270 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 271Zgodovina slovenskega naravoslovja • Fran Dobovšek (1876-1915), spregledani naravoslovec Bakterije, zelene tovarne antioksidantov • Molekularna biologija in biotehnologija prazne škatle in entomološki pribor. Nekaj tednov kasneje je Deželni odbor vojvodine Kranjske odobril odkup entomološke zbirke Frana Dobovška za 2.000 kron. Zbirka, če- prav nekoliko »osiromašena«, se tako še da- nes nahaja v Prirodoslovnem muzeju Slove- nije (Černila, 2003). Ohranjena Dobovškova zbirka metuljev šteje več tisoč primerkov v 35 škatlah (www.pms-lj.si). Kratkotrajno naravoslovno delovanje Frana Dobovška je bilo kljub tragični smrti izje- mno plodno. Z nekaterimi novimi spoznanji iz arhivskih dokumentov in fotografijami ga želimo postaviti na pravo in zasluženo me- sto v slovenskem naravoslovju, muzealstvu in navsezadnje v družbi. Literatura in viri: Arhiv Narodnega muzeja Slovenije (arhivski dokumenti od leta 1907 do 1917 in fotografije), digitalne verzije hrani Prirodoslovni muzej Slovenije. Černila, M., 2003: Urejanje zbirk metuljev (red Lepidoptera) Prirodoslovnega muzeja Slovenije. Argo, 46 (1): 36-39. Kos, M., 2014: Deželni muzej in prva svetovna vojna. Argo, 57 (1): 34-45. Mantuani, J., Sajovic, G., 1915: Fran Dobovšek (Nekrolog). Carniola (nova izdaja), 6: 241-244. Rebel, H., 1911: Lepidopteren aus dem Gebiete des Triglav und der Crna Prst in Krain. III. Nachtrag. Jahresberichte Wiener entomologischer Verein, 21: 111- 147. Sajovic, G., 1909: Bericht über die naturhistorische Abteilung. Bericht für das Jahr 1908. Landesmuseum Rudolfinum in Laibach, 17-20. Sajovic, G., 1913: Herpetologični zapiski za Kranjsko. Carniola, 1-2: 22-52. Schawerda, K., 1922: Zwölfter Nachtrag zur Lepidopterenfauna Bosniens und der Herzegowina. Verhandlungen der Zoologisch-Botanischen Gesellschaft in Wien. Frueher: Verhandlungen des Zoologisch- Botanischen Vereins in Wien, 71: 145-170. Seidl, F., 1912: Širokočelni los (Alces latifrons) v starejši diluvijalni naplavini Ljubljanskega barja. Carniola, 4: 261-274. Staut Turk, T., 1974: Zoologi osrednje Slovenije (bivše Vojvodine Kranjske) do l. 1918. Diplomska naloga. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Biološki oddelek, 89 str. www.pms-lj.si/si/raziskovanje- in-zbirke/zbirke/zbirke-nevretencarjev. Nekatere objavljene Dobovškove fotografije naravoslovnih primerkov, med katerimi je tudi na terenu posneta črnica (levo). V sredini je tabla z nočnimi metulji, ki jih je večinoma zbral sam, na desni pa spodnja čeljust ledenodobnega losa z Viča. Fran Dobovšek je med svojimi ekskurzijami fotografiral tudi živali v naravi, kar je bilo v tistem času velika redkost na Kranjskem. Vir: Muzejski časopis Carniola. Na kaj najprej pomislite, ko vam kdo ome- ni bakterije? Na moteče vnetje med lični- kom in kočnikom zgoraj desno? Na skisano mleko, ki je nastalo v šalici pozabljene bele kave? Obe asociaciji sta razumljivi, saj sta pogost pojav v našem vsakdanjem življenju. Hkrati pa nam ponazorita, da so bakteri- je vsenavzoči organizmi, ki se uspejo hitro razrasti v raznovrstnih gojiščih. Čeprav na bakterije ponavadi gledamo kot na zlovešče organizme, pa lahko prav lastnost njihovega uspešnega razraščanja s pridom uporabimo v različne človeku koristne namene. Ali ve- ste, da bakterije lahko spremenimo v celič- ne tovarne? In jih tako uporabimo za sin- tezo različnih molekul, od zdravil pa celo do gradbenega materiala? V tem prispevku bova opisala, kako smo genetsko spremenili bakterije, da so za nas proizvajale rumene in oranžne pigmente, ter zakaj te molekule lahko dosegajo stokratno vrednost čistega zlata. Klorofil, najbolj razširjeni pigment Večina ljudi naravo povezuje z zeleno bar- vo. A kaj barva sploh je? Z besedo »barva« označujemo lastnost snovi, ki jo zaznajo na- še oči, ko na njih posveti svetloba. V slo- venščini s to besedo opisujemo tudi snov, ki jo uporabljamo za nanos barvne snovi (»barva za les«). To, da je barva obarvana, pa je posledica vsebnosti pigmentov, pri če- mer različni pigmenti določajo različno bar- vo neke snovi. Če je barva le lastnost snovi, pa so pigmenti molekule. Te molekule so takšne, da odbijajo svetlobo točno določenih valovnih dolžin v vidnem delu spektra, kar zaznamo v različni obarvanosti snovi. Izmed vseh organizmov, ki poseljujejo planet, lah- ko največ zaslug za barvitost pripišemo rast- linam, ki vsebujejo velik nabor pigmentnih molekul. Izmed vseh naravnih pigmentov, ki obstajajo, je največ klorofila. Ta moleku- la ne absorbira v zelenem delu spektra, kar pomeni, da ga naše oči zaznajo kot zelene- ga, kar daje rastlinam značilno barvo, ki jo povezujemo z naravo. Klorofil je molekula, ki jo rastline potrebu- jejo za izvedbo fotosinteze – procesa, kjer iz vode in ogljikovega dioksida ustvarjajo sladkorje. Pri tem kot stranski produkt na- staja kisik, ki ga ostali organizmi tega pla- neta (glive in živali) porabljamo za dihanje. Fotosinteza je energetsko precej potraten proces, kar pomeni, da rastline potrebuje- jo precej energije za njeno izvedbo. In prav »lovljenje« svetlobe oziroma natančneje fo- tonov je glavna naloga klorofila, ki z veza- vo fotonov omogoči delovanje fotosintetskih središč. Zato se zdi razumljivo, da so rastli- ne tako zelene, saj jim le zadostna količina klorofila lahko omogoči ustrezno izvedbo fotosinteze in posledično zadostne količine ustvarjenega sladkorja za preživetje. Vendar pa tudi klorof il ni tako magična molekula, kot se zdi. Če pogledamo celotni spekter vidne svetlobe (to je med valovnimi dolžinami približno 380 nanometrov in 740 nanometrov), lahko ugotovimo, da kloro- fil ne uspe ujeti fotonov celotnega spektra, temveč le tiste, ki imajo valovno dolžino okrog 430 oziroma 660 nanometrov, zato večina ostalega dela vidnega spektra osta- ne neizkoriščena. Da rastline lahko ujamejo tudi fotone nepokritih valovnih dolžin, naj- demo v listih tudi dodatne pigmente, ki jim glede na njihov namen rečemo tudi pomož- ni pigmenti. Njihova naloga je, da ujamejo fotone tistih valovnih dolžin, ki jih klorofil ne more, in jih preusmerijo v fotosintetska središča. Pomožne pigmente kopenskih rastlin raz- delimo v dve večji skupini, ki jih enostavno ločimo po barvi: rumeni pigmenti spadajo v družino ksantofilov (ksanto pomeni v grščini rumen), oranžni pa v družino karotenov (kar Bakterije, zelene tovarne antioksidantov Marina Klemenčič, Aleš Ručigaj 272 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 273Bakterije, zelene tovarne antioksidantov • Molekularna biologija in biotehnologijaMolekularna biologija in biotehnologija • Bakterije, zelene tovarne antioksidantov izvira iz latinskega izraza za korenje carota). Ksantofili so odgovorni za rumeno barvo paprik, koruze in buč, karoteni pa dajejo značilno barvo korenju, sladkemu krompirju in papaji. Čeprav so vsi ti našteti plodovi, pa je treba vedeti, da so ravno ksantofili in karoteni v listih odgovorni za pisano jesen v gozdu. Od kod barvitost jesenskih gozdov? Listi večine listopadnih dreves so zaradi prevladujočega pigmenta klorof ila zeleni. Najdemo ga v rastlinski celici v organelu, ki mu rečemo kloroplast. Vendar pa rastlina za uspešno lovljenje fotonov vidne svetlobe poleg klorofila vsebuje še rumene (ksanto- file) in oranžne pigmente (karotene). Teh je v listu precej manj kot klorofila, zaradi če- sar njegova barva pomladi in poleti prevla- da nad ostalimi. Ko pa se približuje jesen, mora rastlina poskrbeti, da ima zadostne zaloge hranil za zimske čase, ko je svetlo- be precej manj in je zato sinteza sladkorjev s fotosintezo omejena. Posledično pride do razgradnje klorofila in fotosintetskih središč, ne pa tudi do razgradnje oranžnih in rume- nih pomožnih barvil. Ti so torej v listih prisotni ves čas, a se njihova barva razkrije šele jeseni in ostane na listih, dokler ti ne padejo z drevesa. Izjema teh barvnih spek- trov so rdeči listi, ki so posledica prisotnos- ti barvila antocianina, ki med drugim daje značilno vijolično barvo vijolicam in modro barvo borovnicam. Tega pigmenta listi ne ustvarjajo vse leto, temveč samo jeseni, ko naj bi imel zaščitno vlogo proti mrazu in se z njegovo sintezo rastlina pripravi na zimo (Hughes in sod., 2010). Pigmenti, človeku koristne molekule Pigmenti niso le lovilci svetlobe pri rastli- nah. Te molekule namreč opravljajo podob- no vlogo tudi pri človeku. Omenjeni karo- ten je molekula, iz katere nastane vitamin A. Gre za vitamin, ki si ga naše telo ne more ustvariti sámo in prav pomanjkanje vitamina A je v nerazvitih državah glavni razlog za slepoto. Zadostne količine te- ga vitamina lahko pridobimo le z ustrezno prehrano. Vitamin A se v mrežnici (retini) očesa nahaja v obliki retinala in se povezuje s proteinom opsinom. Kompleksu retinala in opsina rečemo rodopsin, njegova vloga pa je absorbiranje svetlobe. Poleg dobro znanega vitamina A pa človeku niso koristni le karoteni, temveč tudi ksan- tofili. Eden izmed najbolj znanih ksantofi- lov je molekula zeaksantin. Povpraševanje po tej rumeno obarvani molekuli se strmo povečuje, saj vse več raziskav potrjuje njego- vo pomembno antioksidativno vlogo. Upo- rabljajo ga kot aditiv v živilski industriji in kot aditiv živalski krmi (na primer kot oja- čevalec barve ribjega mesa ali pigmentacije jajčnega rumenjaka), pa tudi v kozmetiki in farmacevtski industriji. Zeaksantin po- staja tudi popularni prehrambeni dodatek, zelo veliko ga je v jagodah »goji« (navadna kustovnica, Lycium barbarum). Vrednost trga zeaksantina v letu 2020 naj bi znašala več deset milijonov ameriških dolarjev. Za pri- merjavo: en gram zelo čistega karotena ima ceno okrog sto evrov, medtem ko bi morali za enako čisti gram zeaksantina odšteti več tisoč evrov. Zeaksatin sicer lahko izoliramo iz zelenjave, a so izkoristki s tehnološkega vidika prenizki, organska sinteza pa zahte- va uporabo topil in procesov, ki so okolju in končnemu potrošniku neprijazni. Vprašanje torej je, kako pridobiti velike količine zeak- santina? Prenos genov iz paprik v bakterije Do odgovora na zastavljeno vprašanje lahko pridemo z uporabo metod in znanj moleku- larne biologije in tehnologije rekombinantne DNA. Najprej moramo sicer vedeti, kako pride do »priprave« zeaksantina v paprikah ali pa jagodah »goji«. Za sintezo molekul so v celici največkrat odgovorne specializirane beljakovine (proteini), ki jim rečemo encimi. Ti delujejo kot katalizatorji kemijskih reak- Spekter vidne svetlobe ter absorpcijski spektri obeh klorofilov in karotenoidov, iz katerih je razvidno, da klorofila ne absorbirata pri valovni dolžini okrog 550 nanometrov. Ta valovna dolžina ustreza zeleni barvi, ki se od listov torej odbije, kar rastlinam daje prevladujočo zeleno barvo. Da bi dokazali, da se v rastlinah kljub prevladujoči zeleni barvi nahajajo tudi drugi pigmenti, pa lahko izvedemo tekočinsko kromatografijo, ki bi razkrila še prisotnost pomožnih pigmentov, kot so rumeni ksantofili in organžni karoteni. Barve jesenskih listov in prevladujoče pigmentne molekule. 272 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 273Bakterije, zelene tovarne antioksidantov • Molekularna biologija in biotehnologijaMolekularna biologija in biotehnologija • Bakterije, zelene tovarne antioksidantov izvira iz latinskega izraza za korenje carota). Ksantofili so odgovorni za rumeno barvo paprik, koruze in buč, karoteni pa dajejo značilno barvo korenju, sladkemu krompirju in papaji. Čeprav so vsi ti našteti plodovi, pa je treba vedeti, da so ravno ksantofili in karoteni v listih odgovorni za pisano jesen v gozdu. Od kod barvitost jesenskih gozdov? Listi večine listopadnih dreves so zaradi prevladujočega pigmenta klorof ila zeleni. Najdemo ga v rastlinski celici v organelu, ki mu rečemo kloroplast. Vendar pa rastlina za uspešno lovljenje fotonov vidne svetlobe poleg klorofila vsebuje še rumene (ksanto- file) in oranžne pigmente (karotene). Teh je v listu precej manj kot klorofila, zaradi če- sar njegova barva pomladi in poleti prevla- da nad ostalimi. Ko pa se približuje jesen, mora rastlina poskrbeti, da ima zadostne zaloge hranil za zimske čase, ko je svetlo- be precej manj in je zato sinteza sladkorjev s fotosintezo omejena. Posledično pride do razgradnje klorofila in fotosintetskih središč, ne pa tudi do razgradnje oranžnih in rume- nih pomožnih barvil. Ti so torej v listih prisotni ves čas, a se njihova barva razkrije šele jeseni in ostane na listih, dokler ti ne padejo z drevesa. Izjema teh barvnih spek- trov so rdeči listi, ki so posledica prisotnos- ti barvila antocianina, ki med drugim daje značilno vijolično barvo vijolicam in modro barvo borovnicam. Tega pigmenta listi ne ustvarjajo vse leto, temveč samo jeseni, ko naj bi imel zaščitno vlogo proti mrazu in se z njegovo sintezo rastlina pripravi na zimo (Hughes in sod., 2010). Pigmenti, človeku koristne molekule Pigmenti niso le lovilci svetlobe pri rastli- nah. Te molekule namreč opravljajo podob- no vlogo tudi pri človeku. Omenjeni karo- ten je molekula, iz katere nastane vitamin A. Gre za vitamin, ki si ga naše telo ne more ustvariti sámo in prav pomanjkanje vitamina A je v nerazvitih državah glavni razlog za slepoto. Zadostne količine te- ga vitamina lahko pridobimo le z ustrezno prehrano. Vitamin A se v mrežnici (retini) očesa nahaja v obliki retinala in se povezuje s proteinom opsinom. Kompleksu retinala in opsina rečemo rodopsin, njegova vloga pa je absorbiranje svetlobe. Poleg dobro znanega vitamina A pa človeku niso koristni le karoteni, temveč tudi ksan- tofili. Eden izmed najbolj znanih ksantofi- lov je molekula zeaksantin. Povpraševanje po tej rumeno obarvani molekuli se strmo povečuje, saj vse več raziskav potrjuje njego- vo pomembno antioksidativno vlogo. Upo- rabljajo ga kot aditiv v živilski industriji in kot aditiv živalski krmi (na primer kot oja- čevalec barve ribjega mesa ali pigmentacije jajčnega rumenjaka), pa tudi v kozmetiki in farmacevtski industriji. Zeaksantin po- staja tudi popularni prehrambeni dodatek, zelo veliko ga je v jagodah »goji« (navadna kustovnica, Lycium barbarum). Vrednost trga zeaksantina v letu 2020 naj bi znašala več deset milijonov ameriških dolarjev. Za pri- merjavo: en gram zelo čistega karotena ima ceno okrog sto evrov, medtem ko bi morali za enako čisti gram zeaksantina odšteti več tisoč evrov. Zeaksatin sicer lahko izoliramo iz zelenjave, a so izkoristki s tehnološkega vidika prenizki, organska sinteza pa zahte- va uporabo topil in procesov, ki so okolju in končnemu potrošniku neprijazni. Vprašanje torej je, kako pridobiti velike količine zeak- santina? Prenos genov iz paprik v bakterije Do odgovora na zastavljeno vprašanje lahko pridemo z uporabo metod in znanj moleku- larne biologije in tehnologije rekombinantne DNA. Najprej moramo sicer vedeti, kako pride do »priprave« zeaksantina v paprikah ali pa jagodah »goji«. Za sintezo molekul so v celici največkrat odgovorne specializirane beljakovine (proteini), ki jim rečemo encimi. Ti delujejo kot katalizatorji kemijskih reak- Spekter vidne svetlobe ter absorpcijski spektri obeh klorofilov in karotenoidov, iz katerih je razvidno, da klorofila ne absorbirata pri valovni dolžini okrog 550 nanometrov. Ta valovna dolžina ustreza zeleni barvi, ki se od listov torej odbije, kar rastlinam daje prevladujočo zeleno barvo. Da bi dokazali, da se v rastlinah kljub prevladujoči zeleni barvi nahajajo tudi drugi pigmenti, pa lahko izvedemo tekočinsko kromatografijo, ki bi razkrila še prisotnost pomožnih pigmentov, kot so rumeni ksantofili in organžni karoteni. Barve jesenskih listov in prevladujoče pigmentne molekule. 274 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 275Molekularna biologija in biotehnologija • Bakterije, zelene tovarne antioksidantov Bakterije, zelene tovarne antioksidantov • Molekularna biologija in biotehnologija cij in iz začetnih snovi (reaktantov) pripravl- jajo končne molekule (produkte). Bakterije, kot je na primer najpogosteje uporabljeni laboratorijski sev Escherichia coli, same ne znajo proizvesti zeaksantina, vsebujejo pa že nekaj reaktantov, ki se porabljajo pri drugih metabolnih poteh. Bakterijo moramo torej reprogramirati tako, da ji dodamo encime, ki bodo v celici naravno prisotne reaktante spreminjale v želeni produkt (v našem pri- meru zeaksantin). Tega sicer ne naredimo tako, da dodamo celicam kar encime v obliki proteinov, am- pak jim v celice vrinemo zapis za te encime na ravni DNA, torej gene. To naredimo ta- ko, da zapise za encime vključimo v krožno DNA, ki ji rečemo vektor, saj omogoča pre- nos želene dedne informacije v gostiteljsko celico. Bakterije, ki imajo sedaj poleg svoje kromosomske DNA še našo, vektorsko, so gensko spremenjene. Ko bakterije rastejo in se delijo, prepisujejo tako svojo DNA kot tudi našo, na kateri je zapis za gene za sintezo zeaksantina. Na ta način se v veli- kih količinah v celicah ustvarjajo encimi, ki omogočajo nastanek tega produkta. Kako spremljati koncentracije nastalega pro- dukta, optimizirati rast bakterij ter še do- datno gensko spremeniti bakterije za dose- go večjih izkoristkov, je bil cilj projekta, ki smo ga to pomlad in poletje v partnerstvu s podjetjem AciesBio iz Ljubljane izvajali na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani. Pet genov in milijarda oranžnih bakterij Seveda nismo bili prvi, ki smo si želeli ustvariti bakterije, ki bi proizvajale zeaksan- tin. Zato smo lahko vektor, ki je vseboval gene za gene, ki sintetizirajo zeaksantin, kar naročili. Vektor je vseboval pet genov, ki so potrebni za sintezo zeaksantina: gen za pirofosfat sintazo (crtE), likopen ciklazo (crtY ), f itoen dehidrogenazo (crtI ), f itoen sintazo (crtB) in beta karoten hidroksilazo (crtZ) (Sun in sod., 1996). Poleg tega vek- torja smo uporabili tudi vektor brez zapisa za zadnji encim: ta v E. coli omogoča sinte- zo in kopičenje beta karotena. Oba vektorja smo s postopkom transformacije vnesli v ce- lice E. coli, ki smo jih nato gojili na agarnih ploščah pri sobni temperaturi. Da je bil prenos genov uspešen in da so bakterijske celice sintetizirale beta karoten in zeaksantin v velikih količinah, je bilo vidno že po nekaj dneh. Namesto bledo ru- menih kolonij gensko nespremenjenih E. coli so bile na ploščah vidne oranžne kolonije tistih celic, ki so sintetizirale beta karoten, in intenzivno rumene kolonije tistih, ki so sintetizirale zeaksantin. Tako kot vsi ostali pigmenti sta tudi beta karoten in zeaksantin molekuli, ki sta sla- bo topni v vodi in se zato v celici kopičita predvsem v membranah, ki jih tvori lipidni dvosloj. In prav to je eden izmed bistve- nih omejujočih dejavnikov takih molekul v bakterijah. Obe molekuli se kopičita v membranah, vgradnja zeaksantina v lipidni dvosloj pa poleg tega povečuje rigidnost ce- lične membrane. To pomeni, da je njegovo kopičenje omejeno, ko membrana doseže maksimalno rigidnost. Da bi zaobšli to te- žavo, smo si zamislili sistem, v katerem se zeaksantin ne kopiči le v membrani, temveč tudi v citoplazmi, ki je vodotopno okolje. Da bi to dosegli, smo morali v bakterijske celice, v katere smo vnesli biosintezno pot do zeksantina, dodati še gen za človeški protein glutation S-transferazo Pi (GSTP1), ki se pri človeku nahaja v rumeni pegi in veže dve molekuli zeaksantina (Bhosale in sod., 2004) Na ta način smo želeli doseči, da se del sintetiziranega zeaksantina z veza- vo na ta protein prenese tudi v citoplazmo, s čimer se poveča celična kapaciteta za ko- pičenje tega pigmenta in posledično njegova celokupna koncentracija v celici. Povečanje vsebnosti zeaksantina smo v ce- licah poskušali doseči tudi z naključno mu- tagenezo z ultravijolično svetlobo in dodat- nimi zapisi za beta karoten hidroksilazo. Vzporedno pa smo razvijali in optimizirali metodo za ekstrakcijo ter kvantif ikacijo koncentracije obeh pigmentov z uporabo različnih topil. Naravni gensko spremenjeni organizmi in biotehnologija Če dobro pomislimo, sta zeaksantin in beta karoten nadvse posebni molekuli in pigmen- ta za človeka. Oba imata namreč pomembno vlogo v vidu in nam tako pravzaprav omo- gočata, da ju vidimo. Kljub njuni pomembni vlogi tudi pri ostalih živalih pa je zanimivo, da teh molekul tudi živali ne znajo sinteti- zirati same, temveč jih lahko pridobimo le s hrano. Kot povsod pa tudi tu obstajajo po- sebne izjeme: žuželke, ki so gene za sintezo beta karotena uspele »prekopirati« od gliv s tako imenovanim procesom horizontalnega prenosa genov (Altincicek in sod., 2012). Nismo torej samo ljudje tisti, ki vidimo do- dano vrednost v teh molekulah! Ker pa nam horizontalni prenos genov (zaenkrat) še ni uspel, ostaja tako biotehnologija mikroorga- nizmov ključno področje nadaljnjega razvo- ja za pridobivanje teh pomembnih barvnih molekul. Literatura: Altincicek, B., Kovacs, J. L., Gerardo, N. M., 2012: Horizontally transferred fungal carotenoid genes in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Biology Letters,  8 (2): 253–257. https://doi.org/10.1098/ rsbl.2011.0704. Bhosale, P., Larson, A. J., Frederick, J. M., Southwick, K., Thulin, C. D., Bernstein, P. S., 2004: Identification and characterization of a Pi isoform of glutathione S-transferase (GSTP1) as a zeaxanthin-binding protein in the macula of the human eye. Journal of Biological Chemistry, 279 (47): 49447–49454. https://doi. org/10.1074/jbc.M405334200. Hughes, N. M., Reinhardt, K., Field, T. S., Gerardi, A. R., Smith, W. K., 2010: Association between winter anthocyanin production and drought stress in angiosperm evergreen species. Journal of Experimental Botany, 61 (6): 1699–1709. https://doi.org/10.1093/jxb/erq042. Sun, Z., Gantt, E., Cunningham, F. X., 1996: Cloning and functional analysis of the beta-carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 271 (40): 24349–24352. https://doi.org/10.1074/ jbc.271.40.24349. Bakterije naravno vsebujejo molekulo dimetilpirofosfat, ki pa jo z dodatkom treh genov (crtE, crtB in crtI) lahko pretvorimo v rdeče obarvani likopen. Tega encim crtY lahko pretvori v beta karoten, prisotnost gena crtZ pa omogoči sintezo zeaksantina. Kopičenje beta karotena je tako vidno že na agarni plošči, na katerih rastejo bakterije E. coli. Na levi so vidne kolonije bakterij brez genov, ki omogočajo proizvodnjo beta karotena. Na desni plošči pa rastejo bakterije, ki imajo dodane gene za sintezo beta karotena. Ta se sintetizira v tolikšni meri, da se kolonije obarvajo značilno oranžno. 274 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 275Molekularna biologija in biotehnologija • Bakterije, zelene tovarne antioksidantov Bakterije, zelene tovarne antioksidantov • Molekularna biologija in biotehnologija cij in iz začetnih snovi (reaktantov) pripravl- jajo končne molekule (produkte). Bakterije, kot je na primer najpogosteje uporabljeni laboratorijski sev Escherichia coli, same ne znajo proizvesti zeaksantina, vsebujejo pa že nekaj reaktantov, ki se porabljajo pri drugih metabolnih poteh. Bakterijo moramo torej reprogramirati tako, da ji dodamo encime, ki bodo v celici naravno prisotne reaktante spreminjale v želeni produkt (v našem pri- meru zeaksantin). Tega sicer ne naredimo tako, da dodamo celicam kar encime v obliki proteinov, am- pak jim v celice vrinemo zapis za te encime na ravni DNA, torej gene. To naredimo ta- ko, da zapise za encime vključimo v krožno DNA, ki ji rečemo vektor, saj omogoča pre- nos želene dedne informacije v gostiteljsko celico. Bakterije, ki imajo sedaj poleg svoje kromosomske DNA še našo, vektorsko, so gensko spremenjene. Ko bakterije rastejo in se delijo, prepisujejo tako svojo DNA kot tudi našo, na kateri je zapis za gene za sintezo zeaksantina. Na ta način se v veli- kih količinah v celicah ustvarjajo encimi, ki omogočajo nastanek tega produkta. Kako spremljati koncentracije nastalega pro- dukta, optimizirati rast bakterij ter še do- datno gensko spremeniti bakterije za dose- go večjih izkoristkov, je bil cilj projekta, ki smo ga to pomlad in poletje v partnerstvu s podjetjem AciesBio iz Ljubljane izvajali na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani. Pet genov in milijarda oranžnih bakterij Seveda nismo bili prvi, ki smo si želeli ustvariti bakterije, ki bi proizvajale zeaksan- tin. Zato smo lahko vektor, ki je vseboval gene za gene, ki sintetizirajo zeaksantin, kar naročili. Vektor je vseboval pet genov, ki so potrebni za sintezo zeaksantina: gen za pirofosfat sintazo (crtE), likopen ciklazo (crtY ), f itoen dehidrogenazo (crtI ), f itoen sintazo (crtB) in beta karoten hidroksilazo (crtZ) (Sun in sod., 1996). Poleg tega vek- torja smo uporabili tudi vektor brez zapisa za zadnji encim: ta v E. coli omogoča sinte- zo in kopičenje beta karotena. Oba vektorja smo s postopkom transformacije vnesli v ce- lice E. coli, ki smo jih nato gojili na agarnih ploščah pri sobni temperaturi. Da je bil prenos genov uspešen in da so bakterijske celice sintetizirale beta karoten in zeaksantin v velikih količinah, je bilo vidno že po nekaj dneh. Namesto bledo ru- menih kolonij gensko nespremenjenih E. coli so bile na ploščah vidne oranžne kolonije tistih celic, ki so sintetizirale beta karoten, in intenzivno rumene kolonije tistih, ki so sintetizirale zeaksantin. Tako kot vsi ostali pigmenti sta tudi beta karoten in zeaksantin molekuli, ki sta sla- bo topni v vodi in se zato v celici kopičita predvsem v membranah, ki jih tvori lipidni dvosloj. In prav to je eden izmed bistve- nih omejujočih dejavnikov takih molekul v bakterijah. Obe molekuli se kopičita v membranah, vgradnja zeaksantina v lipidni dvosloj pa poleg tega povečuje rigidnost ce- lične membrane. To pomeni, da je njegovo kopičenje omejeno, ko membrana doseže maksimalno rigidnost. Da bi zaobšli to te- žavo, smo si zamislili sistem, v katerem se zeaksantin ne kopiči le v membrani, temveč tudi v citoplazmi, ki je vodotopno okolje. Da bi to dosegli, smo morali v bakterijske celice, v katere smo vnesli biosintezno pot do zeksantina, dodati še gen za človeški protein glutation S-transferazo Pi (GSTP1), ki se pri človeku nahaja v rumeni pegi in veže dve molekuli zeaksantina (Bhosale in sod., 2004) Na ta način smo želeli doseči, da se del sintetiziranega zeaksantina z veza- vo na ta protein prenese tudi v citoplazmo, s čimer se poveča celična kapaciteta za ko- pičenje tega pigmenta in posledično njegova celokupna koncentracija v celici. Povečanje vsebnosti zeaksantina smo v ce- licah poskušali doseči tudi z naključno mu- tagenezo z ultravijolično svetlobo in dodat- nimi zapisi za beta karoten hidroksilazo. Vzporedno pa smo razvijali in optimizirali metodo za ekstrakcijo ter kvantif ikacijo koncentracije obeh pigmentov z uporabo različnih topil. Naravni gensko spremenjeni organizmi in biotehnologija Če dobro pomislimo, sta zeaksantin in beta karoten nadvse posebni molekuli in pigmen- ta za človeka. Oba imata namreč pomembno vlogo v vidu in nam tako pravzaprav omo- gočata, da ju vidimo. Kljub njuni pomembni vlogi tudi pri ostalih živalih pa je zanimivo, da teh molekul tudi živali ne znajo sinteti- zirati same, temveč jih lahko pridobimo le s hrano. Kot povsod pa tudi tu obstajajo po- sebne izjeme: žuželke, ki so gene za sintezo beta karotena uspele »prekopirati« od gliv s tako imenovanim procesom horizontalnega prenosa genov (Altincicek in sod., 2012). Nismo torej samo ljudje tisti, ki vidimo do- dano vrednost v teh molekulah! Ker pa nam horizontalni prenos genov (zaenkrat) še ni uspel, ostaja tako biotehnologija mikroorga- nizmov ključno področje nadaljnjega razvo- ja za pridobivanje teh pomembnih barvnih molekul. Literatura: Altincicek, B., Kovacs, J. L., Gerardo, N. M., 2012: Horizontally transferred fungal carotenoid genes in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Biology Letters,  8 (2): 253–257. https://doi.org/10.1098/ rsbl.2011.0704. Bhosale, P., Larson, A. J., Frederick, J. M., Southwick, K., Thulin, C. D., Bernstein, P. S., 2004: Identification and characterization of a Pi isoform of glutathione S-transferase (GSTP1) as a zeaxanthin-binding protein in the macula of the human eye. Journal of Biological Chemistry, 279 (47): 49447–49454. https://doi. org/10.1074/jbc.M405334200. Hughes, N. M., Reinhardt, K., Field, T. S., Gerardi, A. R., Smith, W. K., 2010: Association between winter anthocyanin production and drought stress in angiosperm evergreen species. Journal of Experimental Botany, 61 (6): 1699–1709. https://doi.org/10.1093/jxb/erq042. Sun, Z., Gantt, E., Cunningham, F. X., 1996: Cloning and functional analysis of the beta-carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 271 (40): 24349–24352. https://doi.org/10.1074/ jbc.271.40.24349. Bakterije naravno vsebujejo molekulo dimetilpirofosfat, ki pa jo z dodatkom treh genov (crtE, crtB in crtI) lahko pretvorimo v rdeče obarvani likopen. Tega encim crtY lahko pretvori v beta karoten, prisotnost gena crtZ pa omogoči sintezo zeaksantina. Kopičenje beta karotena je tako vidno že na agarni plošči, na katerih rastejo bakterije E. coli. Na levi so vidne kolonije bakterij brez genov, ki omogočajo proizvodnjo beta karotena. Na desni plošči pa rastejo bakterije, ki imajo dodane gene za sintezo beta karotena. Ta se sintetizira v tolikšni meri, da se kolonije obarvajo značilno oranžno. 276 ■ Proteus 83/6 • Februar 2021 277Molekularna biologija in biotehnologija • Bakterije, zelene tovarne antioksidantov Mineraloška dediščina rudnika Sitarjevec (tretji del) • Mineralogija Slovarček: Pigment. Molekula, ki zaradi svoje struktu- re odbija svetlobo določene valovne dolžine, kar oko zazna kot spremembo v barvi. Kloroplast. Organel, prisoten samo v rast- linskih celicah, kjer poteka proces fotosinte- ze, s katerim rastline iz ogljikovega dioksida in vode ustvarjajo sladkorje. Pri tem procesu kot stranski produkt nastaja kisik. Tehnologija rekombinantne DNA. Nabor tehnik, ki jih lahko uporabimo, da združu- jemo genski material različnih organizmov, na primer bakterijskega in živalskega oziro- ma rastlinskega, s čimer ustvarimo zapise DNA, ki jih narava ne bi mogla ustvariti sama. Gen. Del DNA, ki se med prepisovanjem v katerikoli živi celici prepiše v RNA. Pona- vadi z besedo gen označujemo dele DNA, ki zapisujejo za protein. Plazmid. Krožna molekula DNA, ki jo ne- katere bakterije vsebujejo poleg kromosom- ske DNA. V laboratoriju plazmide lahko uporabljamo kot vektorje, prenašalce dednih informacij, med različnimi celicami. Citoplazma. Del celice, ki ga zaobjema ce- lična membrana. V bakterijskih celicah v citoplazmi najdemo DNA, morebitne plaz- mide, ribosome ter veliko ostalih proteinov. Pri živalih in rastlinah pa citoplazma vsebu- je tudi organele, ki v celicah opravljajo po- sebne funkcije (mitohondrij, endoplazemski retikulum in podobno). Dr. Marina Klemenčič in dr. Aleš Ručigaj sta docenta na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani. Marina Klemenčič je biokemik in raziskuje, kako potekajo molekularni mehnizmi, ki povzročijo nadzorovano smrt celic enostavnih organizmov, kot so bakterije in enocelične alge. Aleš Ručigaj je kemijski inženir in raziskuje, kako različne strukturne lastnosti hidrogelov, pripravljenih iz biopolimerov, vplivajo na hitrost sproščanja zdravilnih učinkovin iz njih. V dvojni, deveti in deseti številki v prej- šnjem 82. letniku in prvi številki letošnje- ga 83. letnika smo začeli obujati spomin na rudnik Sitarjevec v Litiji, v katerem je pridobivanje rude s prekinitvami trajalo več kot štiri stoletja. Sitarjevec je polimetalno rudno nahajališče z izrazito oksidacijsko cono v obliki železovega klobuka in z nižje ležečimi, bolj ali manj oksidiranimi rudnimi žilami in rudnimi telesi. Mineralno parage- nezo tega rudišča sestavljajo primarne rude in žilni minerali ter sekundarni minerali, ki nastajajo zaradi oksidacije primarnih mine- ralov. Trenutno je določenih petdeset raz- ličnih mineralov, vendar večina le v mikro- skopski obliki. Zaradi tega se v prispevku osredotočamo le na najbolj pogoste minerale in na tiste, ki nastopajo v makroskopskih kristalih. Sadra Ta značilni sekundarni oksidacijski mineral je tukaj dokaj redek, še posebej v lepo obli- kovanih kristalih. To lahko pripišemo od- sotnosti apnenca oziroma kalcita v rudniku. Najdemo jo na stenah rovov v obliki pre- vlek, ki jih sestavljajo drobni igličasti krista- li. Redki so primerki s kristali na limonitni podlagi, ki merijo do 6 milimetrov. Posa- mezni kristali z značilnim bisernim leskom na ploskvah pinakoida b{010} so do 0,5 mi- limetra debeli in imajo lističasto obliko, ki spominja na kristale sljud. Mnogo kristalov je zdvojčenih po dveh različnih zakonih. Nekateri so enostavni kontaktni dvojčki po ploskvi (100). Ti so podaljšani vzdolž dvoj- čične ravnine in zrcalno simetrični z ozirom na to ravnino. Tovrstne dvojčke poznamo pod nazivom »lastovičji rep«. Drugi tip dvojčenja so kristali, ki so zdvojčeni po plo- skvi (010), pri čemer so istočasno zasukani za 180 stopinj vzdolž kristalografske c-osi v skladu s tako imenovanim karlovarskim za- konom. Mineraloška dediščina rudnika Sitarjevec (tretji del) Mirjan Žorž, Igor Dolinar, Miha Jeršek, Mirijam Vrabec Oblika kristalov sadre (A). Risba B prikazuje (100)-dvojček oziroma »lastovičji rep«. Dvojčenje po karlovarskem zakonu rezultira v kristalih z različno orientacijo. Risba C prikazuje desno-, risba D pa levosučni dvojček. Kristalografski liki: a{100}, e{120}, g{ 01}, in k{ 011}.