Pregledni prispevek/Review article
UPORABA AMNIJSKE MEMBRANE V OČESNI KIRURGIJI
AMNIOTIC MEMBRANE TRANSPLANTATION IN THE OCULAR SURGERY
Kristina Mikek, Vladimir Pfeifer, Brigita Drnovšek-Olup
Očesna klinika Ljubljana, Klinični center, Zaloška 29 a, 1525 Ljubljana
Prispelo 2003-11-29, sprejeto 2004-03-16; ZDRAV VESTN 2004; 73: 419-22
Ključne besede: amnijska membrana; shranjevanje, presaditev, bolezni zunanje površine očesa
Izvleček - Izhodišča. V preglednem članku smo prikazali uporabo in mehanizem delovanja amnijske membrane v očesni kirurgiji, in sicer pripravo in shranjevanje; indikacije, kdaj jo uporabljamo, ter različne vrste kirurških tehnik.
Metode. Pregledali smo klinično in ekperimentalno literaturo ter prikazali indikacije in uporabo amnijske membrane. Predstavili smo tudi naše bolnike.
Rezultati. Amnijska membrana pospešuje epitelizacijo in zavira vnetno reakcijo ter brazgotinjenje tkiva. S tem prispeva k hitrejši reepitelizaciji in celjenju poškodovanega tkiva.
Zaključki. Dobri uspehi zdravljenja s presaditvijo amnijske membrane so se pokazali pri ponavljajočih se epitelnih okvarah roženice z ulkusom ali brez, simptomatski bulozni keratopatiji po operaciji sive mrene, akutnih kemičnih in toplotnih poškodbah sprednje površine očesa ter poškodbi limbalnih zarodnih epitelijskih celic.
Key words: amniotic membrane;preparing; storage; ocular surface diseases
Abstract - Background. To review the use and proposed mechanisms of amniotic membrane transplantation in the ocular surgery: preparing and storage; indication for the use of amniotic membrane and description of different surgical procedures.
Methods. Significant clinical and experimental publications are reviewed and our results are presented.
Results. Amniotic membrane transplantation stimulates epithelialization and has anti-inflammatory and anticicatri-cal effect.
Conclusions. Good results of treatment with amniotic membrane transplantation can be seen in resolving a persistent epithelial defect of the cornea, symptomatic bullous keratopathy after cataract surgery, acute chemical and thermal burn of the ocular surface and limbal stem cell deficiency.
Uvod
Uporabo amnijske membrane skupaj s horionom so prvič v očesni kirurgiji opisali leta 1940, in sicer za kritje vrzeli veznice (1). Nekaj let kasneje so opisani uspešni primeri zdravljenja z amnijsko membrano pri kemičnih poškodbah sprednje površine očesa (2). V začetku 90. let pa se je z izdelanim protokolom odvzema in shranjevanja amnijske membrane, ki sta ga objavila Kim in Tseng (3), razširila njena uporaba za vrsto bolezni sprednje površine očesa, kot so ponavljajoči se epitelni defekti roženice (4), sterilni ulkusi roženice (nevrotrofični kera-titis, sindrom suhega očesa, kronične vnetne bolezni: Stevens-Johnsonov sindrom ali očesno brazgotinski pemfigoid, delno ali celotno pomanjkanje zarodnih epitelijskih celic ob limbu-su roženice) (5, 6), bulozna keratopatija (7, 8), primarni (9, 10) in recidivantni pterigij (11) ter pomanjkanje limbalnih zaro-dnih epitelijskih celic (11-14). Poleg kritja defektov je amnijska membrana uporabna tudi kot substrat za ex vivo gojenje limbalnih zarodnih epitelijskih celic, ki so pomembne pri obnavljanju epitelne plasti roženice (15, 16). Poleg shranjene lahko uporabimo tudi svežo amnijsko membrano (8, 17). Amnijska membrana predstavlja notranjo plast posteljice. Sestavljena je iz treh plasti: enojne epitelne plasti, sledi debelejša bazalna membrana in nato avaskularna stroma (18). Sesta-
va amnijske membrane je podobna bazalni membrani roženice in veznice in vsebuje kolagen tipa IV, V in VII ter fibro-nektin in laminin (19).
Priprava amnijske membrane
Amnijsko membrano odvzamemo v sterilnih pogojih pri načrtovanih porodih s carskim rezom. Pred posegom se pogovorimo s porodnico in anamnestično izključimo možne dejavnike tveganja ter jo prosimo za soglasje. Odvzamemo teste za HIV, hepatitis B in C virus ter sifilis. Posteljico takoj po carskem rezu izpiramo s sterilno pripravljeno raztopino fiziološke raztopine z dodanimi antibiotiki (50 ug/ml penicilina, 50 Hg/ml streptomycina in 100 ug/ml neomycina) in antimikoti-ki (2,5 ug/ml amfotericina B). Notranjo amnijsko plast ločimo od horiona in jo položimo na sterilno pripravljen nitrocelulo-zni papir s porami velikosti 0,45 um in sicer z epitelno plastjo obrnjeno navzgor. Amnijsko membrano skupaj z nitrocelulo-znim papirjem razrežemo v kose velikosti 4x4 cm in jih vsakega posebej shranimo v steklenički z medijem Eagle's in gli-cerolom v razmerju 1:1. Tako pripravljene stekleničke nato shranimo pri -80 °C. Pred tem odvzamemo še material za mikrobiološko testiranje (3, 4).
Sl. 1. Tehnika inlay: kritje sterilnega perforiranega ulkusa roženice z amnijsko membrano (na levi takoj po operaciji, desno po odstranitvi šivov 8 tednov po operaciji). Perforirani ulkus seje zazdravil z brazgotino.
Figure 1. Inlay technique of the amniotic membrane transplantation: sterile perforated ulcus of the cornea which was healed with the scar (on the left one day after the surgery and on the right 8 weeks after the surgery during which the sutures were removed).
Kirurška tehnika
Amnijsko membrano tik pred kirurškim posegom vzamemo iz zmrzovalnika in jo odtajamo na sobni temperaturi. Pred posegom določimo, katera stran amnijske membrane je obrnjena navzgor. Stroma amnijske membrane je pokrita s steklovini podobno plastjo, medtem ko je epitelna plast v primerjavi s prejšnjo bolj gladke površine (20). Glede na klinično sliko se odločimo za vrsto kirurške tehnike (21). Amnijsko membrano uporabimo kot »presadek« (inlay tehnika) (4) ali kot terapevtsko kontaktno lečo (overlay tehnika) (22, 23). Pri t. i. tehniki inlay je velikost amnijske membrane le nekoliko večja od velikosti spremembe, ki jo želimo pokriti. Membrano obrnemo z epitelno stranjo obrnjeno navzgor. Ta ima funkcijo bazalne membrane, preko katere potujejo in se razraščajo epitelne celice. Membrano zašijemo s posameznimi šivi na roženico. Uporabimo šiv 10-0 nylon ali 10-0 vycril (4). Pri globokih ulkusih roženice, ki segajo tudi v stromo roženice, lahko uporabimo več plasti amnijske membrane, s katerimi zapolnimo defekt roženice ne glede na usmerjenost notranjih plasti amnijske membrane. Na koncu vrzel prekrijemo z membrano, obrnjeno z epitelno plastjo navzgor (4, 21).
Pri t. i. tehniki overlay z amnijsko membrano pokrijemo celotno sprednjo površino očesa skupaj z roženico, limbusom in veznico ob limbusu. Tako pritrjena amnijska membrana ima funkcijo biološke terapevtske kontaktne leče. Pri omenjeni tehniki je orientiranost membrane glede na epitel ali stromo manj pomembna. Zašijemo jo na okolno veznico-epi-sklero s posameznimi vicrylnimi šivi 7-0 ali 8-0. Včasih dodamo tudi šiv na srednjo periferijo roženice za boljšo pritrditev membrane. Obe tehniki lahko uprabimo eno za drugo glede na klinično sliko prizadetosti sprednje površine roženice: najprej tehnika inlay ter nato tehnika overlay. Presaditev amnij-ske membrane lahko kombiniramo tudi s presaditvijo limbal-nih zarodnih epitelijskih celic (21-23). Uporabimo jo lahko tudi na mestih, kjer potrebujemo manjkajoče tkivo, kot je to na primer po tumorjih, simblefaronu ali drugih primerih vrzeli veznice.
Operacijo zaključimo z vstavitvijo mehke terapevtske kontaktne leče. Po operaciji bolnik prejema lokalno antibiotično in kortikosteroidno zdravljenje najmanj 4 tedne. Šive odstranimo glede na potek celjenja oziroma reepitelizacijo površine roženice. V nekaj tednih do mesecih se amnijska membrana resorbira. Včasih so potrebni tudi večkratni kirurški posegi (4, 21-23).
Mehanizem delovanja
Študije potrjujejo, da amnijska membrana vsebuje številne citokine, rastne dejavnike, encime in recep-torje, ki aktivno sodelujejo pri procesih zdravljenja. Ni pa še natančno poznan mehanizem njihovega delovanja. Amnijska membrana ima dva poglavitna učinka: 1. pospešuje epitelizacijo in 2. zavira vnetno reakcijo in brazgotinjenje tkiva.
Pospeševanje epitelizacije
Amnijska membrana služi kot substrat oziroma bazalna membrana, preko katere se v primerih epitel-nih sprememb razraščajo in potujejo epitelne celice (24). Amnijska membrana deluje pri adheziji bazalne plasti epitelijskih celic (25). Pomembno vlogo ima tudi v procesu celične diferenciacije (26) in preprečuje celično smrt ali apoptozo (27). Pospeševanje epi-telizacije poteka tudi zaradi mehanske vloge postavitve amnijske membrane: pri tehniki kritja površine roženice (overlay) membrana deluje kot kontaktna leča, ki preprečuje odplavljanje na novo nastalih epitelnih celic, ki bi se sicer odstranile s premikom očesnih vek (22, 23). Prav tako lahko razložimo protivnetno delovanje am-nijske membrane: membrana deluje kot fiziološka pregrada, ki ščiti stromo roženice pred vnetnimi celicami in proteini, ki se nahajajo v solznem filmu (21).
Preprečevanje vnetja in brazgotinjenja tkiva
Amnijska membrana s svojim protivnetnim delovanjem zmanjša razraščanje žilja (neovaskularizacijo) in brazgotinje-nje tkiva (fibrozo). Študije na roženicah živali, povzročene z alkalno poškodbo (28) in odstranitvijo dela tkiva z laserjem excimer (29, 30), so pokazale, da amnijska membrana zmanjša vnetno infiltracijo in število vnetnih celic v stromi roženi-ce. Potrdili so tudi, da amnijska membrana zavre mešano lim-focitno reakcijo. In vitro je tako enakovredna reakciji pozne preobčutljivosti (31).
Veliko raziskav je primerjalo učinek amnijske membrane v kulturi gojenih epitelijskih celic roženice, limbalnih zarodnih epitelijskih celic, fibroblastov in keratocitov. Ugotovili so, da je izločanje mediatorjev vnetja (citokinov), kot sta na primer interlevkin-1a in -1P znižana v kulturi na amnijski membrani v primerjavi z gojenjem celic brez amnijske membrane (32). Pri živalskih modelih roženic, okuženih z virusom herpes simplex tip 1, so ravno tako primerjali količino mediatorjev vnetja (citokinov) in sicer pri roženicah, zdravljenih z amnijsko membrano, in roženicah, kjer je bila narejena tarzorafija. Potrdili so nižje vrednosti citokinov v primerih zdravljenja z amnijsko membrano (33). Amnijska membrana zavre pretvorbo fibroblastov v miofibroblaste in ima s tem tudi antifibro-tični učinek (34).
Pri ulkusih roženice polimorfonuklearni levkociti, poškodovane epitelijske celice in keratociti izločajo čezmerne vrednosti proteinaz, ki še dodatno pomagajo pri uničenju tkiva strome roženice. Amnijska membrana vsebuje zaviralce proteinaz in ima tako zaviralni učinek na aktivnost proteinaz. Izsledke so dokazali v modelu in vitro (35) kakor tudi pri živalskem modelu kemične poškodbe, povzročene z bazo (28).
Zapleti po presaditvi amnijske membrane
Opisali so tri primere vnetja z vnetno eksudacijo (hipopion) v sprednjem prekatu po večkratni presaditvi amnijske membrane, verjetno zaradi lokalne vnetne imunske reakcije (36, 37). Celice amnijske membrane na svoji površini nimajo hi-
stokompatibilnih (HLA) antigenov A, B ali DR skupine. Zato je zavmitvena reakcija malo verjetna (38). V enem primeru je opisan bakterijski ulkus roženice (7) in psevdopterigij (7) ter vnetni granulom po operaciji pterigija (39). V pred kratkim objavljeni raziskavi so opisovali primere nalaganja kalcija v roženici (kalcifikacija) po operaciji presaditve amnijske membrane, ki so bili povezani bodisi z nalaganjem kalcija tudi v drugem očesu ali pa z uporabo lokalnih kapljic po operaciji, ki so vsebovale fosfat (40).
Uporaba amnijske membrane v Sloveniji
S pridobitvijo soglasja Komisije za medicinsko etična vprašanja smo v letu 2000 pričeli uporabljati amnijske membrane na Očesni kliniki v Ljubljani. Amnijsko membrano smo uporabili pri naslednjih boleznih (Razpr. 1).
Razpr. 1. V razpredelnici so prikazane indikacije in število primerov, ki smo jih opravili na Očesni kliniki v Ljubljani s kirurško tehniko presaditve amnijske membrane.
Table 1. Amniotic membrane transplantation - indications and number of cases which were done at the University Eye Clinic Ljubljana.
Diagnoza pred operacijo Diagnosis before surgery
Število primerov Number of cases (n - 50)
Stanje po enukleaciji Status after enucleation
Simblefaron Symblepharon
Kemična poškodba očesa Chemical injury of the eye
Toplotna poškodba očesa Thermal injury of the eye
Recidivantni pterigij Recurrent pterygium
Ulkus roženice s perforacijo Perforated ulkus of the cornea
Bulozna keratopatija Bullous keratopathy
Descemetokela Descemetocela
Recidivantni epiteliom roženice Recrrent epithelioma of the cornea
Sindrom suhega očesa Sicca syndrome of the eye
3
5
4 l
17 l0
6 1 2 1
Pri nekaterih indikacijah so se sprva pokazali zelo obetavni rezultati, še posebno pri operaciji recidivantnega pterigija, kasneje pa smo opažali velik odstotek ponovitev (28%). Kot učinkovito se je pokazalo zdravljenje z amnijsko membrano pri nadomestitvi manjkajočega tkiva pri operaciji simblefarona in poglobitvi forniksov po operaciji enukleacije očesa. Pomembno je, da amnijska membrana ne zagotavlja dokončne nadomestitve manjkajočega tkiva veznice, ker se le-ta absorbira in po nekaj tednih izgine. Za to je potrebno, da je ob presajeni amnij-ski membrani prisotno zdravo tkivo veznice. Dobre rezultate smo opazili pri kritju perforiranih sterilnih ulkusov roženice pri bolnikih z revmatoidnim artritisom, Sjogrenovim sindromom in Stevens-Johnsonovim sindromom. Olajšanje s presaditvijo amnijske membrane je pri bolnikih s simptomatsko bu-lozno keratopatijo po operaciji sive mrene. Neuspešno je bilo zdravljenje pri bolnici z bulozno keratopatijo po glavkomski operaciji in stanju po prebolelem endoftalmitisu. Zapleti po operaciji presaditve amnijske membrane pri naših bolnikih so bili naslednji: delno potrganje amnijske mem-
Sl. 2. Kritje površine roženice pri bolnici s simptomatsko bu-lozno keratopatijo roženice po operaciji sive mrene.
Figure 2. Amniotic membrane transplantation in the patient with symptomatic bullous keratopathy after the cataract surgery.
brane in popustitev šivov. Zato je bila pri dveh bolnikih potrebna dodatna namestitev šivov (v primerih bolnikov po kemični poškodbi), v enem primeru pa dodatna presaditev amnijske membrane čez že prisotno amnijsko membrano zaradi obsežne spremembe roženice po recidivantnem pte-rigiju.
Zaključki
Glavne prednosti uporabe amnijske membrane so naslednje:
1.	amnijska membrana je avaskularna, po presaditvi na prizadeto področje zavre proliferacijo in razraščanje krvnih žil;
2.	deluje protivnetno (antivirusno in antibakterijsko) in zavre brazgotinjenje tkiva;
3.	ne izzove zavrnitvene reakcije;
4.	pospešuje apoptozo ali programirano celično smrt vnetnih celic;
5.	s presaditvijo na prizadeto mesto se tvori nova membrana, ki se prehranjuje s preprosto difuzijo z mesta tkiva prejemnika in ima dobro raztezno trdnost;
6.	omogoča potovanje okolnih celic preko njene površine: epitelijskih celic roženice, ustne sluznice in tudi endotelij-skih celic.
Literatura
1.	De Rotth A. Plastic repair of conjunctival defects with fetal membranes. Arch Ophthalmol 1940; 23: 522-5.
2.	Sorsby A, Symons HM. Amniotic membrane grafts in caustic burns of the eye (burns of the second degree). Br J Ophthalmol 1964; 30: 337-45.
3.	Kim JC, Tseng SCG. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea 1995; 14: 473-84.
4.	Lee SH, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. Am J Ophthalmol 1997; 123: 303-12.
5.	Chen HJ, Piers RTF, Tseng SCG. Amniotic membrane transplantation for severe neurotrophic ulcers. Br J Ophthalmol 2000; 84: 826-33.
6.	Kruse FE, Rohrschneider K, Volcker HE. Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers. Ophthalmology 1999; 106: 1504-11.
7.	Pires RTF, Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K et al. Amniotic membrane transplantation for symptomatic bullous keratopathy. Arch Ophthalmol 1999; 117: 1291-7
8.	Mejia L, Santamaria JP, Acosta C. Symptomatic management of postoperative bullous keratopathy with nonpreserved human amniotic membrane. Cornea 2002; 21: 342-5.
9.	Prabhasawat P, Barton K, Burkett G et al. Comparison of conjunctival auto-grafts, amniotic membrane grafts and primary closure for pterygium excision. Ophthalmology 1997; 104: 974-85.
10. Ma DHK, See LC, Liau SB et al. Amniotic membrane graft for primary ptery-gium: comparison with conjunctival autograft and topical mitomycin C tre-atement. Br J Ophthalmol 2000; 84: 973-8.
11.	Schimazaki J, Shinozaki N, Tsubota K. Transplantation of amniotic membrane and limbal autograft in patients with recurrent pterygium associated with symblepharon. Br J Ophthalmol 1998; 82: 235-40.
12.	Tsubota K, Satake Y, Ohyama M et al. Surgical reconstruction of the ocular surface in advanced ocular cicatrical pemphigoid and Stevens-Johnson syndrome. Am J Ophthalmol 1996; 122: 38-52.
13.	Shimazaki J, Yang HY, Tsubota K. Amniotic mebrane transplantation for ocular surface reconstruction in patients with chemical and thermal burns. Ophthalmology 1997; 104: 2068-76.
14.	Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K et al. Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Arch Ophthalmol 1998; 116: 431-41.
15.	Koizumi N, Inatomi T, Quantock AJ et al. Amniotic membrane as a substrate for cultivating limbal corneal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits. Cornea 2000; 19: 65-71.
16.	Schwab I. Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease. Cornea 2000; 19: 421-6.
17.	Panda A. Amniotic membrane in ophthalmology (fresh v preserved tissue). Br J Ophthalmol 1999; 83: 748-52.
18.	Van Herendael BJ, Oberti C, Brosens I. Microanatomy of the human amni-otic membranes. A light microscopic, transmission, and scanning electron microscopic study. Am J Obstet Gynecol 1978; 131: 872-80.
19.	Fukuda K, Chikama T, Nakamura M, Nishida T. Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea and conjunctiva. Cornea 1999; 18: 73-9.
20.	Dua HS, Azuara-Blanco A. Amniotic membrane transplantation. Br J Oph-thalmol 1999; 83: 748-52.
21.	Sippel KC, Ma JJK, Foster CS. Amniotic membrane surgery. Curr Opin Ophthalmol 2001; 12: 269-81.
22.	Letko E, Stechschulte SU, Kenyon KR et al. Amniotic membrane inlay and overlay grafting for corneal epithelial defects and stromal ulcers. Arch Opht-halmol 2001; 119: 659-63.
23.	Azuara-Blanco A, Pillai CT, Dua HS. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Br J Ophthalmol 1999; 83: 399-402.
24.	Terranova VP, Lyall RM. Chemotaxis of human gingival epithelial cells to laminin. A mechanism for epithelial cell apical migration. J Periodontol 1986; 57: 311-7.
25.	Khodadoust AA, Silverstein AM, Kenyon DR et al. Adhesion of regenerating corneal epithelium. The role of basement membrane. Am J Ophthalmol 1968; 65: 339-48.
26.	Meller D, Tseng SC. Conjunctival epithelial cell diferentiation on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 878-86.
27.	Boudreau N, Sympson CJ, Werb Z et al. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science 1995; 267: 891-3.
28.	Kim JS, Kim JC, Na BK et al. Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn. Exp Eye Res 2000; 70: 329-37.
29.	Park WC, Tseng SC. Modulation of acute inflamation and keratocyte death by suturing, blood and amniotic membrane in PRK. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 2906-14.
30.	Woo HM, Kim MS, Kweon OK et al. Effect of amniotic membrane on epithelial wound healing and stromal remodelling after excimer laser keratec-tomy in rabbit cornea. Br J Ophthalmol 2001; 85: 345-9.
31.	Ueta M, Sano Y, Sotozono C. Immunosuppressive properties of human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: S473-S473.
32.	Solomon A, Rosenblatt M, Monroy D et al. Suppression of interleukin 1 alpha and interleukin 1beta in human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix. Br J Ophthalmol 2001; 85: 444-9.
33.	Heiligenhaus A, Bauer D, Wasmuth S et al. Influence of amniotic membrane transplantation on neutrophils in the HSV infected cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: S45-S45.
34.	Choi TH, Tseng SC. In vivo and in vitro demonstration of epithelial cell-induced myofibroblast differentiation of keratocytes and an inhibitory effect by amniotic membrane. Cornea 2001; 20: 197-204.
35.	Na BK, Hwang JH, Kim JC. Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent of recalcitrant keratitis. Trophoblast Res 1999; 13: 459-66.
36.	Messmer EM. Hypopyon after amniotic membrane transplantation. Ophthalmology 2001; 108: 1714-5.
37.	Gabler B, Lohmann CP. Hypopyon after repeated transplantation of human amniotic membrane onto the ocular surface. Ophthalmology 2000; 107: 1344-6.
38.	Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI et al. Imunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet 1981; 2: 1003-5.
39.	Solomon A, Pires RTF, Tseng SCG. Amniotic membrane transplantation after extensive removal of primary and recurrent pterygia. Ophthalmology 2001; 108: 449-60.
40.	Anderson SB, Ferreira de Souza R, Hofmann-Rummelt C, Seitz B. Corneal calcification after amniotic membrane transplantation. Br J Ophthalmol 2003; 87: 587-91.