Encimi vkljuœeni v biosintezo glivnega melanina - potencialne tarœe za razvoj novih antimikotikov
Encimi vkljuœeni v biosintezo glivnega melanina - potencialne tarœe za razvoj novih antimikotikov
Enzymes involved in fungal melanin biosynthesis - potential targets for the development of new antimicotic drugs
Mojca Brunskole, Tea Lanišnik Rižner, Jure Stojan
Povzetek: Dematozne ali temno pigmentirane glive so vzrok za øtevilne infekcije predvsem pri ljudeh z oslabljenim imunskim sistemom. V celiœni steni vseh temno pigmentiranih gliv je prisoten melanin, ki je tako najverjetneje odgovoren za njihovo patogenost. Dokazano je, da melanin øœiti glivne celice, hkrati pa je povezan z njihovo virulenco. Infekcije, ki jih povzroœajo dematozne glive, so feohifomikoze, kromoblastomikoze in micetomi. Kljub kombiniranemu zdravljenju z antimikotiki øe vedno predstavljajo velik zdravstveni problem z visoko stopnjo umrljivosti. V œlanku predstavljamo biosintezno pot 1,8-dihidroksinaftalen melanina, vkljuœno z encimi, ki katalizirajo posamezne reakcije. Ker sinteza melanina po 1,8- dihidroksinaftalenski poti v gostiteljevem organizmu ne poteka, so encimi v njegovi biosintetski poti zanimive tarœe pri razvoju novih antimikotiœnih uœinkovin s selektivnim delovanjem.
Kljuœne besede: pigmentirane glive, 1,8-dihidroksinaftalen (DHN)-melanin, mikoze, antimikotiki
Abstract: Dematiaceous or dark-pigmented fungi are responsible for many infections, and especially in immunocompromised patients. These fungi contain melanin in their cell walls that protects them from environmental stresses and is considered to be an important virulence factor. Infections caused by dematiaceous fungi include phaeohyphomycosis, chromoblastomyciosis and mycetoma. Despite combined antimicotic therapies, these infections can still result in high overall mortality rates and represent an important health issue. We present here the 1,8-dihydroxynaphthalene melanin biosynthetic pathway and the enzymes involved. As 1,8-dihydroxynaphthalene melanin appears only in fungi the enzymes involved in its biosynthesis represent interesting targets for the development of new selective antimicotics.
Key words: dematiaceous fungi, 1,8-dihydroxynaphthalene (DHN)-melanin, mycosis, antimicotic drugs
1 Uvod
V zadnjih letih se pojavlja vedno veœ gliviœnih infekcij, ki so posledica razvoja rezistence na antimikotiœne uœinkovine, vedno veœ pa je tud novih vrst patogenih gliv, ki so se razvile iz nepatogenih. Poznamo øtevilne dejavnike, ki vodijo do infekcij z glivami
•  razøirjena uporaba antibiotikov s øirokim spektrom delovanja, ki zavirajo normalno prisotne nepatogene bakterije v telesu, na raœun katerih se potem razvijejo glive,
•  uporaba imunosupresivnih uœinkovin in kemoterapevtikov,
•  poveœano øtevilo bolnikov okuæenih z virusom HIV (1).
Te infekcije so posledica slabøe telesne odpornosti in se le redko pojavijo pri zdravih posameznikih. Zdravimo jih z antimikotiœnimi uœinkovinami, ki pa imajo poleg neæelenih uœinkov in razvoja rezistence, tudi nekatere druge slabosti. Slabo prehajajo v tarœna tkiva in imajo ozek antimikotiœni spekter delovanja (2). Zato se pojavlja potreba po razvoju novih antimikotiœnih uœinkovin z novimi prijemaliøœi delovanja in s selektivnim delovanjem na glivne celice,  ki ne bi
povzroœale stranskih uœinkov v gostiteljevem organizmu. V œlanku predstavljamo glivni 1,8-dihidroksinaftalen (DHN)-melanin in encime vkljuœene v njegovo biosintezo kot zanimiva tarœna mesta za razvoj novih antimikotikov.
2 Infekcije, ki jih povzroœajo temno pigmentirane glive
Øtevilne glive, ki povzroœajo infekcije pri ljudeh in æivalih, uvrøœamo v skupino temno pigmentiranih gliv. Zanje je znaœilna prisotnost melanina v celiœni steni, zato so njihove spore in hife znaœilno temne barve (3). Œrno pigmentirane glive le redko povzroœajo bolezni pri zdravih ljudeh, so pa vzrok za øtevilne æivljenjsko nevarne infekcije pri ljudeh z oslabljenim imunskim sistemom. Œeprav natanœen mehanizem njihove patogenosti ni popolnoma znan, domnevajo, da je virulentni dejavnik melanin (4).
Mojca Brunskole, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
izr. prof. dr. Tea Lanišnik Rižner, univ. dipl. kem., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
prof. dr. Jure Stojan, dr. med., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
farm vestn 2008; 59 21
Pregledni znanstveni œlanki - Scientific Review Articles
V razvoj bolezni pri cloveku naj bi bilo vpletenih vec kot 100 vrst iz 60 rodov dematoznih gliv. Nahajajo se v prsti in so razširjene povsod po svetu (5). V telo jih vnesemo predvsem z dihanjem ali skozi odprte rane. Povzrocajo lahko površinske in globoke lokalne infekcije diseminirano feohifomikozo, alergijske bolezni, pljucnico, možganski ognojek, itd. (4).
Infekcije, ki jih povzrocajo pigmentirane filamentozne glive, razdelimo v tri skupine: kromoblastomikoze, micetome in feohifomikoze. Kromoblastomikoze povzrocajo glive, ki tvorijo skleroticna telesa v tkivu in so znacilne predvsem za tropske predele (5). V vecin primerov so vzrok zanje glive iz petih vrst: Fonseacea compactum, Fonsecaea pedrosoi, Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii in Rhinocladiella aquaspersa. Zdravljenje obicajno zahteva kirurško odstranitev okuženega predela ter antimikoticno terapijo (6). Micetomi so okužbe globokih tkiv, obicajno spodnjih ekstremitet, ki jih oznacujejo podkožne otekline, vnetja, drenaža sinusov in prisotnost mikoticnih granul (5). Povzrocajo jih lahko glive (eumicetomi) ali pa filamentozne bakterije (aktinomicetomi), ki se nahajajo v prsti in vstopijo v gostiteljski organizem skozi poškodbe na koži (7) Eumicetomi so kronicne, granulomatozne, podkožne vnetne bolezni, ki zahtevajo agresivno kirurško zdravljenje v kombinaciji z antimikotiki. Ob neustreznem zdravljenju lahko privedejo do deformacij in amputacij prizadetih predelov ali celo do smrti (7). Vse ostale klinicne sindrome uvršcamo med feohifomikoze (4).
Najpogostejše infekcije, ki jih povzrocajo dematozne glive, so površinske infekcije in so povezane z manjšimi poškodbami kože. Ceprav le redko ogrožajo življenje, lahko v dolocenih primerih privedejo do smrti. Pri tem je odlocilno mesto okužbe in odziv na protiglivno terapijo (4). Diseminirana feohifomikoza je razmeroma redka bolezen, ki jo povzrocajo dematozne glive, vendar pa število infekcij zadnja leta narašca. V preglednem clanku Revankarja in sodelavcev (5) je povzetih 72 primerov diseminiranih feohifomikoz, ki so se pojavile v letih od 1966 do 2001. Najpogostejši vzroki zanje so bili oslabljen imunski sistem, rakava obolenja, nevtropenija povezana s kemoterapijo, transplantacija kostnega mozga in drugih organov ter okužba z virusom HIV. Vendar pa je bila med njimi približno cetrtina infekcij pri ljudeh z zdravim imunskim sistemom. Za bolezen so znacilni izpušcaji in razjede na koži, povišana telesna temperatura, kronicne bolezni dihal in centralnega živcnega sistema, gastrointestinalni simptomi in sepsa. Povprecna smrtnost je bila 79 % in sicer 84 % pri ljudeh z oslabljenim in 65 % pri ljudeh z zdravim imunskim sistemom. Ugotovljena je bila tudi slaba odzivnost na amfotericin B in ostala antimikoticna zdravila, prav tako pa tudi kombinirano zdravljenje ni pripomoglo k vecjemu preživetju. Vecina opisanih primerov je iz Severne Amerike in Evrope (5).
Pomemben oftalmološki problem, predvsem v tropskih predelih, predstavlja glivni keratitis. Približno polovica primerov je povezanih s predhodnimi poškodbami na ocesu, posebej dovzetni pa naj bi bil posamezniki s sladkorno boleznijo, predhodnimi operacijami na ocesu ter uporabniki kontaktnih lec. Kljub zdravljenju s peroralnimi in lokalnimi antimikotiki se številnim bolnikom ob koncu zdravljenja vid ne  povrne  v  prvotno  stanje  (4).   Med  alergijskimi  boleznimi  so
najpogostejše glivni sinusitis in alergijske bronhopulmonalne mikoze (4).
Ceprav prihaja do opisanih okužb najpogosteje pri bolnikih z oslabljenim obrambnim mehanizmom - predvsem zaradi okužbe z virusom HIV in kemoterapije, pa je primarna feohifomikoza centralnega živcnega sistema izjema. Med 101 opisanim primerom jih je vec kot polovica pri ljudeh z zdravim imunskim sistemom in brez dejavnikov tveganja za glivne infekcije (8). Bolezen se najveckrat kaže kot možganski ognojek s spremljajocim glavobolom in nevrološkimi motnjami, je redka, vendar pogosto smrtna (4). Opisani primeri kažejo, da za številne infekcije s pigmentiranimi glivami še vedno ni primerne terapije. V prihodnje bodo potrebne dodatne preiskave in spremljanje teh infekcij, predvsem z namenom, da bi poiskali nove možnosti za zdravljenje in preizkusili nova prijemališca zdravilnih ucinkovin
3 Vloga melanina v glivnih celicah
V glivah imajo melanini zašcitno vlogo, delujejo pa tudi kot virulentni dejavniki. Šcitijo jih pred stresnimi dejavniki iz okolja ter gostiteljevim obrambnim mehanizmom in s tem omogocijo njihovo preživetje (9, 10).
3.1   Zašcitna vloga melanina
Ker se nahajajo melanini v glivni celicni steni, delujejo kot nekakšen oklep na površini celice in jo varujejo pred zunanjimi vplivi. V primerjavi  z  nemelaniziranimi  so  melanizirane  vrste  gliv veliko
Slika 1: Preœni prerez apresorija divjega tipa Magnaporthe grisea. Melaninski sloj, ki obkroæa celico, je prekinjen na mestu stika z gostiteljevo povrøino (med A), kar omogoœi nastanek pore skozi katero lahko iz glive prehajajo veœje molekule. (Ponatisnjeno z dovoljenjem Annual Review of Microbiology, Volume 50, ©1996 by Annual Reviews, www.annualre-views.org).
Figure 1: Cross-section of an appressorium of wild-type Magnaporthe grisea. The melanin layer surrounds the cell except for an area in contact with the host surface (between A), comprising the appressorium pore where the larger molecules can pass from the fungus. (Reprinted, with permission, from the Annual Review of Microbiology, Volume 50, ©1996 by Annual Reviews,    www.annualreviews.org)
22 farm vestn 2008; 59
Encimi vkljuœeni v biosintezo glivnega melanina - potencialne tarœe za razvoj novih antimikotikov
odpornejøe na UV, X ali gama æarke, toploto in nizke temperature (9). Na pomembno vlogo melanina pri zaøœiti pred sevanjem kaæe tudi dejstvo, da je bil eden izmed reaktorjev v Œernobilu kontaminiran s œrnimi glivami (11). Pigmenti pa varujejo celice tudi pred hidrolitiœnimi encimi kot so hitinaze, celulaze, (5-1,3- in (5-1,6-glukanaze in na ta naœin zavarujejo glivno celiœno steno pred razgradnjo (9). Predvidevamo, da melanin øœiti pigmentirane celice in tkivo, ki jih obkroæa, tudi z adsorpcijo potencialno nevarnih substanc (øtevilnih zdravilnih uœinkovin in drugih kemikalij, kot so organski amini, kovinski ioni, policikliœni aromati), ki se potem poœasi sproøœajo v netoksiœnih koncentracijah (12). To naj bi bil tudi vzrok za odpornost pigmentiranih gliv na antimikotiœno terapijo. Inkubacija amfotericina B in kaspofungina z melaninom je znaœilno zmanjøala njuno protiglivno delovanje na Cryptococcus neoformans, kar kaæe na to, da je lahko melanizacija vzrok za teæave pri zdravljenju kriptokoknih okuæb (11 13). Vendar pa adsorpcija uœinkovin ni edini vzrok za odpornost na protimikrobno terapijo, saj inkubacija melanina z itrakonazolom, flukonazolom in flucitozinom ni vplivala na njihovo protimikrobno delovanje. Kaæe, da manjøe molekule lahko prehajajo med zrnci melanina v glivni celiœni steni, medtem ko sta amfotericin B in kaspofungin prevelika (11).
Ko gliva vstopi v gostitelja, je izpostavljena njegovemu imunskemu sistemu, aktiviranim makrofagom in reaktivnim kisikovim in duøikovim radikalom, ki se sproøœajo med oksidativnim stresom. Le-ti naj bi imel fungicidno in fungistatiœno delovanje (14, 15). Melanin øœiti glive pred oksidativnim stresom in fagocitozo (16). Melanizirani konidiji glive Sporothrix schenckiina primer so bolj odporni na kisikove in duøikove radikale ter monocite in makrofage kot nemelanizirani (17). Tudi glivo Cryptococcus neoformans melanin varuje pred oksidirajoœim dejavniki, ki jih sproøœa obrambni mehanizem in hkrati zavira s protitelesi posredovano fagocitozo (18, 19). Zaradi svojih elektrokemiœnih lastnosti pa melanini ne delujejo le kot lovilci prostih radikalov, ampak tudi kot ionski izmenjevalci, ki veæejo æelezove ione in s tem prepreœijo njihovo sodelovanje v t.i. Fentonovi reakciji, kjer nastane iz superoksidnega radikala in vodikovega peroksida izjemno
reaktiven hidroksilni radikal (16). Melanini naj bi delovali tudi podobno kot superoksid dizmutaza in s tem øe dodatno omejili oksidativni stres (16). Mehanizem odpornosti na fagocitozo øe ni popolnoma pojasnjen, vendar pa naj bi bila osnova za rezistenco negativen naboj na povrøini celic. Ker so melanini negativno nabiti polimeri, njihova prisotnost v celiœni steni spremeni naboj na povrøini glivnih celic in s tem prepreœi fagocitozo (11, 20).
3.2 Melanin kot virulentni dejavnik
Sposobnost gliv, da sintetizirajo melanin, je povezana tudi s prilagajanjem na parazitizem in virulenco. Øtevilne za rastline patogene glive tvorijo melanizirane konidije ali apresorije -specializirane organe, ki sodelujejo pri adheziji na povrøino celice in penetraciji hif v gostiteljevo tkivo (slika 1) (16). Za nekatere rastlinske patogene je tvorba apresorijev nujna za njihovo invazijo v gostiteljeve celice (9). Apresorijske celice razvijejo zelo visoko rigidnost in mehansko odpornost. Njihov osmotski tlak lahko naraste na 8 MPa. Sila s katero deluje Magnaporthe grisea na rastlinsko celiœno steno doseæe na apikalni strani apresorija 8 µN/µm2, pri Colletotrichum graminicola pa celo 17 µN/µm2, kar je pribliæno toliko, kot œe bi œloveøko dlan obremenili z osmimi tonami (16, 21). Tako visok osmotski tlak je doseæen zaradi izredno visoke koncentracije glicerola v apresoriju, ki je posledica velike zamreæenosti celiœne stene in celiœne membrane (16). Melanin naj bi v celiœni steni zmanjøal velikost por pod 1 nm, zaradi tega lahko skozi prehaja samo voda, veœje molekule pa ne - to omogoœi influks vode, ko se v apresoriju naberejo osmotsko aktivni topljenci (21). Hkrati pa se z melaninom poveœa tudi mehanska odpornost celiœne stene.
Apresorij se prilepi na kutikulo na povrøini gostitelja in vanjo naredi vdrtino, kar omogoœa hifi penetracijo v gostiteljsko celico (9). Pri tem ima prisotnost melanina pomembno vlogo. Dokazano je bilo, da albino mutanti Colletotrichum lagenarium, ki nimajo gena za poliketidno sintazo (PKS, prvi encim pri biosintezi DHN melanina), v nasprotju z divjim tipom, niso bili sposobni inficirati listov kumaric in penetrirati skozi njihovo celulozno steno. Ta sposobnost pa se je
Slika 2:   Biosinteza melanina po 1,8-dihidroksinaftalen (DHN)-melaninski poti v Verticillum dahliae, Magnaporthe grisea in Curvularia lunata (1,3,6,8-tetra-HN: 1,3,6,8-tetrahidroksinaftalen; 1,3,8-tri-HN: 1,3,8-trihidroksinaftalen)
Figure 2: 1,8-dihydroxynaphthalene (DHN)-melanin biosynthesis in Verticillum dahliae, Magnaporthe grisea and Curvularia lunata (1,3,6,8-tetra-HN: 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene; 1,3,8-tri-HN: 1,3,8-trihydroxynaphthalene)
farm vestn 2008; 59 23
Pregledni znanstveni œlanki - Scientific Review Articles
Slika 3:   Komercialno dostopni fungicidi, ki inhibirajo biosintezo DHN-melanina Figure 3: Commercial fungicides that inhibit DHN-melanin biosynthesis
ponovno vzpostavila po transfekciji z genom za PKS iz Alternaria alternata. Œeprav so bile takøne glive potem slabøe infektivne, verjetno zaradi niæje vsebnosti melanina kot pri nemutiranih, je ta poskus potrdil pomembno vlogo melanina za parazitske lastnosti gliv (16). Albino mutanti Pyricularia oryzae tudi tvorijo apresorije, ki se prilepijo na kutikulo, vendar pa hife ne morejo penetrirati v gostiteljevo celico. Podobno so ugotovili tudi ob uporabi inhibitorjev sinteze melanina, kjer je priølo do tvorbe hialinskih konidijev in apresorijev, ki so se prilepili na gostiteljevo celico, vendar pa hife niso mogle penetrirati (9). Poøkodovano rastlinsko tkivo lahko inficirajo glive z melaniziranimi kot tudi nemelaniziranimi konidiji, kar kaæe na to, da melanin olajøa penetracijo v rastlinsko tkivo, ne vpliva pa na kasnejøi razrast gliv (9). K rigidnosti apresorijev poleg melanina pripomorejo tudi hitin in drugi polimeri v glivni celiœni steni. V prisotnosti inhibitorja sinteze hitina apresoriji Colletotrichum graminicola niso dovolj rigidni, da bi razvili ustrezno visok tlak in zato poœijo (21). Pri ljudeh in æivalih pa je virulentnost melaniziranih gliv povezana z zaøœitno vlogo melanina, ki zmanjøa obœutljivost na gostiteljev obrambni mehanizem in modificira imunski odziv (11).
4 Melanin
Melanini so negativno nabiti, hidrofobni pigmenti visokih molekulskih mas, ki nastajajo z oksidativno polimerizacijo fenolnih in/ali indolnih komponent in so navadno vezani s proteini, v nekaterih primerih pa tudi z ogljikovimi hidrati. Obiœajno so rjavi ali œrni, œeprav obstajajo tudi melanini drugih barv (18, 22). Najdemo jih pri ljudeh, æivalih, rastlinah in mikroorganizmih, kjer opravljajo øtevilne funkcije, œeprav za rast in razvoj glivnih in drugih celic niso nujno potrebni (9, 22). Kljub razøirjenosti melaninov pa je zaradi kompleksne polimerne zgradbe le malo znanega o njihovi kemijski strukturi (11). V sploønem lahko vse tipe prokariontskih in evkariontskih melaninov razdelimo v tri skupine (16):
•  eumelanini: œrni ali rjavi pigmenti, ki nastajajo z oksidacijo tirozina ali fenilalanina v o-dihidroksifenilalanin (DOPA) in dopakinon, ki v nadaljnih stopnjah ciklizirata v 5,6-dihidroksiindol (DHI) ali 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilno kislino (DHICA). Eumelanini so heterogene makromolekule DHI in DHICA (16, 23).
•  feomelanini: rumeno-rdeœi melanini, ki nastajajo podobno kot eumelanini, vendar pa se na DOPO direktno ali s pomoœjo glutationa pripne cistein. Nastala cisteinil-DOPA nato polimerizira do razliœnih derivatov benzotiazinov (16, 23).
•  alomelanini: heterogena skupina polimerov, ki nastanejo z oksidacijo in polimerizacijo di- ter tetrahidroksinaftalena v pentaketidni poti. Pri tem nastanejo øtevilni pigmenti kot so DHN melanini, homogentinska
kislina,  Y-glutaminil-4-hidroksibenzen,   kateholi  ter 4-hidroksifenil -ocetna kislina. Alomelanini ne vsebujejo duøika (16). Pri œloveku in æivalih nastaja melanin iz tirozina s pomoœjo encima tirozinaze. Pri tem lahko nastanejo melanini iz skupine eumelaninov ali feomelaninov (24).
4.1  Sinteza melanina v glivnih celicah
Za razliko od æivali, kjer poteka sinteza melanina v melanocitih, glive sintetizirajo melanine v citoplazmi, od koder se prenesejo v celiœno steno ali pa izloœijo kot ekstracelularni polimeri (22). V øtevilnih glivah in drugih mikroorganizmih nastaja melanin iz tirozina preko 3,4-dihidroksifenilalanina (DOPA), v Bazidiomicetah (prostotrosnice) preko Y-glutaminil-3,4-dihidroksibenzena (GDBH) ali kateholov in pri Askomicetah (odprtotrosnice) in sorodnih Deuteromicetah preko 1,8-dihidroksinaftalena (DHN) (22).
Œeprav obstaja veœ razliœnih tipov glivnih melaninov, øtevilne temno rjavo in œrno melanizirane glive, ki so patogene za rastline in/ali œloveka, sintetizirajo pigmente iz acetata po 1,8-dihidroksinaftalen (DHN)-melaninski poti (9).
Sinteza melanina se zaœne s poliketidno-sintazo, ki v veœstopenjski reakciji pretvori acetat v 1,3,6,8-tetrahidroksinaftalen (slika 2), le-tega pa tetrahidroksinaftalen-reduktaza reducira do scitalona. Scitalon scitalon-dehidrataza pretvori v 1,3,8-trihidroksinaftalen, œemur sledi redukcija do vermelona s trihidroksinaftalen-reduktazo. Z odcepom vode s pomoœjo vermelon-dehidrataze nastane iz vermelona 1,8-dihidroksinaftalen (22). Sledi konœna stopnja sinteze melanina - oksidacija 1,8-dihidroksinaftalena v melanin, ki naj bi jo kataliziral encim lakaza, vendar pa sam mehanizem polimerizacije øe ni pojasnjen (25).
Poznane so øtevilne za œloveka patogene glive, ki sintetizirajo melanin po poliketidni poti: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alternaria alternata, Cladosporium carionii, Curvularia lunata, Exophiala jeanselmei, Exophiala dermatidis, Fonsecaea compacta, Fonsecaea pedrosoi, Hendersonula toruloidii, Phaeoannellomyces werneckii, Phialophora richardsiae, Phialophora verrucosa, Sporothrix schenckii, Wangiella dermatidis in Xylohypha bantiana (10, 17, 26).
4.2  Inhibicija biosinleze melanina
Magnaporthe grisea (anamorf Pyricularia oryzae) in Bipolaris oryzae sta znani povzroœiteljici rje na riæu. Ker predstavlja omenjena bolezen velik ekonomski problem, so bile v preteklosti opravljene øtevilne raziskave, ki so ugotavljale mehanizem nastanka te bolezni ter iskale
24 farm vestn 2008; 59
Encimi vkljuœeni v biosintezo glivnega melanina - potencialne tarœe za razvoj novih antimikotikov
moæne reøitve, ki bi zmanjøale njene razseænosti. Za virulentnost teh gliv naj bi bil odgovoren melanin, ki ga sintetizirajo po 1,8-dihidroksinaftalenski poti (DHN-melanin) (27, 28, 29). Pri sintezi melanina po 1,8-dihidroksinaftalenski poti sodelujejo 4 encimi poliketidna-sintaza, 1,3,6,8-tetrahidroksinaftalen-reduktaza, 1,3,8-trihidroksinaftalen-reduktaza (THNR) in scitalon-dehidrataza (22). Encimi, ki sodelujejo pri sintezi glivnega melanina, so zanimive tarœe za razvoj novih antimikotiœnih uœinkovin, saj biosinteza DHN-melanina v gostiteljevih (rastlinskih oz. æivalskih) celicah ne poteka in bi na ta naœin dosegli njihovo selektivnost.
Najbolj raziskani tarœi v biosintetski poti melanina sta THNR in scitalon-dehidrataza, ki sodelujeta v dveh zaporednih reakcijah Poznani so trije komercialno dostopni inhibitorji THNR - triciklazol, pirokvilon in ftalid (slika 3), v uporabi pa je tudi karpropamid, inhibitor scitalon-dehidrataze (22, 30).
Vsi naøteti inhibitorji se uporabljajo kot fungicidi, na træiøœu pa øe vedno ni nobenega antimikotika. Triciklazol z inhibicijo sinteze melanina stanjøa celiœno steno v glivnih apresorijskih celicah in s tem prepreœi penetracijo v gostitelja, ko pa se enkrat penetracija zaœne, je uœinkovitost triciklazola niæja. Inhibitorjem sinteze melanina zato pravimo tudi “antipenetranti”
5  Sklep
Potreba po novih protiglivnih uœinkovinah se pojavlja predvsem zaradi razvoja rezistence na trenutno dostopne antimikotiœne uœinkovine in zaradi njihovih øtevilnih neæelenih uœinkov. Pojavlja se vedno veœ novih vrst patogenih gliv, ki so odporne tudi na kombinirano antimikotiœno zdravljenje. Zaradi naraøœanja gliviœnih infekcij so raziskave usmerjene v razvoj novih protiglivnih uœinkovin vse bolj pomembne. Iøœemo predvsem uœinkovine z novim prijemaliøœem delovanja in selektivnim uœinkom. Med njimi so tudi inhibitorji sinteze melanina.
6  Literatura
1.   Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Moore PK. In: Pharmacology. 5th Ed. Edinburg: Churchill Livingstone, 2003; 666-671
2.   Gubina M, Ihan A. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. Ljubljana: Medicinski razgledi, 2002; 457-499.
3.   http://microbiology.mtsinai.on.ca/mig/defungi/index.shtml (maj 2007)
4.   Revankar SG. Therapy of infections caused by dematiaceous fungi. Expert Rev Anti Infect Therapy 2005; 3 (4): 601-612.
5.   Revankar SG, Patterson JE, Sutton DA et al. Disseminated phaeohyphomycosis: review of an emerging mycosis. Clin Infect Dis 2002; 34: 467-476.
6.   Milam CP, Fenske NA. Chromoblastomycosis. Dermatol Clin 1989; 7 (2): 219-225.
7.   Fahal AH. Mycetoma: a thorn in the flesh. Trans R Soc Trop Med Hyg 2004; 98 (1): 3-11
8.   Revankar SG, Sutton DA, Rinaldi MG. Primary central nervous system pha eohyp homycosis: a review of 101 cases. Clin Infect Dis 2004; 38: 206-216.
9.   Polak A. Melanin as a virulence factor in pathogenic fungi. Mycoses 1989; 33 (5): 215-224.
10. Jacobson ES. Pathogenic roles for fungal melanins. Clin Microbiol Rev 2000; 13 (4): 708-717.
11.  Nosanchuk JD, Casadevall A. Impact of melanin on microbial virulence and clinical resistance to antimicrobial compounds. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50 (11): 3519-3528.
12.  Larsson BS. Interaction between chemicals and melanin. Pigment Cell Res 1993; 6 (3): 127-133.
13. Wang Y, Casadevall A. Growth of Cryptococcus neoformans in presence of L-dopa decreases its sucseptibility to amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38 (11): 2648-2650
14. Yoshida K, Akaike T, Doi T et al. Pronounced enhancement of •NO-dependent antimicrobial action by an •NO-oxidizig agent, imidazolineoxyl N-oxide. Infect Immun 1993; 61 (8): 3552-3555.
15. Alspaugh JA, Granger DL. Inhibition of Cryptococcus neoformans replication by nitrogen oxides supports the role of these molecules as effectors af macrophage-mediated cytostasis. Infect Immun 1991; 59 (7): 2291-2296.
16. Plonka PM, Grabacka M. Melanin synthesis in microorganisms - biotehno -logical and medical aspects. Acta Biochim Pol 2006; 53 (3): 429-443.
17.  Martinez RR, Wheeler M, Plata AG et al. Biosynthesis and functions of melanin in Sporothrix schenckii. Infect Immun 2000; 68 (6): 3696-3703.
18. Casadevall A, Rosas AL, Nosanchuk JD. Melanin and virulence in Cryptococcus neoformans. Curr Opin Microbiol 2000; 3: 354-358.
19.  Brakhage AA, Langfelder K, Wanner G et al. Pigment biosynthesis and virulence. Contrib Microbiol 1999; 2: 205-215.
20. Walter H, Graham LL, Krob EJ, Hill M. Correlation between phagocytic and membrane surface properties reflected by partitioning of human peripheral blood monocytes in two-polymer aqueous phases. Biochim Biophys Acta 1980; 602 (2): 309-322.
21.  Deising HB, Werner S, Wernitz M. The role of fungal appressoria in plant infection. Micr Infect 2000; 2: 1631-1641
22.  Bell AA, Wheeler MH. Biosynthesis and funtions of fungal melanins. Ann Rev Phytopathol 1986; 24: 411-451
23.  Meredith P, Sarna T. The physical and chemical properties of eumelanin. Pigment Cell Res 2006; 19: 572-594.
24. Westerhof W. The discovery of the human melanocyte. Pigment Cell Res 2006; 19 (3): 183-193.
25.  Butler MJ, Day AW. Fungal melanins: a review. Can J Microbiol 1998; 44: 1115-1136.
26.  Laniønik Riæner T, Wheeler MH. Melanin biosynthesis in the fungus Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus). Can J Microbiol 2003; 49: 110-119.
27. Thompson JE, Basarab GS, Andersson A et al. Trihydroxynaphthalene reductase from Magnaporthe grisea: Realization of an active center inhibitor and elucidation of the kinetic mechanism. Biochemistry 1997; 36: 1852-1860
28.  Kihara J, Moriwaki A, Ito M et al. Expressin of THR1, a 1,3,8-trihydroxynaphthalene reductase gene involved in melanin biosynthesis in the phytopathogenic fungus Bipolaris oryzae, is enhanced by near-ultraviolet radiation. Pigment Cell Res 2004; 17: 15-23.
29. Jordan DB, Basarab GS, Liao DI et al. Structure-based design of inhibitors of the rice blast fungal enzyme trihydroxynaphthalene reductase. J Mol Graph Model 2001; 19: 434-447.
30.  Kurahashi Y, Sakawa S, Kinbara T et al. Biological activity of carpropamid (KTU 3616): A new fungicide for rice blast disease. Nipp Noy Gakka 1997; 22 (2): 108-112.
farm vestn 2008; 59 251