CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O
t? t
co t
<
Ö O Z
m <
cc <
O <
o ^
I—
co O
Z
£
< <
z
cc
o
o
o ^
o
IMUNOMODULATORNA AKTIVNOST KOMBINACIJ ARABINOGALAKTANA IN p-(1^3, 1^6)-GLUKANA IN NJUNA INDUKCIJA PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI
THE IMMUNOMODULATORY ACTIVITY OF THE COMBINATION OF ARABINOGALACTAN AND P-(1^3, 1^6)-GLUCAN IN RELATION TO THEIR'S INDUCTION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY
AVTOR / AUTHOR: dr. Bratko Filipič1, prof. biol., Lidija Gradišnik2, ing. živ. in prehr. dr. Adriana Pereyra3, univ. dipl. kem. dr. Domen Jaklič3, univ. dipl. biol. Jana Potokar3, ing. kem. teh.
1Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo,
Medicinska fakulteta v Ljubljani,
Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, 1105 Ljubljana
2Inštitut za biomedicinske vede,
Medicinska fakulteta v Mariboru,
Univerza v Mariboru, Taborska 8, 2000 Maribor
3MEDEX d.o.o., Linhartova 49a, 1000 Ljubljana
NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: Bratko.Filipic@gmail.com
POVZETEK
Imunomodulatorji so snovi, ki pospešujejo ali zavirajo imunski odgovor. Po izvoru so to lahko strukturni deli mikroorganizmov, limfokini, različne snovi rastlinskega izvora in nekatere oblike bakterijske DNA. Med njimi so tudi arabinogalaktani, polimeri iz monosaharidov arabinoze in galaktoze in ß-glukani, polisaharidi z glukozo kot strukturno komponento,vezano z ß-glikozidno vezjo. Cilj predstavljenih poskusov je bil raziskati imunomodula-torno aktivnost in indukcijo protimikrobne aktivnosti kombinacij 1:15 in 1:20 ß-(1^3, 1^6)-glukana iz kvasovke Saccharomyces cerevisiae in arabinoga-laktana iz macesna. Imunomodulacija je bila izvedena v celičnem sistemu: TLT-makrofagi-monociti iz sveže periferne krvi (PBMC) (106 celic/ml). Sistem smo obdelali z 10 % kombinacijama 1:15 in 1:20 ß-(1 ^3, 1 ^6)-glukana in arabinogalaktana za 24 ur pri 37oC in 5 % CO2 in nato analizirali produkte imu-nomodulacije in indukcijo protimikrobne aktivnosti. Najprej smo analizirali aktivacijo makrofagov s povečanimi aktivnostmi NO, H2O2 in lizocima. Po vezavi na makrofage in interakcije z limfociti, je prišlo do zmanjšanja aktivnosti GM-CSF, povečanja aktivnosti TNF-a in IFN-y in do znižanja aktivnosti IFN-a ter selektivnega povečevanja aktivnosti IL-1 a, IL-2 in IL-4. Kombinacija 1:15 je bila približno za tretjino bolj aktivna od kombinacije 1:20. Kombinacija 1:15 je bila v in vitro pogojih bolj aktivna v indukciji protimikrobne aktivnosti proti po Gramu pozitivnim bak-teri- jam: Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus (MRSA), Micrococcus luteus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae in Streptococcus mutans in kvasovki Candida albicans, kot tudi proti po Gramu negativnim bakterijam: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis in Acinetobacter baumannii.
KLJUČNE BESEDE:
ß-(1^3, 1 ~^6)-glukan, arabinogalaktan, citokini, imunomodulacija, interferon
ABSTRACT
The immunomodulators are substances capable of interaction with the immune system to up- or down-regulate the specific aspects of host response. They include some structural parts of microorganisms,
250
farm vestn 2015; 66
some forms of bacterial DNA, lymphokines and plant-derived substances. p-Glucans, polysaccharides containing glucose linked with p-glycosidic bonds and arabinogalactans, biopolymers consisting of arabinose and galactose monosaccharides, are included into this group. The aim of presented experiments was to elucidate the immunomodulatory activity and induction of the antimicrobial activity of the combination of 1:15 and 1:20 of p-(1 ^3, 1 ^6)-glucan from Saccharomyces cerevisiae and arabinogalactan from larch. The immunomodulation analysis was performed on TLT-macrophage cell line and fresh peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (106 cells/ml). After treatment with 10 % of 1:15 and 1:20 p-(1^3, 1^6)-glucan:arabinogalac-tan incubated at 37oC for 24 hours, the immunomodulation was analysed. At first, the macrophages were activated by NO "burst", H2O2 and lysozyme increase. After binding to the macrophages and induce the interaction with lym-phocites, an increase of GM-CSF, TNF-a and IFN-Y was detected. Concomitantly, the decrease of the proinflamatory cytokines (IFN-a) and the increase of the IL-1a, IL-2 and IL-4 was found. The combination 1:15 was approximately one third more active than the combination 1:20. The combination 1:15 induces higher antimicrobial activity against Grampositive bacteria: Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus (MRSA), Micrococcus luteus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalac-tiae and Streptococcus mutans and yeast Candida albicans than against Gram-negative bacteria: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii.
KEYWORDS:
1 ~^6)-glucan, arabinogalactan, cytokines, immunomodulation, interferon
1
UVOD
Snovi, ki reagirajo z imunskim sistemom in pri tem povečajo ali zavirajo specifične aspekte imunskega odgovora, imenujemo imunomodulatorji (1, 2). Njihova funkcija je ve-
zana na nespecifično stimulacijo makrofagov in s tem imunskega odgovora (3). Po izvoru so to strukturni deli mikroorganizmov, kot so celične stene ali membrane. Imu-nomodulatorno lahko deluje tudi bakterijska DNA, ki vsebuje nemetilirano zaporedje citozina-gvanina (4). Poleg tega so imunomodulatorji tudi limfokini in različne snovi rastlinskega izvora. Med njimi so tudi arabinogalaktani in ß-glukani.
Cilj opravljenih poskusov je bil analizirati imunomodulatorno aktivnost kombinacij ß-(1 ^3, 1 ^6)-glukana in arabinoga-laktana v celičnem sistemu: TLT-makrofagi - monociti iz sveže periferne krvi (PBMC) (106 celic/ml) v zvezi z njihovo indukcijo protimikrobne aktivnosti.
1.1	ARABINOGALAKTANI
Arabiogalaktan je biopolimer sestavljen iz arabinoznih in galaktoznih monosaharidov (5). Macesnov (Laríx sp.) ara-binogalaktan, v nadaljevanju skarjšano MAG, je sestavljen iz razvejanih polisaharidov, ki vsebujejo glavno verigo iz galaktana, na katero so kot stranske verige vezane molekule galaktoze in arabinoze. Macesnov arabinogalaktan je pomemben izvor prehranskih vlaknin. Pospešuje nastanek kratkoverižnih maščobnih kislin, in sicer butirata in propio-nata. Razen tega pa zmanjšuje nastanek in absorbcijo amonijaka. Obstajajo dokazi, da uživanje arabinogalaktana pospešuje delovanje koristne črevesne mikroflore, posebej še črevesnih anaerobov, kot sta Bifidobacterium sp. in Lactobacillus sp.
MAG ima mnoge zanimive lastnosti, ki so ga postavile za idealno pomožno zdravilno sredstvo uporabno tudi v protokolih zdravljenja raka. Rezultati opravljenih poskusov so pokazali, da arabinogalaktan stimulira citotoksičnost naravnih celic ubijalk (NK), povečuje funkcionalne aspekte imunskega sistema in preprečuje metastaziranje tumorskih celic v jetrih (6). To nakazuje na njegovo klinično uporabo, tako v preventivi, ko "ustvarja" bolj odziven imunski sistem, kot tudi pri zdravljenju zmanjšanih funkcij imunskega sistema, zmanjšani aktivnosti celic NK ali kroničnih virusnih infekcijah.
1.2	B-GLUKANI
ß-glukani so verige polisaharidov iz D-glukoze povezane z ß-glikozidno vezjo. Najbolj biološko aktivni so ß-(1^3, 1^6)-glukani. Eden izmed najpogostejših virov ß-(1^3, 1 ^6)-glukanov je celična stena kvasovke S. cerevisiae. Ti so sposobni imunomodulacije in aktivacije imunskega sistema (5).
3
>o
2Í
LU g
"Z. <
z
N
Ž
_I
<
Z
en O
250
farm vestn 2015; 66
CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O
t? t
co t
<
Ö O Z
m <
cc <
O <
o ^
I—
co O
Z
£
< <
z
cc
o
o
o ^
o
Netopni p-(1 ^3, 1 ^6)-glukan je biološko bolj aktiven od vodotopnega p-(1 ^3, 1 ^6)-glukana (7). Za vezavo p-glu-kanov sta odgovorna površinski receptor prirojenih imunskih celic imenovan dectin-1 in komplementni receptor 3 (CR3 ali CD11 b/CD18). Samo dva receptorja "dovoljujeta" imunskim celicam, da jih spoznajo kot "tuje" (8, 9).
Najbolj se p-(1 ^3, 1 ^6)-glukani absorbirajo po peroral-nem uživanju na tešče. V zvezi s tem so ugotovili, da ente-rociti olajšajo prehod p-(1 ^3, 1 ^6)-glukanov skozi celično steno tankega črevesa v limfo. Tam se vežejo na makro-fage in tako aktivirajo njihove različne imunske funkcije (10). Študije, kjer so uporabili radioaktivno označene molekule so pokazale, da v serumu najdemo manjše in večje fragmente p-glukanov, kar kaže na absorbcijo iz tankega črevesa (11). Celice-M znotraj Peyer-jevih polojev fizično prenašajo netopne glukanske delce v limfoidno tkivo, ki je povezano s črevesom (12).
2
MATERIALI IN METODE
2.1 MATERIALI
2.1.1 Reagenti in celice
Gojišče po Eagle-u z visoko vsebnostjo glukoze, L-gluta-mina, 25 mM HEPES-a in antibiotiki (penicilin, streptomicin in gentamicin) dodanimi v koncentraciji 0,1 % standardne količine in raztopina tripsina sta bili pripravljeni na Inštitutu za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinske fakultete v Ljubljani v Laboratoriju za raziskave interferonov. Uporabili smo fetalni bovini serum (FBS) (Euroclone, Italija). p-(1^3, 1 ^6)-glukan iz S. cerevisiae, v nadaljevanju Sp-G (Immitec nutrition AB, ZDA) in macesnov arabinogalaktan - MAG (Lonza, Švica) in arabinogalaktan iz ameriškega slamnika, skrajšano EAG (Pfannenschmidt, Nemčija) je prispevalo podjetje MEDEX d.o.o., Slovenija.
Pri delu smo uporabljali humano makrofagno linijo TLT, ki smo jo dobili od Lidije Gradišnik iz Medicinske fakultete, Univerze v Mariboru. Mononuklearne celice (PBMC) smo izolirali iz buffy coat-ov pripravljenih iz periferne krvi. Buffy coat-e smo kombinirali in centrifugirali pri 1700 RPM za 20 minut pri 4oC. Sedimentu, ki je vseboval eritrocite, limfocite, makrofage in granulocite smo dodali 9 delov 0,83 % amonijevega klorida. Liza eritrocitov je potekala pri 4oC in je trajala 15-20 minut. Celično suspenzijo smo nato centrifugirali
20 minut pri 2500 obratih in 4oC, supernatant smo odstranili, sediment z levkociti/limfociti/makrofagi pa smo resu-spendirali v PBS-u, ki je vseboval 1 % glukoze. Procent preživelih celic smo določali z barvanjem s tripanskim mo-drilom.
2.1.2 Mikroorganizmi
Vse mikroorganizme, ki smo jih uporabili v poskusih smo dobili iz mikrobne zbirke Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinske fakultete, Univerze v Ljubljani. Uporabili smo naslednje po Gramu negativne bakterije: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, in po Gramu pozitivne bakterije: Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus (MRSA), Micrococcus luteus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae in Streptococcus mutans. Pri delu smo uporabljali tudi kvasovko Candida albicans.
2.2 METODE
2.2.1	Obdelava celic
V 10 ml stekleničkah z ravnim dnom, zaprtih z gumijastimi zamaški smo kultivirali humano makrofagno linijo (TLT) z uporabo modificiranega Eaglovega gojišča z dodatkom 10 % FBS. Ko so celice dosegle konfluenco, smo supernatant odstranili in dodali 2 ml suspenzije PBMC (106 celic/ml). Po dveh urah, smo dodali 2,5 ml modificiranega Eaglovega gojišča z dodatkom 2 % FBS. Za indukcijo imunomodula-cije in protmikrobne aktivnosti, smo dodali po 0,5 ml 10 % oz. 1 % Sß-G, MAG in arabinogalaktana iz ameriškega slamnika - EAG, kot kontrolo. Dodatno pa še: 10 % raztopini Sß-G in MAG v medsebojnih razmerjih 1:15 in 1:20. Stekleničke smo inkubirali 24 in 48 ur pri 37oC. Vse poskuse smo izvajali v triplikatu z dvakratno ponovitvijo. Po inkubaciji smo stekleničke centrifugirali 20 minut pri 1700 obratih in 4oC. Supernatante smo filtrirali skozi 0,2 |jm filtre in do analiz hranili na temperaturi -20oC.
2.2.2	Določanje stimulacije makrofagov preko vodikovega peroksida (H2O2), lizocima in dušikovega monoksida (NO)
Stimulacijo makrofagov smo določali s pomočjo nastale in sproščene količine H2O2 (jM/ml) v kultiviranih celicah (TLT+PBMC) s pomočjo metode, ki jo je razvil Orsi s sod. (14). K svežim sedimentiranim celicam (TLT+PBMC) smo dodali 500 jl modificiranega fenol rdečega (50 ml vsebuje: 140 mM NaCl, 10 mM K2HPO4 , 5,5 mM dekstroze in 8,5 U/ml peroksidaze hrena). Po štirih urah inkubacije na 37oC, smo dodali 100 jl 1 M NaOH in vse skupaj 10 x razredčili s fiziološko raztopino. Optično gostoto raztopine smo merili
250
farm vestn 2015; 66
spektrofotometrično pri 620 nm. Kot kontrolo smo uporabili 10 mM H2O2.
Količino lizocima v celičnem supernatantu (TLT+PMBC) smo določili po metodi, ki jo je razvil Nash s sod. (15). Pripravili smo različne raztopine vzorca in lizocima. V 1,6 ml MH bujona (pH=6,5) smo dodali 200 |jl, 10 mM PBS-a (pH=7,4), 200 |l vzorca celičnega supernatanta, 103 CFU bakterije S. pyogenes in 3 različne koncentracije lizocima: 1, 0, 10 in 100 |g/ml. Po enodnevni inkubaciji pri 37°C smo merili optično gostoto (OD) pri 595 nm. Količino lizocima (|M/ml) smo izračunali v primerjavi z bakterijsko OD po 24 urah.
Koncentracijo stabilnega nitrita, končnega produkta meta-bolizma NO prisotnega v supernatantu obdelanih ali neobdelanih celičnih suspenzij (TLT+PMBC) smo merili s pomočjo Griessove reakcije (16). K 50 |l supernatanta smo dodali 50 |l Griessovega reagenta (1 % sulfanilamida v 2,5 % H3PO4 in 0,1 % naftiletilendiamin dihidroklorida v destilirani vodi). Obe raztopini v razmerju 1:1 smo 30 minut mešali pri sobni temperaturi. Absorbanco smo merili pri 550 nm. Standardno krivuljo za nitrit smo pripravili z uporabo 10 - 100 |M natrijevega nitrita v destilirani vodi.
2.2.3 Imunološki testi
Količino induciranega HuIFN-aN3 (pg/ml) smo določali s pomočjo Human IFN ELISA kit Platinum ELISA (eBio-science, ZDA). Kot kontrolo smo uporabili mednarodno priznani HuIFN-aN3 standard (Human IFN-a Platinum ELISA (BMS 216/BMS 216 TEN, Affymetrix, eBioscience, ZDA). Določanje HuIFN-aN3 je potekalo po navodilih proizvajalca.
Količino HuIFN-y (pg/ml) v celičnem (TLT+PBMC) supernatantu so določali s pomočjo Mini ELISA Development Kit (Peprotech, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Najprej smo vezali zajemalna (capture) protitelesa (1 |g/ml) na Nunc Maxisorp mikrotiterske plošče, in nato dodali 300 |l blokirajočega (blocking) pufra. Nanos Standarda/Vzorca: razredčili smo standard (HuIFN-y) od 300 pg do 0,1 pg v dilunetu in dodali 100 |l standarda ali vzorca v vsako luknjico v triplikatu in inkubirali mikrotiterske plošče 6 ur pri 37oC. Detekcija: po trikratnem spiranju mikrotiterskih plošč smo razredčili detekcijska protitelesa v dilunetu do koncentracije 1 |g/ml in dodajali po 100 |l/luknjico in mikrotiterske plošče inkubirali pri sobni temperaturi za dve uri. Avidin-HRP Konjugat: po spiranju plošč smo raztopili 5,5 |l Avidin-HRP konjugata 1:2000 v 11 ml diluneta in do-
dajali po 100 |jl/luknjico. Mikrotiterske plošče smo inkubirali eno uro pri sobni temperaturi. ABTS Tekoči Substrat: mikrotiterske plošče smo sprali dvakrat. Na prazne plošče smo nato dodali po 100 jl substrata v vsako luknjico in počakali da se razvije zelena barva. Nato smo dodali v vsako luknjico po 10 jl 1 % SDS in merili optično gostoto pri 650 nm. Reliabilno standardno krivuljo dobimo pri vrednostih, ki ne presegajo 0,2 enote ničelnega koncentracijskega standarda ali 1,2 enoti standarda najvišje koncentracije. Količino GM-CSF (pg/ml) v celičnem supernatantu (TLT+PBMC) smo določali s pomočjo GM-CSF Mini ELISA Development Kit (Peprotech, ZDA) na podoben način kot v primeru HuIFN-y, le da smo tu uporabili GM-CSF specifična zajemalna (capture) in detekcijska protitelesa kot tudi specifični avidin-HRP konjugat.
Poleg tega, smo v celičnem (TLT+PBMC) supernatantu določevali še naslednje citokine: TNF-a, IL-1a, IL-2 in IL-4. Pri vseh smo uporabili specifičen mini ELISA kit (Peprotech, ZDA). Postopki so podobni kot v primeru HuIFN-y, le da smo pri specifičnem markerju uporabili specifična zaje-malna (capture) in detekcijska protitelesa, kot tudi specifični avidin-HRP konjugat.
2.2.4	Indukcija protimikrobne aktivnosti
Protimikrobno aktivnost smo določali s pomočjo difuzije v agarju (13). Suspenzijo mikrobov v hranilnem bujonu gostote 0,5 McFarlanda smo »razmazali« po celotni površini Mueller Hinton agarja. S pomočjo kovinskega luknjača smo nato izvrtali 6 mm široke luknje v katere smo dodajali po 70 jl vzorca. Vzorci so bili sledeči: 10 % EAG, 10 % MAG, 10 % Sp-G, 10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:15 in 10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:20. Na kontrolnih ploščah smo dodali po 70 jl 0,1 % raztopine penicilina, streptomicina, gentamicina oziroma 70 jl 0,1 % raztopine antimikotika nistatina. Plošče smo inkubirali 72 ur pri 37oC. Zono inhibicije smo izmerili v mm.
2.2.5	Obdelava podatkov
Vsi poskusi so bili opravljeni v trikratnih ponovitvah. Izrazili smo srednjo vrednost ± standardna deviacija. Za ugotavljanje signifikantnosti smo uporabili t-test.
3
>o
ž
LU
I
z <
z
N
Ž
_I
<
Z
en O
250
farm vestn 2015; 66
CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O
3
REZULTATI IN RAZPRAVA
Aktivacijo makrofagov in vivo lahko povzročita bodisi uporaba zdravil, bodisi je posledica virusne infekcije (Slika 1). In vitro jo oponašamo v sistemu: monosloj humane makro-fagne celične linije (TLT) na katerem je suspenzija PBMC (106 celic/ml) (Slika 2). Podatke o imunomodulatorni aktivnosti p-(1 ^3, 1 ^6)-glukana, arabinogalaktana, in različnih kombinacijah med njima, lahko razdelimo v dva dela: (a) imunomodulatorna aktivnost in (b) indukcija protimikrobne aktivnosti.
3.1 IMUNOMODULATORNA AKTIVNOST IN VITRO
3.1.1 Vpliv arabinogalaktana, P-(1^3, 1^6)-glukana in kombinacij med njima na sproščanje H2O2, NO in lizocima.
Vpliv arabinogalaktana, p-(1 ^3, 1 ^6)-glukana in kombinacij med njima na sproščanje H2O2, NO in lizocima je prikazan v Preglednici 1 in Sliki 3.
o t
co t
<
O O Z
m <
cc <
O <
Slika 1: Aktivacija makrofagov in vivo. Figure 1: Macrophage activation in vivo.
O ^
i—
co O
Z
>
£ < <
z
cc
o
Q
O
o
Slika 2: Shema aktivacije makrofagov in vitro v naših poskusih.
Figure 2: Scheme of the macrophage activation in vitro in the performed experiments.
264
farm vestn 2015; 66
Preglednica 1: Arabinogalaktan in p-(1—3, 1 —6)-glukan vplivata na sproščanje H2O2, NO in lizocima.
Table 1: Arabinogalactan and p- (1 —3, 1 —6)-glucan effect the release of H2O2, NO and lysozim from treated macrophages.
Vzorec:	H2O2 ^M/ml		NO (^M/ml)		Lizocim (^M/ml)	
	Kontrola celic1	H2°22	Kontrola celic1	NO2	Kontrola celic1	Lizocim2
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	1 ±0,17	1±0,60	3±0,60	3±0,35	10±0,48	35±0,87
10 % Larix sp. arabinogalaktan	1 ±0,17	1±0,20	3±0,60	4±0,60	10±0,48	36±0,50
10 % S. cerevisae P-(1—3, 1—6)-glukan	1 ±0,17	1 ±0,18	3±0,60	4±0,12	10±0,48	38±0,18
10 % 1:15 S. cerevisae p-(1—3, 1—6)-glukan:Lar/x sp. arabinogalaktan	1 ±0,17	4±0,18*	3±0,60	12±0,74*	10±0,48	47±0,52**
10 % 1:20 S. cerevisae p-(1—3, 1— 6)-glukan:Larx sp. arabinogalaktan	1 ±0,17	2±0,20	3±0,60	11 ±0,55	10±0,48	26±0,27
Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05, 1 supernatant neobdelanih celic, 2 supernatant obdelanih celic
Iz rezultatov je razvidno, da 10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:15 bolj povečuje sproščanje: H2O2, NO in lizocima iz kombinacije celic TLT + PBMC kot 10 % raztopina v razmerju 1:20.
3.1.2 Vpliv arabinogalaktana, P-(1 —3, 1 —6)-glukana in kombinacij med njima na sproščanje GM-CSF in TNF-a iz humanih makrofagov.
Rezultati vpliva arabinogalaktana in p-(1 —3, 1 —6)-glukana, in kombinacij med njima na sproščanje GM-CSF in TNF-a iz humanih makrofagov so prikazani v Preglednici 2 in Sliki 4.
Slika 3: Vpliv arabinogalaktana, p-(1—3, 1—6)-glukana in njunih kombinacij na nivo sproščenega H2O2, NO in lizocima iz celičnega sistema makrofagna celična linija TLT/PBMC. Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05.
Figure 3: Effect of arabinogalactan and p-(1—3, 1—6)-glucan and their's combination on the level of H2O2, NO and lysozyme released from the cell system: TLTMacrophage cell line/PBMC. Significant difference *p<0,1, **p<0,05
>o
ž
LU
I
z <
z
N
Ž
_I
<
Z
CC O
250
farm vestn 2015; 66
CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O ^
3 Q
Z
<
Preglednica 2: Arabinogalaktan, @-(1 —3, 1 —6)-glukan, in kombiacije med njima vplivajo na sproščanje GM-CSFin TNF-a iz humanih makrofagov.3 Table 2: Arabinogalactan, fi-(1 -3, 1 —6)-glucan and conmbinations induce the macrophage's release of GM-CSF and TNF-Alfa.3
Vzorec	GM-CSF (pg/ml		TNF-a (pg/ml)	
	Kontrola1	GM-CSF2	Kontrola1	TNF-a2
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	59±0,89	152±98	136±47	200±29
10 % Larix sp. arabinogalaktan	59±0,89	87±0,41	136±47	180±35
10 % S. cerevisae p-(1—3, 1—6)-glukan	59±0,89	64±0,20	136±47	193±25
10 % 1:15 S. cerevisae p-(1 — 3, 1—6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	59±0,89	182±63*	136±47	451±76**
10 % 1:20 S. cerevisae P-(1—3, 1—6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	59±0,89	108±45	136±47	247±35*
Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05, 1 supernatant neobdelanih celic, 2 supernatant obdelanih celic, 3 v 2 % FBS-u najdemo 29±22 ng GM-CSF in 10 ng/ml TNF-a, ki ne vplivata na rezulate poskusa.
O t
co t
<
Z
š
!5 <
o o z
m <
cc <
O <
o ^
I—
co O
Z
>
£ < <
z
cc
o
Q
O
o
10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:15 bolj povečuje nivo GM-CSF in TNF-a v sistemu TLT/PBMC kot 10 % MAG bolj kot njuna 10 % raztopina v razmerju 1:20. 10 % EAG.
3.1.3 Vpliv Arabinogalaktana, P-(1 ^3, 1 ^6)-glukana, in kombinacij med njima na sproščanje IFN-a in IFNy in aktivnost citokinov IL1a, IL-2 ter IL-4.
p-(1^3, 1^6)-glukan, arabinogalaktan in kombinacije med njima vplivajo na sproščanje IFN-a, IFNy (Preglednica 3) (Slika 5). Poleg tega smo pri poskusih opazili tudi vpliv na aktivnost citokinov IL1 a, IL-2 in IL-4, kar je prikazano v Preglednici 4 in grafično na Sliki 6.
i.'-l'J.'lm ...............
1 k -i in ilUHflUDIh Pil II tinnh- ill] l-V-r* ta-
_ — ----■-,-■■-
- -T- ■ ■ f--------I ^ F.-H.;.■•■. j i ■ w ■ pm
Bfiq	K>	pi; u
h mril i	Uivlm^
Slika 4: Vpliv arabinogalaktana, @-(1—3, 1 —6)-glukana in njunih kombinacij na nivo sproščenega GM-CSF in TNF-a iz celičnega sistema makrofagna celična linija TLT/PBMC. Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05.
Figure 4: Effect of arabinogalactan, @-(1 —3, 1 —6)-glucan and their's combinations on the level of GM-CSF and TNF-a released from the cell system: TLTMacrophage cell line/PBMC. Significant difference *p<0,1, **p<0,05
264
farm vestn 2015; 66
Preglednica 3: Arabinogalaktan in @-(1—3, 1 —6)-glukan inducirata sproščanje citokinov IFN-a, IFNy iz humanih makrofagov.3 Table 3: Arabinogalactan and@-(1 —3, 1 —6)-glucan and induce the macrophage's release of cytokins: IFN-a, IFNy.3
Vzorec	HulFN-y (pg/ml)		HuIFN-a (pg/ml)	
	Kontrola1	IFN-Y2	Kontrola1	IFN-a2
10% Echinacea sp. arabinogalaktan	79±0,69	83±0,72	22±0,84	25±0,55
10% Larix sp. arabinogalaktan	79±0,69	86±0,44	22±0,84	26±0,54
10% S. cerevisae P-(1—3, 1—6)-glukan	79±0,69	79±0,70	22±0,84	23±0,23
10% 1:15 S. cerevisae P-(1—3, 1—6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	79±0,69	198±68**	22±0,84	28±0,27
10% 1:20 S. cerevisae P-(1—3, 1—6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	79±0,69	86±0,88*	22±0,84	26±0,24
Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05, 1 supernatant neobdelanih celic, 2 supernatant obdelanih celic, 3 v 2 % FBS-u najdemo: 3.0±0.9 pg/ml HulFN-y in 1.13±0.09 pg/ml HulFN-a, ki bistveno ne vplivata na rezultate poskusa.
10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:15 bistveno poveča sproščanje HuIFN-y in zmanjšuje nivo HuIFN-a v su-pernatantu obdelanih celic (TLT/PMBC).
I tuli' V i IIuEr\ . Hm I K'V M v; 1 LflU-^-r I4i
K iiiiEfnlu	kiinlruln
Slika 5: Vpliv arabinogalaktana, fi-(1 -3, 1 —6)-glukana in njunih kombinacij na nivo sproščenega HulFN-y in HuIFN-aN3 iz celičnega sistema makrofagna celična linija TLT/PBMC. Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05.
Figure 5: Effect of arabinogalactan, fi-(1 —3, 1 —6)-glucan and their's combination on the level of HulFN-y nad HuIFN-aN3 released from the cell system: TLT Macrophage cell line/PBMC. Significant difference *p<0,1, **p<0,05.
>o
ž
LU
I
z <
z
N
Ž
_I
<
Z
en O
250
farm vestn 2015; 66
CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O ^
3 Q
Z
<
Preglednica 4: Arabinogalaktan, @-(1 ^3, 1 ~^6)-glukan in kombinacije med njima vplivajo na aktivnost IL1a, IL-2 in IL-4 3
Table 4: Arabinogalactan,	1 ~^6)-glucan and combinations induce the macrophage's release of cytokines: IL1a, IL-2 and IL-4 3
Vzorec	IL-1a (pg/ml)		IL-2 (pg/ml)		IL-4 (pg/ml)	
	Kontrola1	IL-1a2	Kontrola1	IL-22	Kontrola1	IL-42
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	59±0,63	91±0,96	79±0,33	146±34	54±0,99	83±0,44
10 % Larix sp. arabinogalaktan	59±0,63	117±23	79±0,33	78±0,86	54±0,99	98±0,56
10 % S. cerevisae P-(1^3, 1^6)-glukan	59±0,63	114±39	79±0,33	93±0,24	54±0,99	99±0,89
10 % 1:15 S. cerevisae P-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	59±0,63	161 ±16**	79±0,33	178±21 **	54±0,99	212±36**
10 % 1:20 S. cerevisae P-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	59±0,63	98±14*	79±0,33	102±17*	54±0,99	128±26*
a t
CO t
<
Z
š
!5 <
o o z
m <
cc <
O <
o ^
I—
co O
Z
£
< <
z
cc
o
Q
O
o
Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05, 1 supernatant neobdelanih celic, 2 supernatant obdelanih celic, 3 v 2 % FBS-u najdemo: 0.12±0.09 ng/mlIL-1a, 22±0.12 pg/mlIL-2 in 10.0 ±0.12 ng/mlIL-4. Tudi te količine v 2 % FBS-u ne vplivajo na rezultate.
10 % Sp-G bolj povečuje sproščanje IL-1a, IL-2 in IL-4 od 10 % EAG in 10 % MAG. 10 % raztopina Sp-G in MAG v razmerju 1:15 bistveno bolj povečuje sproščanje IL-1a, IL-2 in IL-4 kot njuna 10 % raztopina v razmerju 1:20.
Slika 6: Vpliv arabinogalaktana, p-(1^3, 1^6)-glukana in njunih kombinacij na nivo sproščenega IL-1a, IL-2 in IL-4 iz celičnega sistema makrofagna celična linija TLT/PBMC. Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05.
Figure 6: Effect of arabinogalactan,	1 ~^6)-glucan and theirs combination on the level of IL-1a, IL-2 and IL-4 released from the cell
system: TLTMacrophage cell line/PBMC. Significant difference *p<0,1, **p<0,05.
264
farm vestn 2015; 66
3.2 INDUKCIJA PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI IN VITRO.
3.2.1	Arabinogalaktan, P-(1^3, 1^6)-glukan in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti po Gramu negativnim bakterijam.
Rezultati indukcije protimikrobne aktivnosti arabinogalak-tana, p-(1 ^3, 1 ^6)-glukana, in kombinacij med njima so prikazani v Preglednici 5.
3.2.2	Arabinogalaktan, P-(1^3, 1^6)-glukan in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti po Gramu pozitivnim bakterijam.
Rezultati indukcije protimikrobne aktivnosti proti po Gramu "+" bakterijam z arabinogalaktanom, p-(1^3, 1^6)-gluka-nom in kombinacij med njima so prikazani v Preglednici 6.
3.2.3	Arabinogalaktan, P-(1^3, 1^6)-glukan in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti kvasovki Candida albicans.
Rezultati indukcije protiglivne aktivnosti proti C. albicans z arabinogalaktanom, p-(1 ^3, 1 ^6)-glukanom in kombinacijami med njima so prikazani v Preglednici 7.
Arabinogalaktan stimulira citotoksičnost naravnih celic ubi-jalk (NK), povečuje funkcionalne aspekte imunskega sistema in preprečuje metastaziranje tumorskih celic v jetra. Tako povečevanje funkcionalnih aspektov imunskega sistema s pomočjo arabinogalaktana, pa nakazuje tudi na njegovo klinično uporabo, tako v preventivi ko "ustvarja" bolj odziven imunski sistem, kot tudi pri zdravljenju zmanjšanih funkcij imunskega sistema, zmanjšani aktivnosti celic NK ali kroničnih virusnih infekcijah (11). V naših poskusih smo uporabili dve vrsti arabinogalaktana in sicer: 10 % EAG in 10 % MAG. V večini primerov se je MAG izkazal z boljšo biološko aktivnostjo. Zaradi tega smo ga v poskusih uporabili v kombinaciji s Sp-G v razmerjih 1:15 oz. 1:20. Imunomodulatorna aktivnost Sp-G je dobro je znana (17). Pri njej pride do aktivacije makrofagov (18), neutrofilcev in celic NK (19), celic T (20) in celic B (21). p-(1^3, 1^6)-glukan nespecifično povzroča nastanek rezistence proti bakterijskim (22) in nekaterim virusnim infekcijam (23). Primarno gre pri takih indukcijah protimikrobne aktivnosti za aktivacijo makrofagov tako in vitro, kot tudi in vivo. Ugotovili so da p-(1 ^3, 1 ^6)-glukan povzroča aktivacijo makrofagov in s tem selektivno produkcijo različnih citokinov. En način delovanja p-(1 ^3, 1 ^6)-glukanov zajema stimulacijo monocitov/makrofagov in sproščanje mediatorjev vključenih v vnetje, kot so: prostaglandin E2, interferon y,
!5
o
ž
LU g
Z <
z
N
Preglednica 5: Arabinogalaktan, fi-(1 —3, 1 —6)-glukan in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti po Gramu negativnim bakterijam1
Table 5: Arabinogalactan, @-(1—3, 1 —6)-glucan and theirs combinations induce the antimicrobial rezistence against Gramm negative bacteria1
<
en O
Vzorec	E. coli2	P. aeruginosa2	P. mirabilis2	A. baumannii2
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	3±0,25	2±0,15	2±0,15	4±0,90
10 % Larix sp. arabinogalaktan	10±2,4*	5±1,1	4±0,90	5±1,1
10 % S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan	8±1,9	5±1,1	6±1,8	3±0,25
10 % 1:15 S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	14±3,7**	10±2,4**	9±2,0**	9±2,0*
10 % 1:20 S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	8±1,9	7±1,5*	6±1,8	6±1,8
0,1 % penicilin	8±1,9	4±0,90	5±1,1	3±0,25
0,1 % streptomicin	10±2,4	7±1,5	9±2,0	12±2,5
0,1 % gentamicin	12±2,5	8±1,9	8±1,9	14±3,1
70 % povprečja inhibicijske cone (mm ±) penicilina, streptomicina in gentamicina je služila kot kontrola	7±0,11	4±0,41	5±0,11	6±0,72
1 Protimikrobna aktivnost v mm±SD, 2 Uporabljena koncentracija je bila 0,5 McFarlanda, Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05
farm vestn 2015; 66
CO
o
z
>
£ <
m
O cr
O
cc <
Z2
O
Preglednica 6: Arabinogalaktan, fi-(1—3, 1 —6)-glukan, in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti po Gramu pozitivnim bakterijam1.
Table 6: Arabinogalactan and @-(1 -3, 1 —6)-glucan and thiers combinations induce the antimicrobial resistance against Gramm positive bacteria1.
Vzorec	S. aureus2	MRSA2	M. luteus2	S. pyogenes2	S. agalactiae2	S. mutans2
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	2±0,15	2±0,15	3±0,25	4±0,90	2±0,15	4±0,90
10 % Larix sp. arabinogalaktan	4±0,90	4±0,90	9±2,0*	4±0,90	4±0,90	9±2,0
10 % S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan	4±0,90	7±1,5	6±1,8	10±2,4*	4±0,90	11 ±2,8*
10 % 1:15 S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	8±1,9*	9±2,0**	11 ±2,8*	8±1,9	9±1,9*	12±2,5*
10 % 1:20 S. cerevisae ß-(1 ^3, 1 ^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	5±1,1	7±1,5*	8±1,9	6±1,8	5±1,1	8±1,9
0,1 % penicilin	9±2,0	2±0,15	8±1,9	11 ±2,8	8±1,9	6±1,8
0,1 % streptomicin	6±1,8	8±1,9	12±2,5	14±3,1	14±3,1	11 ±2,8
0,1 % gentamicin	8±1,9	11 ±2,8	14±3,1	17±3,7	15±3,3	16±3,7
70 % povprečja inhibicijske cone (mm ±) penicilina, streptomicina in gentamicina je služila kot kontrola	5±0,32	4±0,9	7±1,2	9±0,8	8±1,61	7±0,7
a t
CO t
1 Protimikrobna aktivnost v mm±SD, 2 Uporabljena je bila koncentracija po Gramu pozitivnih bakterij 0.5 McFarlanda, Signifikantna razlika: *p<0,1, **p<0,05
<
Z
š <
o o z
m <
cc <
O <
o ^
I—
co O
Z
>
£ < <
z
cc
o
o
o ^
o
Preglednica 7: /3-(1—3, 1 —6)-glukan, arabinogalaktan, in kombinacije med njima inducirajo protimikrobno aktivnost proti C. albicans.2
Table 7: @-(1—3, 1 —6)-glucan, arabinogalactan, and theirs combinations induce the antimicrobial resistance against yeast C. albicans2
Vzorec	Candida albicans2
10 % Echinacea sp. arabinogalaktan	4±0,9
10 % Larix sp. arabinogalaktan	5±1,1
10 % S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan	7±1,5*
10 % 1:15 S. cerevisae ß-(1^3, 1^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	9±2,0**
10 % 1:20 S. cerevisae ß-(1 ^3, 1 ^6)-glukan: Larix sp. arabinogalaktan	6±1,8
0,1 % nistatin	8±1,9
70 % inhibicijske cone nistatina kot kontrola	5±0,6
1 Protimikrobna aktivnost v mm±SD.2 Uporabili smo suspenzijo kvasovk koncentracije 0,5 McFarlanda, Signifikantna razlika: *p<0.1, **p<0.05
interlevkini in faktor tumorske nekroze (TNF-2). Pri taki stimulaciji pride do 1 ^3 vezave p-glukanov na receptorje na površini makrofagov. V naših poskusih smo to potrdili, in raziskave razširili na celični sistem: monosloj humanih makrofagov (TLT) in suspenzija PBMC (106 celic/ml) (Slika 2), ki smo ga obdelali z 10 % raztopinama Sp-G in MAG v razmerjih 1:15 in 1:20. Ob aktivaciji makrofagov (TLT) najprej pride do »izbruha« NO, povečanja sproščanja H2O2 in lizo-cima. Po interakciji p-glukanov z makrofagi (TLT) in indukciji interakcije s PBMC pride nato do sproščanja GM-CSF, TNF-a in IFN - y in istočasno do zmanjšanja nivoja vnetnih citokinov (IFN - a). Vzporedno, pa ob taki interakciji pride do selektivnega sproščanja: IL-1a, IL-2 in IL-4.
4
ZAKLJUČKI
Imunomodulacijo smo izvedli v celičnem sistemu: TLT-ma-krofagi/monociti iz sveže periferne krvi (PBMC) (106 celic/ml) (Slika 2). Po obdelavi sistema z 10 % raztopino Sß-G in MAG v razmerju 1:20 oz. 1:15 za 24 ur pri 37°C smo analizirali produkte imunomodulacije in indukcijo pro-timikrobne aktivnosti. Najprej je prišlo do vezave kombina-
250
farm vestn 2015; 66
cije p-(1 ^3, 1 ^6)-glukana in arabinogalaktana na makro-fage (TLT - monosloj) in nato do njihove aktivacije, ki je povezana z izbruhom aktivnosti NO ter povečanjem nivoja H2O2 in lizocima. Po povzročitvi interakcije z monociti iz periferne krvi (PBMC) je prišlo do povečanja aktivnosti GM-CSF, TNF-a in IFN-y, in istočasno do znižanja aktivnosti IFN-a ter selektivnega povečevanja aktivnosti IL-1a, IL-2 in IL-4. Raztopina v Sp-G in MAG razmerju 1:15 je bila za tretjino bolj aktivna kot 1:20. Prav tako je ta raztopina, v razmerju 1:15, inducirala večjo protimikrobno aktivnost in vitro proti po Gramu "+" bakterijam: S. aureus, S. aureus (MRSA), M. luteus, S. pyogenes, S. agalactiae in S. mutans ter kvasovki C. albicans, kot proti po Gramu "-" bakterijam: E. coli, P.aeruginosa, P. mirabilis in A. baumannii. Izgleda, da pri uporabi kombinacije Sp-G in MAG v razmerju 1:15 pride do neke vrste sinergije med njima pri povečevanju celokupnega biološkega učinka. Ta kombinacija je pomembna zaradi povečevanja imunskega statusa pri ljudeh in zaradi indukcije protimikrobne rezistence proti po Gramu "+" bakterijam, kvasovki C. albicans in nekaterim virusom tudi v in vivo pogojih.
5
LITERATURA
Stanilova SA, Dobreva ZG, Slavov ES et al. C3 binding glycoprotein from cuscuta europea induced different cytokine profiles from human pbmc compared to other plant and bacterial immunomodulators. International immunopharmacology 2005; 5: 723-734.
Utoh-Nedos AU, Akah PA, Okoye TC et al. Evaluation of the toxic effects of dihydroartemisinin on the vital organs of wistar albino rats. American Journal of Pharmacology and Toxicology 2009; 4: 169-173.
Tzianabos AO Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: Structural aspects and biologic function. Clinical microbiology reviews 2000; 13: 523-533. Hacker G, Redecke V, and Hacker H Activation of the immune system by bacterial cpg-DNA. Immunology 2002; 105(3): 245251.
Ooi VE and Liu F Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current medicinal chemistry 2000; 7: 715-729.
Teas J The dietary intake of laminaria, a brown seaweed, and breast cancer prevention. Nutrition and cancer 1983; 4: 217-222. Miura N Blood clearance of (1 3)-fi-?-glucan in mrl lpr/lpr mice. FEMS Immunology and Medical Microbiology 1996; 13: 51-57. Vetvicka V, Dvorak B, Vetvickova J et al. Orally administered marine (1 — >3)-beta-d-glucan phycarine stimulates both humoral and cellular immunity. International journal of biological macromolecules 2007; 40: 291-298.
9.	Brown GD and Gordon S Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature 2001; 413: 36-37.
10.	Frey A, Giannasca KT, Weltzin R et al. Role of the glycocalyx in regulating access of microparticles to apical plasma membranes of intestinal epithelial cells: Implications for microbial attachment and oral vaccine targeting. The Journal of experimental medicine 1996; 184: 1045-1059.
11.	Tsukagoshi S, Hashimoto Y, Fujii G et al. Krestin (psk). Cancer treatment reviews 1984; 11: 131-155.
12.	Hong F, Yan J, Baran JT et al. Mechanism by which orally administered -1,3-glucans enhance the tumoricidal activity of antitumor monoclonal antibodies in murine tumor models. The Journal of Immunology 2004; 173: 797-806.
13.	Lino A and Deogracious O The in-vitro antibacterial activity of annona senegalensis, securidacca longipendiculata and steganotaenia araliacea - ugandan medicinal plants. African health sciences 2006; 6:31-35.
14.	Orsi RO, Funari SRC, Soares AMVC et al. Immunomodulatory action of propolis on macrophage activation. Journal of Venomous Animals and Toxins 2000; 6: 205-219.
15.	Nash JA, Ballard TNS, Weaver TE et al. The peptidoglycan-degrading property of lysozyme is not required for bactericidal activity in vivo. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 2006; 177: 519-526.
16.	Ding AH, Nathan CF, and Stuehr DJ Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent production. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 1988; 141: 2407-2412.
17.	Estrada A, Yun CH, Van Kessel A et al. Immunomodulatory activities of oat beta-glucan in vitro and in vivo. Microbiology and immunology 1997; 41: 991-998.
18.	Konopski Z, Seljelid R, and Eskeland T Cytokines and pge2 modulate the phagocytic function of the beta-glucan receptor in macrophages. Scandinavian journal of immunology 1993; 37: 587-592.
19.	Vetvicka V, Thornton BP, and Ross GD Soluble beta-glucan polysaccharide binding to the lectin site of neutrophil or natural killer cell complement receptor type 3 (cd11b/cd18) generates a primed state of the receptor capable of mediating cytotoxicity of ic3b-opsonized target cells. The Journal of clinical investigation 1996; 98: 50-61.
20.	Sakurai T, Hashimoto K, Suzuki I et al. Enhancement of murine alveolar macrophage functions by orally administered beta-glucan. International journal of immunopharmacology 1992; 14: 821-830.
21.	Soltys J, Benkova M, and Boroskova Z Immunorestorative effect of glucan immunomodulator on guinea pigs with experimental ascariosis. Veterinary immunology and immunopathology 1994; 42: 379-388.
22.	Reynolds JA, Kastello MD, Harrington DG et al. Glucan-induced enhancement of host resistance to selected infectious diseases. Infection and immunity 1980; 30: 51-57.
23.	Williams DL and Di Luzio NR Glucan-induced modification of murine viral hepatitis. Science (New York, N.Y.) 1980; 208: 67-69.
Slovar:
»Buffy coat« je komponenta krvi, pridobljena s centrifugiranjem enote polne krvi vsebuje pomemben delež levkocitov in trombocitov
3
O
2Í
LU g
"Z. <
z
N
Ž
_I
<
Z
en O
1
2
3
4
5
6
7
S
250
farm vestn 2015; 66