Analiza mutacij v kinazni domeni proteina BCR-ABL1 pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo in z nezadostnim odgovorom na zdravljenje z zaviralcem tirozinske kinaze
BCR-ABLi kinase domain mutation analysis in chronic myeloid Leukaemia patients with suboptimaL response to tyrosine kinase inhibitors
tadej Pajič, nejc Lamovšek, Martina Fink, Irena Zupan Preložnik, Peter černelč
Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 7, SI-1525 Ljubljana, Slovenija
Korespondenca/ Correspondence:
asist. dr. tadej Pajič, univ. dipl. ing. kem. inž., spec. med. biokem., klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 7, SI-1525 Ljubljana, Slovenija; tel: + 386 1 43 20 230, e-mail: tadej.pajic@kcLj.si
Ključne besede:
BcR-ABL1, sekvenciranje, mutacije, kronična mieloična levkemija
Key words:
BCR-ABL1, sequencing, mutation, chronic myeloid leukaemia
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2012; 81 supl 2: II-174-9
Prispelo: 16. apr. 2012, Sprejeto: 12. jul. 2012
Izvleček
Izhodišča: Pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo (KML) lahko pridobljene mutacije v kinazni domeni proteina BCR-ABL1 prispevajo k neučinkovitemu zdravljenju z zaviralcem tirozinske kinase (TK). Z našim delom želimo napraviti mutacijsko analizo v skupini bolnikov s KML, ki so jih zdravili z zaviralcem TK in ki niso dosegli glavnega molekularnega odgovora (MolO) v najmanj 18 mesecih ali pa so ga izgubili.
Metode: V raziskavo smo vključili 9 bolnikov s KML (7 žensk, 2 moška). Iz levkocitov periferne krvi smo osamili celotno RNA in pripravili komplementarno DNA (cDNA) z reverzno transkripcijo. V preurejenem alelu BCR-ABL1 smo z načinom vgnezdene verižne reakcije s po-limerazo (PCR) pomnožili celotni odsek kinazne domene ABLi. Nukelotidno zaporedje pridelka PCR smo določili s sekvenciranjem, ki smo ga izvedli na napravi ABI Prism 310. Dobljeno zaporedje smo primerjali z nukelotidnim zaporedjem divjega tipa gena ABLi. Mutacijo T315I smo ugotavljali tudi z občutljivejšim načinom, z alel-no specifičnim PCR. Mutacija T315I je odporna tako na imatinib, nilotinib in dasatinib.
Rezultati: S sekvenciranjem in ASO-PCR smo pri enem od 9 bolnikov s KML dokazali prisotnost mutacije T315I. Pri drugem bolniku smo s sekvenciranjem ugotovili tiho mutacijo p.Glu499Glu. Pri ostalih bolnikih mutacij nismo ugotovili.
Zaključki: Mutacije so najverjetneje redke pri bolnikih s KML, ki niso dosegli glavnega MolO najmanj po 18 mesecih ali so ga izgubili. Ugotovitev mutacije T315I, odporne na zaviralce TK (imatinib, nilotinib, dasatinib), v naši raziskavi
kaže, da je analizo mutacij v BCR-ABLi smiselno opraviti pri tej skupini bolnikov. Ugotovljena tiha mutacija, pri kateri ni prišlo do zamenjave aminokisline, je zavedena v glavnih podatkovnih bazah polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP, rs2227985). Vpliv polimorfizma na odpornost za zdravljenje z zaviralcem TK ni pojasnjena.
Abstract
Background: The acquired mutations in the BCR-ABL1 kinase domain (KD) may contribute to resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in chronic myeloid leukemia (CML) patients. The aim of our work was to perform the BCR-ABL1 mutation analysis in a cohort of CML patients receiving TKIs, who did not achieve a major molecular response (MMR) by 18 months or more, or who lost MMR.
Methods: Nine CML patients (7 female, 2 male) were included in the study. Total RNA was extracted from peripheral blood leukocytes and used to prepare complementary DNA (cDNA) by reverse transcription. The entire ABL1 kinase domain of the rearranged BCR-ABLi allele was amplified using a nested PCR. The PCR products were analyzed using an ABI Prism 310 sequencer. Sequences were compared with the wild-type ABL1 sequence. In addition, the T315I mutation detection was carried out by the more sensitive method-allele specific oligonucleotide-polymerase chain reaction (ASO-PCR). It is a highly-resistant mutation to imatinib, nilotinib and dasatinib.
Results: The T315I mutation was detected in one out of nine CML patients by direct sequencing and ASO-PCR. The silent mutation p.Glu499Glu
was detected in another CML patient by direct sequencing. No mutation was found in the rest of the cohort of CML patients.
Conclusions: It seems that the BCR-ABli mutations are rare in patients who do not achieve a MMR by 18 months or more or who have lost MMR. The T315I mutation detected in one patient in our cohort of CML patients indicates
that the BCR-ABLi mutation analysis could be recommended in these cases. The silent mutation detected did not lead to amino acid change, however, it is listed in major single nucleotide polymorphisms databases (SNP, rs2227985). The role of the SNP in the resistance to TKIs is not clear.
Uvod
Zaviralec tirozinske kinase imatinib me-silat (IM) je prvo zelo učinkovito zdravilo za zdravljenje bolnikov s kronično mieloično levkemijo BCR-ABL1 pozitivno. (KML).!'^ Kot zdravili prve izbire zdravljenja bolnikov s KML lahko uporabimo zaviralca druge generacije, nilotinib in dasatinib.^-^ Kjub temu se nekateri bolniki s KML ne odzivajo na zdravljenje ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju z IM; redkeje to pri nilotinibu in dasatinibu.8 V teh primerih se odločimo za povečanje odmerka zdravila (IM), drugo obliko zaviralca tirozinske kinaze (TKI), presaditev krvotvornih matičnih celic (PKMC) ali drugo raziskovalno zdravljenje.®-"
Vzrokov za pojav odpornosti na zdravljenje s TKI je več. Klonska evolucija in pojav točkovnih mutacij sta najpomembnejša dejavnika, ki sta medsebojno povezana.^^ Mutacije odkrijemo pri bolnikih v pospešenem poteku bolezni ali blastni krizi (preobrazbi). Pri bolnikih s KML, odporno na zdravljenje z IM, so ugotovili že več kot 90 točkovnih mutacij, ki povzročajo spremembe aminokislin na 57 mestih v genu ABLi.® Med njimi so nekatere, ki močno vplivajo na odzivnost na zdravljenje s TKI. Takšna mutacija je tudi zamenjava treonina za izolevcin na mestu 315 (T315I) aminokislinskega zaporedja beljakovine BCR-ABLi, ki povzroči pojav klona, ki je odporen na učinek imatiniba, nilotiniba in dasatiniba. Za nilotinib in da-satinib je manj odpornih mutacij in se med seboj ne pokrivajo, razen mutacije T315I.8
Priporočajo, da opravimo mutacijsko analizo BCR-ABL1 v posebnih primerih, ko je zdravljenje s TKI neučinkovito.® Med njimi je tudi skupina bolnikov s KML, zdravljenih s TKI, ki niso dosegli glavnega molekularnega odgovora (MolO) najmanj po 18
mesecih ali pa so ga izgubili. Glavni MolO (0,1 %) ustreza zmanjšanju za 3 desetiške logaritme od začetne standardne vrednosti (100 %) (angl. log reduction).9-ii'i3 Začetna standardna vrednost je bila v raziskavi IRIS določena kot mediana vrednosti razmerja BCR-ABL1 prepisa in kontrolnega prepisa BCR 30 nezdravljenih bolnikov v kroničnem obdobju bolezni.^'^^'^^ Pomen glavnega MolO se kaže v tem, da imajo bolniki, ki dosežejo glavni MolO po 12 ali 18 mesecih zdravljenja z IM, zelo veliko verjetnost, da bolezen v 5 letih ne bo napredovala.®'!"'!^ Določitev ravni BCR-ABL1 prepisa na mednarodnem merilu opravimo z obratnim prepisovanjem (RT) in s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) ter ob upoštevanju konverzijske-ga faktorja, ki si ga je laboratorij pridobil z izmenjavo vzorcev z referenčnim laboratorijem. Dobljeno vrednost razmerja med številom kopij BCR-ABL1 in ABL1 vzorca v odstotkih pomnožimo s konverzijskim fak-torjem.i3
Mutacije so najverjetneje redke pri bolnikih s KML, ki niso dosegli glavnega MolO najmanj po 18 mesecih ali so ga izgubili, vendar je podatkov o tem malo.® Zato je bil namen našega dela mutacijska analiza BCR--ABL1, s katero bi ugotovili smiselnost njenega izvajanja pri tej skupini bolnikov.
Bolniki in metode dela
V raziskavo smo vključili 9 bolnikov s KML, BCR-ABL1 pozitivno (7 žensk, 2 moška, Tabela 1), zdravljenih z zaviralcem TK, ki niso dosegli glavnega molekularnega odgovora (MolO) najmanj 18 mesecih ali so ga izgubili.
Vzorce periferne krvi bolnikov smo odvzeli v ambulanti Kliničnega oddelka za
Slika i: ELektroferograma nukLeotidnega zaporedja, dobljenih iz aparata ABI 310 (applied Biosystems) za:
A.	odsek PCR segmenta BCR-ABL1 bolnika s kronično mieloično levkemijo, ki vsebuje mutacijo p.T315I (c.947 C>T ref zap NM_005157.4; pT315I ref zap NP_005148.2).
B.	odsek PCR segmenta BCR-ABL1 bolnika s kronično mieloično levkemijo, ki vsebuje tiho mutacijo p.E499E (c.1500 A>G ref zap NM_005157.4; p.E499E ref zap NP_005148.2).
hematologijo, UKC Ljubljana. Meritve smo opravili na vzorcih RNA, shranjenih pri temperaturi -80 °C v Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana.
Iz levkocitov periferne krvi smo osamili celotno RNA in pripravili komplementarno DNA (cDNA) z reverzno transkripcijo. V preurejenem alelu BCR-ABL1 smo z načinom vgnezdene verižne reakcije s polimera-zo (PCR) pomnožili celoten odsek kinazne domene ABLi.^* Nukelotidno zaporedje pridelka PCR smo določili s sekvenciranjem, ki smo ga izvedli na napravi ABI Prism 310. Dobljeno zaporedje smo primerjali z nuke-lotidnim zaporedjem divjega tipa gena ABLi (referenčna sekvenca NM_005157.4). Mutacijo T315I (c.947C>T, NM_005157.4; T315I NP_005148.2) smo ugotavljali tudi z občutljivejšim načinom, z alelno specifičnim PCR.15 Izvedli smo dve ločeni reakciji PCR. V prvo reakcijo PCR smo dodali smerni začetni oligonukleotid, s katerim ugotovimo normalni preiskovani alel (divji tip, angl. wild type, W). V drugo reakcijo PCR smo dodali smerni začetni oligonukleotid, ki zazna spremenjen, mutirani alel (mutiran, angl. mutated, M). V obe reakciji smo dodali tudi ustrezen protismerni začetni oli-gonukleotid, ki je enak za obe reakciji (W in M). Nastale produkte reakcije PCR smo analizirali z agrarozno gelsko elektroforezo, velikost pridelka PCR pa je 157 bp.^^ Hkrati smo pomnožili negativno kontrolo, vzorec brez mutacije in kontrolo brez prisotnosti
nukleinskih kislin, ki nam služi kot kontrola onesnaženja s pridelki prejšnjih reakcij PCR.
Izvedeni postopki so bili v skladu z načeli Helsinške deklaracije o biomedicinskih raziskavah na človeku (1975).
Rezultati
Sekvenčna analiza odseka cDNA BCR-ABL1
V preurejenem alelu BCR-ABL1 smo z načinom vgnezdene verižne reakcije s po-limerazo (PCR) pomnožili celoten odsek kinazne domene ABL1 v treh ločenih reakcijah PCR. Nukleotidna zaporedja fragmentov, ki se med seboj delno pokrivajo, ustrezajo aminokislinskemu zaporedju ABL1 od 207. do 517. mesta (referenčno nukelotidno zaporedje NM_005157.4; referenčno prote-insko zaporedje NP_005148.2).
S sekvenciranjem smo pri enem od 9 bolnikov s KML dokazali prisotnost mutacije T315I (Slika 1, A). Pri drugem bolniku smo s sekvenciranjem ugotovili tiho mutacijo p.E499E (c.1500 A>G ref zap NM_005157.4; p.E499E ref zap NP_005148.2) (slika 1, B). Pri ostalih bolnikih mutacij nismo ugotovili (Tabela 1).
Alelno specifični PCR določanja mutacije T315I
Mutacijo T315I smo ugotavljali tudi z občutljivejšim načinom z ASO PCR.^^ Pri bolniku, pri katerem smo s sekvenciranjem

T3151 BCR-AB
6280 6105 6103 6281 6290 ^MW MWWM WMWM
Slika 2: Prikaz agarozne geLske eLektroforeze pridelkov alelno-specifične verižne reakcije s polimerazo (ASO-PcR) določanja mutacije T315I pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo, BCR-ABL1 pozitivno (KML).
Mx, označevalec DNA velikosti od 100 do 1000 baznih parov (bp). M, mutiran alel T315I; W, normalni, nemutiran alel (divji tip); vrstica 1-2, vzorec z oznako 6280-ni mutacije; vrstica 3-4, vzorec z oznako 6105-ni mutacije; vrstica 5-6, vzorec z oznako 6103-ni mutacije; vrstica 7-8, vzorec z oznako 6281-ni mutacije; vrstica 9-10, vzorec z oznako 6290-mutacija T315I prisotna. Velikost madežev je 157 bp. E-gel 4 %, Invitrogen, ZDA.
ugotovili mutacijo T315I, smo jo dokazali tudi z ASO-PCR (Slika 2, vzorec 6290). V reakciji PCR, pri kateri smo ugotavljali prisotnost mutacije, smo z agarozno gelsko elektroforezo zaznali pridelek PCR velikosti 157 bp. Pri drugih bolnikih mutacije nismo zaznali. Prisotnost pridelka PCR, v katerem ugotavljamo normalni alel, je znak ustrezne kakovosti vzorca cDNA in nam služi kot kontrola kakovosti naših rezultatov (Slika 2).
Razpravljanje
Pri bolnikih s KML lahko pridobljene mutacije v kinazni domeni proteina BCR--ABL1 prispevajo k neučinkovitemu zdravljenju z zaviralcem tirozinske kinaze (TKI). Priporočajo, da opravimo mutacijsko analizo BCR-ABL1 v posebnih primerih, ko zdravljenje s TKI ni učinkovito.8
Med njimi je tudi skupina bolnikov s KML, zdravljenih z zaviralcem TK, ki niso dosegli glavnega molekularnega odgovora (MolO) najmanj po 18 mesecih ali so ga iz-gubili.8-10 V našo raziskavo smo vključili devet takšnih bolnikov in samo pri enem bolniku s KML ugotovili prisotnost mutacije, in sicer mutacijo T315I. Prisotnost te mutacije
večinoma pomeni odpornost na zdravljenje tako z imatinib mesilatom kot nilotinibom in dasatinibom.8 V tem primeru je odločitev o nadaljnjem zdravljenju težka. Vključuje tudi premislek o presaditvi krvotvornih matičnih celic, če je ta mogoča. Vse mutacije ne vplivajo enako na odpornost na zdravljenje s TKI, zato je za odločitev o izbiri nadaljnjega zdravljenja, večinoma o izbiri naslednjega TKI, pomembno poznati vrsto pridobljene mutacije v BCR-ABL1. Dosedanje klinične raziskave so pokazale, da je za nekatere mutacije učinkovitejši nilotonib, za druge dasatinib. Tako npr. je verjetno v primeru prisotnosti ene izmed mutacij V299L, T315A ali F317L/V/I/C nilotinib bolj učinkovit kot dasatinib. V primeru prisotnosti mutacij Y253H, E255K/V ali F359V/C/I je verjetno dasatinib bolj učinkovit kot nilotinib. Pri kateri koli drugi mutaciji, razen T315I, sta nilotinib in dasatinib podobno učinkovita.®
Priporočeni način za ugotovitev mutacij BCR-ABLi je način direktnega sekvenci-ranja. Ta zaznava mutacije, če so prisotne v 20 celicah ali več s preureditvijo BCR--ABL1 oziroma s prisotnim kromosomom Philadelphia. Ta način lahko kombiniramo z drugim presejalnim načinom, npr. z dena-turacijo in visokoločljivo tekočinsko kroma-tografijo (D-HPLC).8 Prisotnost odpornih mutacij, ki so jih ugotovili z občutljivejšimi načini, ne pomeni vedno, da bo odgovor na zdravljenje s TKI neučinkovit. Ker je mutacija T315I med pogostejšimi, klon s to mutacijo pa odporen na zdravljenje z imatinib mesilatom, nilotinibom in dasatinibom, se odločimo najprej za določitev prisotnosti mutacije T315I z ASO-PCR, čemur sledi direktno sekvenciranje. Na tak način hitro prepoznamo najbolj odporne mutacije za zdravljenje s TKI.
Pri enem izmed bolnikov smo ugotovili tiho mutacijo p.E499E. Tiha mutacija, pri kateri ni prišlo do zamenjave aminokisline, je zavedena v glavnih podatkovnih bazah polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP, rs2227985). Vpliv polimorfizma na odpornost za zdravljenje z zaviralcem TK ni pojasnjena, vendar raziskave kažejo, da lahko takšne mutacije vplivajo na izražanje proteinov ali spremembo stabilnosti infor-
Tabela i: Podatki in rezultati mutacijske analize BCR-ABLi bolnikov s kronično mieloično levkemijo, BCR-ABLi pozitivno.
Bolnik	Starost (spol)	Datum odvzema	TKI	Raven BCR-ABL1		Sekvenciranje	ASO-PCR mutacija T315I	Razlog analize
				(% IS)		Izsledek	Izsledek	
bolnik 1	58 (Ž)	18.04.2011	imatinib/nilotinib	6.49		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 2	62 (Ž)	12.04.2011	imatinib/nilotinib	22.9		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 3	70 (Ž)	16.11.2011	imatinib/dasatinib	35.8		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 4	81 (Ž)	18.08.2010	imatinib/nilotinib	6.38		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 5	59 (Ž)	05.12.2011	imatinib/nilotinib	0.27		ni mutacije	ni mutacije	izguba glavnega MolO
bolnik 6	57 (Ž)	08.09.2011	imatinib/nilotinib	0.519		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 7	70 (Ž)	26.09.2011	imatinib	7.47		ni mutacije	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 8	76 (M)	27.09.2011	imatinib/dasatinib	0.553		mutacija tiha c.1500a>g;p.e499e	ni mutacije	ni glavni MolO
bolnik 9	71 (M)	22.09.2011	imatinib/dasatinib	4.55		mutacija c.947 c>T; p.T315I	mutacija c.947 C>T; p.T315I	ni glavni MolO
Legenda/Legend: TKI, zaviralec tirozinske kinase; glavni MolO, glavni molekularni odgovor; IS, mednarodno merilo; Ž, ženska; M, moški; ASO-PCR, alelnospecifična verižna reakcija s polimerazo; referenčna sekvenca za nukleotidno zaporedje: NM_005157.4; referenčna sekvenca za proteinsko zaporedje: NP_005148.2.
macijske RNA.^® Morda vplivajo tudi na od- Zahvala zivnost na zdravljenje s TKI.
Zaključki
Mutacije so verjetno redke pri bolnikih s KML, ki niso dosegli glavnega MolO najmanj po 18 mesecih ali so ga izgubili. Ugotovitev odporne mutacije T315I na zaviralce TK (imatinib, nilotinib, dasatinib) kaže, da je analizo mutacij v BCR-ABLi smiselno opraviti pri tej skupini bolnikov. Tiha mutacija, pri kateri ni prišlo do zamenjave aminokisline, je zavedena v glavnih podatkovnih bazah polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP, rs2227985). Vpliv polimorfizma na odpornost na zdravljenje z zaviralcem TK ni pojasnjena.
Avtorji se zahvaljujemo Anici Mihajlovic in Mariji Jedrt Mandelc Mazaj za pomoč pri zbiranju in evidentiranju vzorcev.
Literatura
1.	Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, Gathmann I, Kantarjian H, Gattermann N, et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2006; 355: 240817.
2.	Guilhot F, Druker B, Larson RA, Gathmann I, So C, Waltzman R, et al. High rates of durable response are achieved with imatinib after treatment with interferon alpha plus cytarabine: results from the International Randomized Study of Interferon and STI571 (IRIS) trial. Haematologica 2009; 94: 1669-75.
3.	Saglio G, Kim DW, Issaragrisü S, le Coutre P, Eti-enne G, Lobo C, et al. Nüotinib versus imatinib for newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2010; 362: 2251-59.
4.	Kantarjian HM, Giles F, Gattermann N, Bhalla K, Alimena G, Palandri F, et al. Nüotinib (formerly AMN107), a highly selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, is effective in patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelo-genous leukemia in chronic phase following ima-tinib resistance and intolerance. Blood 2007; 110:
3540-6.
5.	Kantarjian HM, Hochhaus A, Saglio G, De Souza C, Flinn IW, Stenke L,e tal. Nilotinib versus imatinib for the treatment of patients with newly diagnosed chronic phase, Philadelphia chromosome-positive, chronic myeloid leukaemia: 24-month minimum follow-up of the phase 3 randomised ENESTnd trial. Lancet Oncol 2011; 12: 841-51.
6.	Kantarjian H, Shah NP, Hochhaus A, Cortes J, Shah S, Ayala M, et al. Dasatinib versus imatinib in newly diagnosed chronic-phase chronic mye-loid leukemia. N Engl J Med 2010; 362: 2260-70.
7.	Kantarjian HM, Shah NP, Cortes JE, Baccarani M, Agarwal MB, Undurraga MS, et al. Dasatinib or imatinib in newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia: 2-year follow-up from a randomized phase 3 trial (DASISION). Blood 2012; 119: 1123-9.
8.	Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, Gruber F, Lange T, Saglio G, et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: re-
commendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood 2011; 118: 1208-15.
9.	Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2006; 108: 1809-20.
10.	Baccarani M, Cortes J, Pane F, Niederwieser D, Saglio G, Apperley J et al. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009; 27: 6041-51.
11.	Preložnik Zupan I, Pajič T. Smernice za odkrivanje in zdravljenje kronične mieloične levkemije. Zdrav Vestn 2008; 77: I-5-10.
12.	Apperley JF. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007; 8: 1018-29.
13.	Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonising current methodology for detecting BCR--ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006; 108: 28-37.
14.	Ernst T, Erben P, Müller MC, Paschka P, Schenk T, Hoffmann J et al. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib, Haematologica 2008; 93: 186-192.
15.	Kang HY, Hwang JY, Kim SH, Goh HG, Kim M, Kim DW. Comparison of allele specific oligonu-cleotide-polymerase chain reaction and direct sequencing for high throughput screening of ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia resistant to imatinib. Haematologica 2006;
91: 659-62.
16.	Ernst T, Hoffmann J, Erben P, Hanfstein B, Leitner A, Hehlmann R, et al. ABL single nucleotide polymorphisms may masquerade as BCR-ABL mutations associated with resistance to tyrosine kinase inhibitors in patients with chronic myeloid leukemia. Haematologica 2008; 93: 1389-93.