26 Povzetek Tumorske vakcine predstavljajo obliko biolo{kega (imunskega) zdravljenja, s katerim sku{amo spro`iti u~inkovit sistemski imunski odziv proti tumorskim antigenom, s tem pa tudi proti tumorskim celicam v celoti. U~inek tumorskih vakcin je tako odvisen od: 1) prisotnosti/odsotnosti prepoznavnih tumorskih antigenov, 2) prisotnosti kostimulatornih molekul, ki sodelujejo pri aktivaciji efektorskih celic, 3) u~inkovitosti predstavljanja antigenov in kostimulatornih molekul efektorskim celicam, 4) razvoja specifi~ne protitumorske imunosti in 5) razvoja procesov, s katerimi se tumorske celice izognejo imunskemu nadzoru. Glede na osnovne metode oblikovanja tumorskih vakcin in glede na njihovo pri~akovano u~inkovitost jih razdelimo v dve skupini: 1) vakcine prve generacije, ki temeljijo na na~elih klasi~ne imunologije – t. i. klasi~ne tumorske vakcine, in 2) vakcine druge generacije, ki temeljijo na na~elih molekularne imunologije – gensko spremenjene in rekombinantne tumorske vakcine. V tem ~lanku `elim predstaviti kratek pregled glavnih pristopov k oblikovanju tumorskih vakcin in raziskave s tega podro~ja, ki potekajo na Onkolo{kem in{titutu. Tumorske vakcine Zdravljenje rakavih bolezni je {e vedno premalo u~inkovito. Ve~ina sedanjih konvencionalnih sistemskih zdravljenj temelji na uporabi kombinacij citostatikov, ki niso specifi~ni za tumorske celice, predvsem pa ne dovolj u~inkoviti, da bi jih v celoti uni~ili. Njihovo u~inkovitost pogosto dodatno zmanj{uje razvoj odpornosti tumorskih celic proti razli~nim citostatikom, kar privede do tega, da bolniki potrebujejo druga~no zdravljenje. Velik napredek v imunologiji, molekularni in tumorski biologiji pa po drugi plati omogo~a razvoj bolj specifi~nih oblik zdravljenja. Med temi biolo{kimi oblikami zdravljenja imajo ravno tumorske vakcine prav posebno mesto. Predstavljajo namre~ popolnoma novo obliko sistemskega zdravljenja. V nasprotju s konvencionalnimi zdravljenji, ki delujejo neposredno na tumorske celice, so tumorske vakcine usmerjene predvsem v spro`enje protitumorskega imunskega odziva obolelega organizma. Glavni namen zdravljenja s tumorskimi vakcinami je tako vzpostavitev aktivnega sistemskega imunskega odgovora proti antigenom, ki jih izra`ajo tumorske celice. Glavni merili, ki ju morajo tumorske vakcine izpolniti, preden postanejo u~inkovita protitumorska zdravila, pa sta profilakti~na in terapevtska u~inkovitost. To pomeni, da morajo tumorske vakcine spro`iti tak{en sistemski imunski odgovor, ki bo povzro~il zavra~anje tumorskih celic in hkrati omogo~il dolgotrajen imunski spomin, s katerim bo vakcinirani gostitelj za{~iten pred ponovitvijo rakaste bolezni. Glavni omejitvi pri oblikovanju tak{nih vakcin sta te`avna identifikacija ustreznega tumorskega antigena in slaba imunogenost teh antigenov. Obe omejitvi izhajata iz dejstva, da tumorske celice nastanejo iz normalnih celic in da so antigeni, ki jih izra`ajo, prisotni tudi v normalnih tkivih. To pomeni, da jih gostiteljev imunski sistem zaznava kot »lastne« antigene. Tako postane razumljivo, da so raziskovanja s podro~ja oblikovanja tumorskih vakcin usmerjena predvsem v modulacijo (spreminjanje) prepoznavanja antigenov in v modulacijo stanja gostiteljevega imunskega sistema. Vakcine prve generacije – klasi~ne tumorske vakcine – temeljijo na predstavitvi kar najve~jega mo`nega {tevila antigenskih determinant, ki se nahajajo na tumorskih celicah. Zato so sestavni deli vakcin obsevane tumorske celice v celoti ali njihovi lizati. V {estdesetih letih dvajsetega stoletja so raziskovalci oku`ili tumorske celice z virusi in uporabili njihove lizate kot tumorske vakcine ravno z namenom, da bi napravili predstavljene antigene ~im bolj prepoznavne (imunogene) (1). Naslednji pristop k pripravi klasi~nih tumorskih vakcin pa predstavlja kombinacija obsevanih tumorskih celic in nespecifi~nega imunomodulatorja, kot so BCG (Bacillus Calmette-Guerin), MDP (muramil dipeptid), CP (Corynebacterium parvum), KLH (»keyhole limpet hemocyanin«) ali Detox (endotoksin iz Salmonelle minesota in citoskelet iz Mycobacterium phlei). V sedanjem ~asu se v klini~ni praksi med klasi~nimi tumorskimi vakcinami uporabljajo predvsem vakcine za maligni melanom. Najbolj poznani sta CancerVax in Melacin (2). Na{a raziskovalna skupina na Onkolo{kem in{titutu je pripravila klasi~no tumorsko vakcino iz obsevanih singenskih celic malignega melanoma in MVE-2 (nespecifi~ni imunomodulator). S predklini~nimi raziskavami smo potrdili njeno izjemno u~inkovitost (3, 4). Z eno samo vakcinacijo 7 dni pred vbrizganjem tumorskih celic smo ve~ kot 45 % cepljenih `ivali za{~itili pred razvojem tumorja (mo~no tumorogenega malignega melanoma). S ponovljeno vakcinacijo smo dele` `ivali, ki so bile za{~itene pred razvojem tumorja, pove~ali na 90 %. Potrdili smo tudi razvoj dolgotrajne za{~itne imunosti pri 60 % `ivali, ki so bile cepljene dvakrat, in pri 20 % `ivali, ki so bile cepljene enkrat (diagrama 1 in 2). Izkazalo se je, da je na{a vakcina specifi~na za tip tumorskih celic in da je glavni na~in, prek katerega vakcina spro`i protitumorsko za{~ito, aktivacija peritonealnih makrofagov. Hkrati z ONKOLOGIJA / novosti  -# #. ,           -           27 aktivacijo makrofagov smo opazili tudi pove~anje dele`a peritonealnih T-celic (CD3+, CD4+). Tumorske vakcine druge generacije vklju~ujejo najnovej{a odkritja molekularne biologije in imunologije; njihova priprava temelji na regulaciji bolj specifi~nih procesov v aktivaciji imunskega sistema. To skupino vakcin lahko razdelimo na rekombinantne in gensko spremenjene tumorske vakcine (tabela 1). ONKOLOGIJA / novosti Diagram 1. Pre`ivetje `ivali z i. p. tumorji B-16 po enkratnem ali dvakratnem cepljenju s tumorsko vakcino, ki je vsebovala 1 x 106 obsevanih tumorskih celic B-16 in 25 mg/kg MVE-2 (nespecifi~ni imunostimulator). Diagram 2. Ocena dolgotrajne za{~itne imunosti pri mi{kah, ki so predhodno prejele vakcino. Pre`ivelim mi{im iz skupin, ki so dobile tumorsko vakcino enkrat (7 dni pred prvo i. p. aplikacijo 5 x 105 `ivih tumorskih celic B-16) – vakcina 1 – in pre`ivelim mi{im iz skupin, ki so dobile enako vakcino dvakrat (7 dni pred prvo aplikacijo tumorskih celic in 7 dni po njej) – vakcina 2 – smo znova vbrizgali i. p. 5 x 105 `ivih tumorskih celic B-16 101 dan po prvem vbrizganju tumorskih celic. Tabela 1. Osnovna razdelitev tumorskih vakcin glede na na~in priprave. KLASI^NE TUMORSKE VAKCINE 1. obsevane avtologne ali alogene tumorske celice 2. lizati tumorskih celic z virusnimi antigeni 3. obsevane tumorske celice z nespecifi~nimi imunomodulatorji (BCG, MDP, CP)* REKOMBINANTNE IN GENSKO SPREMENJENE TUMORSKE VAKCINE 1. rekombinantne vakcine a. kratki peptidi, ki se izra`ajo prek MHC-razreda I in II b. oligopeptidi c. fuzijski proteini d. imunoglobulini 2. vakcine, pripravljene na podlagi gensko spremenjenih tumorskih celic a. vnos genov za razli~ne citokine b. vnos genov za peptide, ki se izra`ajo prek MHC-razreda I c. vnos genov, ki kodirajo kostimulatorne molekule 3. vakcine, pripravljene na podlagi gensko spremenjenih netumorskih celic a. aktivirane dendritske celice b. gensko spremenjene dendritske celice c. priprava hibridomov iz dendritskih in tumorskih celic *BCG – Bacillus Calmette-Guerin; MDP – muramil dipeptid; CP – Corynebacterium parvum; Skupina rekombinantnih tumorskih vakcin vklju~uje peptide, fuzijske proteine in imunoglobuline. Imunski odgovor lahko spro`imo z dvema glavnima skupinama peptidov. Peptidi z 8 do 11 aminokislinskimi ostanki, ki so predstavljeni prek MHC-razreda I na antigen predstavitvenih celicah, spro`ijo prek vezave s celi~nimi receptorji T-limfocitov aktivacijo CTL (citotoksi~ni T- limfociti CD8+). Druga skupina peptidov z 11 do 15 aminokislinskimi ostanki so predstavljeni prek MHC-razreda II na predstavitvenih celicah. Ti peptidi so odgovorni za aktivacijo limfocitov CD4+. Tudi oligopeptide, ki vklju~ujejo oba epitopa (epitop MHC-razreda I in epitop MHC-razreda II) lahko uporabljamo kot tumorske vakcine. Ve~ino uporabljanih oligopeptidov kot tumorske vakcine uporabljajo pri bolnikih z malignim melanomom (MAGE-1, MAGE-3, MART-1, gp100, tirozinaza, gp75), kolorektalnim karcinomom (CEA) in karcinomom dojke (MUC-1). Druga oblika rekombinantnih vakcin so fuzijski proteini s citokini. Ena od obetavnih vakcin tega tipa so monoklonalna protitelesa, vezana z molekulo IL-2 (6). Vakcine, ki temeljijo na uporabi samih imunoglobulinov, so razmeroma pogosto uporabljene v klini~ni praksi. To so predvsem protitelesa proti specifi~nim antigenskim determinantam na tumorskih celicah. Ta skupina vklju~uje 28 protitelesa proti Her-2/Neu pri karcinomu dojke (Herceptin), protitelesa proti CD20 pri B-celi~nih limfomih (MabThera) in protitelesa proti CD52 pri KLL (MabCampath) (6, 7). Na~eloma poteka njihovo delovanje na dva na~ina – tako, da prepre~ijo vezavo rastnih faktorjev na tumorsko celico ali da spro`ijo liti~ne procese v tumorskih celicah (neposredno citotoksi~no delovanje, vezava komplementa, opsonizacija in aktivacija citotoksi~nih limfocitov). Gensko spremenjene tumorske vakcine naprej razdelimo v skladu z vrsto celic, ki jih uporabimo za njihovo pripravo, na: a) vakcine, pripravljene z gensko spremenjenimi tumorskimi celicami; in b) vakcine, pripravljene z gensko spremenjenimi netumorskimi celicami (tabela 1). Tumorske vakcine, pripravljene z gensko spremenjenimi tumorskimi celicami, vklju~ujejo naslednje pristope: i) transfekcija tumorskih celic z geni, ki kodirajo razli~ne citokine ali rastne faktorje; ii) transfekcija tumorskih celic z geni za specifi~ne antigenske determinante, ki se izra`ajo prek MHC I/II; in iii) transfekcija tumorskih celic z geni, ki kodirajo kostimulatorne molekule, zna~ilne za antigen predstavitvene celice. Med geni, ki kodirajo razli~ne citokine ali rastne faktorje, ve~ina raziskovalcev najpogosteje uporablja gene za IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF in G- CSF. U~inek vakcin je odvisen od vrste citokina, ki ga tvorijo celice, od koli~ine nastalega citokina in od vrste tumorskih celic, ki sestavljajo vakcino. Razli~ni raziskovalci so potrdili, da tumorske vakcine, ki vklju~ujejo preneseni gen za IL-2, u~inkovito aktivirajo T-limfocite, medtem ko tiste, ki vklju~ujejo preneseni gen za TNF-α, spodbujajo aktivacijo makrofagov (posredno torej CTL) in tudi neposredno citotoksi~no delovanje na tumorske celice (prek TNF- receptorjev). Za zdaj so se kot naju~inkovitej{e vakcine tega tipa izkazale tiste, ki vklju~ujejo GM-CSF (8). Na{a raziskovalna skupina je uspe{no oblikovala kar nekaj vakcin te vrste. Pripravili smo ekspresijske kasete s plazmidnimi vektorji in geni, ki kodirajo naslednje citokine: hTNF-α, IL-2, IFN-γ, G-CSF in GM-CSF. Pravilno vstavitev genov v plazmidne vektorje smo potrdili z encimsko restrikcijsko analizo, s PCR-analizo in z neposrednim DNA- sekveniranjem. Z biolo{kimi testi in testi ELISA pa smo nadalje dokazali sposobnost tranzientne ekspresije (tvorba in izlo~anje citokinov) pripravljenih ekspresijskih kaset v razli~nih tipih humanih celic (9–11). Priprava vakcin s prenosom genov za strukture, ki se izra`ajo prek MHC-razreda I/II v tumorske celice, je precej identi~na uporabi vakcin, ki vsebujejo kratke peptide. Razlika je v tem, da so antigenske strukture v tem primeru nastale znotraj samih tumorskih celic in so predstavljene skupaj z drugimi antigeni, ki so prisotni na tumorskih celicah. Tako lahko u~inkoviteje spro`imo specifi~no aktivacijo CTL (CD8+) in T-celic pomagalk (CD4+). Tako kot pri kratkih peptidih tudi v ta namen najpogosteje uporabljamo gene, ki kodirajo MAGE, MART, MUC-1 in CEA. Transfekcija tumorskih celic z geni za kostimulatorne molekule, kot sta B7.1 (CD80) in B7.2 (CD86) ligand, omogo~a neposredno aktivacijo CTL, s ~imer obidemo vlogo antigen predstavitvenih celic. Raziskave, pri katerih so vnesli gen za B7 v tumorske celice, so potrdile preobrazbo neimunogenih tumorskih celic v mo~no imunogene tumorske celice, kar je privedlo do zavrnitve tumorja in vivo. (12). Podoben je bil tudi u~inek transfekcije tumorskih celic z geni za druge kostimulatorne molekule, kot sta ICAM-1 in LFA-3. Priprava tumorskih vakcin z gensko spremenjenimi netumorskimi celicami temelji predvsem na uporabi dendritskih celic, ki jih uvr{~amo med najpomembnej{e antigen predstavitvene celice. Tak{na priprava tumorskih vakcin predstavlja poskus ~imu~inkovitej{e aktivacije efektorskih celic prek manipulacije s »super oboro`enimi« dendritskimi celicami. Obstajajo trije temeljni pristopi k pripravi tumorskih vakcin na podlagi dendritskih celic: i) in vitro aktivacija dendritskih celic s specifi~nimi antigenskimi strukturami, kot so OVA peptid, gp 100 in MelanA/MART; ii) transfekcija dendritskih celic z geni za razli~ne proteine, kot so MART-1, MUC-1, β-galaktozidaza, PSA; in iii) priprava hibridomov iz dendritskih in tumorskih celic (13). V nadaljevanju na{ega dela s tumorskimi vakcinami sedaj poteka optimizacija metod za izolacijo dendritskih celic in pripravo hibridomov. Ker dendritske celice predstavljajo heterogeno skupino usmerjenih (»profesionalnih«) antigen predstavitvenih celic, ki dozorevajo iz prekurzorskih mononuklearnih celic (fenotip CD14, CD11c, CD13), ve~ino raziskovalnega dela usmerjamo v monocite, izolirane iz »buffy coata«. V prvih poskusih posku{amo dolo~iti razmere za uspe{no dozorevanje dendritskih celic in za elektrofuzijo s tumorskimi celicami (diagram 3 in slika 1). ONKOLOGIJA / novosti Diagram 3. Elektrofuzija monocitov (A) ali celic malignega melanoma (B-16F1) (B). Dolo~anje dele`a `ivih celic (?) in dele`a fuziranih celic (■) v pufrih za elektrofuzijo z razli~no osmolarnosti. 29 Sklep Raziskave tumorskih vakcin so nakopi~ile vznemirljive predklini~ne podatke, ki potrjujejo, da lahko z razli~nimi vrstami vakcin spro`imo specifi~en imunski odgovor proti tumorskim celicam. @al pa ve~ina preliminarnih klini~nih rezultatov prina{a razo~aranje. Mo`nih razlag za neuspehe v klini~nih raziskavah je kar nekaj: (1) bolnikov imunski sistem je lahko postal toleranten ali neodziven na tumorske antigene; (2) prisotna so `e predhodno nastala nevtralizirajo~a protitelesa; (3) najprimernej{i antigen se ne izra`a na tumorskih celicah; (4) tumorske vakcine preizku{amo na napa~no izbrani skupini bolnikov. ^e upo{tevamo navedene mo`nosti, potem sploh ni presenetljivo, da so klasi~ne tumorske vakcine pogosto enako ali celo u~inkovitej{e kot novej{e, ravno zaradi pristopov, ki jih uporabimo pri njihovi pripravi. Moderne vakcine so namre~ velikokrat v svoji aktivnosti preve~ specifi~ne, s ~imer omogo~ijo, da se tumorske celice izognejo imunski prepoznavi. Prihodnost tumorskih vakcin zato verjetno predstavlja priprava vakcin, ki bodo vsebovale razli~ne temeljne strukture, potrebne za aktivacijo imunskega sistema (npr. hibridomi), ali pa kombinirana uporaba `e poznanih vakcin. Viri 1. Schirrmacher V, Hoegan P, Schlag P, Liebrich W, et al. Active specific immunotherapy with autologous tumor cell vaccines modified by Newcastle disease virus: Experimental and clinical studies. In: Schirrmacher V, Schwartz-Abiez R, eds. Cancer Metastasis. Berlin: Springer-Verlag, 1989: 157–70. 2. Chan AD, Morton DL. Active immunotherapy with allogeneic tumor cell vaccines: present status. Semin Oncol 1998; 25: 611–622. 3. Novakovi} S, Ihan A, Wraber B, Jezer{ek B. An effective tumor vaccine against malignant melanoma: irradiated autologous tumor cells admixed with MVE-2. Int J Mol Med 1999; 3: 95–102. 4. Novakovi} S, Ihan A, Jezer{ek B. Effectiveness of a simply designed tumor vaccine in prevention of malignant melanoma development. Jpn J Cancer Res 1999; 90: 1130–8. 5. Schlom J, Abrams IS. Tumor immunology. In: Bast CR, Kufe WD, Pollock ER, Weichselbaum RR, Holland FJ, Frei E, eds. Cancer medicine. London: B.C. Decker Inc. 2000: 153–67. 6. Ghetie MA, Bright H, Vitetta ES. Homodimers but not monomers of Rituxan (chimerc anti-CD20) induce apoptosis in human B-lymphoma cells and synergize with a chemotherapeutic agent and an immunotoxin. Blood 2001; 97: 1392–8. 7. Hock H, Dorsch M, Kunzendorf Uquin Z, Diamanstein T, Blankenstein T. Mechanisms of rejection induced by tumor cell-targeted gene transfer of interleukin 2, interleukin 4, interleukin 7, tumor necrosis factor, or interferon γ. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 2774–8. 8. Novakovi} S, Kne`evi} M, Golouh R, Jezer{ek B. Transfection of mammalian cells by the methods of receptor mediated gene transfer and particle bombardment. J Exp Clin Cancer Res 1999; 18: 531–6. 9. Novakovi} S, ^egovnik U, Menart V, Galvani V, Wraber B. Construction of an expression casete with hTNF-α gene for transient expression of the gene in mammalian cells. Anticancer Res 2001; 21: 365–72. 10. ^egovnik U, Novakovi} S. Setting optimal parameters for in vitro electrotransfection of B16F1, SA1, LPB, SCK, L929 and CHO cells using predefined exponentially decaying electric pulses. Bioelectrochem 2004; 62: 73–82. 11. Sivasubramanian B, Ostrand-Rosenberg S, Nabavi N, et al. Constitutive expression of B7 restore immunogenicity of tumor cells expressing truncated major histocompatibility complex class II molecules. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 5687–90. 12. Nestle FO, Banchereau J, Hart D. Dendritic cells: On the move from bench to bedside. Nature Med 2001; 7: 761–5. ■ ONKOLOGIJA / novosti Slika 1. Fuzija celic, ozna~enih s fluorescentnima barviloma CMTMR in CMFDA, ki obarvata citoplazmo zeleno ali rde~e. Fuzirane celice so dvojno obarvane.