] Izdelki za zašcito pred soncem morajo vsebovati vidna opozorila o tem da ne zagotavljajo 100 % zašcite, npr. • Tudi ko uporabljate izdelek za zašcito pred soncem, ne ostajajte na soncu predolgo • Dojencki in majhni otroci ne smejo biti izpostavljeni neposrednim soncnim žarkom • Prevelika izpostavljenost soncu resno ogroža vaše zdravje". • Izdelki za zašcito pred soncem morajo vsebovati navodila za uporabo, ki bodo zagotovila njihovo ucinkovitost, npr. • "Izdelek za zašcito pred soncem nanesite pred izpostavljanjem soncu" • "Zlasti po potenju, kopanju ali brisanju z brisaco izdelek ponovno nanesite na kožo" • Za doseganje ravni zašcite, ki jo zagotavlja navedeni zašcitn faktor, se morajo izdelki za soncenje nanesti na kožo v dovolj veliki kolicini. Ta kolicina je pribl. 6 polnih kavnih žlick za telo odrasle osebe (35 g). "Uporaba manjše kolicine od navedene bo bistveno znižala raven zašcite." • Izdelki za zašcito pred soncem morajo zagotoviti minimalno stopnjo zašcite pred UV A in UV B žarki. Minimalna stopnja zašcite mora biti naslednja: • Vrednost SPF zašcitnega faktorja najmanj 6 (izmerjena s standardizirano metodo in vivo ali in vitro) in vrednost UV A farm vestn 2008; 59 1411 Pregledni znanstveni ślanki - Review Scientific Articles zařśitnega faktorja najmanj 1/3 SPF, izmerjenega z in vivo metodo obstojne pigmentacije ali z in vitro COLIPA metodo. Kritiśna valovna dolćina, dosećena pri uporabi preskusne metode kritiśne valovna dolćine, mora biti vsaj 370 nm. • Omejiti je treba řtevilo razliśnih vrednosti zařśitnega faktorja na embalaćah, da se tako olajřa primerjava med razliśnimi izdelki Priporośa se naslednji razpon zařśitnih faktorjev (tabela): Oznaśena Oznaśeni SPF Min UV A Kritiśna kategorija: na ovojnini: PF: valovna dolćina: NIZKA ZAŘŚITA SPF 6 (do 10) SPF 10 SREDNJA ZAŘŚITA SPF 15 (do 25) SPF 20 SPF 25 1/3 SPF 370 nm VISOKA ZAŘŚITA SPF 30 (do 50) SPF 50 ZELO VISOKA ZAŘŚITA SPF 50+ (veś kot 50???) Na embalaći je zelo priporośljiva uporaba posebnih piktogramov, ki uporabniku nazorno pokaćejo pravilno uporabo izdelka za zařśito pred soncem in ga hkrati opozarjajo na nevarnosti, ki jih prinařa prekomerno izpostavljanje sonśnim ćarkom [17] 5 Zakljuśek Varovalni kozmetiśni izdelki za zařśito pred soncem nikakor niso prva in edina zařśita pred řkodljivimi vplivi sonśnih ćarkov. Najbolj varno in uśinkovito je, da omejimo izpostavljanje sonśnim ćarkom v śasu, ko so najmośnejři in zato najbolj nevarni in nosimo zařśitna oblaśila, pokrivala in ośala. Posebej pozorni moramo biti pri otrocih, saj sonśne opekline v otrořtvu podvojijo moćnost za kasnejři nastanek koćnega raka. 6 Literatura 1. Technical Series: Solar Radiation, C&T, 3/1997. 2. Technical Series: UV Radiation and Skin Cancer, C&T, 2/1998. 3. S. Forestier, R. Mascotto: Sun&UV A, SOFW Journal, 125, 8/1999, 2-6. 4. K. Klein: Encyclopedia of UV Absorbers for Sunscreen Products, C&T, Vol. 107, 10/1992, 45-64. 5. D. Steinberg: Sunscreen Encyclopedia Regulatory Update, C&T, Vol. 111, 12/1996, 77-86. 6. Technical Series: Microfine Zinc Oxide: Photostable UVB & UVA Protection, C&T, 9/1999. 7. R. Sayre: Physical Sunscreens, J. Soc. Cosmet. Chem., 41, 4/1990, 103-109. 8. Scheman: Dermatologic Aspect of Cosmetics: Adverse Reactions to Cosmetic Ingredients, Dermatologic Clinics, 18, 10/2000. 9. H. DeBuys, S. Levy, J. Murray, D. Madey, S. Pinnel: Dermatologic Aspect of Cosmetics: Modern approaches to Photoprotection, Dermatologic Clinics, 18, 10/2000. 10. COUNCIL DIRECTIVE (76/768/EGS), ANNEX VII (List of UV filters which cosmetic products may contain) 11. Pravilnik o sestavi kozmetiśnih proizvodov, Uradni list RS řt. 35/2005, 5. 4. 2005. 12. http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/sunscreen/ (International Protection Factor Test Method) 13. http://www.colipa.com/ (Method for the in vitro Determination of UV A Protection provided by Sunscreen Products) 14. Uradni list Evropske unije L 265/39, 26. 9. 2006, Priporośilo komisije o uśinkovitosti izdelkov za zařśito pred soncem in s tem povezanimi trditvami proizvajalca 15. D.T.Floyd, et al: Formulation of Sun Protection Emulsions with Enhanced SPF Response, C&T, Vol. 112, 6/1997, 55-62. 16. Matejka Kumperřśak Duh:Optimiranje sestave in oblikovanja ter zagotavljanje stabilnosti varovalne emulzije za sonśenje, Specialistiśna naloga, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Ljubljana 2001 17. http://ec.europa.eu/health-eu/ 142 farm vestn 2008; 59 Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina med vzorci Slovencev in drugih narodov Allele frequency of mutations of homocysteine metabolism key enzymes in Slovene population in comparison to that in other populations Nadja Plazar, Barbara Ostanek Povzetek: V vzorcu 149 navidezno zdravih prostovoljcem smo prouśevali pogostost mutacij genov: 677C>T 5,10-metilentetrahidrofolat reduk-taze - MTHFR, 1947G>A katehol-O-metil transferaze - COMT in 1420C>T citosolne serin hidroksimetiltransferaze - cSHMT), ki dolośajo tri kljuśne encime presnove homocisteina in jih primerjali z će objavljenimi rezultati. Ugotovili smo, da pri alelni frekvenci mutacije 677C>T MTHFR med Slovenci in ostalimi evropskimi narodi (z izjemo Italijanov in Nemcev) ni statistiśno znaśilne razlike. Prav tako ni statistiśno znaśilne razlike pri mutaciji 1947G>A COMT (z izjemo Italijanov in Řpancev). Alelne frekvence za 1420C>T cSHMT se med evropskimi narodi statistiśno znaśilno ne razlikujejo, so pa v pogostosti pojavljanja gena primerljive z Japonci. Primerjali smo priśakovane in za evropsko populacijo dolośene frekvence genotipov in ugotovili, da se statistiśno pomembno ne razlikujejo za vse tri preiskovane mutacije, iz śesar sklepamo, da v evoluciji Evropejcev ni bilo ośitne prednosti ali slabosti zaradi mutacij izbranih genov, kljub temu, da imajo mutirani homozigoti le 50 % ali manj aktivnosti nemutiranega encima. Kljuśne besede: hiperhomocisteinemija, aktivnost encima, mutirani gen, alelni gen. Abstract: In 149 apparently healthy volunteers we studied the frequency of gene mutations 677C>T 5.10-methylenetetrahydrofolate reductase - (MTHFR), 1947G>A catechol-O-methyltransferase - COMT and 1420C>T cytosol serine hydroxymethylransferase -cSHMT) which define the three key enzymes essential for normal homocysteine metabolism, and compared them to already reported results. We concluded that there is no significant difference in the allele frequency of 677C>T MTHFR mutation in Slovene population comparable to that in European population (except Italian and Spanish). There is no significant difference in the frequency of the 1420C>T cSHMT allele in European population, whereas in comparison to that in the Japanese there is. We compared the expected and for the European population determined genotype frequency and came to the conclusion that there is no significant difference for any of the mutations examined. We thus conclude that the mutation of selected genes, even though the activity of the non-mutated enzyme in mutated homozygotes is only of 50% or less, was of no obviously positive or negative significance for the evolution of European populations. Key words: hyperhomocysteinemia, enzyme activity, mutated gene, allele gene 1 Uvod 1.1 Hiperhomocisteinemija - dejavnik tveganja Zmerna hiperhomocisteinemija je priblićno enako pomemben dejavnik tveganja za nastanek aterotromboze kot kajenje in hiperlipidemija (1). Pri porastu koncentracije homocisteina za 5 mol/L se relativno tveganje poveśa od 1,3 do 2,7 (2). Poviřan homocistein naj bi bil odgovoren za najmanj 10 % tveganja za razvoj aterotrombotiśne ćilne bolezni (3). Dodatni dejavniki tveganja, kot so kajenje, poviřan krvni tlak, sladkorna bolezen in hiperlipidemija lahko sinergistiśno delujejo s poviřanim homocisteinom in ga ře poveśujejo (2). Mehanizmi, s katerimi homocistein vpliva na nastanek aterotrombotiśne spremembe ćilne stene, ře niso povsem razjasnjeni osnovani pa so na predpostavki, da homocistein pospeřuje nalaganje Dr. Nadja Plazar, Univerza na Primorskem, Visoka řola za zdravstvo Izola, Polje 42, 6310 Izola, Slovenija Dr. Barbara Ostanek, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Oddelek za kliniśno biokemijo, Ařkerśeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 143 Raziskovalni ślanki - Research Article fibrina (nastanek tromba) na ćilno steno ter da spremeni endotelijske celice in celice gladkega miřiśja tako, da povzrośi nastanek ćilne bolezeni ali pospeři njen razvoj. Verjetno homocistein deluje na ćilno steno po veś poteh: neposredno pořkoduje celice ćilnega endotelija, pospeřuje proliferacijo celic gladkega miřiśja in nalaganje kolagena ter oksidacijo lipoproteinov nizke gostote. Moćna sta dva mehanizma, po katerih naj bi homocistein spreminjal ćilno funkcijo, ki vkljuśujeta oksidativni stres in spremembe celiśne metilacije: Po mehanizmu oksidativnega stresa oksidacija homocisteina v plazmi v homocistin, meřane disulfide in homocistein-tiolakton, vodi do nastanka reaktivnih oksidativnih vrst, kot so vodikov peroksid superoksidni anion in hidroksilni radikal. Rezultati raziskav in vitro kaćejo, da nastanejo pořkodbe endotelijskih celic pri zmern hiperhomocisteinemiji predvsem zaradi delovanja vodikovega peroksida (4). Drugi moćni mehanizem, ki vodi do motene ćilne funkcije pri hiperhomocisteinemiji, je prepletenost presnove homocisteina z reakcijami metilnega prenosa. Presnova homocisteina je povezana s celiśnim nivojem S-adenozil-metionina (SAM), ki se vpleta tako v transsulfuracijsko kot remetilacijsko pot presnove. SAM je obenem dajalec metilnih skupin pri metilaciji DNA, beljakovin, fosfolipidov in biogenih aminov. Aktivnost metiltransferaz je torej odvisna od celiśne koncentracije SAM-a, pa tudi S-adenozil-homocisteina (SAH). Obenem pa visoke vrednosti homocisteina, ki zastajajo v celicah, inhibirajo reakcije metiliranja. Metilacija je bistvenega pomena za vzdrćevanje strukture DNA; brez reparacije pride do mutacij in ruřenja same strukture (5, 6). Tesna povezava med homocisteinom, SAM in SAH kaćejo, da je spremenjena celiśna metilacija odgovorna za nekatere uśinke homocisteina pri ćilni disfunkciji (7). 1.2 Presnova homocisteina Homocistein nastaja pri presnovi metionina v skoraj vseh celicah. V kri ga prehaja le del, najveś iz hepatocitov, in sicer 5 do 10 % dnevno sintetiziranega homocisteina, kar je 1,2 mmol/dan. Tveganje za srśnoćilne bolezni narařśa sorazmerno z narařśanjem koncentracije homocisteina in zato jasne razmejitve med normalnimi in poviřanimi vrednostmi ni. Kljub temu so hiperhomocisteinemije razdelili po koncentraciji celokupnega homocisteina v plazmi, odvzeti na teřśe v zmerno (koncentracija homocisteina 12-30 µmol/L), srednjo (koncentracija homocisteina 31-100 µmol/L) in hudo hiperhomocisteinemijo (nad 100 µmol/L) (4). Homocistein nastaja iz esencialne aminokisline metionina. V telo prihaja s hrano ali nastaja z razgradnjo endogenih beljakovin. Metilna skupina metionina se aktivira s prehodom v S-adenosil-metionin. Reakcijo katalizira ATP: L-metionin-S-adenoziltransferaza. Metionin se v reakciji poveće z adenozilskim delom molekule ATP preko ćveplovega mostiśka (-S-) tako, da nastane vez med 5'-ogljikovim atomom riboze in ćveplovim atomom metionina. S-adenozil-metionin je zaradi ćveplovega mostiśka »visoko energetska« molekula in je glavni biolořki dajalec metilne skupine, ki jo ob prisotnosti metilaz (katehol-O-metiltransferaza, COMT; EC 2.1.1.6) prenařa na kateholamine, nukleinske kisline, proteine, fosfolipide, mielin, polisaharide in řtevilne druge molekule (slika 1). Po prenosu metilne skupine prehaja S-adenozil-metionin v tioester S- adenozil-homocistein. S-adenozil-homocistein ima podobno strukturo kot S-adenozin-metionin, zato se lahko veće na ista vezalna mesta (vendar z drugaśno afiniteto) in s tem zmanjřuje njegovo aktivnost. Razmerje med njima je kazalec metilacijskih procesov v telesu. Z merjenjem koncentracije so ugotovili, da je S-adenozil-homocisteina v jetrih normalnih odraslih podgan 13 nmol/g, S adenozin-metionina pa 60 do 90 nmol/g, kar pomeni, da je njuno razmerje priblićno 1:4. Njuno razmerje je zaradi zaviralnega delovanja S-adenozil-homocisteina pomembno; śe se poruři, se zmanjřa aktivnost metiltransferaz, odvisnih od S-adenozil-metionina, za 10 do 60 %. S-adenozil-homocistein nato hidrolizira v homocistein in adenozin z reverzibilno reakcijo, ki jo katalizira S-adenozil-homocistein hidrolaza. Homocistein se lahko presnavlja naprej po dveh poteh: remetilacijski ali transsulfuracijski poti. V veśini tkiv se homocistein lahko remetilira v metionin. Pri remetilizaciji homocisteina v metionin je v veśini tkiv dajalec metilne skupine 5-metiltetrahidro-folat. Reakcijo katalizira 5-metiltetrahidrofolat-homo -cistein-metiltransferaza (metonin-sintaza, MS) s kofaktorjem vitaminom B12, kar je prikazano na sliki 1. Nastali tetrahidrofolat prehaja v 5,10-metiltetrahidrofolat z encimom 5,10-metiltetrahidrofolat-reduktazo, (MTHFR, EC 1.1.9.9) in nato v 5-metiltetrahidro-folat. V nekaterih tkivih predvsem v jetrih, ledvicah pa tudi v ośesnih leśah, poteka remetilacija homocisteina po poti, neodvisni od folatov in vitamina B12; dajalec metilne skupine je betain (trimetilglicin), ki prehaja v dimetilglicin Reakcijo katalizira encim betain-homocistein-metiltransferaza. Dimetilglicin se lahko naprej demetilira z dimetilglicin dehidrogenazo do sarkozina in pri tem nastaja 5,10-metilentetrahidrofolat. Sarkozin se razgradi s sarkozin dehidrogenazo do glicina, ki se lahko porabi za tvorbo 5,10-metilentetrahidrofolata (4, 8). Druga presnovna pot homocisteina je transsulfuracijska, pri kateri homocistein s serinom prehaja v cistationin z encimom cistationin-sintazo (CBS) in s kofaktorjem vitaminom B6, nato v cistein z encimom-cistationazo (GCT). Katerikoli proces v presnovi homocisteina (remetilacija, transulfuracija, metilacija) je lahko moten zaradi neustreznih aktivnosti sodelujośih encimov, do katerih lahko privedejo spremembe v genih za te encime ali neustrezne koliśine potrebnih kofaktorjev (vitamin B6, B12, folati, piridoksal-5 fosfat). Najbolj so raziskovane spremembe v genih za tiste encime, ki privedejo do hude hiperhomocisteinemije, na primer v genu za CBS ali v genu za GCT na transsulfuracijski poti. V zadnjem śasu je vedno veś objav o vzrokih, ki privedejo do srednje in zmerne hiperhomocisteinemije. Ti so lahko mutacije v genih za encime, ki sodelujejo v remetilacijski poti in z njo povezano presnovno potjo folata (predvsem MTHFR, cSHMT) in v metilacijskih procesih (predvsem COMT). Domnevamo, da so za viřjo koncentracijo homocisteina in s tem viřjim tveganjem za razvoj srśnoćilnih bolezni odgovorni tudi ali predvsem genetski dejavniki, zato smo ugotavljali pogostost mutacij pri treh izbranih genih encimov, ki sodelujejo na kljuśnih mestih v presnovi homocisteina in jih primerjali z će objavljenimi rezultati. Ti so 5,10-metilentetrahidrofolat reduktaza (MTHFR), katehol-O-metil transferaza (COMT) in citosolna serin hidroksimetiltransferaza (cSHMT). 144 farm vestn 2008; 59 Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina Slika 1: Presnova homocisteina Figure 1: Homocysteine metabolic patways Okrajřave: 5-metilTHF - 5-metiltetrahidrofolat; 5,10-metilenTHF - 5,10-metilentetrahidrofolat; B6- vitamin B6; B12 - vitamin B12; BHMT-betain-homocistein metiltransferaza; CBS - cistationin fi-sintaza; COMT - katehol-o-metiltransferaza; DHF - dihidrofolat; dUMP - deoksiuridin monofosfat; dTMP - deoksitimidin monofosfat; GCT - y-cistationaza; MS - metionin sintaza; MSR - reduktaza metionin sintaze; MTHFR - 5,10-metilentetrahidrofolat reduktaza; SAH - s-adenozil homocistein; SAM - s-adenozil metionin; SHMT - serin hidroksimetiltransferaza; THF -tetrahidrofolat, TS-timidilat sintaza. 1.3 Gen za 5,10-metilentetrahidrofolat reduktazo (MTHFR) Gen za MTHFR se nahaja na kromosomu 1, na koncu krajře rośice p, na poloćaju 1p36.32. Kodirajośa regija je dolga 1980 bp in kodira za protein molekulske mase 77 kDa. Gen je sestavljen iz 11 eksonov, dolćine od 102 bp do 432 bp, in intronov, dolćine od 250 bp do 1,5 kb, razen enega introna, ki ima 4,2 kb. (9, 10). Dolośa encim 5,10-metilentetrahidrofolat reduktazo (MTHFR), flavoprotein iz drućine metilentetrahidrofolat reduktaz (EC:1.5.1.20). Śloveřki encim je homodimer, ki ga sestavljata dve podenoti, velikosti 77 kDa. Dolćina aminokislinskega zaporedja je 656. MTHFR je citoplazemski encim, ki katalizira redukcijo 5,10-metilentetrahidrofolata v 5-metil tetra hidrofolat. Encim veće koencim flavin adenin dinukleotid (FAD) in potrebuje NADPH kot elektronski dajalec. V fiziolořkih pogojih je reakcija ireverzibilna, encimsko aktivnost pa alosteriśno regulira glede na koncentracijo metionina v celici S-adenozil-metionin (SAM), ki je inhibitor encima (11, 12). V genu za MTHFR so odkrili 34 redkih, a řkodljivih mutacij in 9 pogostih polimorfizmov. Ena izmed prvih odkritih je bila mutacija 677C>T. Mutacija 677C>T se nahaja v eksonu 4, na mestu, ki kodira vezalno mesto za folat. Posledica je zamenjava 220 aminokisline alanina (A) z valinom (V) na mestu 222. Pri homozigotni osebi z mutacijo je aktivnost encima znićana na 35 % normalne, kar je posledica poveśane termolabilnosti. Ugotovili so tudi, da mutacija povzrośi razpad dimernega encima v monomerni, slabřo vezavo FAD koencima in s tem manjřo aktivnost (12, 13). 1.4 Gen za katehol-O-metil transferazo (COMT) Poznamo dve izoobliki encima, topno (S-COMT) in membransko vezano (MB-COMT), ki se v razliśnih tkivih razliśno izraćata (14, 15) Kodira ju skupni gen na daljři rośici 22. kromosoma, na mestu 22q11.21-q11.23. Gen je sestavljen iz 6 eksonov, od katerih eksona 1 in 2 nista kodirajośa. Prepis COMT gena uravnavata dva lośena promotorja P1 in P2. (16) Encim COMT katalizira prenos metilne farm vestn 2008; 59 145 Raziskovalni ślanki - Research Article skupine iz SAM na -OH skupino kateholnega akceptorja (noradrenalin, adrenalin in drugi), pri śemer se SAM pretvori v SAH Na ta naśin COMT sodeluje pri inaktivaciji kateholaminskih nevrotransmiterjev, kot so adrenalin, noradrenalin in dopamin ter razgradnji kateholnih estrogenov. Prouśevana mutacija 1947G>A na genu v COMT je tośkasta mutacija, pri kateri se na 4. eksonu v 158. kodonu za MB-COMT, oziroma 108. kodonu za S-COMT, gvanin zamenja z adeninom. Posledica te mutacije je zamenjava amino kisline valina (GTG) z metioninom (ATG) v polipeptidu, kar zmanjřa za 3 do 4-krat aktivnost nastalega encima. Aktivnost encima COMT s homozigotno mutacijo je od 25 do 35 % v primerjavi s homozigom z nemutiranima aleloma. (17,18) 1.5 Gen za citosolno serin hidroksimetiltransferazo (cSHMT) Encim SHMT katalizira reverzibilno reakcijo, v kateri serin prehaja v glicin, medtem ko hidroksimetilna skupina prehaja na tetrahidrofolat in tako nastane 5,10-metilentetrahidrofolat. Na ta naśin ima SHMT kljuśno vlogo v metabolizmu folatov, ki so povezani z biosintezo purinov in pirimidinov in s tem nukleinskih kislin (19). Aktivnost encima SHMT je pogojena z vezavo koencima piridoksal-5'-fosfat (PLP) in spada v razred piridoksal-5-fosfat encimov, śeprav ima manjřo sekvenśno podobnost z ostalimi encimi skupine, na primer z aspartat aminotransferazo (20). Dva razliśna gena kodirata zapis za izoencima SHMT: gen SHMT1 (za encim cSHMT) in SHMT2 (za encim mSHMT). Nahajata se na dveh kromosomih: 17p11.2 in 12q13. Gen SHMT1 je dolg 23 kb in vsebuje 12 intronov ter 13 eksonov. Izrezovanje intronov poteka po pravilu gt/ag. Kodirajośi del gena je prekinjen z 10 introni, od katerih sta le 2 pozicijsko ohranjena v genu za mSHMT. Visoka stopnja identiśnosti med obema genoma in prisotnost genov za keratin na obeh kromosomskih regijah kaće na moćnost, da sta regiji kromosoma 12 in 17 nastali z duplikacijo, najverjetneje v filogenetskem razvoju po lośitvi razvojne poti prokariontov in evkariontov. (20, 21) Mutacija 1420C>T v genu za cSHMT se nahaja v zadnjem, 13. eksonu, ki kodira C-terminalno domeno, pri śemer je mesto mutacije řteto od zaśetnega mesta translacije (AUG kodona). Posledica tranzicije citozina v timin je zamenjava aminokisline levcina (Leu) s fenilalaninom (Phe) na mestu 474 proteina (L474F) (22). Pri tem se zmanjřa aktivnost encima in posledice so podobne kot pri pomanjkanju folatov. Zaradi znićanja aktivnosti mutirane cSHMT pride do motene remetilacije homocisteina in sinteze DNA (23). Lahko pa polimorfizem 1420C>T povzrośi usmerjanje folatov v sintezo timidina zaradi interakcije (protein-protein) s timidilat sintazo ali zarad poveśane sinteze 5-formiltetrahidrofolata (24) Izbrani geni kodirajo encime, ki sodelujejo v presnovi homocisteina. Mutacije razliśno znićujejo aktivnost encimov, obiśajno pri homozigotih pod 50 %. Namen naře řtudije je bil dolośiti, kakřna je alelna frekvenca dolośenih mutacij v slovenski populaciji, in jih primerjati z objavljenimi podatki o alelnih frekvencah drugih narodov. Ugotavljali smo prisotnosti naslednjih mutacij: 677C>T v genu za 5,10-metilretrahidrofolat reduktazo (MTHFR), 1947G>A v genu za katehol-O-metiltransferazo (COMT) in 1420C>T v genu za serin hidroksimetiltransferazo (SHMT) Te mutacije vplivajo na aktivnost kljuśnih encimov v presnovi homocisteina (MTHFR), obenem pa povezujejo presnovo homocisteina s presnovo folatov in s sintezo nukleinskih kislin (SHMT) ter z glavno potjo presnove kateholaminskih nevrotransmitorjev (COMT). 2 Materiali in metode Vzorec: 149 navidezno zdravim prostovoljcem, starih od 20 do 78 let, s povpreśjem 43,9 (+,-13,7) let je bilo odvzete 4 ml venozne krvi z antikoagulantom K3EDTA . Med vkljuśenimi prostovoljci je bilo 112 ćensk (81,9 %) in 37 mořkih (18,1 %) Řtudijo je odobrila Komisija za etiśna vprařanja Republike Slovenije (57/05/04). Privolitev so podpisali vsi prostovoljci vkljuśeni v řtudijo. Analiza DNA Genomsko DNA smo izolirali iz levkocitov venske krvi, odvzete z antikoagulantom K3EDTA, pri śemer smo uporabili komplet FlexiGene DNA (Qiagen, Hilden, Germany). Za identifikacijo mutacij MTHFR 677C > T, COMT 1947G > A in cSHMT 1420C > T smo uporabili verićno reakcijo s polimerazo (PCR), ki ji je sledila analiza dolćin restrikcijskih fragmentov (RFLP) ali analiza konformacijskih polimorfizmov enoverićnih DNA (SSCP). Genotipizacija MTHFR 677 C > T. PCR so izvedli tako, da smo v reakcijsko zmes s skupnim volumnom 20 µL smo dodali DNA vzorca (100 ng), 1 x PCR Gold pufer, 0.2 mM vsakega od řtirih deoksiribonukleotidov, 1.5 mM MgCl2, 0.4 enote AmpliTaq GoldTM polimeraze (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 0.2 mM vsakega oligonukleotidnega zaśetnika (F: (5'-TGA-AGG-AGA-AGG-TGT-CTG-CGG-GA-3', R: 5'-AGG-ACG-GTG-CGG-TGA-GAG-TG-3'). Uporab ljene oligonucleotide zaśetnike je opisal Frosst et al. . Optimizirani pogoji za PCR reakcijo pomnoćevanja so bili: zaśetek 10 minut na 95 °C, ki mu je sledilo 37 ponovitev po 30 sekund na 94 °C (denaturacija), 30 sekund na 62 °C (prileganje zaśetnikov) in 30 sekund na 72 °C (podaljřevanje DNA) ter na koncu 7 minut na 72 °C (konśno podaljřevanje DNA). Pet mL tako dobljenega PCR produkta (198 bp) smo śez noś inkubirali z 1 enoto HiifI restrikcijske endonukleaze (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Uspeřnost restrikcije smo preverili z elektroforezo (Mini-protean, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) na 4 % agaroznem gelu pri napetosti 85 V, śasu poteka 90 minut in z uporabo 1.0 x TAE pufra (4 mM Tris-HCl, 20 mM ocetne kislina, 0,96 mM EDTA) ter barvanjem z etidijevim bromidom. Fragment velikosti 198 bp je predstavljal CC genotip, 175- in 23-bp TT genotip in 198, 175- in 23-bp CT genotip Genotipizacija COMT 1947 G > A. Pri PCR smo v reakcijsko zmes s skupnim volumnom 20 µL smo dodali DNA vzorca (100 ng), 1 x PCR Gold pufra, 0.2 mM vsakega od řtirih deoksiribonukleotidov, 2.5 mM MgCl2, 0.4 enote AmpliTaq GoldTM polimeraze in 0.2 mM vsakega oligonukleotidnega zaśetnika (F: 5'-CTC-ATC-ACC-ATC-GAG-ATC-AA-3' in R: 5'-CCA-GGT-CTG-ACA-ACG-GGT-CA-3'). Uporabljene oligonucleotide zaśetnike je opisal Malhotra et al. (26). Optimizirani pogoji za PCR reakcijo pomnoćevanja so bili: zaśetek 10 minut na 95 °C, ki mu je sledilo 37 ponovitev po 30 sekund na 94 °C, 30 sekund 146 farm vestn 2008; 59 Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina na 55 °C in 30 sedund na 72°C ter na konśnih 7 minut na 72°C. Pet mL PCR tako dobljenega PCR produkta (109 bp) smo śez noś inkubirali z 1 enoto NlaIII restrikcijske endonukleaze (New England Biolabs, Inc.). Uspeřnost restrikcije smo preverili z elektroforezo na 12 % poliacrilamidnem gelu pri napetosti 200 V, śasu poteka 40 minut in 0.5 x TAE pufru (50 mM Tris-borata, pH 8.3 in 0.5 mM EDTA) ter barvanjem z etidijevim bromidom. Fragment velikosti 87- in 22-bp je predstavljal GG genotip, 69-, 18- in 22-bp AA ter 87-, 69-, 18- in 22-pa GA genotip. Genotipizacija CSHMT1420 C > T . Pri PCR smo v reakcijsko zmes s skupnim volumnom 20 µL smo dodali DNA vzorca (100 ng), 1 x PCR pufera II, 0.2 mM vsakega od řtirih deoksiribonukleotidov, 2.0 mM MgCl2, 0.4 enote AmpliTaq GoldTM polimeraze in 0.25 mM vsakega oligonukleotidnega zaśetnika (F: 5’-AGA-GTT-CAA-GGA-GAG-ACT-GGC-AG-3’ in R: 5’-GTC-AAC-AGT-TCC-CCT-TTG-GAG-3’). ki smo ju izbrali glede na sekvenco cSHMT, objavljeno v GenBank (NM-004169) s pomośjo raśunalniřkega programa NetPrimer 3. Optimizirani pogoji za PCR reakcijo pomnoćevanja so bili: zaśetek 10 min na 95 °C, ki mu je sledilo 37 ponovitev po 30 sekund na 94 °C 30 sekund na 60 °C in 30 sekund na 72°C ter konśnih 7 min na 72°C Za SSPS analizo smo 2 mL tako pridobljenega PCR produkta (220 bp) pomeřali s 17 mnanařalnega LIS pufra (10 % saharoza, 0.01 % bromfenol-modro in 0.01 % ksilenciano) denaturirali v vodn kopeli pri 95 do 97°C 3 minute in nato takoj prenesli na led za 5 minut. 15 mL tako pripravljenega vzorca smo nanesli na on 8 % (37:1) poliakrilamidni gel. Elektroforeza je potekala na Protean II elektroforezni enoti (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA), pri śemer smo uporabljali 0.5 x TBE pufer (50 mM Tris-borate, pH 8.3 in 0.5 mM EDTA) in konstanten elektriśni tok 20 W pri temperaturi 22 °C in trajanju 2.5 ure. Sledilo je barvanje s srebrovim nitratom. Statistika Genotipsko in alelno frekvenco smo izraśunali po prikazanih formulah fA … frekvenca alela A v populaciji fa … frekvenca alela a v populaciji nAA, nAa, naa … řtevila posameznikov z genotipi AA, Aa in aa N … řtevilo vseh posameznikov Alelno frekvenco mutacije genov smo preverili s pravili Hardy-Weinbergovega ravnovesja. Řtevilśnost genotipov smo primerjali s pomośjo testa %2 in Fischer Exact testa(SPSS za Windows 4.0) 3 Rezultati in razprava Pogostost mutacije 677C>T v genu za MTHFR pri preiskovani skupin je bila: CC 52,5 %, CT 39,0 % in TT genotipa 8,5 %. Alelna frekvenca C alela je pa 67,8 %, alelna frekvenca T alela pa 32,2 %. S Fisherjevim exact testom smo primerjali alelne frekvence C in T alela med Slovenci in objavljanimi rezultati za ostale narode v Evrop (preglednica 1). Tabela 1: Alelna frekvenca T alela mutacije 677C>T v genu za MTHFR pri razliśnih populacijah v Evropi in primerjava s Slovenci. Table 1: Allele frequency of the 677C>T mutation in MTHFR gene T allele in diverse European populations in comparison with that in Slovenian population Populacija Število preiskovancev Alelna frekvenca T alela (%) Fisher Exact test (p) Slovenci 149 32,2 / Britanci 1046 35,4 0,299 Nizozemci 503 32,2 1,000 Francozi 133 36,1 0,374 Nemci 257 24,5 0,022 Irci 1309 32,5 0,948 Italijani 2053 43,8 0,000 Norvećan 391 28,0 0,178 Řved 126 30,2 0,645 Hrvati 298 30,5 0,646 Alelne frekvence med Slovenci in ostalimi evropskimi narodi (z izjemo Italijanov in Nemcev) se statistiśno znaśilno ne razlikujejo. Italijani imajo najviřjo pojavnost T alela v Evropi (43,8 %), Nemci pa najnićjo (24,5 %). Razlika med Slovenci in Italijani ter Nemci je statistiśno znaśilna. Pogostost mutacije 1947G>A v genu za COMT dolośena pri isti skupini je bila GG 24,2 %, GA 45,60 % in AA genotipa 30,2 %. Alelna frekvenca G alela je 47,0 % in A 53,0 %. S Fisher Exact testom smo primerjali alelne frekvence G alela med Slovenci in ostalimi narodi v Evropi in ugotovili statistiśno znaśilne razlike s Řvedi, Italijani in Řpanci, ki imajo najviřjo pojavnost G alela v Evropi (preglednica 2). Primerjali smo tudi pojavnost G alela med narodi razliśnih celin. Ker se podatki v virih nanařajo na G alel, smo temu prilagodili tudi naře podajanje, ne glede na to, da je A mutirani alel. Veśje razlike v alelni frekvenci mutacije 1947G>A v genu za COMT opazimo v primerjavi s povpreśnimi alelnimi frekvencami populacij drugih kontinentov, izraśunanih iz podatkov v ALFRED bazi. Podatki so podani v preglednici 3. Pogostost mutacije mutacije 1420C>T v genu za cSHMT preiskovane skupine je bila: CC 40,3 %, CT 50,3 % in TT genotipa 9,4 %. V slovenski populaciji je pojavnost T alela 34,6 %, kar je blizu alelni frekvenci drugih kavkařkih narodov. S Fisher exact testom smo primerjali alelne frekvence T alela slovenske populacije z ostalimi objavljenimi raziskavami, katerih alelne frekvence so na voljo (Preglednica 4). Med alelno frekvenco slovenske in alelnimi frekvencami drugimi kavkařkih narodov ni statistiśno pomembnih razlik, obstaja pa z farm vestn 2008; 59 147 Raziskovalni ślanki - Research Article Tabela 2: Alelna frekvenca G alela mutacije 1947G>A v genu za COMT pri razliśnih populacijah v Evropi in primerjava s Slovenci. Table 2: Allele frequency of the 1947G>A in COMT gene G allele in diverse European populations in comparison with that in Slovenian population Populacija Řtevilo preiskovancev Alelna frekvenca G alela (%) Primerjava s Slovenci Fisher Exact test (p) Slovenci 149 47 / Švedi 458 56 0,007 Nemci 328 49 0,530 Italijani 127 61 0,001 Rusi 96 49 0,711 Angleći 161 51 0,297 Danci 102 39 0,099 Spanci 226 57 0,007 rci 230 50 0,457 Ameriśani (EP) 55 55 0,182 Oznake: EP - evropsko poreklo. Denotation: EO - European origin Tabela 3: Povpreśne frekvence G alela mutacije 1947G>A v genu za COMT za populacije razliśnih kontinentov. Table 3: Average frequency of the 1947G>A in COMT gene G allele in diverse continents populations Celina G alel Evropa 52 ± 9 % Afrika 75 ± 10 % Azija 63 ± 7 % Vzhodna Azija 75 ± 6 % Severna Amerika 66 ± 14 % Jućna Amerika 82 ± 13 % Oceanija 77 ± 8 % Japonci (p=0,0001), ki imajo alelno frekvenco T statistiśno pomembno nićjo (8,9 %). Napravili smo povzetek řtevilśnosti posameznih genotipov vseh treh genov za preiskovano skupino 149 prostovoljcev (Preglednica 5). Po Hardy-Weinbergovih pravilih (p2 + 2pq + q2=1, pri śemer sta p in q alelni frekvenci nevtralnih genov) smo iz povpreśnih alelnih frekvenc treh prouśevanih genov, izraśunanih iz razpoloćljivih virov (Preglednica 1, 2 in 4) izraśunali teoretiśno priśakovane genske frekvence. Priśakovane in za evropsko populacijo dolośene frekvence genotipov smo primerjali s pomośjo %2 testa in ugotovili, da se statistiśno pomembno ne razlikujejo za vse tri preiskovane mutacije. Ker Hardy-Weinbergovo ravnovesje velja le za velike izolirane populacije, pri katerih je bilo parjenje nakljuśno ter so imeli vsi genotipi enake moćnosti prećivetja in razmnoćevanja, lahko Tabela 4: Alelna frekvenca T alela mutacije 1420C>T v genu za cSHMT pri razliśnih populacijah v Evropi in primerjava s Slovenci. Table 4: Allele frequency of the 1420C>T in cSHMT gene T allele in European populations in comparison with that in Slovenian population Populacija Řtevilo Alelna Primerjava s preiskovancev frekvenca Slovenci T alela (%) Fisher Exact test (p) Slovenci 149 34,6 / Britanci 114 38,1 0,411 Nizozemci 411 32 0,428 Ameriśan 458 30,4 0,173 (Kavkazijci) Ameriśan (beli (ne)hispanci) 729 30,6 0,192 Japonci 411 8,9 0,0001 Tabela 5: Řtevilśnost posameznih genotipov in kombinacije mutacij 677C>T gena za MTHFR, 1947G>A gena za COMT in 1420C>T gena za cSHMT pri skupini 149 prostovoljcev. Table 5: Frequency of individual genotypes and mutation combinations of the 677C>T in MTHFR gene, 1947G>A in COMT gene, and 1420C>T in cSHMT gene in 149 volunteers. COMT cSHMT MTHFR AA GA GG Skupaj CC CT TT Skupaj CC 22 31 18 71 34 27 10 71 CT 18 29 13 60 21 36 3 60 TT 5 8 5 18 5 12 1 18 Skupaj 45 68 36 149 60 75 14 149 sklepamo, da v evoluciji Evropejcev ni bilo ośitne prednosti ali slabosti zaradi mutacij izbranih genov. Iz tega lahko sklepamo, da mutacije prouśevanih genov niso vplivale na prećivetje in moćnost razmnoćevanja kljub temu, da imajo homozigoti mutiranih genov le od polovico do tretjine aktivnosti encimov nemutiranih genotipov. Sklepamo, da so imeli osebki z mutiranimi genotipi neke druge prednosti. V naři raziskavi smo prouśevali gene za kljuśne encime presnove homocisteina, ki povezujejo presnovo homocisteina s sintezo DNA (MTHFR-cSHMT). Znićana aktivnost encima MTHFR genotipa TT na priblićno 35 % in polna aktivnost encim cSHMT genotipa CC omogośata preusmeritev folatov iz presnove homocisteina v sintezo timidilata in s tem DNA (slika 1). Izmerjena pogostost T alela v genu za MTHFR v slovenski populaciji je 32 % (v Evropi od 24,5 do 43,8), kar je zelo visoka pogostost glede na to, da 148 farm vestn 2008; 59 Primerjava alelnih frekvenc mutacij kljuśnih encimov presnove homocisteina ima encim TT genotipa le tretjino aktivnosti encima nemutiranega homozigota. V evoluciji je, po vsej verjetnosti, mutirani alel imel v dolośenih pogojih prednost in je omogośal boljřo prilagoditev na pomanjkanje hrane ćivalskega izvora, ki vsebuje aminokislino metionin. Omogośal je preusmeritev folatov v sintezo timidilata (cSHMT) in s tem DNA. S tem je dajal evolucijsko prednost nosilcem T alela. (27) 4 Zakljuśek Rezultati naře raziskave so pokazali, da se ugotovljene frekvence genotipov v slovenski populaciji ne razlikujejo od priśakovanih Zakljuśimo lahko, da v evoluciji Evropejcev ni bilo ośitne prednosti al slabosti zaradi mutacij v izbranih genih, ki vplivajo na presnovo homocisteina in s tem na razvoj srśnoćilnih bolezni. 5 Literatura 1. Chen P, Poddar R,Tipa EV et al. Homocysteine metabolism in cardiovascular cells and tissues: implications for hyperhomocysteinemia and cardiovascular disease. Adv Enzyme Regul 1999; 39:93-109. 2. Biasioli S, Schiavon R. Homocysteine as a cardiovascular risk factor. Blood Purif. 2000; 18:177-82. Review. 3. Clarke R, Levington S, Donald A et al. Understiation of the importance of homocysteine as a risk factor for cardiovascular disease in epidemiological studies. J Cardiovasc Risc 2001 8:396-9. 4. Castro R et al. Homocysteine metabolism, hyperhomocysteinaemia and vascular disease: an overview. J Inherit Metab Dis, 2006. 29(1): p. 3-20. 5. Stegnar M. Hiperhomocisteinemija in ćilna bolezen. Farm. Vestn 2002; 343-346. 6. Weisberg IS, Park E, Ballman KV et al. Investigations of a common genetic variant in betaine-homocysteine methyltransferase (BHMT) in coronary artery disease. Atherosclerosis 2003; 167(2): 205-214. 7. Marc J. Laboratorijska medicina pri obravnavi bolnika s konśno ledviśno boleznijo. Farm vestn 2004; 283-285. 8. Van der Put NMJ, Van Straaten HWM, Trijbels FJM et al: Folate, homocysteine and neural tube defects: an overview. Exp Biol Med 2001; 226: 243-270. 9. Geisel J, Hübner U, Bodis M et al. The Role of Genetic Factors in the Development of Hyperhomocysteinemia. Clin Chem Lab Med 2003; 41(11):1427-1434. 10. Leclerc D, Sibani S, Rozen R. Molecular biology of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and overwiev of mutations/polymorphisms. In: NCBI Books. Dostopno marca 2005 na internetu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.chapter.3 0251 11. Uni-prot podatkovna baza na internetu. Dostopno marca 2007 na internetu: http://www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.do?proteinId=MTHR_HUMAN&pager.offset=0. 12. Yamada K, Chen Z, Rozen R et al. Effects of common polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate reductase. PNAS 2001; 98 (26): 14853-14858. Dostopno februarja 2007 na internetu http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.261469998. 13. Fodinger M, Horl WH, Sunder-Plassmann G. Molecular biology of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase. JNephrol 2000; 13:20-33. 14. Voutilainen, S et al. Functional COMT Val158Met Polymorphism, Risk of Acute Coronary Events and Serum Homocysteine: The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study. PLoS ONE, 2007. 2: p. e181 15. Munafo MR et al. Lack of association of the COMT (Val158/108 Met) gene and schizophrenia: a meta-analysis of case-control studies. Mol Psychiatry, 2005. 10(8): p. 765-70. 16. Vidgren J, Svensson LA, Liljas A. Catechol: O-Methyltransferase; Deposition 5-Jan-96; Taxonomy: Rattus norvegicus. Dostopno maja 2007 na internetu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/ mmdbsrv.cgi?form=6&db=t&Dopt=s&uid=4499. 17. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) - COMT. Dostopno maja 2007 na internetu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=116790. 18. ALFRED baza za COMT 1947G>A mutacijo. Dostopno maja 2007 na internetu: 19. Costi MP, Ferrari S. Update on antifolate drugs targets. Current Drugs Tarets 2001; 2:135-166. 20. Renwick SB, Snell K, Baumann U. The crystal structure of human cytosolic serine hydroksymethyltransferase: a target for cancer chemotherapy. Structure 1998; 6:1105-1116. 21. Chaturvedi S, Bhakuni V. Unusual structural, functional, and stability properties of serine hydroxymethyltransferase from Mycobacterium tuberculosis. Biol Chem 2003;78:40793-805. 22. Garrow TA, Brenner AA, Whitehead VM et al. Cloning of human cDNAs encoding mitochondrial and cytosolic serine hydroxymethyltransferase and chromosomal localization. The journal of biological chemistry 1993; 268:11910-6. 23. Slkibola CF, Smith MT, Hubbard M et al. Polymorphisms in the Thymidylate synthase and serine hydroxymethyltransferase genes and risk of adult acute lymphocytyc leukemia. Blood 2002; 99:3786-3791 24. Hishida A, Matsuo K, Hamajima N et al. Associations between polymorphisms in the thymidylate synthase and serine hydroxymethyltransferase and susceptibility to malignant lymphoma. Haematologica 2003; 88:159-166. 25. Frosst P, Blom HJ, Milos R et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995 May;10(1):111-3. 26. Malhotra AK, Kestler LJ, Mazzanti C et al. A functional polymorphism in the COMT gene and performance on a test of prefrontal cognition. Am J Psychiatry. 2002 Apr;159(4):652-4. 27. Kimura M. The neutral theory of molecular evolution. Cambridge University Press. Cambridge, UK.1983. farm vestn 2008; 59 149 I p alofvostoliri, Blmsto obložene tablete po 10 mg, 20 mg in -JO mg Skrajšano navodilo za predpisovanje TERAPEVTSKE INOIKACJE: Pdnwmo hieei*inlestemlerni|n [hp Itn), bombi nirana hjpeHipidemijai jlip llhj. heie-iO-Zigpina in homozigo'na druiinska hiperholesJeicfemip Uporaba zdravita je indirirona kal dodalek L dimnemu .zdravljenju xn minevanje ravni ceiolneoa haie.O&ioSa. naJeslerola LDl. apoTipaproreina B tn trig lice ridov ODMERJANJE IN NACIN UPORA6E: /acelT.i odmerek ID mg nn dan, ncjveŁ|i odmerek 80 mg no dan. Roinikom z ledvicna okvaro odmerka zdiovila ru Ireba prilagajali KONTRAINDIKACIJE: P-reobiUjlIjivost za alarvoslolin ali katerokgk pomožno snov. aktivna jetrna bolezen nli nepojasnjena skalna zv&Łxm\n serumskih vredriasJi Iransamimz. bolezni skeletnih miSic. noret nost in dojenje, genske v rodni- dobi. ki ne upoiablrajo zaneiTjive ko n'race pc ij.sk e zolcMe POSEBNA OPOZORILA IN PREVIDNOSTNI UKREPI: Jetrna okvara: Po uporabi ^awalcev redukraje HiVLG CoA se lahko laka kol po upambi nekaJarili drugih hipdipami^v pajavija brokemiine ncpfavilnasS v delovanju jeler jetrne kintcijske lesre je priporocena aprgvili pred zoielkgm zdravljenja in 1? ledngv po jocelku zdravljenja ali pa zvecanju odmerka, ngro pa periodicno, npr. na "-3 |e zvecanje vrednasi Alt nil AST veŁje ad Irikraine zgpmje mejne vrednoplr. je priporoceno odme/el atarvastaUnc zmpn|xili ali pq zdravljenje Z n|lm ustavili. Algrywralin je 1rebo drjjtfl zeEo previdno bolnikom, ki popijejo prncflj alkoholnih pijgt. In/ok lisiim z jetino hafezn-ijo w anamnez ^kelfvrna miSiro: MqŁna;r miopalije [po dpftniriji mijifne bolecini? oil mišicno. oilgbelafi 2 vrednpilml krealinrosrokinaze iCPKJ. ki so veŁ kal deselkrat veCje od zgornje mejne vrednosti) je Irene upoitevgri pri vsakem bolniku z cMuznimn mnalgtjaini. mi5iŁng ab4ud|ivaatjo ali ailobelailjo in/ali bistvenim zvecanjem viedngsli CPK Zdravnik mora pri odlocanju za kombinirana zdravljen}? z arorvaslafingm In derivati fibricne kisline. eiiriompcinam, Imkmo-supresivnimi zdiovili, azalnlmi nnlimitgJiki gl| hi pol Fpen ucnimi odmerki niacirtn skrbno pceiehraii. gli je rnaina koiin vecja od rveggnjg. vse bolnike, pri leo.ie.rih se pojavijo, znaki alj simpjgmi bolecin v miSitgh.niihove obcuiljtvosli ali o^lobelg^ri. 3e posebej v prvih mewclh zdrgv||en|q In gb vwkem zvecanja odmerfcov zoVaviF pri njihovem Kiriranjm pa sJfjbnoopazcvaJl, cdraytjenje Z ataFvgsJarlnnm je rreba zacasno at» za stilno «lovili pri bolnih v hudem akulnem FJgnj«. ti bi UftgriH bili pwbdtca mkjpalijfk, in pri tisiih, pri katerih obirajo zaradi dejavnikov tyegonjn nevainctf pa|avo «Jfundarne ledtftne InjuficiBnce po fabdpmlaJrZi. takmza. Zdravilo Tulip vsebuje forktozo Bolniki z redko dedno inloieronco za galnAlozo. laponslto obliko zmanjlame aktivnost lakhjze qrli mglabsorpcito glutoze/gahkloze ne smejo jen»aH tega zdramila. MEDSEBOJNO DELOVANJE Z DRUGIMI ZDRAVIU IN DRUGE OBUKE INTERAKCIJ: Ob socasni uporabi clkbspcxJnn. fibratm. nrokjofcdnlh anriroliov [rudi eriirnmicina). azolsllh anrimilgl4w oil niodna &e zve^o hnaganjo za miopariio; v indkih primerih jo priilo do rrjbdomiolizn z moicnim deFcwanjeri ledvic zotadi niittqfobinunfe-. Zoro je neba nniaipCno proEohiori korisil in rueaanfa io^osnogo zdrovtjenjo. Aforvaildmi m pTOsnaMfQ] i clokromom P450 3A4. zoro |e powebw pfevkJrioti. -Ca olorvo^ohn uporoblromo *o!osrio z zovirolcl ctokcooia PASO JA4 (npf, okk) spojno m, rnokrokJniml oAlibkš*^. vHiucno z orilrarrtdnom m kktHrrDmrcrMrn. neFozodcnom. ozoMnl anNfiHohkl (»udi Iriaicnazobnil in zovuaicJ HIV prolaoze] Mod ^amonfHn aiwvairaiina nf pf90^(^0. da bolmk p1|a vetku ojrentvklnego «Aar ki v!.cbu|e voi »jtovin, Id zo^rnjo CvP 3A4, tntofokdrje 'p Iraba upadlsralf rudr pi drugih zdravilih z nlzfcim letopovlskim Indeksom, npr. pri onilarllmlbh iz skupine ill (todl ofnfadoroou] Do inieroJkcij pride rud ob soioini upoftjtn Qkxva^ofana 1 libraJl dgokaJnom, pcrorQlnimL kmirocepBrv) mroodi, vorfofinom NEŽELENI UCINKI: Bolnjii adorvosiotin na iploSno dabfa pfBnaiajo. NflielsnJ uŁlnlci 5a ponavadi blagi In prehodni. Nateienl ufinldi» razvr^en po pogounoifc Pogo&rl (s I /100 do < l/10f zap rjo, fioruienta, diipepsJ|a, novz»p. driska. olrwgl|ske Hdkc^flL nsipAfnarsa. growofcol. omorika, poiestozil«. hipoj*o-zi|Q. kazni izpui^aj. pruriiui, mialgija, anralglja, astenija. bole&ne v prsiPt. boleiin& v hrbtu, porlferni edemi. zvfEanje viednoai serumske kieaiin FoJoklwz* [CPK|[>3^ ZrvIN]. Obdtisni (2- 1/9000 da-^ I/IDO]: ono^ekiija, btuhanjc, iraniwiiDpenijo. dopocrju, hipwgllkMmlfa. hipagllliflmlja. pankrao^fi*. omnizfio, perona niMapaUja. urrHariro, i.miu:. miopdija. z^iOAjfr VMKl^ilMronsainlnai j>3x ZM fN VSEBINA Skaiice i 30 roUstaml po 10 r^g, 30 mg in 40 mg otorvaitarlino in Sfcarlico z 40 tabbiomi pa 10 mg, 20 mg. in 40 mg otoivaaroiina IZDAJANJE ZDRAVILA: Šamana fdravnilfd ratep». IMETNIK DOVOLJENJA ZA PfiOMET: \ak rtirmacevtsla diužba d.d.. Ve-ravJJcava 57. LJubljana, SlrTrenijo Informacijo pflpcgvlffjng- marec 2008, PooVobnBJie nFormadje o zdravilu » no voljo pri proizvajaleu-, ®lek clan skupine Sandoz Lek fannacevtska druiba d. d., VeravSkova 57.1526 Llubljana • www.lek.si Obravnava astme v Sloveniji - prospektivna opazovalna raziskava Obravnava astme v Sloveniji prospektivna opazovalna raziskava Managing of asthma in Slovenia -prospective observational study Stanislav Šuškovic Povzetek: Veliko bolnikov ima kljub zdravilom slabo urejeno astmo. V opazovalni prospektivni raziskavi smo preuśevali v kolikřni meri se da urejenost astme ře dodatno izboljřati. V raziskavo je bilo vkljuśenih 425 bolnikov z neurejeno astmo, katerim so zdravniki po lastni presoji spremenili terapijo. Izkazalo se je, da so zdravniki veliki veśini bolnikom, ki so imeli do vkljuśitve v raziskavo predpisan olajřevalec, inhalacijski glukokortikoid brez ali z dolgodelujośim simpati komimetikom dodatno predpisali montelukast 10 mg/dan. Bolnikom se je statistiśno signifikant-no (vse p< 0.001) po 6 tednih dodanega montelukasta ne glede na izhodiřśno terapijo izboljřala pljuśna funkcija (merjena s PEF in/ali FEV1) zmanjřala pogostnost dnevnih in nośnih simptomov ter popravila telesna zmogljivost. Bolniki so ocenili, da se jim je kakovost ćivljenja pomembno izboljřala. Menimo, da je potrebno redno razkrivanje stopnje urejenosti astme ter da montelukast pomembno izboljřa parametre urejenosti astme ne glede na predhodno terapijo, celo pri bolnikih, ki imajo neurejeno astmo ob prejemanju fiksne kombinacije inhalacijskega glukoko-rtikoida z dolgodelujośim simpatikomimetikom beta2. Kljuśne besede: Urejenost astme, montelukast, inhalacijski glukokortikoid, dolgodelujośi simpatikomimetik beta2 Abstract: Many patients have in spite of regular treatment still poorly controlled asthma. In prospective observational study we questioned the possibility of further improving the level of asthma control. 425 patients with uncontrolled asthma were included. At first visit the treatment plan was changed according to physician’s preference. As patients were before the entry in to the study treated with short acting bronchodilators, inhaled glucocorticoids alone or in fixed combination with long acting beta2 sympathicomimetics most of the included patients were additionally treated for next 6 weeks with montelukast 10 mg/day. In that period control of asthma statistically significantly improved with less day or night symptoms, improved exercise tolerance and heightened quality of life (all p< 0.001). Lung function also statistically significantly improved (PEF or/and FEV1, p< 0.001). It was concluded, that addition of montelukast is useful in patients with uncontrolled asthma even in patients, treated with fixed combination of inhaled glucocorticoid and long acting sympaticomimetic beta2. Key words: Control of asthma, montelukast, inhaled glucocorticoid, long acting sympaticomimetic beta2. 1 Uvod Astma je bolezen za katero je znaśilno persistentno vnetje bronhijev, ki se kaće s simptomi tećkega dihanja, piskanja, kařljanja in tiřśanja v prsih. Vnetje prispeva k zapori dihalnih poti, bronhialni preodzivnosti in zveśani cirkadialni variabilnosti. Osnovni vzrok vnetja je neznan vnetje pa najpogosteje poslabřajo virusi ter redkeje vdihani alergeni. Sproćilci pri astmi izzovejo aktivacijo limfocitov T, eozinofilcev, mastocitov in makrofagov iz katerih se sprořśajo vnetni mediatorji, kot so citokini in levkotrieni. Tako citokini kot levkotrieni so pomembn mediatorji vnetja. Citokini stimulirajo proliferacijo in diferenciacijo vnetnih celic (limfociti B in T, makrofagi, nevtrofilci, eozinofilci) in vplivajo na njihovo delovanje. Levkotrieni pomembno zmanjřajo ciliarno aktivnost, zveśajo izlośanje sluzi, poveśajo prepustnost ćil, kar vodi v nastanek edema, ter v vnetiřśe privabljajo vedno nove vnetne celice. Levkotrieni so mośni bronhokonstriktorji, saj je njihov uśinek 1000-krat mośnejři od uśinka histamina. Ob zmanjřanju vnetja se astma kliniśno in funkcijsko izboljřa (1-3). Temeljna protivnetna zdravila so glukokortikoidi in antilevkotrieni Oboji so primerni za zaśetno zdravljenje astme. V kolikor astma samo z enim prepreśevalcem ni zadovoljivo urejena lahko bolnik prejema kombinacijo inhalacijskega glukokortikoida in antilevkotriena, saj je s tem zagotovljen boljři nadzor nad vnetjem v pljuśih (4-6). V Sloveniji nimamo natanśnega podatka o prevalenci astme pri odrasli populaciji. Nekatere raziskave kaćejo na slabřo urejenost astme od priśakovane (prepogosti dnevni in nośni simptomi poslabřanja zaradi katerih bolniki izostajajo od dela/řole, motene vsakodnevne telesne aktivnosti, slabřanje/upadanje pljuśne Prof. dr. Stanislav Šuškovic, dr.med., Bolnišnica Golnik, Klinicni oddelek za pljucne bolezni in alergijo, 4204 Golnik farm vestn 2008; 59 151 Raziskovalni ślanki - Research Article funkcije...) in to kljub prejemanju inhalacijskih glukokortikoidov oz. tudi će fiksnih kombinacij inhalacijskega glukokortikoida z dolgodelujośimi simpatikomimetiki (7). Odlośili smo se, da bomo z neintervencijsko opazovalno raziskavo poskuřali odkriti bolnike s slabo nadzorovano astmo in jim izboljřati kvaliteto ćivljenja. Pri obravnavi bolnikov so zdravniki ocenjeval simptome astme, parametre pljuśne funkcije, urejenost astme in kakovost ćivljenja. 2 Metode V neintervencijski opazovalni raziskavi, ki je bila izvedena med oktobrom 2005 in marcem 2006 je sodelovalo 67 nakljuśno izbranih zdravnikov (pulmologov in splořnih/drućinskih zdravnikov) iz vse Slovenije. Za raziskavo so bili primerni vsi bolniki z astmo, za katere so zdravniki ob pregledu ugotovili kazalce neurejenosti astme. V raziskavi sodelujośi zdravniki so za vsakega bolnika ob vkljuśitvi v raziskavo (»1. obisk«) zabelećili njegovo trenutno terapijo zoper astmo, kazalce urejenosti astme (dnevne in nośne simptome, uporabo olajřevalca, telesno zmogljivost bolnika), bolnikovo oceno o kakovosti ćivljenja, pljuśno funkcijo (FEV1 in/ali PEF) in svetovano nadaljevalno terapijo zoper astmo. PEF (najveśji ekspiratorni pretok -peak expiratory flow) smo merili s prenosnim Mini-Wrightovim merilcem. FEV1 (forsirani ekspiratorni volumen v prvi sekundi) smo merili s spirometri, ki so bili na voljo v posameznih raziskovalnih centrih. Parne vrednosti FEV1 so bile izmerjene vselej z istim aparatom ter z enako merilno tehniko. Kriteriji za urejenost astme so bili: brez dnevnih ali nośnih simptomov, brez uporabe olajřevalca ter z normalno telesno zmogljivostjo. Odstopanje od kateregakoli kriterija je pomenilo, da ima bolnik astmo neurejeno ter da se ga lahko vkljuśi v raziskavo. Vsi bolniki so bili po naśelih dobre prakse obveřśeni, da se njihovi podatki zbirajo v anonimizirani bazi podatkov. Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije. Zdravnik je ob vkljuśitvi bolnika v raziskavo lahko po svoji presoj zdravljenje spremenil. Po 4 do 6 tednih je sledil kontrolni obisk (»2. obisk«) in zdravnik je zabelećil iste parametre, kot ob vkljuśitvi bolnika v raziskavo. Izpolnjene protokole smo analizirali z studentovim t testom ali hi-kvadrat testom. Pri analizi smo uporabljali Excel 2003. 3 Rezultati V raziskavo je bilo vkljuśenih 425 bolnikov. Povpreśna starost bolnikov vkljuśenih v raziskavo je bila 47,3 let. 3.1 Terapija - zdravila, ki so jih jemali bolniki Pri prvem obisku je 52 bolnikov uporabljalo le kratkodelujośi simpatikomimetik (SABA), 168 bolnikov le inhalacijski glukokortikoid (IGK), 175 kombinacijo IGK s dolgodelujośim simpatikomimetikom (IGK/LABA) ter 30 druga zdravila (antihistaminik, peroraln glukokortikoid itd). Nihśe ni imel predpisanega antilevkotriena Pri vseh bolnikih z ugotovljeno neurejeno astmo so se zdravniki ob prvem pregledu odlośili za dodatek antagonista levkotrienskih receptorjev montelukast, opaćene pa so bile tudi nekatere druge manjře terapevtske spremembe (tabela 1) 3.2 Vpliv na pljuśno funkcijo PEF in/ali FEV1 so merili pri 266 od 425 vkljuśenih bolnikov. PEF se je od prvega do drugega obiska v povpreśju poviřal za 55 L/min oziroma za 13,5 % (p<0,001). FEV1 se je od prvega do drugega obiska v povpreśju poviřal za 306 ml oziroma za 12,4 % (p<0,001). 3.3 Primerjava kazalcev urejenosti astme ob prvem in drugem obisku 3.3.1 Dnevni simptomi Zdravniki so pogostnost dnevnih simptomov ocenjevali s pomośjo petih kategorij. Ob prvem obisku je imela veśina bolnikov (67%) simptome veśkrat dnevno oz. veśkrat tedensko, le śetrtina (26 %) nekajkrat meseśno oz. nikoli. Ob drugem obisku je bilo ravno nasprotno: kar 71% bolnikov je imelo dnevne simptome le nekajkrat meseśno oz. nikoli, 28% pa je bilo ře vedno takih, ki so imeli dnevne simptome veśkrat dnevno oz. veśkrat tedensko. Razlika je bila statistiśno visoko pomembna (p<0.001) (slika 1). 3.5.2 Nośni simptomi Podoben trend izboljřanja se je pokazal pri nośnih simptomih Podobno kot v primeru dnevnih simptomov so imeli zdravniki na voljo pet kategorij. Pri prvem obisku je skoraj polovica bolnikov porośala o nośni astmi vsako noś oz. veśkrat na teden (49%), pri drugem obisku Tabela 1. Sprememba terapije ob vkljuśitvi v raziskavo. Legenda: kratkodelujośi bronhodilatator (SABA), inhalacijski glukokortikoid (IGK), dolgodelujośi bronhodilatator (LABA), montelukast (MTL). Table 1: Change of therapy at enrolment into the study. Legend: short acting bronchodilator (SABA), inhaled corticosteroid (IGK), long acting bronchodilator (LABA), montelukast (MTL). SABA IGK IGK/LABA MTL OSTALO IGK + MTL IGK/LABA + MTL 1.obisk 52 168 175 0 30 0 0 2.obisk 0 0 0 107 0 164 154 152 farm vestn 2008; 59 Obravnava astme v Sloveniji - prospektivna opazovalna raziskava Slika 1: Pogostnost dnevnih simptomov je po uvedbi montelukasta statistiśno pomembno upadla (p<0.001). Picture 1: Frequency of daily symptoms has statistically significant decreased after initiation of montelukast (p<0.001). Slika 4: Uporaba olajřevalca je po uvedbi montelukasta statistiśno pomembno upadla (p<0.001). Picture 4: Frequency of reliever consumption has statistically significant decreased after initiation of montelukast (p<0.001). Slika 2: Pogostnost nośnih simptomov se je po uvedbi montelukasta statistiśno pomembno zmanjřala (p<0.001). Picture 2: Frequency of night symptoms has statistically significant decreased after initiation of montelukast (p<0.001). Slika 3: Po uvedbi montelukasta se je bolnikom statistiśno pomembno poveśala telesna zmogljivost (p<0.001). Picture 3: The exercise tolerance has statistically significant increased after initiation of montelukast (p<0.001). Slika 5: Po uvedbi montelukasta so bolniki kakovost ćivljenja statistiśno pomembno bolje ocenili (p<0.001). Picture 5: The quality of life has statistically significant improved after initiation of montelukast (p<0.001). se je delež teh bolnikov zmanjšal na 11%. Druga polovica bolnikov (48%) je pri prvem obisku porocala o simptomih nocne astme nekajkrat na mesec oz. nikoli, pri drugem obisku se je delež povecal na 88 % Razlika je bila statisticno visoko pomembna (p<0.001) (slika 2). 3.5.3 Telesna zmogljivost Pri drugem obisku se je mocno povecal delež bolnikov, ki so imeli težko sapo le ob zelo hudem telesnem naporu (iz 17% na 53%). Po uvedbi montelukasta so se znižali deleži bolnikov, ki so doživljali napor pri manj intenzivnih oblikah telesne aktivnosti, kot sta hoja po ravnem (iz 36 % na 10 %) in hitra hoja (iz 44 % na 37 %) Razlika je bila statisticno visoko pomembna (p<0.001) (slika 3). 3.5.4 Uporaba olajševalca Pri prvem obisku je bilo le 11% bolnikov, ki niso nikoli uporabljali olajševalca. Ob drugem obisku pa kar dobra tretjina (35%) bolnikov ni farm vestn 2008; 59 153 Raziskovalni ślanki - Research Article vec uporabljala olajševalca. Pri drugem obisku se je nekoliko znižal delež bolnikov, ki so olajševalec uporabljali vsakodnevno, a manj kot 10 vpihov na dan (iz 78 % na 63 %) in tistih, ki so olajševalec uporabljali vsakodnevno, a vec kot 10 vpihov na dan (iz 11 % na 3 %) Razlika je bila statisticno visoko pomembna (p<0.001) (slika 4). 3.5.5 Kakovost življenja Po terapiji se je izboljšala tudi percepcija bolnikov o njihovi kakovosti življenja. Pred dodatno terapijo je vecina bolnikov ocenila svojo kakovost življenja kot zadovoljivo oz. slabo (74%). Po uvedb montelukasta je bilo takih še 24%, vecina pa je ocenila svojo kakovost življenja kot dobro oz. zelo dobro (76%) Razlika je bila statisticno visoko pomembna (p<0.001) (slika 5). 3.6 Varnost Zdravilo montelukast se je izkazalo za varno. V casu trajanja raziskave (okt 05 - mar 06) so zdravniki porocali o 4 (štirih) neželenih ucinkih pri zdravljenju z montelukastom (glavobol, utrujenost in zgaga, bolecine in otekanje sklepov, žeja ter otekanje obraza), med njimi ni bilo resnih neželenih ucinkov. 4 Razprava V prospektivni opazovalni raziskavi smo ugotovili, da dodatek montelukasta k ustaljeni terapiji bolnikov z neurejeno astmo pripomore k zboljšani urejenosti astme, izboljšani kakovosti astme ter k izboljšanju pljucne funkcije. Podatki, ki so pridobljeni z neintervencijskimi raziskavami so koristni, ker odražajo posnetek realnega dogajanja v populaciji bolnikov z astmo in s tem tudi ucinkovitost terapije v realnem življenju (8-10). Podatki pridobljeni v opazovalnih raziskavah zato odlicno dopolnjujejo rezultate nadzorovanih klinicnih raziskav. Slabost opazovalne študije je v tem, da ni oblikovana dvojno slepo ter s placebo skupino. Vendar pa so bili po drugi strani v randomizirane farmakološke raziskave vkljucevani le mocno selekcionirani bolniki z astmo. Zaradi številnih izkljucitvenih kriterijev (starost, predhodna terapija, nekadilci, brez komorbidnosti) je bilo v takšne raziskave vkljucenih le del bolnikov z astmo. S cimer pa veljajo izidi sicer metodološko brezhibno oblikovanih randomiziranih raziskav seveda le za majhen delež »realnih« bolnikov. Za vecji del bolnikov, ki jih srecujemo ob našem vsakodnevnem delu, rezultatov randomiziranih »izkljucitvenih« raziskav ne moremo brez zadržkov sprejeti. To se je na primer jasno pokazalo ob spoznanju, da inhalacijski glukokortikoid pri astmatikih, ki kadijo ne ucinkujejo dobro, ali pa sploh ne ucinkujejo. Ker so bili kadilci astmatiki dolgo casa izkljuceni iz randomiziranih raziskav, smo do tega spoznanja prišli relativno pozno. Za vkljucitev v našo opazovalno raziskavo ni bilo niti ene omejitve. Razen seveda ugotovitve, da je astma že urejena s trenutno predpisanimi zdravili. Rezultati opazovalne raziskave so pokazali, da je v Sloveniji še vedno veliko bolnikov z astmo, ki imajo nenadzorovano astmo, a se jo da primerno urediti. Vsem bolnikom, ki so bili vkljuceni v raziskavo (ugotovljena neurejenost astme) so zdravniki ob prvem obisku predpisali antilevkotrien (montelukast). Rezultati potrjujejo pomembno vlogo levkotrienov kot mediatorjev vnetja pri astmi, katero so ugotovil v podobnih, nedavnih opazovalnih raziskavah drugi avtorji (8-10). 154 farm vestn 2008; 59 Uvedba oz. dodatek antilevkotriena je izboljšala vse opazovane parametre. Pomembno in statisticno znacilno se je povecal PEF in FEV1, zmanjšalo se je število bolnikov z dnevnimi in nocnimi simptomi, mocno se je povecal delež bolnikov, ki so bili brez pomembnih težav ob telesnem naporu. Ce pogledamo kazalce urejenosti astme lahko vidimo, da so se po uvedbi montelukasta vsi preucevani kazalci statisticno pomemno izboljšali. Vecina bolnikov je ob vkljucitvi v raziskavo že uporabljala inhalacijski glukokortikoid ali fiksno kombinacijo; z dodatkom antlevkotriena so dodatno pridobili na urejenosti. Samo montelukast je zadostoval 25% bolnikov, ki pred tem niso uporabljali nobenega protivnetnega zdravila za zdravljenje astme. V subanalizi podatkov se je tudi izkazalo, da je dodatek montelukasta koristil tako bolnikom, ki so prejemali inhalacijski glukokortikoid (N=168) kakor celo tudi bolnikom, ki so ob vkljucitvi v raziskavo prejemali fiksno kombinacijo inhalacijskega glukokortikoida z dolgodelujocim simpatikomimetikom (N=175). Takšne ugotovitve imajo tudi drugi (10). 5 Literatura 1. Moore WC, Peters SP. Update in asthma 2006. Am J Respir Crit Care Med 2007;7:649-54. 2. W. Glezen. Asthma, influenza, and vaccination. J Allerg Clin mmunol 2006;118: 1199-1206. 3. Ogawa Y, Calhoun WJ. The role of leukotrienes in airway inflammation. 2006;118(4):789-98. 4. Global Strategy for Asthma Management and Prevention 2006, www.ginasthma.org.GINA, 5. Šuškovic S.Košnik M, Fležar M et al. Stališce Bolnišnice Golnik -KOPA, Združenja pnevmologov Slovenije in Katedre za družinsko medicino do obravnave odraslega bolnika z astmo Zdrav Vestn 2007; (6): 369-79. 6. Scow DT, Luttermoser GK, Dickerson KS. Leukotriene inhibitors in the treatment of allergy and asthma. Am Fam Physician. 2007 Jan 1;75(1):65-70. 7. Šuškovic S. Raziskava o odraslih in otroških bolnikih z astmo v Sloveniji. Zdrav Vestn 2003; 72(6):367-72. 8. Borderias L, Mincewicz G, Sazonov Kocevar V et al. Asthma control in patients with asthma and allergic rhinitis receiving add-on montelukast therapy for 12 months: a retrospective observational study. Curr Med R Opinion 2007;23:721-30. 9. Zhang Q, Thomas M, Price D. Treatment and outcomes in patients with asthma and allergic rhinitis in the United Kingdom. Int Arch Allergy Immunol 2007;142:318-28. 10. Dupont L, Potvin E, Korn D. Singulair as Complementary Therapy to Fixed Association in Real life Study Group. Improving asthma control in patients suboptimally controlled on inhaled steroids and long-acting beta2-agonists: addition of montelukast in an open-label pilot study. Curr Med Res Opin 2005;21(6):863-9. Novice iz sveta farmacije Novice iz sveta farmacije dr. Andrijana Tivadar, dr. Petra Slane Može, Marjetka Smolej, dr. Bojan Doljak, prof. dr. Borut Štrukelj uśinkovitost FDA potrdila fenilefrina Borut Štrukelj Posvetovalni komite ameriřke Agencije za hrano in zdravila (FDA) je potrdil uśinkovitost in varnost uporabe peroralnih pripravkov, ki vsebujejo 10 mg fenilefrinijevega hidroklorida. FDA se je odzvala s tem mnenjem na podlagi peticije, ki je bila naslovljena nanjo v februarju 2007. Predlagatelji peticije zatrjujejo, da za uśinkovitost in varnost delovanja fenilefrinijevega hidroklorida in bitartrata v danih odmerkih, v obstojeśih monografijah ni zadostnih dokazov. V skladu s peticijo bi bilo potrebno odmerek za odrasle dvigniti z 10 mg na 25 mg vsake řtiri ure, vendar pa dnevni odmerek ne bi smel preseśi 100 mg fenilefrinijevega hidroklorida na dan. Za bitartratno sol pa iz 15,6 mg na 40 mg vsake řtiri ure z maksimalnim dnevnim odmerkom 160 mg. Predlagatelji peticije se prav tako zavzemajo, da bi bilo potrebno izvesti dodatne řtudije, ki bi potrdile uśinkovitost viřjih odmerkov pri predlaganem dozirnem intervalu. Poleg tega se peticija zavzema tudi za ukinitev uporabe pri otrocih mlajřih od 12 let. Fenilefrinijev hidroklorid se uporablja kot nazalni dekongestiv, kot paralela pseudoefedrinu. Primerjava uśinkovitosti je protislovna, saj zanesljivih podatkov, ki bi belećili uśinkovitost fenilefrina po peroralnem dajanju ni. Glede na literaturne podatke je uśinkovitost fenilefrina po peroralnem dajanju osnovana na řtudijah farmacevtskih podjetij. V letu 2007 je bila sicer objavljena meta-analiza sedmih navzkrićnih řtudij, ki je potrdila uśinkovitost 10 mg fenilefrina v primerjavi s placebom (Kollar et al. 2007), vendar pa sta bila le tri mesece pred tem objavljena meta-analiza in pregled řtudij, ki pa za potrditev uśinkovitosti fenilefrina nista zbrala zadosti podatkov (Hatton et al. 2007). Uśinkovitost pseudoefedrina je bistveno bolj dokumentirana. Kljub temu pa ne gre zanemariti dveh dejstev, da je fenilefrin registriran v řtevilnih pripravkih na evropskih trgih ter po drugi strani, da je pseudoefedrin sintezni prekurzor metamfetamina. Varnost obeh uśinkovin je primerljiva. Priporośila posvetovalnega komiteja za FDA niso zavezujośa, vendar pa jim FDA navadno sledi. Zanimivo pa je, da porośilo prihaja ravno v śasu, ko je problematika uporabe pseudoefedrina na vrhuncu Viri: 1. www.otcbulletin.com 2. Kollar C, Schneider H, Waksman J, Krusinska E. Meta-analysis of the efficacy of a single dose of phenylephrine 10 mg compared with placebo in adults with acute nasal congestion due to the common cold. Clin Ther. 2007 Jun; 29 (6): 1057-70. 3. Hatton RC, Winterstein AG, McKelvey RP, Shuster J, Hendeles L. Efficacy and safety of oral phenylephrine: systematic review and meta-analysis. Ann Pharmacother. 2007 Mar; 41 (3): 381-90. Zdravljenje infekcij urinarnega trakta -nova odkritja Marjetka Smolej nfekcije urinarnega trakta (IUT) so za respiratornimi najpogostejře infekcije pri otrocih. Glede na mesto nastanka jih delimo na okućbe zgornjih seśil (pielonefritis) in okućbe spodnjih seśil (cistitis). Normalen urin ne vsebuje bakterij. Bakterije lahko pridejo v urinarni trakt in urin iz koće okrog rektuma in genitalij tako, da potujejo po seśevodu v mehur. Ko se to zgodi, bakterije lahko povzrośijo vnetje mehurja, ki se kaće kot zatekanje in boleśina v spodnjem delu trebuha. To vnetje mehurja se imenuje cistitis. Śe pa bakterije potujejo navzgor po seśnici v ledvica, se lahko razvije bakterijsko vnetje ledvic, ki se imenuje pielonefritis. Do sedaj je bilo zdravljenje IUT povezano z uporabo antibiotikov. Po zadnji řtudiji, objavljeni v reviji The Journal of the American Medical Association, pa pri zdravljenju ponavljajośih se IUT dolgotrajna uporaba antibiotika ni veś smiselna. Śe ima otrok ponavljajośe infekcije urinarnega trakta, zdravnik otroka pogosto pořlje na preiskavo za vesikoureteralni refluks Vesikoureteralni refluks je stanje, ki povzrośi vraśanje urina v ledvice. Pri tretjini otrok je refluks vzrok za IUT. Śe je bil pri otroku dokazan vesikoureteralni refluks, so zdravniki do sedaj rutinsko priporośali dolgotrajno (veśletno) terapijo z nizkimi odmerki antibiotika, da bi s tem prepreśili nadaljnje infekcije urinarnega trakta. Strokovnjaki so sedaj ugotovili, da je tako zdravljenje neuśinkovito in lahko celo poveśa moćnost za nastanek na antibiotik odpornih infekcij. Otroci s ponavljajośimi IUT, ki nastanejo zaradi vesikoureteralnega refluksa ali drugih dejavnikov (zaprtje, genetskih faktorjev ali preprosto zaradi zadrćevanja urina), po najnovejřih ugotovitvah ne potrebujejo dolgotrajne terapije z antibiotiki. Druga moćnost pri teh otrocih je opazovanje simptomov, testiranje urina in řele, śe testi kaćejo na bakterijsko okućbo, je potrebno zdraviti IUT s kratkotrajno (sedem do deset dni) terapijo z antibiotikom. Vśasih je potrebna tudi operacija, pogosto pa tećave izzvenijo, ko otrok zraste. Najboljře zdravljenje pa je preventiva. IUT je ena pogostejřih infekcij pri otrocih do řestih let, ki se jo da v dolośenih primerih prepreśiti. Deklice in neobrezani fantki so bolj ogroćena skupina, pri kateri je potrebna ře veśja pazljivost pri negi. Vedno jih je potrebno umivati od spredaj nazaj in jih tudi nauśiti, da se bodo sami pravilno brisali. Zmanjřati je potrebno tudi uporabo sladkih tekośin in tekośin z dodatki kofeina ter otroku ponujati veliko navadne vode. Viri 1. http://www.parenting.com/Common/printArticle.jsp?articleID= 1000053544 2. http://kidney.niddk.nih.gov/kudiseases/pubs/utichildren/ farm vestn 2008; 59 155 Novice iz sveta farmacije Zahteva FDA po umiku internetnega prehranskega dopolnila Xiadafil VIP: Razkrita še ena »naravna viagra« Borut Štrukelj Relativno majhna farmacevtska drućba SEI Pharmaceuticals iz Miamija, ZDA, je poveśala svoje prihodke za 700 % v zadnjih dveh letih z internetno prodajo prehranskega dopolnila Xiadafil VIP, ki ga je trćila v obliki pretisnega omota z dvema tabletama oziroma v min plastenkah po osem tablet. Izjemno agresivno trćenje po internetu je opisovalo Xiadafil kot popolnoma naravno prehransko dopolnilo za poveśevanje spolne mośi s takojřnjim delovanjem, brez nećelenih stranskih uśinkov in popolnoma varno. Vsebovalo naj bi izvleśke nekaterih zdravilnih rastlin, med njimi: ginsenga, roćnega korena, ginka in kitajske pokonśne dresni. Glavni uśinkovini, ki jih Xiadalafi vsebuje, naj ne bi bili v takem odstotku vsebovani v nobenem drugem pripravku. Ena od uśinkovin, ki je naravni derivat pirazolopirimidona, pa naj bi stimulirala nastanek duřikovega oksida, poveśevala koncentracijo cGMP in inhibirala fosfodiesterazo PDE-5, torej naj bi imela enake uśinke kot sildenafil, ki je uśinkovina znanega zdravila Viagra. Seveda uvrřśamo Viagro v skupino zdravil na recept, Xiadafi pa se je trćil kot prehransko dopolnilo. FDA je ugotovila, da vsebuje prehransko dopolnilo Xiadafil nevarno sintezno spojino, strukturno podobno sildenafil, ki lahko povzrośi nenaden padec krvnega tlaka, kar lahko privede tudi do smrti. To velja predvsem za paciente, ki jemljejo nitroglicerin in podobne uśinkovine. Janet Woodcock, direktorica Centra za evalvacijo zdravil pri FDA poudarja, da obstaja nevarnost predvsem zaradi napaśnega oznaśevanja, ki je zavajajośe, saj uporabnik verjame, da je prehransko dopolnilo stoodstotno naravno in ne povezuje moćnosti medsebojnega delovanja z ostalimi zdravili. FDA poudarja, da Xiadafil VIP tablete niso bile odobrene kot zdravilo in je poleg kvalitativne in kvantitativne sestave vprařljiva tudi kakovost in varnost pripravka. Vir: 1. FDA Immediate Release, junij 2008 Veś informacij www.fda.gov/consumer/updates/erectiledysfunction010408.html. Z novimi testi do varnejših zdravil Petra Slane Može V juniju 2008 sta tako Evropska agencija za zdravila (EMEA) kot Ameriřka agencija za zdravila in hrano (FDA) izdala prvi skupni predpis, ki vkljuśuje nove teste za ugotavljanje nefrotoksiśnosti uśinkovin. Doslej so farmacevtske drućbe, ki so hotele registrirati novo zdravilno uśinkovino, dokazovale odsotnost nefrotoksiśnosti z merjenjem kreatinina in uree v plazmi. Ker je bila metoda relativno pomanjkljiva, so uvedli merjenje koncentracije sedmih proteinov, imenovanih »ledviśni biomarkerji«. To so KIM-1, albumin, beta2-mikroglobulin, cistatin C, klusterin, celokupni proteini in trefoilni dejavnik-3. Z uvedbo omenjenih novih testov bodo uporabniki testiranih zdravilnih uśinkovin bolje zařśiteni, saj so bile doslej pořkodbe ledvic zaradi jemanja nekaterih zdravil relativno pogoste. Pri uporabi starih, trenutno ře veljavnih testov na osnovi uree in kreatinina, je mogośe zaznati pořkodbe ledvic en teden po tem, ko je pořkodba će nastala. Novi test pa je bolj obśutljiv in lahko zazna pořkodbo na celiśnem nivoju će nekaj ur po pořkodbi, prav tako pa je iz razmerja sedmih biomarkerjev mogośe ugotoviti, na katerem delu ledviśnega tkiva je pořkodba nastala. Zanimivo je, da je test razvila skupina raziskovalcev 16 inovativnih farmacevtskih drućb in ne EMEA ali FDA. Vodilno vlogo pri razvoju so imeli znanstveniki iz drućb Novartis in Merck&Co. Vir: 1. FDA Immediate Release, junij 2008 156 farm vestn 2008; 59 Iz društvenega življenja 33. skupšcina SFD Jelka Dolinar Tematika letošnjega simpozija Slovenskega farmacevtskega društva je pritegnila skoraj 400 udeležencev, pretežno farmacevtov iz cele Slovenije. O kakovosti vsebin prica majska številka Farmacevtskega vestnika, v katerem so objavljeni referati s simpozija. Srecanje se je zakljucilo z redno letno skupšcino v soboto, 17. maja. Raznolike aktivnosti Slovenskega farma cevtskega društva, o katerih je porocal predsednik Društva, se iz leta v leto pove cujejo. Narašca predvsem delovanje sekcij ki povezujejo clane s podobni profe sionaln interesi. Skupšcina je soglasno potrdila vsa porocila, prav tako tudi plane za leto 2008. Živahna razprava, ki je sledila porocilom kaže, da clani od Društva pricakujejo vec podpore pri uveljavljanju stroke v sistemu zdravstvenega varstva in v javnosti. Posebej je bil izpostavljen problem nepoznavanja poslovanja lekarniške službe, izraženih je bilo veliko predlogov glede nadaljnega razvoja FlC-a, farmacevtskega infor ma cijskega centra, ki je ob ustanovitvi med clan vzbudil velika pricakovanja, ki pa so se le delno izpolnila. Dejstvo je, da v teh treh letih projekt ni bil ustrezno voden, glede na cilje pa je bila postavljena prešibka kadrovsko-organizacijska struktura. Predstavljenih je bilo vec idej glede nadaljnjega razvoja FIC-a, med drugim tudi predlog, da FIC pridobi status organizacije za dajanje informacij javnega pomena, potem ko bi ga prej morali umestiti v zdravstveni sistem oz. ko bi pridobil status uradnosti. Tudi predlog o preimenovanje FlC-a v center za zdravila je vzbudil veliko zanimanja. Po predvidevanjih predsednika SFD bo razvoj FlC-a posledicno vplival tudi na razvoj založništva pri SFD, predvsem nacionalnega biltena o zdravilih, ki zadnja leta zarad nestabilnih razmer pri urednikovanju neredno izhaja. Pri obeh projektih je vsebinska usmeritev k lekarništvu tista, ki bo najbolj povezala clane in vecala ugled stroke. Skladno s tem stališci je skupšcina sprejela sklep, da mora postati dejavnost FlC-a prioritetna naloga SFD v naslednjih letih. Društvena priznanja v letu 2008 Izvršni odbor SFD je na 33. skupšcini podelil društvena priznanja. Minarikovo odlicje je prejel prof. dr. Slavko Peśar, mag. farm. Minarikovo priznanje so prejeli Marija Zupan Bizjak, mag. farm. spec. Marija Cehovin, mag. farm. mag. Andreja Cufar, mag. farm. spec. Nataša Faganelli, mag. farm. spec. Dušan Hus, mag. farm. Duša Kramer, mag. farm. Jože Kukman, mag. farm Matejka Kumperšcak Duh, mag. farm. spec. Saša Mauric, mag. farm. spec. Davorin Poherc, mag. farm. Mojca Prah Klemencic, mag. farm. Prof. dr. Slavko Peśar Prejemniki druřtvenih priznanj za leto 2008, skupaj z dr. Marcem in s prof. dr. Mrharjem farm vestn 2008; 59 157 Iz društvenega življenja Utemeljitve Pri magistri Mariji Zupan Bizjak izstopa njen osebni prispevek pri izdelavi monografij galenskih izdelkov, nadalje znacilno prispeva k dvigu kakovosti v lekarništvu z izvajanjem strokovnega nadzora s svetovanjem in s številnimi predavanji, z veliko predanostjo opravlja mentorsko delo za specializante, farmacevte in tehnike, je pa tudi zanesljiv in trezen mislec v kriznih situacijah, zato se kolegi vedno lahko zanesejo na njo. Predsednik SFD dr. Gašper Marc, predsednik Odbora za podeljevanje društvenih priznanj prof. dr. Aleš Mrhar in Marija Zupan Bizjak, mag. farm. spec. Magistra Marijo Cehovin odlikujejo strokovne in cloveške kvalitete. Svoje delo je usmerjala k cilju, da se dostojno predstavita in ovrednotita poklic in vloga lekarniškega farmacevta, kar je dosegla s povezovalnim delovanjem in odpiranjem možnosti strokovnega doka zovanja svojim sodelavcem. Svoje delo je vseskozi povezovala z delom Primorske podružnice, v kateri je uspela preseci razlicne regijske interese pri doseganju strokovnih ciljev. Marija Cehovin, mag. farm. Težko je na kratko z nekaj besedam predstaviti osebnost magistre Andreje Cufar, ki tako zelo preveva slovensko strokovno in javno sfero. V laicni javnosti je sinonim za 158 arm vestn 2008; 59 slovensko lekarništvo, prav tako pa pušca svoj pecat na vseh podrocjih farmacevtske stroke. S svojo neizcrpno energijo in življenjskim optimizmom se loteva vsakodnevnih izzivov kot predsednica Lekarniške zbornice. Neizbrisna je njena vloga v popularizaciji lekarništva ter pri dvigovanju kvalitete dela in organiziranosti slovenskega lekarništva. Kot asistentka na Katedri za socialno farmacijo prenaša bogato znanje in pripadnost stroki na bodoce farmacevte. mag. Andreja Cufar, mag. farm. spec. Magistra Nataša Faganelli s svojim delom, znanjem in izkušnjami od samega zacetka svoje kariere odlocilno prispeva k razvoju klinicne farmacije v Ortopedski bolnišnici Valdoltra, kjer je uspela uveljaviti klinicnega farmacevta kot enakopravnega clana zdravstvenega tirna. Kot predsednica Sekcije klinicnih farmacevtov SFD si je zadala zelo ambiciozen cilj - organizacijsko, pravno in strokovno umestiti klinicnega farmacevta na klinicni oddelek kot prepoznavnega strokovnjaka za nacrtovanje in vodenje zdravljenja z zdravili Nataša Faganelli, mag. farm. spec Magister Dušan Hus je diplomiral na Farmacevtsko biokemijski fakulteti v Zagrebu. Poklicno pot je pricel v javnem zavodu Celjske lekarne in jo nadaljuje od leta 1993 kot koncesionar zasebne lekarne v Celju. Svojo aktivnost v SFD je pricel kot predsednik Celjske podružnice in jo nadaljuje kot clan Odbora sekcije javnih lekarn in organizacijskega odbora za pripravo športnih iger, na katerih sodelujejo tudi naši kolegi iz Hrvaške. V okviru Lekarniške zbornice Slovenije je vec mandatov clan UO, predsednik komisije za informatiko, clan pogajalske skupine LZS in clan skupine za odnose z drugimi evropskimi lekarniškimi zbornicami. Ves cas si aktivno prizadeva za promocijo in ustrezno družbeno priznavanje farmacevtskega poklica, zato je cenjen v domacem in mednarodnem okolju Dušan Hus, mag. farm. V zacetku 60-tih let, ko lekarništvo pri nas še ni bilo razvito, je magistra Duša Kramer uspela nagovoriti vodstvo obcine za novo lekarno Bežigrad. Aktivna je bila pri novoustanovljenem poslovnem združenju -Skupnosti lekarn, kasneje Združenju lekarn Kot predsednica komisije za tehnologijo je sodelovala pri projektu Storitveni sistem v zdravstvu, kar je tudi omogocilo zbližati lekarniško dejavnost z zavarovalnico in politicnimi institucijami. Tako je zaslužna za oblikovanje in uveljavitev storitvenega sistema in vkljucitev farmacevtov med zdravstvene poklice. Magistri Kramer je bilo priznanje izroceno posthumno. Aktivni prostovoljci iz seniorskih vrst so pomembni vzorniki vsem mlajšim clanom društva. S svojim delom nas spodbujajo in nam posredujejo iskrico optimizma za življenje v tretjem življenjskem obdobju Iz društvenega življenja Nadaljevanje zapušcine predhodnikov je pomemben prispevek k ohranjanju naravne dedišcine v farmacevtski stroki. In prav v tem je magister Jože Kukman dal svoj izjemn prispevek z nadaljevanjem in nadgra jevanjem zapušcine Domace lekarne patra Ašica. Jože Kukman, mag. farm Magistra Matejka Kumperšcak Duh se je uveljavila z razumljivimi strokovnimi nastopi s predavanji na farmacevtskih srecanjih in predstavitvah galenskega dela bodocim študentom FFA. Poucuje na srednj zdravstveni šoli, objavila pa je tudi vec clankov v strokovnih revijah. Pomemben je njen prispevek pri nastajanju Kodeksa galenskih izdelkov. Kot predsednica mariborske podružnice SFD je dvignila raven rednih strokovnih srecanj in tudi dobro obiskanega farmski. Matejka Kumperšcak Duh, mag. farm., spec. Magistra Saša Mauric je prepoznavna po aktivnem delu v komisiji za strokovni nadzor in svetovanje pri Lekarniški zbornic Slovenije in po dolgoletnem delu v komisiji za verifikacijo lekarn pri Ministrstvu za zdravje. V obeh komisijah se je zavzemala za dosledno izvajanje strokovnih nacel v lekarniški praksi. Nastopala je tudi javno in si prizadevala približati lekarniško dejavnost laicni javnosti. Prof. Mrhar bere utemeljitev za podelitev priznanja Saši Mauric, mag. farm., spec. Magister Davorin Poherc je bistveno pripomogel k uveljavitvi sekcije farma cevtskih tehnikov in sekcije farmacevtov javnih lekarn ter k realizaciji njunih pro gramov dela. Njegove organizacijske spo sobnosti so splošno znane že dolga leta skozi organizacijo razlicnih dogodkov SFD; od študentskih simpozijev, organizacije praks študentov v tujini do simpozijev SFD; farmacevtskega plesa ter športnih prireditev. Gre za osebnost, ki je spiritus agens, povezovalec in animator strokovnega in družabnega življenja farmacevtov. Davorin Poherc, mag. farm. Magistra Mojca Prah Klemencic je prepoznavna po osebnem prispevku pri promociji društva in stroke v širši družbeni skupnosti, še posebej pa pri strokovnem povezovanju med zdravniki in farmacevti v okviru organizacije vsakoletnih skupnih strokovnih srecanj. Je tudi pobudnica projekta približevanja stroke uporabnikom z izdajo publikacije ”Krka v skrbi za vaše zdravje”, ki je na voljo vsem obiskovalcem lekarn. Predsednik Društva cestita Mojci Prah Klemencic, mag. farm. Profesor Slavko Pecar je v svoji karieri odlocilno prispeval k uveljavitvi farmacije kot znanstvene discipline v slovenskem in svetovnem prostoru. V sedemdesetih letih je oral ledino pri postavitvi temeljev za bodoco Fakulteto za farmacijo kot vrhunsko raziskovalno in izobraževalno ustanovo ter pri povezovanju takratnega Oddelka za Farmacijo z domacimi in tujimi raziskovalnimi inštituti. Pri postopni preobrazbi prvotnega Odseka za farmacijo na Oddelku za kemijo in kemijsko tehnologijo Fakultete za nara voslovje in tehnologijo v današnjo Fakulteto za farmacijo je odlocilno pripomogel v dveh fazah: prvic pri preobrazbi Odseka za farmacijo v VTOZD Farmacija (Visokošolska temeljna organizacija združenega dela farmacija), ko je v zacetku sedemdesetih letih s predlogi za pravocasno pripravo ustreznega programa omogocil osamo svojitev univerzitetnega študija farmacije in na tem temelju v zacetku devetdesetih let nastanek samostojnega Oddelka za Farmacijo v okviru FNT ter drugic, pri preoblikovanju FNT v štiri fakultete v sredini devetdesetih let je s svojo znanstveno bibliografijo, še zlasti s clanki v mednarodnih revijah in s citiranostjo teh del odlocilno pripomogel k doseganju kriterijev za prehod iz Oddelka za farmacijo v samostojno Fakulteto za farmacijo. farm vestn 2008; 59 159 Iz društvenega življenja Nadalje, vec kot tridesetletno kvalitetno pedagoško in prodorno znanstveno delo vanje profesorja Pecarja na podrocju farma cevtske kemije in biofizike je dalo pecat vsem generacijam slovenskih farmacevtom in naredilo farmacevtsko stroko in znanost prepoznavno v slovenski farmacevtski industriji in lekarništvu. In najpomembnejše, profesor Pecar ima izjemne zasluge pri razvoju in uveljavitvi Fakultete za farmacijo kot vrhunske izo braževalne in znanstvene ustanove v slovenskem in mednarodnem visokošolskem in raziskovalnem prostoru. V obdobju 1995 -1999 je kot dekan Fakultete za farmacijo z vizionarskim pogumom in vztrajnostjo izpeljal gradnjo novega južnega krila fakultete, tako da sta standard in opremljenost prenovljene fakultete presegla povprecni evropski nivo. Ta korak je dal nov zagon kadrovski rasti na FFA; pedagoškemu in znanstveno razi skovalnemu delu ter zacetku novega razvojnega cikla FFA. Za svoje zasluge pri razvoju in vodenju Fakultete za farmacijo je leta 2001 prejel zlato plaketo Univerze v Ljubljani. Profesor Pecar je bil letih 1999 - 2007 podpredsednik programskega sveta uni verzitetnega podiplomskega študija Bio - Prejemnik Minarikovega odliśja prof. dr. Slavko Peśar, se je zahvalil v imenu vseh nagrajencev medicina, leta 2007 pa je postal predsednik programskega sveta preno v ljenega doktor skega študija Biomedicina. Sodelo vanje pri nastajanju prve podiplomske šole na Univerzi v Ljubljani , ki je sedaj prerasla v doktorsko šolo, je pomembno prispevalo k prepoz navnosti FFA na UL, saj je FFA sousta noviteljica prve uspešne, že 9 let delujoce podiplomske šole na UL. V tej vlogi je odlocilno vplival na kakovosten razvoj podiplomskega izobraževanja farmacevtov, ki je predpogoj za nadaljnji razvoj slovenske farmacije. Ker se je profesor Pecar v 35 - ih letih svojega poklicnega delovanja kot visokošolski ucitelj in znanstvenik vedno zavzemal za kvalitetno in na znanstvenih osnovah temeljece izobraževanje in z njim povezano raziskovanje, in pri tem dosegel merljive rezultate, je Izvršilni odbor SFD sklenil, da mu podeli najvišje društveno priznanje. Razpis za podelitev društvenih priznanj v letu 2009 Podružnice in sekcije prijavijo kandidate za podelitev društvenih priznanj skladno z dolocili Pravilnika o podeljevanju društvenih priznanj tajništvu Slovenskega farmacevtskega društva. Predlogi morajo biti pripravljeni na obrazcih, ki so sestavni del Pravilnika in objavljeni na spletni strani www.sfd.si. Predlagatelji pošljejo predloge najkasneje do 31. januarja 2009, tajništvu SFD. 160 farm vestn 2008; 59 Iz društvenega življenja 10. jubilejni FarmaSki 2008 Ljubica Lovišcek V organizacijskem odboru za prireditev smucarskega tekmovanja FarmaSki smo clani Mariborske podružnice Slovenskega farmacevtskega društva ponovno zavihali rokave in pripravili vse potrebno za jubilejno deseto tekmovanje. V letu 2007 nam tekme ni uspelo izpeljati, saj so nas visoke temperature opeharile za tisto malo snega, kot ga je dala zima. Tudi letos ni kazalo najboljše, toda prvi februarski vikend nas je vendarle obdaril z nekaj centimetri debelo snežno odejo na nekaj umetne podlage in Smucarskemu klubu Branik Maribor je uspelo pripraviti na Arehu zimsko idilo in odlicne tekmovalne pogoje. 9. februarja 2008 se nas je zbralo v hotelu Arena ob vznožju Pohorja 48 tekmovalk in 51 tekmovalcev za veleslalom, ki ga je že desetic za FarmaSki postavil Milan Šmon. Tekmovalci smo prišli iz šestih podružnic in ene sekcije Slovenskega farmacevtskega društva: Ljubljanske, Celjske, Dolenjske, Gorenjske, Mariborske, Posavske in Študentske sekcije. Na 1090 m nadmorske višine smo se pogumno pognali s starta in skozi 18 vratic prismucali na cilj 115 metrov nižje. Najhitreje je prispel v cilj Tadej Dolenc s casom 0:36.18, pod 40 sekundami pa je uspelo prismucati v cilj tudi naši kolegici iz organizacijskega odbora Neni Šajber in je tako dosegla najboljši cas med damami. Tekmovalce je spremljalo tudi nekaj navijacev, po napornih spustih se nam je vsem prilegla topla malica. Ko se je dan že spušcal k veceru, smo se ponovno sestali v dolini. Že med vecerjo nas je vse pozdravil tudi predsednik organizacijskega odbora Silvo Koder s Prešernovimi verzi za vse tiste, ki se prejšnji vecer niso udeležili praznovanja v cast dnevu kulture. Po pozdravu predsednika Mariborske podružnice Matjaža Tuša je zbrane navdušila skupina Turbo Angels s poskocnimi takti ob spremljavi harmonike. Pokale in nagrade je ob jubilejnem srecanju podaril kar sam Pohorski car. Tradicija Pohorskih carjev je stara že 49 let. Pohorskega carja izberejo vsako leto na pustovanju smucarski zanesenjaki, car pa je dolžan zagotavljati sneg, spodbujati mora smucanje v Smucarskem klubu Branik, aktivno pomagati pri tekmovanju svetovnega pokala Zlate lisice, spodbujati razvoj turizma na Pohorju in poskrbeti tudi za kakšen sodcek rujnega. Letos je Pohorski car postal dolgoletni direktor hotela Arena Miran Ferk, ki je v vseh letih poskrbel tudi za kulinariko na FarmaSkijih in je na podelitev prišel oblecen v tradicionalno oblacilo carja, ki ga sestavlja do tal segajoc ovcji kožuh s carsko kucmo, prekrito s plošcicami, na katerih so imena bivših carjev. Po podelitvi nagrad smo za vse tekmovalce in goste pripravili film, ki je v sliki in besedi spominjal na dogodke izpred dvanajstih let, ko smo v Mariboru prvic organizirali FarmaSki, pa vse do leta 2006. Še enkrat smo pogledali pohorske strmine, proge na Cojzarici, Habakuku in v ciljni areni, prijateljska druženja in kramljanja, hitre spuste po progi in pocitek ob prijaznih pohorskih kocah, stalne tekmovalce in posebne goste, farm vestn 2008; 59 161 Iz društvenega življenja In komu smo podelili pokale? DAME 1. SKUPINA: MOŘKI 1. SKUPINA: 1. LJUBICA LOVIŘŚEK MPSFD 0:51,02 1. DUŘAN HUS CPSFD 0:41,74 2. SILVA SMOLEJ GPSFD 0:54,91 2. SILVO KODER MPSFD 0:42,33 3. MAKS GORENJAK MPSFD 0:44,35 DAME 2. SKUPINA: 1. NENA ŘAJBER 2. TATJA KOSTNAPFEL 3. BRIGITA PUCELJ MPSFD LPSFD DPSFD 0:39,44 0:43,94 0:45,50 MOŘKI 2.SKUPINA: 1. BRUNO NUSSDORFER 2. TOMI POPOVSKI 3. ROBERT OBERŚ LPSFD LPSFD DPSFD 0:37,74 0:38,34 0:39,03 DAME 3. SKUPINA: 1. MAJA VOVK 2. BARBARA ZADRAVEC 3. M. GORIŚANEC BERNOT LPSFD GPSFD LPSFD 0:39,67 0:39,74 0:42,32 MOŘKI 3.SKUPINA: 1. ALJAĆ SOŚAN 2. IGOR PETROVIŚ 3. MATEJ BERNOT LPSFD DPSFD LPSFD 0:38,15 0:38,45 0:39,08 DAME 4. SKUPINA: MOŘKI 4. SKUPINA: 1. VANJA PRAPOTNIK MPSFD 0:41,10 1. TADEJ DOLENC ŘSSFD 0:36,18 2. VESNA KRALJ DPSFD 0:41,23 2. TIMOTEJ VIVOD MPSFD 0:38,25 3. POLONA BUKOVEC DPSFD 0:42,82 3. MILOŘ REPŘE ŘSSFD 0:39,21 nastopajośe skupine z nepozabnimi Sestrami, ki so jih ustvarili farmacevti Mariborske podrućnice s Silvom na śelu. Skupaj smo prećiveli veliko prijetnih uric in veliko zabave in vsem, ki so FarmaSki zamudili, ćal ne moremo pomagati. Tudi zdravila sponzorjev, ki so nam ves śas stali ob strani in smo se jim tudi ře za poslednjiś zahvalili, v tem primeru niso uśinkovita. Na jubilejnem FarmaSkiju smo se zahvalili tudi Silvu Kodru, ki se je na predsedniřkem mestu organizacijskega odbora obdrćal dolgih deset in nekaj let, predsednik pa tudi vsem ślanom odbora, ki so s svojimi idejami FarmaSkije vedno pripravljali vrhunsko, duhovito in neponovljivo. Poleg tekmovalnega duha je FarmaSki bil vedno priloćnost za sprostitev in drućenje in le ćelimo lahko, da bo tako tudi v bodośe, ko bo smuśarska sreśanja pripravljala Celjska podrućnica, ki je v Mariboru od Mariborske podrućnice prejela simboliśno smuśko, objeto z bahavo farmacevtsko kaśo. Na svidenje! Morda na Rogli? 162 farm vestn 2008; 59 Osebne vesti In memoriam Vladu Vebletu, mag. farm. Na naših obicajnih srecanjih bomo odslej zaman cakali, da bi k omizju farmacevtov upokojencev prisedel tudi naš dragi kolega, Vlado Veble. Smrt je konec aprila 2008 pretrgala nit življenja cloveku, ki je dolga leta hodil svojo strokovno pot skupaj z nami. Rojen je bil 28. 07. 1923 v Mariboru , osnovno šolo je koncal v Celju, štiri leta gimnazije v Sremskih Karlovcih naslednja štiri leta je nadaljeval v Murski Soboti, kjer je tudi maturiral. Potem je bil poslan v kazensko delovno brigado, od koder se je vrnil domov v Mursko Soboto. Novembra meseca 1945. leta se je vpisal na ljubljansko farmacevtsko fakulteto, ki je takrat prvic zacela s predavanji. Po dveh letih je nadaljeval svoj študij v Beogradu. Tam je 2. marca 1950 tudi diplomiral. Že pred diplomo je delal v vec mestnih lekarnah v Mariboru in tako je nadaljeval tudi po diplomi vse do casa, ko je oktobra 1950 dobil poziv za služenje rednega vojaškega roka. Tega je najprej služil v Ljubljani, nato opravil tecaj rezervnih oficirjev v Vojni medicinski akademiji JLA v Beogradu. Od tu je bil poslan v Zagreb, kjer je koncal staž in bi oktobra 1951 demobiliziran. Od takrat je delal kot magister farmacije v Okrajni lekarni v Slovenj Gradcu. 1. avgusta 1952 je bil službeno premešcen v Rogaško Slatino kot upravnik Okrajne lekarne. Prav tu je naslikal eno svojih prvih oljnih slik, Alkimista. Po štirih letih dela v Rogaški Slatini je bil premešcen v Kranj. Od tu naprej je svoje strokovno delo nadaljeval kot predstavnik pri zastopstvu FABEG za firmo Boehringer/Sehn. Nato je prestopil v Galeniko, pa v Krko in nazadnje je bil zastopnik pri firmi Agroprogres za firmo CILAG Chemie vse do svoje upokojitve t.j. trideset let. Po pestri in dolgi strokovni poti pa z upokojitvijo njegov ustvarjalni um ni obmiroval. Kolega Vlado je bil clovek mnogih registrov. V svojem mini ateljeju je dajal duška vsem svojim notranjim potrebam po izražanju samega sebe in to v vseh mogocih tehnikah. Svoja obcutja je prenašal v oljne slike, v slikanje na steklu v posebni tehniki, v plastiki, v lesorezu. Motive je jemal predvsem iz stroke in njene zgodovine, blizu mu je bila narava in tudi etnologija. Vsega skupaj je ustvaril okrog tristo del. Ob priliki farmacevtske letne skupšcine v Portorožu je pred leti imel svojo samostojno razstavo, kjer je bilo razstavljenih približno 20 njegovih slik. Razstavljal pa je tudi v Društvu upokojencev Ljubljana - Poljane. Kolega Vlado Veble je bil clan sekcije seniorjev od njene ustanovitve leta 1987 in vec let tudi clan izvršnega odbora te sekcije. Kot pobudnik mesecnih srecevanj clanov sekcije upokojenih farmacevtov se je teh srecanj tudi redno udeleževal. Prizadeval si je, da bi se le-teh udeleževalo kar najvec clanov sekcije, zlasti iz Ljubljane in bližnje okolice. V svoji sredini ga bomo zelo pogrešali Poleg njegovih toplih cloveških lastnosti nas v lekarni Ormož nanj spominja njegov Alkimist, v kleteh vinskih goric Peter-kletar Ptujski, v lekarni Radgona Radgonski grad, v Mariborskih lekarnah njegovo poslikano lekarniško posodje ... v naših srcih pa neizbrisen spomin na plemenitega, delavnega in ustvarjalnega cloveka, vrednega vsega spoštovanja. Naj mu njegove Breze šepetajo nežno uspavanko miru in zahvalo za vse, kar smo ob njem lepega doživeli Omizje farmacevtov upokojencev farm vestn 2008; 59 163 Navodila avtorjem Strokovne ślanke in druge prispevke objavljamo v slovenskem, po dogovoru z uredniřtvom pa tudi v angleřkem jeziku Vsi poslani rokopisi morajo biti jezikovno in slogovno neoporeśni. Uporabljena terminologija mora biti ustrezna, s posluhom za uveljavljanje ustreznih strokovnih izrazov v slovenskem jeziku Navajanje zařśitenih imen zdravil in drugih izdelkov ali imen proizvajalcev je nedopustno. Dovoljeno je le v poglavju Materiali in metode, izjemoma pa ře v primeru, śe se objavi popoln seznam vseh na trćiřśu dostopnih izdelkov. Strokovni ślanki so recenzirani, kar pomeni, da bodo avtorji oddal najmanj dve verziji besedila: • prvo verzijo, ki jo uredniřtvo pořlje najmanj dvema recenzentoma v strokovno oceno in • konśno verzijo. Med postopkom ugotavljanja primernosti prispevka za objavo v Farmacevtskem vestniku je zagotovljena tajnost. Prva verzija Predstavljajo jo: • trije, na papir natisnjeni izvodi prispevka, na katerih avtorji niso imenovani, slike in preglednice pa so vkljuśene v besedilo, ter • prispevek v elektronski obliki Avtorji strokovnih ślankov priloćijo lastnorośno podpisan spremn dopis z naslednjimi podatki: • naslov prispevka, • imena in priimki avtorjev z vsemi nazivi, • imena in naslovi inřtitucij, v katerih so zaposleni • telefonska řtevila in elektronski naslov kontaktne osebe ter • izjavo, da prispevek ře ni bil objavljen ali poslan v objavo v drugo revijo, ter da se z vsebino strinjajo vsi soavtorji. V primeru ponatisa slik ali drugih elementov v prispevku mora avtor priloćiti dovoljenje zaloćbe, ki ima avtorske pravice. Rokopisi strokovnih ślankov lahko obsegajo najveś 20.000 znakov, vkljuśno s presledki, obseg prispevkov za rubriko zanimivosti iz stroke in iz druřtvenega ćivljenja je lahko najveś 6.000 znakov (vkljuśno s presledki). Prispevki za rubriko osebne vesti ne smejo presegati 3.000 znakov (vkljuśno s presledki). Prispevke o osebnih vesteh objavlja uredniřtvo ob jubilejih, smrti ali za posebne dosećke v aktualnem obdobju. Uredniřtvo si pridrćuje pravico, da po strokovni presoji objavi tudi daljře prispevke. Vsebina naj bo sistematiśno strukturno urejena in razdeljena na poglavja. Izvirni raziskovalni ślanki naj imajo najmanj naslednja poglavja: • Uvod • Materiali in metode, • Rezultati in razprava, • Povzetek v slovenskem in angleřkem jeziku (vsak po najveś 150 besed) in najveś 5 kljuśnih besed v slovenskem in angleřkem jeziku • poglavje Sklep • poglavje Literatura • Kazalo vsebine, takoj za povzetkom in kljuśnimi besedami. Besedilo (Times New Roman 12, razmik vrstice 1,5) naj bo obojestransko poravnano. Slike in preglednice morajo biti opremljene s pripadajośim besedilom v slovenskem in angleřkem jeziku. Vsako trditev je potrebno potrditi z literaturnim virom, zaporedno řtevilko iteraturnega vira pa navesti na koncu trditve, v oklepaju pred piko. Śe je referenc veś, so řtevilke lośene z vejicami in presledki, npr. (1, 3, 8). Na koncu prispevka naj bo navedenih najveś 30 literaturnih virov, po vrstnem redu, kot se pojavljajo v besedilu Primer navajanja literature: 1. Obreza A. Vanadij v ćivem organizmu in farmaciji. Farm Vestn 2003; 54: 713-718. 2. Danesh A, Chen X, Davies MC et al. The discrimination of drug polymorphic forms from single crystals using atomic force microscopy. 3. Pharm Res 2000; 17 (7): 887-890. 4. Doekler E. Cellulose derivatives. In: Peppas NA, Langer RS. Advances in polymer science 107; Biopolymers I. Springer-Verlag, 1993: 200-262. Konśna verzija Avtor stokovnega ślanka prejme po opravljenem recenzijskem postopku najmanj dve strokovni oceni in navodila glede sprejetja v objavo in potrebnih popravkov. Uredniřtvo priśakuje, da bo avtor pripombe recenzentov in uredniřtva upořteval in najkasneje dva tedna po prejetju recenzij poslal popravljen prispevek v elektronski obliki ter eno natisnjeno verzijo besedila na naslov glavne urednice. Slike morajo biti shranjene v ustreznem slikovnem formatu (zaćeleno v jpg bmp), tudi v natisnjeni verziji je potrebno slikovni material priloćiti lośeno od besedila, ořtevilśeno in oznaśeno s pripadajośimi podnapisi. Fotografije morajo biti posnete z visoko lośljivostjo, najmanj 250 do 300 dpi, v enakih velikostih, kot jih avtor ćeli objaviti oz. prilagojene obliki revije. Naslov prispevka (v slovenskem in angleřkem jeziku) in naslovi poglavij in podpoglavij naj bodo napisani krepko, vendar z malimi śrkami (kakor v stavku). V konśni verziji morajo biti pod naslovom prispevka v slovenskem in angleřkem jeziku napisana polna imena vseh avtorjev brez nazivov. mena in priimke vseh avtorjev z nazivi, skupaj z imeni in naslovi ustanov, v katerih so zaposleni, je potrebno navesti lośeno na prvi strani. Elektronska in natisnjena verzija morata biti identiśni Pořiljanje strokovnih prispevkov Prispevke v pisni in elektronski obliki avtorji pořljejo na naslov: dr. Andrijana Tivadar, mag. farm. glavna urednica Farmacevtskega vestnika Tacenska 133 A, 1000 Ljubljana e-pořta: andrijana.tivadar@siol.net Korekture Krtaśne odtise prispevka je avtor dolćan natanśno pregledati in oznaśiti nujne popravke (tiskarske řkrate), s katerimi ne sme posegati v vsebino prispevka. Korekture pořlje avtor v treh delovnih dneh na zgoraj navedi naslov. Prvi avtor prejme tri izvode Farmacevtskega vestnika brezplaśno. Ślanki so objavljeni tudi na spletni strani: www.sfd.si v pdf obliki 164 farm vestn 2008; 59 FARMACEVTIKA - DENTAL Oskrbujemo I lekarne, bolnišnice, zdravstvene domove in veterinarske I ustanove po Sloveniji z zdravili, zdravstvenim materialom in dentalnimi izdelki Imiiiiillll FARMADENT FARMADBNT d.o.n. MiliarIKova ulica 6, Ł000 Maribor Telefon: *3BS Z 450 28 11 Fax; *38S 2 462 Z0 52 E-mail; lnfo@fdrmadant.Bl Is m* Bilobil" dOtaLhtopiul EX^^^^B BJl1 J Bilobil SO mp Irth Lapiub ttlrd 'i IukiivI h Bilobil in Bilobil Forte. Razvili strokovnjaki iz Krke, Za boljši spomin in vecjo moc koncentracije. Redno jemanje Bitobila izboljšuje prekrvitev. Vaši možgani bodo bolje oskrbljeni s kisikom in energijo. Za trajnejši ucinek priporocamo vsaj trimesecno zdravljenje. www.krka.si I^KRKk Naša inovalivnost in znanje za ucinkovite in varne izdelke vrhunske kakovosti. Pred uporabo natancno preberite navodilo! O tveganju in neželenih ucinkih se posvetujte z zdravnikom ali farmacevtom.