UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Dorian DOLANC MERITVE CITOSOLNE KONCENTRACIJE CAMP IN L-LAKTATA V PODGANJIH ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 V KULTURI DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Dorian DOLANC MERITVE CITOSOLNE KONCENTRACIJE CAMP IN L-LAKTATA V PODGANJIH ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 V KULTURI DOKTORSKA DISERTACIJA MEASUREMENTS OF CYTOSOLIC CONCENTRATION OF CAMP AND L- LACTATE IN CULTURED RAT ASTROCYTES AND 3T3 CELLS DOCTORAL DISERTATION Ljubljana, 2022 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa Komisije za doktorski študij Univerze v Ljubljani z dne 4.2.2020 je bilo potrjeno, da kandidat izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na Interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Bioznanosti, znanstveno področje Znanosti o celici. Za mentorja je bil imenovan prof. dr. Robert Zorec. Za somentorico je bila imenovana izr. prof. dr. Helena H. Chowdhury. Poskuse za doktorsko disertacijo sem opravljal na Inštitutu za patološko fiziologijo, Zaloška 4, 1000 Ljubljana, v Laboratoriju za nevroendokrinologijo-molekularna celična fiziologija in v prostorih Celica, biomedicinski center d.o.o., Tehnološki park 24, 1000 Ljubljana. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Marko KREFT Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Peter VERANIČ Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biologijo celice Član: prof. dr. Toni PETAN Inštitut "Jožef Stefan", Odsek za molekularne in biomedicinske znanosti Datum zagovora: Dorian Dolanc II Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ŠD Dd DK 577(043.3) KG Astrociti, celice 3T3, Laktat, cAMP, GPCR, GPR27, FRET AV DOLANC, Dorian, magister mikrobiologije SA ZOREC, Robert (mentor), CHOWDHURY H., Helena (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Bioznanosti, znanstveno področje Znanost o celici LI 2022 IN MERITVE CITOSOLNE KONCENTRACIJE CAMP IN L-LAKTATA V PODGANJIH ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 V KULTURI TD Doktorska disertacija OP XI, 90 str., 8 pregl., 22 sl., 87 vir. IJ sl JI sl/en AI Z G-proteini sklopljeni receptorji (GPCR) so transmembranski proteini med katere spada več kot 800 receptorjev. Pri ljudeh je ena tretjina le-teh tarča odobrenih zdravil. V tem delu smo raziskali GPRB, GPCR sirota, ki spada v družino super ohranjenih receptorjev, izraženih v možganih, z neznano funkcijo. Citosolne ravni L-laktata, končnega produkta aerobne glikolize, smo merili z nanosenzorjem Laconic, ki temelji na metodi FRET. V posameznih embrionalnih celicah divjega tipa (WT) 3T3 je uporaba agonistov Smart009 in Smart075, ter molekule 8535 (1 µM), nadomestnega agonista, za katerega je znano, da aktivira GPRB, povzročila povečanje koncentracije L-laktata. Podobno povečanje je bilo zabeleženo v primarnih astrocitih podgan, nevroglialnih celic, ki vsebujejo glikogen in izražajo encime aerobne glikolize. Pri celicah 3T3, ki niso izražale GPRB (3T3KOB), je bilo povečanje L-laktata, ki ga povzročata agonista Smart009 in 8535, zmanjšano v primerjavi s kontrolami WT. V celicah 3T3KOB smo povečanje L-laktata po stimulaciji ponovno vzpostavili s pomočjo plazmida, ki nosi GPRB. Ti rezultati kažejo, da stimulacija GPR27 poveča aerobno glikolizo in proizvodnjo L-laktata v celicah 3T3 in astrocitih. Spremljali smo tudi podcelično dinamiko L-laktata in cAMP in ugotovili, da stimulacija z agonisti za GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v znotrajcelični porazdelitvi L-laktata in cAMP. III Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) DN Dd DC 577(043.3) CX Astrocytes, 3T3 cells, Lactate, cAMP, GPCR, GPR27, FRET AU DOLANC, Dorian, master of microbiology AA ZOREC, Robert (supervisor), CHOWDHURY H., Helena (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, Scientific field Cell Sciences PY 2022 TI MEASUREMENTS OF CYTOSOLIC CONCENTRATION OF CAMP AND L- LACTATE IN CULTURED RAT ASTROCYTES AND 3T3 CELLS DT Doctoral disertation NO XI, 90 p., 8 tab., 22 fig., 87 ref. LA sl AL sl/en AB G-protein coupled receptors (GPCRs) are transmembrane proteins that include more than 800 receptors. One third of these are the target of approved drugs in humans. In this work, we investigated GPRB, an orphan GPCR belonging to a family of super-preserved receptors expressed in the brain with unknown function. The cytosolic levels of L-lactate, the end product of aerobic glycolysis, were measured with a Laconic nanosensor based on the FRET method. In individual wild-type (WT) 3T3 embryonic cells, the use of the agonists Smart009 and Smart075, and molecule 8535 (1 µM), a replacement agonist known to activate GPRB, resulted in an increase in L-lactate concentration. A similar increase was observed in primary rat astrocytes, glycogen-containing neuroglial cells expressing aerobic glycolysis enzymes. In 3T3 cells that did not express GPRB (3T3KOB), the increase in [lactate]i caused by the Smart009 and 8535i agonists was reduced compared to WT controls. In 3T3KOB cells, the increase in L-lactate was restored after stimulation with a GPRB-expressing plasmid. These results suggest that GPR27 stimulation increases aerobic glycolysis and L-lactate production in 3T3 cells and astrocytes. We also monitored the subcellular dynamics of L-lactate and cAMP and found that stimulation with GPCR agonists induces spatially heterogeneous changes in the intracellular distribution of L-lactate and cAMP. IV Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ..................................................... III KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD).............................................................................. IV KAZALO VSEBINE ...................................................................................................................... V KAZALO SLIK .......................................................................................................................... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI .......................................................................................................... X 1 UVOD ................................................................................................................................. 1 1.1 RAZISKOVALNE HIPOTEZE .......................................................................................... 2 2 PREGLED OBJAV ........................................................................................................... 3 2.1 cAMP .................................................................................................................................. 3 2.2 L-LAKTAT ......................................................................................................................... 4 2.3 GPCR .................................................................................................................................. 5 2.3.1 G-proteini, ki vplivajo na nastajanje cAMP ................................................................... 6 2.3.2 Laktatni receptor GPR81 ................................................................................................. 6 2.4 NANOSENZORJI FRET .................................................................................................... 7 2.4.1 Nanosenzor FRET Epac1-camps ..................................................................................... 8 2.4.2 Nanosenzor FRET Laconic .............................................................................................. 8 3 MATERIAL IN METODE .............................................................................................. 9 3.1 MATERIAL ........................................................................................................................ 9 3.1.1 Hranilni medij ................................................................................................................... 9 3.1.2 Lipofekcijski medij ........................................................................................................... 9 3.1.3 Zunajcelične raztopine...................................................................................................... 9 3.1.4 Raztopina ligandov Smart075, Smart009 in agonista 8535/8535n ............................... 9 3.1.5 Fosfatni pufer z NaCl (PBS) ........................................................................................... 10 3.1.6 Raztopina za spiranje celic pri imunohistokemiji ........................................................ 10 3.2 METODE .......................................................................................................................... 10 3.2.1 Priprava krovnih stekelc za nasajanje astrocitov in celic 3T3 .................................... 10 3.2.2 Priprava in nasajanje celic 3T3 ..................................................................................... 10 3.2.3 Nasaditev podganjih astrocitov na krovna stekelca premazana s poli-L-lizinom .... 10 3.2.4 Namnožitev in izolacija plazmidne DNA FRET-nanosenzorjev in GPR27-FLAG .. 11 3.2.5 Transfekcija celične kulture podganjih astrocitov s plazmidno DNA z zapisom za FRET-nanosenzorje in za GPR27-FLAG ..................................................................... 11 3.2.6 Meritve [cAMP]i in [L-laktat]i v posamezni celici z metodo FRET ter analiza ........ 12 V Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.2.7 Protokol stimulacije celic z agonisti in merjenje sprememb citoplazemske koncentracije cAMP in L-laktata .................................................................................. 12 3.2.8 Imunocitokemija ............................................................................................................. 13 3.2.9 Analiza posnetkov porazdelitve [cAMP]i ali [L-laktat]i .............................................. 13 3.2.10 Analiza meritev spremembe [L-laktata]i v celicah 3T3 po stimulaciji z agonisti ...... 14 3.2.11 Statistična analiza ........................................................................................................... 15 3.2.12 Bioinformatična analiza ................................................................................................. 16 3.2.13 Transkriptom astrocitov ................................................................................................. 16 3.2.14 Primerjava sekvenc RNA astrocitov divjega tipa in astrocitov z izbitim genom za GPR81 ..............................................................................................................................16 3.2.15 Evklidska razdalja podatkov vezavne energije agonistov GPR81 ............................. 16 4 REZULTATI ................................................................................................................... 18 4.1 RAZMERJE SIGNALA FRET JE NEODVISNO OD KOLIČINE NANOSENZORJA FRET V CITOSOLU ........................................................................................................ 18 4.2 PODCELIČNA HETEROGENOST PORAZDELITVE [cAMP]i V ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 .................................................................................................................. 25 4.3 PODCELIČNA HETEROGENOST PORAZDELITVE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) V ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 .............................. 28 4.4 RAZLIKE V ČASOVNO-ODVISNIH SPREMEMBAH CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) V CELICAH 3T3, POVZROČENE Z RAZLIČNIMI KONCENTRACIJAMI MOLEKUL SMART075 ALI SMART009 ............................................................................................................... 30 4.5 PRIMERJAVA DOZNE ODVISNOSTI SPREMEMB CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) PO STIMULACIJI S SMART075 ALI SMART009 V CELICAH 3T3WT ........................................................................... 32 4.6 KANDIDATI GPCR IN PREGLED ODZIVOV CELIC 3T3KO NA STIMULACIJO S SMART075 ALI SMART009 .......................................................................................... 33 4.7 PRIMERJAVA SPREMEMB CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) PO STIMULACIJI S 5, 10 IN 50 µM SMART009 NA CELICAH 3T3WT IN TREH RAZLIČNIH KLONIH CELIC 3T3KOB .......................................... 34 4.8 DODATNA NEODVISNA POTRDITEV VLOGE GPRB PRI URAVNAVANJU SPREMEMB [L-LAKTAT]i ............................................................................................. 35 5 RAZPRAVA .................................................................................................................... 41 5.1 PORAZDELITEV [cAMP]i V ODVISNOSTI OD ODDALJENOSTI OD JEDRA PROTI CELIČNEM OBROBJU ...................................................................................... 41 5.2 PORAZDELITEV [L-LAKTAT]i V ODVISNOSTI OD ODDALJENOSTI OD JEDRA PROTI CELIČNEM OBROBJU ......................................................................... 42 5.3 ISKANJE NOVEGA RECEPTORJA ............................................................................... 43 VI Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5.4 SPREMEMBE V [L-LAKTAT]i, KI JIH POVZROČIJO AGONISTI V CELICAH 3T3KO .............................................................................................................................. 44 5.5 PONOVNA VZPOSTAVITEV ODZIVNOSTI V [L-LAKTAT]i CELIC 3T3KOB, POSREDOVANO Z GPRB, S TRANSFEKCIJO PLAZMIDA GPRB-FLAG ............... 44 6 SKLEPI ............................................................................................................................ 46 7 POVZETEK .................................................................................................................... 47 8 SUMMARY ..................................................................................................................... 51 9 VIRI .................................................................................................................................. 55 VII Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Shematski prikaz GPCR ob vezavi agonista (Li in sod., 2002). ....................................... 6 Slika 2: Shematski model nanosenzorja FRET. .............................................................................. 8 Slika 3: Učinek stimulacije celic 3T3 z 8535, agonistom GPR27, na [L-laktat]i. ........................ 15 Slika 4: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem intenzitete fluorescence kanalov CFP in YFP, v astrocitih. ................................................................................................ 19 Slika 5: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem intenzitete fluorescence kanalov CFP in YFP, v celicah 3T3. ............................................................................................ 21 Slika 6: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem kanalov mTFP in Venus, v astrocitih. ........................................................................................................................ 23 Slika 7: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem kanalov mTFP in Venus, v celicah 3T3. ..................................................................................................................... 24 Slika 8: Analiza majhnih regij cAMP zanimanja v astrocitu. ....................................................... 26 Slika 9: Analiza majhnih regij cAMP zanimanja v celici 3T3. .................................................... 27 Slika 10: Podcelična heterogenost cAMP v astrocitih in celicah 3T3. ......................................... 28 Slika 11: Analiza majhnih krožnih regij zanimanja (premer 2 µm) v astrocitu. .......................... 28 Slika 12: Analiza majhnih krožnih regij zanimanja (premer 2µm) v celicah 3T3. ...................... 29 Slika 13: Podcelična heterogenost koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v astrocitih in celicah 3T3................................................................................................................................ 30 Slika 14: Časovno-odvisne spremembe znotrajcelilčne koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v celicah 3T3WT, povzročene s Smart075 ali Smart009. ............................................... 31 Slika 15: Dozne odvisnosti sprememb citosolne koncentracije L-laktata ([L-laktat]i), po stimulaciji z molekulama Smart075 ali Smart009 v celicah 3T3WT. ......................... 32 Slika 16: Presejanje kandidatov GPCR......................................................................................... 34 Slika 17: Zmanjšana sprememba [L-laktat]i v celicah 3T3KOB in 3T3WT, po stimulaciji s Smart009. ..................................................................................................................... 35 Slika 18: Optimizacija sočasne transfekcije plazmidov Laconic in GPRB-FLAG. ..................... 36 Slika 19: Rekonstrukcija odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s Smart009 (5 µM), v celicah 3T3KOBIE1, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG............................................. 37 VIII Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 20: Rekonstrukcija odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s Smart009 (5 µM), v celicah 3T3KOBIC5, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG. ........................................... 38 Slika 21: Ponovna vzpostavitev odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s 8535, selektivnim agonistom GPRB, v celicah 3T3KOBIE1, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG. ...................................................................................................................................... 39 Slika 22: Primerjava odzivov [L-laktat]i v celicah 3T3WT (WT) in celicah 3T3KOBIE1 (KOBIE1) po stimulaciji z 1 µM 8535 in 8535n. ........................................................ 40 IX Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 3T3KO celice 3T3 z izbitim genom α-AR α-adrenergični receptorji β-AR β-adrenergični receptorji AC adenilil ciklaza AMP adenozin monofosfat ATP adenozin trifosfat ANOVA analiza variance ANSL hipoteza o izmenjavi laktata med astrociti in nevroni (angl. "Astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis") AUC površina pod krivuljo (angl. "Area under the curve") cAMP ciklični adenozin monofosfat CFP cian fluorescenčni protein (angl. "Cyan fluorescent protein") CREB cAMP-response-element-binding protein CRISPR-cas9 gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (angl. "Clustered regularly interspaced short palindromic repeats") CŽS centralni živčni sistem DG diacilglicerol EPAC exchange protein directly activated by cAMP Epac1camps poročevalec sprememb v znotrajcelični koncentraciji cAMP ER endoplazemski retikulum FRET prenos energije z resonanco fluorescence (angl. fluorescence resonance energy transfer, GAP GTP-ase activating protein GDP gvanozin difosfat GFP zeleni fluorescenčni protein (angl. "Green fluorescent protein") X Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 GPCR z G-proteini sklopljeni receptorji (angl. "G-protein coupled receptors") GTP gvanozin trifosfat GTPaza gvanozinska trifosfataza IP3 inozitoltrifosfat Laconic poročevalec sprememb v znotrajcelični koncentraciji laktat (angl. "Lactate optical nano indicator from Cecs") mTFP monomerni modrozeleni fluorescenčni protein (angl. "Monomeric teal fluorescent protein") NA noradrenalin PDE fosfodiesteraza PKA protein kinaza A Rap1 Ras-related protein SREB super conserved receptor genes expressed in the brain tmAC transmembranska adenilatna ciklaza Venus izboljšana verzija YFP YFP rumeni fluorescenčni protein (angl. "Yellow fluorescent protein") ZCR zunajcelična raztopina XI Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD Astrociti, tip celic nevroglije, so bili poimenovani leta 1895 (Von Lenhossék in Mills, 1895). So ektodermalnega, nevroepitelijskega izvora. Astrociti vzdržujejo homeostazo v centralnem živčnem sistemu (CŽS) (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Skoraj stoletje so bile raziskave teh celic zapostavljene, saj je prevladovalo mnenje iz 19. stoletja, da so celice glije le t.i. "nervenkitt" (Virchow, 1858), "lepilo" v možganih za povezovanje nevronov, ki naj bi bile edine strukture v CŽS sposobne signaliziranja s kemičnimi prenašalci. Danes je znano, da astrociti aktivno sodelujejo pri številnih fizioloških in patoloških procesih CŽS prek izločanja kemičnih snovi iz mešičkov in so zato v zadnjih dveh desetletjih predmet intenzivnih raziskav (Verkhratsky in Nedergaard, 2018; Zorec in sod., 2012). Astrociti so zvezdaste oblike in prek številnih izrastkov so v tesnem stiku z žiljem na eni in nevroni (s sinapsami) na drugi strani. Tako so anatomsko optimalno umeščeni za signaliziranje med nevroni in endotelijem, kar omogoča astrocitom presnovno podporo nevronskim mrežam, ki so osrednji porabnik energije v CŽŠ, in sicer v obliki porabe glukoze (Dienel, 2019; Nortley in Attwell, 2017). Astrociti tako sodelujejo pri prevzemu glukoze iz krvnega obtoka, ki jo lahko kot vir energije posredujejo nevronom ali jo skladiščijo v obliki glikogena. V primeru povečane aktivnosti nevronov se v astrocitih razgradi glikogen do glukoze v procesu aerobne glikolize, nastali L-laktat se izloči v zunajcelični prostor in se posreduje nevronom ( t.i. hipoteza o izmenjavi laktata med astrociti in nevroni, angl. Astrocyte-neuron lactate shuttle, ANLS), ki ga pretvorijo v piruvat za oksidativno razgradnjo v Krebsovem ciklu (Belanger in sod., 2011; Stobart in Anderson, 2013; Pellerin in Magistretti, 1994; Verkhratsky in Nedergaard, 2018; Peng in sod., 2005), zelo verjetno pa je tudi zunajcelična signalna molekula, primarni prenašalec (Bergersen in sod., 2001). Kot sekundarna signalna molekula v citosolu deluje 3',5'-ciklični adenozinmonofosfat (cAMP), univerzalni sekundarni prenašalec, katerega koncentracija se uravnava z mnogimi receptorji, ki so sklopljeni z G-proteini (angl. G protein-coupled receptor; GPCR) (Peng in sod., 2005). Ti receptorji se številčno izražajo na plazemski membrani astrocitov (Lauritzen in sod., 2014; Wang in Bordey, 2008). Med receptorje GPCR sodijo tudi L-laktatni receptorji (npr. GPR81 ali GPR81), adrenergični receptorji (npr. receptorji β) in metabotropni glutamatni in purinergični receptorji (Lauritzen in sod., 2014; Wang in Bordey, 2008). Pri aktivaciji Gs-proteinov se aktivira encim adenilil ciklaza, ki katalizira pretvorbo adenozin trifosfata v cAMP, medtem ko aktivacija Gi-proteinov inhibira aktivnost adenilil ciklaze (Nikolaev in Lohse, 2006). Aktivacija Gq-proteinov stimulira fosfolipazo C, ki cepi fosfoinozitoldifosfat v diacilglicerol (DG) in inozitoltrifosfat (IP3). IP3 se veže na receptorje v endoplazemskem retikulumu (ER) in povzroči sproščanje Ca2+ iz znotrajceličnih zalog ER (Nikolaev in Lohse, 2006; Vardjan in sod., 2014; Peng in sod., 2005). 1 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Zvišana citosolna koncentracija cAMP v astrocitu aktivira različne znotrajcelične efektorje, vključno z mehanizmi za uravnavanje aerobne glikolize. Predno pa se aktivirajo končni efektorji, se cAMP veže na vmesne signalne molekule. Primarno se cAMP veže na od cAMP odvisno protein-kinazo A (PKA), ki lahko fosforilira različne proteine v citoplazmi in jedru ter na ta način uravnava celične procese, kot so aerobna glikoliza, delitev celic, morfološka plastičnost in ekspresija genov prek regulacije transkripcijskih faktorjev, npr. CREB (angl. cAMP-response-element-binding protein) (Allen in Zhang, 2006; Beavo in Brunton, 2002). Poleg PKA lahko cAMP uravnava tudi delovanje od cikličnih nukleotidov-odvisne kanale (HCN, ionski kanali), proteinske domene Popeye in GTP-izmenjevalnega proteina Epac (angl. Exchange Protein directly Activated by cAMP) (Beavo in Brunton, 2002; Bos, 2003; Nikolaev in Lohse, 2006; Horvat in sod., 2016). Epac je bil prvič opisan kot znotrajcelični receptorski protein za cAMP, ki posreduje signalizacijo cAMP preko od-cAMP odvisne nukleotidne izmenjave prek monomerne gvanozinske trifosfataze (monomerna GTPaza), Rap1 (DiPilato in sod., 2004). Citosolna porazdelitev cAMP in znotrajcelične koncentracije L-laktata, ki se uravnava tudi prek sekundarnega prenašalca cAMP, v astrocitih in celicah 3T3 še ni bila opisana in predstavlja enega od problemov, ki ga predlagano raziskovalno delo obravnava. Nove raziskovalne metode, ki temeljijo na prenosu energije z resonanco fluorescence (angl. fluorescence resonance energy transfer, FRET) (Förster, 2006), omogočajo meritve sprememb znotrajcelične koncentracije cAMP ([cAMP]i) oziroma znotrajcelične koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v realnem času. V doktorski nalogi smo spremljali dinamiko [cAMP]i in [L-laktat]i v mirovanju in po stimulaciji GPCR z različnimi agonisti. 1.1 RAZISKOVALNE HIPOTEZE - [cAMP]i je v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in/ali fibroblastom podobnih celic 3T3. - Stimulacija z agonisti za različne GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v znotrajcelični porazdelitvi cAMP in L-laktata. - [L-laktat]i je v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in/ali celic 3T3. 2 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 PREGLED OBJAV 2.1 cAMP cAMP je prvi identificiral Earl W. Sutherland leta 1958, kot termostabilno molekulo, ki posreduje znotrajcelično aktivacijo glukagona in epinefrina v jetrih (Rall in Sutherland, 1958). Danes je znano, da aktivnost cAMP uravnava veliko celičnih procesov, kot so genska ekpresija, celična delitev, apoptoza, eksocitoza, ima pa tudi fiziološke funkcije pri imunskem odzivu, krčenju srčnih mišic in spominu. Njegova sinteza poteče, kot odgovor na aktivacijo membranskih receptorjev, ki spadajo v superdružino receptorjev GPCR. Po vezavi liganda se aktivni G-protein sprosti in sproži delovanje membransko-vezanega encima adenilil ciklaze (AC), ki ustvari ciklični AMP iz ATP. Trenutno prevladuje domneva, da je koncentracija prostega cAMP v celici odvisna od hitrosti njegove sinteze, hitrosti razgradnje in od morebitnih znotrajceličnih sistemov, kot so vezavni proteini cAMP ali celičnih mikrodomen, ki lahko upočasnijo difuzijo cAMP. Hitrost sinteze se uravnava z aktivnostjo AC, stopnja razgradnje cAMP pa je odvisna od lokalne aktivnosti fosfodiesteraz (PDE), ki hidrolizirajo cAMP v AMP (Nikolaev in Lohse, 2006; Agarwal in sod., 2016; Richards in sod., 2016; Bers in sod., 2019; Calebiro in Maiellaro, 2014). Zvišana citosolna koncentracija cAMP v astrocitu aktivira različne znotrajcelične efektorje, vključno z mehanizmi za uravnavanje aerobne glikolize (Vardjan in sod., 2018). Pred aktivacijo končnih efektorjev se cAMP veže na vmesne signalne molekule. Primarno se cAMP veže na od cAMP odvisno protein-kinazo A (PKA), ki lahko fosforilira različne proteine v citoplazmi in jedru ter na ta način uravnava celične procese, kot so aerobna glikoliza, delitev celic, morfološka plastičnost in ekspresija genov prek regulacije transkripcijskih faktorjev, npr. CREB (angl. cAMP-response-element-binding protein) (Allen in Zhang, 2006; Beavo in Brunton, 2002). Poleg PKA lahko cAMP uravnava tudi delovanje od cikličnih nukleotidov-odvisne kanale (HCN, ionski kanali), proteinske domene Popeye in GTP-izmenjevalnega proteina Epac (angl. Exchange Protein directly Activated by cAMP) (Beavo in Brunton, 2002; Bos, 2003; Nikolaev in Lohse, 2006; Vardjan in Zorec, 2015). Epac je bil prvič opisan kot znotrajcelični receptorski protein za cAMP, ki posreduje signalizacijo cAMP preko od-cAMP odvisne nukleotidne izmenjave prek monomerne gvanozinske trifosfataze (monomerna GTPaza), Rap1 (DiPilato in sod., 2004). Zaccolo in sodelavci (2000) so opazovali koncentracijske gradiente cAMP na ravni mikrometrov v živih neonatalnih miocitih srčne mišice. Za prisotnost mikro-domen s povečano koncentracijo cAMP naj bi bile odgovorne PDE, ki razgradijo cAMP in preprečijo difuzijo le-tega izven mikrodomen (Zaccolo in sod., 2000; Zaccolo in Pozzan, 2002; Zaccolo, 2011). Maiellaro in sodelavci (2016) so pokazali, da je nastanek cAMP heterogen v živčnih končičih motoričnih nevronov, ki naj bi bili najbolj dinamičen predel motonevronov glede akumulacije molekul cAMP (Maiellaro in sod., 2016). Četudi je cAMP majhna difuzibilna molekula (D[cAMP]i znaša 1,36 x 10-6 – 7,80 x 10-6 cm2/s, DcAMP v vodi znaša 3,30 x 10-6 – 9,70 x 10-6 cm2/s, D[kalij]i znaša 1,30 x 10-5 – 1,73 x 3 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 10-5 cm2/s, D[kalcij]i znaša 5,3 x 10-6 cm2/s) (Agarwal in sod., 2016; Donahue in Abercrombie, 1987; Hodgkin in Keynes, 1953), sta že Buxton in Brunton (1983) predvidela, da cAMP nima enakomernega dostopa do vseh encimov PKA, ki so prisotni v celici, kar posledično pomeni prostorsko nehomogeno porazdeljenost molekul cAMP v celici in s tem prisotnost kompartmentaliziranega signaliziranja s tem sekundarnim prenašalcem (Brunton, 1983). Znano je, da je znotrajcelični cAMP uravnavan z aktivnostjo AC in PDE (Beavo in Brunton, 2002). Raziskave so pokazale, da imajo membranske AC bazalno aktivnost (Tasken in Aandahl, 2004), vendar je zaradi vezave na proteinske kinaze koncentracija prostega cAMP v celici zelo nizka in difuzija le-tega zelo počasna. To omogoča PDE, ki so precej počasni encimi, da okoli sebe naredijo nanometrske predelke, ki skorajda ne vsebujejo cAMP. To celicam, ob aktivaciji receptorjev, zagotavlja ločeno regulacijo signalov v vsakem od teh majhnih nanometrskih predelkov (Bock in sod., 2020). Znotrajcelično heterogenost [cAMP]i v astrocitih smo opisali v sklopu študije, ki je obravnavala primerjavo funkcionalne in signalizacijske plastičnosti serumskih astrocitov in zvezdastih astrocitov. Rezultati so pokazali, spremenjeno dinamiko mešičkov v zvezdastih, a ne v t.i. ' serumskih'' astrocitih, ki je bila povezana s zvišanim [Ca2+]i v mirovanju in povečano podceličino heterogeno porazdelitvijo [Ca2+]i, medtem ko je podcelična dinamika [cAMP]i ostala stabilna v obeh kulturah, kar kaže na to, da je signalizacija cAMP manj nagnjena k plastičnemu preoblikovanju kot signalizacija Ca2+ (Pirnat in sod., 2021). 2.2 L-LAKTAT V CŽS, pri procesu aerobne glikolize, se ob razgradnji glukoze preko piruvata tvori L-laktat, ob normalnem parcialnem tlaku kisika, fenomen poznan tudi kot "Warburgov efekt" (Warburg, 1956). L-laktat, ima v CŽS energetsko vrednost, saj poleg glukoze služi kot gorivo za nevrone. Kot signalna molekula zunajcelčni L-laktat igra vlogo "volumskega prenašalca" informacij, saj z difuzijo dosega daljše razdalje in aktivira receptorje okrog mesta sproščanja (Morland in sod., 2015). Volumski prenos ne poteka med sinapsami, pač pa je to signaliziranje način, ki omogoča komunikacijo med možganskimi celicami, kjer se izrablja koncentracijski gradient na obsežnejšem področju možganskega tkiva. Za razliko od sinaptičnega prenosa, kjer razdalja med izvorom in tarčo signalne molekule znaša nekaj deset nanometrov, lahko volumski prenašalec z difuzijo doseže veliko večje mikrometrske razdalje (Borroto-Escuela in sod., 2015; Lauritzen in sod., 2014). L-laktat morda deluje tudi kot gliotransmiter v CŽS, saj naj bi astrociti imeli zmožnost modulacije aktivnosti noradrenergičnih nevronov. Tako lahko L-laktat uravnava razpoložljivost noradrenalina (NA), kjer sproščanje L-laktata iz aktiviranih astrocitov v jedru locus coeruleus povzroči vzbujanje nevronov in posledično sproščanje NA (Tang in sod., 2014). Na tvorbo L-laktata lahko vpliva več mehanizmov, ki igrajo signalno vlogo v CŽS, vključno z redoks regulacijo (Brooks, 2009), modulacijo prostaglandinov (Gordon in sod., 2008) in z vezavo na L-laktat občutljivi z Gi-proteinom povezan receptor GPR81 (Lauritzen in sod., 2014) ali prek 4 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 še neidentificiranih receptorjev plazemske membrane (Tang in sod., 2014; Vardjan in sod., 2018). Identifikacija teh receptorjev predstavlja del doktorske študije. 2.3 GPCR Za zaznavanje zunanjih kemičnih signalov celice izražajo veliko število receptorjev. Receptorji GPCR lahko posredujejo celične odzive na veliko število zunajceličnih signalnih molekul kot so hormoni, nevrotransmiterji in lokalni celični mediatorji. Te signalne molekule se med seboj razlikujejo tako po strukturi kot po funkcionalnosti. Med njimi so tako prisotni proteini, majhni peptidi, kot tudi derivati aminokislin in maščobnih kislin. Med drugim lahko en sam ligand ali agonist, aktivira več različnih GPCR-jev. Kljub kemični in funkcionalni pestrosti signalnih molekul, imajo GPCR-ji podobno molekulsko strukturo. Sestavljeni so iz sedmih transmembranskih α-vijačnic (Yang in sod., 2021). Ob vezavi zunajceličnega liganda na receptor pride do konformacijske spremembe receptorja, ki se prenese na znotrajcelični heterotrimerni G-protein. G-proteini so sestavljeni iz podenot α, β in γ. V stanju neaktivnosti G-proteina ima α- podenota nase vezan gvanozin difosfat (GDP). Ob stimulaciji aktiviranega receptorja, se vezani GDP sprosti iz α-podenote, kar omogoči vezavo gvanozin trifosfata (GTP). Ta reakcija povzroči razpad trimernega G-proteina v dve aktivirani komponenti, α-podenoto in kompleks sestavljenega iz β- in γ-podenote, ki posredujeta navzdolnjo signalizacijo (Slika 1). Poleg delovanja preko G-proteina lahko signaliziranje poteče tudi preko arestinov. Arestini so bili prvič opisani kot proteini, ki "ugasnejo" signaliziranje preko G-proteinov (Weis in Kobilka, 2018). Po hidrolizi vezanega GTP-ja v GDP se α-podenota ponovno združi s kompleksom βγ-podenot in oblikuje neaktivni G-protein. Hidrolizo GTP-ja v GDP pospeši vezava specifičnega modulatorja, proteina RGS (angl. Regulator of G-protein signaling), ki deluje kot protein GAP (angl. GTP-ase activating protein). Za razliko od velikega nabora različnih genov, ki v evkariotskih organizmih kodirajo proteine GPCR, se G-proteini delijo na štiri glavne družine. Te družine so Gs/olf, Gi/o/t, Gq/11 in G12/13 (Hilger in sod., 2018). 5 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 1: Shematski prikaz GPCR ob vezavi agonista (Li in sod., 2002). 2.3.1 G-proteini, ki vplivajo na nastajanje cAMP Astrociti na svojih membranah izražajo številne receptorje GPCR, ki se prek G-proteinov uravnavajo signalne poti s cAMP. Ti receptorji so sklopljeni z G-proteini, ki vključujejo proteine Gs in Gi, ki so sklopljeni z β-adrenergičnimi receptorji (β-AR; (protein Gs)), z α2-AR (protein Gi), adenozinski receptorji (proteini Gs/Gi), glutamatni receptorji mGlu3 (protein Gi), dopaminski receptorji D1 (protein Gs), histaminski receptorji H2 (protein Gs), opioidni receptorji (proteini Gi), PACAP/VIP receptorji (proteini Gs) (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Sinteza cAMP je v veliki meri odvisna od aktivnosti encima AC, ki se nahaja na citoplazemski membrani. Aktivacija proteinov Gs stimulira transmembransko adenilatno ciklazo (tmAC), kar posledično vodi v povečanje sinteze cAMP. Inhibicija tmAC poteče z ligandi, ki stimulirajo receptorje sklopljene z Gi proteinom, kar zniža nivo sinteze znotrajceličnega cAMP (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Aktivnost nekaterih GPCR vpliva na celokupni znotrajcelični cAMP, vendar še vedno ni povsem jasno, kako velika številčnost teh receptorjev povzroči specifične celične odzive. Specifični odzivi, značilni za določen receptor, bi lahko bili posledica celične kompartmentalizacije signaliziranja s cAMP. Napredne mikroskopske tehnike so omogočile opazovanje teh domen na nanometrski skali (Bers in sod., 2019; Bock in sod., 2020; Zaccolo in sod., 2021). 2.3.2 Laktatni receptor GPR81 Signalizacija z L-laktatom lahko poteka preko aktivacije GPCR-jev, ki so občutljivi na laktat. Med te GPCR-je spada tudi GPR81. Ta receptor je bil odkrit v adipocitnem tkivu (Cai in sod., 2008), 6 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izražanje pa je v manjši meri prisotno tudi v ledvičnih in mišičnih tkivih ter v možganih (Ge in sod., 2008; Lauritzen in sod., 2014; Liu in sod., 2012). Znano je, da aktivacija GPR81 v adipocitih povzroči znižanje sinteze znotrajceličnega cAMP zaradi inhibicije adenilil ciklaze, kar posledično v avtokrini zanki inhibira lipolizo in vzpodbudi skladiščenje lipidov in s tem energije (Ahmed in sod., 2009). Endogeni agonist za GPR81 je L-laktat (Liu in sod., 2009). Za ta receptor pa so opisani tudi selektivni agonisti, kot so 3-kloro-5-hidroksibenzojska kislina (Dvorak in sod., 2012), 2-hidroksi-5-metoksibenzojska kislina in "Compound 2" (4-metil-N-(5-(2-(4-metilpiperazin-1-il)-2-oksoetil)-4-(2-tienil)-1,3-tiazol-2-il)-cikloheksankarboksilamid) (Sakurai in sod., 2014). Znano je, da zunajcelični L-laktat v astrocitih povzroči aktivacijo adenilat ciklaze, kar posledično zviša raven znotrajceličnega cAMP, pospeši aerobno glikolizo in zaradi prisotnosti mehanizma pozitivne povratne zanke, poveča citosolno raven L-laktata (Vardjan in sod., 2018). Prav tako dodatek selektivnih agonistov za GPR81 v astrogliji, poveča znotrajcelični cAMP in L-laktat, zaradi prisotnosti mehanizma pozitivne povratne zanke. Raziskave so pokazale, da v astrocitih dodatek selektivnih agonistov za GPR81 ojača astroglialno aerobno glikolizo, tudi ko ekspresija tega receptorja v celicah ni prisotna, kar kaže, da poleg aktivacije GPR81, ti agonisti aktivirajo še neznani receptorski mehanizem (Vardjan in sod., 2018). 2.4 NANOSENZORJI FRET Različne fluorescenčne mikroskopske metode omogočajo spremljanje citosolne koncentracije cAMP ali L-laktata z visoko prostorsko in časovno ločljivostjo na ravni posamezne celice. Ena prvih opisanih metod zmožna detektiranja sprememb z nanometrsko resolucijo temelji na prenosu energije z resonanco oz. na Försterjevem resonančnem prenosu energije (Shrestha in sod., 2015). Koncept dipolno-dipolne interakcije in prenosa energije odvisnega od razdalje brez molekularnega trka je bil prvič predstavljen v začetku 20. stoletja, bolj natančno pa je kvantitativno teorijo FRET opisal Theodor Förster leta 1948 (Clegg, 2006). Fenomen FRET se pojavi med dvema fluoroforoma, kjer prvi deluje kot donor in drugi kot akceptor energije. Če je razdalja med molekulama manjša od 1 nm, med njima prihaja do trkov, če je razdalja večja od 10 nm pride do prenosa fotonov. Zaradi tega, lahko FRET poteka samo na razdaljah 1-10 nm (Lakowicz, 2006). Emisijski spekter donorskega fluorofora se mora prekrivati z absorbcijskim spektrom akceptorja za vsaj 30 %. Najbolj pogosti donorji in akceptorji izhajajo iz fluorescenčnih proteinov GFP (Sekar in Periasamy, 2003). Napredne tehnike fluorescenčne mikroskopije vključujejo nanosenzorje FRET, ki so sestavljeni iz prepoznavne domene in poročevalske domene. Prepoznavna domena je vezavni protein za metabolit, oz. molekulo, ki naj bi jo detektirali. Vezava liganda na prepoznavno domeno povzroči konformacijsko spremembo in s tem zvečanje ali zmanjšanje razdalje med fluorescentnima proteinoma (akceptor in donor). Posledično pride do porasta ali padca učinkovitosti prenosa energije resonance (San Martin in sod., 2013). 7 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 2: Shematski model nanosenzorja FRET. Vezavno mesto za ligand se nahaja med donorjem in akceptorjem. Vezava liganda lahko povzroči sterično konformacijo in posledično povečanje razdalje med fluorescentnima fluoroforoma, ter znižanje signala FRET (Povzeto po Tamma in sod., 2017). 2.4.1 Nanosenzor FRET Epac1-camps V fizioloških pogojih je v celicah prisoten cAMP zaradi bazalne aktivnosti encima AC. Odkritje proteina Epac, ki je pomembna efektorska molekula za cAMP, je prispevalo k razvoju novih nanosenzorjev FRET za merjenje sprememb v koncentraciji znotrajceličnega cAMP. Nanosenzor Epac1-camps je sestavljen iz vezavne domene Epac, ki je vključena med dva fluorescenčna proteina, donorskim fluorofornim proteinom CFP (angl. Cyan Fluorescent Protein) in akceptroskim fluorofornim proteinom YFP (angl. Yellow Fluorescent Protein). Ob vezavi cAMP na vezavni protein, se inducira konformacijska sprememba nanosenzorja, kar posledično vodi do spremenjene razdalje med fluoroforoma CFP in YFP (Allen in Zhang, 2006; Brunton, 1983; DiPilato in sod., 2004; Jurevicius in sod., 2003; Nikolaev in sod., 2004). To izmerimo kot padec oz. porast signala FRET, ki predstavlja razmerje intenzitet emitirane svetlobe CFP in YFP (CFP/YFP). Razmerje intenzitet predstavlja nivo cAMP, saj je razmerje fluorescenc neodvisno od količine molekul na optični poti v volumsko različnih delih celice (G Grynkiewicz, 1985), skozi katere potuje žarek, ki vzbuja fluorescenčni protein pri relativno krajši valovni dolžini (Calebiro in Maiellaro, 2014). 2.4.2 Nanosenzor FRET Laconic Laconic (angl. LACtate Optical Nano Indicator from Cecs) nanosenzor FRET za merjenje znotrajceličnega L-laktata na ravni posamezne celice. Sestavljen je iz vezavnega proteina za laktat, Lidr in fluorescenčnih proteinov mTFP (varianta CFP) in Venus (varianta YFP) (San Martin in sod., 2013). Ob vezavi L-laktata na vezavno domeno pride do konformacijske spremembe, kar povzroči povečanje razdalje med fluoroforoma in posledično zvišanje emisije mTFP in znižanje emisije Venus oz. zvišanje signala FRET (mTFP/Venus). Razmerje intenzitet mTFP/Venus v fizioloških pogojih predstavlja nivo L-laktata v celici. Laconic omogoča zaznavanje koncentracije znotrajceličnega L-laktata med 1µM in 10mM (San Martin in sod., 2013). 8 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL 3.1.1 Hranilni medij Hranilni medij za gojenje celic 3T3 smo pripravili iz gojišča DMEM (ang. Dulbecco's Modified Eagle's medium) z visoko vsebnostjo glukoze, 4500 mg/L (Sigma-Aldrich), ki smo mu v končnih koncentracijah dodali 5mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), 10 % FBS-a (ang. Fetal bovine Serum, Sigma-Aldrich), ter mešanice antibiotikov streptomicina in penicilina s koncentracijama 5 ug/mL (Innoprot). Prefiltrirani hranilni medij smo do uporabe hranili na +4 ºC, največ 3 tedne. Hranilni medij za gojenje astrocitov se je razlikoval samo po manjši končni koncentraciji L-glutamina (2 mM) in po dodatku 1 mM Na-piruvata. 3.1.2 Lipofekcijski medij Lipofekcijski medij za celice 3T3 smo pripravili iz gojišča DMEM s 4500 mg/l D-glukoze, ki smo mu dodali 5 mM L-glutamina. Lipofekcijski medij za astrocite je poleg DMEM-a (4500 mg/l D-glukoze) vseboval tudi 1mM Na-piruvata in 2 mM L-glutamina. Do uporabe smo ga hranili pri temperaturi +4 ºC, največ 3 tedne. 3.1.3 Zunajcelične raztopine Zunajcelična raztopina (ZCR) za merjenje laktata je vsebovala 135,3 mM NaCl; 5 mM KCl; 10 mM HEPES; 0,5 mM NaH2PO4xH2O; 5,0 NaHCO3; 3 mM D-glukoze; 1,8 CaCl2; 2 mM MgCl2. Zunajcelična raztopina z laktatom je vsebovala 95,3 mM NaCl in 40mM Na-Laktat, vse ostale koncentracije sestavin so ostale enake. Končni pH raztopine smo umerili na 7,20. (NaOH) Osmoralnost raztopine je znašala 290-305 mOsm/kg. ZCR za merjenje cAMP je vsebovala 131,8 mM NaCl, 5mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,5 mM NaH2PO4xH2O, 5 mM NaHCO3 in 10 mM D-glukoze. Končni pH raztopine smo umerili na 7,20 z NaOH. Osmolarnost raztopine je znašala 290-305 mOsm/kg. 3.1.4 Raztopina ligandov Smart075, Smart009 in agonista 8535/8535n Založno količino agonista Smart009 (3-tert-butil-5-hidroksibenzojska kislina; SINOVA, Bethesda, ZDA) ali Smart075 (3-kloro-5-hidroksibenzojska kislina; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ZDA) v prahu smo raztopili v ustrezni količni ZCR, da je končna koncentracija liganda znašala 10mM. Založno količino agonista 8535 (N-[4-(anilinokarbonil)fenil]-2,4-diklorobenzamid) (Dupuis in sod., 2017) ali 8535n (N-[4-(anilinosulfonil)fenil]-2,4-diklorobenzamid) (Pillaiyar in sod., 2021) v prahu smo raztopili v ustrezni količni DMSO, da je končna koncetracija liganda znašala 10mM. 9 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.5 Fosfatni pufer z NaCl (PBS) Eno tableto PBS (Sigma-Aldrich, P4417) smo raztopili v 200 ml destilirane vode. Nastala raztopina je vsebovala 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl in 10 mM fosfatnega pufra. Do uporabe smo jo hranili na sobni temperaturi. 3.1.6 Raztopina za spiranje celic pri imunohistokemiji Raztopino za spiranje celic smo pripravili z raztapljanjem govejega serumskega albumina (BSA, angl. "bovine serum albumin") v PBS do 3 % končne koncentracije in jo hranili do uporabe na - 20 ºC. 3.2 METODE 3.2.1 Priprava krovnih stekelc za nasajanje astrocitov in celic 3T3 Krovna krožna stekelca s premerom 22 mm (Chance Propper, Velika Britanija) smo 20 min sterilizirali v 70 % etanolu in za tem dvakrat sprali z redestilirano vodo. Nato smo sterilna stekelca 20 min inkubirali v raztopini 1% poli-L-lizina (PLL, Sigma-Aldrich). Po ponovnem dvakratnem spiranju v redestilirani vodi smo stekelca sušili v manjših petrijevkah. Po 1 uri sušenja smo suha stekelca zaprli v petrijevke in jih do uporabe hranili na +4 ºC. 3.2.2 Priprava in nasajanje celic 3T3 Celice 3T3-MEF so klasificirane kot embrionalni preadipocitni fibroblasti. Posredoval nam jih je Dr. K. Chylinski iz Univerze na Dunaju. Celice smo v gojilni posodi sprali z 2 ml hranilnega gojišča, ga odstranili, celicam dodali 4 ml tripsin-EDTA in jih inkubirali 5 min na 37 ºC. Odlepljenim celicam smo v gojitveno posodo dodali 2 mL hranilnega gojišča za inhibicijo delovanja tripsina, celoten volumen prenesli v centrifugirko in centrifugirali 5 min na 900 obratih/min (Centric 150, Tehtnica, Železniki, Slovenija). Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, ter pelet resuspendirali v 5 ml hranilnega gojišča. Na krovna stekelca smo nanesli 30-50 µl celične suspenzije in jih inkubirali 25 min na 37 ºC, 95 % relativni zračni vlažnosti in sestavi atmosfere 5 % CO2/95 % zrak. Po 30 minutni inkubaciji smo celicam dodali 2 ml svežega gojišča in jih do izvedbe poskusov vzdrževali v inkubatorju (37 ºC, 95 % relativna zračna vlažnost, 5 % CO2/95 % zrak). 3.2.3 Nasaditev podganjih astrocitov na krovna stekelca premazana s poli-L-lizinom Izolacija in priprava kulture primarnih podganjih astrocitov je potekala v skladu z zakonodajo o delu na izoliranih tkivih, organih in truplih predhodno usmrčenih živali po 22.a členu Zakona o zaščiti živali (ZZZiv-UPB3, Uradni list RS, št. 38/2013 z dne 3. 5. 2013). Eksperimentalni protokol je bil odobren s strani Uprave RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano, Dunajska cesta 22, 1000 Ljubljana), dokument št. U34401-47/2014/7, podpisan s strani Barbare Tomše, dr. vet. med. 10 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Hranilno gojišče smo v gojitveni posodi s kulturo primarnih podganjih astrocitov nadomestili z 1,5 ml mešanice tripsin/EDTA in inkubirali 5 min pri 37 ºC. Odlepljenim celicam smo v gojitveno posodo dodali 1,5 mL hranilnega gojišča za inhibicijo delovanja tripsina, celoten volumen prenesli v dve centrifugirki in centrifugirali 5 min na 900 obratih/min (Centric 150, Tehtnica, Železniki, Slovenija). Supernatant smo odstranili in celice resuspendirali v 0,5 ml hranilnega gojišča. Celično suspenzijo primerne gostote smo nanesli na krovna stekelca in jih inkubirali pri 37 ºC, 95 % relativni zračni vlažnosti in sestavi atmosfere 5 % CO2/95 % zrak. Po 30 minutni inkubaciji smo celicam dodali 2 ml svežega gojišča in jih do izvedbe poskusov vzdrževali v inkubatorju (37 ºC, 95 % relativna zračna vlažnost, 5 % CO2/95 % zrak). 3.2.4 Namnožitev in izolacija plazmidne DNA FRET-nanosenzorjev in GPR27-FLAG Bakterijske celice Escherichia coli DH5α, ki vsebujejo plazmidno DNA (pDNA) pcDNA3 z zapisom za Epac1-camps (Julius-Maximilians Univerza v Wuertzburgu, Nemčija), pcDNA3.1 z zapisom za Laconic (Centro de Estudios Científicos, Valdivia, Čile) in pcDNA3.1 z zapisom za ssFlagGPR27 (Dupuis in sod., 2017) smo namnožili v gojišču LB v prisotnosti 100 µg/ml ampicilina. Gojišče s celicami smo stresali 16 h na 250 obratih/min pri 37 ºC. pDNA smo izolirali po navodilu proizvajalca s kompletom za vakuumsko izolacijo DNA (PureYieldtm Plasmid Midiprep System, Promega, Madison, ZDA). Koncetracijo in čistost izolirane pDNA smo preverili spektroforometrično z meritvami absorbance (spektrofotometer Ultrospec 3100 pro, Amersham Bioscineces, Olittel chalfront, Velika Britanija). Koncentracijo ( c) izolirane pDNA smo izračunali iz absolutne vrednosti absorbance pri 260 nm (A260) po enačbi: 𝑐 pDNA (µg 𝑚𝑙 ⁄ ) = A260 × DF × 50 µg 𝑚𝑙 ⁄ , kjer DF (angl. "dilution factor") predstavlja faktor redčitve. Čistost izolirane pDNA smo določili z razmerjem med absorpcijo pri valovni dolžini 260 nm in 280 nm (A260/A280). Plazmide smo do uporabe hranili pri -20 ºC. 3.2.5 Transfekcija celične kulture podganjih astrocitov s plazmidno DNA z zapisom za FRET-nanosenzorje in za GPR27-FLAG Lipofekcija je vnos genskega materiala v celice s pomočjo liposomov (Felgner in sod., 1987). S to metodo smo v celice vnesli konstrukte pDNA z zapisom za FRET-nanosenzorje Epac1-camps, Laconic oz. GPR27-FLAG, 24-48 ur po nasaditvi na krovna steklca. V sterilni centrifugirki smo pripravili lipofekcijsko mešanico, ki je vsebovala 100 µl lipofekcijskega gojišča, 3 µl lipofekcijskega reagenta Fugene® 6 (Promega, Madison, ZDA) in 1 µg ustrezne pDNA ter mešanico inkubirali 20 min pri sobni temperaturi. Krovnikom z nasajenimi celicami smo zamenjali hranilno gojišče z 900 µl svežega hranilnega gojišča in mu po končani inkubaciji dodali 100 µl lipofekcijske mešanice. Transfecirane celice smo inkubirali 24 ur v inkubatorju. Pri poskusih "reševanja odzivov" smo celice sočasno transfecirali z nanosenzorjem Laconic, v končni koncentraciji 1 µg/ml in plazmidom GPR27-FLAG, v končni koncentraciji 0,5 µg/ml. Celicam smo po 2 urah inkubacije zamenjali hranilno gojišče in jih inkubirali 24 ur oz. do uporabe. 11 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Postopek sočasne transfekcije smo standardizirali glede na koncentracijsko stopnjo prisotnosti obeh plazmidov v celicah in čas inkubacije celic v lipofekcijski mešanici (slika 18 E, F). 3.2.6 Meritve [cAMP]i in [L-laktat]i v posamezni celici z metodo FRET ter analiza Meritve spremembe [cAMP]i in [L-laktat]i v celicah, katere smo transficirali s pDNA z zapisom za FRET-nanosenzorje Epac1-camps ali Laconic smo izvedli v realnem času z invertnim fluorescenčnim mikroskopom Zeiss Axio Observer.A1 (Zeiss, Oberkochen, Nemčija), pod vodnim imerzijskim objektivom s povečavo 63x/NA 1,4 in zračnim objektivom s povečavo 20x/NA 0,8. Kot vir svetlobe smo uporabili svetlobni modul Polychrome V (Till Photonic, Nemčija), celice smo obsvetljevali z valovno dolžino 436 nm. Emitirano svetlobo je delilec slike (Optical Insights, Tucson, Arizona, ZDA) s pomočjo dveh emisijskih filtrov zaznal kot ločeni emisiji obeh fluoroforjev nanosenzorja, 480/30 nm za CFP (Epac1-camps) oz. mTFP (Laconic) in 535/40 nm za YFP (Epac1-camps) oz. Venus (Laconic). Emisijske slike nanosenzorja Epac1camps smo zajemali vsake 5 s, emisijske slike nanosenzorja Laconic pa vsakih 10 s. Krovnike s transfeciranimi celicami smo predhodno 10 min inkubirali v ZCR, pri sobni temperaturi. Nato smo krovnike vpeli v snemalno kamrico in jim dodali 200 µl sveže ZCR. Pod okularjem smo poiskali celico z ustrezno stopnjo fluorescence ter ustrezno morfologijo (brez vključkov in proteinskih agregatov) in pred začetkom snemanja posneli sliko pod presevno svetlobo in fluorescenčno sliko celice. V nadaljevanju je bilo posnetih 210 slik v primeru snemanja celic, ki so bile transfecirane z nanosenzorjem Epac1-camps in 120 slik v primeru celic, ki so bile transfecirane z nanosenzorjem Laconic. Celice so bile med zajemanji slik izpostavljene ekspozicijskim časom 0,1-0,8 s pri isti intenziteti eksitacije fluorescence. Učinek različno dolge ekscitacije je bil analiziran predhodno (Maver, 2020). 3.2.7 Protokol stimulacije celic z agonisti in merjenje sprememb citoplazemske koncentracije cAMP in L-laktata Emisijske slike celic, ki so izražale Epac1-camps, smo zajemali v 5-sekundnih intervalih 1045 s. Celicam smo po 145 s snemanja (stanje mirovanja) dodali: i. 200 µl ZCR z agonistom izbrane končne koncentracije oz. v primeru negativne kontrole samo ZCR ii. Učinkovitost senzorja in primerne izbire celice smo preverili z dodatkom ZCR z agonistom izbrane končne koncentracije in NA v končni koncentraciji 100 µM Emisijske slike celic, ki so izražale Laconic, smo zajemali v 10-sekundnih intervalih 1190 s. Celicam smo po 290 s snemanja (stanje mirovanja) dodali: i. 200 µl ZCR z agonistom izbrane končne koncentracije oz. v primeru negativne kontrole samo ZCR 12 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ii. Učinkovitost senzorja in primerne izbire celice smo preverili z dodatkom ZCR z agonistom izbrane končne koncentracije in L-laktata v končni koncentraciji 16-20 mM. 3.2.8 Imunocitokemija Za optimizacijo kolokalizacije plazmidnih konstruktov Laconic in GPR27-FLAG v celicah 3T3KO27 smo celice, ki so bile sočasno transfecirane z obema plazmidoma barvali in vivo s protitelesi specifičnimi za označevalno sekvenco FLAG, ki je označevalec prisoten na plazmidu GPR27-FLAG. Celice smo 48 ur po nasaditvi na krovna stekelca 3 min spirali v 2 ml PBS. V nadaljevanju smo celice za 2 min prelili s 300 µl 4 µM jonomicina in jih nato sprali v PBS s 3 % BSA. Nato smo celice barvali s primarnimi protitelesi anti-FLAG (redčitev 1:600), redčenimi v PBS s 3 % BSA in krovna stekelca s celicami inkubirali 10 min na sobni temperaturi (kunčja monoklonska protitelesa proti oznaki DDDDK oz. FLAG (Abcam, Cambridge, Velika Britanija, ab205606). Po 10 min smo celice spirali 3-krat po 2 min v PBS. Nato smo celice barvali s sekundarnimi protitelesi (redčitev 1:500), redčenimi v PBS s 3 % BSA in krovna stekelca s celicami inkubirali 20 min na sobni temperaturi (AlexaFluor546, Invitrogen, Life Technologies, Eugene, Oregon, ZDA). Na koncu smo celice spirali 3-krat po 2 min v PBS in jih nato prelili z 2 ml ZCR. Imunsko pobarvane žive celice smo takoj po barvanju opazovali pod fluorescenčnim mikroskopom (Zeiss Axio Observer.A1, Zeiss Oberkochen, Germany) z objektivom Plan neofluar 20x/0.4, kamero Axiocam 702 in svetlobnim virom HXP 120 C (Zeiss, Oberkochen, Germany). 3.2.9 Analiza posnetkov porazdelitve [cAMP]i ali [L-laktat]i Spremembe v fluorescenci CFP in YFP (Epac1-camps) oz. mTFP in Venus (Laconic) smo evalvirali s programom ImageJ, kjer smo od obeh fluorescenčnih kanalov odšteli fluorescenco ozadja (povprečna vrednost ± 3 x standardna deviacija) in potem na temelju tako odbelanih podatkov izračunali signal FRET, kot razmerje kanalov CFP/YFP oz. mTFP/Venus. Povečanje [cAMP]i oz. [L-laktat]i se je tako odražalo v povečanju signala FRET. Za karakterizacijo mikrodomen [cAMP]i oz. [L-laktat]i smo s pomočjo programa Matlab narisali linearne poti znotraj citoplazme na katerih so bila območja zanimanja v obliki krogov (2r = 2µm), v smeri pravokotno od jedra proti periferiji celice. Povprečje razmerja fluorescence CFP/YFP oz. mTFP/Venus smo po odštevanju ozadja izračunali za vsako območje zanimanja (mikrodomena). Za oceno časovno odvisnih sprememb [cAMP]i oz. [L-laktat]i znotraj mikrodomen, smo uporabili celotno časovno vrsto slik CFP in YFP oz. mTFP in Venus. Za oceno ravni [cAMP]i (razmerje CFP/YFP) v mirovanju, smo povprečili podatkovne točke zbrane v časovnem intervalu 30 s v posamezni mikrodomeni. Enako smo naredili za oceno nivoja [cAMP]i po stimulaciji, kjer smo povprečili podatkovne točke zbrane v časovnem intervalu 30 s po 120 s dodatka 100 µM NA. Za oceno ravni [L-laktat]i (razmerje mTFP/Venus) v mirovanju, smo povprečili podatkovne točke zbrane v časovnem intervalu 60 s v posamezni mikrodomeni. Enako smo naredili za oceno nivoja [L-laktat]i po stimulaciji, kjer smo povprečili podatkovne točke zbrane v časovnem intervalu 400-460 s oz. 100 s po dodatku agonista Smart009. Vsa razmerja CFP/YFP v posameznih celicah smo normalizirali po enačbi: (X – Xmin) X’ = …(1) (Xmax – Xmin) 13 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.2.10 Analiza meritev spremembe [L-laktata]i v celicah 3T3 po stimulaciji z agonisti Posnetke celic smo analizirali v programu OA Offline Analysis (Till Photonics, Nemčija). Za območja zanimanja smo označili celotno celico in del ozadja. V označenih regijah je program podal vrednosti intenzitete emitirane svetlobe za mTFP in Venus. S programom Excel (Microsoft, ZDA) smo izračunali razmerje signalov mTFP/Venus po enačbi: mTFP mTFP (celica)– mTFP (ozadje) = …(2) Venus Venus (celica)– Venus (ozadje) Zvišan signal pomeni, da se je raven [L-laktat]i povečal. Vse signale FRET smo normirali na vrednost 1,0 tako, da smo absolutne vrednosti razmerja FRET delili s povprečno vrednostjo meritev v mirovanju (določena kot povprečje vrednosti v obdobju 30 s, od začetka posnetka). Celice smo opredelili kot odzivne, ko je bila povprečna sprememba v signalu FRET, določena po dodatku agonista v obdobju 320-420 s po začetku snemanja, višja od treh standardnih deviacij povprečne vrednosti signala FRET v mirovanju (časovni interval pred dodatkom agonistov, 190-290 s). Če ta prag ni bil dosežen, smo celice uvrstili med neodzivne. Površino pod krivuljo (AUC, slika 3) smo izračunali za vsako normalizirano krivuljo odziva v časovnem intervalu od dodatka agonista do dodatka 16-20 mM L-laktata. Povprečna AUC je bila izračunana za vsak dodatek agonista in negativne kontrole. Za gladitev šuma v signalu FRET smo uporabili Excel-ovo drseče povprečje z intervalom 5 točk (Excel, Moving average). 14 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 3: Učinek stimulacije celic 3T3 z 8535, agonistom GPR27, na [L-laktat]i. (A) Slika prikazuje spremembe v razmerju FRET (mTFP/Venus) laktatnega senzorja Laconic v celici 3T3 (razmerje FRET, glejte Metode). Izražanje senzorja Laconic je pretežno prisotno v citosolu. Reprezentativne slike prikazujejo celico 3T3 na začetku poskusa (i), po dodatku 1 µM 8535 (ii) in 20 mM L-laktata (iii). Zunajcelični L-laktat smo dodali kot pozitivno kontrolo, kjer smo preverili ali se izraženi nanosenzor FRET Laconic v celici odziva na povišane vrednosti [laktata]i, ki jih povzroči povečanje zunajceličnega L-laktata, ki vstopa v celico prek transporterjev. Merilna vrstica, 20 µm. (B) Razmerje FRET, pridobljeno iz časovne serije mikroskopskih slik citoplazemske regije celice prikazane v (A). Prikazano je povečanje signala po aplikaciji 1 µM 8535 (+8535; vodoravna črtkana črta) in zunajceličnega 20mM L-laktata (+Lac; vodoravna črtkana črta). Puščice označujejo časovne okvirje, prikazane na (A). Rdeče črtasto območje označuje območje pod krivuljo (AUC). 3.2.11 Statistična analiza Podatke smo predstavili kot povprečje ± standardna napaka ali mediana z interkvartilnim razponom ("škatla z brki"). Test normalnosti smo naredili s testom Shapiro-Wilk ali s testom Kolmogorov-Smirnov. Statistično značilnost med dvema skupinama smo določili s Studentovim t-testom in testom vsote ranga Mann-Whitney. Statistično značilnost med več kot dvema skupinama smo določili z eno- ali dvosmerno analizo variance po rangih. Statistična značilnost med dvema vrstama razvrstitev smo določili s Fisherjevim natančnim testom. Vse statistične analize so bile narejene s programoma SigmaPlot (SyStat, San Jose, CA, ZDA) in Excel 15 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (Microsoft, Albuquerque, Nova Mehika, ZDA). Kot statistično značilne smo upoštevali razlike med vzorci, kjer je bila vrednost P ≤ 0,05. Za pripravo rezultatov smo uporabili računalniška orodja Matlab (MathWorks, ZDA), Zen2010 (Carl Zeiss, Nemčija), Offline Analysis 2.1.0.10 (Till Photonics GmbH, Nemčija) in Photoshop (Adobe, ZDA). 3.2.12 Bioinformatična analiza Za bioinformatično analizo potencialnih kandidatov GPCR, ki bi lahko imeli vlogo pri regulaciji aerobne glikolize v astrocitih smo uporabili javno dostopno bazo podatkov (Uniprot 2019). Podatki za vseh 249 potencialnih kandidatov GPCR so predstavljeni v Preglednici 6. 3.2.13 Transkriptom astrocitov Z uporabo podatkov transkriptoma glije, nevronov in žilnih celic možganske skorje smo izvozili podatke za 36 GPCR sirot (Preglednica 7) (Zhang in sod., 2014). 3.2.14 Primerjava sekvenc RNA astrocitov divjega tipa in astrocitov z izbitim genom za GPR81 Podatke za primerjavo izražanja genov GPCR v astrocitih divjega tipa (WT) in astrocitih, ki so imeli izbit gen za GPR81(GPR81KO) smo pridobili iz predhodne študije (Vardjan in sod., 2018). Diferencialno izraženi geni so predstavljeni v Preglednici 8. 3.2.15 Evklidska razdalja podatkov vezavne energije agonistov GPR81 Za določitev novih potencialnih kandidatov za receptorje GPCR, smo ocenili vezavno energijo agonistov GPR81: L-laktata (Ahmed in sod., 2009), 3Cl-5OH-BA (Dvorak in sod., 2012) in 4-metil-N-(5-(2-(4-metilpiperazin-1-il)-2-oksoetil)-4-(2-tienil)-1,3-tiazol-2-il)cikloheksankarboksilamid – Compound 2, ki zvečajo koncentracijo cAMP v astrocitih WT in astrocitih GPR81KO (Vardjan in sod., 2018). Vezavne energije vseh treh agonistov smo izračunali za vsak protein GPCR (Preglednica 5) in dobili 3 vrednosti za vsak protein GPCR, ki smo jih predstavili v 3-dimenzionalnem Evklidskem prostoru, ki predstavlja geometrijsko razdaljo v večdimenzionalnem prostoru, določeno z enačbo: 𝑅 = ∑√𝑥2 …(3) 𝑖 Vrednost xi predstavlja normalizirano vrednost vezavne energije med receptorjem in ligandom, ki smo jo dobili s programom Autodock Vina (Trott in Olson, 2010), ki v svojem lokalnem postopku optimizacije uporablja sofisticirano metodo optimizacije gradienta. S surovimi podatki vezavnih energij za vsak ligand in receptor smo ocenili v petdesetih tehničnih replikah (poskus in silico), kjer je bila v vsaki repliki sprejeta le najnižja vrednost in uporabljena za nadaljnji izračun povprečne vrednosti. Dobljene povprečne vrednosti smo normalizirali z enačbo: (X – Xmin) X’ = …(4) (Xmax – Xmin) 16 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kristalne strukture proteinov GPCR smo prenesli iz baze podatkov GPCRdb (Munk in sod., 2016). Dobljene podatke smo nato predstavili v kartezijskem koordinatnem sistemu. Na kratko, kartezijske koordinate določajo točko v n-dimenzionalnem evklidskem prostoru za katerokoli n-dimenzijo (Brannan in sod., 1999). Kot evklidske razdalje smo uporabili normalizirane vrednosti surovih vezavnih energij za vsak protein GPCR. Kriterij za sprejem domnevne interakcije med ligandom in receptorjem smo definirali kot evklidsko razdaljo, ki je bila nižja ali enaka evklidski razdalji GPR81 v prej omenjenem 3-dimenzionalnem kartezijskem prostoru (Preglednica 9). 17 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 REZULTATI 4.1 RAZMERJE SIGNALA FRET JE NEODVISNO OD KOLIČINE NANOSENZORJA FRET V CITOSOLU Razmerjemerne meritve fluorescence označevalcev so v temelju neodvisne od artefaktov, ki so povezani z volumsko heterogeno porazdelitvijo nanosenzorja znotraj celice (G Grynkiewicz, 1985). To smo preverili pri skupno osmih astrocitih, ki so bili transfecirani z nanosenzorjem FRET Epac1-camps. Pri tem smo izračunali Pearsonov koeficient korelacije (R) med normalizirano vsoto intenzitet fluorescence kanalov CFP in YFP (CFP + YFP), ki je sorazmerna količini fluoroforja v celici, ter normaliziranim razmerjem kanalov CFP in YFP (CFP/YFP), meritev, ki predstavlja koncentracijo znotrajceličnega cAMP, na ravni posameznih slikovnih pik izračunana vrednost R je znašala -0,01 (Slika 4U; n = 492097 slikovnih pik). Tako lahko zaključimo, da med omenjenima parametroma ni korelacije, torej sta parametra neodvisna, kar je skladno z že objavljenim (G Grynkiewicz, 1985). To tudi pomeni, da regijsko specifične razlike v količini nanosenzorja ne vplivajo na meritve koncentracije znotrajceličnega cAMP, prek razmerjemerne metode. 18 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 4: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem intenzitete fluorescence kanalov CFP in YFP, v astrocitih. (A-D) Mikroskopske slike fluorescence signalov (A) CFP in (B) YFP v astrocitih transfeciranih z nanosenzorjem Epac1-camps, v mirovanju, (A, B) pred in (C, D) po odštetju fluorescence ozadja (okvir 50 x 50 slikovnih pik; bg). Merilo 20 µm. Histogrami frekvence porazdelitev fluorescence slikovnih pik kanalov CFP, YFP, CFP + YFP in CFP/YFP, brez odštevanja fluorescence ozadja (raw), (I-L) ozadja (bg) in (M-P) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R-T) Primerjava korelacij med vsoto kanalov CFP + YFP in razmerjem kanalov CFP/YFP, (R) brez odštevanja ozadja (raw), (S) ozadje (bg) in (T) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R) Pearsonov koeficient korelacije je pokazal negativno korelacijo med vsoto kanalov CFP + YFP in razmerjem kanalov CFP/YFP, ki se je po 19 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 odštetju (S) ozadja (T) izničila. (U) Primerjava normaliziranih podatkov vsote kanalov CFP + YFP in razmerja kanalov CFP/YFP pri mikroskopskih slikah z odštetim ozadjem, v 8 astrocitih, transfeciranih z nanosenzorjem Epac1-camps. Sodeč po Pearsonovem koeficientu korelacije (R=-0,01), korelacija vseh slikovnih pik ni prisotna (n = 492097 slikovnih pik). Metodo določanja heterogenosti [cAMP]i smo ponovili tudi pri osmih celicah 3T3, ki so bile transfecirane z nanosenzorjem FRET Epac1-camps. Vrednost R je znašala -0,06 (Slika 5U; n = 151859 slikovnih pik). Rezultati tudi na tem celičnem tipu kažejo, da je razmerjemerna metoda meritve cAMP neodvisna od količine nanosenzorja v različnih predelih celice in njegove volumske porazdelitve. 20 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 5: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem intenzitete fluorescence kanalov CFP in YFP, v celicah 3T3. (A-D) Mikroskopske slike fluorescence signalov (A) CFP in (B) YFP v celicah 3T3 transfeciranih z nanosenzorjem Epac1-camps, v mirovanju, (A, B) pred in (C, D) po odštetju fluorescence ozadja (okvir 50 x 50 slikovnih pik; bg). Merilo 20 µm. Histogrami frekvence porazdelitev fluorescence slikovnih pik kanalov CFP, YFP, CFP + YFP in CFP/YFP, brez odštevanja fluorescence ozadja (raw), (I-L) ozadja (bg) in (M-P) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R-T) Primerjava korelacij med vsoto kanalov CFP + YFP in razmerjem kanalov CFP/YFP, (R) brez odštevanja ozadja (raw), (S) ozadje (bg) in (T) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R) Pearsonov koeficient korelacije je pokazal negativno korelacijo med vsoto kanalov CFP + YFP in razmerjem kanalov CFP/YFP, ki se je po odštetju (S) ozadja (T) izničila. (U) Primerjava normaliziranih podatkov vsote kanalov CFP + YFP in razmerja kanalov CFP/YFP 21 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 pri mikroskopskih slikah z odštetim ozadjem, v 8 celicah 3T3, transfeciranih z nanosenzorjem Epac1-camps. Sodeč po Pearsonovem koeficientu korelacije (R=-0,06), korelacija vseh slikovnih pik ni prisotna (n = 151859 slikovnih pik). Neodvisnost razmerjemernih meritev fluorescence označevalcev od volumskih artefaktov smo preverili pri petih astrocitih in osmih celicah 3T3, transfeciranih z nanosenzorjem Laconic. Izračunali smo Pearsonov koeficient korelacije med normalizirano vsoto kanalov mTFP in Venus (mTFP + Venus), ki je sorazmerna količini fluoroforjev v celici in normaliziranim razmerjem kanalov mTFP in Venus (mTFP/Venus), ki predstavlja koncentracijo znotrajceličnega L-laktata. V primeru Pearsonovega koeficienta korelacije pri astrocitih je vrednost R znašala -0,15 (Slika 6U; n = 183725 slikovnih pik), v primeru celic 3T3 pa 0,14 (slika 7U; n = 18531 slikovnih pik). To je potrdilo naše domneve, da je naša metoda meritev L-laktata neodvisna od volumske porazdelitve nanosenzorja Laconic. 22 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 6: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem kanalov mTFP in Venus, v astrocitih. (A-D) Mikroskopske slike fluorescence signalov (A) mTFP in (B) Venus v astrocitih trasfeciranih z nanosenzorjem Laconic, v mirovanju, (A, B) pred in (C, D) po odštetju fluorescence ozadja (okvir 50 x 50 slikovnih pik; bg). Merilo 20 µm. Histogrami frekvence porazdelitev fluorescence slikovnih pik kanalov mTFP, Venus, mTFP + Venus in mTFP/Venus, brez odštevanja fluorescence ozadja (raw), (I-L) ozadja (bg) in (M-P) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R-T) Primerjava korelacij med vsoto kanalov mTFP + Venus in razmerjem kanalov mTFP/Venus, (R) brez odštevanja ozadja (raw), (S) ozadje (bg) in (T) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R) Pearsonov koeficient korelacije je pokazal negativno korelacijo med vsoto kanalov mTFP + Venus in razmerjem kanalov mTFP/Venus, ki se je po odštetju (S) ozadja (T) izničila. (U) Primerjava normaliziranih podatkov vsote kanalov mTFP + Venus in razmerja kanalov 23 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 mTFP/Venus pri mikroskopskih slikah z odštetim ozadjem, v 5 astrocitih, transfeciranih z nanosenzorjem Laconic. Sodeč po Pearsonovem koeficientu korelacije (R=-0,14), korelacija vseh slikovnih pik ni prisotna (n = 183725 slikovnih pik). Slika 7: Korelacija med količino fluoroforjev in razmerjem kanalov mTFP in Venus, v celicah 3T3. (A-D) Mikroskopske slike fluorescence signalov (A) mTFP in (B) Venus v celicah 3T3 trasfeciranih z nanosenzorjem Laconic, v mirovanju, (A, B) pred in (C, D) po odštetju fluorescence ozadja (okvir 50 x 50 slikovnih pik; bg). Merilo 20 µm. Histogrami frekvence porazdelitev fluorescence slikovnih pik kanalov mTFP, Venus, mTFP + Venus in mTFP/Venus, brez odštevanja fluorescence ozadja (raw), (I-24 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 L) ozadja (bg) in (M-P) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R-T) Primerjava korelacij med vsoto kanalov mTFP + Venus in razmerjem kanalov mTFP/Venus, (R) brez odštevanja ozadja (raw), (S) ozadje (bg) in (T) z odštetim ozadjem (bg sub.). (R) Pearsonov koeficient korelacije je pokazal negativno korelacijo med vsoto kanalov mTFP + Venus in razmerjem kanalov mTFP/Venus, ki se je po odštetju (S) ozadja (T) izničila. (U) Primerjava normaliziranih podatkov vsote kanalov mTFP + Venus in razmerja kanalov mTFP/Venus pri mikroskopskih slikah z odštetim ozadjem, v 8 celicah 3T3, transfeciranih z nanosenzorjem Laconic. Sodeč po Pearsonovem koeficientu korelacije (R=-0,14), korelacija vseh slikovnih pik ni prisotna (n = 18531 slikovnih pik). 4.2 PODCELIČNA HETEROGENOST PORAZDELITVE [cAMP]i V ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 Za ugotavljanje heterogene porazdelitve [cAMP]i smo analizirali majhne regije zanimanja, postavljene v ravni vrsti pravokotno od jedra v smeri proti obrobju celice (Slika 8A). V regijah zanimanja smo analizirali časovno-odvisne spremembe v razmerju CFP/YFP, pred in po stimulaciji z NA. Časovna odvisnost razmerja CFP/YFP v regijah zanimanja je bila podobna kot pri analizi celotne celice. Analiza sprememb v regijskem razmerju mirovnih signalov CFP/YFP od jedra proti periferiji smo opazili statistično značilno spremembo v 8 astrocitih (11/16 smeri; Preglednica 1). Reprezentativni primer znižanja [cAMP]i v astrocitih je prikazan na Sliki 8B in 8C. 25 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 8: Analiza majhnih regij cAMP zanimanja v astrocitu. (A) Mikroskopska slika razmerja kanalov CFP/YFP in majhnih krožnih regij zanimanja (premer 2 µm) od jedra proti periferiji celice. Spremembe v razmerju CFP/YFP, sorazmerne spremembam v ([cAMP]i), (B) v mirovanju in (C) po stimulaciji s 100 µM NA, v odvisnosti od razdalje od jedra proti periferiji celice. Prikazana sta reprezentativna naklona (P ≤ 0,001; Studentov t-test). Merilo 10 µm. V celicah 3T3 (n = 8) je bilo statistično značilnih sprememb manj (5/16 smeri; Preglednica 2), od tega so bili trije statistično značilni padci in dva primera statistično značilne rasti podcelične [cAMP]i, v mirovanju. V primeru prisotnosti negativnega ali pozitivnega trenda signala CFP/YFP od jedra proti periferiji celic v mirovanju (Slika 9A, C), smo v enaki celici opazili enak trend tudi po stimulaciji s 100 µM NA (Slika 9B, D). Ti rezultati kažejo na domnevno soodvisnost med subcelično lokalizacijo [cAMP]i pred in po stimulaciji z NA. 26 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 9: Analiza majhnih regij cAMP zanimanja v celici 3T3. (A) Spremembe v razmerju CFP/YFP, sorazmerne spremembam v ([cAMP]i), (A, C) v mirovanju in (B, D) po stimulaciji s 100 µM NA, v odvisnosti od razdalje od jedra proti periferiji celice. Prikazani so reprezentativni nakloni (P ≤ 0,05; Studentov t-test). V nadaljevanju smo za vsak tip celic korelirali normalizirane vrednosti razmerja CFP/YFP v mirovanju, z vrednostmi razmerja CFP/YFP po stimulaciji; ločeno za astrocite (n = 160; Preglednica 1) in za celice 3T3 (n = 81; Preglednica 2) (Slika 10A, B). V obeh tipih celic smo zaznali statistično značilno pozitivno korelacijo (Rastro = 0,690; P ≤ 0,001; Slika 10A in R3T3 = 0,477, P ≤ 0,001; Slika 10B). Ti rezultati kažejo, da mikrodomene z nižjo koncentracijo cAMP dosežejo relativno manjše zvečanje [cAMP]i po stimulaciji, mikrodomene z relativno večjo [cAMP]i v mirovanju pa dosežejo proporcionalno večjo [cAMP]i po stimulaciji. Slika 10A predstavlja heterogenost porazdelitve cAMP v celicah astrocitov, Slika 10B pa heterogenost porazdelitve cAMP v celicah 3T3. 27 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 10: Podcelična heterogenost cAMP v astrocitih in celicah 3T3. Grafa predstavljata primerjavi normaliziranih vrednosti razmerij CFP/YFP v mirovanju in po stimulaciji z 100 µM NA, (A) v astrocitih in (B) v celicah 3T3. V obeh primerih je prisotna statistično značilna pozitivna korelacija podatkov (P ≤ 0,001; Studentov t-test). 4.3 PODCELIČNA HETEROGENOST PORAZDELITVE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) V ASTROCITIH IN CELICAH 3T3 Kakor pri določanju podcelične heterogenosti [cAMP]i, smo enako postopali pri določanju heterogenosti morebitne celične porazdelitve [L-laktat]i. Analizirali smo majhne krožne regije zanimanja (premer 2µm), položene linearno pravokotno od jedrnega roba proti obrobju celice. Pri tem smo uporabili nanosenzor FRET Laconic, ki poroča o spremembah [L-laktat]i (signalu mTFP/Venus) v realnem času (Metode). V mirovanju smo pri astrocitih (n = 5) opazili statistično značilno spremembo v signalu mTFP/Venus v regijah med jedrom in celičnim obrobjem astrocitov (9/10 smeri; Preglednica 3) in pri celicah 3T3 (8/16 smeri; Preglednica 4). V vseh primerih je bil prisoten negativen trend, kar bi lahko pomenilo, da se [L-laktat]i v mirovanju celic znižuje v smeri od jedra proti celičnemu obrobju (Slika 11A in Slika 12A). Enak trend smo v obeh tipih celic opazili tudi po stimulaciji z agonistom Smart009 (konc. 1 mM; Slika 11B in konc. 5 µm; Slika 12B). Ti rezultati kažejo na domnevno soodvisnost med vrednostjo [L-laktat]i v neki točki v mirovanju in po stimulaciji s Smart009. Slika 11: Analiza majhnih krožnih regij zanimanja (premer 2 µm) v astrocitu. Spremembe v razmerju mTFP/Venus, sorazmerne spremembam v [L-laktat]i , (A) v mirovanju in (B) po stimulaciji s Smart009 (1 µM). Prikazana sta reprezentativni odvisnosti posneti v enem astrocitu (P ≤ 0,001; Studentov t-test). 28 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Dodatno smo analizirali tudi, če se intenziteta regijskih odzivov na stimulacijo s Smart009 spreminja v odvisnosti od oddaljenosti od jedra proti celičnemu obrobju. Podatke iz posameznih krožnih regij zanimanja smo primerjali tako, da smo pri vsakem tipu celic odšteli vrednosti signala mTFP/Venus v mirovanju od vrednosti signala mTFP/Venus po stimulaciji astrocitov z 1mM Smart009 in celic 3T3 s 5µM Smart009. Razlike smo primerjali z oddaljenostjo od jedra in na podatkih z linearno regresijo določili parameter premice y = k * x + n, kjer y predstavlja razliko med razmerjem mTFP/Venus po stimulaciji in razmerjem mTFP/Venus v mirovanju; x je oddaljenost od jedra (µm); k je naklon regresijske premice (µm-1); n je presečišče z osjo y. Linearna funkcija je v obeh tipih celic pokazala relativno majhen, ampak statistično značilno različen naklon. Ta predstavlja prostorsko porazdelitev intenzitete produkcije L-laktata. V primeru astrocitov smo statistično značilni padec opazili pri veliki večini analiziranih smeri regijskih območij (9/10 smeri; Preglednica3). V celicah 3T3 je bilo statistično značilnih sprememb manj (6/16 smeri; Preglednica 4), od tega so bili štirje statistično značilni padci in dva primera statistično značilne rasti prostorsko porazdeljene podcelične sinteze L-laktata. Reprezentativna naklona prikazana na Sliki 12C, D. Slika 12: Analiza majhnih krožnih regij zanimanja (premer 2µm) v celicah 3T3. Spremembe v razmerju mTFP/Venus, sorazmerne spremembam v [L-laktat]i, (A) v mirovanju in (B) po stimulaciji s Smart009 (5 µM). Prikazana sta reprezentativna naklona (P ≤ 0,001; Studentov t-test). (C, D) Primerjava razlike med normaliziranimi vrednostmi razmerja mTFP/Venus po stimulaciji in v mirovanju (razlika = stimulacija – mirovanje). Prikazana sta reprezentativna naklona (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; Studentov t-test). 29 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V nadaljevanju smo za vsak tip celic primerjali vse normalizirane vrednosti razmerja mTFP/Venus v mirovanju z vrednostmi po stimulaciji; ločeno za astrocite (n = 186) (Slika 13A) in za celice 3T3 (n = 173) (Slika 13B). V obeh tipih celic smo zaznali statistično značilno pozitivno korelacijo (Rastro = 0,950 in R3T3 = 0,962). Ti rezultati kažejo, da mikrodomene z nižjim [L-laktat]i dosežejo relativno nižje vrednosti [L-laktat]i po stimulaciji, mikrodomene z relativno višjo [L-laktat]i v mirovanju pa dosežejo relativno višji [L-laktat]i po stimulaciji. Slika 13: Podcelična heterogenost koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v astrocitih in celicah 3T3. Grafa predstavljata primerjavo normaliziranih vrednosti razmerij mTFP/Venus v mirovanju in po stimulaciji s Smart009, (A) v astrocitih in (B) v celicah 3T3. V obeh primerih grafov je prisotna statistično značilna pozitivna korelacija (P ≤ 0,001; Studentov t-test). 4.4 RAZLIKE V ČASOVNO-ODVISNIH SPREMEMBAH CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) V CELICAH 3T3, POVZROČENE Z RAZLIČNIMI KONCENTRACIJAMI MOLEKUL SMART075 ALI SMART009 Znotrajcelični L-laktata [L-laktat]i je predhodno povezan s spremembami znotrajceličnega sekundarnega prenašalca cAMP [cAMP]i, saj je bilo pokazano, da se ob dodatku NA, ki aktivira receptorje GPCR na površini celic, zveča [cAMP]i, posledično pa tudi [L-laktat]i (Vardjan in sod., 2018) Zaradi pozitivne povratne zanke se ob dodatku zunajceličnega L-laktata, aktivirajo laktatni receptorji, ki so neznani, in tudi lahko zvečajo [L-laktat]i (Vardjan in sod., 2018), a narava tega receptorja ni znana. Ta pojav je bil opisan kot "presnovna vzdražnost" (Vardjan in sod., 2018). Zelo verjetno je, da pri tem procesu ne sodeluje klasični L-laktatni receptor GPR81, saj so agonisti za ta receptor v astrocitih brez tega receptorja tudi zvečali [L-laktat]i (Vardjan in sod., 2018). Da bi identificirali novi L-laktatni, še nepoznani, receptor, smo uporabili celice 3T3 (divji tip – 3T3WT), transfecirane z nanosenzorjem Laconic, in testirali ali predhodno uporabljeni selektivni agonist za GPR81 Smart075 (Dvorak in sod., 2012) in ligand Smart009, ki je bil določen z metodami molekulske dinamike in silico (Zorec, 2018), stimulirata zvečanje [L-laktat]i pri koncentracijah 5, 50 in 500 µM. Reprezentativne časovno-odvisne učinke obeh ligandov na [L-laktat]i prikazuje Slika 14A, povprečne vrednosti spremembe v [L-laktat]i vseh celic v raziskavi pa Slika 14B. Frekvence odzivnosti celic so prikazane v Preglednici 5. Obe molekuli Smart sodita 30 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 v družino 3-hidroksi-5-substituiranih benzojskih kislin in imata podobne značilnosti sprožitve časovno odvisnih sprememb znotrajceličnega L-laktata, kot NA; začetna faza poteka z eksponentno rastjo, ki ji sledi faza stacionarnega stanja, kjer [L-laktat]i doseže plato (Vardjan in sod., 2018), kar smo merili z integriranjem časovnega odziva po dodatku ligandov (angl. area under curve – AUC, Metode). Po stimulaciji celic 3T3WT z molekulami Smart, smo opazili razliko v amplitudi stacionarnega stanja v [L-laktat]i pri različnih koncentracijah. V primeru stimulacije s Smart075 smo izmerili korelirano zvečanje v [L-laktat]i pri zvečani koncentraciji agonista (Slika 14A). Pri ligandu Smart009 je bila dozna odvisnot odzivov bolj zapletena, saj smo opazili zvečane amplitude stacionarnega stanja in zvečano frekvenco odzivnosti pri relativno nizki koncentraciji (5 do 10 µM) in potem pri koncentracijah višjih od 100 µM. Pri koncentraciji 50 µM so bili odzivi celic zmanjšani v amplitude in v frekvenci odzivnosti: pri 5 µM (AUC = 8,55 ± 1,34 %, n=81) večji kot pri 50 µM (AUC=0,46 ± 0,64, n=26; Slika 14B, Razpredelnica 5). Pri koncentracijah Smart009 nad 500 µM je [L-laktat]i pričel eksponentno naraščati Slika 15B). Slika 14: Časovno-odvisne spremembe znotrajcelilčne koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v celicah 3T3WT, povzročene s Smart075 ali Smart009. (A) Reprezentativni in (B) povprečni odzivi [L-laktat]i , ki smo jih izmerili kot razmerje med kanaloma mTFP/Venus. Število stimuliranih celic na sliki B (Smart075/Smart009): pri 0 µM (n = 30); 5 µM (n = 61/80); 50 µM (n = 19/26) in pri 500 µM (n = 77/88). (B) povprečni odzive s standardno napako (s.n.). Koncentracije uporabljenih agonistov so zapisane na sredini obeh panelov. Za negativno kontrolo smo dodali ZCR (0 µM). Procenti odzivnosti celic so prikazani v Preglednici 5. 31 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4.5 PRIMERJAVA DOZNE ODVISNOSTI SPREMEMB CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L-LAKTAT]i) PO STIMULACIJI S SMART075 ALI SMART009 V CELICAH 3T3WT Za boljšo predstavitev razlik v odzivih ob stimulaciji celic z molekulama Smart, smo v nadaljevanju naredili krivuljo dozne odvisnosti (Slika 15). Krivulji prikazujeta odvisnost med celičnimi odzivi v [L-laktat]i in koncentracijo ligandov, kjer posamezne točke prikazujejo povprečno, integrirano površino pod krivuljo izmerjenih odzivov (Slika 15), prikazanih kot AUC (glej Metode). Pri stimulaciji s Smart075 dozno odvisnost oriše sigmoidna funkcija, kjer je koncentracija, ki povzroči 50 % maksimalnega učinka približno 300 µM (Slika 15A). Pri stimulaciji s Smart009 prilagajanje sigmoidne funkcije ni bilo mogoče, saj so se po predhodnem zvečanju odzivov celic pri koncentraciji 5-10 µM, le-ti močno prehodno zmanjšali pri 50 µM in potem spet zvečevali do koncentracije 500 µM (Slika 15B). Rezultati na Sliki 14 in 15 kažejo, da sta učinkovitosti molekul Smart075 in Smart009 zelo različni. Pri prvi molekuli dozna odvisnost kaže na preprostejši farmakološki mehanizem, kot v primeru delovanja molekule Smart009, kjer sta vsaj dva vrhova v odvisnosti (Slika 14B), ki kaže na vpletenost vsaj dveh receptorskih mehanizmov delovanja na spremembe [L-laktat]i v celicah 3T3WT. V nadaljevanju disertacije nas je zanimalo, kako določiti možne nove receptorje, ki uravnavajo [L-laktat]i. Slika 15: Dozne odvisnosti sprememb citosolne koncentracije L-laktata ([L-laktat]i), po stimulaciji z molekulama Smart075 ali Smart009 v celicah 3T3WT. (A) Slika prikazuje dozno odvisnost po stimulaciji celic 3T3WT s Smart075. Točke predstavljajo povprečne vrednosti površine pod krivuljo (AUC; %) po stimulaciji s Smart075, merjenimi z nanosenzorjem Laconic (mTFP/Venus). Vrednosti po stimulaciji z 1 mM in 2mM koncentracijo so bile ločeno statistično različne od odzivov pri 50 µM, 10 µM, 5 µM, 250 nM, 500 nM, 5 nM in negativne kontrole (*** P ≤ 0,001). Vrednosti pri stimulaciji 500 µM so bile ločeno statistično značilne od koncentracij 5 µM, 250 nM, 500 nM, 5 nM in negativne kontrole (*** P ≤ 0,001). (B) Povprečne vrednosti AUC po stimulaciji celic 3T3WT s Smart009. Insert predstavlja vrhova odzivov pri koncentracijah 5 µM in 10 µM. Vrednosti po stimulaciji z 2 mM koncentracijo so bile ločeno statistično različne od koncentracij 100 µM, 50 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM, 500 32 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nM, 5 nM in negativne kontrole (*** P ≤ 0,001). Vrednosti po stimulaciji z 1 mM so bile ločeno statistično različne od koncentracij 500 nM in kontrole (*** P ≤ 0,001). Vrednosti po stimulaciji z 500 µM so bile ločeno statistično različne od koncentracij 50 µM, 250 nM, 500 nM. 5 nM in negativne kontrole (*** P ≤ 0,001). Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno analizo variance (angl. "One-way" ANOVA) in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001). Števila testiranih celic so napisana ob krivuljah za vse testirane koncentracije. 4.6 KANDIDATI GPCR IN PREGLED ODZIVOV CELIC 3T3KO NA STIMULACIJO S SMART075 ALI SMART009 Znano je, da agonist Smart075 zveča [cAMP]i in posledično tudi [L-laktat]i v astrocitih divjega tipa, kot tudi v astrocitih z izbitim genom za GPR81 (GPR81KO) (Vardjan in sod., 2018). Ta rezultat je pokazal, da Smart075 vpliva na signalizacijo s cAMP in na aerobno glikolizo neodvisno od GPR81 (Vardjan in sod., 2018), verjetno prek novega, še neodkritega, receptorja. Kandidatne receptorske gene smo izbrali z bioinformatično analizo, ki je vključevala tri kriterije. Prvi kriterij je temeljil na genih GPCR, ki se izražajo v astrocitih (Zhang et al. 2014; Preglednica 7). Drugi kriterij je temeljil na podatkih predhodnega sekvenciranja RNA, kjer smo primerjali izražanje genov sirot GPCR v astrocitih divjega tipa in astrocitih z izbitim genom, ki nosi zapis za GPR81 (Vardjan et al., 2018; Preglednica 8). Tretji kriterij je temeljil na Evklidski razdalji (glej Metode) podatkov vezavne energije treh agonistov GPR81, L-laktata (Ahmed in sod., 2009), Smart075 (Dvorak in sod., 2012) in Compound 2 (Sakurai in sod., 2014) (Preglednica 8). S primerjavo teh treh podatkovnih nizov smo izbrali 7 kandidatnih GPCR genov (Slika 16A), trije so: adrb3, lgr4, p2ry2; štirje ( gprA, gprB, gprC, gprD) imajo oznako v literaturi, da so receptorji GPCR "sirote" (angl. orphan), njihovi endogeni agonisti še niso znani. Za določitev receptorskega mehanizma ob stimulaciji celic s Smart075 in Smart009, smo uporabili 3T3 celične linije z izbitimi posameznimi geni za 4 kandidatne receptorje sirote (celice 3T3KO). Celične linije so bile generirane s tehniko CRISPR-cas9 (Vienna Bio Center, glej Metode). Glede na rezultate dozne odvisnosti stimulacije celic 3T3WT (Slika 15B, insert), smo sklepali, da iskani receptor posreduje zvečanje [L-laktat]i pri stimulaciji s 5-10 µM Smart009. Tako smo pri celicah 3T3KO ob stimulaciji s 5 µM koncentracijo Smart009, pričakovali znižano spremembo [L-laktat]i v celicah z izbitim genom, ki naj bi bil kandidat za novi GPCR Signifikantno razliko smo opazili pri celični liniji 3T3KOB (Slika 16B), kjer celice nosijo delecijo gena gprB, ki spada v družino zelo ohranjenih receptorskih genov izraženih v možganih (angl. super conserved receptor genes expressed in the brain - SREB) (Matsumoto in sod., 2000). 33 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 16: Presejanje kandidatov GPCR. (A) Vennov diagram predstavlja število kandidatov GPCR iz baz podatkov: Transkriptom astrocitov je vključeval podatke za ekspresijo GCPR sirot v astrocitih (Zhang in sod., 2014); Sekveniranje RNA je temeljilo na ekspresiji GPCR sirot v astrocitih divjega tipa in astrocitih z izbitim genom za GPR81 (KO81) (Vardjan in sod., 2018); Evklidska razdalja je predstavljala kandidate izbrane na podlagi najmanjše vezavne energije med receptorjem in ligandom, ter tridimenzionalne Evklidske razdalje, kjer smo preiskovali vezavne energije agonistov Smart075, Compound 2 in L-laktata. (B) Odzivi celic 3T3 z izbitimi geni GPRA, B, C in D na stimulacijo s 5 µM Smart075 ali 5 µM Smart009. (i) Primerjava povprečnih AUC (+ s.n.) po stimulaciji z (črn stolpec) negativno kontrolo in Smart075 (rdeči stolpec) celic 3T3WT, (zeleni stolpec) 3T3KOA, (rumeni stolpec) 3T3KOB, (modri stolpec) 3T3KOC, (roza stolpec) 3T3KOD. (ii) Primerjava povprečnih AUC (+s.n.) po stimulaciji z (črni stolpec) negativno kontrolo in Smart009 (rdeči stolpec) celic 3T3WT, (zeleni stolpec) 3T3KOA, (rumeni stolpec) 3T3KOB, (modri stolpec) 3T3KOC, (roza stolpec) 3T3KOD. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001). Števila testiranih celic so napisana na stolpcih za posamezne celice 3T3. 4.7 PRIMERJAVA SPREMEMB CITOSOLNE KONCENTRACIJE L-LAKTATA ([L- LAKTAT]i) PO STIMULACIJI S 5, 10 IN 50 µM SMART009 NA CELICAH 3T3WT IN TREH RAZLIČNIH KLONIH CELIC 3T3KOB Za validacijo rezultatov na sliki 15, ki kažejo, da je možni novi receptor GPRB, smo s Smart009-izzvano spremembo v [L-laktat]i primerjali v vseh pripravljenih klonih 3T3KOB, kakor tudi s kontrolnimi celicami 3T3WT. Po stimulaciji s 5 in 10 µM Smart009 smo potrdili na treh neodvisnih celičnih klonih linije 3T3KOB (3T3KOBIA11, 3T3KOBIE1, 3T3KOBIC5), da je gen gprB potreben za zaznavanje s Smart009-odvisnim zvečanjem [L-laktat]i (Slika 17). To kaže na pomembnost prisotnosti receptorja GPRB, pri stimulaciji aerobne glikolize v celicah 3T3. 34 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 17: Zmanjšana sprememba [L-laktat]i v celicah 3T3KOB in 3T3WT, po stimulaciji s Smart009. Primerjava sprememb [L-laktat]i merjena z nanosenzorjem Laconic po stimulaciji z 5, 10 in 50 µM Smart009 v celicah 3T3WT in treh različnih klonih z izbitim genom za GPRB (3T3KOB). Grafi predstavljajo povprečno vrednost AUC v kontrolnih celicah (beli stolpci) 3T3WT in v celicah (A) 3T3KOBIE, (B) 3T3KOBIA11, (C) 3T3KOBIC5 (sivi stolpci). Rdeče črtkane črte predstavljajo povprečne vrednosti, beli krogci pa izstopajoče meritve. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno in dvosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001). Števila testiranih celic so napisana ob stolpcih za posamezne celice 3T3. 4.8 DODATNA NEODVISNA POTRDITEV VLOGE GPRB PRI URAVNAVANJU SPREMEMB [L-LAKTAT]i Za dodatno potrditev, da receptor GPRB posreduje zvečanje [L-laktat]i po stimulaciji s 5 µM Smart009, smo celice 3T3KOB transfecirali s plazmidom za konstitutivno izražanje GPRB (GPRB-FLAG). Plazmid kodira tudi zapis za označevalec FLAG, kar omogoča potrditev uspešne transfekcije plazmida GPRB-FLAG z imunocitokemijo s protitelesi proti FLAG (Dupuis in sod., 2017). Pričakovali smo, da bomo s ponovnim vnosom receptorja GPRB rekonstruirali odzivnost celic 3T3KOB (brez gprB) na draženje s Smart009. Pred tem smo standardizirali dvojni vnos plazmidov za Laconinc in za plazmid GPRB-FLAG, tako, da smo spreminjali čas transfekcije in koncentracijo posamičnega plazmida. Uspešno transfekcijo s plazmidom GPRB-FLAG smo potrdili s protitelesi proti označevalcu FLAG. Slika 18 kaže rezultate uspešne transfekcije obeh plazmidov, kar smo določili z deležem celic, ki so bile hkrati pozitivne na Laconic in GPRB-FLAG. Za uspešno imunocitokemično označevanje znotrajcelične prisotnosti proteina GPRB-FLAG, smo celice permeabilizirali z inkubacijo celic z ionomicinom (4 µM), pri čemer pa smo optimizirali čas izpostavitve raztopini z ionomicinom tako, da se intenziteta fluorescence konstrukta Laconic ni znižala. 35 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 18: Optimizacija sočasne transfekcije plazmidov Laconic in GPRB-FLAG. Imunocitokemija celic 3T3KOB, ki so bile ko-transficirane z nanosenzorjem Laconic in plazmidom GPRB-FLAG. Uspešnost transfekcije smo spremljali z merjenjem fluorescence konstrukta Laconic in fluorescence imuno-označenih protiteles proti označevalcu FLAG. (A) Mikroskopske slike celic pod transmisijsko svetlobo (Zeiss HAL 100). (B) Celice, ki so izražale nanosenzor Laconic so emitirale svetlobo pri 535 nm (glej Metode). (C) Celice, ki so izražale plazmid GPRB-FLAG so fluorescirale pri 546 nm (glej Metode). (D) Kolokalizacija svetlobnih točk fluorescence nanosenzorja Laconic in plazmida GPRB-FLAG. (E) Kolokalizacija plazmidov Laconic in GPRB-FLAG, v odvisnosti od različnih koncentracij plazmidov. (F) Kolokalizacija plazmidov Laconic in GPRB-FLAG, v odvisnosti od različnih inkubacijskih časov celic (glej Metode). Števila testiranih celic so navedena ob stolpcih za posamezne celice 3T3. Da bi preverili ali je znižano, s Smart009-inducirano zvečanje [L-laktat]i v celicah 3T3KOB (Slika 17A), posledica odsotnosti GPRB, smo celice 3T3KOB transfecirali s plazmidom GPRB-FLAG, ki nosi zapis za konstitutivno ekspresijo GPRB. Rezultati na sliki 19A prikazujejo povprečne vrednosti AUC po stimulaciji celic 3T3WT (WT), 3T3KOBIE1 (KOBIE1) in celic transficiranih s plazmidom GPRB-FLAG (KOBIE1-FLAG). Povprečna sprememba, ki smo jo povzročili s stimulacijo Smart009, je bila znatno manjša v celicah 3T3KOBIE1 (AUC = -522,8 ± 114,9 %; n=13), v primerjavi s kontrolnimi celicami 3T3WT (AUC = 855,0 ± 134,1 %; n = 81; P ≤ 0,001; Slika 19B). V prisotnosti plazmida GPRB-FLAG se je odziv [L-laktat]i po stimulaciji s Smart009 znatno povečal (AUC = 106,8 ± 77,3) v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,001; Slika 19B). 36 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 19: Rekonstrukcija odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s Smart009 (5 µM), v celicah 3T3KOBIE1, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG. (A) Povprečne normalizirane vrednosti sprememb v [L-laktat]i po stimulaciji s negativno kontrolo (Vehicle) in Smart009 (5 µM), v celicah 3T3WT (WT), 3T3KOBIE1 (KOBIE1) in 3T3KOBIE1, ki so bile transfecirane s plazmidom za konstitutivno ekspresijo GPRB (KOBIE1-FLAG). Pri celicah 3T3KOBIE1 je prišlo do znižanja [L-laktat]i, kar smo rekonstruirali v celicah KOBIE1-FLAG. To kaže, da je bilo za vzpostavitev ponovnih odzivov v [L-laktat]i potrebna prisotnost GPRB. (B) Slika prikazuje primerjavo AUC med celicami 3T3WT, 3T3KOBIE1 in 3T3KOBIE1-FLAG, stimuliranimi z negativno kontrolo (beli stolpci) ali s 5 µM Smart009 (sivi stolpci). Rdeče črtkane črte predstavljajo povprečne vrednosti, beli krogci pa izstopajoče meritve. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno in dvosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001). Števila testiranih celic so navedena ob stolpcih za posamezne celice 3T3. Rezultati na sliki 20A prikazujejo povprečne vrednosti AUC po stimulaciji celic 3T3WT (WT), 3T3KOBIC5 (KOBIC5) in celic transficiranih s plazmidom GPRB-FLAG (KOBIC5-FLAG). Povprečna sprememba, ki smo jo povzročili s stimulacijo Smart009, je bila znatno manjša v celicah 3T3KOBIC5 (AUC = -6,5 ± 49,1 %; n=17), v primerjavi s kontrolnimi celicami 3T3WT (AUC = 855,0 ± 134,1 %; n = 81; P ≤ 0,001; Slika 20B). V prisotnosti plazmida GPRB-FLAG se je odziv [L-laktat]i po stimulaciji s Smart009 znatno povečal (AUC = 309,0 ± 64,1 %; n=27) v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; Slika 20B). Ti rezultati podpirajo hipotezo, da spremembe [L-laktat]i, ki jih izzovemo s Smart009 (5 µM), zahtevajo prisotnost GPRB. 37 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 20: Rekonstrukcija odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s Smart009 (5 µM), v celicah 3T3KOBIC5, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG. (A) Povprečne normalizirane vrednosti sprememb v [L-laktat]i po stimulaciji s negativno kontrolo (Vehicle) in Smart009 (5 µM), v celicah 3T3WT (WT), 3T3KOBIC5 (KOBIC5) in 3T3KOBIC5, ki so bile transfecirane s plazmidom za konstitutivno ekspresijo GPRB (KOBIC5-FLAG). Pri celicah 3T3KOBIC5 je prišlo do znižanja [L-laktat]i, kar smo rekonstruirali v celicah KOBIC5-FLAG. To kaže, da je bilo za vzpostavitev ponovnih odzivov v [L-laktat]i potrebna prisotnost GPRB. (B) Slika prikazuje primerjavo AUC med celicami 3T3WT, 3T3KOBIC5 in 3T3KOBIC5-FLAG, stimuliranimi z negativno kontrolo (beli stolpci) ali s 5 µM Smart009 (sivi stolpci). Rdeče črtkane črte predstavljajo povprečne vrednosti, beli krogci pa izstopajoče meritve. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno in dvosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001). Števila testiranih celic so navedena ob stolpcih za posamezne celice 3T3. Poskuse smo ponovili s stimulacijo s selektivnima agonistoma za GPRB, (Dupuis in sod., 2017). Celice 3T3WT so se odzvale na stimulacijo z ID5128535 (8535, 1 µM) z zvišanjem [L-laktat]i (AUC = 284,60 ± 92,01 %; n = 39). Kot pričakovano se celice 3T3KOBIE1 niso odzvale na stimulus 8535 (1 µM; AUC = -44,47 ± 31,74 %; n = 20), oz. ni bilo razlike v odzivu v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; dvosmerna ANOVA). Odzivi na selektivni agonist so bili prisotni pri celicah 3T3KOBIE1 transfeciranih s plazmidom za konstitutivno izražanje GPRB. Pri tem so bili signifikantno višji (AUC = 464,20 ± 134,54 %; n = 22) kot pri celicah 3T3KOBIE1, brez plazmida (P ≤ 0.001; dvosmerna ANOVA; Slika 21B). 38 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 21: Ponovna vzpostavitev odzivov v [L-laktat]i, povzročenih s 8535, selektivnim agonistom GPRB, v celicah 3T3KOBIE1, transfeciranih s plazmidom GPRB-FLAG. (A) Povprečne normalizirane vrednosti sprememb v [L-laktat]i po stimulaciji s negativno kontrolo (Vehicle) in 8535 (1 µM), v celicah 3T3WT (WT), 3T3KOBIE1 (KOBIE1) in 3T3KOBIE1, ki so bile transfecirane s plazmidom za konstitutivno ekspresijo GPRB (KOBIE1-FLAG; KO-FLAG). Pri celicah 3T3KOBIE1 je prišlo do znižanja z 8353-inducirano spremembo [L-laktat]i, kar smo ponovno vzpostavili v celicah KOBIE1-FLAG (KO-FLAG). To kaže, da je GPRB pomemben za zvečanje [L-laktat]i. (B) Slika prikazuje primerjavo AUC med celicami 3T3WT, 3T3KOBIE1 in 3T3KOBIE1-FLAG, stimuliranimi z negativno kontrolo (beli stolpci) ali z 1 µM 8535 (sivi stolpci). Rdeče črtkane črte predstavljajo povprečne vrednosti, beli krogci pa izstopajoče meritve. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno in dvosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01). Števila testiranih celic so napisana ob stolpcih za posamezne celice 3T3. Pri celicah 3T3WT in 3T3KOBIE1 smo poskuse ponovili tudi s stimulacijo s selektivnim agonistom 8535n, ki ima namesto karbonilne skupine na istem mestu sulfonilno (Dupuis in sod., 2017; Pillaiyar in sod., 2021). Pri stimulaciji z 1 µM 8535n smo opazili zvečanje [L-laktat]i v celicah 3T3WT (AUC = 490,03 ± 87,95 %; n = 29). Pri celicah 3T3KOBIE1 pa nismo zaznali odziva v [L-laktat]i (AUC = -73,02 ± 31,55 %; n =20) oz. ni bilo razlike v odzivu v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; dvosmerna ANOVA) (Slika 22). 39 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 22: Primerjava odzivov [L-laktat]i v celicah 3T3WT (WT) in celicah 3T3KOBIE1 (KOBIE1) po stimulaciji z 1 µM 8535 in 8535n. Slika prikazuje primerjavo AUC med celicami 3T3WT in 3T3KOBIE1, stimuliranimi z negativno kontrolo (beli stolpci), z 1 µM 8535 (temno sivi stolpci) in 1 µM 8535n (svetlo sivi stolpci). Rdeče črtkane črte predstavljajo povprečne vrednosti, beli krogci pa izstopajoče meritve. Za testiranje statistične razlike smo uporabili enosmerno in dvosmerno analizo variance (angl. "One-way ANOVA") in Mann-Whitneyev test za primerjavo posameznih skupin (*** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; * P ≤ 0,05). Števila testiranih celic so napisana ob stolpcih za posamezne celice 3T3. Delež odzivnosti celic 3T3WT na stimulacijo z 8535 je bil 33,3 % (n=19/39), pri stimulaciji z 8535n pa 41,4 % (n=12/29). Rezultati so potrdili, da je za zvečanje [L-laktat]i, po stimulaciji s selektivnim agonistom za GPRB, nujno potrebna prisotnost receptorja GPRB. 40 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 RAZPRAVA Astrociti so tip celic glije, ki igrajo ključno vlogo pri vzdrževanju homeostaze centralnega živčnega sistema (CŽS) (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Celice astroglije so v možganih prisotne v velikem številu, tako zasedajo veliko večino prostora, kar jim omogoča komuniciranje s sinapsami in krvnimi žilami ter z drugimi glialnimi celicami prek kompleksnih izrastkov (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Tako se nahajajo v idealnem položaju za shranjevanje in oskrbo z energijo, vzdrževanje zunajceličnega okolja in dostavo trofičnih dejavnikov (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Te funkcije so pomembne za vzdrževanje ustrezne nevronske aktivnosti, preprečevanje oksidativnega stresa in omogočanje osnovnih možganskih funkcij na primer učenje in tvorjenje spomina (Murphy-Royal in sod., 2017; Bellot-Saez in sod., 2017; Suzuki in sod., 2011; Henneberger in sod., 2010). Astrociti lahko na aktivnost bližnjih nevronov vplivajo z regulacijskim mehanizmom, ki vključuje sproščanje glijotransmiterjev, kot so L-laktat, glutamat, ATP in D-serin (Pellerin in sod., 1998; Pellerin in Magistretti, 1994; Bowser in Khakh, 2004; Panatier in sod., 2006). Astrociti na plazmalemi izražajo številne receptorje GPCR, preko katerih aktivirajo znotrajcelične signalne poti, ki vodijo do porasta različnih sekundarnih prenašalcev, tudi cAMP. Zvečanje [cAMP]i vpliva na posledični porast [L-laktat]i, presnovka aerobne glikolize (Dienel, 2018). V doktorskem delu smo na kulturi podganjih astrocitov in na celicah 3T3 spremljali podcelično dinamiko cAMP in L-laktata, po stimulaciji z agonisti GPCRjev. Ker je zvečanje [L-laktat]i, predhodno povezano s spremembami [cAMP]i smo raziskali ali je porazdelitev [cAMP]i in [L-laktat]i, znotraj celice heterogena in ali to vpliva na odziv celic na agoniste, ki uravnavajo aerobno glikolizo. 5.1 PORAZDELITEV [cAMP]i V ODVISNOSTI OD ODDALJENOSTI OD JEDRA PROTI CELIČNEM OBROBJU Nedavne študije so pokazale, da aktivnost fosfodiesteraze in proteinske kinaze A pogojuje porazdelitev podceličnih mikrodomen cAMP (Bock in sod., 2020; Zhang in sod., 2020). Ker je vloga cAMP v astrocitih pomembna za njeno delovanje (Vardjan in sod., 2014), podcelična porazdelitev [cAMP]i pa še ni bila raziskana, smo se v naši raziskavi osredotočili prav v opredelitev podcelične heterogenosti [cAMP]i. Poleg astrocitov smo uporabili tudi celice 3T3, saj je za oba tipa celic značilno izražanje aerobne glikolize (Vardjan in sod., 2018). V ta namen smo uporabili tehniko FRET, pri kateri se uporablja dva fluorofora s pomočjo katerih lahko merimo razmerje dveh intenzitet fluorescence. S tem se odpravi anomalija meritev fluorescence, ki se pojavi zaradi volumske nehomogenosti celice. Na začetku smo izločili možnosti artefaktov, tako da smo dokazali, da je razmerje signalov fluorescence (CFP/YFP) neodvisno od podcelične količine fluorescenčnega nanosenzorja na optični poti (CFP+YFP) za merjenje znotrajceličnega cAMP (Slika 4, 5). 41 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Analiza podceličnih mikrodomen, ki so bile zaporedno nameščene vzdolž linije od jedra proti periferiji celice, je pokazala, da se v mirovanju znotrajcelični cAMP z oddaljevanjem od jedra se v astrocitih zmanjšuje (Preglednica 1), v celicah 3T3 pa smo opazili trende zviševanja in trende zniževanja cAMP (Preglednica 2). S tem smo potrdili našo raziskovalno hipotezo, da je znotrajcelična koncentracija cAMP v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in fibroblastom podobnih celic 3T3. Podcelična zmožnost sinteze cAMP po stimulaciji z NA, ki smo jo izmerili kot spremembo med cAMP po stimulaciji in pred stimulacijo, v mikrodomenah, ki so si sledile od jedra proti periferiji celice, se je v astrocitih zmanjševala (Slika 8; Preglednica 1), v celicah 3T3 pa smo opazili, da je v nekaterih celicah prisoten trend zniževanja, v drugih pa trend zviševanja (Slika 9; Preglednica 2). Razlog za to podcelično heterogenost porazdelitve cAMP še ni povsem znan, vendar bi lahko razlike v razmerju med površino in prostornino povzročile nastanek gradientov [cAMP]i med različnimi deli celice z višjo koncentracijo [cAMP]i v manjših strukturah celice (Neves in sod., 2008) in prostorske razlike v količini encimov, ki pogojujejo porazdelitev in signalizacijo s cAMP (Bock in sod., 2020; Zhang in sod., 2020). Nadaljnji rezultati v naši študiji so pokazali, da v astrocitih in celicah 3T3 obstaja pozitivna korelacija med razmerjem CFP/YFP v mirovanju in po stimulaciji (Slika 10), kar kaže na to, da mikrodomene z nižjo koncentracijo [cAMP]i dosežejo nižjo raven [cAMP]i, kot mikrodomene z relativno visoko koncentracijo [cAMP]i, po stimulaciji z NA. Ti podatki potrjujejo našo hipotezo, da stimulacija z agonisti za različne GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v znotrajcelični porazdelitvi cAMP. 5.2 PORAZDELITEV [L-LAKTAT]i V ODVISNOSTI OD ODDALJENOSTI OD JEDRA PROTI CELIČNEM OBROBJU V doktorskem delu smo opazovali tudi porazdelitev [L-laktat]i v astrocitih in celicah 3T3. Pri merjenju [L-laktat]i smo uporabili nanosenzor Laconic, pri katerem smo dokazali, da je razmerje signalov fluorescence mTFP/Venus neodvisno od podcelične količine fluorescenčnega nanosenzorja za merjenje znotrajceličnega L-laktata (Slika 6, Slika 7). Za dokaz neodvisnosti smo uporabili enak postopek kot pri merjenju cAMP z nanosenzorjem Epac (glej poglavje 5.1). Nadaljnja analiza podceličnih mikrodomen, ki so bile zaporedno nameščene vzdolž linije od jedra proti periferiji celice, je pokazala, da se količina znotrajceličnega L-laktata v mirovanju znižuje z oddaljenostjo od jedra (Slika 11A, Slika 12A). Ti rezultati potrjujejo hipotezo, da je koncentracija znotrajceličnega L-laktata v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in celic 3T3. Pri obeh tipih celic smo enak trend zmanjševanja L-laktata opazili tudi po stimulaciji celic z agonistom Smart009 (Slika 11B in Slika 12B). Podcelična zmožnost sinteze L-laktata v mikrodomenah po stimulaciji z agonistom Smart009, ki smo jo izmerili kot spremembo med L-laktatom po stimulaciji in pred stimulacijo, se je v astrocitih zmanjševala v smeri od jedra proti periferiji celic. V primeru celic 3T3 pa smo pri nekaterih celicah opazili trend zmanjševanja, v nekaterih celicah trend zviševanja podcelične zmožnosti sinteze L-laktata ali pa kombinacijo 42 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 obojega. Pri merjenju porazdelitve L-laktata glede na oddaljenost od jedra smo opazili, da obstaja pozitivna korelacija med razmerjem mTFP/Venus v mirovanju in po stimulaciji, kar kaže na to, da mikrodomene z nižjo koncetracijo L-laktata dosežejo nižjo raven L-laktata kot mikrodomene z relativno visoko koncentracijo L-laktata po stimulaciji z agonistom Smart009 (Slika 13). Cilj analize razporeditve L-laktata v citoplazmi je bil nasloviti vprašanje ali je L-laktat razporejen nehomogeno, kakor so encimi in substrati, ki so udeleženi v produkciji L-laktata, razporejeni po citoplazmi na specifičnih lokacijah. Metodologija, ki smo jo uporabili neposredno lahko eksperimentalno naslovi to vprašanje. Rezultati so skladni s predvidevanji. 5.3 ISKANJE NOVEGA RECEPTORJA V doktorski nalogi smo raziskovali nov, še ne odkriti receptor, ki naj bi stimuliral aerobno glikolizo astrocitov in posledično tvorbo L-laktata. Mehanizem, poznan kot "presnovna vzdražnost" (Vardjan in sod., 2018), temelji na mehanizmu, kjer zunajcelični L-laktat aktivira neznani receptor. S pomočjo računalniške baze podatkov o geometriji in fizikalnokemijskih lastnostih velikega števila spojin smo poiskali spojino, ki se je najbolje prilegala računalniškem modelu receptorja GPR81 (Zorec, 2018). Poleg tega, se je moral novi domnevni ligand razlikovati od znanih selektivnih agonistov klasičnih L-laktatnih receptorjev, vključno s Smart075 in Compound 2 (Dvorak in sod., 2012; Sakurai in sod., 2014). Ena od molekul, ki je izpolnjevala ta merila je Smart009, pri kateri sta bili dozna odvisnost in odzivnost celic očitno različna od molekule Smart075 (Slika 2). Pri stimulaciji celic s Smart075 smo opazili korelacijo med koncentracijo agonista in celičnim odzivom v [L-laktat]i, medtem ko smo pri stimulaciji celic s Smart009 opazili, da so odzivi celic pri koncetraciji 5 in 10 µM signifikantno višji od odzivov celic pri koncetraciji 50 in 100 µM, pri višjih koncentracijah (500, 1000 in 2000 µM) pa so odzivi celic primerljivi z odzivi pri koncentracijah 5 in 10 µM. NA in zelo verjetno tudi L-laktat (Bergersen in sod., 2001; Peng in sod., 2005) sta primarna prenašalca v CŽS, ki preko aktivacije GPCR na površini astrocitov povzročita spremembo v [cAMP]i in [L-laktat]i. Testirali smo odziv posameznih astrocitov na selektivna agonista receptorja GPR81 (Dvorak in sod., 2012) in opazovali podcelične spremembe v [cAMP]i in [L-laktat]i v realnem času. Spremembe v [cAMP]i smo spremljali s fluorescenčnim mikroskopom ter FRET-nanosenzorjem Epac1-camps (Nikolaev in sod., 2004), ki poroča spremembe v [cAMP]i posredno preko aktivacije proteina Epac, ki je direktno aktiviran s cAMP. Spremembe [L-laktat]i pa smo spremljali s fluorescenčno mikroskopijo in FRET-nanosenzorjem Laconic, ki zazna L-laktat. Poskusi so pokazali, da po stimulaciji celic 3T3WT, ki so izražale FRET-nanosenzor Laconic (San Martín in sod., 2013), z različnimi koncentracijami selektivnih agonistov laktatnega receptorja GPR81, pride do povečanja signala FRET. To posredno kaže na zvečanje [cAMP]i, ki vpliva na zvečanje [L-laktat]i (Vardjan in sod., 2018). V primeru stimulacije z agonistom Smart075 smo zaznali korelacijo med višanjem koncentracije agonista in višanjem odziva celic (Slika 14A). Sklepamo, da gre za mehanizem, kjer en sam receptor posreduje zvečanje [L-laktat]i. Pri stimulaciji z agonistom Smart009 je ta odnos bolj kompleksen, saj imajo odzivi vrhove pri dveh 43 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 koncentracijah, kar kaže na kompleksnost receptorskih mehanizmov (Slika 14B). Ti rezultati kažejo, da Smart075, ki je selektivni agonist GPR81 (EC50 = 16 µM) in Smart009, ki GPR81 ne aktivira, tudi pri 1 mM koncentracijah (Dvorak in sod., 2012), z različnimi doznimi odvisnostimi stimulirata aerobno glikolizo v celicah 3T3, merjeno v povečanju znotrajceličnega laktata. Da bi ugotovili, kateri receptor aktivira molekula Smart009, smo generirali celične linije celic 3T3, z izbitimi specifičnimi geni za kandidatne GPCR-je. 5.4 SPREMEMBE V [L-LAKTAT]i, KI JIH POVZROČIJO AGONISTI V CELICAH 3T3KO V nadaljevanju smo merili odzive celic 3T3, ki so imele izbite 4 posamezne kandidatne gene, GPRA, GPRB, GPRC, GPRD (celice 3T3KO). Celice smo stimulirali s 5 µM Smart075 in Smart009, pri tem smo merili spremembo [L-laktat]i. Pričakovali smo, da če kateri od kandidatnih genov posreduje zvečanje [L-laktat]i pri 5 do 10 µM Smart009 (Slika 14B, insert), bi morala stimulacija celic 3T3KO s 5 µM Smart009 posredovati inhibirano spremembo v [L-laktat]i. Rezultati so pokazali, da je bilo med vsemi testiranimi celičnimi linijami 3T3KO znatno zmanjšanje spremembe v zvečanju [L-laktat]i, po stimulaciji s Smart009, prisotno le pri celicah 3T3KOB (Slika 15Bii). Celice 3T3KOB nosijo delecijo gena GPR27, ki spada v družino super-ohranjenih receptorskih genov, izraženih v možganih (angl. super conserved receptor genes expressed in the brain – SREB) (Matsumoto in sod., 2000b). Za potrditev teh rezultatov smo primerjali odzive [L-laktat]i po stimulaciji s koncentracijami 5, 10 in 50 µM Smart009 v treh celičnih linijah 3T3KOB: 3T3KOBIA11, 3T3KOBIC5 in 3T3KOBIE1. Kot je prikazano na Sliki 16, je pri vseh testiranih celičnih linijah prišlo do bistveno zmanjšane spremembe [L-laktat]i , pri stimulaciji s 5 ali 10 µM (Slika 16). To kaže na potrebo po GPRB pri s Smart009-posredovanem povečanju aerobne glikolize v celicah 3T3. 5.5 PONOVNA VZPOSTAVITEV ODZIVNOSTI V [L-LAKTAT]i CELIC 3T3KOB, POSREDOVANO Z GPRB, S TRANSFEKCIJO PLAZMIDA GPRB-FLAG Za potrditev, da zmanjšana odzivnost [L-laktat]i v celicah 3T3KOB, ki ga povzroči Smart009, smo celice, ki niso izražale gprB transficirali s plazmidom za konstitutivno ekspresijo GPRB. Transfecirane celice so se ob stimulaciji s Smart009 znova odzvale z zvečanjem [L-laktat]i (Slika 19 in Slika 20), kar je potrdilo hipotezo, da je za odzivnost celic ob stimulaciji s Smart009, potrebno izražanje GPRB. V nadaljevanju smo celice stimulirali z nadomestnim selektivnim agonistom 8535 (Dupuis in sod., 2017) in dokazali, da so odzivi v [L-laktat]i (Slika 21) zelo podobni primeru stimulacije s Smart009 (Slika 19 in Slika 20) pri celicah divjega tipa, celicah 3T3KOB in celicah 3T3KOB, ki so konstitutivno izražale GPRB. S tem smo dodatno potrdili vlogo GPRB pri uravnavanju aerobne glikolize po aktivaciji s selektivnima agonistoma. Rezultati poskusov v doktorskem delu so pokazali, da farmakološka aktivacija GPRB v celicah 3T3 povzroči zvečanje [L-laktat]i. Endogeni ligand za GPRB še ni znan, vendar so bili nadomestni selektivni agonisti že opisani, vključno z molekulama 8535 in 8535n (Dupuis in sod., 2017; Pillaiyar in sod., 2021), kar omogoča nadaljnje študije delovanja tega receptorja. 44 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Sklopitev GPRB z G-proteinom je še neznana. Prvotna študija, ki so opravili Chopra in sod., je pokazala, da konstitutivno izražanje GPRB v celicah 293T poveča IP1, kar naj bi pomenilo, da je receptor sklopljen z Gαq-podenoto, njihova zadnja študija pa kaže, da obstaja možnost zmanjšanega izločanja insulina v miškah, ki ne izražajo gena za GPRB, kar bi lahko kazalo na sklopitev z Gαs ali Gαq (Chopra in sod., 2020). Teh rezultatov niso potrdili drugi raziskovalci, saj niso našli nobenih dokazov, da je receptor sklopljen z Gαq, Gαs ali Gαi (Dupuis in sod., 2017). Martin in sod., pa so ugotovili konstitutivno sklopitev GPRB z Gαi (Martin in sod., 2015). 45 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 6 SKLEPI Čeprav naša študija ni obravnavala natančne citosolne signalizacije zvečanja [L-laktat]i, posredovanega z GPRB, rezultati jasno kažejo, da ima ta receptor vlogo pri uravnavanju aerobne glikolize. To smo potrdili s tremi dokazi. Prvi dokaz je ta, da v odsotnosti GPRB, v celicah 3T3KOB, farmakološka aktivacija z aplikacijo Smart009 ali 8353 ni uspela povzročiti zvečanja [L-laktat]i (Slika 17,19,20,21,22). Drugi dokaz vključuje odzive [L-laktat]i, ki smo jih lahko ponovno vzpostavili s transfekcijo plazmida, ki kodira GPRB, v celicah 3T3KOB, ki niso izražale GPRB (Slika 19, Slika 20, Slika 21). Za tretji dokaz pa smo z uporabo nadomestnega selektivnega agonista 8353 (Dupuis in sod., 2017) potrdili, da GPRB izzove zvečanje [L-laktat]i v celicah divjega tipa in v celicah 3T3KOB, predhodno transfeciranih s plazmidom, ki kodira GPRB (Slika 21). Ti rezultati kažejo, da Smart009 in 8535 delujeta podobno na [L-laktat]i v celicah 3T3, pri koncentracijah 1-5 µM, kar kaže, da Smart009 deloma deluje prek GPRB. Poleg tega smo potrdili naše tri raziskovalne hipoteze, da je [cAMP]i v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in fibroblastom podobnih celic 3T3, da stimulacija z agonisti za različne GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v znotrajcelični porazdelitvi cAMP in L-laktata ter, da je [L-laktat]i v mirovanju heterogeno porazdeljena v citosolu astrocitov in celic 3T3. Nedavna študija je pokazala, da z NA stimulirana proizvodnja L-laktata v astrocitih potrebuje vstop in prehod D-glukoze skozi glikogenski šant (Fink in sod., 2021). Zanimivo bo preučiti, ali je povečana glikoliza povezana z aktivacijo GPRB, prav tako kot je aktiviranje adrenergičnih receptorjev v astrocitih (Dienel, 2019), in ali je to odvisno od znotrajceličnega Ca2+ in/ali cAMP (Vardjan in sod., 2018; Horvat in sod., 2021). 46 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 7 POVZETEK Astrociti so celice nevroglije, ki vzdržujejo homeostazo v centralnem živčnem sistemu (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Znano je, da aktivno sodelujejo pri številnih fizioloških in patoloških procesih CŽS prek izločanja kemičnih snovi iz mešičkov (Verkhratsky in Nedergaard, 2018; Zorec in sod., 2012). Zaradi svoje zvezdaste oblike so preko številnih izrastkov v tesnem stiku s sinapsami in z žiljem. Ta anatomsko optimalna umeščenost jim omogoča signaliziranje med endotelijem in nevroni, kjer nudijo presnovno podporo nevronskim mrežam, ki so osrednji porabnik energije v CŽS (Dienel, 2019; Nortley in Attwell, 2017). Astrociti sodelujejo pri prevzemu glukoze iz krvnega obtoka, ki jo kot vir energije posredujejo nevronom ali jo skladiščijo v obliki glikogena. Ob povečanju aktivnosti nevronov se v astroctihi razgradi glikogen do glukoze v procesu aerobne glikolize, nastali L-laktat (Kreft in sod., 2013) se izloči v zunajcelični prostor in posreduje nevronom (t.i. hipoteza o izmenjavi laktata med astrociti in nevroni, angl. "Astrocyte-neuron lactate shuttle", ANLS). Laktat ima poleg energetske vloge tudi signalno vlogo saj verjetno deluje tudi kot primarni prenašalec (Bergersen in sod., 2001), kjer igra vlogo volumskega prenašalca informacij, saj lahko z difuzijo dosega daljše razdalje in aktivira receptorje okrog mesta sproščanja (Morland in sod., 2015), za razliko od sinaptičnega prenosa, kjer razdalja znaša le nekaj deset nanometrov (Borroto-Escuela in sod., 2015; Lauritzen in sod., 2014). Preko L-laktata naj bi astrociti imeli zmožnost modulacije aktivnosti noradrenergičnih nevronov, kjer sproščanje L-laktata iz aktiviranih astrocitov v jedru locus coeruleus povzroči vzbujanje nevronov in posledično sproščanje noradrenalina (NA) (Tang in sod., 2014). Signaliziranje z L-laktatom poteče tudi s pomočjo aktivacije laktatnega receptorja GPR81 ali s pomočjo še neidentificiranih receptorjev plazemske membrane (Tang in sod., 2014; Vardjan in sod., 2018). V astrocitih zunajcelični L-laktat aktivira adenilil ciklazo (AC), kar povzroči povečano sintezo znotrajceličnega cAMP ([cAMP]i) in posledično pospeši aerobno glikolizo. Po stimulaciji astrocitov s selektivnimi agonisti za receptor GPR81 pride do povišanja [cAMP]i tudi, ko celice ne izražajo GPR81 (GPR81KO), kar kaže na to, da ti agonisti aktivirajo še nek neznan receptorski mehanizem. Cilj doktorske naloge je bil potrditi tezi, da sta [L-laktat]i in [cAMP]i v astroctih in celicah 3T3 heterogeno porazdeljena ter, da stimulacija astrocitov in celic 3T3, z agonisti za različne GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v [L-laktat]i in [cAMP]i. Poleg astrocitov smo uporabili tudi celice 3T3MEF, kajti za oba tipa celic je značilno izražanje aerobne glikolize (Leibiger in sod., 2013; Vardjan in sod., 2018). Poskuse smo naredili na celični kulturi podganjih astrocitov in celični kulturi celic 3T3. Spremembe v [L-laktat]i in [cAMP]i v mirovanju in po stimulaciji z agonisti GPCR-jev smo spremljali s pomočjo nanosenzorjev FRET Epac1-camps in Laconic. Ti nanosenzorji so relativno neodvisni od artefaktov, ki so povezani z volumsko porazdelitvijo fluorescenčnih označevalcev. To smo preverili z izračunom Pearsonovega koeficienta korelacije med normalizirano vsoto intenzitet fluorescence kanalov (CFP + YFP, Epac1-camps ali mTFP + Venus, Laconic), ki je 47 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 sorazmerna količini fluoroforjev v celici ter normaliziranim razmerjem kanalov (CFP/YFP, Epac-camps ali mTFP/Venus, Laconic), ki predstavlja koncentracijo preiskovane znotrajcelične molekule. V primeru merjenja [cAMP]i (kanala CFP in YFP) je v astrocitih vrednost R znašala -0,01 (Slika 4U; n = 492097 slikovnih pik), v celicah 3T3 pa -0,06 (Slika 5U; n = 151859 slikovnih pik). V primeru merjenja [L-laktat]i (kanala mTFP in Venus) v astrocitih je vrednost R znašala - 0,14 (Slika 6U; n = 183725 slikovnih pik), v celicah 3T3 pa -0,14 (Slika 7U; n = 18531 slikovnih pik). Podcelično heterogenost porazdelitve cAMP v astrocitih in celicah 3T3, smo merili pred in po stimulaciji z NA, v mikrodomenah, ki so si sledile od jedra proti periferiji celice. Koncentracija cAMP se je v astrocitih zniževala od jedra proti periferiji (Slika 8). V nekaterih celicah 3T3 smo opazili trend zniževanja koncentracije cAMP od jedra proti periferiji celice (Slika 9 A, B), v drugih pa trend zviševanja koncentracije z oddaljenostjo od jedra (Slika 9 C, D). V primeru prisotnosti negativnega ali pozitivnega trenda signala od jedra proti periferiji celic v mirovanju, smo v isti celici opazili enak trend tudi po stimulaciji z NA (Slika 9). V nadaljevanju smo ugotovili, da v astrocitih in celicah 3T3 stimulacija z agonisti za različne GPCR izzove prostorsko heterogene spremembe v znotrajcelični porazdelitvi cAMP, saj so rezultati pokazali, da obstaja pozitivna korelacija med razmerjem CFP/YFP v mirovanju in po stimulaciji (Slika 10). Enak pristop pri določanju heterogenosti podcelične porazdelitve [cAMP]i smo uporabili pri določanju heterogenosti porazdelitve [L-laktat]i. Analizirali smo majhne krožne regije zanimanja (premer 2um), pravokotno od jedrnega roba proti obrobju celice. V vseh primerih je bil prisoten negativen trend, kar bi lahko pomenilo, da se [L-laktat]i v mirovanju in po stimulaciji z agonistom Smart009 znižuje v smeri od jedra proti periferiji celice (Slika 11 in Slika 12 A, B). Dodatno smo analizirali tudi spreminjanje intenzitete regijskih odzivov na stimulacijo s Smart009, v odvisnosti od oddaljenosti od jedra proti celičnem obrobju. Pri tem smo vrednosti razmerja signalov mTFP/Venus v mirovanju odšteli od vrednosti razmerja po stimulaciji. V primeru astrocitov smo statistično značilni padec intenzitete produkcije L-laktata opazili pri veliki večini analiziranih smeri regijskih območij (9/10 smeri; Preglednica 3). Pri celicah 3T3 je bilo statistično značilnih sprememb manj (6/16 smeri; Preglednica 4), od tega so bil štirje statistično značilni padci in dva primera statistično značilne rasti podcelične sinteze L-laktata. Reprezentativna naklona prikazana na Sliki 12C, D. Za vsak tip celic smo primerjali vse normalizirane vrednosti razmerja mTFP/Venus v mirovanju z vrednostmi po stimulaciji in v obeh tipih celic zaznali statistično značilno pozitivno korelacijo. Na podlagi teh rezultatov lahko sklepamo, da mikrodomene z nižjim [L-laktat]i dosežejo relativno nižje vrednosti [L-laktat]i po stimulaciji, mikrodomene z relativno višjo [L-laktat]i v mirovanju pa dosežejo relativno višjo [L-laktat]i po stimulaciji (Slika 13). Te ugotovitve so nam v pomoč pri raziskovanju celičnih odzivov v L-laktatu, saj moramo zaradi nehomogene porazdelitve laktata v celici spremljati spremembe v celici, namesto da se osredotočamo samo na določene lokacije. 48 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V drugem delu doktorske naloge smo iskali novi L-laktatni, še nepoznani, receptor. Pri tem smo uporabili celice 3T3 (divji tip – 3T3WT), transfecirane z nanosenzorjem Laconic in testirali ali predhodno uporabljeni selektivni agonist za GPR81 Smart075 (Dvorak in sod., 2012) in ligand Smart009 (Zorec, 2018), stimulirata zvišanje [L-laktat]i pri različnih koncentracijah. V primeru stimulacije s Smart075 smo opazili korelacijo med višanjem koncentracije agonista in višanjem odziva celic v [L-laktat]i. Predvidevamo, da je tukaj prisoten enostaven receptorski mehanizem. V primeru stimulacije s Smart009 je bila dozna odvisnost odzivov bolj zapletena, saj smo opazili vrhove odzivov pri več kot eni koncentraciji. Ti rezultati kažejo na to, da je tukaj prisoten več kot en receptorski mehanizem (Slika 14, 15). V nadaljevanju nas je zanimalo, kako določiti nove receptorje, ki uravnavajo [L-laktat]i. Kandidatate za receptorske gene smo izbrali s pomočjo bioinformatične analize, ki je vključevala tri kriterije. Prvi kriterij je vključeval GPCR, ki se izražajo v astrocitih (Zhang in sod., 2014) (Preglednica 7). Drugi kriterij je vključeval podatke predhodnega sekveniranja RNA, kjer smo primerjali izražanje genov sirot GPCR v astrocitih divjega tipa in astroctih z izbitih genom, ki nosi zapis za GPR81 (Vardjan in sod., 2018) (Preglednica 8). Tretji kriterij je vključeval Evklidsko razdaljo podatkov vezavne energije treh agonistov GPR81 (Preglednica 9). Na podlagi teh treh nizov podatkov smo izbrali 7 kandidatnih GPCR genov (Slika 16A), od katerih so štirje bili GPCR sirote ( gprA, gprB, gprC, gprD) in za nas še posebej zanimivi. V nadaljevanju smo uporabili celične linije 3T3 z izbitimi posameznimi geni za 4 kandidatne receptorje sirote (celice 3T3KO). Glede na rezultate dozne odvisnosti stimulacije celic 3T3WT (Slika 15B, insert), smo sklepali, da iskani receptor posreduje zvečanje [L-laktat]i pri stimulaciji s 5-10 µM Smart009. Ob stimulaciji s 5 µM koncentracijo Smart009, pričakovali znižano spremembo [L-laktat]i v celicah z izbitim genom, ki naj bi bil kandidat za novi GPCR. Signifikantno razliko smo opazili pri celični liniji 3T3KOB (Slika 16B), kjer celice nosijo delecijo gena gprB, ki spada v družino zelo ohranjenih receptorskih genov izraženih v možganih (angl. super conserved receptor genes expressed in the brain - SREB) (Matsumoto in sod., 2000a). To smo potrdili na treh neodvisnih klonih celične linih 3T3KOB (3T3KOBIA11, 3T3KOBIE1, 3T3KOBIC5), kar kaže na pomembnost prisotnosti receptroja GPRB, pri stimulaciji aerobne glikolize v celicah 3T3 (Slika 17). Za dodatno potrditev, da receptor GPRB posreduje zvečanje [L-laktat]i po stimulaciji s 5 µM Smart009, smo celice 3T3KOB transfecirali s plazmidom za konstitutivno izražanje GPRB (GPRB-FLAG). Dvojni vnos plazmidov Laconic in GPRB-FLAG smo optimizirali in uspešno kotransfekcijo potrdili s protitelesi proti označevalcu FLAG, ki ga kodira plazmid (Slika 18). Odzive v [L-laktat]i na stimulacijo s 5 µM Smart009 pri celicah 3T3KOBIE1 in 3T3KOBIC5 smo ponovno vzpostavili z vnosom GPRB-FLAG. V prisotnosti plazmida GPRB-FLAG se je odziv v [L-laktat]i po stimulaciji s Smart009 znatno povišal pri celicah 3T3KOBIE1 (AUC = 106,8 ± 77,3) v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,001; Slika 19B). 49 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V primeru celic 3T3KOBIC5 se je v prisotnosti plazmida GPRB-FLAG odziv v [L-laktat]i po stimulaciji s Smart009 znatno povišal pri celicah 3T3KOBIC5 (AUC = 309,0 ± 64,1 %; n=27) v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; Slika 20B). Ti rezultati podpirajo hipotezo, da spremembe [L-laktat]i, ki jih izzovemo s Smart009 (5 µM), zahtevajo prisotnost GPRB. Z uporabo znanih selektivnih agonistov za GPRB (Dupuis in sod., 2017; Pillaiyar in sod., 2021) smo poskuse ponovili. Kot pričakovano po stimulaciji s agonistom 8535 (Dupuis in sod., 2017) pri celicah 3T3KOBIE1 v odzivu (1 µM; AUC = -44,47 ± 31,74 %; n = 21) pri primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; dvosmerna ANOVA), ni bilo razlike. Odzivi na selektivni agonist so bili prisotni pri celicah 3T3KOBIE1 transfeciranih s plazmidom za konstitutivno izražanje GPRB. Pri tem so bili signifikantno višji (AUC = 464,20 ± 134,54 %; n = 22) kot pri celicah 3T3KOBIE1, brez plazmida (P ≤ 0,001; dvosmerna ANOVA; Slika 21B). Poskuse smo ponovili tudi s stimulacijo s selektivnim agonistom 8535n, ki ima namesto karbonilne skupine na istem mestu sulfonilno (Pillaiyar in sod., 2021). Pri stimulaciji z 1 µM 8535n smo opazili zvečanje [L-laktat]i v celicah 3T3WT (AUC = 490,03 ± 87,95 %; n = 29). Pri celicah 3T3KOBIE1 pa nismo zaznali odziva v [L-laktat]i (AUC = -73,02 ± 31,55 %; n =20) oz. ni bilo razlike v odzivu v primerjavi s kontrolo (P ≤ 0,01; dvosmerna ANOVA) (Slika 22). Ti rezultati so potrdili, da je za zvečanje [L-laktat]i, po stimulaciji s selektivnim agonistom za GPRB, nujno potrebna prisotnost receptorja GPRB. Doktorska disertacija je pripomogla k boljšemu razumevanju procesov uravnavanja laktata in cAMP v astrocitih in celicah 3T3 ter tako poglobila razumevanje vloge metabolitov v celični signalizaciji, ki je novo kompetitivno področje v fiziologiji in patofiziologiji osrednjega živčnega sistema. 50 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 8 SUMMARY Astrocytes are neuroglia cells that maintain homeostasis in the central nervous system (Verkhratsky and Nedergaard, 2018). They are known to be actively involved in many physiological and pathological processes of the CNS through the excretion of chemicals from the follicles (Verkhratsky and Nedergaard, 2018; Zorec et al., 2012). Due to their star-shaped shape, they are in close contact with synapses and blood vessels through many protrusions. This anatomically optimal placement allows them to signal between the endothelium and neurons, where they provide metabolic support to neural networks which are the main consumer of energy in the CNS (Dienel, 2019; Nortley and Attwell, 2017). Astrocytes are involved in the uptake of glucose from the bloodstream, which is transported to neurons as an energy source or stored in the form of glycogen. As neuronal activity increases, the glycogen which is stored in astrocytes is broken down into glucose by a process called aerobic glycolysis, and the resulting L-lactate (Kreft et al., 2013) is excreted into the extracellular space and transmitted to neurons (Astrocyte-neuron lactate shuttle, ANLS). In addition to its energy role, lactate also has a signaling function, probably acting as a primary carrier (Bergersen et al., 2001), where it acts as a volume carrier of information, as it can diffuse longer distances and activate receptors around the release site (Morland. 2015), in contrast to synaptic transmission, where the distance is only a few tens of nanometers (Borroto-Escuela et al., 2015; Lauritzen et al., 2014). Through L-lactate, they are thought to have the ability to modulate the activity of noradrenergic neurons, where in the locus coeruleus nucleus, the release of L-lactate from activated astrocytes causes neuronal excitation and a consequent release of norepinephrine (NE) (Tang et al., 2014). L-lactate signaling also occurs through the activation of the lactate receptors, such as GPR81 or through a yet unidentified plasma membrane receptor (Tang et al., 2014; Vardjan et al., 2018). In astrocytes, extracellular L-lactate activates adenylyl cyclase (AC), resulting in an increased synthesis of intracellular cAMP ([cAMP]i) and consequently accelerating aerobic glycolysis. Following the stimulation of astrocytes with selective agonists for the GPR81 receptor, an increase in [cAMP]i occurs even when cells do not express GPR81 (GPR81KO), suggesting that these agonists activate another yet unknown receptor mechanism. The aim of this doctoral dissertation was to confirm the thesis that [L-lactate]i and [cAMP]i in astrocytes and 3T3 cells are heterogeneously distributed and that stimulation of astrocytes and 3T3 cells with agonist for different GPCR causes spatially heterogeneous changes in [L-lactate]i and in [cAMP]i. In addition to astrocytes, we used 3T3MEF cells, as both cell types are characterized by the expression of aerobic glycolysis (Leibiger et al., 2013; Vardjan et al., 2018). Experiments were performed on rat astrocyte cell culture and 3T3 cell culture. Changes in [L-lactate]i and [cAMP]i were measured, using FRET nanosensors Laconic and Epac1-camps, respectively, in resting stage and after stimulation with GPCR agonists. These nanosensors are relatively independent of artifacts associated with the volume distribution of fluorescent markers. This was verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the normalized sum of channel 51 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 fluorescence intensities (CFP + YFP for Epac1-camps or mTFP + Venus for Laconic), which is proportional to the amount of fluorophores in the cell, and the normalized channel ratio (CFP/YFP for Epac-camps and mTFP/Venus for Laconic), which represents the concentration of the investigated intracellular molecule. In the case of measuring [cAMP]i (CFP and YFP channels), the value of R was -0.01 in astrocytes (Figure 4U; n = 492097 pixels) and -0.06 in 3T3 cells (Figure 5U; n = 151859 pixels). In the case of measuring [L-lactate]i (mTFP and Venus channels) the value of R was -0.14 in astrocytes (Figure 6U; n = 183725 pixels), and -0.14 in 3T3 cells (Figure 7U; n = 18531 pixels). Subcellular heterogeneity of cAMP distribution in both cell types was measured before and after NE stimulation, in microdomains that followed one another from the nucleus to the cell periphery. The concentration of cAMP in astrocytes decreased from the nucleus towards the periphery (Figure 8). In some 3T3 cells, a trend of decreasing cAMP concentration from the nucleus towards the cell periphery was observed (Fig. 9 A, B), while in others a trend of increasing concentration with distance from the nucleus was observed (Fig. 9 C, D). In the presence of a negative or positive signal trend from the nucleus to the resting cell periphery, the same trend was observed in the same cell even after NA stimulation (Figure 9). We further found that in astrocytes and 3T3 cells, agonist stimulation for different GPCRs causes spatially heterogeneous changes in the intracellular distribution of cAMP as the results showed a positive correlation between resting and post-stimulation CFP/YFP ratio (Figure 10). To determine the heterogeneity of the subcellular [L-lactate]i distribution we used the same approach as in determining the heterogeneity of the [cAMP]i distribution. We analyzed small circular regions of interest (diameter 2µm), perpendicular from the nucleus toward the cell periphery. In all cases, a negative trend was present, which could mean that [L-lactate]i at rest and after stimulation with the Smart009 agonist decreases in the direction from the nucleus to the periphery of the cell (Figure 11 and Figure 12 A, B). We additionally analyzed the intensity changes of regional responses to stimulation with Smart009, depending on the distance from the nucleus to the cell periphery. The values of the mTFP/Venus signal ratio at rest were subtracted from the values of the ratio after stimulation. In the case of astrocytes, a statistically significant decrease in the intensity of L-lactate production was observed in the vast majority of the analyzed directions of regional areas (9/10 directions; Table 3). There were fewer statistically significant changes in 3T3 cells (6/16 directions; Table 4), of which four were statistically significant decreases and two were statistically significant increases in subcellular L-lactate synthesis. Representative slopes for 3T3 cells are shown in Figures 12C, D. For each cell type, all normalized values of the resting mTFP/Venus ratios were compared with the values after stimulation, and a statistically significant positive correlation was detected in both cell types. Based on these results, we can conclude that microdomains with lower [L-lactate]i achieve relatively lower values of [L-lactate]i after stimulation, and microdomains with 52 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 relatively higher [L-lactate]i at rest achieve relatively higher [L-lactate]i after stimulation (Figure 13). These findings contribute to the better understanding of cellular biological responses (i.e. L-lactate production) because it is expected that enzymes and substrates for L-lactate production are likely positioned within specific location and not homogeneously within the cytoplasm. In the second part of this doctoral thesis, we searched for a new L-lactate receptor. We used 3T3 cells (wild type - 3T3WT) transfected with the Laconic nanosensor and tested the previously used selective agonist for GPR81, Smart075 (Dvorak et al., 2012) and ligand Smart009 (Zorec, 2018) to stimulate the increase in [L-lactate]i at different concentrations. In the case of Smart075 stimulation, a correlation was observed between the increase in agonist concentration and the increase in cell response in [L-lactate]i. We hypothesize that a simple receptor mechanism is present here. In the case of Smart009 stimulation, the dose-response response was more complex, as response peaks were observed at more than one concentration. These results suggest that more than one receptor mechanism is present (Figures 14, 15). Next, we were interested in how to determine new receptors that regulate [L-lactate]i. Candidates for receptor genes were selected using bioinformatics analysis that included three criteria. The first criterion included GPCRs which were highly expressed in astrocytes (Zhang et al., 2014) (Table 7). The second criterion included RNA sequencing data, where we compared the expression of GPCR orphan genes in wild-type astrocytes with the expressions from the GPR81 knocked-out astrocytes (Vardjan in sod., 2018) (Table 8). The third criterion included the Euclidean distance binding data of the three GPR81 agonists (Table 9). Based on these three data sets, we selected 7 candidate GPCR genes (Figure 16A), four of which were GPCR orphans (gprA, gprB, gprC, gprD) which were of particular interest to us. Subsequently, we used 3T3 cell lines with knocked out individual genes for 4 orphan candidate receptors (3T3KO cells). Based on the results of the dose dependence of 3T3WT cell stimulation (Fig. 15B, insert), we concluded that the receptor in question would mediate an increase in [L-lactate]i upon stimulation with 5–10 μM Smart009. Upon stimulation with a 5 µM Smart009 concentration, a reduced change in [L-lactate]i was expected in cells that did not express one of the candidate GPCRs. A significant difference was observed in the 3T3KOB cell line (Figure 16B), where cells carry a deletion of the gprB gene, which belongs to the family of highly conserved receptor genes expressed in the brain (SREB) (Matsumoto et al., 2000). This was confirmed in three independent clones of 3T3KOB cell lines (3T3KOBIA11, 3T3KOBIE1, 3T3KOBIC5), indicating the importance of the presence of the GPRB receptor in stimulating aerobic glycolysis in 3T3 cells (Figure 17). To further confirm that the GPRB receptor mediates an increase in [L-lactate]i after stimulation with 5 μM Smart009, the 3T3KOB cells were transfected with the plasmid for constitutive expression of GPRB (GPRB-FLAG). The cotransfection of Laconic and GPRB-FLAG plasmids 53 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 was optimized and a successful cotransfection was confirmed with antibodies against the FLAG marker encoded by the plasmid (Figure 18). Responses in [L-lactate]i to stimulation with 5 µM Smart009 in 3T3KOBIE1 and 3T3KOBIC5 cells were re-established by GPRB-FLAG transfection. In the presence of plasmid GPRB-FLAG, the response in [L-lactate]i after stimulation with Smart009 was significantly increased in 3T3KOBIE1 cells (AUC = 106.8 ± 77.3) compared to the control (P ≤ 0.001; Figure 19B). In the case of 3T3KOBIC5 cells, in the presence of plasmid GPRB-FLAG, the response to [L-lactate]i after stimulation with Smart009 was significantly increased in 3T3KOBIC5 cells (AUC = 309.0 ± 64.1%; n = 27) compared to control (P ≤ 0.01; Figure 20B). These results support the hypothesis that changes in [L-lactate]i induced by Smart009 (5 µM) require the presence of GPRB. Experiments were repeated using known selective agonists for GPRB (Dupuis et al., 2017; Pillaiyar et al., 2021). As expected after stimulation with agonist 8535 (Dupuis et al., 2017) in 3T3KOBIE1 cells there was no difference in response (1 µM; AUC = -44.47 ± 31.74%; n = 21) compared to the controls (P ≤ 0.01; Two way ANOVA). Responses to the selective agonist were present in 3T3KOBIE1 cells transfected with the plasmid for constitutive expression of GPRB. They were significantly higher (AUC = 464.20 ± 134.54%; n = 22) as opposed to the plasmid-free 3T3KOBIE1 cells (P ≤ 0.001; bidirectional ANOVA; Figure 21B). The experiments were repeated with the selective agonist 8535n, which has a sulfonyl instead of a carbonyl group at the same site (Pillaiyar et al., 2021). Upon stimulation with 1 µM 8535n, an increase in [L-lactate]i was observed in 3T3WT cells (AUC = 490.03 ± 87.95%; n = 29). In 3T3KOBIE1 cells, however, no response was detected in [L-lactate]i (AUC = -73.02 ± 31.55%; n = 20) or there was no difference in response compared to control (P ≤ 0.01; Two way ANOVA) (Figure 22). These results confirmed that the presence of the GPRB receptor is essential for an increase in [L-lactate]i after stimulation with a selective GPRB agonist. The doctoral dissertation contributed to a better understanding of the processes of lactate and cAMP regulation in astrocytes and 3T3 cells, thus deepening the understanding of the role of metabolites in cellular signaling, which is a new competitive field in central nervous system physiology and pathophysiology. 54 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 9 VIRI Agarwal S. R., Clancy C. E., Harvey R. D. 2016. Mechanisms Restricting Diffusion of Intracellular cAMP. Scientific Reports, 6, 19577 (2016), doi: 10.1038/srep19577: 11 str. Ahmed K., Tunaru S., Offermanns S. 2009. GPR109A, GPR109B and GPR81, a family of hydroxy-carboxylic acid receptors. Trends in Pharmacological Sciences , 30: 557-562 Allen M. D., Zhang J. 2006. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications , 348: 716-721 Beavo J. A., Brunton L. L. 2002. Cyclic nucleotide research - still expanding after half a century. Nature Reviews Molecular Cell Biology , 3: 710-718 Belanger M., Allaman I., Magistretti P. J. 2011. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metabolism , 14: 724-738 Bellot-Saez A., Kekesi O., Morley J. W., Buskila Y. 2017. Astrocytic modulation of neuronal excitability through K(+) spatial buffering. Neuroscience and Biobehavioral Reviews , 77: 87-97 Bergersen L., Waerhaug O., Helm J., Thomas M., Laake P., Davies A. J., Wilson M. C., Halestrap A. P., Ottersen O. P. 2001. A novel postsynaptic density protein: the monocarboxylate transporter MCT2 is co-localized with delta-glutamate receptors in postsynaptic densities of parallel fiber-Purkinje cell synapses. Experimental Brain Research , 136: 523-534 Bers D. M., Xiang Y. K., Zaccolo M. 2019. Whole-Cell cAMP and PKA Activity are Epiphenomena, Nanodomain Signaling Matters. Physiology (Bethesda) , 34: 240-249 Bock A., Annibale P., Konrad C., Hannawacker A., Anton S. E., Maiellaro I., Zabel U., Sivaramakrishnan S., Falcke M., Lohse M. J. 2020. Optical Mapping of cAMP Signaling at the Nanometer Scale. Cell , 182: 1519-1530 Borroto-Escuela D. O., Agnati L. F., Bechter K., Jansson A., Tarakanov A. O., Fuxe K. 2015. The role of transmitter diffusion and flow versus extracellular vesicles in volume transmission in the brain neural-glial networks. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 370, 20140183, doi: 10.1098/rstb.2014.0183: 14 str. Bos J. L. 2003. Epac: a new cAMP target and new avenues in cAMP research. Nature Reviews Molecular Cell Biology , 4: 733-738 Bowser D. N., Khakh B. S. 2004. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. Journal of Neurosciences , 24: 8606-8620 55 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Brannan D. A., Brannan D. A., Esplen M. F., Gray J. J. 1999. Geometry. 1st ed., Cambridge, University Press: 373-375 Brooks G. A. 2009. Cell-cell and intracellular lactate shuttles. Journal of Physiology and Pathophysiology , 587: 5591-5600 Brunton B. A. 1983. Compartments of cyclic AMP and protein kinase in mammalian cardiomyocytes. The Journal of biological chemistry , 258: 10233-10239 Cai T. Q., Ren N., Jin L., Cheng K., Kash S., Chen R., Wright S. D., Taggart A. K., Waters M. G. 2008. Role of GPR81 in lactate-mediated reduction of adipose lipolysis. Biochemical Biophysical Research Communications , 377: 987-991 Calebiro D., Maiellaro I. 2014. cAMP signaling microdomains and their observation by optical methods. Frontiers Cellular Neuroscience, 8, doi: 10.3389/fncel.2014.00350: 9 str. Chopra D. G., Yiv N., Hennings T. G., Zhang Y., Ku G. M. 2020. Deletion of Gpr27 in vivo reduces insulin mRNA but does not result in diabetes. Scientific Reports , 10: 9 Clegg R. M. 2006. The History of Fret. V: Reviews in Fluorescence. Geddes, C. D., Lakowicz, J. R. (ur.). Boston, MA, Springer: 1-45 Dienel G. A. 2019. Brain Glucose Metabolism: Integration of Energetics with Function. Physiological Reviews , 99: 949-1045 Dipilato L. M., Cheng X., Zhang J. 2004. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America , 101: 16513-16518 Donahue B. S., Abercrombie R. F. 1987. Free diffusion coefficient of ionic calcium in cytoplasm. Cell Calcium , 8: 437-448 Dupuis N., Laschet C., Franssen D., Szpakowska M., Gilissen J., Geubelle P., Soni A., Parent A. S., Pirotte B., Chevigne A., Twizere J. C., Hanson J. 2017. Activation of the Orphan G Protein-Coupled Receptor GPR27 by Surrogate Ligands Promotes beta-Arrestin 2 Recruitment. Molecular Pharmacology , 91: 595-608 Dvorak C. A., Liu C., Shelton J., Kuei C., Sutton S. W., Lovenberg T. W., Carruthers N. I. 2012. Identification of Hydroxybenzoic Acids as Selective Lactate Receptor (GPR81) Agonists with Antilipolytic Effects. ACS Medicinal Chemistry Letters , 3: 637-639 56 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Felgner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold G. M., Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America , 84: 7413-7417 Fink K., Velebit J., Vardjan N., Zorec R., Kreft M. 2021. Noradrenaline-induced l-lactate production requires d-glucose entry and transit through the glycogen shunt in single-cultured rat astrocytes. Journal of Neuroscience Research , 99: 1084-1098 Förster T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annalen der Physik , 437: 55-75 G Grynkiewicz M. P., R Y Tsien. 1985. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry , 260: 3440‐3450 Ge H., Weiszmann J., Reagan J. D., Gupte J., Baribault H., Gyuris T., Chen J. L., Tian H., Li Y. 2008. Elucidation of signaling and functional activities of an orphan GPCR, GPR81. Journal of Lipid Research , 49: 797-803 Gordon G. R., Choi H. B., Rungta R. L., Ellis-Davies G. C., Macvicar B. A. 2008. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature , 456: 745-749 Henneberger C., Papouin T., Oliet S. H., Rusakov D. A. 2010. Long-term potentiation depends on release of D-serine from astrocytes. Nature , 463: 232-236 Hilger D., Masureel M., Kobilka B. K. 2018. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural Molecular Biology , 25: 4-12 Hodgkin A. L., Keynes R. D. 1953. The mobility and diffusion coefficient of potassium in giant axons from Sepia. The Journal of Physiology , 119: 513-528 Horvat A., Zorec R., Vardjan N. 2016. Adrenergic stimulation of single rat astrocytes results in distinct temporal changes in intracellular Ca(2+) and cAMP-dependent PKA responses. Cell Calcium , 59: 156-163 Horvat A., Zorec R., Vardjan N. 2021. Lactate as an Astroglial Signal Augmenting Aerobic Glycolysis and Lipid Metabolism. Frontiers in Physiology, 12, 735532, doi: 10.3389/fphys.2021.735532: 11 str. Jurevicius J., Skeberdis V. A., Fischmeister R. 2003. Role of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoforms in cAMP compartmentation following beta2-adrenergic stimulation of ICa,L in frog ventricular myocytes. The Journal of Physiology , 551: 239-252 57 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kreft M., Luksic M., Zorec T. M., Prebil M., Zorec R. 2013. Diffusion of D-glucose measured in the cytosol of a single astrocyte. Cellular Molecular Life Sciences , 70: 1483-1492 Lakowicz J. R. 2006. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd ed. New York, Springer: 954 str. Lauritzen K. H., Morland C., Puchades M., Holm-Hansen S., Hagelin E. M., Lauritzen F., Attramadal H., Storm-Mathisen J., Gjedde A., Bergersen L. H. 2014. Lactate receptor sites link neurotransmission, neurovascular coupling, and brain energy metabolism. Cerebral Cortex , 24: 2784-2795 Leibiger C., Kosyakova N., Mkrtchyan H., Glei M., Trifonov V., Liehr T. 2013. First molecular cytogenetic high resolution characterization of the NIH 3T3 cell line by murine multicolor banding. Journal of Histochemistry Cytochemistry , 61: 306-312 Li J., Ning Y., Hedley W., Saunders B., Chen Y., Tindill N., Hannay T., Subramaniam S. 2002. The Molecule Pages database. Nature , 420: 716-717 Liu C., Kuei C., Zhu J., Yu J., Zhang L., Shih A., Mirzadegan T., Shelton J., Sutton S., Connelly M. A., Lee G., Carruthers N., Wu J., Lovenberg T. W. 2012. 3,5-Dihydroxybenzoic acid, a specific agonist for hydroxycarboxylic acid 1, inhibits lipolysis in adipocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics , 341: 794-801 Liu C., Wu J., Zhu J., Kuei C., Yu J., Shelton J., Sutton S. W., Li X., Yun S. J., Mirzadegan T., Mazur C., Kamme F., Lovenberg T. W. 2009. Lactate inhibits lipolysis in fat cells through activation of an orphan G-protein-coupled receptor, GPR81. Journal Biological Chemistry , 284: 2811-2822 Maiellaro I., Lohse M. J., Kittel R. J., Calebiro D. 2016. cAMP Signals in Drosophila Motor Neurons Are Confined to Single Synaptic Boutons. Cell Reports , 17: 1238-1246 Martin A. L., Steurer M. A., Aronstam R. S. 2015. Constitutive Activity among Orphan Class-A G Protein Coupled Receptors. PLoS One, 10, 9:e0138463, doi: 10.1371/journal.pone.0138463: 12 str. Matsumoto M., Saito T., Takasaki J., Kamohara M., Sugimoto T., Kobayashi M., Tadokoro M., Matsumoto S., Ohishi T., Furuichi K. 2000a. An evolutionarily conserved G-protein coupled receptor family, SREB, expressed in the central nervous system. Biochemical Biophysical Research Communications , 272: 576-582 Matsumoto M., Saito T., Takasaki J., Kamohara M., Sugimoto T., Kobayashi M., Tadokoro M., Matsumoto S., Ohishi T., Furuichi K. 2000b. An evolutionarily conserved G-protein coupled 58 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 receptor family, SREB, expressed in the central nervous system. Biochemical Biophysical Research Communications , 272: 576-582 Maver A. 2020. Standardizacija protokola meritev L-laktata v posamezni celici 3T3-L1 . Diplomsko delo. Ljubljana, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo: 38 str. Morland C., Lauritzen K. H., Puchades M., Holm-Hansen S., Andersson K., Gjedde A., Attramadal H., Storm-Mathisen J., Bergersen L. H. 2015. The lactate receptor, G-protein-coupled receptor 81/hydroxycarboxylic acid receptor 1: Expression and action in brain. Journal of Neuroscience Research , 93: 1045-1055 Munk C., Isberg V., Mordalski S., Harpsoe K., Rataj K., Hauser A. S., Kolb P., Bojarski A. J., Vriend G., Gloriam D. E. 2016. GPCRdb: the G protein-coupled receptor database - an introduction. British Journal of Pharmacology , 173: 2195-2207 Murphy-Royal C., Dupuis J., Groc L., Oliet S. H. R. 2017. Astroglial glutamate transporters in the brain: Regulating neurotransmitter homeostasis and synaptic transmission. Journal of Neuroscience Research , 95: 2140-2151 Nikolaev V. O., Bunemann M., Hein L., Hannawacker A., Lohse M. J. 2004. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry , 279: 37215-37218 Nikolaev V. O., Lohse M. J. 2006. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda) , 21: 86-92 Nortley R., Attwell D. 2017. Control of brain energy supply by astrocytes. Current Opinion in Neurobiology , 47: 80-85 Panatier A., Theodosis D. T., Mothet J. P., Touquet B., Pollegioni L., Poulain D. A., Oliet S. H. 2006. Glia-derived D-serine controls NMDA receptor activity and synaptic memory. Cell , 125: 775-784 Pellerin L., Magistretti P. J. 1994. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America , 91: 10625-10629 Pellerin L., Pellegri G., Bittar P. G., Charnay Y., Bouras C., Martin J. L., Stella N., Magistretti P. J. 1998. Evidence supporting the existence of an activity-dependent astrocyte-neuron lactate shuttle. Developmental Neuroscience , 20: 291-299 59 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Peng L., Huang R., Yu A. C., Fung K. Y., Rathbone M. P., Hertz L. 2005. Nucleoside transporter expression and function in cultured mouse astrocytes. Glia , 52: 25-35 Pillaiyar T., Rosato F., Wozniak M., Blavier J., Charles M., Laschet C., Kronenberger T., Muller C. E., Hanson J. 2021. Structure-activity relationships of agonists for the orphan G protein-coupled receptor GPR27. European Journal of Medicinal Chemistry , 225: 113777 Pirnat S., Bozic M., Dolanc D., Horvat A., Tavcar P., Vardjan N., Verkhratsky A., Zorec R., Stenovec M. 2021. Astrocyte arborization enhances Ca(2+) but not cAMP signaling plasticity. Glia , 69: 2899-2916 Richards M., Lomas O., Jalink K., Ford K. L., Vaughan-Jones R. D., Lefkimmiatis K., Swietach P. 2016. Intracellular tortuosity underlies slow cAMP diffusion in adult ventricular myocytes. Cardiovascular Research , 110: 395-407 Sakurai T., Davenport R., Stafford S., Grosse J., Ogawa K., Cameron J., Parton L., Sykes A., Mack S., Bousba S., Parmar A., Harrison D., Dickson L., Leveridge M., Matsui J., Barnes M. 2014. Identification of a novel GPR81-selective agonist that suppresses lipolysis in mice without cutaneous flushing. European Journal of Pharmacology, 727, doi: 10.1016/j.ejphar.2014.01.029: 7 str. San Martin A., Ceballo S., Ruminot I., Lerchundi R., Frommer W. B., Barros L. F. 2013. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One, 8, 2:e57712, doi: 10.1371/journal.pone.0057712: 11 str. Sekar R. B., Periasamy A. 2003. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology , 160: 629-633 Shrestha D., Jenei A., Nagy P., Vereb G., Szollosi J. 2015. Understanding FRET as a research tool for cellular studies. International Journal of Molecular Sciences , 16: 6718-6756 Stobart J. L., Anderson C. M. 2013. Multifunctional role of astrocytes as gatekeepers of neuronal energy supply. Frontiers in Cellular Neuroscience, 7, 38, doi: 10.3389/fncel.2013.00038: 21 str. Suzuki A., Stern S. A., Bozdagi O., Huntley G. W., Walker R. H., Magistretti P. J., Alberini C. M. 2011. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation. Cell , 144: 810-823 Tang F., Lane S., Korsak A., Paton J. F., Gourine A. V., Kasparov S., Teschemacher A. G. 2014. Lactate-mediated glia-neuronal signalling in the mammalian brain. Nature Communications, 5, 3284, doi: 10.1038/ncomms4284: 14 str. 60 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Tasken K., Aandahl E. M. 2004. Localized effects of cAMP mediated by distinct routes of protein kinase A. Physiological Reviews , 84: 137-167 Trott O., Olson A. J. 2010. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. Journal of Computational Chemistry , 31: 455-461 Vardjan N., Chowdhury H. H., Horvat A., Velebit J., Malnar M., Muhic M., Kreft M., Krivec S. G., Bobnar S. T., Mis K., Pirkmajer S., Offermanns S., Henriksen G., Storm-Mathisen J., Bergersen L. H., Zorec R. 2018. Enhancement of Astroglial Aerobic Glycolysis by Extracellular Lactate-Mediated Increase in cAMP. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 148, doi: 10.3389/fnmol.2018.00148: 15 str. Vardjan N., Kreft M., Zorec R. 2014. Dynamics of beta-adrenergic/cAMP signaling and morphological changes in cultured astrocytes. Glia , 62: 566-579 Vardjan N., Zorec R. 2015. Excitable Astrocytes: Ca(2+)- and cAMP-Regulated Exocytosis. Neurochemical Research , 40: 2414-2424 Verkhratsky A., Nedergaard M. 2018. Physiology of Astroglia. Physiological Reviews , 98: 239-389 Von Lenhossék M., Mills W. 1895. Der feinere Bau des Nervensystems im lichte neuester Forschungen, Berlin, Fischer: 409 str. Wang D. D., Bordey A. 2008. The astrocyte odyssey. Progress Neurobiology , 86: 342-367 Warburg O. 1956. On the origin of cancer cells. Science , 123: 309-314 Weis W. I., Kobilka B. K. 2018. The Molecular Basis of G Protein-Coupled Receptor Activation. Annual Review Biochemistry , 87: 897-919 Yang D., Zhou Q., Labroska V., Qin S., Darbalaei S., Wu Y., Yuliantie E., Xie L., Tao H., Cheng J., Liu Q., Zhao S., Shui W., Jiang Y., Wang M. W. 2021. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy, 6, 7, doi: 10.1038/s41392-020-00435-w: 27 str. Zaccolo M. 2011. Spatial control of cAMP signalling in health and disease. Current Opinion Pharmacology , 11: 649-655 Zaccolo M., De Giorgi F., Cho C. Y., Feng L., Knapp T., Negulescu P. A., Taylor S. S., Tsien R. Y., Pozzan T. 2000. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nature Cell Biology , 2: 25-29 61 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Zaccolo M., Pozzan T. 2002. Discrete microdomains with high concentration of cAMP in stimulated rat neonatal cardiac myocytes. Science , 295: 1711-1715 Zaccolo M., Zerio A., Lobo M. J. 2021. Subcellular Organization of the cAMP Signaling Pathway. Pharmacological Reviews , 73: 278-309 Zhang J. Z., Lu T. W., Stolerman L. M., Tenner B., Yang J. R., Zhang J. F., Falcke M., Rangamani P., Taylor S. S., Mehta S., Zhang J. 2020. Phase Separation of a PKA Regulatory Subunit Controls cAMP Compartmentation and Oncogenic Signaling. Cell , 182: 1531-1544 Zhang Y., Chen K., Sloan S. A., Bennett M. L., Scholze A. R., O'keeffe S., Phatnani H. P., Guarnieri P., Caneda C., Ruderisch N., Deng S., Liddelow S. A., Zhang C., Daneman R., Maniatis T., Barres B. A., Wu J. Q. 2014. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience , 34: 11929-11947 Zorec R., Araque A., Carmignoto G., Haydon P. G., Verkhratsky A., Parpura V. 2012. Astroglial excitability and gliotransmission: an appraisal of Ca2+ as a signalling route. ASN Neuro, 4, 2, doi: 10.1042/an20110061: 17 str. Zorec T. M. 2018. Method for identifying a compound useful in mitigating and/or the treatment of a disease associated with abnormal astrocytic function. 16778017.0: 25 str. 62 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Priloga A Preglednica 1: Podcelična heterogenost [cAMP]i v astrocitih. Koeficienti naklonov regresijskih premic (k), ki predstavljajo relativno spremembo podceličnega [cAMP]i v majhnih krožnih regijah zanimanja (premer 2 µm), ki so bile postavljene v ravni črti pravokotno od jedra proti obrobju celice. Funkcije linearne regresije opisujejo razmerje fluorescenčnih kanalov CFP/YFP glede na oddaljenost od jedra med: (i) razmerjem kanalov CFP/YFP v mirovanju in oddaljenostjo od jedra (Spr. v mirovanju z razd.); (ii) razmerjem kanalov CFP/YFP po stimlaciji in oddaljenostjo od jedra (Spr. po stim. z razd.); (iii) razmerjem kanalov CFP/YFP pred in po stimulaciji (Mirovanje s stim.); (iv) razlika med razmerjem kanalov CFP/YFP pred in po stimulaciji v odvisnosti od oddaljenosti od jedra (Spr. razlike z razd.). Statistično značilni koeficienti naklonov so označeni z * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Koeficienti označeni z NS, niso različno od 0 (Studentov t-test). Cel. Št. Spr. v mirovanju z smeri razd. Spr. po stim. z razd. Mirovanje s stim. Spr. razlike z razd. Št. regij zanimanja k(x10^-3) znač. k(x10^-3) znač. k znač. k(x10^- 3) znač. 1 -5,1 ± 1,7 * -12,6 ± 3,0 ** 1,5 ± 0,5 * -7,5 ± 2,9 * 12 1 2 -18,3 ± 4,4 ** -21,1 ± 6,0 ** 1,2 ± 0,2 *** -2,9 ±3,5 NS 9 1 -2,3 ± 1,1 NS -9,0 ± 0,9 *** 1,0 ± 0,5 * -6,7 ± 1,3 *** 16 2 2 -1,7 ± 2,6 NS 0,1 ± 2,6 NS 0,8 ± 0,2 ** 1,9 ± 1,6 NS 12 1 -6,6 ± 0,8 *** -4,3 ± 1,7 * 0,8 ± 0,2 *** 2,3 ± 1,3 NS 16 3 2 -30,3 ± 5,3 ** -26,6 ± 7,5 * 0,9 ± 0,1 ** 3,7 ± 4,0 NS 6 1 -29,0 ± 3,7 *** -38,6 ± 7,9 ** 1,4 ± 0,2 *** -9,6 ± 5,1 NS 8 4 2 -10,3 ± 7,7 NS -0,7 ± 10,7 NS 1,0 ± 0,3 * 9,6 ± 4,7 NS 7 1 -15,3 ± 6,2 * -14,5 ± 4,8 * 0,7 ± 0,2 ** 0,9 ± 4,7 NS 9 5 2 21,1 ± 8,4 NS 22,0 ± 8,1 NS 1,0 ± 0,1 ** 0,9 ± 2,6 NS 5 1 -6,9 ± 1,2 *** -7,5 ± 1,1 *** 1,0 ± 0,1 *** -0,6 ± 0,6 NS 17 6 2 -29,1 ± 4,9 ** -31,0 ± 3,4 *** 1,0 ± 0,1 *** 1,9 ± 2,8 NS 6 1 -8,6 ± 2,5 ** -14,4 ± 2,4 *** 1,0 ± 0,4 * -5,8 ± 3,4 NS 10 7 2 -15,1 ± 4,3 * -14,5 ± 4,5 * 0,9 ± 0,1 ** 0,6 ± 2,5 NS 6 1 -7,1 ± 1,7 *** -8,4 ± 1,2 *** 0,7 ± 0,2 *** -1,2 ± 1,8 NS 17 8 2 -34,6 ± 9,0 NS -5,2 ± 20,5 NS 0,3 ± 0,5 NS 29,4 ± 15,1 NS 4 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 2: Podcelična heterogenost [cAMP]i v celicah 3T3. Koeficienti naklonov regresijskih premic (k), ki predstavljajo relativno spremembo podceličnega cAMP v majhnih krožnih regijah zanimanja (premer 2 µm), ki so bile postavljene v ravni črti pravokotno od jedra proti obrobju celice. Funkcije linearne regresije opisujejo razmerje kanalov CFP/YFP glede na oddaljenost od jedra med: (i) razmerjem fluorescenčnih kanalov CFP/YFP v mirovanju in oddaljenostjo od jedra (Spr. v mirovanju z razd.); (ii) razmerjem kanalov CFP/YFP po stimlaciji in oddaljenostjo od jedra (Spr. po stim. z razd.); (iii) razmerjem kanalov CFP/YFP pred in po stimulaciji (Mirovanje s stim.); (iv) razlika med razmerjem kanalov CFP/YFP pred in po stimulaciji v odvisnosti od oddaljenosti od jedra (Spr. razlike z razd.). Statistično značilni koeficienti naklonov so označeni z * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Koeficienti označeni z NS, niso različno od 0 (Studentov t-test). Spr. v mirovanju z Cel. Št. razd. Spr. po stim. z razd. Mirovanje s stim. Spr. razlike z razd. Št. regij smeri zanimanja k(x10^-2) znač. k(x10^-2) znač. k znač. k(x10^-2) znač. 1 -0,6 ± 0,8 NS -6,6 ± 4,2 NS 6,6 ± 2,2 NS -6,0 ± 3,5 NS 4 1 2 2,3 ± 2,7 NS 6,2 ± 3,9 NS 1,7 ± 0,5 NS 3,9 ± 1,5 NS 4 1 -5,1 ± 1,3 NS -8,0 ± 3,2 NS 1,5 ± 0,6 NS -2,9 ± 3,2 NS 4 2 2 1,6 ± 3,8 NS -6,2 ± 3,7 NS 0,5 ± 1,0 NS -7,8 ±1,8 * 4 1 -1,5 ± 0,3 * -6,3 ± 2,1 * 4,4 ± 0,6 ** -4,7 ± 1,8 NS 6 3 2 -3,9 ± 0,7 * -9,4 ± 3,7 NS 2,5 ± 0,6 * -5,4 ± 3,1 NS 4 1 0,8 ± 2,3 NS 3,0 ± 2,6 NS 0,2 ± 0,7 NS 2,3 ± 3,4 NS 5 4 2 2,6 ± 1,6 NS 3,2 ± 0,4 ** 0,7 ± 0,3 NS 0,7 ± 1,2 NS 5 1 2,8 ± 0,7 * 2,5 ± 1,0 * 1,0 ± 0,1 *** -0,3 ± 0,4 NS 7 5 2 0,9 ± 0,6 NS 1,2 ± 0,2 ** 0,7 ± 0,3 NS 0,2 ± 0,4 NS 5 1 - 0,3 ± 0,7 NS 0,3 ± 1,5 NS -0,9 ± 6 1,1 NS 0,6 ± 1,9 NS 5 2 1,5 ± 1,8 NS 0,6 ± 0,7 NS 0,4 ± 0,1 * -0,9 ± 1,2 NS 5 1 -2,6 ± 1,6 NS -3,2 ± 1,0 * 0,8 ± 0,2 * -0,6 ± 0,8 NS 6 7 2 0,4 ± 2,2 NS 5,2 ± 1,6 * 0,3 ± 0,9 NS 4,8 ± 2,4 NS 5 1 1,0 ± 0,3 * 2,4 ± 2,3 NS 0,4 ± 2,3 NS 1,5 ± 2,5 NS 6 8 2 -3,3 ± 1,1 * -4,3 ± 0,7 ** 1,1 ± 0,2 ** -0,9 ± 0,6 NS 6 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 3: Podcelična heterogenost [L-laktat]i v astrocitih. Koeficienti naklonov regresijskih premic (k), ki predstavljajo relativno spremembo podceličnega [L-laktat]i v majhnih krožnih regijah zanimanja (premer 2 µm), ki so bile postavljene v ravni črti pravokotno od jedra proti obrobju celice. Funkcije linearne regresije opisujejo razmerje kanalov mTFP/Venus glede na oddaljenost od jedra med: (i) razmerjem fluorescenčnih kanalov mTFP/Venus v mirovanju in oddaljenostjo od jedra (Spr. v mirovanju z razd.); (ii) razmerjem kanalov mTFP/Venus po stimlaciji in oddaljenostjo od jedra (Spr. po stim. z razd.); (iii) razmerjem kanalov mTFP/Venus pred in po stimulaciji (Mirovanje s stim.); (iv) razlika med razmerjem kanalov mTFP/Venus pred in po stimulaciji v odvisnosti od oddaljenosti od jedra (Spr. razlike z razd.). Statistično značilni koeficienti naklonov so označeni z * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Koeficienti označeni z NS, niso različno od 0 (Studentov t-test). Spr. v mirovanju z Cel. Št. razd. Spr. po stim. z razd. Mirovanje s stim. Spr. razlike z razd. Št. regij smeri zanimanja k znač. k znač. k znač. k(x10^-3) znač. 1 -2,2 ± 0,2 *** -2,9 ± 0,2 *** 1,3 ± 0,0 *** -7,3 ± 0,8 *** 22 1 2 -3,0 ± 0,4 *** -3,5 ± 0,5 *** 1,2 ± 0,0 *** -5,2 ± 1,4 ** 19 1 -1,1 ± 0,2 *** -1,6 ± 0,2 *** 1,2 ± 0,1 *** -4,9 ± 0,7 *** 24 2 2 -1,8 ± 0,5 *** -2,0 ± 0,5 *** 1,1 ± 0,0 *** -2,4 ± 0,9 * 16 1 -2,0 ± 0,6 ** -2,5 ± 0,6 *** 1,0 ± 0,1 *** -5,5 ± 1,5 ** 19 3 2 -4,5 ± 0,4 *** -5,6 ± 0,3 *** 1,2 ± 0,1 *** -10,7 ± 2,4 ** 11 1 -3,2 ± 0,8 *** -3,7 ± 0,7 *** 1,0 ± 0,1 *** -5,0 ± 1,5 ** 15 4 2 -3,4 ± 0,6 *** -3,6 ± 0,5 *** 1,0 ± 0,1 *** -2,4 ± 2,1 NS 15 1 2,6 ± 2,7 NS -0,1 ± 0,3 NS 1,0 ± 0,1 *** -3,7 ± 1,1 ** 27 5 2 -3,3 ± 0,4 *** -3,5 ± 0,3 *** 1,1 ± 0,0 *** -2,7 ± 1,2 * 18 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 4: Podcelična heterogenost koncentracije L-laktata ([L-laktat]i) v astrocitih. Koeficienti naklonov regresijskih premic (k), ki predstavljajo relativno spremembo ([L-laktat]i v majhnih regijah zanimanja, ki so bile postavljene v ravni črti od jedra proti periferiji celic. Naklon (k) premice določene z regresijo opisujejo [L-laktat]i glede na oddaljenost od jedra med: (i) [L-laktat]i (razmerje kanalov mTFP/Venus) v mirovanju in oddaljenostjo od jedra (Spr. [L-laktat]i v mirovanju z razd.); (ii) ([L-laktat]i po stimlaciji in oddaljenostjo od jedra (Spr. [L-laktat]i po stim. z razd.); (iii) ([L-laktat]i pred in po stimulaciji (Korelacija: mirovanje s stim ); (iv) razlika med [L-laktat]i pred in po stimulaciji v odvisnosti od oddaljenosti od jedra (Spr. razlike: stim.- mir.[L-laktat]i in razd.). Statistično značilni koeficienti naklonov so označeni z * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Koeficienti označeni z NS, niso različni od 0 (Studentov t-test). Spr. [L-laktat] Spr. razlike: stim.- i v Spr. [L-laktat]i po Korelacija: mir.[L-laktat]i in Cel. Št. mirovanju z razd. stim. z razd. mirovanje s stim. Št. regij smeri razd. zanimanja k(x10^-3) znač. k(x10^-3) znač. k znač. k(x10^-3) znač. 1 -32,2 ± 5,1 *** -41,2 ± 5,3 *** 1,2 ± 0,1 *** -9,1 ± 1,8 *** 11 1 2 -55,2 ± 16,9 * -63,5 ± 18,1 * 1,1 ± 0,0 *** -8,3 ± 1,9 ** 7 1 -1,3 ± 6,7 NS -7,2 ± 4,3 NS 0,6 ± 0,1 *** -5,9 ± 3,7 NS 13 2 2 -9,6 ± 7,8 NS -7,6 ± 9,1 NS 1,1 ± 0,1 *** 2,0 ± 2,5 NS 13 1 -15,9 ± 10,4 NS -5,6 ± 9,5 NS 0,8 ± 0,1 *** 10,2 ± 2,5 ** 9 3 2 -25,0 ± 13,2 NS -48,3 ± 14,7 * 1,4 ± 0,2 *** -23,3 ± 3,0 *** 7 1 -55,1 ± 6,5 *** -45,9 ± 6,7 *** 0,8 ± 0,1 *** 9,2 ± 3,2 * 8 4 2 -18,2 ± 8,0 * -23,5 ± 7,0 ** 1,0 ± 0,1 *** -5,3 ± 3,5 NS 11 1 15,6 ± 8,9 NS 16,5 ± 11,0 NS 1,2 ± 0,1 *** 0,9 ± 3,6 NS 11 5 2 -37,7 ± 14,7 NS -35,3 ± 6,2 ** 0,7 ± 0,2 * 2,4 ± 10,2 NS 6 1 -22,7 ± 3,3 *** -22,6 ± 2,9 *** 1,0 ± 0,1 *** 0,0 ± 1,5 NS 15 6 2 39,8 ± 22,2 NS 41,0 ± 28,2 NS 1,1 ± 0,1 ** 1,2 ± 7,5 NS 5 1 -12,2 ± 2,3 *** -13,7 ± 2,6 *** 1,1 ± 0,1 *** -1,5 ± 1,2 NS 21 7 2 -22,7 ± 6,6 ** -29,1 ± 6,7 *** 1,1 ± 0,1 *** -6,5 ± 1,6 *** 16 1 -1,8 ± 0,9 NS -2,0 ± 0,9 * 1,1 ± 0,1 *** 0,2 ± 0,2 NS 13 8 2 -31,1 ± 10,3 * -45,1 ± 10,3 ** 1,2 ± 0,2 *** -13,9 ± 5,8 NS 7 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 5: Odzivnost celic 3T3WT na stimulacijo s Smart075 in Smart009. Concentration Odzivnost celic (%) Odzivne celice (vse celice) AUC (%) [µM] Smart075 Smart009 Smart075 Smart009 Smart075 Smart009 0 0 0 0(13) 0(6) -1.19 ± 0,15 0.17 ± 0,78 0.5 10 0 3(30) 0(26) -1.11 ± 0.83 -0.05 ± 0.55 2.5 4 3 1(29) 1(31) 1.02 ± 0.85 1.68 ± 1.03 5 18 15 11(61) 12(81) 4.46 ± 0.92 8.55 ± 1.34 10 28 32 9(32) 9(28) 8.68 ± 2.11 8.57 ± 1.99 50 32 4* 6(19) 1(26) 11.41 ± 3.07 0.46 ± 0.64## 100 33 9 6(12) 1(11) 24.56 ± 6.78 2.76 ± 1.26 500 66 39 46(70) 34(88) 46.46 ± 5.37 14.06 ± 1.50### 1000 87 30* 33(38) 17(57) 67.26 ± 4.84 12.87 ± 1.94### 2000 100 80 17(17) 12(15) 92.38 ± 7.96 35.57 ± 4.50### Preglednica 6: Zbirka uporabljenih GPCR proteinov v bioinformatični analizi # Gen Protein Koda UniProt 1 5ht1a 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A P08908 2 5ht2a 5-Hydroxytryptamine Receptor 2A P28223 3 5ht2c 5-Hydroxytryptamine Receptor 2C P28335 4 5ht4r 5-Hydroxytryptamine Receptor 4 Q13639 5 5ht5a 5-Hydroxytryptamine Receptor 5A P47898 6 5ht6r 5-Hydroxytryptamine Receptor 6 P50406 7 5ht7r 5-Hydroxytryptamine Receptor 7 P34969 8 aa2br Adenosine A2b Receptor P29275 9 aa3r Adenosine A3 Receptor P0DMS8 10 ackr1 Atypical Chemokine Receptor 1 Q16570 11 ackr2 Atypical Chemokine Receptor 2 O00590 12 ackr3 Atypical Chemokine Receptor 3 P25106 13 ackr4 Atypical Chemokine Receptor 4 Q9NPB9 14 acm3 Muscarinic Acetylcholine Receptor M3 A0A0X3PH97 15 acm5 Cholinergic Receptor Muscarinic 5 P08912 16 acthr Melanocortin 2 Receptor Q01718 17 ada1a Adrenoceptor Alpha 1A P35348 18 ada1b Adrenoceptor Alpha 1B P35368 19 ada1d Adrenoceptor Alpha 1D P25100 20 ada2a Adrenoceptor Alpha 2A P08913 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 21 ada2b Adrenoceptor Alpha 2B P18089 22 ada2c Adrenoceptor Alpha 2C P18825 23 adrb1 Adrenoceptor Beta 1 P08588 24 adrb3 Adrenoceptor Beta 3 P13945 25 agtr2 Angiotensin II Receptor Type 2 P50052 26 apj Apelin Receptor P35414 27 bkrb1 Bradykinin Receptor B1 P46663 28 bkrb2 Bradykinin Receptor B2 P30411 29 brs3 Bombesin Receptor Subtype 3 P32247 30 c3ar Complement C3a Receptor 1 Q16581 31 c5ar1 Complement C5a Receptor 1 P21730 32 c5ar2 Complement Component 5a Receptor 2 Q9P296 33 cckar Cholecystokinin A Receptor P32238 34 ccr1 C-C Motif Chemokine Receptor 1 P32246 35 ccr10 C-C Motif Chemokine Receptor 10 P46092 36 ccr3 C-C Motif Chemokine Receptor 3 P51677 37 ccr4 C-C Motif Chemokine Receptor 4 P51679 38 ccr6 C-C Motif Chemokine Receptor 6 P51684 39 ccr7 C-C Motif Chemokine Receptor 7 P32248 40 ccr8 C-C Motif Chemokine Receptor 8 P51685 41 ccrl2 C-C Motif Chemokine Receptor Like 2 O00421 42 cltr1 Cysteinyl Leukotriene Receptor 1 Q9Y271 43 cltr2 Cysteinyl Leukotriene Receptor 2 Q9NS75 44 cml1 N-Acetyltransferase 8 Q9UHE5 45 cnr2 Cannabinoid Receptor 2 P34972 46 cx3c1 C-X3-C Motif Chemokine Receptor 1 P49238 47 cxcr1 C-X-C Motif Chemokine Receptor 1 P25024 48 cxcr2 C-X-C Motif Chemokine Receptor 2 P25025 49 cxcr3 C-X-C Motif Chemokine Receptor 3 P49682 50 cxcr5 C-X-C Motif Chemokine Receptor 5 P32302 51 cxcr6 C-X-C Motif Chemokine Receptor 6 O00574 52 drd1 Dopamine Receptor D1 P21728 53 drd2 Dopamine Receptor D2 P14416 54 drd4 Dopamine Receptor D4 P21917 55 drd5 Dopamine Receptor D5 P21918 56 ednra Endothelin Receptor Type A P25101 57 etbr2 Endothelin B receptor-like protein 2 U6DRJ2 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 58 ffar2 Free Fatty Acid Receptor 2 O15552 59 ffar3 Free Fatty Acid Receptor 3 O14843 60 ffar4 Free Fatty Acid Receptor 4 Q5NUL3 61 fpr1 Formyl Peptide Receptor 1 P21462 62 fpr2 Formyl Peptide Receptor 2 P25090 63 fpr3 Formyl Peptide Receptor 3 P25089 64 fshr Follicle Stimulating Hormone Receptor P23945 65 galr1 Galanin Receptor 1 P47211 66 galr2 Galanin Receptor 2 O43603 67 galr3 Galanin Receptor 3 O60755 68 gasr Cholecystokinin B Receptor P32239 69 ghsr Growth Hormone Secretagogue Receptor Q92847 70 gnrhr Gonadotropin Releasing Hormone Receptor P30968 71 gpbar G Protein-Coupled Bile Acid Receptor 1 Q8TDU6 72 gper1 G Protein-Coupled Estrogen Receptor 1 Q99527 73 gpr1 G Protein-Coupled Receptor 1 P46091 74 gpr101 G Protein-Coupled Receptor 101 Q96P66 75 gpr119 G Protein-Coupled Receptor 119 Q8TDV5 76 gpr12 G Protein-Coupled Receptor 12 P47775 77 gpr132 G Protein-Coupled Receptor 132 Q9UNW8 78 gpr135 G Protein-Coupled Receptor 135 Q8IZ08 79 gpr139 G Protein-Coupled Receptor 139 Q6DWJ6 80 gpr141 G Protein-Coupled Receptor 141 Q7Z602 81 gpr142 G Protein-Coupled Receptor 142 Q7Z601 82 gpr146 G Protein-Coupled Receptor 146 Q96CH1 83 gpr148 G Protein-Coupled Receptor 148 Q8TDV2 84 gpr149 G Protein-Coupled Receptor 149 Q86SP6 85 gpr15 G Protein-Coupled Receptor 15 P49685 86 gpr150 G Protein-Coupled Receptor 150 Q8NGU9 87 gpr151 G Protein-Coupled Receptor 151 Q8TDV0 88 gpr152 G Protein-Coupled Receptor 152 Q8TDT2 89 gpr153 G Protein-Coupled Receptor 153 Q6NV75 90 gpr160 G Protein-Coupled Receptor 160 Q9UJ42 91 gpr161 G Protein-Coupled Receptor 161 Q8N6U8 92 gpr162 G Protein-Coupled Receptor 162 Q16538 93 gpr17 G Protein-Coupled Receptor 17 Q13304 94 gpr171 G Protein-Coupled Receptor 171 O14626 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 95 gpr173 G Protein-Coupled Receptor 173 Q9NS66 96 gpr174 G Protein-Coupled Receptor 174 Q9BXC1 97 gpr176 G Protein-Coupled Receptor 176 Q14439 98 gpr18 G Protein-Coupled Receptor 18 Q14330 99 gpr182 G Protein-Coupled Receptor 182 O15218 100 gpr183 G Protein-Coupled Receptor 183 P32249 101 gpr19 G Protein-Coupled Receptor 19 Q15760 102 gpr20 G Protein-Coupled Receptor 20 Q99678 103 gpr22 G Protein-Coupled Receptor 22 Q99680 104 gpr25 G Protein-Coupled Receptor 25 O00155 105 gpr26 G Protein-Coupled Receptor 26 Q8NDV2 106 gpr27 G Protein-Coupled Receptor 27 Q9NS67 107 gpr3 G Protein-Coupled Receptor 3 P46089 108 gpr31 G Protein-Coupled Receptor 31 O00270 109 gpr32 G Protein-Coupled Receptor 32 O75388 110 gpr33 G Protein-Coupled Receptor 33 Q49SQ1 111 gpr34 G Protein-Coupled Receptor 34 Q9UPC5 112 gpr37 G Protein-Coupled Receptor 37 O15354 113 gpr39 G Protein-Coupled Receptor 39 O43194 114 gpr4 G Protein-Coupled Receptor 4 P46093 115 gpr42 G Protein-Coupled Receptor 42 O15529 116 gpr45 G Protein-Coupled Receptor 45 Q9Y5Y3 117 gpr52 G Protein-Coupled Receptor 52 Q9Y2T5 118 gpr55 G Protein-Coupled Receptor 55 Q9Y2T6 119 gpr6 G Protein-Coupled Receptor 6 P46095 120 gpr61 G Protein-Coupled Receptor 61 Q9BZJ8 121 gpr62 G Protein-Coupled Receptor 62 Q9BZJ7 122 gpr63 G Protein-Coupled Receptor 63 Q9BZJ6 123 gpr75 G Protein-Coupled Receptor 75 O95800 124 gpr78 G Protein-Coupled Receptor 78 Q96P69 125 gpr82 G Protein-Coupled Receptor 82 Q96P67 126 gpr83 G Protein-Coupled Receptor 83 Q9NYM4 127 gpr84 G Protein-Coupled Receptor 84 Q9NQS5 128 gpr85 G Protein-Coupled Receptor 85 P60893 129 gpr87 G Protein-Coupled Receptor 87 Q9BY21 130 gpr88 G Protein-Coupled Receptor 88 Q9GZN0 131 grpr Gastrin Releasing Peptide Receptor P30550 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 132 hcar1 Hydroxycarboxylic Acid Receptor 1 Q9BXC0 133 hcar2 Hydroxycarboxylic Acid Receptor 2 Q8TDS4 134 hcar3 Hydroxycarboxylic Acid Receptor 3 P49019 135 hrh2 Histamine Receptor H2 P25021 136 hrh3 Histamine Receptor H3 Q9Y5N1 137 hrh4 Histamine Receptor H4 Q9H3N8 138 kissr KISS1 Receptor Q969F8 139 lgr4 Leucine Rich Repeat Containing GPCR 4 Q9BXB1 140 lgr5 Leucine Rich Repeat Containing GPCR 5 O75473 141 lgr6 Leucine Rich Repeat Containing GPCR 6 Q9HBX8 142 lpar2 Lysophosphatidic Acid Receptor 2 Q9HBW0 143 lpar3 Lysophosphatidic Acid Receptor 3 Q9UBY5 144 lpar4 Lysophosphatidic Acid Receptor 4 Q99677 145 lpar5 Lysophosphatidic Acid Receptor 5 Q9H1C0 146 lpar6 Lysophosphatidic Acid Receptor 6 P43657 147 lshr Lutropin-Choriogonadotropic Hormone Receptor P22888 148 lt4r1 Leukotriene B4 Receptor Q15722 149 lt4r2 Leukotriene B4 Receptor 2 Q9NPC1 150 mas MAS1 Proto-Oncogene P04201 151 mas1l MAS1 Proto-Oncogene Like P35410 152 mc3r Melanocortin 3 Receptor P41968 153 mc4r Melanocortin 4 Receptor P32245 154 mc5r Melanocortin 5 Receptor P33032 155 mchr1 Melanin Concentrating Hormone Receptor 1 Q99705 156 mchr2 Melanin Concentrating Hormone Receptor 2 Q969V1 157 mrgrd MAS Related GPR Family Member D Q8TDS7 158 mrgre MAS Related GPR Family Member E Q86SM8 159 mrgrf MAS Related GPR Family Member F Q96AM1 160 mrgrg MAS Related GPR Family Member G Q86SM5 161 mrgx1 MAS Related GPR Family Member X1 Q96LB2 162 mrgx2 MAS Related GPR Family Member X2 Q96LB1 163 mrgx3 MAS Related GPR Family Member X3 Q96LB0 164 mrgx4 MAS Related GPR Family Member X4 Q96LA9 165 mshr Melanocortin 1 Receptor Q01726 166 mtlr Motilin Receptor O43193 167 mtr1a Melatonin Receptor 1A P48039 168 mtr1b Melatonin Receptor 1B P49286 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 169 mtr1l Melatonin-Related Receptor Q13585 170 nk1r Tachykinin Receptor 1 P25103 171 nk2r Tachykinin Receptor 2 P21452 172 nmbr Neuromedin B Receptor P28336 173 nmur1 Neuromedin U Receptor 1 Q9HB89 174 nmur2 Neuromedin U Receptor 2 Q9GZQ4 175 npbw1 Neuropeptides B And W Receptor 1 P48145 176 npbw2 Neuropeptides B And W Receptor 2 P48146 177 npff1 Neuropeptide FF Receptor 1 Q9GZQ6 178 npff2 Neuropeptide FF Receptor 2 Q9Y5X5 179 npsr1 Neuropeptide S Receptor 1 Q6W5P4 180 npy1r Neuropeptide Y Receptor Y1 P25929 181 npy2r Neuropeptide Y Receptor Y2 P49146 182 npy4r Neuropeptide Y Receptor Y4 P50391 183 npy5r Neuropeptide Y Receptor Y5 Q15761 184 ntr1 Neurotensin Receptor 1 P30989 185 ntr2 Neurotensin Receptor 2 O95665 186 ogr1 Ovarian Cancer GPCR 1 Q15743 187 opn3 Opsin 3 Q9H1Y3 188 opn4 Opsin 4 Q9UHM6 189 opn5 Opsin 5 Q6U736 190 oprm Opioid Receptor Mu 1 P35372 191 opsb Opsin 1 SWS P03999 192 opsg Opsin 1 P04001 193 opsr Opsin 1 LWS P04000 194 oxer1 Oxoeicosanoid Receptor 1 Q8TDS5 195 oxgr1 Oxoglutarate Receptor 1 Q96P68 196 oxyr Oxytocin Receptor P30559 197 p2ry2 Purinergic Receptor P2Y2 P41231 198 p2ry4 Pyrimidinergic Receptor P2Y4 P51582 199 p2ry6 Pyrimidinergic Receptor P2Y6 Q15077 200 p2ry8 P2Y Receptor Family Member 8 Q86VZ1 201 p2y10 P2Y Receptor Family Member 10 O00398 202 p2y11 Purinergic Receptor P2Y11 Q96G91 203 p2y12 Purinergic Receptor P2Y12 Q9H244 204 p2y13 Purinergic Receptor P2Y13 Q9BPV8 205 p2y14 Purinergic Receptor P2Y14 Q15391 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 206 par2 F2R Like Trypsin Receptor 1 P55085 207 par3 Par-3 Family Cell Polarity Regulator Q8TEW0 208 par4 F2R Like Thrombin Or Trypsin Receptor 3 Q96RI0 209 pd2r Prostaglandin D2 Receptor Q13258 210 pd2r2 Prostaglandin D2 Receptor 2 Q9Y5Y4 211 pe2r1 Prostaglandin E Receptor 1 P34995 212 pe2r2 Prostaglandin E Receptor 2 P43116 213 pe2r3 Prostaglandin E Receptor 3 P43115 214 pe2r4 Prostaglandin E Receptor 4 P35408 215 pf2r Prostaglandin F Receptor P43088 216 pi2r Prostaglandin I2 Receptor P43119 217 pkr1 Prokineticin Receptor 1 Q8TCW9 218 pkr2 Prokineticin Receptor 2 Q8NFJ6 219 prlhr Prolactin Releasing Hormone Receptor P49683 220 psyr Psychosine Receptor Q8IYL9 221 qrfpr Pyroglutamylated RFamide Peptide Receptor Q96P65 222 rl3r1 Relaxin Family Peptide Receptor 3 Q9NSD7 223 rl3r2 Relaxin Family Peptide Receptor 4 Q8TDU9 224 rxfp1 Relaxin Family Peptide Receptor 1 Q9HBX9 225 rxfp2 Relaxin Family Peptide Receptor 2 Q8WXD0 226 s1pr2 Sphingosine-1-Phosphate Receptor 2 O95136 227 s1pr3 Sphingosine-1-Phosphate Receptor 3 Q99500 228 s1pr4 Sphingosine-1-Phosphate Receptor 4 O95977 229 s1pr5 Sphingosine-1-Phosphate Receptor 5 Q9H228 230 ssr2 Signal Sequence Receptor Subunit 2 P43308 231 ssr3 Signal Sequence Receptor Subunit 3 Q9UNL2 232 ssr4 Somatostatin Receptor 4 P31391 233 ssr5 Somatostatin Receptor 5 P35346 234 sucr1 Succinate Receptor 1 Q9BXA5 235 ta2r Thromboxane A2 Receptor P21731 236 taar1 Trace Amine Associated Receptor 1 Q96RJ0 237 taar2 Trace Amine Associated Receptor 2 Q9P1P5 238 taar3 Trace Amine Associated Receptor 3 Q9P1P4 239 taar5 Trace Amine Associated Receptor 5 O14804 240 taar6 Trace Amine Associated Receptor 6 Q96RI8 241 taar8 Trace Amine Associated Receptor 8 Q969N4 242 taar9 Trace Amine Associated Receptor 9 Q96RI9 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 6 # Gen Protein Koda UniProt 243 trfr Transferrin Receptor P02786 244 tshr Thyroid Stimulating Hormone Receptor P16473 245 ur2r Urotensin 2 Receptor Q9UKP6 246 v1ar Arginine Vasopressin Receptor 1A P37288 247 v1br Arginine Vasopressin Receptor 1B P47901 248 v2r Arginine Vasopressin Receptor 2 P30518 249 xcr1 X-C Motif Chemokine Receptor 1 P46094 Preglednica 7: Podatki GPCR sirot pridobljenih iz transkriptoma glije, nevronov in žilnih celic možganske skorje (Zhang in sod., 2014) # Gen Protein Koda UniProt 1 ackr2 Atypical Chemokine Receptor 2 O00590 2 acm3 Cholinergic Receptor Muscarinic 3 P20309 3 ada1d Adrenoceptor Alpha 1D P25100 4 adrb3 Adrenoceptor Beta 3 P13945 5 ccr4 C-C Motif Chemokine Receptor 4 P51679 6 ffar2 Free Fatty Acid Receptor 2 O15552 7 ffar3 Free Fatty Acid Receptor 3 O14843 8 galr2 Galanin Receptor 2 O43603 9 galr3 Galanin Receptor 3 O60755 10 gipr Gastric Inhibitory Polypeptide Receptor P48546 11 gnrhr Gonadotropin Releasing Hormone Receptor P30968 12 gpr12 G Protein-Coupled Receptor 12 P47775 13 gpr135 G Protein-Coupled Receptor 135 Q8IZ08 14 gpr153 G Protein-Coupled Receptor 153 Q6NV75 15 gpr19 G Protein-Coupled Receptor 19 Q15760 16 gpr27 G Protein-Coupled Receptor 27 Q9NS67 17 gpr45 G Protein-Coupled Receptor 45 Q9Y5Y3 18 gpr84 G Protein-Coupled Receptor 84 Q9NQS5 19 lgr4 Leucine Rich Repeat Containing GPCR 4 Q9BXB1 20 lpar4 Lysophosphatidic Acid Receptor 4 Q99677 21 mtr1l Melatonin-Related Receptor Q13585 22 npy1r Neuropeptide Y Receptor Y1 P25929 23 opn5 Opsin 5 Q6U736 24 opsb Opsin 1, Short Wave Sensitive P03999 25 p2ry2 Purinergic Receptor P2Y2 P41231 26 par2 F2R Like Trypsin Receptor 1 P55085 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 7 # Gen Protein Koda UniProt 27 par3 Par-3 Family Cell Polarity Regulator Q8TEW0 28 par4 F2R Like Thrombin Or Trypsin Receptor 3 Q96RI0 29 pd2r2 Prostaglandin D2 Receptor 2 Q9Y5Y4 30 pe2r1 Prostaglandin E Receptor 1 P34995 31 pe2r3 Prostaglandin E Receptor 3 P43115 32 pe2r4 Prostaglandin E Receptor 4 P35408 33 pf2r Prostaglandin F Receptor P43088 34 rxfp2 Relaxin Family Peptide Receptor 2 Q8WXD0 35 ssr2 Signal Sequence Receptor Subunit 2 P43308 36 sstr4 Somatostatin Receptor 4 P31391 Preglednica 8: Diferencialno izraženi geni GPCR sirot v astrocitih, ki niso izražali GPR81. Podatki so bili pridobljeni s sekveniranjem RNA (Vardjan in sod., 2018). # Gen Protein Koda UniProt 1 gprc5c G protein-coupled receptor, family C I7HPW4 2 gprc5a Retinoic acid-induced protein 3 G5E8C3 3 gpr89 Golgi pH regulator (Protein GPR89) Q8BS95 4 gpr88 G-protein coupled receptor 88 B2RXU4 5 gpr85 Probable G-protein coupled receptor 85 P60894 6 gpr84 G-protein coupled receptor 84 Q8CIM5 7 gpr65 Psychosine receptor A0A0R4J0Y2 8 gpr63 Probable G-protein coupled receptor 63 Q9EQQ3 9 gpr55 G protein-coupled receptor 55 Q14BV9 10 gpr45 G protein-coupled receptor 45 Q148B5 11 gpr4 G-protein coupled receptor 4 Q8BUD0 12 gpr39 G-protein-coupled receptor 39 A0A0B4J1E4 13 gpr37l1 G protein-coupled receptor 37-like 1 A1L151 14 gpr37 Prosaposin receptor GPR37 Q9QY42 15 gpr35 G-protein coupled receptor 35 Q9ES90 16 gpr31b G-protein coupled receptor 31 F8VQN3 17 gpr3 G-protein coupled receptor 3 P35413 18 gpr27 Probable G-protein coupled receptor 27 O54897 19 gpr19 Probable G-protein coupled receptor 19 Q61121 20 gpr180 Integral membrane protein GPR180 Q8BPS4 21 gpr179 G protein-coupled receptor 179 E9PY61 22 gpr162 Probable G-protein coupled receptor 162 Q3UN16 23 gpr161 G-protein coupled receptor 161 B2RPY5 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 8 # Gen Protein Koda UniProt 24 gpr160 Probable G-protein coupled receptor 160 Q3U3F9 25 gpr158 Probable G-protein coupled receptor 158 Q8C419 26 gpr156 Probable G-protein coupled receptor 156 Q6PCP7 27 gpr155 G protein-coupled receptor 155 D7RXL9 28 gpr153 Probable G-protein coupled receptor 153 Q8K0Z9 29 gpr150 Probable G-protein coupled receptor 150 Q8BL07 30 gpr146 Probable G-protein coupled receptor 146 Q99LE2 31 gpr137c G protein-coupled receptor 137C E9Q343 32 gpr137b Integral membrane protein GPR137B A0A0R4J022 33 gpr137 Integral membrane protein GPR137 Q3UPL3 34 gpr135 G-protein coupled receptor 135 Q7TQP2 35 gpr12 G-protein coupled receptor 12 P35412 36 gpr108 G-protein coupled receptor 108 Q91WD0 37 gpr107 G protein-coupled receptor 107 Q148Z6 Preglednica 9: GPCR proteini, katerih Evklidska razdalja je bila manjša ali enaka Evklidski razdalji GPR81. # Gen Protein Koda UniProt 1 ackr2 Atypical Chemokine Receptor 2 O00590 2 acm3 Muscarinic Acetylcholine Receptor M3 A0A0X3PH97 3 ada1d Adrenoceptor Alpha 1D P25100 4 adrb3 Adrenoceptor Beta 3 P13945 5 ccr4 C-C Motif Chemokine Receptor 4 P51679 6 ccr8 C-C Motif Chemokine Receptor 8 P51685 7 drd4 Dopamine Receptor D4 P21917 8 ffar2 Free Fatty Acid Receptor 2 O15552 9 ffar3 Free Fatty Acid Receptor 3 O14843 10 fpr3 Formyl Peptide Receptor 3 P25089 11 galr1 Galanin Receptor 1 P47211 12 galr2 Galanin Receptor 2 O43603 13 galr3 Galanin Receptor 3 O60755 14 ghsr Growth Hormone Secretagogue Receptor Q92847 15 gnrhr Gonadotropin Releasing Hormone Receptor P30968 16 gpr101 G Protein-Coupled Receptor 101 Q96P66 17 gpr132 G Protein-Coupled Receptor 132 Q9UNW8 18 gpr135 G Protein-Coupled Receptor 135 Q8IZ08 19 gpr141 G Protein-Coupled Receptor 141 Q7Z602 20 gpr149 G Protein-Coupled Receptor 149 Q86SP6 se nadaljuje Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 9 # Gen Protein Koda UniProt 21 gpr152 G Protein-Coupled Receptor 152 Q8TDT2 22 gpr153 G Protein-Coupled Receptor 153 Q6NV75 23 gpbar G Protein-Coupled Bile Acid Receptor 1 Q8TDU6 24 gpr12 G Protein-Coupled Receptor 12 P47775 25 gpr19 G Protein-Coupled Receptor 19 Q15760 26 gpr25 G Protein-Coupled Receptor 25 O00155 27 gpr27 G Protein-Coupled Receptor 27 Q9NS67 28 gpr33 G Protein-Coupled Receptor 33 Q49SQ1 29 gpr42 G Protein-Coupled Receptor 42 O15529 30 gpr45 G Protein-Coupled Receptor 45 Q9Y5Y3 31 gpr52 G Protein-Coupled Receptor 52 Q9Y2T5 32 gpr61 G Protein-Coupled Receptor 61 Q9BZJ8 33 gpr84 G Protein-Coupled Receptor 84 Q9NQS5 34 lgr4 Leucine Rich Repeat Containing GPCR 4 Q9BXB1 35 lpar4 Lysophosphatidic Acid Receptor 4 Q99677 36 mtlr Motilin Receptor O43193 37 mtr1b Melatonin Receptor 1B P49286 38 mtr1l Melatonin-Related Receptor (GPR50) Q13585 39 opn4 Opsin 4 Q9UHM6 40 opn5 Opsin 5 Q6U736 41 oprm Opioid Receptor Mu 1 P35372 42 opsb Opsin 1, Short Wave Sensitive P03999 43 opsr Opsin 1, Long Wave Sensitive P04000 44 p2ry2 Purinergic Receptor P2Y2 P41231 45 par2 F2R Like Trypsin Receptor 1 P55085 46 par3 Par-3 Family Cell Polarity Regulator Q8TEW0 47 pd2r2 Prostaglandin D2 Receptor 2 Q9Y5Y4 48 pe2r3 Prostaglandin E Receptor 3 P43115 49 pf2r Prostaglandin F Receptor P43088 50 rxfp2 Relaxin Family Peptide Receptor 2 Q8WXD0 51 ssr2 Signal Sequence Receptor Subunit 2 P43308 52 ssr5 Somatostatin Receptor 5 P35346 53 taar1 Trace Amine Associated Receptor 1 Q96RJ0 54 taar2 Trace Amine Associated Receptor 2 Q9P1P5 55 taar5 Trace Amine Associated Receptor 5 O14804 Dolanc D. Meritve citosolne koncentracije cAMP in L-laktata v podganjih astrocitih in celicah 3T3 v kulturi. Dokt. Disertacija. Ljubljana, Univ. V Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Zahvaljujem se mentorju akad. prof. dr. Robertu Zorcu, ki mi je omogočil opravljanje raziskovalnega dela in izdelavo doktorske disertacije na Inštitutu za patološko fiziologijo v Laboratoriju za nevroendokrinologijo in molekularno celično fiziologijo ter za številne uporabne nasvete in usmeritve med samim izvajanjem dela. Zahvaljujem se somentorici izr. prof. dr. Heleni Haque Chowdhury za obilo podpore in konstruktivnih kritik pri nastajanju disertacije. Hvala članom komisije; prof. dr. Marku Kreftu, prof. dr. Petru Veraniču in prof. dr. Toniju Petanu, za pregled doktorskega dela in komentarje, s katerimi so prispevali k izboljšavi doktorske disertacije. Zahvaljujem se sodelavkam in sodelavcem iz Inštituta za pomoč pri praktičnem delu in konstruktivnih diskusijah. Na koncu gre velika zahvala tudi mojim staršem in prijateljem, ki so me vsa ta leta podpirali in mi z vso ljubeznijo ter potrpljenjem vedno stali ob strani.