31 PREDKLINI ČNE RAZISKA VE TAR ČNIH ZDRA VIL Prof. dr. Maja Čemažar, univ. dipl. biol. Onkološki inštitut Ljubljana Univerza na Primorskem, Fakulteta za vede o zdravju mcemazar@onko-i.si; maja.cemazar@fvz.upr.si IZVLE ČEK V prispevku so predstavljene predklini čne raziskave. Predklini čne raziskave zajemajo preu čevanje mehanizmov nastanka in razvoja raka ter bioloških in molekularnih zna čilnosti malignih celic in tumorjev. Poleg tega predklini čne raziskave preu čujejo tudi u činke razli čnih vrst zdravljenja ali njihovih kom- binacij na eksperimentalnih tumorjih laboratorijskih živali, s poudarkom na specifi čnosti, ki je pomembna pri razvoju in ovrednotenju tar čnih zdravil. Predstavljene so tudi translacijske raziskave, ki vklju čujejo prenos novih vrst zdravljenja v klini čno prakso in preu čevanje bioloških ozna čevalcev na velikem številu klini čnih vzorcev tumorjev z orodji genomike, proteomike, farmakogenomike in metabolomike z namenom iskanja novih terapevtskih tar č ter diagnosti čnih in napovednih dejavnikov. Pomen predklini čnih in translacijskih raziskav je predvsem v povezovanju znanja o biologiji tumorjev na molekularnem podro čju s klini čnim zdravlje- njem, ki pa je uspešno samo ob dobrem in produktivnem sodelovanju vseh raziskovalcev, predklinikov in klinikov. Klju čne besede: translacijska onkologija, celi čne kulture, živalski tumorski modeli UVOD Rak je bolezen, za katero je zna čilna nenadzorovana delitev celic in spo- sobnost teh celic, da vdirajo med druge celice z neposrednim vraš čanjem v lokalna tkiva (invazija) ali z migracijo celic na bolj oddaljena mesta (za- 32 sevanje). Te spremenjene biološke lastnosti rakavih celic so posledica po- škodb (mutacij) na DNA, predvsem v genih, ki nadzorujejo delitev, smrt in diferenciacijo celic. Te mutacije so lahko dedne ali pridobljene in vodijo v nenadzorovano delitev celic in nastanek tumorja. Izraz tumor (po latinsko »oteklina«) se nanaša na katerokoli nenormalno maso tkiva, ki je lahko ma- ligna (rakava) ali benigna (nerakava). Le maligni tumorji imajo sposobnost invazije v druga tkiva in zasevanja (Tannock et al., 2013). Karcinogeneza in lastnosti rakavih celic Rak je bolezen genov. Obi čajno mora priti do ve č mutacij, preden se nor- malna celica spremeni v rakasto. Proces vklju čuje tako protoonkogene kot tumor-supresorske gene, ki lahko nosijo zapis bodisi za proteine bodisi za molekule RNA (t. i. nekodirajo če molekule RNA), ki regulirajo prepisovanje genov in molekul mRNA, ki nosijo zapis za proteine (t. i. kodirajo či geni). Med najbolj prou čene gene, katerih mutacije vodijo do nastanka raka, spa- dajo protoonkogeni in tumor-supresorski geni, ki nosijo zapis za proteine (onkoproteine in tumor-supresorske proteine). Protoonkogeni nosijo zapise za proteine, ki sodelujejo pri prenosu signalov. Te beljakovine sodelujejo pri prenosu sporo čil celici ali drugim celicam, da je treba skozi proces delitve (mitoza in citokineza). Ko mutirajo, postanejo onkogeni in pošiljajo nepravilne signale, kar lahko vodi do prekomerne de- litve celice. Protoonkogeni so ve činoma molekule, ki sodelujejo v signalnih poteh; lahko so rastni faktorji ali receptorji rastnih faktorjev (HER2/neu, ErbB2, PDGF), molekule, ki prenašajo signale (ras in src), transkripcijski faktorji (myc, fos in jun) ali protoonkogeni, ki kodirajo antiapoptoske pro- teine (Bcl-2 ali Mdm2). Prav ti proteini so glavne tar če, proti katerim razvi- jamo tar čna zdravila. Pomembno pa je seveda poznati natan čne mehanizme signalnih poti, da ima z zdravilom povzro čena inhibicija res u činek na delo- vanje rakave celice. Tumor-supresorski geni nosijo zapis za proteine, ki zaustavijo ali upo časnijo proces celi čne delitve, z namenom, da se popravi DNA. Njihovo izražanje obi čajno spodbudijo signali, ki sporo čijo, da je prišlo do poškodbe DNA. Mutacija lahko prizadene sam tumor-supresorski gen ali pa signalno pot, ki jo ta aktivira, zato je ovirano popravilo DNA. Primeri tumor-supresorskih genov so p53, RB1, APC in BRCA1 (Weinberg, 2013; Tannock et al., 2013). 33 Med karcinogenezo rakave celice pridobijo mnogo lastnosti, po katerih se razlikujejo od normalnih celic. Poznavanje teh specifi čnih lastnosti ter celic, proteinov in molekul RNA, ki so vpleteni v te spremenjene procese (lastnosti), nam omogo ča, da razvijemo tudi ustrezna zdravila proti tem spremenjenim lastnostim tumorskih celic oz. molekulam (Slika 1) (Hanahan, Weinberg, 2011). Slika 1: Lastnosti tumorskih celic in tar čna zdravila (prirejeno po Hanahan, Weinberg, 2011). Predklini čne raziskave Eksperimentalna onkologija se ukvarja z raziskavami raka na predklini čnem nivoju. Preu čuje mehanizme nastanka in razvoja raka, biološke in moleku- larne zna čilnosti malignih celic in tumorjev ter u činke razli čnih vrst zdra- vljenja ali njihovih kombinacij na eksperimentalnih tumorjih laboratorijskih živali. Tako se ve čina znanja o biologiji tumorjev zbira na predklini čnem 34 nivoju. Za uvedbo novih vrst zdravljenj v klini čno onkologijo in njihovo rutinsko uporabo pa je potreben prenos znanja iz predklinike s pomo čjo na- črtovanih klini čnih raziskav. Ta prenos znanja se izvaja s translacijskimi raz- iskavami (Slika 2). Nobena klini čna raziskava, ki uvaja novo zdravljenje, ne more dobiti privolitve strokovnih in eti čnih komisij, če nima trdnih dokazov v predklini čnih raziskavah o potencialnem u činku tudi na ljudeh. Mnoge translacijske raziskave pa potekajo tudi na biološkem materialu zdravljenih bolnikov, tako da preu čujejo biološke ozna čevalce ali molekularne mehaniz- me in s tem razloge za uspešnost ali neuspešnost zdravljenja (Serša, 2009). S takimi raziskavami tudi preu čujemo in dolo čamo potencialne tar če (muti- rani, spremenjeni proteini), proti katerim razvijamo zdravila. Slika 2: Veriga raziskav v onkologiji, VIR: lasten. Zato je vloga eksperimentalne predklini čne onkologije nepogrešljiva za prenos znanja o biologiji malignih celic v klini čno testiranje in prakso. Za dobro sodelovanje med »eksperimentalci« (biologi, kemiki, mikrobiologi, farmacevti itd.) in klini čnimi onkologi je potrebno medsebojno poznavanje področij delovanja. Predkliniki morajo imeti dovolj znanja o klini čnih pro- blemih v onkologiji, da lahko zastavijo raziskave, ki so klini čno pomembne, 35 kliniki pa osnovna znanja o biologiji raka in predklini čnih testih, da lahko na osnovi njihovih izsledkov na črtujejo klini čne raziskave. Ravno sodelo- vanje, zaupanje in raziskovalni nemir je tisto, kar je gonilna sila napredka v onkologiji. Predklini čne raziskave potekajo na razli čnih bioloških vzorcih bolnikov, ce- li čnih kulturah in laboratorijskih živalih. Molekularnobiološke metode, ki jih uporabljamo pri rakavih boleznih za preu čevanje karcinogeneze, dolo čevanje potencialnih tar č in ugotavljanje učinkov specifi čnega zdravljenja, so (Tannock et al.,2013): A. Kromosomske analize rakavih celic v primerjavi z normalnim človeškim kariotipom:  spektralna kariotipizacija (SKY in FISH). B. Molekularne analize, ki obsegajo:  sekveniranje DNA in dolo čanje mutacij,  kvalitativno in kvantitativno dolo čevanje genov: PCR in PCR v realnem času (qPCR),  analize polimorfi zmov posameznih nukleotidov: SNP (angl. single nucleotid polymorphism),  hibridizacijo nukleinskih kislin, uporabo restrikcijskih encimov in manipulacijo genov,  ustvarjanje gensko spremenjenih klonov: genska transfekcija in mutageneza ter  funkcionalno inaktivacijo genov na razli čnih nivojih izražanja. C. Genomske metode:  fl uorescen čna in situ hibridizacija (FISH),  primerjalna genomska hibridizacija (CHG),  mikromreže za dolo čevanje genske ekspresije (hibridizacija). D. Proteinske metode:  proteinske mikromreže (imunski odtisi), ekspresija proteinov (metode ELISA),  analiza tkivnih rezin (histološke, histopatološke in imunohistološke metode),  analiza posameznih celic (citopatološke in imunocitološke metode), 36  X-žarki – rentgenska analiza in nuklearna magnetna resonanca proteinskih struktur,  encimske aktivnosti. Te metode lahko izvajamo neposredno na vzorcih, pridobljenih od bolnikov (biopsije, histološki vzorci, primarne celi čne kulture), ali pa na trajnih ce- li čnih kulturah in vitro in tumorskih modelih in vivo (Hau, 2003; Workman et al., 2010). Tako imenovane in vitro raziskave omogo čajo gojenje razli čnih vrst celic v kulturah, kar zagotavlja homogen sistem (enake celice) v izoliranih pogojih, brez vplivov fi zioloških dejavnikov organizma. Celi čne kulture, predvsem humanih tumorjev, so nepogrešljivo orodje pri predklini čnih raziskavah o raku. Za zelo veliko celi čnih kultur namre č natan čno vemo, kateri geni so mutirani, in tako lahko zelo natan čno spremljamo u činek dolo čenega tar č- nega zdravila na neko signalno pot, za katero vemo, kateri proteini v tej si- gnalni poti so mutirani. Najnovejše metode z uporabo tehnologije CRISPR/ Cas9 pa nam omogo čajo pripravo celi čnih linij s to čno usmerjenimi muta- cijami, tako da lahko še bolj natan čno spremljamo mehanizme delovanja tar čnih zdravil na posamezne signalne poti (Sander, Joung, 2014). Naslednji višji nivo od celi čnih kultur so tumorski modeli in vivo na laboratorijskih živalih, kjer ugotavljamo tako sistemske spremembe kot tudi protitumorsko učinkovitost. Na voljo je vrsta mišjih in humanih tumorskih modelov, ki jih lahko presadimo v razli čne organe laboratorijskih živali, najprimernejše pa je ortotopi čno presajanje (v organ, iz katerega tumor primarno izhaja). Kot laboratorijske živali najve čkrat uporabljamo laboratorijske miši, v manjši meri podgane, pa tudi praši če, pse, ma čke in opice. Za presajanje humanih tumorskih celi čnih linij v laboratorijske miši uporabljamo imunsko zavrte živali (gole miši in SCID-miši). Namen preizkušanja u činkovin na laborato- rijskih živalih je čim bolj se približati pogojem in razmeram, ki so prisotne pri humanih tumorjih, z upoštevanjem razlik v fi ziologiji. Na čelo 3R (reduc- tion, refi nement in replacement) moramo upoštevati pri vseh raziskavah na živalih. Posebno pozornost moramo posvetiti na črtovanju poskusov (pilotne študije, nasvet statistika, u čenje dela z živalmi in pravilna dokumentacija), napovedovanju in prepoznavanju stranskih u činkov, dolo čevanju stopnje bole čine in stresa, poznavanju biologije tumorjev, čim bolj humanemu izbo- ru postopkov, stalnemu pregledovanju živali, dokumentaciji in objavljanju. Seveda pa je treba za raziskave na laboratorijskih živalih pridobiti vsa ustre- zna dovoljenja (Ministrstva za kmetijstvo in okolje in Republiške eti čne ko- 37 misije za poskuse na živalih). Teste, ki jih uporabljamo za dolo čevanje pro- titumorskega u činka, razdelimo na: test klonogenosti, test zaostanka rasti in test lokalnega nadzora rasti tumorjev. Bolj pomembna kot absolutna ob ču- tljivost tumorskih celic na dolo čeno zdravljenje pa je relativna ob čutljivost v primerjavi z ob čutljivostjo normalnih tkiv. Teste, s katerimi ovrednotimo občutljivost normalnih tkiv, delimo na teste klonogenosti in teste, ki ovre- dnotijo funkcionalnost tkiv (Hau, 2003; Workman et al., 2010). ZAKLJU ČEK Z rezultati poskusov, ki jih opravimo na predklini čnem nivoju, kjer doka- žemo, da je tar čno zdravilo specifi čno (res cilja tar čo, proti kateri je bilo razvito), u činkovito (ima dober protitumorski u činek) in ne povzro ča neže- lenih stranskih u činkov (nima oz. ima minimalen u činek »off-target«), lahko za čnemo pripravljati t. i. translacijske raziskave, ki so most med bazi čnimi in klini čnimi raziskavami in omogo čajo vstop novim, tar čnim zdravilom v klini čno uporabo. LITERATURA Hanahan D, W einberg RA. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 201 1;144:64674. Hau J. Animal models. In: Hau J, Van Hoosier GL, eds. Handbook of Laboratory Animal Science, 2nd ed. Volume II: Animal models. Boca Raton: CRC p ress; 2003: 1–9. Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 2014;32(4):347-55. Serša G, Čufer T, Sadikov A. Predklini čne, klini čne in translacijske raziskave ter statistika v onkoloških raziskavah. In Novakovi ć S, Jezeršek Novakovi ć B, Strojan P, Žgajnar J, eds. Onkologija. Ljubljana: Mladinska knjiga; 2009: 74-8 3. Tannock I, Hill R, Bristow R, Harrington L. The Basic Science of Oncology, Fifth Edition. USA:Mc Graw Hill Education; 2013. Weinberg AR. The Biology of Cancer, 2nd Edition. USA:Garland Science; 2013. 38 Workman P, Aboagye EO, Balkwill F, Balmain A, Bruder G, Chaplin D J, Double JA, Eve- ritt J, Farningham DAH, Glennie MJ, Kelland LR, Robinson V, Stratford IJ, Tozer GM, Watson S, Wedge SR, Eccles SAl. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Brit J Cancer. 2010;102:1555–77.