Oznaka obrazca: ARRS-CRP-ZP-2022/20 Status: Oddano -Digitalno podpisano Zaključno poročilo o rezultatih raziskovalnega projekta diagnostiki virusa RNA smo dobili boljše rezultate z združevanjem brisov ptic (5 ptic/bris), pri diagnostiki MS pa so se bolje izkazali združeni individualni brisi (5 brisov/vzorec). Uspešno smo RNA virusa IB dokazali tudi v vzorcih okolja. Za zelo uporabne so se pokazali brisi tal, saj smo z njimi v vseh šestih testiranih objektih ugotovili virusno RNA. Žal pa se v našem primeru vzorci okolja niso izkazali primerni za detekcijo MS, saj so bili vsi vzorci negativni, medtem ko smo MS dokazali v brisih orofarinksa v vseh 6 objektih. Namesto simulacije ugotavljanja različnih respiratornih virusov v rejah prašičev smo za preizkušanje testiranja izkoristili izbruh influence pri konjih v sezoni 2019/2020. V okviru projekta smo prvič potrdili virus influence pri konjih podtipa H3N8. Za namen detekcije IAV smo opravili deset tedenskih vzorčenj, vzorčili smo konje (nosni bris) in hlevske prostore. Za detekcijo IAV smo uporabili suhe brise iz umetnih vlaken. Virus smo pri vseh konjih potrdili še 6 dni po začetku okužbe, medtem ko smo bili brisi sten obeh hlevov v pozitivni še 48 oz. 62 dan po potrjeni okužbi. Namesto vpojnih prevlek, za katere so že dokazali, da so primerni za vzorčenje objektov za detekcijo IAV, smo uporabili cenovno ugodne in dostopne polietilenske prevleke za čevlje. Ugotovili smo, da v paru prevlek, ki ga namočimo v 50 ml pufra, ne zaznamo inhibitorjev, ki bi vplivali na obratni prepis in verižno reakcijo s polimerazo (RT-PCR) v realnem času. Takšna priprava vzorca je tudi enostavna in hitra. Ker smo uporabili zelo nizke koncentracije virusa IAV, je bila izolacija virusa neuspešna. Z metodo RT-PCR v realnem času smo pri vzorcu prevlek s koncentracijo ELD50 0,5 x 103,3 /ml virus zaznali s 66% uspešnostjo in pri koncentraciji virusa ELD50 0,5 x 102,3 /ml s 33% uspešnostjo. Prevleke za čevlje so se izkazale kot zelo dober način vzorčenja na perutninski farmi za detekcijo virusne RNA (IBV), saj smo v vseh 6-tih testiranih objektih z njimi dokazali najvišjo koncentracijo virusne RNA. Prevleke smo uporabili tudi za vzorčenje zunanjih površin obrežja reke Drave in pobrežja Koseškega bajerja, kjer je bila v sezoni 2020/2021 potrjena visoko patogena aviarna influenca. Na obrežju Drave nismo zaznali IAV; ne v brisih iztrebkov in površine, kot tudi ne v vzorcu prevlek, čeprav so bili vzorci odvzeti mestih, ki so bila vidno kontaminirana z iztrebki vodnih ptic. Na obrežju in bližnji okolici Koseškega bajerja smo vzorčenje izvajali tedensko en mesec. V vzorcih brisov in prevlek smo s PCR potrdili različne viruse IAV, nizko patogen in visoko patogen podtip H5, nevraminidazni podtip N1 in N5. Na osnovi rezultatov lahko zaključimo, da so za vzorčenje okolja primerne tako prevleke kot brisi, vendar moramo izbrati površine, ki so vidno kontaminirane z izločki ptic. V okviru raziskave smo testirali tudi možnost vzorčenja krme. V vzorcih krme nismo zaznali inhibitorjev, ki bi vplivali na molekularno detekcijo virusa ali izolacijo virusa na kokošjih embriih. Za detekcijo virusov smo uporabili tudi vzorčevalnik zraka, ki se v naši študiji ni izkazal za učinkovitega, ne pri detekciji IBV in MS na farmah kokoši nesnic, kot tudi ne IAV v hlevu s pozitivnimi konji. 2. Zaradi velikega pomena prašičev v ekologiji virusov influence menimo, da je potrebno ugotoviti, kateri tipi virusovkrožijo v Sloveniji ter pripraviti protokole vzorčenja za terenske veterinarje ter gradivo za osveščanje rejcev in druge laične javnosti, kako ravnati ob primeru pojava influence pri prašičih. V Sloveniji smo prvič potrdili in z določitvijo genoma determinirali virus prašičje influence podtipa H1N1. Cel genom smo določili štirim virusom iz treh od štirih pozitivnih rej. S primerjavo genomov smo ugotovili, da sta virusa iz dveh rej (reja 1 in reja 6) skoraj identična, medtem ko je virus iz reje 2 drugačen. Zaporedje nukleotidov gena za hemaglutinin ima med temi virusi le 88% podobnost. Kljub razlikam vsi sevi spadajo v skupino aviarnim sevom podobnih virusov prašičje influence, ki so v evropskih državah pogosto prisotni. Eden od glavnih ciljev je bila tudi priprava protokola za vzorčenje prašičev v primeru suma okužbe z IAV. Protokol smo pripravili po smernicah, ki ga priporočajo v priročnikih: Influenza A virus of swine (OIE Terrestrial Manual 2015), Collection of Specimens from Swine for the Detection of Influenza A Virus by Molecular Assays or Virus Isolation (OFFLU Swine Influenza Virus Technical Working Group). Naknadno smo ugotovili, da je poleg standardnega vzorčenja živali zelo uporaben tudi odvzem brisa površin. Brisi okolja so se izkazali kot zelo uporabni, saj z njimi lahko dlje časa spremljamo prisotnost virusne RNA v objektu, medtem ko prašiči izločajo virus le omejen čas. Prevalenco okužb z IAV smo ugotavljali z detekcijo protiteles proti IAV v serumih pitancev, ki so po odstotku pozitivnih živali, takoj za odraslimi plemenskimi svinjami. Pregledali smo 700 vzorcev serumov iz 140 rej, ki so bili odvzeti v okviru Odredbe o izvajanju sistematičnega spremljanja zdravstvenega stanja živali, programov izkoreninjenja bolezni živali ter cepljenj živali v letu 2018 in 2019 in so bili primarno odvzeti za dokaz protiteles proti virusu hepatitisa E. Uporabili smo dva različna ELISA testa proizvajalcev IDEXX in IDvet za detekcijo protiteles proti IAV pri različnih živalskih vrstah. Z ELISA IDEXX testom je bilo pozitivnih 33,86% vzorcev in z ELISA IDvet testom pa 36,57% vzorcev serumov. Z obema testoma skupaj je pozitivno reagiralo 30% vzorcev. Zaradi razlik v odstotku pozitivih vzorcev s posameznim ELISA testom, smo analizirali podatke še po rejah. Ugotovili smo, da je bilo 45% rej pozitivnih z obema testoma, 57% z IDEXX ELISA testom in 48% z ID Vet ELISA testom. Pri testiranju različnih kategorij prašičev je bil odstotek pozitivnih plemenskih svinj 52 do 40%, pitancev 43-33% in tekačev 12-8%, odvisno ali smo uporabi ELISA IDEXX ali IDvet test. Da bi ugotovili podtip virusa, proti kateremu imajo prašiči protitelesa, smo uporabili test inhibicije hemaglutinacije in kot antigene uporabili H1N1, H1N2 in H3N2. Pri 35% vzorcih, ki so bili pozitivni v ELISA testu, smo dobili pozitivno reakcijo z enim od testiranih antigenov. Najvišji odstotek pozitivnih reakcij je bil potrjen z antigenom podtipa H1N1 (78% pozitivnih vzorcev), 22% vzorcev je reagiralo s H3N2. Reakcij s podtipom H1N2 nismo ugotovili. 3. Pri pojavih HPAI v Sloveniji so bili najbolj prizadeti labodi grbci (Cygnus olor), kar je lahko posledica večje dovzetnosti populacije za okužbo IAV. Namen projekta je bil preveriti epidemiološko situacijo pri labodih grbcih na območjih SV Slovenije. Preučili smo tudi njihovo dinamiko gibanja in s tem pridobili podatke o kritičnih točkah možnih prenosov na teh območjih. V okviru projekta smo z analizo podatkov obročkanih labodov grbcev proučili dinamiko gibanja teh ptic v Sloveniji. Za ogled in urejanje prostorskih podatkov in oblikovanje zemljevidov smo v ArcGIS/ArcMap izdelali distribucijske karte najdb obročkanih labodov grbcev (Cygnus olor) za hitro vizualno oceno ogroženosti pri pojavljanju in izbruhih HPAI pri labodih v Evropi in Sloveniji. Med v Sloveniji obročkanimi labodi grbci smo obročke teh ptic v tujini odčitali 610 krat (261 različnih osebkov) in v domovini 749 krat (445 različnih osebkov). Najdbe v Sloveniji obročkanih labodov so po tujini razpršene na 10 evropskih držav. Največ različnih osebkov, 71,3%, je bilo odčitanih v Avstriji, Madžarski in Poljski. V teh državah, v obratnem vrstnem redu, je tudi največ odčitavanj. Najdbe v Sloveniji obročkanih labodov so vtujini razpršene na 10 evropskih držav. Distribucija najdb obročkanih ptic kaže na očiten vpliv Alpske bariere in odsotnost najdb iz vzhoda Panonije. Ker labod grbec južneje od Save ne gnezdi in ta reka v oblikuje rob evropskega areala prezimovanja vrste, je odsotnost najdb obročkanih ptic južneje od Slovenije pričakovana. Na lokaciji obročkanja smo labode v domovini odčitali 550 krat (303 osebkov) na lokacijah drugod po državi pa 199 krat (142 osebkov). Pozimi (dec-feb) je bilo opravljenih 63,4% vseh odčitavanj. Na temelju lokalnih najdb sklepamo, da sta oblikovana dva tipa pojavljanja: prvi nakazuje zvestobo lokaliteti obročkanja (2/3 grbcev) in drugi, ki govori o pojavljanju na lokalitetah vzdolž povodij ali med povodji rek (1/3 grbcev). Pri slednjem tipu odčitavanja obročkanih grbcev kažejo na komunikacijo pod Alpskim lokom vzhod-zahod oz. zahod-vzhod ter pričakovano na komunikacijo vzdolž povodja Save, Savinje i n Drave. Komunikacija med Muro, Spodnjo Savo in Obalo z drugimi povodji v Sloveniji ni ugotovljena ali je zelo šibka. Na osnovi 338 odčitavanj v obdobju 1972-2018 je bilo v Sloveniji identificiranih 163 različnih osebkov iz tujine. Obročkani so bili v 9 evropskih državah. Kar 75,4% vseh ptic izvira iz Hrvaške, Madžarske in Poljske. Najpomembnejši lokaliteti tujih najdb sta Maribor (23%) in Ptuj (18,5%). Območja iz katerih izvirajo najdbe v tujini obročkanih labodov najdenih v Sloveniji (ptice obročkane v topli polovici leta v času gnezditve in golitve) se geografsko prekrivajo z rezultati najdb v Sloveniji obročkanih osebkov. Za proučevanje prevalence IAV pri labodih z virološkimi in serološkimi metodami smo vzorčili 95 labodov grbcev, 6 jih je bilo vzorčenih dvakrat, tako da smo skupaj odvzeli 101 vzorec brisov in krvi. V brisih kloake smo IAV potrdili v 2% preiskanih vzorcev, odstotek pozitivnih ptic je primerljiv s podatki iz drugih držav. Zaradi nizke koncentracije virusa, podtipa IAV nismo uspeli določiti. Protitelesa proti virusu influence tipa A smo z ELISA testom proizvajalca IDEXX potrdili v 47% in z ELISA testom proizvajalca IDvet v 62% vzorcev serumov labodov grbcev. Oba ELISA testa sta namenjena detekciji protiteles proti tip A influence pri različnih živalskih vrstah. S specifičnim ELISA testom za detekcijo protiteles proti IAV podtipa H5 smo protitelesa ugotovili v 56% vzorcev. Z uporabo testa inhibicije hemaglutinacije smo serume testirali na 16 različnih hemaglutininskih podtipov IAV, za detekcijo protiteles proti podtipu H5 smo uporabi dva visoko patogena seva H5N8 in H5N1 ter en nizko patogeni sev H5N3. Največ vzorcev je pozitivno reagiralo na podtip H6N1 (40%), H13N6 (32%), H5N3 (29%), H5N8 (29%), H5N1 (28%), H9N9 (20%), H8N4 (12%) in H16N3 (11%). Pri odraslih labodih je v HIT testu z dvema ali več podtipi reagiralo 52% testiranih vzorcev in 22% serumov odvzetih mladim labodom, ti serumi so reagirali največ z dvema različnima podtipoma IAV. Skupno je na dva ali več podtipov IAV pozitivno reagiralo 48% vzorcev. 5. Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev V okviru projekta smo uspešno realizirali pričakovane rezultate: R1. S primerjavo uporabe različnih brisov smo ugotovili, da so suhi brisi alternativa brisom z dodanim medijem. S suhimi brisi smo uspešno zaznali viruse IAV. R2. Prevleke za čevlje so primerne za vzorčenje in diagnostiko različnih virusov, tako na farmah kot v zunanjem okolju. V laboratoriju smo pripravili enostaven in hiter protokol za odvzem vzorca in za pripravo vzorca v laboratoriju. R3. V okviru raziskave smo testirali tudi možnost vzorčenja krme, pri kateri nismo zaznali inhibitorjev, ki bi vplivali na molekularno detekcijo virusa ali izolacijo virusa na kokošjih embriih. Vendar bi bilo potrebno opraviti dodatna testiranja, da bi ugotovili primerno količino vzorca, pri kateri bi z gotovostjo izključili odsotnost virusa. Za detekcijo virusov smo uporabili tudi vzorčevalnik zraka Coriolis (Bertin Instruments), ki se v naši študiji ni izkazal za učinkovitega, kar pa ne pomeni, da takšen način vzorčenja ni primeren z uporabo drugega tipa sorodnega aparata. R4. Pridobili smo podatke o prevalenci in podtipih virusov influence pri prašičih, ki so prisotni v Sloveniji. Prvič smo tudi dokazali in določili virus influence pri prašičih. R5. Pripravili smo protokol za odvzem vzorcev prašičem na terenu ter standardne operativne postopke za serološko in molekularno ugotavljanje IAV pri prašičih. Protokoli služijo za redno diagnostiko influence pri prašičih kot tudi za diferencialno diagnostiko v primeru okužbe z aviarnimi sevi IAV na mešanih gospodarstvih. R6. Z molekularnimi metodami smo ugotovili 2% prevalenco IAV pri labodih grbcih, primerljiva s stanjem v drugih državah. Odstotek serološko pozitivnih ptic je v primerjavi z virološko prevalenco veliko višji, vključno s protitelesi proti podtipu H5, in se med sezonami vzorčenja razlikuje . Za boljše razumevanje dinamike virusa bi bilo potrebno, predvsem na območjih z večjim številom labodov med prezimovanjem, uvesti več letni serološki monitoring, zlasti pri pticah, ki zahajajo v urbana okolja in imajo v stike z ljudmi. R7. Z analizo najdb obročkanih labodov grbcev, kot enega ključnih aktivnih in pasivnih vektorjev AI v naravi, smo prvič pridobili izjemno pomembne informacije na osnovi katerih lahko izdelamo oceno tveganja za morebitno širjenje HPAI v Sloveniji. 6. Spremembe programa dela raziskovalnega projekta oziroma spremembe sestave projektne skupine V delovnem sklopu 2: »Ugotoviti in implementirati najbolj ustrezen način vzorčenja v terenske pogoje s simulacijo za detekcijo drugih patogenih ali cepnih virusov sevov, ki jih detektiramo v rejah piščancev in prašičev«, smo namesto simulacije na prašičji farmi izkoristili izbruh IAV pri konjih v hlevih Veterinarske fakultete. V hlevih in pri konjih smo opravili večkratno testiranje, ki je potekalo v tedenskih razmikih 68 dni. V Sloveniji smo prvič potrdili virus influence konj in vpeljali diagnostiko za klinične vzorce. Pridobili smo veliko informacij o detekciji virusa v okolju, saj takšen način vzorčenja v rejah konj še ni opisan in je zelo dobra alternativa za dokaz povzročitelja veliko dlje, kot pa s klasičnim načinom odvzema vzorcev -nosnih brisov konj. V okviru 30-mesečnega projekta smo enkrat zaprosili za vključitev novih sodelavcev (en sodelavec iz partnerske ustanove Prirodoslovni muzej Slovenije in ena tehnična sodelavka iz Veterinarske fakultete) ter enkrat za izključitev sodelavca iz Veterinarske fakultete zaradi prenehanje delovnega razmerja. 7. Najpomembnejši dosežki projektne skupine na raziskovalnem področju 8. Najpomembnejši dosežek projektne skupine na področju gospodarstva, družbenih in kulturnih dejavnost 9. Drugi pomembni rezultati projektne skupine V okviru projekta smo pripravili standardne postopke za molekularno diagnostiko influence pri prašičih in konjih ter za določanje različnih hemaglutininskih (H1-H16) in nevraminidaznih podtipov (N1-N9). Vpeljali in optimizirali smo različne metode vzorčenja za detekcijo respiratornih patogenov s poudarkom na virusih influence pri živalih -perutnini, prašičih in konjih, hkrati pa tudi v različnih vzorcih iz njihovega okolja. Pridobljena znanja omogočajo skrajšanje časa odvzema kot tudi priprave vzorcev za diagnostiko, s čemer smo optimizirali celoten diagnostični postopek. V okviru projekta smo pripravili tudi protokol za tovrstna vzorčenja namenjena veterinarskim delavcem za potrebe diagnostike virusov influence pri prašičih. 10. Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine 10.1. Pomen za razvoj znanosti Virusi influence tipa A (IAV) so zaradi svoje sposobnosti okužb živali in ljudi ter povzročanja pandemij temeljito proučevani, še vedno pa o njih ne vemo vsega. S svojim spreminjanjem, nastajanjem novih kombinacij ter nepričakovanem pojavljanjem in možnostjo okužbe različnih gostiteljev nas IAV vedno znova presenečajo. Pridobivanje novih podatkov o ekologiji virusa v različnih okoljih in pri različnih gostiteljskih vrstah so izjemnega pomena. V okviru projekta smo v Sloveniji prvič potrdili virus prašičje influence in virus influence konj. Z metodo odvzema brisov površin, kjer se zadržujejo živali, smo potrdili, da lahko IAV v brisih površine sten, opreme in tal zaznamo še več tednov po tem, ko se virusi pri živalih ne izločajo več. Kot zelo uporabne za vzorčenje tal v zaprtih prostorih in tudi v zunanjem okolju so se izkazale tudi polietilenske prevleke za čevlje. Takšen način vzorčenja je hiter, neinvaziven za živali in je uporaben tako za epidemiološke študije kot tudi za potrditve suma bolezni. Epidemiološki podatki o prekuženosti prašičev z IAV v Evropi so v primerjavi s podatki pri perutnini in pticah sila skopi; opravljene so bile sicer posamezne študije, ki kažejo, da v nekateri evropskih državah krožijo 3 različni podtipi virusov: H1N1 aviarnega izvora in H3N2 ter H1N2 humanega izvora. Z obsežno analizo vzorcev prašičev smo ugotovili, da je 34% do 37% vzorcev pitancev serološko pozitivnih na IAV. Prevladuje podtip H1N1, ki spada v skupino aviarnim sevom podobnih virusov prašičje influence. Virusni genom smo uspeli določiti direktno iz kliničnih vzorcev in tako dopolnili informacije tudi iz našega območja. Pridobljene informacije in izkušnje bomo koristno vključili tudi v nov COST projekt, v katerem smo sodelujoči partner. Z obsežno analizo podatkov o obročkanih labodih grbcih med leti 1972 in 2018, smo pridobili pomembne informacije o migracijah labodov v Sloveniji kot tudi izven naših meja, kar nam omogoča razumeti možne poti širjenja virusa. Čeprav je narejenih veliko študij o prevalenci IAV pri prostoživečih pticah, smo v okviru našega projekta opravili eno najbolj natančnih analiz serumov labodov grbcev z uporabo 16 hemaglutniniskih podtipov IAV v Evropi. Pridobili smo izjemno zanimive podatke za širšo strokovno javnost kot tudi izkušnje v diagnostiki IAV, ki omogočajo učinkovitejši nadzor. Influenza A viruses (IAVs) are the subject of intense research because of their ability to infect animals and humans and because they can cause major pandemics, but we still do not know everything about them. With their variability, formation of new combinations and unintentional emergence along with their ability to infect different hosts, IAVs continue to surprise us. Gaining new information about the ecology of the virus in different environments and in different host species remains of paramount importance. In this project, we confirmed and characterised swine and equine influenza viruses for the first time in Slovenia. For virus detection, we introduced a new method that involves sampling the environment where animals are kept -swabs from the surface of walls, equipment, and floors. Using this sampling method, we were able to detect avian influenza viruses for several weeks after the viruses were no longer excreted by the animals. Polyethylene boot swabs have proven to be very suitable for floor/soil sampling both indoors and outdoors. Such a sampling method is rapid, non-invasive to the animals, and useful for epidemiological studies as well as for confirming suspected disease. Compared to birds and poultry, epidemiological data on IAV infections in pigs are rare and less comprehensive. The results of some individual studies suggest that 3 different subtypes of viruses circulate in some European countries: H1N1 of avian origin and H3N2 and H1N2 of human origin. In the extensive study of fattening pigs, we confirmed that 34% to 37% of the samples were serologically positive for IAV. We were able to identify the viral genome directly from clinical samples. The results showed that the H1N1 subtype, which belongs to the group of avian strain-like viruses of swine influenza, is predominant in Slovenia. The information and experience gained in this project will also be useful for the new project COST, in which we are a partner. Through comprehensive analysis of data on ringed mute swans from 1972 to 2018, we have obtained important information on the migrations of this bird species in Slovenia as well as beyond borders, which allows us to better understand the possible pathways of introduction and spread of the virus in Slovenia. Although many studies have been conducted on the prevalence of IAV in free-living birds, our project carried out one of the most detailed serological analyses of samples collected from mute swans, using 16 different IAV hemagglutinin subtypes. The project has provided us with extremely valuable data of interest to the professional community and the public, as well as invaluable experience important for IAV diagnostics. ANG Intensive poultry production in Slovenia is one of the most important agricultural sectors, which is why effective protection of this sector against the outbreak of infectious diseases is of great importance. Due to its characteristics, intensive farming requires a special approach to animal health maintenance and disease prevention. In poultry sector, large numbers of animals in a relatively small space predominate, which allows the spread of various diseases in a very short time. The situation is similar in intensive pig production, although to a lesser extent. Over the past decade, outbreaks of highly pathogenic avian influenza (HPAI) infections have become more frequent, and the situation is very serious all over the world. The fact is that HPAI is no longer a seasonal disease, but it occurs throughout the year. HPAI is among the diseases that cause high mortality in poultry and other birds’ species. The infection spreads rapidly, and the most serious control measures such as mass depopulation of infected flocks are applied. Unfortunately, prophylactic vaccination is currently not allowed and used in Europe. These cause great losses, with important negative impact on animal welfare, and consequently an important economic problem. Moreover, infections with IAV in other animal species are also of concern, as is the possibility of transmission to humans. Due to all these facts, it is extremely important to fasten and optimise diagnostic procedures which is of great importance in the cases of mass outbreaks to efficiently limit the spread of the dis-ease. The basis for successful planning of control measures is knowledge of the ecology o f the virus. Within the project we investigated the ecology of avian influenza viruses in wild mute swans in the northeast area of Slovenia. This is an area where intensive poultry farming is highly developed and the poultry population is extremely large; moreover, the population of wild waterfowl is the largest in this region, which is one of the most important factors for disease introduction. With an epidemiological study of the circulation of IAV in the population of mute swans, which are one of the most common bird species infected with IAV in Slovenia, and by studying their movements, we have obtained data on the critical points of possible transmission in Slovenia. The analysis of the obtained data will help the competent veterinary authorities and veterinary professions, as well as the poultry industry, to plan and implement effective IAV preventive measures in poultry. We optimised and examined the usefulness of different sampling methods for the detection of respiratory pathogens with emphasis on influenza viruses in animals (poultry, pigs and horses), and in different matrices from their environment. The acquired knowledge allows to shorten the sampling time as well as the preparation time of samples needed for diagnostics, which allowed to optimise the whole diagnostic procedure. As part of the project, we also developed a protocol for this type of sampling for veterinarians to diagnose influenza viruses in pigs. This represents a significant progress for the veterinary profession and at the same time helps breeders to improve their production results and thus increase the competitiveness and profitability of farming. 11. Vpetost raziskovalnih rezultatov projektne skupine 11.1. Vpetost raziskave v domače okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? v domačih znanstvenih krogih pri domačih uporabnikih Kdo (poleg sofinancerjev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih? 11.2. Vpetost raziskave v tuje okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? v mednarodnih znanstvenih krogih pri mednarodnih uporabnikih Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujimi raziskovalnimi inštitucijami: Kateri so rezultati tovrstnega sodelovanja: 12. Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov Delno F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.06 Razvoj novega izdelka DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj DA NE Cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.11 Razvoj nove storitve DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.12 Izboljšanje obstoječe storitve DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz DA Cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev DA Cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete DA NE Zastavljen cilj Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.30 Strokovna ocena stanja DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.34 Svetovalna dejavnost DA 13. Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv G.01. Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja G.02. Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.02. Širitev obstoječih trgov Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.05. Razširitev področja dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.07. Večji delež izvoza G.02.08. Povečanje dobička Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.09. Nova delovna mesta Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.11. Nov investicijski zagon Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03. Tehnološki razvoj Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03.03. Uvajanje novih tehnologij Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04. Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti G.04.05. Razvoj civilne družbe Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Podpisa: Zastopnik oz. pooblaščena oseba Breda Jakovac Strajn Digitalno podpisano in Vodja programa/projekta Brigita Slavec Digitalno podpisano ŽIG Datum: 10. 08. 2022 Oznaka obrazca: 3h6l-djbo-qxsi-l828-leed-epnw-q INFLUENCA PRI PRAŠIČIH IN NAVODILA ZA ODVZEM VZORCEV ZA DOKAZ VIRUSA INFLUENCE TIPA A asist. dr. Irena Golinar Oven, UL, Veterinarska fakulteta, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana, Irena.GolinarOven@vf.uni-lj.si, izr. prof. dr. Marina Štukelj, UL, Veterinarska fakulteta, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana, marina.stukelj@vf.uni-lj.si, doc. dr. Brigita Slavec, UL, Veterinarska fakulteta, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana, Brigita.Slavec@vf.uni-lj.si Uvod Prašičja influenca (PI) je kužno virusno obolenje, ki ga povzročajo virusi influence tipa A, ki sodijo v družino Orthomyxoviridae (1). PI se je pri prašičih prvič pojavila leta 1918 v ZDA in je sovpadala s pandemijo influence pri ljudeh, ko je po svetu umrlo 20-50 milijonov ljudi. Zaradi kliničnih podobnosti z gripo pri ljudeh so bolezen pri prašičih poimenovali gripa (2). O prašičji influenci govorimo, kadar opazimo več kliničnih primerov bolezni pri prašičih, ki imajo povišano telesno temperaturo, zmanjšan apetit, kašelj ali kihanje, oteženo dihanje, izcedek iz nosu in oči ter so se klinični znaki razvili v enem tednu in prizadeli vsaj 10 % živali v enoti (3). Obstaja kar nekaj povzročiteljev respiratornih bolezni pri prašičih, ki povzročajo podobna klinična znamenja kot so pri PI, poleg tega pa so respiratorna obolenja v velikih čredah prašičev zelo pogosta. Poudariti je treba, da okužba z pandemičnim virusom H1N1/ 2009 (pH1N1/2009) pri prašičih ne povzroči vedno značilnih kliničnih znamenj, čeprav se okuži imunološko naivna čreda prašičev (3). PI se pojavlja na vseh kontinentih, pogosta je v Evropi, Severni in Južni Ameriki, nekaterih delih Azije; o njej so poročali tudi v Afriki (3). Poleg ekonomskega pomena, ki ga ima pri prašičih, okužbe z virusom PI predstavljajo pomembno potencialno grožnjo javnemu zdravstvu. O zoonotičnih okužbah z virusi PI so poročali povsod po svetu, vključno s klasičnimi prašičjimi H1N1 virusi, kot tudi z aviarnimi linijami virusov in z virusi, ki so nastali s prerazporejanjem genskih segmentov med različnimi podtipi in genotipi (4, 5). Podatki o prenosu virusov prašičje influence s človeka na človeka so redki; za razliko od pandemije leta 2009-2010, ki jo je povzročil p H1N1/2009 (6). Prašiči naj bi imeli pomembno vlogo kot vmesni gostitelji pri prerazporejanju genskih segmentov in/ali adaptaciji virusov influence A, ki bi lahko imeli pandemični potencial za ljudi (6). V zadnjih dveh desetletjih je bilo prerazporejanje genskih segmentov med humanimi, aviarnimi, in/ali prašičjimi virusi pri prašičih pogosto evidentirano, ni pa dokazano, da je do prerazporejanja prišlo ravno pri prašičih. Nazadnje je nastal leta 2009 pH1N1 kot rezultat prerazporejanja med virusi prašičje influence, ki zajemajo severnoameriške in evroazijske linije (7). Gostitelj Virusi influence tipa A se najpogosteje pojavljajo pri pticah, ljudeh, prašičih, konjih, psih in vodnih sesalcih (3, 6). Virusi PI lahko poleg domačih prašičev in ljudi, okužijo tudi divje prašiče in v redkih primerih tudi vodno perutnino in purane (6, 8). Med prašiči krožijo predvsem podtipi virusov H1N1, H1N2 in H3N2, ki pa se antigensko in genetsko razlikujejo med posameznimi kontinenti in geografskimi regijami (2, 9). Prašiči se lahko naravno in eksperimentalno okužijo z različnimi podtipi virusov aviarne influence. Iz prašičev v Kanadi in Aziji so npr. izolirali aviarne podtipe H1N1, H3N2, H3N3 in H4N6, iz prašičev v Aziji pa H5N1 in H9N2, vendar se ti virusi ne zadržujejo v prašičji populaciji oz. so zelo omejeni pri njihovem razmnoževanju v prašičih in širjenju med prašiči. Da bi se virus adaptiral na prašiče oz. širil znotraj populacije prašičev, morajo virusi aviarne influence načeloma mutirati oz. mora priti do prerazporejanja genskih segmentov med aviarnimi in prašičjimi geni (6); izjemo predstavlja evropski aviarni prašičji H1N1, kjer se je celoten aviarni virus adaptiral na prašiče (10). Tudi viruse humane influence so občasno izolirali iz prašičev, zlasti humani virus H3N2 je bil pogosto ugotovljen pri prašičih v Aziji in občasno v Evropi in Severni Ameriki. Virusi H3N2, ki so se obdržali pri prašičih v Severni Ameriki in Evropi so nastali s prerazporejanjem tako humanih kot prašičjih genov (6). Prenos PI se v rejo zanese s premiki živali, npr. z nakupom živali ali z živalmi, ki so se vrnile s sejma (11). Najpogosteje se virus prenaša z neposrednim stikom med okuženo in dovzetno živaljo ali kapljično. Pri prašičih je najpogostejša nazofaringealna pot okužbe, najverjetneje preko nosnega kontakta. Virus se lahko začne izločati z nosnim izcedkom že v 24 urah po okužbi, običajno pa ga v nosnem izcedku ne zaznamo več 7 do 10 dni po okužbi (1). Klinična slika Akutni izbruhi s kliničnimi znamenji PI so večinoma omejeni na dovzetne, serološko negativne prašiče npr. odstavljeni pujski brez maternalnih protiteles ali pitanci (6). Pri akutni obliki se po kratki inkubaciji (1-3 dni), pojavijo naslednja klinična znamenja: neješčnost, ležanje, gručenje, povišana telesna temperatura od 40,5°C do 41,7°C. Če so živali prisiljene v gibanje, se lahko pojavi abdominalno dihanje z odprtimi usti in napadi kašlja. Opazimo lahko vnetje očesnih veznic, nosni izcedek in kihanje. Obolevnost je skoraj 100 %, smrtnost pa običajno ni višja od 1 %. Živali si večinoma opomorejo v 5 do 7 dneh po pojavu kliničnih znamenj, v kolikor ne pride do okužb s sekundarnimi povzročitelji (3, 6). Manj pogosta posredna posledica okužbe z virusom PI so lahko tudi abortusi pri svinjah (6). V večini čred prašičev okužba z virusi influence A postane endemična in klinična slika se sčasoma spremeni, postane manj očitna ali celo poteka subklinično (3). Ekonomske izgube zaradi okužbe z virusom PI so posledica predvsem slabših prirastov, daljšega pitanja živali in dovzetnosti živali za sekundarne bakterijske okužbe (6). Diferencialne diagnoze Virus PI je le eden od povzročiteljev, ki povzroča respiratorna obolenja pri prašičih; pogosto sinergistično sodeluje z drugimi bakterijami in virusi pri nastanku prašičjega respiratornega bolezenskega kompleksa (PRDC). Dejstvo je, da sekundarne okužbe z bakterijami kot so Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis in Streptococcus suis tip 2, povečajo resnost in potek okužbe z virusom PI. Ostali respiratorni virusi, kot sta prašičji respiratorni koronavirus (PRCV) in virus prašičjega reprodukcijskega in respiratornega sindroma (PRRSV) pogosto okužita prašiče v enaki starosti kot virus PI. Med temi patogenimi povzročitelji, so PRRSV, M. hyopneumoniae in virus PI največkrat dokazani pri 10 do 22 tednov starih prašičih (1, 6). Terapija Specifičnega zdravljenja ni. Akutno obliko PI zdravimo z antibiotiki, da preprečimo sekundarne bakterijske okužbe in z antipiretiki, da skrajšamo obdobje neješčnosti in izgube teže. Zagotoviti moramo zadostno količino pitne vode in udobno okolje, s čim manj stresa (1, 12). Odpornost virusa v okolju Preživetje virusa v okolju je odvisno od temperature, pH, slanosti in prisotnosti organskega materiala. Kljub temu, da imajo virusi influence ovojnico, lahko preživijo dalj časa v okolju, predvsem pri nižjih temperaturah. Virusi influence pri sesalcih so relativno labilni, lahko pa preživijo nekaj ur v posušeni sluzi. Inaktiviramo jih lahko s segrevanjem pri 56° C najmanj 1 uro (ali pri višji temperaturi krajši čas), z ionizirajočo radiacijo ali nizkim pH (pH 2). Virusi influence so občutljivi na različna razkužila: natrijev hipoklorit, 70 % etanol, oksidacijska sredstva, kvarterne amonijeve spojine, aldehidi (formalin, glutaraldehid, formaldehid), fenoli, kisline, povidon-jod in lipidna topila (1). Preventiva Najpomembnejši biovarnostni ukrepi, ki se uporabljajo pri preprečevanju in širjenju okužb z virusom PI so: karantena živali, ki na novo pridejo v rejo, omejitev obiska na farmi, preoblačenje in preobuvanje pred vstopom v hlev, sistem reje »vse noter-vse ven«, čiščenje in razkuževanje prostorov in orodja, ki se uporablja v reji, zmanjševanje prenaseljenosti hlevov, zmanjševanje količine prahu v reji (13), minimalno premikanje in mešanje živali, preprečevanje stikov z ostalimi vrstami živali, zlasti s perutnino in preprečevanje stikov z ljudmi, obolelimi za influenco. Ponekod v Evropi in ZDA uporabljajo preventivno intramuskularno vakcinacijo s komercialno inaktivirano vakcino. Večina vakcin vsebuje celoten virus. Primarno se živali vakcinirajo dvakrat z dva-do štiritedenskim razmakom. Za svinje so priporočljive poživitvene doze cepiva dvakrat letno. Z vakcinacijo svinj podaljšamo maternalno imunost pri pujskih (6). Vakcinacija pitancev se redkeje izvaja, jo pa priporočajo v tistih čredah, kjer PI predstavlja problem pri pitancih. V tem primeru je bolje, da se ne vakcinira svinj, da pasivna protitelesa ne motijo razvoj aktivne imunosti (14). Laboratorijska diagnostika Virus PI lahko dokažemo z izolacijo na celičnih kulturah ali na embrioniranih kokošjih jajcih, vedno bolj pa se uporablja molekularna diagnostika s katero ugotavljamo virusno RNK v vzorcu. Za dokazovanje virusa se lahko uporablja obratni prepis in konvencionalna verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) ali verižna reakcija s polimerazo v realnem času (RT-qPCR). Kot vzorec se najbolj pogosto uporablja nosni bris, lahko pa virus potrdimo tudi v ustni tekočini in bronhio-alveolarnem izpirku (1, 6). Posredno lahko okužbo ugotavljamo z dokazovanjem protiteles proti virusu influence. Običajno za dokaz protiteles uporabljamo serum. Protitelesa se v serumu lahko pojavijo že 7-10 dni po okužbi in so prisotna vsaj 6 – 8 tednov (15). Za potrditev okužbe se priporoča odvzem parnega seruma v razmaku 14 do 21 dni (1). Serološko testiranje pri PI nima velikega pomena, kadar je PI prisotna endemično in kjer prašiče vakcinirajo (9). V prilogah so podana Navodila za odvzem vzorcev (priloga1) in Obrazec spremnega dopisa (priloga 2). Stanje v Sloveniji V letih od 2001 do 2003 smo na Veterinarski fakulteti, Kliniki za prežvekovalce in prašiče, na protitelesa proti virusu PI podtipa H1N1 in H3N2 preiskali 1005 serumov plemenskih svinj in 1004 serume pitancev iz osmih velikih farm. Pri plemenskih svinjah je bila seroprevalenca proti podtipu H1N1 povprečno 37 %, proti podtipu H3N2 pa 36 %. Pri pitancih je bila seroprevalenca proti podtipu H1N1 20 %, proti podtipu H3N2 pa 26 %. V letu 2006 smo preiskali 304 serume plemenskih svinj iz šestih velikih farm in 350 serumov pitancev iz sedmih velikih farm na protitelesa proti podtipu H1N1. Pri plemenskih svinjah je bila seroprevalenca 49,6 %, pri pitancih pa 47 % (8). Epidemiološka slika okužb prašičev z virusi influence A je v zadnjem desetletju praktično nepoznana. Zaradi velikega pomena prašičev v ekologiji virusov influence je eden od ciljev raziskovalnega projekta z naslovom: Detekcija virusov influence tipa A v okoljskih vzorcih, krmi in nastilju ter priprava algoritma za diagnostiko influence pri prašičih ugotoviti, kateri virusi influence krožijo v populaciji prašičev v Sloveniji, kje in koliko časa se virusi na farmi zadržujejo in pripraviti protokole vzorčenja. V letu 2019 smo preliminarno preiskali 60 krvnih vzorcev plemenskih svinj, 60 krvnih vzorcev pitancev in 60 krvnih vzorcev devet tedenskih tekačev iz šestih konvencionalnih farm na protitelesa proti virusom influence A s testom ELISA za dokazovanje protiteles proti aviarni influenci pri več živalskih vrstah. Pri plemenskih svinjah je bila seroprevalenca 53,3 %, pri pitancih 43,3 % in pri tekačih 11,6 %. PRILOGA 1 1. Navodila za odvzem vzorcev za dokaz virusa PI Če želimo dokazati virus moramo vzorce odvzeti pri živalih, ki kažejo klinična znamenja bolezni (najboljše 24 do 48 ur po pojavu kliničnih znamenj) ali so jih pred kratkim. Na okuženem gospodarstvu vzorčimo do 20 bolnih živali, če je klinično prizadetih manj živali vzorčimo vse bolne živali (1, 3). 1.1. Odvzem nosnega brisa Nosnih brisov od posameznih prašičev ne združujemo -v eno epruveto damo le en bris. Za jemanje nosnih brisov priporočamo uporabo sterilnih najlonskih ali poliestrskih (Dacron), lahko tudi bombažnih brisov. Držalo brisa naj bo dolgo vsaj 15 cm in plastično, če se da zelo upogljivo, da se ne zlomi zlahka. Priporočljiva je uporaba komercialnih brisov, ki imajo priloženo epruveto s transportnim medijem za viruse. Lahko se odvzame tudi suhe brise (16). 1. Prašiča pri jemanju nosnih brisov fiksiramo z zanko, tako da je glava nekoliko dvignjena, kar omogoči lažji dostop do nosnih votlin. Anestezija ni potrebna. Nosnice morajo biti čiste, brez umazanije, blata ali delčkov krme (16). 2. Vstavimo sterilen bris v nosno votlino v dorzalno-medialni smeri (slika 1). Nežno s krožnimi gibi podrsamo po površini nosne sluznice, da zaobjamemo čim več nosne površine sluznice. To počnemo približno 5 sekund (oz. vsaj 5x bris za rotiramo), zato da se absorbira sluz in s tem pridobimo nosni izcedek in površinski epitelij. Povprečna globina pri kateri vzamemo optimalni nosni bris: -1 cm pri pujskih starih 0 do 4 tedne, -2 cm pri odstavljencih starih 4 -7 tednov, -3 -4 cm pri pitancih starih več kot 7 tednov. Takšna globina je primerna kadar jemljemo vzorce pri bolnih prašičih z respiratornimi znamenji; če želimo virus izolirati pri prašičih brez kliničnih znamenj, je potrebno bris vzeti dvakrat globlje. Pri jemanju brisa ne smemo biti pregrobi, saj kri na brisu ni zaželena. Ko izvlečemo bris iz nosne votline, pazimo da se z brisom ne dotaknemo kože in drugih površin (16). 3. Z istim brisom ponovimo postopek še v drugi nosnici (16). Slika 1: Fiksacija in odvzem nosnega brisa (Foto: Irena Golinar Oven) 4. Ko vzamemo nosni bris, ga damo v plastično epruveto s tekočim transportnim medijem (virusni transportni medij ali fosfatni pufer z NaCl (PBS)). Lahko uporabimo tudi suhe brise. Če se uporablja transportni medij, ga mora biti toliko, da prekrije glavo brisa. V kolikor je ročaj brisa predolg, izvlečemo bris nekoliko iz epruvete in upognemo držalo brisa naprej in nazaj čez rob epruvete, dokler se ne prelomi oziroma držalo odrežemo, vendar moramo paziti, da se izognemo kontaminaciji vzorca z neprimerno razkuženim orodjem (16). 5. Epruveta mora biti tesno zaprta, da se vsebina ne razlije, in označena tako, da je zagotovljena sledljivost. Zelo je pomembno, da je vzorec med transportom ves čas na hladnem (cca 4° C, v hladilni torbi). Izogibati se je treba zamrzovanju-odmrzovanju preden vzorec prispe v laboratorij (16). 6. Ohlajen vzorec je potrebno poslati v laboratorij znotraj 48 ur (6). 1.1.1. Velikost vzorca za dokaz virusa PI pri odvzemu nosnih brisov a) Priporočeno je, da se na farmah z več kot dvajsetimi prašiči, kjer se pojavljajo klinična znamenja, odvzame vzorce 20. živalim z izraženimi kliničnimi znaki. Če je število prašičev v enoti manjše od 20, vzamemo vzorce vsem živalim. b) Pri nedavno okuženih farmah, število vzorcev lahko določimo s pomočjo tabele 1 pri 5 % prevalenci in 95 % meji zaupanja (3). a) 5 % prevalenca, 95 % meja zaupanja Tabela 1. Velikost vzorca za različno velike skupine, glede na % prevalence in meje zaupanja (3) Velikost skupina . 2000 1000 500 400 300 200 100 50 25 Velikost vzorca 59 56 53 52 50 46 38 28 18 1.2. Odvzem ustne tekočine Ustna tekočina običajno predstavlja skupinski vzorec živali v boksu in je primerna za ugotavljanje prisotnosti virusa v čredi, v njej lahko ugotavljamo tudi protitelesa proti virusu PI. -Za jemanje ustne tekočine potrebujemo bombažno nebeljeno vrv, premera najmanj 1,27 cm oz. 1 cm za tekače in 2 cm za pitance. -Ena vrv zadostuje za 10 -15 živali. -Konec vrvi obesimo v višini plečke prašiča za približno 20 -30 minut; če prašiči niso aktivni, lahko visi tudi 1 uro. Vrvi ne obešamo v bližini napajalnika, ker lahko voda razredči vzorec. Prav tako ne nad krmilniki, saj s tem zmanjšamo interes prašičev za žvečenje vrvi. Pri mokrem krmljenju je priporočljivo vzorce vzeti pred krmljenjem ali vsaj 2 uri po krmljenju, sicer bodo prašiči neaktivni. Za spodbujanje žvečenja se lahko uporabljajo tudi atraktanti, npr. 5 % sterilna raztopina glukoze. -Ustno tekočino dobimo s stiskanjem vrvi v plastični vrečki. Na tržišču se dobijo vrečke z vijalko, kamor steče ustna tekočina, drugače pa s škarjami odrežemo rob vrečke, še prej pa podstavimo vijalko. Vijalko označimo, napišemo spremni dopis in pri 4° C pošljemo v laboratorij (17,18). 2. Odvzem vzorcev za dokaz protiteles proti virusu PI 2.1. Odvzem seruma Kri vzamemo iz v. cavae cranialis ali v. jugularis, pri čemer potrebujemo epruvete za serum. 1. fiksacija: -do 40 kg lahko uporabimo korito ali desko; žival položimo na hrbet, potrebujemo pomočnike za fiksacijo glave in nog. -nad 40 kg uporabimo zanko, vrat mora biti stegnjen navzgor. 2. odvzem iz v. cave cranialis (slika 2) -dolžina igle: 1cm/10 kg; do 50 kg 5 cm, nad 50 kg 10 cm, nad 100 kg 14 do 20 cm. -vbodno mesto: fossa jugularis (2-3 cm pred manubrium sterni lateralno; pri majhnih pujskih 1 cm kranialno in lateralno od kranialnega roba prsnice), desna stran. -smer: kavdomediodorzalno -proti vihru (19). Slika 2: Odvzem krvi iz v. cavae cranialis (Foto: Marina Štukelj) 3. odvzem iz v. jugularis -igla je usmerjena kavdodorzalno, pravokotno na kožo. -mesto jemanja krvi: najglobja točka jugularnega žleba med medialnimi sternocephalnimi in lateralnimi brachiocephalnimi mišicami. -možno jemanje krvi pri vseh kategorijah (19). 4. Vsako epruveto s krvjo ustrezno označimo in priložimo spremni dopis. Kri pustimo koagulirati na sobni temperaturi. Koagulacija in retrakcija koaguluma nastane po 2 -4 urah. Koagulirane vzorce hranimo pri 2 -8 . C in jih pošljemo v laboratorij znotraj 72. ur. Če to ni mogoče, potem je potrebno serume odliti in vzorce zamrznit. Zamrznjeni vzorci serumov lahko pridejo v laboratorij v nekaj mesecih. Minimalna količina seruma je 0,5 ml. 2.1. Velikost vzorca krvi za dokaz protiteles proti virusu PI Glede na to, da smo pri prašičji influenci v Sloveniji pri plemenskih svinjah ugotovili seroprevalenco 53,3 %, pri pitancih 43,3 % in pri tekačih 11,6 %, se za testiranje odvzame 4 vzorce v čredah do 30 plemenskih svinj, 5 vzorcev v čredah z več kot 50 plemenskimi svinjami, ne glede na število odvzamemo 6 vzorcev pri pitancih in 19 do 29 pri tekačih. PRILOGA 2 Spremni dopis za pošiljanje vzorcev – prašičja influenca (PI) Kontaktni podatki vzorčevalca Ime: …………………………………………………………………………………………... Naslov: ……………………………………………………………………………………….. Telefon (če je na voljo):……………………………………………………………………….. Elektronski naslov (če je na voljo): …………………………………………………………… Tip in število vzorcev: X bris……………. X serum…………. X drugo…………………………………………. Podatki o gospodarstvu 1. Ime lastnika oz. farme:………………………………………………………………. 2. Naslov farme:………………………………………………………………………… 3. Občina / Območni urad UVHVVR:…………………………………………………. 4. Tip reje (obkroži): X velika komercialna farma (nad 800 pl. svinj) X srednja komercialna farma (100-800 pl. svinj) X mala komercialna farma (do 100 pl. svinj) X pitovna farma X nekomercialna reja X farma z izpustom X farma brez izpusta 5. Skupno število živali prisotnih na farmi: sesni pujski……, odstavljenci………, pitanci………., plemenske svinje……, merjasci…… 6. Namen preiskave je: X klinična slika pri prašičih X potrjene okužbe pri ljudeh 7. Kratka anamneza z opisom klinične slike pri živali …………………………………………………………………………………………………... ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… Datum odvzema vzorcev:………………….Podpis vzorčevalca:……………………………… Literatura 1. OIE. Swine influenza, 2009. https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Animal_Health_in_the_World/docs/pdf/Dise ase_cards/SWINE_INFLUENZA.pdf (4.11.2019) 2. Olsen CW, Brown IH, Easterday BC, Van Reeth K. Swine influenza. In: Straw BE, Zimmerman JJ, eds. Diseases of swine. 9th ed. Ames: Iowa State University Press, 2006: 469-82. 3. Dauphin G, Dietze K, Domenech J, et al. FAO guidelines for surveillance of pandemic H1N1/2009 and other influenza viruses in swine populations. Rome: food and agriculture organization of the united nations, March 2010. http://www.fao.org/3/a­ak738e.pdf (4. 11. 2019) 4. Newman AP, Reisdorf E, Beinemann J, et al. Human Case of Swine Influenza A (H1N1) Triple Reassortant Virus Infection, Wisconsin. Emerg Infect Dis 2008; 14(9): 1470-2. 5. Ma W, Kahn RE, Richt JA. The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications. J Mol Genet Med 2009; 3(1): 158-66. 6. Van Reeth K, Brown IH, Olsen CW. Inluenza virus. In: Zimmerman JJ, Karriker LA, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevensen GW, eds. Diseases of swine. 10th ed. Chichester : John Wiley & Sons, 2012: 557-70. 7. Smith GJ, Vijaykrishna D, Bahl J, et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature 2009; 459(7250): 1122-5. 8. Golinar Oven I. Razširjenost prašičje influence na velikih farmah prašičev v Sloveniji. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 2007. Magistrsko delo. 9. OFFLU Strategy document for surveillance and monitoring of influenzas in animals. Maj 2013. http://www.offlu.net/fileadmin/home/en/publications/pdf/OFFLUsurveillance.pdf (8. 11. 2019) 10. Van Reeth K, Brown IH, Dürrwald R, et al. Seroprevalence of H1N1, H3N2 and H1N2 influenza viruses in pigs in seven European countries in 2002–2003. Influenza Other Respir Viruses 2008; 2(3): 99-105. 11. Brown IH. The molecular epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. In: Proceedings of 4th International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Disease, 2003. Rome, 2003: 245-9. 12. Sibbel R. Keeping up with swine influenza. Pig Int 2000; 30(6): 24-6. 13. Done SH. Porcine respiratory disease complex (PRDC). Pig J 2002; 50: 174-96. 14. Straw B. Update on swine influenza. Envoy 2000; 8(4): 1-3. 15. Heinen PP, van Nieuwstadt AP, Plo JM, de Boer-Luijtze EA, van Oirschot JT, Bianchi AT. Systemic and mucosal isotype-specific antibody responses in pigs to experimental influenza virus infection. Viral Immunol 2000; 13: 237-47. 16. OFFLU swine influenza virus technical working group. Collection of specimens from swine for the detection of influenza A virus by molecular assays or virus isolation, 2017. http://www.offlu.net/fileadmin/home/en/resource-centre/pdf/OFFLU­_Collection_of_Specimens_for_Detection_of_Influenza__December2017.pdf (4. 11. 2019) 17. Detmer SE, Patnayak DP, Jiang Y, Gramer MR, Goyal SM. Detection of influenza A virus in porcine oral fluid samples. J Vet Diagn Invest 2011; 23: 241-7. 18. Iowa State University. College of Veterinary Medicine, Veterinary diagnostic and production animal medicine. Oral fluid, 2019. https://vetmed.iastate.edu/vdpam/research/disease-topics/swine/oral-fluids (4. 11. 2019) 19. Dewey CE, Straw BE. Herd examination. In: Straw BE, Zimmerman JJ, eds. Diseases of swine. 9th ed. Ames: Iowa State University Press, 2006: 12-3. 20. Cannon RM, Roe RT. Livestock disease surveys: a field manual for veterinarians. Canberra: Australian Bureau of Animal Health, 1982: 16.