Farmacevtski vestnik STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE • PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA Ø T. 2 • J U L I J 2 0 0 5 • L E T N I K 5 6 Odgovorni urednik Borut Øtrukelj Œastni glavni urednik Aleø Krbavœiœ Glavna urednica Andrijana Tivadar Uredniøki odbor Tajda Gala Miharija Stanko Gobec Katja Gombaœ Aver Iztok Grabnar Janja Marc Franc Vreœer Izdajateljski svet Boøtjan Debeljak Darja Frankiœ Mirjana Gaøperlin Mojca Kerec Mateja Maleøiœ Robert Piøek Magda Zimic Naslov uredniøtva / Adress of the Editorial Office: Farmacevtski vestnik, Aøkerœeva 7, SI-1000 Ljubljana, telefon/phone: 386 1 476 95 00 Farmacevtski vestnik izdaja Slovensko farmacevtsko druøtvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana, Telefon (01) 569 26 01 Transakcijski raœun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010-0016686585. Izhaja øtirikrat letno. Letna naroœnina je 15.000 SIT, za œlane SFD je vkljuœena v œlanarino. Za tuje naroœnike 100 US$. Avtor fotografije na naslovnici, Silvo Koder Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Naklada: 2900 izvodov Letnik 2005 sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published quarterly by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 15.000 SIT other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik is regulary abstracted in: BIOLOGICAL ABSTRACTS, CHEMICAL ABSTRACTS, PHARMACEUTICAL ABSTRACTS, MEDICAL & AROMATIC PLANTS ABSTRACTS AND INBASE / Excerpta Medica farm vestn 2005; 56 Spoøtovana bralka, cenjeni bralec! Kljub poletju, ko obiœajno poseæemo po lahkotnejøemu branju, ponuja druga øtevilka FV obilo zanimivih strokovnih œlankov in novic iz sveta farmacije. Tako se lahko seznanimo z uporabo primarnih celiœnih linij hepatocitov pri preiskovanju delovanja novih zdravilnih uœinkovin, predvsem z vidika metabolizma. V zadnjem desetletju postaja œedalje bolj jasno, da se metabolizem zdravilnih uœinkovin v telesu razlikuje od posameznika do posameznika. Prej ali slej bomo zaradi racionalizacije morali poseœi po individualiziranemu odmerjanju in zdravljenju, zato so øtudije, ki razjasnjujejo molekularne mehanizme delovanja in razgradnje zdravil, øe kako potrebne in zaæeljene. Nekako v istem smislu je napisan tudi œlanek o doloœanju mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma. Tudi na podroœju malignomov in raka, sproæenega z mutageni, spoznavamo, da z zdravili danaønjega œasa podaljøujemo predvsem starost, æal pa ne tudi mladosti. Zaradi tega je œloveøki organizem toliko dalj œasa izpostavljen vsem mogoœim mutagenom, kar lahko vodi do razvoja malignih obolenj. Z drugimi besedami, œloveøtvo v povpreœju ni niœ bolj bolno, kot nekoœ, le drugi bolezenski znaki se izrazijo, v odvisnosti od daljøe æivljenjske dobe posameznikov. Prav tako si lahko preberemo o encimih in hormonih, ki sodelujejo pri nastanku porfirinov, pomembnih za laboratorijsko diagnostiko in obenem v »noviœkah« izvemo, da je minilo 100 let od uvedbe besede hormon. Novice iz sveta farmacije prav tako prinaøajo pregled najbolj prodajanih humanih zdravil v odbobju 2002 do 2004. Na podroœju sin-teznih zdravil prednjaœijo statini, kar le potrjuje zgoraj navedena dejstva o zdravilih, ki podaljøujejo zrelo starostno obdobje, med rekombi-nantnimi zdravili pa je daleœ najbolje prodajano zdravilo eritropoetin. Ali je øvedski monopol prodaje zdravil v nasprotju z evropskih pravom in proti uvajanju svobodne konkurence? Pri branju tega œlanka boste nehote naredili primerjavo s stanjem v Sloveniji. Ali je zato smotrno, da odpiramo vrata pri prodaji zdravil brez recepta tudi nestrokovnjakom? Novi predlog Zakona o zdravilih, ki je ravnokar v javni obravnavi, se temu nezadræno pribliæuje. Ali nismo le farmacevti »gospodarji zdravil«? Koliko veœ odstotkov neæelenih uœinkov bo, z zdravstvenega in ekonomskega vidika, zaradi sprejetja za stroko nedoreœenih pravil in smernic? Berimo, razmislimo in ukrepajmo. Tudi zato smo farmacevti. Odgovorni urednik prof. dr. Borut Øtrukelj, mag. farm. Vsebina Borut Øtrukelj Beseda odgovornega urednika 101 Pregledni œlanki – Review Articles Tina Batista Napotnik, Irena Mlinariœ-Raøœan Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravilt The use of primary hepatocyte cultures in drug discovery and development 103 Stane Srœiœ (doktorska disertacija Mile Boæiœ) Obvladovanje kakovosti in uspeønosti v farmacevtski proizvodnji z uporabo modela poslovne odliœnosti 108 Branka Rozman, Saøa Baumgartner, Mirjana Gaøperlin nterakcije ksantana in semenske sluzi roæiœevca v vodnih sistemi Interactions between xanthan and locust bean gum in water systems 109 Andreja Plaper Doloœanje mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma The mouse lymphoma mutagenicity assay (MLA) 115 Janez Mravljak, Barbara B. Byrne Habiœ, Slavko Peœar Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja Nitric oxide III: inhibitors of excessive formation 120 Stane Srœiœ (doktorska disertacija Roka Dreua) Izdelava pelet z razliœnimi granulacijskimi tekoœinami in upliv hidrodinamskih razmer v Wursterjevi komori na uœinkovitost filmskega oblaganja 124 Ljuba Krnjak, Milan Skitek Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki Importance of porphyrins in laboratory diagnostics 125 Strokovni œlanki – Professional Articles Janja Bedraœ Øvedski monopol prodaje zdravil nasproten evropskemu pravu – kaj pa slovenska ureditev? 131 Zanimivosti iz stroke 133 Martina Cvelbar Poroœilo s sreœanj uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev Novice iz sveta farmacije Iz druøtvenega æivljenja 137 Jelka Dolinar: Simpozij ob 30. skupøœini SFD 137 Silvo Koder: Poroœilo z 10. kongresa Evropskega zdruæenja bolniøniœnih farmacevtov(EAHP) Tajda Gala Miharija: Poroœilo z generalne skupøœine Evropskega zdruæenja bolniøniœnih farmacevtov (EAHP) Julijana Kristl: Poroœilo o 1st PharmSciFair & Exhibition Marija Brenœiœ: Izlet seniorjev v Furlanijo Julijsko krajino Zdenko Tauøiœ: Farmacevtsko-botaniœna ekskurzija na Slavnik 102 farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil The use of primary hepatocyte cultures in drug discovery and development Tina Batista Napotnik, Irena Mlinariœ-Raøœan POVZETEK: Celiœne kulture jetrnih celic (hepatocitov) uporabljamo v predkliniœnih øtudijah novih zdravilnih uœinkovin kot vmesni œlen med biokemiœnimi in in vivo poskusi. In vitro modeli so enostavni, dajo hitre rezultate v strogo nadzorovanih pogojih, omogoœajo dobro ponovljivost in lahko kvantifikacijo. Tako dobimo øtevilne informacije o molekularnem mehanizmu, biotransformaciji, farmakokinetiki in toksiœnosti preiskovanih snovi ter zmanjøamo øtevilo ærtvovanih æivali in prostovoljcev v kliniœnih testiranjih. Z uporabo primarnih œloveøkih hepatocitov lahko ugotavljamo tudi dejavnike starosti, spola in okolja ter individualne razlike v odzivanju na uœinkovine. Ker so primarni œloveøki hepatociti teæko dostopni, celice razliœnih darovalcev shranjujemo z zamrzovanjem. Hepatocitne celiœne linije imajo sposobnost delitve celic in so tako na voljo v neomejenem øtevilu, vendar pa so fenotipske lastnosti slabøe izraæene kot v primarnih hepatocitih, zato je treba biti pazljiv pri interpretaciji rezultatov. KLJUŒNE BESEDE: jetra, hepatocit, celiœna kultura, celiœna linija, predkliniœne øtudije ABSTRACT: Cultured hepatocytes are used in preclinical studies of drugs as a link between biochemical and in vivo assays. The in vitro models are simple, with quick acquisition of data in a highly controlled environment. The data can easily be quantified and reproduced. Primary hepatic cultures are suitable for investigating molecular mechanisms, the biotransformation, the pharmacokinetics and the toxicity of novel compounds, therefore the number of laboratory animals and volunteers in clinical trials can be reduced. Primary human hepatocytes are used to study the effects of age, sex and environment factors, and the interindividual variability in response to drugs. Human hepatocytes are very scarce thus the cells derived from the different donors are cryopreserved. Hepatic cell lines are immortalized and therefore available at a large number of cells, but the expression of hepatic functions is lower than in primary hepatocytes so the prediction to in vivo data is always prone to some degree of uncertainty. KEY WORDS: liver, hepatocyte, cell culture, cell line, preclinical studies 1 Uvod Odkrivanje in optimizacija novih zdravilnih uœinkovin zahteva hitre in ponovljive teste. V predkliniœnih øtudijah se je tako pojavila nova stopnja testiranja – uporaba in vitro modelov (1). Biotransformacija ksenobiotikov ima poslediœno terapevtske ali pa toksiœne uœinke. Proces biotransformacije sicer poteka v razliœnih tkivih, vendar so jetra najaktivnejøi organ pri doloœanju usode kseno-biotikov. Z razvojem metod izolacije in kultivacije parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) je mogoœe v strogo nadzorovanih in vitro pogojih ugotavljati mehanizme uœinkovanja in biotransformacije snovi na celiœnem in molekularnem nivoju (2). Med in vitro modele jeter øtejemo oœiøœene jetrne frakcije in enoencimske sisteme, izolirane jetrne celice in hepatocitne celiœne kulture, jetrne rezine, pretoœne sisteme celotnih izoliranih jeter in raœu-nalniøke modele. Prednosti in slabosti in vitro modelov jeter so zbrane v preglednici 1. Najpogosteje uporabljamo izolirane in kultivirane hepatocite (1, 3, 4), ki delujejo kot vmesni œlen med biokemiœnimi in in vivo poskusi. Œeprav in vitro modeli ne morejo v celoti nadomestiti in vivo poskusov, imajo pred njimi øtevilne prednosti. Modele hitro postavimo, mogoœe jih je avtomatizirati, dajo hitre rezultate, pogoje lahko strogo nadzorujemo, omogoœajo dobro ponovljivost in lahko kvantifikacijo, so ekonomiœni. Izloœimo tudi æivœne dejavnike ter Dr. Tina Batista Napotnik, univ. dipl. biol., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana Doc. dr. Irena Mlinariœ-Raøœan, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2005; 56 103 Pregledni œlanki - Review Articles dejavnike krvnega obtoka. Tako dobimo øtevilne koristne informacije o delovanju, biotransformaciji, farmakokinetiki in toksiœnosti preiskovanih snovi. Zmanjøamo tudi øtevilo ærtvovanih æivali in prostovoljcev v kliniœnih testiranjih ter laæje doloœimo primerno æivalsko vrsto za in vivo testiranja. Vse to pa omogoœi racionaliziracijo in pospeøitev selekcije testiranih potencialnih farmakoloøkih molekul (1, 3, 4). 2 Primarni hepatociti 2.1 Izolirani hepatociti V 50. in 60. letih prejønjega stoletja, v œasu bliskovitega razvoja celiœnih kultur, so poskuøali izolirati tudi glodalske jetrne celice in sicer z mehanskim delovanjem na jetrno tkivo. Metode so bile neuspeøne, ker so hepatociti v tkivu trdno speti s stiœnimi kompleksi (5). Øele encimatske tehnike so dale vzpodbudne rezultate: z in situ perfuzijo jeter z raztopino kolagenaze so uœinkovito izolirali tudi do 50 % celic podganjih jeter (6). Metodo so kasneje izpopolnjevali in danes izoliramo hepatocite z dvostopenjsko in situ perfuzijo jeter: jetra najprej perfundiramo s pufrom, ki vsebuje kelator EGTA, ki odstrani kalcijeve ione in tako razbije od kalcija odvisne medceliœne povezave in sicer poruøi strukturo kadherinov. Sledi perfuzija z raztopino kolagenaze, ki razgradi zunajceliœni matriks v nekaj minutah (7). Metoda je bila prirejena tudi za druge æivali pa tudi za œloveka (8, 9, 10). Izolirani hepatociti v suspenziji obdræijo veœino metabolnih funkcij, sistem je tehniœno nezahteven in omogoœa dostop preiskovanih molekul do vseh celic. Slabost modela je kratkotrajna uporaba, saj celice lahko uporabljamo za preiskave le 2-4 ure, nato priœne aktivnost jetrnih encimov in viabilnost celic moœno upadati (3, 4). 2.2 Primarna kultura jetrnih celic Za daljøe raziskave moramo hepatocite gojiti v celiœni kulturi. S cen-trifugiranjem pri nizkem øtevilu obratov (50 g) odstranimo neparen-himatske celice (endotelne, Kupfferjeve, stelatne celice in celice NK), v suspenziji ostanejo le hepatociti, ki vrøijo veliko veœino jetrnih funkcij (11). Hepatociti rastejo pritrjeni na podlago v posodicah, pre-vleœenih s kolagenom, v gojiøœu William’s z 10 % teleœjega seruma pri 37 °C in 5 % CO2/95 % zraka (6). Celice po nasaditvi v posodice potrebujejo nekaj œasa, da si opomorejo od øoka zaradi izolacije, zato priœnemo s poskusi najmanj 24 ur po nasaditvi (12). Celice se v kulturi ne delijo, zato jih nasadimo v visoki koncentraciji, da doseæejo konfluentnost – se staknejo med seboj (3) (slika 1). Celice v kulturi zadræijo veliko veœino jetrnih funkcij, kot jih vrøijo in vivo: presnavljajo ogljikove hidrate, seœnino, lipide, æolœne kisline, sintetizirajo plazemske proteine, se odzivajo na hormone in vrøijo biotransformacijo oziroma razstrupljanje snovi z encimi I. in II. stopnje in so zato primeren model za raziskave øtevilnih bioloøkih uœinkovin (2). Tako lahko ugotavljamo mehanizme delovanja preiskovanih snovi v razliœnih koncentracijah (3). Ker so kulture enostavnejøi sistem od organizmov, laæje preuœujemo interakcije med zdravili (13, 14). Encimi biotransformacije v kultiviranih jetrnih celicah so aktivni, zato lahko z njimi ugotavljamo presnovo potencialnih zdravil (3, 15). To je za razvoj uœinkovine zelo pomembna stopnja, saj presnova uœinkovine vpliva na oœistek in odstranjevanje zdravila iz telesa, klin-iœno uœinkovitost, individualne farmakokinetiœne razlike, razliœno koncentracijo na tarœnem mestu in toksiœnost zdravila (2). Ugotovili so, da se veœina snovi v kulturi podobno presnavlja kot in vivo – glavne presnovke najdemo v obeh sistemih, pogoste pa so razlike v Slika 1: Fazno-kontrastna mikrografija primarnih hepatocitov v kulturi. Levo: podganji hepatociti, desno: œloveøki hepatociti. 200-kratna poveœava, merilo: 25 µm (35). Figure 1: Phase-contrast micrograph of primary cultured hepatocytes. Left: rat hepatocytes, right: human hepatocytes. 200x magnification, bar: 25 µm (35). 104 farm vestn 2005; 56 Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil Preglednica 1: In vitro modeli jeter, njihove prednosti in slabosti. Povzeto po: 1, 3, 4. Table 1: In vitro liver models, their advantages and disadvantages. Summarized from: 1, 3, 4. Model Prednosti Slabosti Celiœne frakcije (mikrosomi, mitohondriji) in enoencimski sistemi Molekularni mehanizmi, izolirani encimski sistemi Odsotnost citosolnih encimov, kratkotrajnost Izolirane jetrne celice v suspenziji Funkcije podobne in vivo celicam, tehniœno nezahteven, lahka dostopnost preiskovanih molekul do vseh celic, moænost krioprezerviranja, medvrstne raziskave Kratkotrajnost (2-4 ure), ni æolœnih kanalœkov Primarne kulture hepatocitov Funkcije ohranjene veœ dni, raziskava procesov biotransformacije, medvrstne raziskave Pod standardnimi pogoji omejeno trajanje (nekaj dni), fenotipiœne spremembe, ni celiœnih delitev Hepatiœne celiœne linije Neomejeno øtevilo (nesmrtne - se delijo), øtevilne jetrne funkcije ohranjene Jetrne funkcije manj izraæene kot v normalnih hepatocitih, nekatere celo odsotne Jetrne rezine Ohranjena lobularna struktura, dostopni humani vzorci Kratkotrajnost (do 10 ur), celice niso enakomerno funkcionalne, zbiranje æolœa ni mogoœe Pretoœni sistemi celotnih izoliranih jeter Podobno in vivo stanju, 3D struktura, funkcionalni æolœni kanalœki, mogoœe zbiranje æolœa, kinetiœne øtudije Tehniœno zahteven model, kratkotrajnost (nekaj ur), preiskovanje veœ snovi ni moæno, œloveøki organi niso dostopni Raœunalniøki modeli zmanjøamo øtevilo prostovoljcev in poskusnih æivali Ne moremo predvideti vseh okoliøœin poskusa koliœini posameznih produktov (13, 14, 17). Podobno kot in vivo lahko tudi v kulturi z induktorji in inhibitorji spreminjamo aktivnost citokromov P450. Tako ugotavljamo, kako preiskovane snovi vplivajo na presnovo drugih ksenobiotikov (15, 16). V kultiviranih hepatoc-itih se ohranijo tudi encimi II. stopnje biotransformacije, ki vrøijo kon-jugacijo razliœnih skupin na izhodne produkte redoks reakcij I. stopnje biotransformacije (2). Problem potencialnih zdravil so obiœajno nepredvideni stranski uœinki, ki so toksiœni za razliœna tkiva in organe. Najpogostejøa tarœa so obiœajno jetra, saj hepatotoksiœnost velikokrat povzroœijo produkti biotransformacije (1, 3). Biotransformacija je obiœajno detoksifikacijski proces, vœasih pa presnovki zdravil postanejo bolj toksiœni kot osnovna uœinkovina, npr. øtevilni intermediati so elek-trofilni in nepovratno alkilirajo celiœne makromolekule, kar vodi v poøkodbe tkiva (1, 2). S pomoœjo razliœnih kvalitativnih in kvantitativnih metod lahko s hepatocitnimi kulturami ugotavljamo toksiœne vplive preiskovanih snovi na delovanje jetrnih celic (sintezo DNA in proteinov, na homeostazo kalcija, znotrajceliœni K+, vsebnost ATP in AMP, nivo glutationa, glukoneogenezo, ureagenezo, sintezo holesterola in lipoproteinov, sintezo in sekrecijo albumina, serumske encime, transport konjugiranih æolœnih kislin in bilirubina, membranski transport, iztekanje citosolnih encimov ob poøkodbi membrane), spremembe morfologije celic (na citoskelet, celiœni volumen, celiœno membrano), genotoksiœnost (poøkodbe DNA, formacija adduktov z DNA, spremembe popravljalnih mehanizmov), celiœno smrt (nekrozo, apoptozo) (1, 3). Kulture so tudi zelo uporabne za doloœanje kemoprotektivnih sredstev, ki jetra oziroma organizem zaøœitijo pred økodljivimi vplivi uœinkovin (16). Kot vse metode imajo tudi primarne kulture jetrnih celic svoje slabosti Najveœja je ta, da izraæanje specifiœnih jetrnih funkcij s œasom upada, kar vodi v fenotipske spremembe hepatocitov in v dediferenciacijo (3). Tudi aktivnosti encimov druæine citokromov P450 (CYP450) v primarnih hepatocitih s œasom upadajo. Vzrok je v zmanjøanem prepisu CYP mRNA, zato je v celicah vse manj encimov in celotna CYP450 aktivnost v celici upade (2, 15) Na ohranjanje specifiœnih jetrnih funkcij vplivajo øtiri skupine dejavnikov: topni dejavniki gojiøœa, zunajceliœni matriks, interakcije med celicami in dejavniki replikacije (2). S spreminjanjem teh dejavnikov so razvili tehnike gojenja hepatocitov, ki vzdræujejo funkcionalnost dlje œasa. Zelo uspeøno je gojenje hepatocitov v ko-kulturi, torej skupaj z drugo vrsto celic, npr. linijskimi epitelnimi, ste-latnimi in drugimi neparenhimskimi jetrnimi ter celo nehepatiœnimi celicami (18). Te celice sproøœajo v kulturo snovi, ki omogoœijo okolje, ki bolje posnema pogoje in vivo, zato hepatociti aktivneje vrøijo specifiœne funkcije. Drugi naœin je tridimenzionalna kultura v obliki kola-genskega sendviœa ali sferoidov, ki lahko vsebujejo tudi druge celice. V teh kulturah hepatociti zadræijo tridimenzionalno kuboidalno obliko, kar vpliva tudi na izraæanje jetrnih funkcij (19). Med celicami nastanejo celo æolœni kanalœki (12) 2.3 Primarna kultura œloveøkih jetrnih celic Najpogosteje uporabljamo podganje hepatocite, saj je njihova izolacija in kultivacija najlaæje izvedljiva in podganja jetra so relativno lahko dostopna. Napovedovanje uœinkov bioloøko aktivnih snovi na œloveka na osnovi raziskav na poskusnih æivali pa je zaradi medvrstnih razlik vedno pod- farm vestn 2005; 56 105 Pregledni œlanki - Review Articles vræeno doloœenemu tveganju. Zato so za preuœevanje potencialnih zdravilnih uœinkovin primernejøi hepatociti humanega izvora. Pridobimo jih lahko s perfuzijo celih ali dela jeter darovalcev organov, iz ostankov terapevtskih hepatektomij ali manjøih kirurøkih biopsij (2). Perfuzija je prav tako dvostopenjska, uporabljamo kolagenazo, lahko pa tudi druge encime (npr. dispazo, liberazo), metode pa so precej uspeøne, saj je via-bilnost celic nad 85 % (2) (slika 1). Tudi œloveøki hepatociti v kulturi zadræijo veœino jetrnih funkcij. So celo bolj stabilni kot glodalski, saj svojo diferenciranost ohranjajo dlje œasa (nekaj tednov) (17). Za daljøo funkcionalnost pa jih moramo tako kot æivalske gojiti v ko-kulturah ali tridimenzionalnih kulturah (19). Primarni œloveøki hepatociti veljajo danes za zlati standard preuœevanja metabolizma œloveøkih jeter. Primerni so za raziskave biotransformacije zdravil (prek CYP450 in encimov II. stopnje), saj obstaja dobra povezava metabolizma in vitro/ in vivo (13, 17). Ksenobiotiki se v œloveøkih jetrih v I. stopnji biotransformacije pretvarjajo predvsem s citokromom P450 3A4, pa tudi z 1A2, 2A6, 2B6, 2C, 2D6 in 2E1, ti pa so v kultiviranih celicah dobro izraæeni (2). Njihova aktivnost tudi v œloveøkih hepatocitih upada s œasom. Nekateri CYP450 encimi (CYP3A4, CYP2C9 in CYP 2D6) po 72-96 urah kulture aktivnost obnovijo, drugi (CYP1A2, CYP2E1) pa ne (2). To je tudi razlog, da imajo transformirane spojine podobne metabolne profile kot in vivo, razlikujejo pa se kvantitativno (13, 14, 17). Drugi razlog za kvantitativne razlike je sistemski: in vivo se uœinkovina lahko slabo absorbira ali pa se veæe na molekule v drugih tkivih, torej ne doseæe jeter v tolikøni koncentraciji kot jetrne celice v kulturi (20). Primarne œloveøke hepatocite v kulturi uporabljamo tudi za øtudije molekularnih mehanizmov, toksiœnosti, biokinetike in interakcije med zdravili. Ugotavljamo lahko dejavnike starosti, spola in okolja (13, 14). Pomembni so pri ugotavljanju individualnih razlik v odzivanju na uœinkovine, saj obstaja veliko genetskih polimorfizmov genov, ki se izraæajo v jetrih (21, 22). Najveœje razlike so opazne v druæini citokromov P450, kar lahko precej vpliva na presnovo snovi in tako na potek zdravljenja (13, 22). Preuœujemo lahko tudi idiosinkratiœno (nenaœrtovano) hepatotoksiœnost, pri kateri so prizadeti le redki posamezniki, verjetno pa je povezana z neo-biœajno presnovo ali imunoalergijskim fenomenom (3, 23). V metabolizmu vsake snovi lahko obstajajo kvalitativne ali kvantitativne razlike med æivalskimi vrstami in œlovekom. S primerjavo uœinkov na celice razliœnega izvora lahko doloœimo æivalski model, ki bo deloval podobno kot œloveøke celice, torej je najprimernejøi za nadaljnje raziskave (13). 2.4 Zamrzovanje hepatocitov Najveœji problem pri vzpostavitvi primarne kulture œloveøkih hepatoci-tov je legalna in etiœna omejenost dostopa do œloveøkih celic. Potrebna je tudi vsakokratna izolacija sveæih celic, ker je kultura kratkotrajna in se celice v njej ne delijo. Pri vsaki izolaciji dobimo veliko øtevilo celic, ki jih obiœajno sproti ne moremo porabiti, zato je priporoœljivo celice shraniti. Z metodo zamrzovanja je to moæno. Kritiœni elementi za uspeøno zamrzovanje hepatocitov so protokol zamrzovanja, izbira kri-opotektivnega sredstva in odstranitev mrtvih celic po odmrzovanju. Izolirane hepatocite v suspenziji moramo zamrzniti v krioprotektivnem sredstvu, obiœajno je to 10 % DMSO, z nadzorovano hitrostjo zamrzo-vanja (-1,9 °C/min od +4 do -30 °C ter -30 °C/min od -30 °C do -150 °C) (8, 9). Celice nato prenesemo v tekoœi duøik, kjer jih lahko obdræimo tudi veœ let. Odmrzovanje pa mora potekati œim hitreje, v vodni kopeli na 37 °C, hitro tudi odstranimo DMSO (8, 9). Proces zamrzovanja in odtajanja celic sicer zmanjøa njihovo viabil-nost, predvsem zaradi poøkodb celiœne membrane, vpliva na membranski transport in sintezo proteinov (24). Vendar pa so z izboljøe-vanjem metode dosegli, da po odmrzovanju celice vrøijo svoje funkcije skoraj v enaki meri kot sveæe izolirane (25). Torej je zamrzovanje pri-poroœljivo za vzpostavljanje banke hepatocitov, izoliranih iz razliœnih pacientov ali æivalskih vrst, ki so primerni za raziskave. To nam omogoœa ugotavljati individualne razlike v enem samem poskusu. 3 Celiœne linije Alternativa teæko dostopnim primarnim hepatocitom so jetrne celiœne linije. Njihova prednost je v tem, da se delijo in so zato na voljo v neomejenem øtevilu. Hepatocitne linije so pridobili na veœ naœinov: 1.) iz primarnih tumorjev jeter [humani liniji Hep G2 (26) in Mz-Hep-1 (27), podganja H4IIE (28)], 2.) SV40-transformirani normalni primarni hepa-tociti [humani liniji THLE-2 in THLE-3 (29)], 3.) iz embrionalnih jetrnih celic [miøja linija BNL CL.2 (30)], 4.) iz TGF-a transgenih miøi [linija AML12 (31)] in 5.) s fuzijo dveh razliœnih tipov celic [hibrid fibroblas-tov in hepatomskih celic WIF12-1 (32)]. Slabost hepatocitnih linij je v tem, da so fenotipske lastnosti jetrnih celic slabøe izraæene, zato se lahko na ksenobiotike odzivajo drugaœe kot primarni hepatociti. V raziskavah najveœkrat uporabljamo linijo Hep G2, ki izvira iz hepatocelularnega karcinoma (26). To je precej Slika 2: Laserska konfokalna fluorescenœna mikrografija primarnega œloveøkega hepatocita, 3 ure po dodatku 50 nM mikrocistina-LR. Aktinski filamenti (rdeœe) zaœenjajo potovati proti srediøœu celice, jedro se krœi. Aktinski filamenti so oznaœeni z rodamin faloidinom (rdeœe), jedro pa s Sytox Green (zeleno). Merilo: 5 µm (34, 35). Figure 2: Laser-scanning confocal fluorescent micrograph of primary human hepatocyte, the cells were treated with 50 nM microcystin-LR for 3 hours. Actin filaments (shown in red) start to move towards the center of the cell, the nucleus condense. Actin filaments are stained with rhodamin-phalloidin (red) and nuclei with Sytox Green (green). Bar: 5 µm (34, 35). farm vestn 2005; 56 Uporaba celiœnih kultur parenhimskih jetrnih celic (hepatocitov) pri razvoju novih zdravil stabilna celiœna linija, ki izraæa 96 % genov primarnih hepatocitov in vrøi øtevilne jetrne funkcije (23, 26). Vrøi tudi øtevilne procese biotransformacije I in II stopnje, vendar v manjøi meri kot primarni hepatociti (23). Aktivnost citokromov P450 v celicah je precej niæja kot v primarnih, CYP 2E1 je celo nezaznaven. Vzrok je manjøe prepisovanje mRNA, kar je posledica niæjega nivoja transkripcijskih faktorjev v hepatiœnih linijah (15). Zaradi odsotnosti CYP 2E1 in alkoholdehidrogenaze je linija Hep G2 odporna proti cito-toksiœnim in lipogenim uœinkom etanola (23). Celice Hep G2 so idealen model za øtudije mitohondrijske toksiœnosti zaradi velikega øtevila mitohondrijev in mitohondrijske DNA (33). Hepatiœne linije uporabljajo v øtevilnih øtudijah, vendar se moramo ves œas zavedati, da drugaœne aktivnosti encimov v linijah lahko privedejo do razlik v odgovoru na preiskovano uœinkovino, zato je potrebna pazljivost pri interpretaciji rezultatov (23). 4 Primer uporabe hepatocitov v toksikologiji Primarni hepatociti v kulturi so zelo primerni za øtudij toksiœnih vplivov na celiœnem in biokemiœnem nivoju. Primer uporabe je ugotavljanje uœinkov mikrocistinov (cianobakterijskih hepatotoksinov) na obliko celic, citoskelet in jedra, sproæanje apoptoze in aktivnost citokroma P450 1A. Ugotovili smo, da mikrocistini v primarnih podganjih in œloveøkih hepatocitih povzroœajo skrœenje in brstenje celic, prerazporeditev aktinskih filamentov v srediøœe celice, kar je posledica sproæitve apoptoze. Uporabljali smo laserski konfokalni mikroskop, kjer smo opazovali fluorescenœno oznaœene hepatocite (slika 2). Pri tem se aktivirajo kaspaze, vendar je vzorec aktivacije kaspaz pri podganjih in œloveøkih hepatocitih drugaœen. Œloveøki hepatociti so tudi bolj obœutljivi na delovanje mikrocistinov, kar moramo upoøtevati pri napovedovanju rezultatov z æivalskih modelov na œloveka. Uporaba hepatocitov veœ pacientov pa nam je omogoœila ugotavljanje razlik med posamezniki (34, 35). 5 Zakljuœek Celiœne kulture ne morejo nadomestiti raziskav na æivalih in prostovoljcih, dajo pa nam veliko koristnih informacij o presnovi zdravil na celiœnem in molekularnem nivoju. Z uporabo kultur v predkliniœnih øtudijah delujemo etiœno, saj zmanjøamo øtevilo poskusnih æivali in prostovoljcev v kliniœnih poskusih, in gospodarno, ker zmanjøamo øtevilo napaœnih odloœitev v razvoju zdravil. Za doseganje œim boljøih rezultatov pa bo øe naprej potrebno izboljøevati hepatocitne kulture, predvsem v smeri œim boljøega posnemanja in vivo celice, ter razviti hepatiœno celiœno linijo z visoko izraæenimi jetrnimi funkcijami. 6 Zahvala Delo s primarnimi podganjimi in œloveøkimi hepatociti je bilo opravljeno na Inøtitutu za patoloøko fiziologijo Medicinske fakultete v Ljubljani pod mentorstvom prof. dr. Duøana Øuputa, ter v laboratoriju INSERM v Antibesu v Franciji pod mentorstvom prof. dr. Rogerja Rahmanija. Obema se iskreno zahvaljujem. 7 Literatura 1. Davila JC, Rodriguez RJ, Melchert RB et al. Predictive value of in vitro model systems in toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1998; 38: 63-96. 2. Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Castell JV et al. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism. Curr Drug Metab 2003; 4: 292-312. 3. Guillouzo A, Morel F, Langouët S et al. Use of hepatocyte cultures for the study of hepatotox-ic compounds. J Hepatol 1997; 26: 73-80. 4. Cross DM, Bayliss MK. A commentary on the use of hepatocytes in drug metabolism studies during drug discovery and development. Drug Metab Rev 2000; 32: 219-240. 5. Berry MN, Simpson FO. Fine structure of cells isolated from adult mouse liver. J Biol Chem 1962; 15: 9. 6. Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J Cell Biol 1969; 43: 506-520. 7. Williams GM, Bermudez E, Scaramuzzino D. Rat hepatocyte primary cell cultures III: Improved disociation and attachment techniques and the enhancement of survival by culture medium. In Vitro 1977; 13: 809-817. 8. de Sousa G, Dou M, Barbe D et al. Freshly isolated or cryopreserved human hepatocytes in primary culture: Influence of drug metabolism on hepatoxicity. Toxic in Vitro 1991; 5: 483-486. 9. Dou M, de Sousa G, Lacarelle B et al. Thawed human hepatocytes in primary culture. Cryobiology 1992; 29: 454-469. 10. Freshney RI. Liver. In: Culture of animal cells. A manual of basic technique, 4th ed. New York-Chichester-Weinheim-Brisbane-Singapore-Toronto: Wiley-Liss, 2000: 357-358. 11. Quistorff B, Dich J, Grunnet N. Preparation of isolated rat liver hepatocytes. In: Pollard JW, Walker JM. Animal cell culture. Clifton, New Jersey: Humana press, 1990; 151-160. 12. Puviani AC, Ottolenghi C, Tassinari B et al. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential use of isolated liver cells. Comp Biochem Physiol, Part A 1998; 121: 99-109. 13. Rahmani R, de Sousa G, Marre F et al. Potential of freshly isolated and cryopreserved human hepatocytes in drug research and development. In: Rogiers V, Sonck W, Shephard E et al. Human cells in in vitro pharmaco-toxicology. Present status within Europe. Brussel: Vub press, 1993: 117-138. 14. de Sousa G, Florence N, Valles B et al. Relationships between in vitro and in vivo biotransfor-mation of drugs in humans and animals: pharmaco-toxicological consequences. Cell Biol Toxicol 1995; 11: 147-153. 15. Rodriguez-Antona C, Donato MT, Boobis A et al. Cytochrome P450 expression in human hepatocytes and hepatoma cell lines: molecular mechanisms that determine lower expression in cultured cells. Xenobiotica 2002; 32: 505-520. 16. Guillouzo A. Liver cell models in in vitro toxicology. Environ Health Perspect 1998; 106: 511-532. 17. Guillouzo A, Morel F, Fardel O et al. Use of human hepatocyte cultures for drug metabolism studies. Toxicology 1993; 82: 209-219. 18. Bhatia SN, Balis UJ, Yarmush ML et al. Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. FASEB J 1999; 13: 1883-1900. 19. Chen HL, Wu HL, Fon CC et al. Long-term culture of hepatocytes from human adults. J Biomed Sci 1998; 5:435-440 20. Fautrel A, Chesné C, Guillouzo A et al. A multicentre study of acute in vitro cytotoxicity in rat hepa-tocytes: tentative correlation between in vitro toxicities and in vivo data. ATLA 1993; 21: 281-284. 21. Miller III, MC, Mohrenweiser, Bell DA. Genetic variability in susceptibility and response to toxicants. Tox Lett 2001; 120: 269-280 22. Ingelman-Sundberg M. Genetic variability and susceptibility and response to toxicants. Tox Lett 2001, 120: 259-268. 23. Harris AJ, Dial SL, Casciano DA. Comparison of basal gene expression profiles and effects of hepatocyrcinogens on gene expression in cultured primary human hepatocytes and HepG2 cells. Mutat Res 2004; 549: 79-99. 24. De Loecker P, Fuller BJ, Gruwez et al. The effects of cryopreservation on membrane integrity, membrane transport, and protein synthesis in rat hepatocytes. Cryobioloy 1990; 27: 143-152. 25. Son JH, Kim KH, Nam YK et al. Optimization of cryoprotectants for cryopreservation of rat hepatocyte. Biotechnol Lett 2004; 26:829-833. 26. Knowles BB, Howe CC, Aden DP. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science 1980; 209: 497-499. 27. Dippold WG, Dienes HP, Knuth A et al. Hepatocellular carcinoma after thorotrast exposure: establishment of a new cell line (Mz-Hep-1). Hepatology 1985; 5: 1112-1119. 28. Rau MA, Whitaker J, Freedman JH et al. Differential susceptibility of fish and rat liver cells to oxidative stress and cytotoxicity upon exposure to prooxidants. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2004; 137: 335-42. 29. Pfeifer AM, Cole KE, Smoot DT et al. Simian virus 40 large tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte characteristics and metabolize chemical carcinogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 5123-7. 30. Patek PQ, Collins JL, Cohn M. Transformed cell lines susceptible or resistant to in vivo surveillance against tumorigenesis. Nature 1978; 276: 510-511. 31. Wu JC, Merlino G, Fausto N. Establishment and characterization of differentiated, nontrans-formed hepatocyte cell lines derived from mice transgenic for transforming growth factor alpha. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 674-8. 32. Cassio D, Hamon-Benais C, Guerin M et al. Hybrid cell lines constitute a potential reservoir of polarized cells: isolation and study of highly differentiated hepatoma-derived hybrid cells able to form functional bile canaliculi in vitro. J Cell Biol 1991; 115: 1397-408. 33. Pinti M, Troiano L, Nasi M et al. Hepatoma HepG2 cells as a model for in vitro studies on mito-chondrial toxicity of antiviral drugs: which correlation with the patient? J Biol Regul Homeost Agents. 2003; 17: 166-171. 34. Batista T, de Sousa G, Øuput JS, Rahmani R, Øuput D. Microcystin-LR causes the collapse of actin filaments in primary human hepatocytes. Aquat Toxicol 2003; 65: 85-91. 35. Batista Napotnik T. Vpliv mikrocistina-LR na primarne œloveøke hepatocite in keratinocite. Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 2004. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Obvladovanje kakovosti in uspeønosti v farmacevtski proizvodnji z uporabo modela poslovne odliœnosti Stane Srœiœ (doktorska disertacija Mile Boæiœ) Predloæena doktorska disertacija obravnava podroœje farmacevtske kakovosti in uspeønosti poslovanja farmacevtskega podjetja v okviru zakonodajnih predpisov in konkurenœnih pritiskov globalnega farmacevtskega træenja. V svojem pristopu kandidatka preizkuøa in uvaja standardizirani model poslovanja, tj. model odliœnosti Evropske fundacije za vodenje kakovosti, kot primer celovitega pristopa za sistem obvladovanja farmacevtske kakovosti. Pri tem izhaja iz teoretsko poglobljene primerjalne analize Dobre proizvodne prakse (GMP) in sploøne ravni standardov sistema vodenja kakovosti ISO (Mednarodne organizacije za standardizacijo) ter raziøœe vzvode in pogoje za doseganje uspeønosti s teoretiœnim razglabljanjem pomena osebne in timske kakovosti ter ustvarjalnega vodenja. V teoretskem delu postavlja tezo, da ni mogoœe priœakovati bistvenih izboljøav kakovosti izdelkov, storitev in procesov le s parcialnim razumevanjem in vodenjem kakovosti izven okvira in moænosti, ki jih daje kontekst vodenja celotnega poslovanja. Meni, da so øibkosti veljavne farmacevtske zakonodaje prisotne, kar utemeljuje tudi s tem, da so ugotovitve ekspertne skupine ICH (Mednarodne konference za harmonizacijo ) za harmonizacijo farmacevtske kakovosti øele v letu 2003 postavile podroœje sistemov kakovosti, farmacevtskega razvoja in obvladovanja tveganja kot novo temo svojega delovanja. V izhodiøœu disertacije doktorandka ugotavlja, da je poloæaj farmacevtskega podjetja pri zagotavljanju kakovosti in uspeønosti v primerjavi z drugimi panogami precej specifiœen, saj so vplivi posrednih odjemalcev, t.j. vlade, zdravnikov in farmacevtov, neprimerno moœne-jøi, kot vpliv uporabnikov, t.j. bolnikov, ki ne morejo prosto odloœati o izbiri zdravila. S statistiœno obdelavo je preverila verjetnost in stopnjo korelacije med posameznimi dejavniki in rezultati uspeønosti ter identificirala podroœ-ja, ki so najbolj øibka in potrebna korektivov. Iz pridobljenih podatkov pri zaporednih izvedbah samoocene v øtir-iletnem obdobju je potrdila zelo moœne povezave in soodvisnost pri posameznih dejavnikih in poslovnem rezultatu. Najmoœnejøi vpliv na rezultate poslovanja je ugotovila za naslednje dejavnike: vodenje, etiœno vodenje in ravnanje celotnega osebja, standardiziran poslovni model, ustvarjalno vodenje. kadri in procesi. Na osnovi teh empiriœnih ugotovitev je predlagala nova izhodiøœa za vodenje in obvladovanje kakovosti. Kot temelje uspeønega vodenja farmacevtske kakovosti na zakonodajni in podjetniøki ravni je izpostavila: 1. 2. 3. Obvladovanje tehniœne kakovosti postaja samoumeven pogoj za doseganje poslovne uspeønosti. Kompleksnost zahtev za proizvodnjo zdravil sili vodstvo v bolj transparente in sistematiœne pristope, ki integrirajo principe in sistem vodenja kakovosti v sistem vodenja poslovanja. Z razvojem sistema kakovosti v farmacevtski praksi je v svojem delu pokazala sistematiœen in praktiœen primer uporabe modela poslovne odliœnosti Najmoœnejøi dokazani vpliv na rezultate poslovanja je spoznala v kakovostnem in ustvarjalnem vodenju, ki bi v bodoœe zagotavljalo podjetju obstanek in vzdræno rast na globalnem trgu. Dokazana moænost uporabe modela odliœnosti v farmacevtski industriji in povezanih zakonodajnih institucijah potrjuje nove moænosti razvoja in bolj zanesljivega obvladovanja tega podroœja v smislu poveœevanja kakovosti, uœinkovitosti in varnosti v proizvodnji zdravil. Nakazani vzvodi za sistematiœno izboljøevanje osebne in timske kakovosti ter ustvarjalnega vodenja pa prispevajo k temeljnim smernicam za razvoj ustvarjalnega potenciala zaposlenih. Dr. Mila Boæiœ, mag. farm., je zagovorjala doktorsko disertacijo 19. januarja 2005, na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani. Mentor: prof. dr. Stane Srœiœ, Fakulteta za farmacijo Somentor: prof. dr. Ivan Svetlik, Fakulteta za druæbene vede v Ljubljani 108 farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Interakcije ksantana in semenske sluzi roæiœevca v vodnih sistemih Interactions between xanthan and locust bean gum in water systems Branka Rozman, Saøa Baumgartner, Mirjana Gaøperlin POVZETEK: Ksantan (xan) in semensko sluz roæiœevca (lbg) uvrøœamo med naravne polisaharide. Xan je anionski bakterijski eksopolisaharid, lbg pa predstavnik neionogenih rastlinskih b-1,4 galaktomananov. Kombinacijo omenjenih polimerov (xlbg) v farmaciji uporabljamo predvsem za izdelavo ogrodnih tablet s prirejenim sproøœanjem. Rezultati vrednotenja vodnih sistemov posameznega polimera oz. njune zmesi z oscilacijsko reometrijo kaæejo, da tvori xan øibke gele, lbg koloidne vodne disperzije, njuna zmes pa moœne gele. Obstaja veœ razliœnih teorij o sinergizmu med tema dvema polimeroma, ki privede do tvorbe œvrstih trodimenzionalnih struktur v vodi. Z analizo rezultatov reoloøkega in ter-miœnega prouœevanja strukture meøanih gelov lahko predpostavimo mehanizem nastanka meøanih gelov in s tem posredno predvidimo obnaøanje zmesi xan in lbg v razliœnih farmacevtskih oblikah. KLJUŒNE BESEDE: ksantan, semenska sluz roæiœevca, polisaharidi, reologija, mikrokalorimetija ABSTRACT: Xanthan (xan) and locust bean gum (lbg) are classified as natural polisaccharides. Xan is an anionic polymer, produced by bacteria, and lbg belongs to a family of non-ionogenic plant b-1,4 galactomannans. The mixture of xan and lbg (xlbg) is used as an effective excip-ient for sustained-release formulations. Addition of non-gelling lbg to xan, which forms weak gels in water, leads to formation of strong gels. There are many theories about the sinergism between these two substances, which results in formation of coherent 3 D structures in water. Rheology and microcalorimetry are most frequently used methods for structural investigation of xlbg water dispersions. These results enable the hypothetical network model formation, which allows prediction of behaviour of xlbg mixtures in different dosage forms. KEY WORDS: xanthan, locust bean gum, polisaccharides, rheology, microcalorimetry 1 Uvod Ogljikovi hidrati so najbolj razøirjene naravne organske spojine. Predstavljajo veœ kot 90 % suhe biomase. Poleg razøirjenosti so njihove glavne prednosti pridobivanje iz obnovljivih virov, netoksiœnost, moænost vplivanja na strukturo s kemiœnimi in biokemiœnimi postopki ter ugodna cena. Veœina ogljikovih hidratov se nahaja v obliki polisa-haridov (1). Heterogeni polisaharidi so polisaharidi, sestavljeni iz veœ razliœnih monosaharidov. Mednje uvrøœamo sluzi, gumije in pektine. V vodi tvorijo polimerne koloidne raztopine (sole ali gele). Med gumije priøte-vamo rastlinske in bakterijske polisaharidne eksudate, med sluzi pa polisaharide, ki sestavljajo celiœne stene alg. Pri viøjih rastlinah se sluzi nahajajo znotraj celice, kjer veæejo vodo ali predstavljajo rezervno hrano (2). Øtevilni polisaharidi tvorijo gele. Gel sestavlja trdna tridimenzionalna makromolekularna mreæa, v katero se ujame voda. Premreæenje je posledica asociacije verig ali dela verig polimera. Z veœanjem øtevila in jakosti povezav med verigami naraøœa jakost gela. Ko postane organiziranost polimera prevelika, pride do obarjanja. V grobem lahko polisaharide glede na obnaøanje v vodi razdelimo v tri skupine: • dolge, homogene, linearne molekule so asociirane v trdna vlakna (npr. celuloza) • heterogeni polimeri brez pravilnega zaporedja monosaharidov so v vodi dispergirani in tvorijo viskozne raztopine (npr. semenska sluz roæiœevca) • polimeri, ki imajo med pravilno zaporedje vrinjene nepravilne odseke, v vodi gelirajo (npr. ksantan, karagen) (3, 4). Branka Rozman, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana, SI-Slovenija doc. dr. Saøa Baumgartner, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana, SI-Slovenija izr. prof. dr. Mirjana Gaøperlin, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana, SI-Slovenija farm vestn 2005; 56 109 Pregledni œlanki - Review Articles 2 Ksantan Ksantan (ang. xanthan, okrajøano xan) je bakterijski eksopolisaharid, izoliran iz Xanthomonas campestris, bakterije, ki je povzroœitelj øtevil-nih bolezni pri rastlinah, za œloveka pa ni patogena. Xanthomonas ne tvori spor, vendar je zaradi xan, ki jo obdaja v obliki kapsule, zelo odporna na visoke temperature in vplive svetlobe (5). Xan je heteropolisaharid, sestavljen iz D-glukoze, D-manoze in D-glukoronske kisline. Glukoze, povezane z b-1,4 vezmi, tvorijo osnovni skelet, ki je na vsaki drugi glukozi substituiran s trisaharidno stransko verigo. Nespremenljiv del ponavljajoœe se stranske verige predstavlja b-D-manozil-(1,4)- b-D-glukuronil-(1,2)-a-D-manoza. Na terminalno manozo je lahko na mestu 4 ali 6 pripet piruvat. Manoza, pripeta na osnovno verigo, je obiœajno acetilirana na mestu 6 (slika 1). Slika 1. Primarna struktura ksantana (5). Figure 1. Primary structure of xanthan gum (5). Koliœina ter mesto acetiliranih delov in piruviœne kisline sta odvisna od seva bakterije, iz katere je xan izoliran. Obiœajno je na trgu dostopen v obliki kalijeve ali natrijeve soli (5). V vodnih sistemih je xan kemijsko stabilen v øirokem temperaturnem intervalu (10 - 90°C) in pH obmoœju (pH 3 - 12). Pri viøjih pH vrednostih medija poteœe delna deacetilacija stranskih verig. Prisotnost encimov in soli ne zmanjøa njegove stabilnosti. Xan je anionski polimer, zato praviloma ni zdruæljiv s kationskimi povrøinsko aktivnimi snovmi, polimeri ali konzervansi (5, 6). Pogoji pridobivanja xan vplivajo tudi na njegovo sekundarno strukturo. Molekula se pri sobni temperaturi v trdnem stanju in v mediju z visoko ionsko moœjo praviloma nahaja v nativni oz. urejeni konformaciji. Obstaja veœ modelov nativne konformacije, vendar veœina novejøih œlankov podpira idejo dvojne vijaœnice, v katero sta povezani dve verigi xan (slika 2A). Naboji na stranskih verigah so nevtralizirani, zato ni prisotnih elektrostatskih odbojnih sil med stranskimi verigami. Poslediœno se stranske verige tesno prilegajo osnovni verigi. Øtudije strukture z mikroskopijo na atomsko silo so pokazale, da se med seboj z nekovalentnimi vezmi (vodikove vezi, elektrostatske interakcije in steriœni vplivi) povezujejo deli verig, ki imajo stranske verige moœno substiturane s piruviœno kislino (5, 7). Poviøanje temperature ali zniæanje ionske moœi privede do denatu-racije molekule. Prevladajo odbojne elektrostatske sile med negativno nabitimi stranskimi verigami. Stranske verige se ne prilegajo veœ na osnovno verigo, ampak segajo z nje. Povezave med deli dveh verig z visokim deleæem piruvata niso veœ moæne. Dvojna vijaœnica se zaœne razpirati in pri doloœeni temperaturi povsem razpade (slika 2B). S pomoœjo masne spektroskopije so dokazali, da je molekulska masa denaturiranega xan za polovico manjøa od molekulske mase xan v nativni konformaciji, kar potrjuje razpad vijaœnice, sestavljene iz dveh verig. Prehod iz nativnega v denaturirano stanje je ireverzibilen (5, 7). Ob ohlajanju oz. viøanju ionske moœi poteœe ponovna tvorba dvojne vijaœnice, vendar jo tokrat tvori ena sama molekula xan. Ta struktura je v primerjavi z nativno konformacijo bistveno manj popolna, saj ostane veliko zavojev ali delov verig, ki prosto segajo z osnovne strukture. Taki obliki pravimo renaturirana konformacija (slika 2C). Struktura je bila potrjena z rentgensko difrakcijo (5). Druge øtudije, ravno tako podprte z rezultati rentgenske difrakcije, navajajo, da je renaturiran ksantan v obliki enojne, desnosuœne vijaœnice. Prehod iz denaturirane v renaturirano obliko je reverzibilen (5, 7). Zakljuœimo lahko, da so v renaturiranem stanju prevladujoœe intramolekularne interakcije, oblika vijaœnice pa je najverjetneje odvisna od izhodnega vzorca, ki ga uporabljamo. S spreminjanjem pogojev fermentacije in œiøœenja praviloma ne vplivamo na primarno strukturo xan, ki je precej konstantna, paœ pa na njegovo sekundarno strukturo (najbolj vplivata ionska moœ in temperatura fermentacijske brozge) (5, 7, 8). Slika 2. Sekundarna struktura ksantana: A-nativna (urejena) konformacija, B-denaturirana oblika, C-renaturirana oblika. Figure 2. Secondary structure of xanthan gum: A-native (ordered) conformation, B-denaturated conformation, C-renaturated conformation. V farmaciji je xan emulgator in zgoøœevalo v peroralnih in dermalnih farmacevtskih oblikah. Izkoriøœamo torej predvsem lastnosti vodnih sistemov xan, œeprav je xan sam ali v kompleksu z æelatino uporabljan tudi za izdelavo ogrodnih tablet in mikrokapsul s prirejenim sproøœanjem. Zaradi bioadhezivnih lastnosti je xan lahko sestavina nadomestkov za slino. Liofilizate sistemov s xan uporabljamo za izdelavo oralnih tablet s hitrim sproøœanjem (9,10, 11, 12, 13). 3 Semenska sluz roæiœevca Semensko sluz roæiœevca (ang. locust bean gum, carob bean gum, carob flour, St. John’s bread; okrajøano lbg) pridobivamo iz endosperma zrelih semen zimzelenega sredozemskega drevesa roæiœevca (Ceratonia siliqua). Predstavlja rezervno hrano, ki jo seme porablja med kalitvijo. Druga bioloøka vloga lbg je zadræevanje vode v semenu, s œimer prepreœuje izsuøitev semena, hkrati pa ustvarja ustrezno okolje za kalitev (14) farm vestn 2005; 56 Interakcije ksantana in semenske sluzi roæiœevca v vodnih sistemih Kemijsko gledano je lbg galaktomanan. Kot pove æe ime, so galak-tomanani polisaharidi, zgrajeni iz manoze in galaktoze. 1000 - 1500 inearnih poli-b-1,4-manopiranoz tvori ogrodje, na katero so v primeru semenske sluzi roæiœevca brez pravega reda pripete a-1,6-D-galak-topiranoze. Na posameznih odsekih manozne verige so lahko galaktoze pravilno razporejene na vsaki drugi manozi (slika 3A), blokovno razporejene (slika 3B), moæna pa je tudi nakljuœna razporeditev (slika 3C). Tako v trdnem stanju kot v raztopini se nahajajo v obliki togih trakovom podobnih struktur (10) GGGGGGGGG I I I I I I I I I -M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M- S GGGGGG GGGGGGG I I I I I I I I I I I I I -M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M- B G GG GGGG G I II I I I I I -M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M—M—M—M—M —M—M—M—M- Slika 3. Primarna struktura semenske sluzi roæiœevca: A-pravilna razporeditev, B-blokovna razporeditev, C-nakljuœna razporeditev. M-manoza, G-galaktoza (10). Figure 3. Primary structure of locust bean gum: A-regular distribution, B-blockwise distribution, C-random distribution. M-mannose, G-galactose (10). Slika 4. Shematski prikaz orientacije verig galaktomanana v vodi: A – agregirane nesubstituirane manoze, B – solvatirane substituirane manoze, ki tvorijo amorfna podroœja Figure 4. Shematic structure of galactomannan in water: A – aggregated unsubstituted mannose chains, B – solvated substituted man-nose chains that form amorphous regions. Galaktomanani iz semenskih sluzi razliœnih rastlin se med seboj razlikujejo po razporeditvi galaktoz na manoznem skeletu in razmerju med obema monosaharidoma, ki moœno vpliva na topnost. Œe so manozne verige nesubstituirane, se pribliæajo druga drugi in tvorijo supramolekularne strukture, ki so lahko solvatirane le na povrøju. Notranji deli ostanejo povsem nedostopni molekulam topila. Rezultat je slaba topnost spojine. Pri galaktomananih galaktoze predstavljajo stranske verige, zaradi katerih se molekule ne morejo tesno pribliæati druga drugi. Nastanejo amorfne regije, v katere zlahka prodre topilo. Galaktomanani tako nabrekajo in se poœasi raztapljajo. Veœja substituiranost osnovne verige oziroma niæje razmerje manoza/galaktoza pomeni torej veœjo topnost galaktomanana (slika 4). Lbg, pri katerem je razmerje manoza : galaktoza 3,20 : 5,75, je eden slabøe topnih galaktomananov, saj se ga v vodi pri sobni temperaturi raztaplja le 10 % (14, 15). Galaktomanani so nevtralni polisaharidi brez ionskih lastnosti. Pri sobni temperaturi in nizki vlaænosti so kemijsko stabilni, pri visokih temperaturah in ekstremnih pH vrednostih pa so podvræeni oksidativni depolimerizaciji. V vodnih raztopinah brez dodatka antioksidanta delno razpadejo æe po nekaj dneh, kar zaznamo kot padec viskoznosti raztopine. Viskoznost je tako parameter, s katerim lahko doloœamo kakovost lbg. Na trgu so prisotne razliœne oblike lbg, od moke, pridobljene z mletjem celih semen, do visoko preœiøœenega izdelka, ki vsebuje manj kot 2 % neœistot. Glavna pomanjkljivost nepreœiøœenega lbg je manjøa stabilnost zaradi delovanja endogenih encimov (14). Vodne koloidne raztopine lbg poveœajo viskoznost sistemov. Pri izdelavi tablet se lbg uporablja kot vezivo (5, 6, 14). 4 Interakcije ksantana in semenske sluzi roæiœevca v vodnih sistemih Xan tvori v vodnih sistemih øibke gele, lbg pa koloidne polimerne raztopine. Ob dispergiranju xan v vodi se med seboj najverjetneje povezujejo vijaœnice v nativni konformaciji in tvorijo gelsko reøetko. Poleg nativne oblike naj bi bili v vodi prisotni tudi denaturirani deli vijaœnic, ki omogoœajo solvatacijo le-te (5, 10). Interakcije med molekulami lbg v vodi so øibke, saj se med seboj povezujejo le nesub-stituirani deli manoznih verig. Substituirana in nesubstituirana obmoœ-ja molekule lbg so nakljuœno razporejena, zato je intermolekularno povezovanje oteæeno. Nastane koloidna polimerna raztopina (5, 10). Dispergiranje zmesi xlbg v vodi privede do nastanka œvrste trodimezionalne gelske strukture, kar so prvi raziskovalci opazili æe v zgodnjih 70-ih letih. Domnevali so, da je sinergizem posledica t.i. »izkljuœitvenega uœinka«, pogosto opaæenega pri zmeseh polimerov. Nezdruæljivost obeh polimerov naj bi namreœ pripeljala do nastanka podroœij, v katerih bi bile prisotne le molekule enega polimera, s œimer bi se njegova koncentracija lokalno zviøala in bi gel nastal hitreje (15). Novejøe teorije razlagajo sinergistiœno tvorbo meøanega gela s prisotnostjo ustreznega razmerja dveh podroœij, ki sta sestavljeni iz: • dolgih, strukturno in konformacijsko pravilnih odsekov polimernih verig, ki zagotavljajo medmolekulske povezave ter farm vestn 2005; 56 111 Pregledni œlanki - Review Articles • neasociiranih, konformacijsko nepravilnih delov molekul, ki so vrinjeni med pravilne odseke in sluæijo za solvatacijo polimera. Strukturno pravilne dele tvorijo molekule xan z nesubstituiranimi deli verige lbg, nepravilne pa prispeva lbg (substituirane regije) (slika 5) (5, 15, 17, 18, 19, 20). Slika 5. Shematski prikaz molekularnih interakcij ksantana (œrtkana œrta) s semensko sluzjo roæiœevca (polna œrta). Figure 5. Shematic presentation of molecular interaction between xan-than (broken line) and locust bean gum (ful line). Dea in sodelavci (15) so na podlagi reoloøkega vrednotenja sistemov xlbg predvidevali, da se molekule xan v nativni konformaciji (ki je bila po njihovem mnenju dvojna vijaœnica, sestavljena iz ene verige xan) povezujejo z nesubstituiranimi deli verig lbg, s katerimi tvorijo visoko specifiœne interakcije. Narava teh visoko specifiœnih interakcij ni poznana, na njihovo prisotnost pa so sklepali, ker zmes lbg z nekaterimi drugimi bakterijskimi eksopolisaharidi iz vrst Arthrobacter ni tvorila gela in je bil tudi sinergizem med xan in guar gumijem oz. mananom iz gomolja Amorphophallus konjac (rastlinskima galaktomananoma) slabo izraæen (15). a / \ b r Slika 6. Shematski prikaz moænih molekularnih interakcij ksantana (I) s semensko sluzjo roæiœevca (II): a-nespremenjen xan, b-deacetiliran xan (21). Figure 6. Shematic presentation of possible molecular interaction between xanthan (I) and locust bean gum (II): a-unmodified xan, b-deacetylated xan (21). 112 farm vestn 2005; 56 Skupina japonskih znanstvenikov je z reoloøkim prouœevanjem jakosti meøanih gelov xlbg z razliœno stopnjo acetiliranosti xan nadalje razvijala teorijo Dea in sodelavcev. Dokazali so, da je nastal moœnejøi gel œe je imel xan manjøi deleæ acetiliranih stranskih verig. Acetilni ostanki namreœ pripomorejo k boljøemu povezovanju molekul xan med seboj, istoœasno pa oteæujejo povezovanje z molekulami lbg (slika 6) Povezovanje med xan in lbg je podobno medmolekulskemu povezovanju pri sistemu encim - substrat, saj so za interakcije potrebne toœno doloœene konformacije molekul (21) Ko se je kot model nativne konformacije xan uveljavila dvojna vijaœni-ca, sestavljena iz dveh molekul xan, so se mnenja raziskovalcev o strukturi, ki tvori medmolekulske povezave z lbg, razdelila. Nekateri avtorji dokazujejo, da so pri tvorbi meøanih struktur udeleæene molekule xan v nativni konformaciji, drugi pa da so to denaturirane molekule (5,16-19). Novejøe raziskave nakazujejo moænost, da za nastanek meøanega gela ni pomembna le sekundarna struktura xan ampak tudi prisotnost drugih snovi, npr. proteinov in nekaterih organskih neœistot nepolarnega znaœaja, preko katerih se molekule polisa-haridov povezujejo med seboj (8, 22) Zmes polimerov xan in lbg (xlbg), se æe vrsto let uporablja v prehrambeni industriji, v zadnjem œasu pa sreœujemo to kombinacijo tudi v farmaciji, zlasti pri oblikovanju ogrodnih tablet s prirejenim sproøœanjem V vodnem mediju polimera nabrekata in sinergistiœno tvorita gelski sloj okoli tablete, ki zadræuje sproøœanje uœinkovine. Meøani xlbg gel je tudi nosilni sistem za uœinkovine za rektalno aplikacijo (5 15, 17-20) 5 Vrednotenje vodnih sistemov polisaharidov Vodne sisteme polisaharidov lahko vrednotimo z razliœnimi tehnikami rotacijsko in oscilacijsko reometrijo, nuklearno magnetno resonanco (NMR), cirkularnim dihroizmom, diferenœno dinamiœno kalorimetrijo (DSC), mikrokalorimetrijo, mikroskopijo na atomsko silo (AFM), idr. Z oscilacijskim merjenjem dinamiœne viskoznosti in viskoelastiœnih modulov doloœamo jakost povezav med molekulami polimerov, z rotacijsko reometrijo pa opazujemo razpad struktur pod vplivom razliœno velikih striænih sil. S pomoœjo NMR lahko zelo uspeøno prouœujemo molekulsko konformacijo polisaharidnih polimerov v vodnih sistemih Rezultati meritev cirkularnega dihroizma nam podajajo informacije o spremembah geometrijskega okolja doloœenih funkcionalnih skupin ki absorbirajo svetlobo v izbranem valovnem obmoœju. Z DSC preuœujemo termiœno obnaøanje polisaharidov. AFM posnetki vodnih disperzij polisaharidov omogoœajo boljøe poznavanje interakcij med polimeri ter med polimeri in topilom (8, 15, 23). Strukturna analiza ogljikovih hidratov je izjemno kompleksna in zahteva kombinacijo fizikalnih (spektroskopske tehnike) in kemijskih metod (hidrolize delne hidrolize, tvorba derivatov, kontrolirana razgradnja…) (4) Za rutinsko pridobivanje osnovnih podatkov o vodnih sistemih polisaharidov najpogosteje uporabljamo razliœne reoloøke tehnike in mikrokalorimetrijo Oscilacijska reometrija Z oscilacijsko reometrijo pridobimo podatke o strukturiranosti in jakosti nastalih gelov. Z naraøœanjem øtevila in moœi interakcij med molekulami polimerov se namreœ veœajo vrednosti dinamiœnih mod- Interakcije ksantana in semenske sluzi roæiœevca v vodnih sistemih ulov, dobljenih z oscilacijskim merjenjem v linearnem viskoelastiœnem obmoœju sistema. To je obmoœje, v katerem ne pride do poruøitve strukture sistema, deformacija in hitrost deformacije pa sta tako majhni, da lahko zveze med napetostjo in deformacijo zapiøemo s pomoœjo linearnih diferencialnih enaœb s konstantnimi koeficienti – dinamiœnimi (viskoelastiœnimi) moduli, ki predstavljajo zapis linearnega viskoelastiœnega obmoœja (24). Vodne sisteme polisaharidov obiœajno opiøemo s frekvenœno odvisnostjo elastiœnega (G’) in viskoznega (G’’) modula (slika 7). Elastiœni modul je merilo elastiœne-ga obnaøanja sistema in karakterizira njegovo upiranje preoblikovanju. Podaja koliœino energije, ki jo sistem reverzibilno shrani in uporabi za vrnitev v prvotno stanje. Viskozni modul opisuje viskozno obnaøan-je sistema in predstavlja tisto koliœino energije, ki jo sistem ireverzibil-no odda okolici, zato je zanj izgubljena in je ne more uporabiti za kom-penziranje deformacije (24). 1 10 100 frekvenca (Hz) Slika 7. Frekvenœna odvisnost dinamiœnih modulov 2-% vodne disperzije xlbg (razmerje xan: lbg = 1 : 1), xan in lbg. Priprava vzorca: v preœiøœeni vodi s temperaturo 85 °C. Pogoji merjenja: amplituda deformacije: 0,1, temperatura merjenja: 37 °C. Figure 7. Dynamic modulus as a function of frequency shown for 2-% water dispersions of xlbg (ratio xan: lbg = 1 : 1), xan and lbg. Preparation of a sample: in purified water at 85 °C. Experimental conditions: strain: 0,1, temperature: 37 °C Slika 7 prikazuje 2-% vodni sistem xan, lbg in njune zmesi. Majhna frekvenœna odvisnost obeh modulov ter veœje vrednosti G’ od G’’ v celotnem frekvenœnem obmoœju nakazujeta nastanek gela (slika 7 -xan in xlbg). Za sisteme, ki jih opredelimo kot gele, velja, da viøji vrednosti dinamiœnih modulov pomenita veœjo strukturiranost le-teh. Iz slike 7 lahko torej ugotovimo, da tvori zmes xlbg moœnejøi gel kot sam xan pri istih pogojih V primeru, da sta G’ in G’’ v celotnem frekvenœnem obmoœju odvisna od frekvence, vzorec ni gel, ampak koloidna raztopina polimera (slika 7 - lbg). Pomemben podatek pri vrednotenju gelov je frekvenca, pri kateri se modula prekriæata - t. i. toœka kriæanja (crossover point). Pri frekvencah, niæjih od le-te, je viskozni modul viøji od elastiœnega, pri viøjih frekvencah pa je elastiœni modul viøji od viskoznega (primer: 2-% lbg na sliki 7). Pri øibkeje strukturiranih sistemih se toœka kriæanja pojavlja pri viøjih frekvencah (7) Z analizo vpliva lastnosti izhodnih polimerov in medija ter priprave vzorca na strukturiranost vodnih disperzij xlbg lahko predpostavimo mehanizem nastanka meøanih gelov na molekularnem nivoju (5, 7, 15 16, 17, 19, 20) Mikrokalorimetrija Pri mikrokalorimetriji merimo toplotni tok v ali iz vzorca pri nadzorovanem segrevanju. Konœni rezultat analize je termogram, tj. temperaturna odvisnost razlik toplotnih tokov vzorca in reference. Z analizo termograma pridobimo podatke o temperaturi, pri kateri pride do sprememb in entalpiji nastale spremembe (25). S slike 8 je razvidno, da se s spreminjanjem razmerja med xan in lbg ter medija, v katerem je bil gel pripravljen, spreminjata tako temperatura kot entalpija eksotemnih vrhov (26). S primerjavo termogramov so ugotovili, da se z viøanjem koncentracije elektrolita pri istem razmerju med polimeroma zmanjøuje entalpija eksotermnega vrha, ker se manjøa deleæ denaturiranega xan. Entalpija vrha naj bi namreœ predstavljala energijo, sproøœeno ob prehodu denaturirane oblike xan v renaturirano. V primeru d (slika 8) na termogramu niso zaznali vrha, saj se je ves denaturiran xan vezal z lbg (26). ¦i-------------1——i-------------1--------------i-------------1------------- 10 20 30 K 50 60 70 Temperatura (°C) Slika 8. Termogrami zmesi xan (c = 1 g/l) in lbg (c = 0,3 g/l), dobljeni z ohlajanjem sistema s hitrostjo 0,5 °C/min v: a - preœiøœeni vodi, b – 5 mM NaCl, c - 100 mM NaCl in d - zmesi xan (c = 1 g/l) in lbg (c = 0,5 g/l) v 5 mM NaCl (26). Figure 8. Thermograms of xan (c = 1 g/l) mixed with lbg (c = 0,3 g/l) during cooling (0,5 °C/min) in: a - water, b – 5 mM NaCl, c - 100 mM NaCl or d - with lbg (c = 0,5 g/l) in 5 mM NaCl (26). 6 Zakljuœek V farmaciji izkoriøœamo zmes polimerov xan in lbg predvsem za izdelavo tablet s prirejenim sproøœanjem. Na podlagi poznavanja lastnosti xan in lbg ter predvidevanja mehanizma tvorbe meøanega xlbg gela na osnovi izsledkov mikrokalorimetrije in reometrije lahko napovemo strukturiranost xlbg gela v izbranem mediju in s tem posredno obnaøanje in/ali uœinek zmesi obeh polisaharidov v razliœnih farmacevtskih oblikah. Z omenjenima metodoma spremljamo vpliv sekundarne strukture obeh polisaharidov na jakost gelov, rezultati novejøih, bolj obœutljivih tehnik pa nakazujejo na to, da je tvorba meøanih gelov na molekularnem nivoju bolj zapletena, saj naj bi na gelsko strukturo vplivale tudi potencialno prisotne organske neœistote. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles 7 Literatura 1. Zohuriaan MJ, Shokrolahi F. Thermal studies on natural and modified gums. Poly test 2004; 23: 575-579. 2. Umek A. Farmakognozija - øtudijsko gradivo. Ljubljana: Fakulteta za farmaci- jo, 2002: 21-26. 3. Tiøler M. Organska kemija. 3rd ed. Ljubljana: Dræavna zaloæba Slovenije, 1991: 365-368 4. Gunnar S. Drugs of natural orign. 47th ed. Stockholm: Apotekarsocieten,1999: 35-43. 5. Born K, Langerdorff V, Boulenguer P. Xanthan. In: Polysaccharides I Polysaccharides from prokarionts. Ed. Vandemene EJ, De Baets S, Steinbuechel A. Weinheim: Willey – VCH Verlag, 2002: 259-290. 6. Friedler HP. Encyclopedia of excipients: for pharmaceuticals, cosmetics and related areas. 5th Ed., Aulendorf: ECV, 2002: 123,124, 691-693. 7. Rochefort EW, Middleman S. Rheology of Xanthan gum: Salt, Temperature, and Strain Effects In Oscilatory and Steady Shear Experiments. Journal of Rheology, 1987; 31: 337-369. 8. Capron I, Alexandre S, Muller G. An atomic force microscopy study of the molecular organisation of xanthan. Polymer 1998; 23: 5225-5730. 9. Ruissen ALA, van der Reijden WA, van’t Hof W et al. Evaluation of the use of xanthan as vehicle for cationic antifungal peptides. J Control Release 1999; 60: 49-56 10. Talukdar MM, Kinget R. swelling and drug release behaviour of xan gum matrix tablets. Int J Pharm 1994; 120: 63-72. 11. Corveleyn S, Remon JP. Formulation and production of rapidly disintegrat- ing tablets by lyophilisation using hydrochlorothiazide as a model drug. Int J Pharm 1997; 152: 215-225. 12. Lii CY, Liaw SC, Ali VMF et al. Xanthan gum-gelatin complexes. Eur Polymer J 2002; 38: 1377-1381. 13. Corveleyn S, Remon JP. Bioavailability of hydrochlorothiazide: conventional versus freeze-dried tablets. Int J Pharm 1998; 173: 149-155. 14. Dierckx S, Dewettinck K. Seed gums. In: Polysaccharides II Polysaccharides from eukarionts. Ed. Vandemene EJ, De Baets S, Steinbuechel A. Weinheim: Willey – VCH Verlag, 2002: 321-343. 15. Dea CM, Morris ER, Rees DA et al. Association of like and unlike polysac- charides: Mechanism and specifity in galaktomannans, interacting bacterial polysaccharides, and related systems. Carbohydr Res 1977; 57: 249-279. 16. Copetti G, Grassi M, Lapasin R et al. Synergistic gelation of xanthan gum with locust bean gum: a rheological investigation.Glycoconjugate journal 1997; 14: 951-961. 17. Zhan DF, Ridout MJ, Browsnwy GJ et al. Xanthan-locust bean interactions and gelation Carbohydr Poly 1993; 21: 53-58. 18. Watanabe K, Yakou S, Takayama K et al. Rectal absorption and mucosal irri- tation of rectal gels containing buprenorphine hydrochloride prepared with water-soluble dietary fibers, xanthan gum and locust bean gum. J Control Release 1996; 38: 29-37. 19. Pai VB, Khan SA. Gelation and rheology of xanthan/enzyme-modified guar blends. Carbohydr Poly 2002; 49: 207-216. 20. Lundin L, Hemansson AM. Supramolecular aspects of xanthan-locust bean gum gels based on rheology and electron microscopy. Carbohydr Poly 1995; 26: 129-140. 21. Tako M, Nakamura S. D-Mannose-specific interaction between xanthan and D-galacto-D-mannan. Agric Biol Chem 1986; 48: 2995-3000. 22. Schorsch C, Garnier C, Doublier JL. Microscopy of xanthan/galactomannan mixtures. Carbohydr Poly 1996; 28: 319-323. 23. Gells and Jellies In Encyclopedia of Pharmaceutical Technology Volume 7. 7th ed. Ed. Swarbick J, Boylan BC. New York, Hong Kong, Basel: Dekker M., 1992: 415-424. 24. Æumer M, Zupanœiœ Valant A, Florjanœiœ U et al. Seminar iz aplikativne reologije. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko inæenirstvo, Katedra za kemijsko inæenirstvo, 1997: 7-13, 20-22, 30-41. 25. Planiøek O, Zajc N, Srœiœ S.: Uporaba diferenœne dinamiœne kalorimetrije v farmaciji. Farm vestn 2001; 52: 173-185. 26. Goycolea FM, Milas M, Rinaudo M. Associative phenomena in galactoman- nan-deacetylated xanthan systems. Int J Biol Macromolecules 2001; 29: 181-192. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Doloœanje mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma The mouse lymphoma mutagenicity assay (MLA) Andreja Plaper POVZETEK: V vsakdanjem æivljenju smo izpostavljeni øtevilnim kemikalijam, ki na naø organizem delujejo z razliœno mero økodljivosti. Ena od toksiœnih potencialov kemikalij je genotoksiœnost. V prispevku je opisana ena od metod, s pomoœjo katere prikaæemo in ovrednotimo genetske poøkodbe na sesalski celiœni liniji miøjega limfoma L5178Y tk (klon 3.7.2C). Celiœna linija je heterozigotna na Tk1 lokusu timidinske kinaze kromosoma 11. Mutacija v tem predelu kromosoma in inaktivacija tk alela povzroœi izgubo aktivnosti tega encima in s tem pridobitev rezistence na tri-fluorotimidin (TFT). Tako lahko mutante tk loœimo od nemutiranih celic. Mutirane celice, ki rastejo v selektivnem gojiøœu s TFT, kvantifici-ramo po doloœenem œasu, v katerem izrazijo svojo novo fenotipsko lastnost. Namen in cilj metode je prikazati potencial testne substance, da nducira mutacije na lokusu tk tk . Metoda je ena od testov mutagenosti, ki jih regulatorne organizacije uvrøœajo v standardno skupino testov za doloœanje genotoksiœnega potenciala zdravilnih uœinkovin, ki morajo biti izvedeni pred registracijo. Kljuœne besede: mutagenost, celice miøjega limfoma, L5178Y, rezistenca na TFT. SUMMARY: In everyday life we are exposed to many chemicals which express different toxic potential to our organism. One of them is geno-toxicity. In this paper, one of the methods which help to determine the genotoxic potential of chemicals is described. The method is mutagenicity assay on mouse lymphoma cell line (L5178Y tk 3.7.2C), heterozygous at the thymidine kinase locus (Tk1) on chromosome 11. Mutation on this part of the chromosome and inactivation of the tk allele induces trifluorothymidine (TFT) resistance, and tk mutants can be selected in a background of tk non-mutant cells. Mutant cells, grown in the media containing the selective substance TFT, are quantified after a certain period of time, during which the cells express the new phenotypic characteristic. The purpose and aim of the test method is a demonstration of the test material potential to induce forward mutations at the tk tk locus. The method is one of the mutagenicity tests included in the standard test battery for genotoxicity by regulatory agencies, and is obligatory for marketing authorisation of pharmaceuticals. Keywords: mutagenicity, mouse lymphoma cells, L5178Y, TFT resistance; OKRAJØAVE: TFT, tri-fluorotimidin; ATCC, American type culture collection; ICH, International conference on harmonisation of technical requirements for registartion of pharmaceuticals for human use - Mednarodna konferenca za harmonizacijo tehniœnih zahtev za registracijo farmacevtskih uœinkovin za humano uporabo; TK, timidinska kinaza; OECD, Organisation for Economic Co-operation and Development - Organizacija za ekonomsko sodelovanje in razvoj; DMSO, dimetil sulfoksid; R0P, gojiøœe RPMI 1640 z antibiotikom, natrijevim karbonatom in pluronikom F68; R5P, gojiøœe R0P s 5-odstotnim konjskim serumom; R10P, gojiøœe R0P z 10-odstotnim konjskim serumom; CM (cloning medium), gojiøœe za kloni-ranje: R0P z 20-odstotnim konjskim serumom, natrijevim piruvatom in antimikotiki; THGM, timidin, hipoksantin, glicin metotreksat,; THG, timidin hipoksantin, glicin; TMP, timidin monofosfat; UKEMS, United Kingdom Environmental Mutagen Society. 1 Uvod Mutageni potencial neke snovi pomeni zmoænost indukcije dedne spremembe genetskega materiala v celici ali organizmu. Mutacija lahko vkljuœuje en sam gen ali pa skupino genov. Genotoksiœnost je øirøi pojem. Razumemo ga kot zmoænost interakcije kemikalije z DNA ali s celiœnim aparatom, ki je vkljuœen v razmnoæevanje genoma (npr. topoizomeraze, delitveno vreteno). Za odobritev uporabe razliœnih kemikalij in proizvodov (pesticidov, kozmetiœnih preparatov, prehrambenih izdelkov in farmacevtikov) regulatorne agencije zahtevajo razliœne skupine genotoksiœnih testov. Kadar ocenjujemo mutagenost oz. genotoksiœnost kemikalije, moramo upoøtevati razliœne konœne uœinke takega delovanja: toœkaste mutacije na molekuli DNA, spremembe v øtevilu (poliplodija, aneuplodija) ali strukturi kromosomov (klastogeneza). Zato seveda preskuøanje genotoksiœnega potenciala uœinkovine z enim testom ne zadoøœa. Kombinacija primernih testov zagotavlja varno uporabo doloœenih kemikalij za ljudi. Med stroæje zakonodajne predpise gotovo sodijo smernice za varno uporabo zdravilnih uœinkovin. Primer predpisane skupine testov za testiranje genotoksiœnosti farmacevtikov vsebuje tri postopke. Prvi je in vitro test povratnih mutacij na bakterijah (Salmonella sp. ali Escherichia sp.), za katerega se je izkazalo, da zazna odgovarjajoœe genetske spremembe za veœino genotoksiœnih glodalskih karcinogenov (1). Druga, tudi in vitro metoda, je doloœanje genskih poøkodb na celicah miøjega lim- dr. Andreja Plaper, KRKA, d. d., Ømarjeøka cesta 6, 8501 Novo mesto farm vestn 2005; 56 115 Pregledni œlanki - Review Articles foma (MLA - mouse lymphoma assay) ali alternativno, test za cito-genetsko vrednotenje kromosomskih poøkodb. Ena ali druga metoda je obvezna v predpisani skupini. Testi na sesalskih celicah zaznajo poøkodbe na DNA, ki jih na bakterijskih celicah ne moremo zaznati (klastogeni uœinki, kromosomske aberacije). Postopki na sesalskih celicah so pomembno dopolnilo predvsem za tiste snovi, ki imajo negativen rezultat na bakterijskem testu za doloœanje mutagenosti. Obvezen v predpisani skupini genotoksiœnih testov je tudi eden od in vivo testov. Ta namreœ zagotovi model, v katerem so vkljuœeni dodatni faktorji, ki vplivajo na genotoksiœno aktivnost spojin. Ti faktorji so absorpcija, distribucija, metabolizem in izloœanje snovi. Za ta namen je primeren in vivo test za zasledovanje kromosomskih poøkodb na glodalskih hematopoietiœnih celicah, ki je lahko analiza kromosomskih aberacij na celicah kostnega mozga ali analiza mikronukleusov v kostnem mozgu ali eritrocitih periferne krvi. Øele kombinacija naøtetih in vitro in in vivo metod zagotavlja konœno oceno varnosti uporabe neke snovi za œloveka. Namen prispevka je prikazati eno od metod, ki so predpisane v obvezni skupini testov za doloœanje genotoksiœnega potenciala kemikalij - metodo doloœanja genskih mutacij na celicah miøjega lim-foma (MLA). Metoda je validirana in se vrsto let uporablja za preizkuøanje mnogih kemikalij (2–7). Testiranje mutacij na speci-fiœnem lokusu sesalskih celic in vitro lahko uporabljamo za prikaz in kvantifikacijo genetskih poøkodb. V prispevku so podani: status metode, zakonodajne zahteve, protokol za izvedbo metode in kriteriji za analizo in evalvacijo rezultatov. 1.1 Zgodovina nastanka mutirane celiœne linije Od leta 1964 so znanstveniki v kulturah sesalskih celic inducirali mutacije, med drugim z namenom, da bi pripravili celiœne linije, na katerih bi bilo mogoœe opazovati mutageni potencial kemikalij (8, 9). Heterozigotni sistem timidinske kinaze, kjer je tk+ lokus mutiran v tk-lokus, je leta 1972 opisal Clive s sodelavci (10) in temelji na celiœni liniji miøjega limfoma, ki jo je osnoval Fisher leta 1958 (11). Bolj natanœen opis testa je Clive s sodelavci objavil leta 1975 (11). Obstajata dve metodi za izvajanje testa: pomnoæevanje (kloniranje) celic v mehkem agarju in novejøa, suspenzijska metoda, ki jo izvajamo v mikrotitrskih ploøœicah (14). +/- 1.2 Genetska osnova testa V MLA uporabljamo celiœno linijo miøjega limfoma L5178Y TK+/- (klon 3.7.2C), ki je heterozigotna v lokusu timidinske kinaze (Tk1) na kromosomu 11. Celice z aktivno timidinsko kinazo (TK) reagirajo na cito-statiœne in citotoksiœne uœinke trifluorotimidina (TFT), tako da odmrejo. Povratne mutacije aktivnega gena TK povzroœijo izgubo aktivnosti tega encima in s tem pridobitev rezistence na TFT. Mutirane celice torej lahko rastejo v prisotnosti TFT, medtem ko normalne celice ne morejo. Mutante kvantificiramo po doloœenem œasu, v katerem izrazijo novo fenotipsko lastnost tako, da jih razmnoæujemo v gojiøœu, ki mu dodamo selektivno substanco TFT (10, 11, 12). 1.3 Zakonodajne zahteve Vrednotenje genotoksiœnega potenciala neke snovi, ki ga zahtevajo mednarodne regulatorne agencije, je doloœeno v razliœnih dokumen- tih. Za registracijo farmacevtskih uœinkovin moramo upoøtevati zahteve in navodila Organizacije za ekonomsko sodelovanje in razvoj (OECD) (15) in Mednarodne konference za harmonizacijo tehniœnih zahtev za registracijo farmacevtskih uœinkovin za humano uporabo (ICH). ICH je v okviru svojih navodil izdala dve poglavji, ki doloœata izbor metod za doloœanje genotoksiœnosti in navodila za izvajanja teh metod: S2A – Navodilo za specifiœne vidike veljavnih genotoksiœnih testov za farmacevtike (16) in S2B – Standardna skupina testov za doloœanje genotoksiœnosti (17). OECD doloœa pravila izvajanja metode MLA v poglavju 476 (15). 2 Postopek +/- 2.1 Celice Za MLA uporabljamo celice miøjega limfoma, klon L5178Y TK 3.7.2C, ki ga lahko kupimo v zbirki ATCC (CRL-9518) ali zbirki Jane Cole, UK. Celice uvrøœamo v varnostni razred 1 (biosafety level: 1) kar pomeni, da je delo s celicami varno z upoøtevanjem obiœajnih pravil ravnanja z bioloøkim materialom v laboratoriju. Celice rastejo v suspenzijski kulturi z generacijskim œasom 11 ur. Imajo stabilno øtevilo diploidnih kromosomov (11) 2.2 Metaboliœna aktivacija Navodila OECD zahtevajo izvajanje MLA v prisotnosti in odsotnost metaboliœne aktivacije. Za metaboliœno aktivacijo uporabljamo encime, ki jih pridobimo iz podganjih jeter, induciranih z znanim induktorji citokromov P450 (Na-fenobarbiton, (3-naftoflavon ali aroclor 1254). Pripravimo postmitohondrijsko frakcijo sesalskih jeter (S9), ki jo v konœnem testnem vzorcu dodamo od 1 % do 10 %. S9 je na voljo komercialno (Molecular Toxicology, Boone, NC, USA) ali jo pripravimo sami po postopku, ki ga je opisal Ames s sodelavci (18) 2.3 Gojiøœa in pogoji za vzgojo celic Za gojenje celic uporabljamo gojiøœe RPMI 1640 z glutaminom (0,3 g/l) brez natrijevega karbonata, ki ga dodajamo naknadno do 0,11 % (R0P). Za razliœne namene v poskusu dodajamo toplotno inaktiviran konjski serum: 5 % v gojiøœe, v katerem celicam dodajamo testno substanco (R5P), 10 % v gojiøœe za gojenje celic (R10P) in 20 % v gojiøœe za pomnoæevanje celic (CM). Obvezno dodajamo tudi pluronik F68 (0,5 %), ki zagotavlja suspenzijsko rast celic (6) in antibiotik. Gojiøœu za razmnoæevanje celic poleg 20 % seruma dodamo tudi antimikotik in Na-piruvat (1,9 mM) Selektivno gojiøœe V testu uporabljamo dve selektivni gojiøœi: gojiøœe za razmnoæevanje celic z dodatkom TFT (tri fluoro timidin), ki zagotavlja kvantifikacijo in karakterizacijo mutant TK , in THGM, oœiøœevalno gojiøœe, ki odstran spontane mutante in optimizira obœutljivost metode. Sestava THGM je naslednja: timidin (0,03 %), hipoksantin (0,05 %), glicin (0,075 %) metotreksat (10 µg/ml) 2.4 Odstranjevanje spontanih mutant + - - - Heterozigotne celice tk tk v suspenziji spontano mutirajo v tktk z mutacijsko frekvenco 2 x 10 mutacij na generacijo (12, 13) Homozigotne mutante moramo pred poskusom odstraniti 116 farm vestn 2005; 56 Doloœanje mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma Odstranitev spontanih tk-/- mutant omogoœa metoda s posebnim gojiøœem THGM. Gojiøœe vsebuje metotreksat, ki inhibira timidilatno sintazo odvisno od folata in s tem sintezo timidin monofosfata. Celice so zato prisiljene uporabljati zunajceliœni timidin, ki pa ga mora fosfo-rilirati timidinska kinaza. Homozigotne mutante TK-/- ne morejo fosfo-rilirati eksogenega timidina in odmrejo zaradi pomanjkanja TMP. Drugi dve sestavini gojiøœa sta hipoksantin in timidin, ki ju dodamo zato, da nadomestimo blokado metabolizma folata in posredno sintezo puri-nov. Glicin dodamo kot vir metilnih skupin (13). Celice rastejo v gojiøœu THGM 24 ur, nato jih speremo in resuspendiramo v THG (THGM brez metotreksata). Oœiøœene celice uporabimo za eksperiment, preostanek zavræemo. 3 Doloœanje mutagenosti 3.1 Topnost testnega materiala Topnost testne substance preizkusimo v razliœnih topilih. Za topne substance je najviøja koncentracija, ki jo izberemo, odvisna od tok-siœnosti le-te, vendar ne sme presegati koncentracije 5 mg/ml. Organska topila naj ne bi presegala 1 % skupnega volumna vzorca. 3.2 Testiranje toksiœnosti substance Odmerki uœinkovine za testiranje mutagenosti morajo segati do tok-siœnih koncentracij. Najviøje uporabljene koncentracije dovoljujejo preæivetje v obmoœju od 10-20 % glede na vzporedne kontrole, ki vsebujejo le topilo. Pred testom mutageneze doloœimo toksiœni potencial substance z meøanico S9 in brez nje. Za test uporabimo nasiœeno raztopino substance in øe 8 razredœitev. Celice izpostavimo substanci tako, kot je doloœeno v testu mutagenosti, le da v tem primeru ne delamo v duplikatu. Po tretiranju doloœimo gostoto celic s hemocito-metrom, prilagodimo koncentracijo do 8 celic/ml in po 0,2 ml zaseje-mo na 2 mikrotitrski ploøœi s 96 vdolbinami. Kulture inkubiramo 9 dni na 37 °C v 5-% CO2 atmosferi. Øtevilo negativnih vdolbin po 9 dneh in gostota celic, ki jo doloœimo po tretiranju s substanco, sluæita za izraœun relativnega preæivetja (RS - relative survival)) za vsako celiœno kulturo na dan 0. 3.3 Test mutagenosti Naredimo dva popolna testa mutagenosti v prisotnosti in odsotnosti meøanice S9. Vse kulture, ki jih izpostavimo testni substanci, pozitivnim in negativnim kontrolam, tretiramo v duplikatu. V prvem poskusu izberemo 6 koncentracij. Najviøja koncentracija za prvo testiranje je tista, ki inducira skoraj 100-% smrtnost celic. Dodatne koncentracije izberemo z namenom, da bi dobili rezultate za kritiœne toksiœne koncentracije, tj. v obmoœju od 10-20 % preæivetja. Za netoksiœne substance najviøja koncentracija navadno ne presega 5 mg/ml. Za drugi poskus lahko koncentracije spremenimo, tako da doseæemo ustrezen nivo toksiœnosti. 3.3.1 Pozitivna in negativna kontrola Negativna kontrola so celiœne kulture, ki jih obdelamo popolnoma enako kot kulture v testu, le da namesto substance dodajamo topilo, v katerem raztapljamo preizkuøanec. Kot pozitivno kontrolo lahko uporabimo razliœne mutagene. Pozitivna kontrola, ki potrebuje metaboliœno aktivacijo z meøanico S9, je za indukcijo malih in velikih kolonij obiœajno 3-metilkolantren (3-MC topen v DMSO). Konœna koncentracija v celiœni kulturi je 2,5 µg/ml Mutagena kemikalija, ki ne potrebuje metaboliœne aktivacije, je za indukcijo velikih kolonij, etilmetan sulfonat (EMS), katerega konœna koncentracija v kulturi je 250 µg/ml. Za indukcijo malih kolonij pa uporabljamo metilmetan sulfonat do konœne koncentracije 15 µg/ml 3.3.2 Tretiranje kultur V gojiøœu, ki ga uporabljamo ob tretiranju, zmanjøamo nivo seruma do 5 %, ker previsoka koliœina seruma lahko zabriøe uœinek nekaterih mutagenov (12). Za vsako pozitivno in negativno kontrolo ter vsako testno koncentracijo pripravimo po dve centrifugirki. V vsak par cen-trifugirk dodamo odgovarjajoœo koliœino gojiøœa, celice do koncentracije 6 x 10 celic/ml, meøanico S9 oz. gojiøœe, pozitivno kontrolo oz. topilo ali eno od koncentracij preizkuøanca. Vse epruvete inkubiramo na rolerju 4 ure pri 37 °C. Odvzamemo majhen vzorec celic (~0,2 ml) iz vsake kulture in doloœimo øtevilo celic (øtevilo celic dneva 0). Celice nato speremo z 20 ml gojiøœa R10P in resuspendiramo v R10P do gos- 5 tote ~ 3x10 celic/ml. Del kultur razredœimo v gojiøœu CM do koncentracije 8 celic/ml. V vsako vdolbino na ploøœici zasejemo po 200 µ razredœene kulture. Inkubiramo v CO2 inkubatorju 9 dni. Relativno preæivetje doloœimo na enak naœin, kakor je opisano pri testiranju toksiœnosti Naslednji dan celice ponovno preøtejemo (øtevilo celic na dan 1) in jih razredœimo tako, da imajo gostoto ~ 3x10 celic/ml. Kulture damo nato nazaj v inkubator, kjer jih pustimo øe en dan Tretji dan (dan 2) celice spet preøtejemo. Vse pozitivne in negativne kontrole ter tiste kulture, ki so bile izpostavljene øtirim najviøjim koncentracijam testne substance in imajo najmanj 3x10 celic/ ml, izberemo za izraæanje genetskih poøkodb 3.3.3 Izraæanje genetskih poøkodb Uœinkovitost kloniranja Vsako kulturo razredœimo v gojiøœu za pomnoæevanje celic (CM) do 8 celic/ml. Po 200 µl kulture odpipetiramo na mikrotitrske ploøœe s 96 vdolbinami Selekcija mutant Selekcijo mutant izvedemo tako, da h gojiøœu CM dodamo TFT (3 µg/ml). Celice resuspendiramo v selekcijskem gojiøœu (1x10 celic/ml) in razdelimo po 200 µl na mikrotitrske ploøœice s 96 vdolbinami Vse ploøœe inkubiramo pri 37°C v atmosferi 5 % CO2, 95 % zraka (v/v) dokler se kolonije popolnoma ne razvijejo (9 dni za doloœanje uœinkovitosti kloniranja in 12 dni za selekcijo mutant). Po konœanem poskusu pregledamo ploøœe pod lupo z osvetljeno podlago. Na ploøœah poskusa uœinkovitosti kloniranja (iz dneva 2) po devetih dneh preøtejemo prazne jamice. Izraœunamo uœinkovitost kloniranja (cloning efficiency-CEnemutante) Na ploøœah poskusa selekcije mutant po 12 dneh preøtejemo vdolbine, ki imajo male kolonije, in vdolbine, ki vsebujejo velike kolonije. Izraœunamo øtevilo praznih vdolbin. Molekularna osnova za velike in male kolonije øe ni povsem razjasnjena. Ena hipoteza predpostavlja gen, ki kontrolira celiœno rast in naj bi bil blizu Tk1 gena (19) farm vestn 2005; 56 1 Pregledni œlanki - Review Articles Poøkodba kromosoma v tem delu naj bi vodila do upoœasnjene rasti celice. Ugotovili so, da pri malih kolonijah dejansko prihaja do kromosomskih aberacij in nastajanja mikronukleusov z veœjo frekvenco kot pri velikih kolonijah (20, 21). Avtorji so zakljuœili, da doloœitev øtevila malih kolonij lahko nakazuje obseg klastogenosti testirane substance poleg mutagenosti, ki jo pokaæejo velike kolonije. Iz podatkov, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa selekcije mutant, doloœi-mo razmerje med malimi in velikimi kolonijami in uœinkovitost kloniran-ja za mutante (CEmutante). Iz razmerja (CEmutante) / (CEnemutante) izraœu-namo mutacijsko frakcijo. 3.3.4 Izraœuni IZRAŒUN RELATIVNEGA PREÆIVETJA Uœinkovitost kloniranja (CE-cloning efficiency) Iz razmerja med praznimi in polnimi jamicami izraœunamo uœinkovitost kloniranja (CE) po naslednji formuli (22): P(o) = prazne jamice/vse jamice CE = -ln(P(o))/øtevilo celic na jamico Faktor celiœnega øtetja (CCF – cell count factor) Na zaœetku eksperimentiranja je gostota celic 3x105 celic/ml. Vsako odstopanje od te gostote na koncu eksperimentiranja izraœunamo tako, da øtevilo celic v individualni kulturi, ki smo jo tretirali, delimo s popreœjem øtevila celic v kontrolnih kulturah: CCF = individualna vrednost gostote celic po tretiranju /srednja vrednost gostote celic, tretiranih s topilom Preæivetje Preæivetje (S – survival) izrazimo kot zmnoæek uœinkovitosti kloniranja (CE) s faktorjem celiœnega øtetja CCF: S = CE x CCF Relativno preæivetje Relativno preæivetje (RS) je izraæeno kot razmerje med vrednostjo preæivetja (S) individualne kulture in popreœno vrednostjo preæivetja (S) kontrolnih kultur. RS = S individualne kulture/ popreœna vrednost S kontrolnih kultur. RELATIVNA SUSPENZIJSKA RAST (RSG – relative suspension growth) Pri testiranju toksiœnosti doloœimo tudi relativno suspenzijsko rast, to je zmoænost kulture, da se namnoæi v dveh dneh do gostote 3 x 105 celic/ml: Izraœun za totalno suspenzijsko rast je: (øtevilo celic dneva 1 /konœna koncentracija dneva 0) x (øtevilo celic dneva 2 /konœna koncentracija dneva 1) % RSG (relativna suspenzijska rast) = ((vrednost suspenzijske rasti individualne kulture) / (vrednost suspenzijske rasti za popreœje kontrolnih kultur)) x 100. OCENA PREÆIVETJA CELIC Priporoœeno izhodiøœe za oceno preæivetja pri poskusu na mikrotitrskih ploøœah je relativno preæivetje v dnevu 0. Relativno preæivetje v dnevu 0 predstavlja uœinkovitost kloniranja kulture takoj po tretiranju. Izraœun je prilagojen tako, da upoøteva izgubo celic zaradi toksiœnosti med tretiranjem (22). Izraœun relativnega preæivetja izvedemo po naslednjem postopku: Na ploøœah za poskus uœinkovitosti kloniranja preøtejemo prazne jamice. Iz teh podatkov izraœunamo uœinkovitost kloniranja (CE), faktor celiœnega øtetja (CCF), preæivetje (S) in relativno preæivetje (RS) po formulah toœke 3.3.4. Iz podatkov øtevila celic v posamezni kulturi ob upoøtevanju dnevnih razredœitev izraœunamo totalno suspenzijsko rast in relativno suspen-zijsko rast (RGS) po formulah toœke 3.3.4. OCENA MUTACIJSKIH FRAKCIJ Mutacijsko frakcijo doloœimo tako, da izraœunamo razmerje med uœinkovitostjo kloniranja mutant (CEmutant) in uœinkovitostjo kloniranja nemutant (CE nemutant). Uœinkovitost kloniranja nemutant (CE nemutant) izraœunamo iz øtevila praznih jamic, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa uœinkovitosti kloniranja dneva 2 po formuli iz toœke 3.4.4. Upoøtevamo øtevilo zasejanih celic (1,6 celic/ jamico). Uœinkovitost kloniranja za mutante (CEmutant) izraœunamo iz øtevila praznih jamic, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa selekcije mutant po enaki formuli kot zgoraj. Upoøtevamo, da smo na teh ploøœah zasejali 2000 celic na jamico. Mutacijsko frakcijo izraœunamo iz razmerja mutacij med kulturo, ki smo jo gojili v selektivnem gojiøœu, in kulturo, ki smo jo gojili v nese-lektivnem gojiøœu. Mutacijska frakcija = CEmutant / CE nemutant Vsako mutacijsko frakcijo izrazimo glede na 106 æivih celic. Frakcija velikosti kolonij Za vsako kulturo doloœimo razmerje med øtevilom malih in velikih kolonij. 4 Analiza in interpretacija rezultatov 4.1 Statistiœna analiza Statistiœno znaœilno frekvenco mutacij doloœimo v skladu z navodili UKEMS (23). Logaritem frekvence mutacij kontrole primerjamo z logaritmom frekvence mutacij vsake testirane koncentracije z Dunnettovim testom. Iz podatkov, ki smo jih pridobili s testiranjem, z uteæno regresijo preverimo linearni trend mutacijske frekvence. Test za linearni trend je »enorepi«, negativnega trenda ne upoøtevamo. Ta test potrebuje izraœun faktorja heterogenosti, da dobimo modificirano oceno variance. 4. 2 Kriteriji za veljaven poskus Poskus je veljaven, œe doseæemo kriterije, ki se ujemajo z navodili UKEMS (21) in sklepi Portlandskega delovnega sreœanja (24). Doseœi moramo naslednje kriterije: 1. Frekvenca mutacij negativne kontrole (topilo) mora doseœi vrednosti, ki so znotraj normalnega obmoœja (nad 60 mutant na 106 118 farm vestn 2005; 56 Doloœanje mutagenega celic, vendar ne trikrat veœ od srednje vrednosti zgodovinskih okvirov) (23, 24). 2. Vsaj ena koncentracija vsake pozitivne kontrole mora izzvati statis-tiœno znaœilno poveœanje frekvence mutacij 3. Uœinkovitost kloniranja negativnih kontrol iz eksperimentov mutagenosti mora biti v okviru med 60 in 140 % na dan 0 in med 70 in 130 % na dan 2 (23, 24). 4. Ne smejo se pojavljati tehniœni problemi, kot je npr. kontaminacija, prevelika toksiœnost, spremembe ozmolarnosti ali pH. 4.3 Kriteriji za vrednotenje rezultatov Preizkuøanec ocenimo kot mutagen, œe so izpolnjeni naslednji kriteriji: 1. œe je poskus veljaven (toœka 4.2); 2. œe je frekvenca mutacij ene ali veœ testiranih koncentracij statis-tiœno veœja od negativne kontrole (p<0,05); 3. œe analiza linearnega trenda pokaæe od doze odvisno poveœanje frekvence mutacij. 5 Sklep Kriteriji za mutagenost, ki jo doloœimo s tem testom, so enaki za vse kemikalije. Konœna ocena o varnosti je odvisna od rezultatov ostalih testov in namena uporabe snovi. Pri zagotavljanju varne uporabe far-macevtikov je potrebno pred prvim preizkuøanjem zdravilne uœinkovine na œloveka narediti in vitro teste za vrednotenje mutacij in kromosomskih poøkodb. Standardna skupina predpisanih testov (omenjena v uvodu prispevka) mora biti narejena pred zaœetkom II. stopnje kliniœnega preskuøanja zdravila. Opisana metoda je torej eno od pomembnih orodij farmacevtske industrije za zagotavljane varne uporabe zdravilnih uœinkovin. 6 Literatura 1. Ames BN, McCann J, Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/Mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Res 1975; 347-64). 2. McGregor DB, Martin R, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay to Coded Chemicals.I: Results for Nine Compounds. Environ Mutag 1987; 9: 143-160. 3. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay II: 18 Coded Chemicals. Environ Molec Mutag 1988; 11; 91-118. 4. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Riach C Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay III: 72 Coded Chemicals. Environ Molec Mutag 1988; 12:85-154. 5. McGregor DB, Brown A, Howgate S, McBride D P, Riach CG , Caspary WJ,. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay V: 27 Coded Environ Molec Mutag 1991; 17: 196-219. 6. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Riach C Shepherd W, Caspary WJ. Responses of the L5178Y Mouse Lymphoma Forward Mutation Assay: V. Gases and Vapors. Environ Molec Mutag 1991;17: 122-29. snovi na celiœni liniji miøjega limfoma 7. Clive D, Johnson KO, Spector JF, Batson AG, Brown MM. Validation and Characterization of the L5178Y/TK± mouse lymphoma mutagen assay system. Mut Res 1979; 59(1): 61-108. 8. Ficher, GA and Sartorelli AC. Develpment, Maintenance and Assay of Drug Resistance. Methods in Medical Research 1964; 10: 247-62. 9. Kao FT and Puck TT. Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells.Procedures of National Academy of Science USA 1968; 60: 1275-81. 10. Clive D, Flamm WG, Machesko MR, Bernheim NJ. A Mutational Assay System Using the Tymidine Kinase Lokus in Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res 1972;16: 77-87. 11. Fisher GA. Studies of The Culture of Leukemia Cells In vitro Ann Ny Acad Sci 1958; 76: 673-80. 12. Clive D, Spector JFS. Laboratory Procedure for Assessing Specific Locus Mutations at the TK Locus in Cultured L5178Y Mouse Lymphoma Cells. Mut Res 1975;31: 17-29. 13. Clive D, Caspary W, Kirby PE, Krehl R, MOore M, Mayo J, Oberly TJ. Guide for Performing the Mouse Lymphoma Assay for Mammalian Cell Mutagenicity. Mut Res 1987; 189: 143-156. 14. Cole J, Arlett CF, Green MHL, Lowe J Muriel W. A comparison of the agar cloning and microtitration techniques for assaying cell survival and mutation frequency in L5178Y mouse lymphoma cells. Mut Res 1983; 111: 371-386. 15. OECD guidelines for testing of chemicals; Section 4, Subpart 476; OECD, 1997. 16. ICH Topic S2A; Harmonised Tripartite Guideline CPM/ICH/141/95, approved September 1995 Guidance on Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals; ICH 1995. 17. ICH Topic S2B: Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals for Humane Use. Step 4 Guideline, Brussels; ICH 1997. 18. Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mut Res 1983;113: 173-215. 19. Liechty MC, Scalzi JM, Sims KR, Crosby H, Spencer DL, Davis LM, Caspary WJ and Hoizer JC. Analysis of large and small colony L5178Y tk-/- mouse lymphoma mutants by loss of heterozygosity (LOH) and by whole chromosome 11 painting: detection of recombination. Mutagenesis 1998; 13: 461-474. 20. Hozier J, Sawyer J, Moore M, Howard B, Clive D. Cytogenetic analysis of the L5178Y tk-/- ?tk-/- mouse lymphoma mutagenesis assay system. Mutat Res 1981; 84: 169-181. 21. Blazak WF, os FJ, Rudd CJ, Caspary WJ. Chromosome analysis of small and large L5178Y mouse lypmhoma cell colonies from mutagen-treated and control cultures. Mutat Res 1989; 224: 197-208. 22. Clements J. The Mouse Lymphoma Assay. 2000. Mut Res 455: 97-110. 23. Robinson WD, Green MHL, Cole J, Garner RC, Healy MJR, Gatehouse D, 1989; Statistical evaluation of bacterial/ mammalian fluctuation tests. V Statistical Evaluation of mutagenicity test data (Edited by Kirkland DJ) Cambridge University Press, pp 102-140. 24. Clive D, Bolcsfoldi G, Clements J, Cole M, Honma J, Majeska M, Moore L, Muller B, Myher T, Oberly M, Oudelhkim MC, Rudd C, Shimada H, Sofuni T, Thybaud V, Vilcox P. Consensus agreement regarding protocol issues discussed during the mouse lymphoma workshop: PortlandOregon, May7, 1994; Environ Mol Mutagen 1995; 25: 165-168. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja Nitric oxide III: inhibitors of excessive formation Janez Mravljak, Barbara B. Byrne Habiœ, Slavko Peœar POVZETEK: Duøikov oksid lahko zaradi svoje radikalske narave pri poviøanih koncentracijah povzroœi øtevilna obolenja in poøkodbe tkiva na mestu prekomernega nastanka. NO sintaze – druæina encimov, ki katalizirajo pretvorbo arginina do NO in citrulina, so pomembne terapevtske tarœe, tako na nivoju vezave substrata in kofaktorjev, kakor tudi na nivoju genske ekspresije. Velik izziv za naœrtovanje in razvoj novih zdravil predstavljajo izoformno selektivni inhibitorji NO sintaz. Kljuœne besede: duøikov oksid, zaviralci NO sintaze, analogi L-arginina. ABSTRACT: Due to its radical nature nitric oxide can cause many illness and injuries of tissue by elevated concentrations at the site of its excessive formation. NO synthases – family of enzymes that catalyze conversion of arginine to NO and citrulline, are important therapeutic targets at the level of binding of substrate and cofactors as well as at the level of gene expression. Isophormically selective inhibitors of NO synthases represent considerable challenges for drug development. Key words: nitric oxide, inhibitors of NO synthase, analogues of L-arginine. 1 Uvod V prvem strokovnem œlanku o duøikovem oksidu (1) smo predstavili kemizem in radikalsko naravo duøikovega oksida (NO) v organizmu, v drugem strokovnem œlanku (2) pa smo podrobneje obravnavali njegove bioloøke uœinke in uœinkovine, ki sproøœajo NO v in vivo pogojih. V tem prispevku pa bomo predstavili prijemaliøœa in razvoj nekaterih selektivnih inhibitorjev NO sintaz (NOS) kot potencialnih zdravilnih uœinkovin pri prepreœevanju in zdravljenju obolenj oziroma poøkodb povezanih s prekomernim nastajanjem NO. Druæina NOS obsega pri sesalcih tri izoformne oblike, ki so jih poimenovali po lastnostih oziroma tipu celic v katerih so jih prviœ opisali: endotelijska NOS (eNOS), nevronska NOS (nNOS) in inducibilna NOS (iNOS) (3). Fizioloøka vloga NO je doloœena predvsem z izoformno obliko NOS, ki ga tvori; lahko nastopa kot medceliœni mediator ali kot citotoksiœni agens v imunskem sistemu. S prekomerno tvorbo NO v doloœenih okoliøœinah pa lahko NOS povzroœijo poøkodbe tkiva pri øtevilnih obolenjih. V teh primerih bi lahko dosegli terapevtsko ugodne uœinke s selektivno inhibicijo iNOS in nNOS, medtem ko je dolgotrajna inhibicija eNOS vsekakor økodljiva. 2 Zaviranje prekomernega nastajanja NO Poveœana lokalna koncentracija NO ob hkratni prisotnosti drugih reaktivnih kisikovih in duøikovih zvrsti dokazano povzroœi okvare v vsakem tkivu (1, 3). Prekomerno izraæanje iNOS so opazili pri modelih sep- tiœnega øoka, pri vseh vnetjih, astmi in v moæganih po ishemiji ali travmi. V øtevilnih nevrodegenerativnih obolenjih kot so Alzheimerjeva bolezen, multipla skleroza, Parkinsonova bolezen ter pri avtoimunih obolenjih (celiakija, artritis) ima iNOS pomembno vlogo (4). Æal iNOS ni edini vzrok za porast NO. Opisali so tudi prekomerno aktivnost nNOS. Dokazali so, da se z N-metil-D-aspartatom (NMDA) inducirana nevro-toksiœnost zmanjøa ob soœasni uporabi zaviralcev NOS in da so pri miøih z okvarjeno nNOS poøkodbe zaradi kapi blaæje (5). Znano je, da NO sintaze lahko v nekaterih okoliøœinah tvorijo tudi superoksidni radikal, neodvisno od tvorbe NO. Za nNOS ugotavljajo, da najlaæje tvori superoksidni radikal, ko sta koncentraciji tetrahidrobiopterina (kofaktor) ali arginina (substrat) nizki, pa tudi ob prisotnosti zaviralcev podobnim argininu (6). Z omejitvijo prekomernega nastajanja NO lahko priœakuje-mo doloœene terapevtske uœinke. Glavni problemi so specifiœnost zaviranja samo doloœenega tipa NOS v doloœenih tkivih, øe zlasti so terapevtsko zanimivi zaviralci iNOS in nNOS. Njihov razvoj je v srediøœu danaønjih raziskav. Po mehanizmu delovanja so zaviralci NOS: -analogi arginina, -zaviralci dimerizacije NOS, -zaviralci kofaktorjev NOS in -zaviralci, ki delujejo po drugih mehanizmih. 2. 1 Zaviralci podobni L-argininu L-arginin (L-Arg) v visokih koncentracijah (nad 100 µM) zavira eNOS. Uœinek je posledica njegove vezave na alosteriœno mesto NOS in s tem ovirana vezave L-Arg na aktivno mesto encima. Prvi znani zavi- Janez Mravljak, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, SI-1000 Ljubljana Barbara B. Byrne Habiœ, mag. farm., Zavod za farmacijo in preizkuøanje zdravil, Ptujska 21, 1000 Ljubljana prof. dr. Slavko Peœar, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7 in Institut Joæef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana 120 farm vestn 2005; 56 Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja ralci so bili preprosti analogi L-Arg, npr.: NG-monometil-L-arginin (L-NMMA), NG-nitro-L-arginin (L-NNA) in njegov metilni ester (L-NAME) (7, 8, 9) (slika 1). Œeprav so si spojine strukturno podobne, zavirajo NOS na razliœne naœine. Ugotovili so da z majhnimi spremembami v argininskem delu poveœamo selektivnost bodisi v smeri iNOS ali nNOS. N-oksid L-NMMA (slika 3) je uœinkovit zaviralec iNOS, ki zavre tvorbo NO po stimulaciji z lipopolisaharidi. Zamenjava metilne skupine pri L-NMMA s propilno (N-propil-L-Arg) ali ciklopropilno (N-ciklopropil-L-Arg) pa da selektivnejøi nNOS zaviralec (6). Øtevilni analogi arginina, citrulina, tiocitrulina in njihovih derivatov so preteæno kompetitivni zaviralci nNOS. Te spojine prepreœijo tudi tvorbo reaktivnih kisikovih spojin in bi bile lahko uporabne proti hipotenz-iji, æveplo vsebujoœi derivati pa pri terapiji artritisa, migrene in postop-erativnega ileusa (3, 6). Slika 1: Prvi opisani zaviralci NOS: NG-monometil-L-arginin (L-NMMA), NG-nitro-L-arginin (L-NNA) in njegov metilni ester (L-NAME). Figure 1: First known inhibitors of NOS: NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), NG-nitro-L-arginine (L-NNA) and its methyl ester (L-NAME). L-NMMA, ki je izoformno nespecifiœen inhibitor, uporaben v raziskovalne namene, pretvori encim v N-hidroksi-N-metil-L-arginin. Pri tem nastane H2O2, ki ireverzibilno okvari encim. V majhnih odmerkih ima L-NMMA ugodne uœinke pri terapiji septiœnega øoka, glavobola ter astme. Zmanjøa tudi vnetje koæe, povzroœene z ultravijoliœno svetlobo (3, 6). L-NNA pa spremeni konformacijo aktivnega mesta NOS in prepreœi vezavo L-Arg. Tovrstni zaviralci se veæejo na NOS poœasi in poœasi tudi disociirajo (10). Po vzoru N-nitroarginina (L-NNA) so pripravili analoge, ki so selektivni inhibitorji nNOS (11, 12) (slika 2). Slika 2: Peptidni in neamidni analogi L-NNA kot selektivni inhibitorji nNOS. Figure 2: Peptide and nonamide analogues of L-NNA as selective inhibitors of nNOS. Sol L-NMMA in acetilsalicilne kisline (slika 3) je kombinacija dveh neselektivnih inhibitorjev encimov: NOS in ciklooksigenaze. V kliniœnih testiranjih (6) jo preizkuøajo za zdravljenje revmatoidnega artritisa, kardiovaskularnih motenj in motenj v cerebralni cirkulaciji. Slika 3: Sol L-NMMA in acetilsalicilne kisline in N-oksid L-NMMA. Figure 3: Salt of L-NMMA and acetylsalicilic acid and N-oxide of L-NMMA. NH H.N^ JK 2 N NHR H N-aminogvanidini nitrogvanidini arilgvanidini Slika 4: Derivati gvanidina kot zaviralci NOS Figure 4: Guanidine derivatives as NOS inhibitors Med arilaminogvanidini in arilgvanidini (slika 4) so naøli selektivne zaviralce iNOS, ki bi bili uporabni za zdravljenje septiœnega øoka, hipotenzije, revmatoidnega artritisa, ulceroznega kolitisa in od insulina odvisnega diabetesa (3, 6). Zanimiv je poskus zdruæitve antioksi-danta (derivat vitamina E) in zaviralca NOS (Slika 4, arilgvanidinski derivat) v eno molekulo, ki istoœasno zavira lipidno peroksidacijo in nastajanje NO s pribliæno enako uœinkovitostjo (13). Za derivate N-tetrametilen-N’-arilgvanidinov so ugotovili, da bi bili lahko kot selektivni zaviralci nNOS (14, 15) (Slika 4) uœinkoviti pri terapiji nevrode-generativnih bolezni, izboljøanju krœenja æelodca in pri vnetnih obolenjih. Prouœujejo tudi uporabnost nitrogvanidinov, ki so zaviralci nNOS in iNOS pri zdravljenju kardiovaskularnih bolezni, motnjah cerebralne cirkulacije, aterosklerozi, diabetesu in sepsi. Za amidine (slika 5) so ugotovili, da so selektivni zaviralci nNOS. Med njimi iøœejo uœinkovine za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni (6). Tudi med S-substituiranimi izotioseœninami so uœinkoviti inhibitorji NOS (3, 6, 16) (Slika 6). Podobno kot L-NMMA, te spojine poøkoduje-jo okolico hema NOS in tako prepreœijo interakcijo encima s sub- farm vestn 2005; 56 121 Pregledni œlanki - Review Articles Me O BN 80933 N-feniltiofenamidini Slika 5: Derivati amidina Figure 5: Amidine derivatives stratom. S-alkil izotioseœnine so uœinkovitejøi zaviralci, kot derivati arginina. Zaradi æveplovega atoma, ki ima veliko afiniteto do hema je S-metilizotioseœnina 500 krat uœinkovitejøi zaviralec iNOS, kot N-metil-L-arginin. Med S-alkil izotioseœninami so tudi selektivni inhibitorji nNOS, ki imajo terapevtski potencial pri zmanjøevanju poøkodb nevronov ob moæganski kapi in drugih nevrodegenerativnih obolenjih. Bis-izotioseœnine (1,3-PBITU, 1,4-PBITU; slika 6) kot prvi selektivni zaviralci iNOS, so zaradi nizke bioloøke uporabnosti in toksiœnosti (vpliva na Na+/K+ ATPazo) neuporabni. S øtudijem vezave ligandov na NOS so priøli do treh znaœilnosti, ki jih mora imeti izoformno selektivni zaviralec (3, 16): -na ogrodju mora biti gvanidinska, amidinska ali (tio)seœninska skupina, ki lahko tvori vodikovo vez z glutamatno stransko verigo v aktivnem mestu NOS. Prisotnost manjøe hidrofobne skupine (alkilna ali tienilna) je ugodna, ker omogoœa dodatno hidrofobno interakcijo; 1,3-PBITU , 1,4-PBITU bisizotiosecnine R3 - 1,3-tiazin-2-amini -NH, izotiosecninski derivati X >¦ R'^N—N 1,3-tiazepin-2-amini W-fenil-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-amini Slika 6: Izotioseœninski derivati Figure 6: Isothiourea derivatives. 122 farm vestn 2005; 56 -zaviralec mora imeti funkcionalno skupino, ki zagotavlja izoformno selektivnost z moænostjo tvorbe primernega vzorca vodikovih vezi. S to skupino izkoriøœamo razlike v aminokislinah med posameznimi izo-formami v kanalu, po katerem pride substrat do aktivnega mesta; -zaviralec mora imeti distanœnik med obema deloma, ki je primerno dolg in gibljiv, da doseæe izoformno specifiœna podroœja. Kljub veliki podobnosti arginin vezavnih mest pri izoencimih NOS so razvili visoko selektivne inhibitorje. Naj omenimo 1400W (slika 7), ki je 10000 krat selektivnejøi pri zaviranju iNOS kot eNOS in 30 krat selek-tivnejøi glede na nNOS (3, 6, 17). Kljub ugodni uœinkovitosti in selektivnosti pa je 1400W preveœ toksiœna spojina, da bi jo uporabljali. Me HN^N H K^ Slika 7: Kemiœna struktura 1400W Figure 7: Chemical structure of 1400W 2. 2 Zaviralci dimerizacije NOS Vse izoformne oblike NOS postanejo katalitiœno aktivne øele, ko dimer-izirata dve podenoti encima (3). Na nastajanje NO vplivamo tudi tako, da oviramo nastanek aktivnega dimera NOS iz monomernih enot. Opisani so derivati imidazolov, ki ob vezavi na hem v monomeru iNOS motijo eno od vijaœnic monomera tako, da spremenijo strukturo veza-vnega mesta za arginin (18). Inhibitor-monomer kompleks tako ne more tvoriti niti arginin- niti tetrahidrobiopterin vezavnega mesta. Opisane lastnosti imajo tudi protigliviœne uœinkovine: klotrimazol, mikonazol, ketokonazol, ki poleg tega prepreœujejo vezavo kalmodulina na iNOS. Kot zanimivi so se izkazali pirimidinimidazoli, med 2-aminopiridini pa so æe naøli øtevilne relativno selektivne iNOS in nNOS inhibitorje (6). 2. 3 Zaviralci kofaktorjev NOS Za encimsko aktivnost NOS so potrebni kofaktorji (6R)-5,6,7,8,-tetrahidrobiopterin (BH4), flavinadenindinukleotid (FAD), flavin-mononukleotid (FMN), æelezov protoporfirin IX (hem) in kalmodulin, ki se veæejo na svoja vezavna mesta na aktiviranem dimeru NOS (3). Zaviralci vezave flavina in kalmodulina so æe dolgo znani, toda zaradi nezmoænosti doseganja selektivnosti so neuporabni. Veœjo pozornost posveœajo snovem, ki zavirajo vezavo tetrahidrobiopterina. Kofaktor (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterin maksimalno aktivira vse tri NOS in stabilizira kvarterno strukturo encima. S pomoœjo 3D-modela postavljenega s poznavanjem kvantitativnega odnosa med strukturo in delovanjem (3D-QSAR) so doloœili strukturne zahteve za zaviranje nNOS: 4-okso- in 4-aminopteridini (slika 8) zavirajo nNOS desetkrat selek-tivneje kot ostale NOS (19). 2. 4 Drugi zaviralci Naøli so tudi endogene peptide in proteine, ki se veæejo na izoforme NOS in zavirjo njihovo aktivnost (3). nNOS inhibira 89 aminokislin dolg protein, imenovan protein inhibitor NOS (PIN), ki se veæe na N-termi- Duøikov oksid III: zaviralci prekomernega nastajanja Slika 8: 4-okso- in 4-aminopteridinski inhibitor izpeljana iz strukture kofaktorja 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina Figure 8: 4-oxo- and 4-aminopteridine inhibitors derived from the structure of cofactor 5,6,7,8-tetrahydrobiopterine nalni konec encima. Odkrili so tudi druge inhibitorne domene na eNOS in nNOS, ki bi lahko bile tarœna mesta za selektivno inhibicijo. Tako in vivo aplikacija ogrodne domene kaveolina-1 inhibira eNOS aktivnost, kar potrjuje, da utegne biti ta pristop uporaben. V literaturi je opisanih veliko uœinkovin (tako endogenega kot ekso-genega izvora), ki vplivajo na ekspresijo inducibilne NO sintaze (iNOS) (20). Del uœinka uveljavljenih glukokorikoidov, je posledica zaviranja transkripcije gena za iNOS. Obetajoœa uœinkovina, ki je v fazi kliniœnega testiranja, je analog heptapeptida a-melanocite stim-ulirajoœega hormona (6, 21). Ta analog zavira izraæanje øtevilnih kljuœnih citokinov, kot so interlevkini -1b, -6 in -10 in TNF-a, kakor tudi iNOS. Poznani so tudi piridotienotriazinski derivati, ki nespecifiœno zavirajo izraæanje iNOS in ciklooksigenaz (COX-1 in COX-2), vendar øe ni povsem jasno, ali bo mogoœe doseœi selektivno zaviranje transkripcije gena za iNOS (6). Podobno ni jasno, ali bo moæno doseœi poveœanje ekspresije gena za eNOS. (Slika 9) 3 Sklep Poleg znanih donorjev duøikovega oksida, ki jih æe vrsto let uspeøno uporabljamo v terapiji in katerih delovanje so pojasnili z odkritjem vloge NO v telesu, raziskovalci iøœejo in preizkuøajo nove zdravilne uœinkovine, z drugaœnimi mehanizmi sproøœanja NO, ki bi lahko delo- m = ci, R2: COMe Slika 9: Piridotienotriazinski derivati kot nespecifiœni zaviralci ekspresije iNOS in ciklooksigenaz. Figure 9: Pyridothienotriazine derivatives as nonspecific inhibitors of iNOS and cyclooxygenases expression. vale na æelena tarœna mesta in uœinkovine, ki bi uravnavale nastajanje NO. Dejstvo, da ima NO v mnogih patofizioloøkih procesih veœ-plastno vlogo, oteæuje odkritje zaviralcev iNOS in nNOS, ki bi uœinkovi-to posegli v uravnavanje nastajanja NO in s tem v doseganje æelene-ga uœinka brez neugodnih posledic. V prednosti bodo uœinkovine, ki bodo tkivno selektivne ter specifiœne za posamezno izoformno obliko NOS, pri œemer pa je æe sedaj znano, da je primernejøa delna inhibi-cija sintaze NO od popolne. Glede na vpletenost NO v øtevilne procese v telesu, je pred raziskovalci velik izziv pri naœrtovanju takih uœinkovin, ki bodo uravnavale le doloœene procese, zato verjetno ne moremo priœakovati kmalu velikih preobratov na tem podroœju. Velik napredek bo, œe bo uspelo dostavljati izbran zaviralec doloœene izomorfne oblike NOS v doloœeno tkivo. V tem primeru pa lahko priœakujemo velike spremembe pri mnogih obolenjih, ki jih danes nemoœno opazujemo. 4 Literatura 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Byrne Habiœ B, Mravljak J, Peœar S. Duøikov oksid I: lastnosti, kemiœna reaktivnost in nastajanje NO v organizmu. Farm Vestn 2004; 55: 283-291. Mravljak J, Byrne Habiœ B, Peœar S. Duøikov oksid I: bioloøki uœinki in uœinkovine, ki sproøœajo NO. Farm Vestn 2005; 56: 11-16. Vallance P, Leiper J. Blocking NO synthesis: how, where and why?. Drug Discov Today 2002; 1: 939-950. Hobbs A J, Higgs A, Moncada S. Inhibition of Nitric Oxide Synthase as a Potential Therapeutic Target. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999; 39:191-220. Bird D C, Bujas-Bobanovic M, Robertson H A et al. Lack of phencyclidine-induced effects in mice with reduced neuronal nitric oxide synthase. Psychopharmacology 2001; 155: 299-309. Granik V G, Grigor’ev N B. Nitric oxide synthase inhibitors: biology and chemistry. Russ Chem Bull 2002; 51: 1973-1995. Peterlin-Masic L, Kikelj D. Arginine mimetics.Tetrahedron 2001; 57 (33): 7073-7105. Moore W M, Webber R K, Jerome G M et al. L-N6-(1-Iminoethyl)lysine: A Selective Inhibitor of Inducible Nitric Oxide Synthase. J Med Chem 1994; 37: 3886-3888. Babu B R, Griffith O W. N5-(1-Imino-3-butenyl)-L-ornithine. J Biol Chem 1998; 273 (15): 8882-8889. Wolfe M M. Future Trends in the Development of Safer Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs. Am J Med 1998; 105 (5A): 44S-52S. Huang H, Martásek P, Roman L J et al. Synthesis and Evaluation of Peptidomimetics as Selective Inhibitors and Active Site Probes of Nitric Oxide Synthases. J Med Chem 2000; 43: 2938-2945. Hallinan E A, Tsymbalov S, Dorn C R et al. Synthesis and Biological Characterizationof L-N6-(1-Iminoethyl)lysine 5-Tetrazole-amide, a Prodrug of a Selective iNOS Inhibitor. J Med Chem 2002; 45: 1686-1689. Chabrier P E, Auguet M, Spinnewyn B et al. BN 80933, a dual inhibitor of neuronal nitric oxide synthase and lipid peroxidation: A promising neuroprotective strategy. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 10824-10829. Beaton H, Hamley P, Nicholls D J at al. 3,4-Dihydro-1-isoquinolinamines: A Novel Class of Nitric Oxide Synthase Inhibitors with a Range of Isoform Selectivity and Potency. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1023-1026. Beaton H, Boughton-Smith N, Hamley P at al. Tienopyridines: Nitric Oxide Synthase Inhibitors with Potent In Vivo Activity. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1027-1030. Raman C S, Li H, Martásek P et al. Implications for Isoform-selective Inhibitor Design Derived from the Binding Mode of Bulky Isothioureas to the Heme Domain of Endothelial Nitric-oxide Synthase. J Biol Chem 2001; 276: 26486-26491. Garvey E P, Oplinger J A, Purfine E S et al. 1400W Is a Slow, Tight Binding, and Highly Selective Inhibitor of Inducible Nitric-oxide Synthase in Vitro and in Vivo. J Biol Chem 1997; 272: 4959-4963. Wolff D J, Datto G A, Samatovicz R A. The Dual Mode of Inhibition of Calmodulin-dependent Nitric-oxide Synthase by Antifungal Imidazole Agents. J Biol Chem 1993; 268: 9430-9436. Matter H, Kotsonis P, Klingler O et al. Structural Requirements for Inhibition of the Neuronal Nitric Oxide Synthase (NOS-I): 3D-QSAR Analysis of 4-Oxo- and 4- Amino-Pteridine-Based Inhibitors. J Med Chem 2002; 45: 2923-2941. Rao K M K. Molecular mechanisms regulating iNOS expression in various cell types. J Toxicol Env Heal B 2000; 3(1): 27-58. Annual Drug Data Report series. Ed J R Prous, Prous Science, S A, Barcelona-Philadelphia 1998, 20: 45. farm vestn 2005; 56 123 2. 3. 4. 5. 6. 9. Pregledni œlanki - Review Articles Izdelava pelet z razliœnimi granulacijskimi tekoœinami in vpliv hidrodinamskih razmer v Wursterjevi komori na uœinkovitost filmskega oblaganja Stane Srœiœ (doktorska disertacija Roka Dreua) Mladi raziskovalec Rok Dreu je na Fakulteti za farmacijo izdelal in zagovarjal doktorsko disertacijo z naslovom Izdelava pelet z razliœnimi gran-ulacijskimi tekoœinami in vpliv hidrodinamskih razmer v Wursterjevi komori na uœinkovitost filmskega oblaganja. Razumevanje fizikalnih procesov, ki potekajo in so prisotni med delci trdne snovi ter tekoœino, je bistveno pri nadzorovanju tehnoloøkega procesa in izdelovanju farmacevtske oblike. Cilj doktorskega dela je bil doloœiti vpliv granu-lacijske tekoœine na lastnosti pelet ter poiskati ustrezno teoretiœno razlago oz. fizikalno koliœino, ki bi opisovala spremembe lastnosti pelet preko razlik v lastnostih uporabljenih granulacijskih tekoœin. Vpeljali smo zmnoæek povrøinske napetosti (gL), dielektriœne konstante granu-lacijske tekoœine (eR) in kosinusa stiœnega kota granulacijske tekoœine s trdnimi snovmi pelete (cos(Q)) z namenom razlage mehanizma nastanka razlik v lastnostih pelet. Produkt gL*cos(Q)*eR smo vpeljali, ker menimo, da obstaja fizikalno ozadje, ki omogoœa razlago vpeljanega zmnoæ-ka kot sorazmernostnega faktorja s seøtevkom sil zgostitve aglomerata med suøenjem in sil, ki zgostitvi aglomerata nasprotujejo. Pelete smo izdelali s tehnologijo iztiskanja in krogliœenja ob uporabi vode, etanola in vodno/etanolnih meøanic kot granulacijskih tekoœin. Vrednotenje izdelanih pelet je pokazalo, da natezna trdnost in œas razpadnosti pelet naraøœa z naraøœanjem vrednosti vpeljanega zmnoæka gL*cos(Q)*eR, medtem ko se obrabnost, povpreœni premer por in poroznost pelet zmanjøujejo. Obstoj korelacij med predlaganim zmnoækom in lastnostmi pelet kaæe na to, da granulacijska tekoœina vpliva na konœne mehanske in strukturne lastnosti pelet prek vpliva na velikost sil zgostitve in sil, ki zgostitvi med procesom suøenja aglomerata nasprotujejo. Hkrati pa poznavanje vrednosti predlaganega zmnoæka nakazuje moænost napovedovanja mehanskih lastnosti pelet. Poznavanje, razumevanje in obvladovanje postopka oblaganja z Wursterjevo procesno komoro nam omogoœa zagotavljanje zveznih, enakomernih in ponovljivih filmskih oblog. Namen dela je pokazati povezavo med enakomernostjo in kakovostjo filmske obloge pelet ter povpreœnim volumskim deleæem pelet v podroœju razmejitvenega valja Wursterjeve komore in s tem eksperimentalno potrditi pomen volumskega deleæa pelet. V ta namen smo obloæili vzorce pelet pri razliœnih masnih tokovih zraka in razliœnih velikostih reæe med distribucijsko ploøœo in razmejitvenim valjem. RSD-je debelin filmske obloge smo doloœili prek posredne metode doloœanja raztrosa debeline filmske obloge z doloœanjem koncentracije barvila v filmski oblogi. Z vgradnjo lopute v procesno komoro smo doloœili volumske deleæe pelet v podroœju razmejitvenga valja, in sicer pri razliœnih masnih tokovih zraka in velikostih reæe. Z mnoæenjem volumskega deleæa pelet in lokalne hitrosti pelet, ki smo jo doloœili s snemanjem s hitro kamero, smo dobili relativno merilo masnega toka pelet. Ugotovili smo, da je masni tok pelet pri doloœenem masnem toku zraka skozi komoro skoraj konstanten oziroma neodvisen od velikosti reæe med razmejitvenim valjem in distribucijsko ploøœo. Primerjava med merilom za masni tok pelet ter RSD-jem debeline obloge ni pokazala povezave, medtem ko se RSD debeline filmske obloge linearno poveœuje z veœanjem volumskega deleæa pelet v podroœju oblaganja (eS) kot posledica uœinka medsebojnega senœenja, vendar le za eksperimente oblaganja s podobnimi velikostmi reæ med razmejitvenim valjem in distribucijsko ploøœo (20, 25 mm). Z namenom razumevanja rezultatov in æelje po nadomestitvi eksperimentov smo priœeli z razvojem CFD simulacije gibanja delcev v Wursterjevi komori. S Pitotovo cevjo smo pomerili hitrostne profile zraka znotraj razmejitvenega valja Wursterjeve komore ter izraœunali masne tokove zraka. S CFD orodjem Fluent 6.1 smo razvili simulacijo gibanja toka zraka skozi Wursterjevo komoro ob odsotnosti pelet. Na podlagi primerjave eksperimentalnih vrednosti masnih tokov zraka skozi razmejitveni valj s simulacijskimi vrednostmi lahko trdimo, da simulacija ob naœrtani raœunski mreæi, izbranem standardnem k-e turbulentnem modelu ter predpisanih robnih pogojih daje ustrezne rezultate. Dobljeni rezultati predstavljajo trdno osnovo za nadaljnji razvoj simulacije. Dr. Rok Dreu, mag. farm., je zagovarjal doktorsko disertacijo 7. januarja 2005 na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani. Mentor: prof. dr. Stane Srœiœ, mag. farm., Fakulteta za farmacijo Somentor: prof. dr. Iztok Æun, univ.dipl.inæ.str., Fakulteta za strojniøtvo 124 farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki Importance of porphyrins in laboratory diagnostics Ljuba Krnjak, Milan Skitek POVZETEK: Porfirini so cikliœni tetrapiroli, derivati osnovnega tetrapirol porfina. So vmesni presnovni produkti v biosintezi hema. Sintentizirajo se v vseh celicah sesalcev. Pri zdravem œloveku se v manjøih koliœinah izloœajo iz organizma z blatom in urinom. Poznamo tri glavne vrste por-firinov: uroporfirin, koproporfirin in protoporfirin. Bolezni, ki se pojavljajo v zvezi z njimi, so dedne ali pridobljene motnje v biosintezi hema. Za boljøe razumevanje jih razdelimo v eritropoetiœne ali hepatiœne oblike, glede na primarni poloæaj pomanjkanja encima. Za kliniœni dokaz hepatiœnih porfirij so ponavadi pomembni sekundarni dejavniki kot: zdravila, hormoni, prehrana, alkohol, doloœene halogenske hidrokarbonske meøanice in poøkodbe jeter. Pri akutnih hepatiœnih porfirijah je nujno takojønje diagnosticiranje in zdravljenje. Kljuœne besede: porfirini, porfirija, porfinurija, porfirinemija. ABSTRACT: Porphyrins are cyclic tetrapyrroles which can be considered as derivatives of the parent tetrapyrrole. They are synthesized in all mammalian cells. They excrete of the health human body in small quantities through excrement and urinous. In humans, there are three major porphyrins: uroporphyrin, coproporphyrin and protopotphyrin. Porphyrias are hereditary or acquired disorders of heme biosynthesis. For practical reasons, they are classified into erythropoietic or hepatic forms according to the primary site of enzyme deficiency. For the clinical manifestation of hepatic porphyrias secondary factors are usually of importance, e.g. drugs, hormones, nutrition, alcohol, certain halogenated hydrocarbon compounds, hepatic lesions. Acute hepatic porphyrias have to give rise to medical emergencies and require intensive care treatment. Key words: porphyrins, porphyrias, porphyuremia, porphyrinemia 1 Uvod Porfirije spadajo v skupino redkih bolezni. Pojavljajo se po vsem svetu. Povezane so s podedovanimi in pridobljenimi motnjami v bios-intezi hema. Primarne ali podedovane bolezni v porfirinskem metabo-lizmu so relativno redke, pogostejøe so nekatere sekundarne ali pridobljene motnje. Laboratorijska diagnostika porfirinskih bolezni je v osnovi povezana z analitiko porfirinov in porfirinskih intermediatov. Vedno bolj postajajo pomembni analizni postopki, ki omogoœajo spremljanje koncentracij metabolitov, znaœilnih za porfirinske motnje. 2 Zgradba in vrste porfirinov Porfirini so cikliœni tetrapiroli, derivati osnovnega tetrapirol porfina. V derivatih porfina so b-vodikovi atomi popolnoma ali delno substituirani z razliœnimi stranskimi verigami, kot so: alkil, hidroksialkil, vinil, kar-bonil ali karboksilna skupina. Razliœni porfirini so razvrøœeni glede na vrsto stranskih verig. V skladu s tem razlikujemo naslednje porfirine: protoporfirin, koproporfirin, etioporfirin, mezoporfirin in uroporfirin. Vsi naravni protoporfirini vsebujejo dve razliœni stranski verigi vsakega pirolovega obroœa. Torej so pri dveh razliœnih verigah moæne øtiri izomere. Protoporfirin se v naravi nahaja le kot izomer øtevilka IX in ker je opredeljen kot derivat koproporfirina III, se lahko imenuje tudi protoporfirin III. Protoporfirin IX je v obliki hema in hemoglobina, mio-globina in v veœini citokromov. Porfirini kompleksirajo øtevilne kovinske ione in tvorijo metaloporfirine. Porfirinogeni, ki so intermediati v sintezi porfirinov predstavljajo porfirine, v katerih sta dva duøika v pirolnih obroœih in vsi metilenski ogljiki hidrogenirani. Vsi bioloøki metaloporfiri-ni se na enak naœin sintetizirajo do stopnje protoporfirina IX (1). 3 Biosinteza porfirinov in hema Ime »porfirin« je grøkega izvora in izhaja iz besede »porphyra«. Raztopine porfirinov so temno rdeœe do økrlatno obarvane. V strukturi tetrapirolovega obroœa so prisotne øtevilne konjugirane dvojne vezi. Porfirini in hem se sintetizirajo v vseh celicah sesalcev. Aktivnost bios-inteze je najbolj pomembna v kostnem mozgu in jetrih. Niz reakcij vodi do sinteze hema, ki se zaœne s sukcinil koecimom A in glicinom ter konœa z vkljuœitvijo Fe2+ iona v molekulo protoporfirina IX (Slika 1) (2). Pri sintezi hema sodeluje osem encimov, øtirje v mitohondrijih in øtirje v citosolu. Predlagana imena encimov so bila objavljena leta 1992 v soglasju s komisijo za nomenklaturo “The International Union of Biochemistry” (Mednarodno zdruæenje za biokemijo). Sprejeta imena encimov so prepreœila zamenjave z do tedaj uporabljenimi imeni. Imena encimov so navedena v preglednici 2 (3). mag. Ljuba Krnjak, prof. kem. in biol., dr. Milan Skitek, mag.farm., Kliniœni center Ljubljana, Kliniœni inøtitut za kliniœno kemijo in biokemijo, Njegoøeva 4, Ljubljana, Slovenija farm vestn 2005; 56 125 Pregledni œlanki - Review Articles Sintaza aminolevulinske kisline EC 2.3.1.36 V prvi reakciji biosinteze hema nastane aminolevulinska kislina (ALA). Sintentizira se v mitohondrijih z encimom sintazo aminolevulinske kisline iz glicina in sukcinil koencima A v prisotnosti pirodoksalfosfata. Aktivnost encima sintaze aminolevulinske kisline uravnava hitrost celotne sinteze hema, vendar je njena aktivnost manjøa od aktivnosti ostalih encimov sistema (4). Sintaza porfobilinogena EC 4.2.1.24 Drugi encim v biosintezi hema je encim sintaza porfobilinogena, ki katalizira nastanek porfobilinogena iz dveh molekul ALA. ALA nastaja v mitohondrijskem matriksu in se premika v citosol, kjer deluje. Zmanjøana aktivnost sintaze porfobilinogena je zelo redka motnja. Bolezen se deduje avtosomno recesivno. Pri homozigotih je aktivnost encima zmanjøana za veœ kot 95 %. V literaturi najdemo opisanih øest takønih primerov. Oseba, ki je heterozigotna za mutacijo, ne zboli, je zgolj prenaøalka. Heterozigoti so povezani s prirojenimi porfirinskimi motnjami. Oblike motenj so blage, vœasih nezaznavne (fenotipsko, biokemijsko) ali pa so kliniœno spregledane. Povzroœitelji motenj so lahko zunanji dejavniki, na primer svinec. Laboratorijska ugotovitev o zniæani aktivnosti sintaze porfobilinogena pokaæe zviøano koncentracijo ALA z normalno koncentracijo porfobilinogena (5). Hidroksimetilbilan sintaza EC 4.3.1.8 Tretji encim v biosintezi hema je hidroksimetilbilan sintaza, ki katalizira sintezo øtirih molekul porfobilinogena v hidroksimetilbilan (6). Akutna intermitentna porfirija se pojavi pri posamezniku, kjer je aktivnost hidroksimetilbilan sintaze v eritrocitih 50 % ali manj. Bolezen je avto-somno recesivna. Za pojav teh obolenj je potrebna mutacija na obeh alelih genskega lokusa. Incidenca v svetu je pribliæno 5 do 10 primerov na 100 000 prebivalcev. Veœ kot 90 % posameznikov z muti-ranim genom nikoli ne zboli (7). Uroporfirinogen III sintaza EC 4.2.1.75 Œetrti encim v biosintezi hema je uroporfirinogen III sintaza. Ta katal-izira pretvorbo hidroksimetilbilana v uroporfirinogen. Pri homozigotih je aktivnost encima nizka. Heterozigoti pri tem niso prizadeti. Motnja se izraæa z moœno fotoobœutljivostjo in temno rdeœo barvo urina v neonatalnem obdobju (8). Zobje in kosti fluorescirajo. Ko bolezen napreduje, zajame øe druge dele telesa, na primer prste in nos, ki so izpostavljeni sonœnim æarkom. Smrt najpogosteje nastopi æe v zgodnjem otroøtvu. Nastop bolezni v kasnejøem æivljenjskem obdobju vodi v kopiœenje porfirinov, ki ni vedno povezano z znaœilno fotoobœutljivostjo. Pri bolnikih so opazne brazgotine in deformacije rok, prstov, nosu in uøes. Laboratorijske preiskave pokaæejo zviøano izloœanje porfirinov v urinu, tudi do 20-krat veœ kot je normalno. To je redka avtosomno recesivna motnja, ki se pojavlja kot kongenitalna eritropoetiœna porfirija ali Güntherjeva bolezen (4). Uroporfirinogen dekarboksilaza EC 4.1.1.37 V peti stopnji biosinteze hema se uroporfirinogen dekarboksilira v koproporfirinogen. Porfirija kutanea tarda je najbolj prepoznavna por-firija z incidenco 1 primer na 25 000. Pojavlja se kot dedna ali pridobljena bolezen. Porfirija kutanea tarda je avtosomno dominantno dedna bolezen in ima 50 % zmanjøano aktivnost encima v jetrih in eritrocitih. Nasprotno je pri pridobljeni porfiriji kutanea tarda za 50 % zmanjøana aktivnost encima le v jetrih, v eritrocitih pa je aktivnost encima normalna. Pri bolnikih se pojavi znaœilna prizadetost koæe in 126 farm vestn 2005; 56 jeter. Laboratorijski rezultati pokaæejo zviøane vrednosti uroporfirinov in koproporfirinov v urinu (9). Hepatoeritropoetiœna porfirija je zelo redka dedna bolezen, pri kateri aktivnost encima ponavadi za 5 do 10 % odstopa od normalne aktivnosti (4). Koproporfirinogen oksidaza EC 1.3.3.3 Koproporfirinogen oksidaza je øesti encim, ki sodeluje v biosintezi hema. Nahaja se na notranji strani membrane mitohondrija. Mehanizmi za transport reaktantov in produkta skozi mitohondrijske membrane niso pojasnjeni. Hereditarna koproporfirija je akutna hepatiœna porfirija, ki se izraæa kot akutna nevroloøka porfirija ali porfirija s fotoobœutljivostjo ali pa kot oboje hkrati (v pribliæno 30% primerov). Bolezen se deduje avtosom-no dominantno s prirojeno encimsko okvaro koproporfirinogen oksi-daze. Laboratorijske preiskave pokaæejo zviøanje koproporfirina III v blatu in urinu. V akutnih stanjih bolezni so zviøane vrednosti porfo-bilinogena in ALA v urinu. Bolniki so obœutljivi na sonœno svetlobo zaradi kopiœenja porfirinov v koæi (10). Protoporfirinogen oksidaza EC 1.3.3.4 Sedmi encim v biosintezi hema je encim protoporfirinogen oksidaza v membrani mitohondrijev. Ta oksidira protoporfirinogen v protoporfirin IX. Protoporfirin IX nastaja z encimsko oksidacijo kot edini porfirin v biosintezi hema. Ostali porfirini nastajajo z neencimsko oksidacijo in predstavljajo ireverzibilno pot v biosintezi hema. Porfirija variegata se lahko pojavi kot akutna nevroloøka porfirija ali porfirija z moœno fotoobœutljivostjo ali kot oboje hkrati (v pribliæno 30 % primerov). Bolezen je dominantno dedna. Laboratorijski rezultati pokaæejo trajno zviøanje porfirinov in koproporfirinov v blatu. Akutni napadi bolezni so povezani z zviøanimi vrednostmi ALA, porfobilino-gena, koproporfirinov in uroporfirinov v urinu. Bolniki so moœno obœutljivi na sonœno svetlobo in mehanske poøkodbe (4). Ferohelataza EC 4.99.1.2 Zadnja faza v biosintezi hema je vgrajevanje Fe2+ v protoporfirin IX. To reakcijo katalizira encim ferohelataza na notranji membrani mito-hondrija. Tako nastane hem. Ferohelataza je specifiœna za Fe2+ in prepreœuje vezavo Fe3+ v molekulo porfirina. Za vezavo tekmujejo kovinski ioni z valenco 2+. Na primer: Zn2+ je v visokih koncentracijah prisoten ob nastajanju rdeœih krvnih celic in neposredno tekmuje z Fe2+ za encimski vstop v protoporfirin IX. Nastali cinkov protoporfirin (ZPP) je posredni pokazatelj razpoloæljivosti æeleza pri dozorevanju eritroblasta. Porast zviøanih koncentracij ZPP pri razliœnih pridobljenih motnjah je povezan z motnjami v metabolizmu æeleza, kar povzroœa pomanjkanje æeleza in anemije pri kroniœnih boleznih. Zviøane koncentracije aluminija pri dializnih bolnikih ali zastrupitev s svincem prav tako povzroœijo zviøanje ZPP z motnjo v metabolizmu æeleza (11). Aktivnost encima ferohelataze pri eritropoetiœni protoporfiriji znaøa 50 %. Zviøane so koncentracije protoporfirina v krvi, æolœu in blatu. Preseæek protoporfirina se nalaga v koæi, posledica je obœutljivost koæe na sonœno svetlobo æe v otroøtvu. Bolezen preide v kroniœno fazo kot solarni ekcem. Za zdravljenje bolnikov je potrebna primerna zaøœi-ta pred soncem in ß karoteni, ki zmanjøujejo fotoobœutljivost (12). Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki 4 Nadzor biosinteze hema V sintezo hema je vkljuœenih osem encimov, ki delujejo v tesni medsebojni povezavi. Genetski material, ki doloœa njihovo sintezo, je nameøœen na razliœnih kromosomih. Gena za sintazo aminolevulinske kisline in hidroksimetilbilan sintazo kontrolirata sintezo hema. Sintaza aminolevulinske kisline ima dva izoencima: eritroidnega in neeritroidnega. Eritroidni gen je bil izoliran na X kromosomu, neer-itroidni gen pa na kromosomu 3. V neeritroidnih tkivih je za normalno delovanje, na primer mitohondrijskih citohromov, potrebna nizka koncentracija hema. Neeritroidni izoencim se sintetizira na prostih poliri-bosomih v obliki predhodnika. Predhodnik se naprej preoblikuje v zrel encim preko translokacije v mitohondrijih predvsem s cepitvijo N-ter-minalnega konca predhodnika. Dokazano je, da hem inhibira prenos predhodnika sintaze aminolevulinske kisline v mitohondrijih, kar predstavlja pomembno kontrolno toœko, saj se sintaza aminolevulinske kisline v citoplazmi hitro razgrajuje. V nasprotju z drugimi celicami mora razvijajoœi se eritroblast akumulirati visoke koncentracije hema za nastanek hemoglobina. Hidroksimetilbilan sintaza ima tudi dve encimski obliki: eritroidno in neeritroidno, vendar se v nasprotju z sintazo aminolevulinske kisline te oblike razvijejo iz istega gena. Bolj kot sintaza aminolevulinske kisline deluje hidroksimetilbilan sintaza v dozorevajoœem eritrocitu kot kontrola za sintezo hema in omogoœa akumulacijo hema v eritrocitih. Humani gen je sestavljen iz 15 eksonov s preko 10 kilobaznih parov v DNA. Prisotna sta dva promotorja, ki povzroœita dve razliœni obliki sporoœilne mRNA: eritroidne in neeritroidne. Vodilni promotor je aktiven v vseh celicah in inducira transkripcijo daljøe neeritroidne mRNA, ki povzroœi nastanek izoencima, sestavljenega iz 361 aminokislin. Nevodilni promotor pa je aktiven samo v eritroidnem tkivu in povzroœi nastanek mRNA, ki je krajøa za sekvenco prvega eksona. Primarna struktura eritroidnega encima je zgrajena iz 344 aminokislin in je iden-tiœna strukturi neeritroidnega izoencima, razen v odsotnosti 17 aminokislin na amino terminalnem koncu. Okvara v prvem eksonu hidroksimetilbilan sintaznega gena lahko povzroœi normalno koncentracijo encima v razvijajoœem eritrocitu in zmanjøano koncentracijo v drugih tkivih. Pribliæno 5 % bolnikov z akutno prehodno porfirijo ima normalne koncentracije hidroksimetilbilan sintaze v eritrocitih (13). 5 Motnje v biosintezi porfirinov Izraz »porfirija« je leta 1911 opisal Günther (14). Porfirinske motnje so bile pred preuœitvijo biosinteze hema opredeljene s kliniœnimi znaœil-nostmi. Porfirije so tudi razvrøœene glede na vrsto tkiva, to je, ali gre za hepatiœno ali eritropoetiœno tkivo. Na sploøno porfirinske motnje delimo na primarne ali podedovane in sekundarne ali pridobljene motnje. Pridobljene motnje so veliko pogostejøe kot podedovana stanja. Laboratorijska podpora pri diagnostiki porfirinskih motenj je v doloœanju zviøanih porfirinov in porfirinskih intermediatov. Dodatne informacije dobimo z merjenjem aktivnosti posameznega encima, ki sodeluje v biosintezi hema in s testiranjem genske osnove. Danes je molekularna biologija vse bolj uveljavljeno diagnostiœno orodje za preuœevanje porfirij (15). Primarne ali podedovane porfirinske motnje Metabolne abnormalnosti v primarnih porfirinskih motnjah so rezultat podedovanih sprememb v genih, ki kodirajo specifiœne encime v biosintezi hema. Primarne porfirinske motnje lahko razdelimo v dve veœji skupini: 1) nevroloøke in/ali psihiatriœne oblike porfirij, ki se pogosto pojavljajo v akutnem stanju in 2) oblike, povezane s fotoobœutljivostjo (16, ). Ta razvrstitev je pomembna za diagnostiko bolezni. Simptomi nevroloøkih porfirij so na primer povezani z zviøan-jem predhodnikov porfirinov, porfobilinogena in ALA. Simptomi fotoobœutljivosti so povezani z akumulacijo porfirinov. Œe se porfirini poviøano izloœajo v urinu, gre za porfirinurijo, œe pa je zviøana njihova koncentracija v eritrocitih gre za porfirinemijo. Znane porfirije so: kon-genitalna eritropoetiœna porfirija (KEP), eritropoetiœna porfirija (EPP), hepatoeritropoetiœna porfirija (HEP), akutna intermitentna porfirija (AIP), hereditarna koproporfirija (HK), porfirija variegata (PV) in porfir-ija kutanea tarda (PKT). Vse te bolezni so podedovane, z izjemo PKT, ki je lahko podedovana ali pridobljena zaradi podedovane in/ali pridobljene okvare encima uroporfirinogen dekarboksilaze. Sekundarne ali pridobljene porfirinske motnje Nastajajo pod vplivom zunanjih dejavnikov kot so: zastrupitve s teæki-mi kovinami (najbolj pogosta je zastrupitev s svincem), alkoholom, pri anemijah, levkemijah, infekcijah, boleznih jeter in pri Hodgkinovi bolezni. Zviøano koncentracijo porfirinov zasledimo v urinu in blatu (17). 6 Analizni postopki 6.1 Doloœanje predhodnikov porfirinov Porfobilinogen in ALA sta dobro topna v vodi, se koncentrirata v urinu in ju zato v kliniœnih laboratorijih doloœamo skoraj izkljuœno v urinu. Postopki doloœanja porfobilinogena in ALA najpogosteje temeljijo na barvni reakciji z Ehrlichovim aldehidnim reagentom in kislo raztopino paradimetilaminobenzaldehida (DMAB). Porfobilinogen reagira z Ehrlichovim reagentom, pri œemer nastane obarvan produkt najpogosteje roænato rdeœe ali økrlatne barve. Danes uporabljamo veœ razliœnih modifikacij Ehrlichovega reagenta, ki se med seboj razlikujejo po koncentraciji DMAB ter vrsti in koncentraciji kisline. 6.1.1 Doloœanje porfobilinogena v urinu Za meritve porfobilinogena je pomembno, da loœimo med kvalitativnimi presejalnimi testi kot so Watson-Schwartzov (18) in Hoeschev test (19) in kvantitativnimi doloœanji. Presejalni testi so relativno slabo obœutljivi in pogosto laæno pozitivni, oziroma laæno negativni. Presejalni testi se v glavnem uporabljajo v primeru nujnih doloœitev, ki pa jih moramo kasneje potrditi s kvantitativno metodo. Referenœne vrednosti porfobilinogena v nakljuœnem vzorcu urina so pod 2,0 mg/L (8,8 µmol/L), v 24-urnem vzorcu pa pod 3,4 mg/d (15 µmol/d). Pri nevroloøkih ali psihiatriœnih porfirijah zasledimo tudi do 10-kratno zviøanje vrednosti porfobilinogena v urinu od zgornje referenœne meje. Danes so na træiøœu æe dostopni reagenti za porfobilinogen pre-sejalne teste, v katere je vkljuœen anionski izmenjevalec, ki loœi porfo-bilinogen od drugih interferenœnih substanc. Pri tem dobimo bolj zanesljive rezultate. Najpogostejøa metoda za kvantitativno doloœitev porfobilinogena je postopek z ionskim izmenjevalcem. Bolj obœutljive metode pa so osnovane na HPLC metodi (20). 6.1.2 Doloœanje ALA v urinu Pri odkrivanju akutnih nevroloøkih porfirij doloœamo ALA skupaj s por-fobilinogenom. Porfobilinogen in ALA sta zviøana pri akutnih porfirijah, farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles pri tem ALA nekoliko manj. ALA je pomembna øe pri ovrednotenju zelo redke porfirije zaradi zmanjøane aktivnosti porfobilinogen sin-taze. Postopki za doloœanje ALA so podobni tistim za doloœanje por-fobilinogena. Na razpolago imamo postopke z ionskimi izmenjevalci in alternativne fotometriœne metode za hitre teste. Postopki obiœajno zahtevajo dodatno reakcijo z reagentom, kot je acetilaceton, ki konvertira ALA v pirolni derivat, ki nato povzroœi nastanek znaœilne barve z Erlichovim reagentom. Problem interferenc je tu øe veœji kakor pri porfobilinogenu. Zviøane koncentracije ALA povzroœi tako akutna kot kroniœna izpostavljenost etanolu (21) in svincu (17). Pri doloœanju ALA je pomembno tudi shranjevanje vzorca do analize. Urine lahko shranjujemo pri 4oC v temi do 14 dni brez izgub aktivnosti ALA. Medtem ko je porfobilinogen bolj stabilen pri pH vrednosti 8 do 9, je ALA bolj stabilna pri pH vrednosti 3 do 4. Pri bolj kislem pH pa se njena stabilnost zmanjøa. Referenœna vrednost ALA v nakljuœnem vzorcu urina je pod 4,5 mg/L (34 µmol/L) in v 24-urnem urinu pod 7,5 mg/d (57 µmol/d). 6.2 Doloœanje porfirinov Veœina porfirinskih spojin moœno absorbira pri valovni dolæini 400 nm, kar imenujemo Soretov pas. Vzbujanje s Soretovim pasom proizvaja karakteristiœno fluorescenco v oranæno rdeœem obmoœju pri valovni dolæini 550 do 650 nm. Intenziteta fluorescence je odvisna od pH in je bolj intenzivna v kislih raztopinah. Fluorescenca omogoœa detekcijo porfirinov tudi v nanomolarnih koncentracijah. Kvantitativna metoda za indentifikacijo porfirinov je HPLC s fluorescenœnim detektorjem. Priprava ustreznih kalibratorjev predstavlja problem zaradi nizke topnosti porfirinov, teænje po dimerizaciji in tvorbe drugih oblik agregatov v vodnih raztopinah. Nove tehnike, kot so kapilarna elektroforeza (22) in masna spektrometrija (23), bodo imele pomembno vlogo v prihodnosti pri doloœanju porfirinov. 6.2.1 Doloœanje porfirinov v urinu V laboratorijih porfirine v urinu obiœajno doloœajo s presejalnimi testi, ki jim sledijo kvantitativne metode v primeru pozitivnih vzorcev (24). V nekaterih laboratorijih doloœajo porfirine v urinu neposredno s kvantitativno metodo. Referenœne vrednosti so: uroporfirin £3,9 (3,5-5,7) µmol/mol kreatinina ali £37 (32-63) nmol/dan in koproporfirin £22 (19-34) µmol/mol kreatinina ali £221 (195-320) nmol/dan. V literaturi je objavljeno veliko øtevilo razliœnih postopkov uporabe HPLC za doloœanje porfirinov v urinu (25). 6.2.2 Doloœanje porfirinov v krvi Koncentracija porfirinov v serumu in plazmi je zelo pomembna pri diagnostiki razliœnih porfirinskih motenj. Referenœna vrednost za celotne porfirine v serumu je pod 15 nmol/L. Najviøja koncentracija porfirina v polni krvi in eritrocitih je ZPP, ki ga ne najdemo v serumu in plazmi, razen ob prisotnosti hemolize. ZPP nastane v dozorevajoœem eritrocitu, œe je zmanjøana koncentracija razpoloæljivega æeleza. ZPP v polni krvi se v kliniœnih laboratorijih doloœa s fluorometrijo in z bolj dolgotrajnimi ekstrakcijskimi metodami. Referenœna vrednost ZPP v polni krvi in eritrocitih je 30 do 70 µmol/mol hema. Za doloœanje prostih ali s kovino kompleksiranih protoporfirinov v polni krvi obstajajo razliœni HPLC postopki (26). 6.2.3 Druge tehnike za doloœanje porfirinov v krvi Zviøano vsebnost porfirinov v eritrocitih lahko doloœamo neposredno z uporabo fluorescenœne mikroskopije v razmazih periferne krvi (27). Ta postopek se uporablja kot presejalni test za odkrivanje eritropoet-iœne porfirije. Vsebnost porfirinov v eritrocitni populaciji prav tako lahko doloœamo s pretoœno citometrijo, saj je porazdelitev florescent-nih eritrocitov drugaœna pri protoporfiriji v primerjavi z normalnimi vzorci (28). 6.2.4 Doloœanje porfirinov v blatu Analiza porfirinov v blatu se uporablja za diferencialno diagnostiko akutnih nevroloøkih porfirij, œeprav rezultati niso vedno jasni. Najbolj pomebna porfirina v diagnostiki porfirinskih motenj sta koproporfirin in protoporfirin (29). Referenœne vrednosti so: koproporfirin pod 200 µg/dan (<306 nmol/dan) ali <45 nmol/g suhe teæe in protoporfirin pod 1500 µg/dan (<2670 nmol/d) ali <150 nmol/g suhe teæe. Doloœanje uroporfirina je laæje in bolj ustrezno v vzorcih urina, kjer ne poteka razgradnja z bakterijami. V diagnostiœne namene je doloœanje porfirinov v æolœu, ki ga dobimo z duodenalno aspiracijo bolj primerno kakor v blatu, pri œemer pa problem predstavlja pridobitev vzorca. V blatu poteka bakterijska razgradnja, kar pogosto lahko privede do napaœne diagnoze porfirinskih motenj. 6.3 Doloœanje encimov, ki sodelujejo v sintezi hema Podedovane porfirinske motnje so povezane z zmanjøano aktivnostjo (aktivnost je 50 % ali manj) doloœenega encima. Z encimskimi testi farm vestn 2005; 56 Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki Preglednica 1: Pregled encimov v biosintezi porfirinov in hema (3). Table 1: Overview the Enzymes of Porphyrin and Heme Biosynthesis (3). ENCIMI (Ostala imena encimov) Dedne bolezni Zviøani intermediati 1. Sintaza aminolevulinske kisline Ni (Sintaza aminolevulinske kisline) 2. Sintaza porfobilinogena Porfirije Aminolevulinska kislina (Aminolevulinska dehidraza) (Aminolevulinska dehidrataza) (Aminolevulinska hidrolaza) 3. Hidroksimetilbilan sintaza AIP Porfobilinogen (Porfobilinogen deaminaza) Aminolevulinska kislina (Uroporfirinogen I sintaza) 4. Uroporfirinogen III sintaza KEP (Uroporfirinogen kosintaza) (Uroporfirinogen izomeraza) 5. Uroporfirinogen dekarboksilaza PKT in HEP Uroporfirin, Porfirini 6. Koproporfirinogen oksidaza HK Porfobilinogen, Koproporfirin 7. Protoporfirinogen oksidaza VP Porfobilinogen, Protoporfirin 8. Ferohelataza EPP Protoporfirin (Hem sintaza) (Hem sintetaza) (Protohem feroliaza) Legenda: EPP eritropoetiœna protoporfirija, KEP kongenitalna eritropoetiœna porfirija, AIP akutna intermitentna porfirija, HK hereditarna kopro-porfirija, VP variegate porfirija, PKT porfirija kutanea tarda, HEP hepatoeritropoetiœna porfirija, PKT porfirija kutanea tarda (V oklepajih so uporabljena imena encimov do leta 1992). lahko identificiramo tiste encime, pri katerih obstaja veœje tveganje za podedovane motnje. Tehniœne teæave, povezane z encimskimi testi bodo delno odpravljene øele, ko bomo v kliniœnih laboratorijih zaœeli rutinsko izvajati teste na genski osnovi. Primer je porfirija variegata, ki je povezana z zniæano aktivnostjo protoporfirinogen oksidaze in fero-helataze. Tako je verjetno zaradi dejstva, da se ti encimi nahajajo v kompleksu v mitohondrijih in nestabilnost enega vpliva tudi na drugega. Z drugimi besedami: doloœitev zniæanja encimske aktivnosti øe ne pomeni, da smo odkrili vzrok zmanjøanja, saj je to lahko sekundarna posledica podedovanim motnjam (15). Veœina nosilcev okvarjenih encimov, kot sta hidroksimetilbilan sintaza in uroporfirinogen dekar-boksilaza nikoli ne razvijejo bolezni zaradi njihove zniæane encimske aktivnosti (7). Z razvojem molekularne biologije na podroœju diagnostike monogenskih in poligenskih bolezni, ki se ukvarja z ugotavljanjem mutacij na enem ali obeh alelih genskega lokusa na avtosomnih kromosomih, se izboljøuje diagnostika in zdravljenje dednih porfirinskih motenj. 7 Sklep Pogostnost porfirij v Sloveniji je pribliæno enaka kot v ostalih dræavah po svetu. V zadnjih desetih letih je tehniœni napredek na podroœju molekularne biologije bistveno pripomogel k diagnozi mnogih podedovanih porfirinskih motenj. V svetu se æe v mnogih kliniœnih laboratorijih, inøtitutih in na fakultetah ukvarjajo z molekularno diagnostiko monogenskih in poligenskih bolezni. Laboratorijska diagnostika dednih porfirij z encimsko okvaro ostaja odprto vpraøanje v prihodnosti. Testiranje pridobljenih porfirinskih motenj se premalo uporablja. Zunanji dejavniki lahko bistveno in funkcionalno spremenijo biosinte-zo hema in lahko sluæijo kot znaœilni pokazatelji toksiœnih vzrokov obravnavanih bolezni. Za specifiœnega bolnika je kljuœen izbor primernih laboratorijskih testov za vrednotenje porfirinskih bolezni. Posebno mesto zavzemajo nujni primeri akutnih porfirij, pri katerih je potrebna kakovostna in uœinkovita laboratorijska podpora za pravilno diagnozo porfirinskih bolezni in primerno zdravljenje. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles 8 Literatura 1. Scott T. Eagles M. In: Concise Encyclopedia Biochemistry Second Edition. Berlin-New York 1988: 470-473. 2. Thomas M. Devlin. Biochemistry with clinical correlations. In: William M. Awad, Jr. Iron and heme metabolism, Fifth Edition. New York 2002: 1063-1071. 3. Tipton KF. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Enzyme nomenclature. Recommendations 1992. Supplement: corrections and additions. Eur J Biochem 1994: 1:1-5. 4. Kappas A, Sassa S, Galbraith RA, Nordmann Y. The porphyrias. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Vale D, eds. The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th edition. New York: McGraw- Hill 1995: 2103-51. 5. Dyer J, Garrick DP, Pye A. Plumboporphyria (ALAD deficiency) in lead work- er: A scenario for potential diagnostic confusion. British Journal of Industrial Medicine 1993; 50:1119-1121. 6. Warren MJ, Scott AI. Tetrapyrrole assembly and modification into the ligands of biologically functional cofactors. Trends Biochem. Sci 1990; 15:486-491. 7. Kushner JP. Laboratory diagnosis of the porphyrias. N. Engl. J. Med 1991;324:1432-1434. 8. Pollock SS, Rosenthal MS. Images in clinical medicine: Diagnosis of por- phyria. N.Engl. J. Med 1994; 330:114. 9. McManus JF, Begley CG, Ratnaike S. Complex pattern of alternative splic- ing in the normal uroporphyrinogen decarboxylase gene: Implications for diagnosis of familial porphyria cutanea tarda. Clin. Chem 1994; 40:1884-1889. 10. Woods JS, Miller HD. Quantitative measurement of porphyrins in biological tissues and evaluation of tissue porphyrins during toxicant exposures. Fundam. Appl. Toxicol 1993; 21:291-297. 11. Zachee P, Boogaerts MA, Lins RL, et al. Erythropoietin, aluminum, and anaemia in patients on haemodialysis. Lancet 1990; 335:1038-1039. 12. Takeda Y, Sawada H, Tashima M, et al. Erythropoietic protoporphyria with- out cutaneous photosensitivity and with ringed sideroblasts in an atomic bomb survivor. Lancet 1996; 347:395-396. 13. Hindmarsh JT. Enzyme heterogeneity in the porphyrias. Clin. Biochem 1990; 23: 371-374. 14. Rimington C. Was Hippocrates the first to describe a case of porphyria? Int. J. Biochem 1993; 25:1351-1352. 15. Schreiber WE. Acute intermittent porphyria laboratory diagnosis by molecu- lar methods. Clin. Lab. Med 1995; 15:943- 956. 16. Tefferi A, Solberg LA, Ellefson RD. Porphyrias: Clinical evaluation and inter- pretation of laboratory tests. Mayo Clin. Proc 1994; 69:289-290. 17. Labbe RF. Lead poisoning mechanisms. Clin. Chem 1990; 36:1870-1871. 18. Watson CJ, Taddeini L, Bossenmaier I. Present status of the Ehrlich alde- hyde reaction for urinary porphobilinogen. Jama 1964; 190:501. 19. Lamon J, With TK, Redeker AG. The Hoesch test: Bedside screening for uri- nary porphobilinogen in patients with suspected porphyria. Clin. Chem 1974; 20:1438-1440. 20. Jamani A, Pudek M, Schreiber WE. Liquid-chromatographic assay of urinary porphobilinogen. Clin. Chem 1989; 35:471-475. 21. Sieg I, Doss MO, Kandels H et al. Effect of alcohol on b-aminolevulinic acid dehydratase and porphyrin metabolism in man. Clin. Chim. Acta 1991; 202:211-218. 22. Wu N, Li, B, Sweedler J. V. Recent developments in porphyrin separations using capillary electrophoresis with native fluorescence detection. J. Liquid Chromatogr 1994; 17:1917-1927. 23. Luo J. Analysis of urinary and faecal porphyrin excretion patterns in human porphyrias by fast atom bombardment mass spectrometry. J. Pharm. Anal 1997;15:1289-1294. 24. Buttery JE, Chamberlain BR, Gee D et al. Total porphyrin and copropor-phyrin and uroporphyrin fractions in urine measured by second-derivative spectroscopy. Clin. Chem 1995; 41:103-106. 25. Zuijderhoudt FM, Koehorst SG, Kluitenberg WE et al. On accuracy and pre- cision of a HPLC method for measurement of urine porphyrin concentrations. Clin Chem Lab Med 2000; 38:227-230. 26. Sato H, Ido K, Kimura K. Simultaneous separation and qucation of free and metal-chelated protoporphyrins in blood by dimensional HPLC. Clin. Chem 1994; 40:1239-1244. 27. Todd DJ, Nesbitt GS, Lavery TD et al. Erythropoietic protoporphyria: The problem of a suitable screening test. Acta Derm. Venereol (Stockh) 1990; 70:347-350. 28. Schleiffenbaum BE, Minder EI, Mohr P et al. Cytofluorometry as a diagnosis of protoporphyria. Gastroenterology 1992; 102:1044-1048. 29. Zuijderhoudt FM, Kamphuis JS, Kluitenberg WE et al. Precision and accu- racy of a HPLC method for measurement of fecal porphyrin concentrations. Clin Chem Lab Med 2002; 40:1036-1039 farm vestn 2005; 56 Strokovni œlanki - Professional Articles Øvedski monopol prodaje zdravil nasproten evropskemu pravu -kaj pa slovenska ureditev? Janja Bedraœ Nedavno je Sodiøœe ES razglasilo øvedski monopolov nad prodajo zdravil na drobno za nasproten naœelom notranjega trga Evropske unije. Pri tem je postavilo nekatera pomembna pravna pravila, ki jih morajo upoøtevati tudi dræave œlanice pri presoji skladnosti njihovih nacionalnih ureditev na podroœju trgovine z zdravili. Na Øvedskem lahko na podlagi Zakona o trgovini z zdravili (1996:1152 om handel med läkemedel m.m.) trgovino zdravil na drobno brez recepta in na recept izvajajo le dræava ali pravne osebe, na katere ima dræava prevladujoœ vpliv. Zakon doloœa izjemo od tega pravila glede trgovine na drobno doloœenih zdravil bolniønicam, zdravnikom in veterinarjem - tako trgovino lahko namreœ izvajajo drugi dobavitelji, œe imajo dovoljenje za trgovino na debelo. Za krøitev tega zakona je predvideno kaznovanje z globo ali z zaporno kaznijo dveh let ali veœ. Od leta 1970 je bila prodaja zdravil na drobno na Øvedskem zaupana druæbi pod dræavno kontrolo Apoteket, ki je uæivala prodajni monopol. Apoteket je øvedska druæba z omejeno odgovornostjo v glavnem z neprofitno podlago, katere upravo sestavljajo politiki in dræavni uradniki; øvedska vlada pa ima v tej druæbi dvotretjinski veœinski deleæ njenega kapitala. Apoteket ne uvaæa zdravil sam, ampak mu jih dobavljajo bodisi neposredno proizvajalci na Øvedskem bodisi grosista Kronans Droghandel in Tamro, ki delujeta zgolj kot logistiœna centra za dostavo zdravil Apoteketu. Slednji razpolaga s pribliæno 800 lekarnami, ki jih ima v lasti in jih sam vodi. Lokacijo teh lekarn je doloœil Apoteket v tesnem sodelovanju z obœinskimi organi in z organi s podroœja zdravstva. V ruralnih obmoœjih Apoteket uporablja pribliæno 970 farmacevtskih agentov, ki jih nadzoruje. Zaloge farmacevtskih zastopnikov so v lasti Apoteketa, njihov izbor pa doloœa regionalni direktor le-tega skupaj z lokalnimi zdravstvenimi sluæbami. Nazadnje je tudi Apoteket po telefonu prodajal zdravila brez recepta. Primer je priøel pred Sodiøœe Evropske skupnosti (odslej Sodiøœe ES) po tem, ko so øvedski organi zaœeli kazenski postopek zoper g. Hannerja kot direktorja øvedske druæbe Bringwell International AB, katere delni lastniki so Norveæani in delni Øvedi. Ta druæba je med 30. majem in 27. julijem 2001 na trg dala dvanajst embalaæ za obliæe in nikotinske æveœilne gumije (ti proizvodi se po øvedskem zakonu øteje-jo za zdravila brez recepta) in s tem krøila øvedsko ureditev, ki trgovi- ni na drobno pridræuje zdravila v Apoteketu. V svojo obrambo je g. Hanner pred øvedskim sodiøœem zatrjeval, da ta ureditev ustvarja dræavni monopol, ki je v nasprotju z 28., 31. in 43. œlenom Pogodbe o ES (PES). Ker so se nacionalnemu sodniku postavljala vpraøanja glede skladnosti navedene øvedske ureditve s pravom Skupnosti, je zaprosil Sodiøœe ES za pojasnila. 31. œlen PES od dræav œlanic zahteva, da prilagodijo dræavne monopole ekonomske narave, tako da zagotovijo odpravo diskriminacije med dræavljani dræav œlanic, in sicer tako kar zadeva pogoje naroœanja blaga kot njihove prodaje. 31. œlen PES je uvrøœen med doloœila, ki zagotavljajo prost pretok blaga. Njegov temeljni namen je dræavam œlanicam prepreœit uporabo njihovih ekonomskih monopolov za protekcionistiœne namene in s tem oblikovanje ovir prostemu pretoku blaga, ki jih druga doloœila PES specifiœno prepovedujejo. 31. œlen PES torej predstavlja specifiœno doloœilo, katerega namen je odpraviti ovire prostemu pretoku blaga, ki izhajajo iz ravnanja dræavnih monopolov. Glede na predpostavke navedenega doloœila sta g. Hanner in Evropska komisija pred Sodiøœem ES trdila, da je øvedska ureditev prodaje dræavni diskriminatorni monopol, ki je v nasprotju s œlenom 31 ES. V podporo svojim staliøœem je Komisija trdila, da opisana ureditev prodaje zdravil lahko ogrozi trgovino zdravil iz drugih dræav œlanic glede na trgovino nacionalnih zdravil in je torej lahko diskriminatorna. Sistem izbire zdravil brez recepta naj ne bi bil pregleden, naj ne bi predvideval obrazloæitve v primeru zavrnitve in naj se nad njim ne bi izvajal neodvisen nadzor. Prodajno omreæje naj bi v velikem delu temeljilo na farmacevtskih zastopnikih, katerih niti øtevilo niti poloæaj naj ne bi bila podvræena objektivnim merilom ali moænostim nadzora. Øvedska vlada je nasprotno navedla veœ trditev, ki utemeljujejo, da ureditev prodaje zdravil ni dræavni diskriminatorni monopol, ki bi bil v nasprotju z 31. œlenom PES. To je argumentirala z dejstvom, da je bil izbor zdravil na recept odvisen bistveno od dejavnikov, na katera Apoteket ni imel nobenega vpliva, torej od dejstva, ali je zdravilo subvencionirano ali ne, in od izbire zdravnika, ki predpiøe zdravilo. Enako naj bi izbor zdravil brez recepta temeljil na objektivnem merilu strogo træne narave, torej na predvidljivi oceni povpraøevanja. Poleg tega naj bi moral Apoteket dobaviti vsako zahtevano zdravilo in naj bi v praks s centralnim in informatiziranim registrom proizvodov, odobrenih kot Janja Bedraœ, univ. dipl. prav., dipl. ekon., Pravna fakulteta Univerze v Mariboru farm vestn 2005; 56 131 Strokovni œlanki - Professional Articles zdravila za prodajo na Øvedskem, to izvrøil v øtirindvajsetih urah. Za vsak nov proizvod, ki je odobren kot zdravilo, naj bi vsem lekarnam poslal broøure s podatki. Sicer pa naj bi proizvajalci z oglaøevanjem za zdravila brez recepta svobodno vplivali na povpraøevanje potroønikov in na odloœitve izbire Apoteketa. Sodba Sodiøœa ES Sodiøœe ES je svojo presojo zaœelo s poudarkom, da se doloœba 31 œlena PES uporablja za dræavne monopole træne narave in to za vse organe, s katerimi dræava œlanica pravno ali dejansko, neposredno al posredno nadzoruje, doloœa ali obœutno vpliva na uvoz ali izvoz med dræavami œlanicami. Na tej osnovi je Sodiøœe ES zakljuœilo, da opisana øvedska ureditev prodaje pomeni dræavni monopol træne narave. V bistvu Apoteket opravlja træno dejavnost, torej prodajo zdravil na drobno, ki ji jo omenjeni øvedski zakon izkljuœno pridræuje. Øe veœ, øvedska vlada ne ugovarja temu, da Apoteket glede te dejavnosti nadzoruje dræava zaradi svoje veœinske udeleæbe v kapitalu te druæbe in v strukturi njenega upravljanja. 31. œlen PES sicer ne zahteva popolne ukinitve dræavnih monopolov træne narave, vendar pa doloœa tako prilagajanje, da se glede pogojev nabave in træenja odpravi vsakrøna diskriminacije med dræavljan dræav œlanic. Namen 31. œlena PES je v bistvu uskladiti moænost dræav œlanic, da ohranijo doloœene monopole træne narave kot sredstva za dosego ciljev javnega interesa z zahtevami vzpostavitve in delovanja skupnega trga. Njegov cilj je odpravljanje ovir za prosti pretok blaga z izjemo omejevalnih uœinkov glede menjav, ki niso povezane z obstojem zadevnih. Na tej osnovi je glede monopolov prodaje Sodiøœe presodilo, da niso sprejemljivi monopoli, ki delujejo tako, da je trgovina blaga iz drugih dræav œlanic pravno ali dejansko zapostavljena glede na trgovino nacionalnega blaga. Naloga Sodiøœa ES je bila preuœiti, ali naœin ureditve in delovanja zadevnega dræavnega monopola lahko zapostavlja zdravila iz drugih dræav œlanic in ali v praksi ta monopol zapostavlja taka zdravila. Pri tem je Sodiøœe ES sklicujoœ se na preteklo sodno prakso poudarilo, da mora sistem izbire monopola prodaje temeljiti na neodvisnih mer-ilih izvora proizvodov in mora biti pregleden, tako da doloœa obveznost obrazloæitve odloœitev in neodvisni postopek nadzora. Nato mora biti njegovo omreæje prodaje organizirano tako, da øtevilo krajev prodaje ni omejeno na to, da se økoduje oskrbi; konœno pa morajo biti ukrepi træenja in oglaøevanja istega monopola nepristranski in neodvisni od izvora proizvodov in se morajo uporabljati za spoznavanje potroønikov z novimi Sodiøœe ES pa je v predmetnem primeru ugotovilo, da øvedska ureditev (sporazum med øvedsko vlado in Apoteketom) ne doloœa niti naœrta nakupa niti sistema „ponudb“, v okviru katerih naj bi bili proizvajalci, katerih proizvodi niso izbrani, upraviœeni do obvestila obrazloæitve odloœitve o izboru. Prav tako ne predpisuje moænosti ugovora tej odloœitvi pred organom neodvisnega nadzora. Nasprotno je po tem dogovoru videti, da ima Apoteket naœeloma proste roke pri izbiranju po svoji volji. To dejstvo je zadostovalo za ugotovitev, da naœin ureditve in delovanja Apoteketa in natanœneje njegovega sistema izbora zdravil lahko neugodno vpliva na trgovino z zdravili iz drugih dræav œlanic glede na trgovino øvedskih zdravil. Tako se dræavn monopol ne vodi tako, da izkljuœi vsakrøno diskriminacijo zoper zdrav-ila iz drugih dræav œlanic in poslediœno krøi 31. œlen PES. V drugem delu sodbe se je Sodiøœe ES ukvarjalo z vpraøanjem, ali je mogoœe predstavljeno ureditev vendarle opraviœiti z doloœenimi utemeljenimi razlogi. Pri opraviœevanju dræavnih monopolov je potrebno upoøtevati drugi odstavek 86. œlena PES, ki doloœa: »Podjetja, pooblaøœena za opravljanje storitev sploønega gospodarskega pomena, oziroma podjetja, ki imajo znaœaj dohodkovnega monopola, ravnajo po pravilih iz te pogodbe, zlasti po pravilih o konkurenci, kolikor uporaba takønih pravil pravno ali dejansko ne ovira izvajanja posebnih nalog, ki so jim dodeljene. Razvoj trgovine ne sme biti prizadet v takønem obsegu, ki bi bil v nasprotju z interesi Skupnosti.« Glede tega iz sodne prakse Sodiøœa izhaja, da se œlen 86(2) ES lahko navaja v utemeljitev, œe dræava œlanica dodeli podjetju za upravljanje s storitvami v sploønem gospodarskem interesu izkljuœne pravice, ki so v nasprotju s œlenom 31(1) ES, œe se izpolnitev posebne naloge, ki mu je bila dodeljena, lahko zagotovi le z dodelitvijo teh pravic in toliko, da razvoj menjave ni ogroæen tako, da bi bil v nasprotju z interesom Skupnosti. Opraviœilo øvedske ureditve je Sodiøœe ES kratko zavrnilo meneœ, da brez sistema izbora, ki naj bi izkljuœil vsakrøno diskriminacijo zdravil iz drugih dræav œlanic, sporna ureditev prodaje zdravil ni opraviœljiva. Na tej osnovi je Sodiøœe ES zakljuœilo, da øvedski dræavni monopol nad prodajo zdravil na drobno nasprotuje pravu ES. Ali iz tega izhaja tudi pouk za Slovenijo? Øvedska ureditev prodaje zdravil na drobno je zelo specifiœna. Vendar pa tudi v Sloveniji najdemo podroœja, na katera bi lahko aplicirali pravna pravila Sodiøœa ES v navedenem primeru. V tem okviru bi æeleli izpostaviti podroœje imunoprofilakse in kemoprofilakse. V Sloveniji se imunoprofilaksa in kemoprofilaksa izvajata na osnovi predpisanih programov za posamezne skupine prebivalcev. Cepljenje izvajajo zdravniki v zdravstvenih zavodih in zasebni zdravniki, pa tudi Inøtitut RS za varovanje zdravja, delo vseh pa usklajujejo obmoœni koordinatorji na Zavodih za zdravstveno varstvo in nacionalni koordinator pri Inøtitutu za varovanje zdravja. V skladu z vsakoletnim programom imunoprofilakse in kemoprofi-lakse, ki ga izda minister za zdravje, se le-ti izvajata izkljuœno s preparati, ki jih za obmoœje Republike Slovenije nabavlja, skrbi za kontrolo njihove kakovosti, centralno shranjuje in distribuira Inøtitut RS za varovanje zdravja. Ekskluzivna pravica Inøtituta za varovanje zdravja do nabave in distribucije cepiv in drugih zdravil, namenjenih imunoprofilaksi in kemo-profilaksi, nasprotuje ustavno zajamœeni pravici do svobodne gospodarske pobude in predstavlja obliko pravno zavarovanega dræavnega monopola. Monopol Inøtituta za varovanje zdravja namreœ zasebno-pravnim subjektom prepreœuje, da bi opravljali dejavnost nabave in distribucije imunoloøkih zdravil, s œimer je na tem podroœju odpravljena konkurenca. Ne glede na posebnosti, so zdravila, vkljuœno z imunoloøkimi zdravili, blago, za katerega je v okvirih Evropske unije predviden prost pretok, distribucija zdravil pa predstavlja dejavnost, za katero je po farm vestn 2005; 56 Øvedski monopol prodaje zdravil nasproten evropskemu pravu - kaj pa slovenska ureditev? slovenskem nacionalnem in po pravu ES potrebno zagotoviti svobodno konkurenco. Sodba Sodiøœa ES v øvedskem primeru ter analiza starejøe sodne prakse Sodiøœa ES s podroœja dræavnih monopolov dokazujeta, da ekskluzivna pravica nabave in distribucije imunoloøkih zdravil, ki je s podzakonskimi predpisi podeljena Inøtitutu za varovanje zdravja RS, ni zakonita – ne samo z vidika slovenskega notranjega prava glede na pomanjkanje zadostnih pooblastil v zakonskih predpisih – ampak tudi z vidika prava ES. Ekskluzivna pravica prodaje nujno vkljuœuje centralizacijo vsega naroœanja predmeta prodaje. Subjekt, kakrøen je IVZ, ki ima monopolno pravico prodaje doloœenega proizvoda, predstavlja ne samo edinega prodajalca tega proizvoda v Sloveniji, ampak je tudi edini slovenski naroœnik tega proizvoda. Proizvajalci in prodajalci na debelo se lahko namreœ obrnejo samo na IVZ, da bi si zagotovili prodajo doloœenih imunoloøkih zdravil odjemalcem na slovenskem trgu. Kar je pri tem moteœe za Sodiøœe ES, je dejstvo, da lahko nacionalni prodajni monopolist, tako kot uvozni monopolist, sam doloœa, kateri proizvodi bodo plasirani na trg zadevne dræave œlanice. S tem pa je monopolist tudi v poloæaju doloœanja stopnje uvoza iz drugih dræav œlanic, na enak naœin kot imetnik ekskluzivne uvozne pravice. Vse navedeno velja za IVZ, ki ima pravico neodvisno odloœiti (œeprav v sodelovanju z zdravstvenim strokovnim svetom), katera munoloøka zdravila bo prodajal svojim odjemalcem in bodo poslediœno imela dostop na slovenski trg Pri tem poudarjamo, da pri omejevanju ekskluzivnih pravic javnopravnih subjektov, ki so pogosto podeljene pod krinko javnega interesa, nacionalno in evropsko pravo izpostavljata tudi drugi vidik javnega interesa, ki je v koristih, ki jih svobodna konkurenca predstavlja za potroønike (in nacionalne zavode zdravstvenega zavarovanja). Ta interes je namreœ ratio veœine pravnih pravil proti ekskluzivnim pravicam na gospodarskih podroœjih, kakrøno je træenje imunoloøkih zdravil Zanimivosti iz stroke Poroœilo z 9. sreœanja uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev in Poroœilo s Satelitskega simpozija ob 10-obletnici ustanovitve mreæe uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev Martina Cvelbar Letoønje sreœanje uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev je potekalo ob deseti obletnici ustanovitve mreæe uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev (Official Medicine Control Laboratory Network – OMCL Network). Mreæa uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev je v obdobju desetih let vzpostavila pomembne mehanizme kontrole kakovosti zdravil v evropskem prostoru. V letu 1998 je vzpostavila postopek poenotene kontrole in sproøœanja krvnih izdelkov in cepiv v Evropski uniji in Evropskem gospodarskem prostoru (Official Control Authority Batch Release Procedure – postopek OCABR). Postopek je bil v zadnjih letih uspeøno dopolnjen s postopkom poenotene kontrole in sproøœanja imunoloøkih zdravil za uporabo v veterinarski medicini. V l. 1999 je EMEA v sodelovanju z EDQM in nacionalnimi pristojnimi organi za zdravila izdelala postopek za vzorœenje in testiranje zdravil, ki so pridobila dovoljenje za promet po centraliziranem postopku registracije (Centrally Authorised Products Programme – CAP Programme). Tudi program CAP je odprt za sodelovanje le za œlanice Evropske unije in Evropskega gospodarskega prostora. Zavod za farmacijo in za preizkuøanje zdravil Ljubljana kot uradni kontrolni laboratorij za kontrolo kakovosti zdravil za uporabo v humani medicini sodeluje v mreæi od ustanovitve dalje. Z vstopom Republike Slovenije v Evropsko unijo 1. maja 2004 pa se je aktivno vkljuœil tudi v postopek OCABR in program CAP. Mreæa uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev preverja usposobljenost laboratorijev s øtudijami preverjanja usposobljenosti laboratorijev (Proficiency Testing Studies). V desetletnem obdobju je OMCL Network organiziral veœ kot petdeset tovrstnih øtudij. Mreæa uradnih kontrolnih laboratorijev je izdelala vodila za izgradnjo sistema zagotavljanja kakovosti v preskusnih laboratorijih za analizno preskuøanje zdravil, ki temeljijo na mednarodnem standardu SIST EN ISO/IEC 17025. Vodila z novo sprejetimi dokumenti OMCL Network vsako leto izpopolnjuje z novo sprejetimi dokumenti kakovosti. Del dokumentov sistema zagotavljanja kakovosti je sprejela tudi Evropska akreditacija (EA). V evropskem pravnem redu je sedaj vloga kontrole kakovosti zdravil v prometu in urad- nih kontrolnih laboratorijev opredeljena in formalizirana z direktivo 2004/27/EC (dopolnjuje direktivo 2001/83/EC –zdravila za uporabo v humani medicini) in direktivo 2004/28/EC (dopolnjuje direktivo 2001/82/EC – zdravila za uporabo v veterinarski medicini). V svetovalni organ mreæe OCABR evropskih uradnih kontrolnih laboratorijev (Ad-GEON) je bila letos prviœ s øtiriletnim mandatom izvoljena tudi predstavnica slovenskega uradnega kontrolnega laboratorija, dr. Martina Cvelbar. Letos je ob letnem sreœanju uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev prviœ od obstoja mreæe potekal tudi simpozij, odprt øirøi strokovni javnosti, predvsem farmacevtski industriji. Na simpoziju so bile predstavljene dejavnosti Evropskega direktorata za kakovost zdravil, povezane z mreæo uradnih evropskih kontrolnih laboratorijev. Na okrogli mizi, ki je sledila predstavitvam, je farmacevtska industrija lahko izrazila priœakovanja glede prihodnjega razvoja dejavnosti OMCL Network. farm vestn 2005; 56 133 Zanimivosti iz stroke Novice iz sveta farmacije Urejajo: dr. Andrijana Tivadar, mag. farm.; Petra Slanc, mag. farm.; dr. Bojan Doljak, mag. farm.; prof. dr. Borut Øtrukelj, mag. farm. Stoletnica hormonov Pripravila: Petra Slanc Junija bo poteklo sto let od prve omembe besede hormon. Ernest Henry Starling, profesor fiziolologije v University College v Londonu, je prviœ leta 1905 uporabil besedo hormon za »snovi, ki predstavljajo kemiœne prenaøalce med celicami in celotnim krvoæil-jem ter lahko koordinirajo aktivnost in rast razliœnih delov telesa«, v svojem predavanju o vplivih izloœkov trebuøne slinavke na gas-trointestinalni trakt. Tedaj ugledni profesor je leta 1915 prav tako opredelil aktivnosti srca, ki ga danes poznamo pod imenom Frank-Starlingov zakon srca. Beseda hormon izvira iz grøke besed hor-man, ki pomeni vzpodbuditi. Ideja o kemiœnih prenaøalcih je obstajala æe pred Starlingom. V svojih raziskavah sta Nemec Arnold Adolphe Berthold in Francoz Claude Bernard v sredini devetnajstega stoletja predvidevala, da mora obstajati nekakøna komunikacija med organi. Kasneje pa so øtevilni zdravniki uporabljali izvleœke iz æivalskih endokrinih ælez za zdravljenje motenj v delovanju øœit-nice, nadledviœne æleze in trebuøne slinavke. V œasu prve omembe hormonov, ko se o hormonih ni vedelo praktiœno niœ, pa vse do danes, sto let kasneje, je znanost naredila velik korak naprej. Vse od razumevanja delovanja pa do kontracepcije, in vitro fertilizaci-je, pa tudi do proizvodnje humanih rekombi-nantnih hormonov. Danes vemo, da hormoni koordinirajo in se vkljuœujejo v metabolne in razvojne procese v razliœnih celicah in da se njihovo delovanje lahko sproæi tudi kot odgovor na odzive iz okolja. Hormonov pa ne najdemo le v æivalskem svetu. Zanimivo je, da nekatere nevrotransmiterje najdemo tudi kot signalne molekule v rastlinah (serotonin) in »primitivnih« organizmih, kar ne dvomno kaæe na razliœno vlogo tekom revolucije. Prav zanimivo je, kako se zgodovina ponavlja, kako opredelitev in poimenovanje doloœenih pojmov za sabo potegne razvoj in raziskovanje, samo pomislimo na besede, kot so: »radioaktivnost«, »kromosom«, »antibiotik«, »apoptoza« in seveda »molekularna biologija«. Nihœe ni mogel predvideti razvoja, ki smo mu bili priœa zadnjih sto let, morda pa se bodo œez sto let spomnili na izjavo Nielsa Bohra, ki je dejal, da je najteæje napovedovanje, øe posebno tisto o prihodnosti. Viri: EMBO reports 6 Najbolj prodajana humana zdravila v letih 2002-2004 Pripravila: Petra Slanc V junijski izdaji revije Drug Discovery Today je bila objavljena preglednica najbolj prodajanih zdravil v letih od 2002 do 2004. V øtudi-jo so bili vkljuœeni podatki razliœnih podatkovnih baz (IMS – »zlati standard«, Datamonitor, Script, Prous, Reuters in IBM), kot tudi objave proizvajalcev na njihovih spletnih straneh. Glede na podatke podatkovne baze IMS naj bi celotna svetovna prodaja v letu 2004 znaøala 550 milijard dolarjev, 55 milijard naj bi odpadlo na pripravke z rekombinantnimi uœinkovinami ter 62 milijard na generike. V œlanku je tudi izrecno poudarjeno, da ni nujno da se podatki podatkovne baze IMS in podatki proizvajalcev ujemajo, zato podatke med sabo ne gre primerjati. Razlike so posledica vzorœenja podatkov podatkovne baze IMS. IMS zbira podatke na podlagi prodaje v posameznih dræavah v okviru podatkov veledrogerij, posameznih farmacevtov in nacionalnih projektov. Za doloœene dræave teh podatkov ne dobivajo, kar je eden glavnih razlogov zgoraj omenjenih razlik. Kljub temu pa je potrebno poudariti, da navadno prispevek takønih dræav bistveno ne vpliva na celotno potroønjo, saj kar veœ kot 86 % celotne prodaje odpade na Severni del Amerike, Japonsko in Evropo. Po drugi strani pa na razlike lahko vplivajo tudi drugi dejavniki, kot so menjalni teœaji, vzporedni uvozi, reklamacije ipd. Primerjalne analize so pokazale tudi, da IMS v doloœenih primerih lahko preceni svoje ocene tudi za veœ kot 1 milijardo dolarjev, kot je to v primeru pripravkov Lipitora (atrovas-tain) in Nexiuma (esomaprazol). Pripravki z rekombinantnimi uœinkovinami so v preteklem letu predstavljali kar 10 % celotne svetovne prodaje, pripravki v preglednici 2 pa so doprinesli kar 68 % prodaje. Do sedaj je na trgu 197 pripravkov z rekom-binantnimi uœinkovinami in nadaljnjih 800 v razvoju, od tega jih kar 100 œaka le øe na registracijo in dovoljenje za træenje. Zelo visoki stroøki pripravkov z rekombinant-nimi uœinkovinami in dejstvo, da bo v kratkem potekla patentna zaøœita prvi generaciji tovrstnih pripravkov, odpira novo pot in moænost biogenerikom (biogenerics, biosim-ilars). Kljub zelo moœnem nasprotovanju orig-inatorjev se tako v ZDA kot tudi v EU oblikujejo naœini same registracije biogenerikov, kar bo vsekakor botrovalo k niæjim cenam pripravkov z rekombinantnimi uœinkovinami. Glede na podatke naj bi v naslednjih petih leti potekla patentna zaøœita 35 uœinkovinam, ki doprinesejo na ameriøkem trgu 82 milijard dolarjev letno, to pa naj bi povzroœilo izgubo trga originatorjev, v najboljøem 25 % in 40 % v najslabøem primeru, v korist generikov. Poleg tega pa naj bi se v svetovnem merilu v naslednjih letih okrepil tudi deleæ Japonske farmacevtske industrije. 134 farm vestn 2005; 56 Zanimivosti iz stroke Preglednica 1. Lista 15 najbolj prodajanih zdravil v letu 2004. Najbolj prodajana zdravila v letih 2002-2004 pripravek proizvajalec prodaja v letu 2002 (milijarede dolarjev) prodaja v letu 2003 (milijarede dolarjev) prodaja v letu 2004 (milijarede dolarjev) proizvajalec IMS proizvajalec IMS proizvajalec IMS Lipitor (atrovastain) Pfizer 7,90 8,60 9,23 10,3 10,86 12,0 Zocor (simvastatin) Merck 5,60 6,20 5,01 6,10 5,20 5,90 Plavix (klopidrogrel) BMS in SA 3,10 - 4,20 3,70 5,20 5,50 Advair (flutikason; salmetrol) GSK 2,00 - 3,60 - 4,50 4,70 Norvasc (amlodipin) Pfizer 3,80 4,00 4,33 4,50 4,46 4,80 Zyprexa (olanzepin) Eli-Lilly 3,60 4,00 4,27 4,80 4,42 4,80 Paxil (paroksetin) GSK 1,90 - 3,00 3,90 3,90 3,90 Nexium (esomaprazol) AstaZenica 1,97 - 3,30 3,80 3,88 4,80 Zoloft (sertralin) Pfizer 2,74 - 3,10 3,40 3,36 - Celebrex (celekoksib) Pfizer 3,00 - 1,90 2,50 3,30 - Effexor (venlafaksin) Wyeth 2,00 - 2,70 - 3,30 3,70 Prevacid (lansoprazol) Takeda in Abbott 3,70 3,60 3,30 4,00 3,10 3,80 Diovan (valsartan) Novartis 1,66 - 2,50 - 3,10 - Fosamax (alendronat) Merck 2,20 - 2,50 - 3,10 - Risperdal (risperidon) J&J 2,10 - 2,50 - 3,00 - okrajøave: BMS – Bristol-Myers Squibb, SA – Sanofi-Avensis, GSK – GlaxoSmithKline, J&J – Johnson and Johnson, - -podatki niso na voljo Preglednica 2. Lista najbolj prodajanih pripravkov z rekombinantnimi uœinkovinami. Najbolj prodajani pripravki z rekombinantnimi uœinkovinami v letih 2002-2004 pripravek Proizvajalec (-i) prodaja v letu 2002 (milijarde dolarjev) prodaja v letu 2003 (milijarde dolarjev) prodaja v letu 2004 (milijarde dolarjev) Araneps, Epogen, Epogin, Procrit in NeoRecormon (a in a – eritropoetin) Amgen, Kirin, J&J, Roche in Sankyo 8,60 10,30 11,80 Avonex, Betaseron, Pegasys, PEG Intron in Refib (a in a – interferon) Biogen IDEC, Chiron, Roche, Schering AG, Schering Plough, Serono 5,60 5,20 6,80 Humalin, Humalog in Novulin (humani insulin) Eli-Lily in Novo Nordisk 4,20 4,60 5,60 Neulasta in Neupogen (G-CSF) Amgen, Roche in Schering 1,5 2,70 3,00 Rituxan (rituksimab) Roche 1,1 2,20 2,80 Enbrel (etanercept) Amgen in Wyeth 0,80 1,30 2,60 Remicade (infliksimab) J&J 1,30 1,70 2,10 Humatrope, Neutropin, Protopin in Saizen (humani rastni hormon) Akzo Nobel, Biogen IDEC, Eli-Lilly, Novo Nordisk, 1,20 1,60 1,80 Roche in Serono Herceptin (trastuzumab) Roch 0,80 1,00 1,80 Synagis (palivizumab) MedImmune 0,67 0,85 0,85 okrajøave: J&J - Johnson and Johnson farm vestn 2005; 56 Zanimivosti iz stroke Viri: Drug Discovery Today 10 (2005): 739-742 Express Pharma Pulse 5 2004 (http://www.expresspharmapulse.com/20040 205/editorial02.shtml) Express Pharma Pulse 29 2004 (http://www.expresspharmapulse.com/20040 129/oped01.shtml) www.ims-global.com/insight/insight.htm www.datamonitor.com www.reutersbusinessinsight.com/content/rb hc0091.pdf Novi antiemetiki za zdravljenje slabosti in bruhanja pri kemoterapiji Pripravila: Petra Slanc Slabost in bruhanje sta med bolniki, ki se zdravijo z razliœnimi oblikami kemoterapije ali pa z njo zaœenjajo, dva najbolj neprijetna neæelena uœinka. Nenadzorovano bruhanje vsekakor zmanjøa kvaliteto æivljenja bolnika in je lahko vzrok tudi slabøega sodelovanja bolnika pri zdravljenju. Poskusi zmanjøevanja oziroma prepreœevanja slabosti in bruhanja, ki sta posledici zdravljena z doloœenimi kemotrepevtiki, so stari æe veœ kot 40 let, vendar pa je vidnejøi napredek vezan na zadnjih 15 let. V letu 1990 je bil razvit prvi selektivni antagonist 5-hidroksitriptamin receptorjev tipa 3 (5-HT3). Leta 1995 pa je bilo pokazano tudi ugodno delovanje soœasnega jemanja kortikosteroidov. Kljub napredku pa je potrebno poudariti, da se pri øtevilnih bolnikih øe vedno pojavljata tako slabost, kot tudi bruhanje ob samem zdravljenju. Med najnovejøimi uœinkovinami, ki so na voljo na trgu, predstavlja palonosetron æe drugo palonosetron generacijo antagonistov 5-HT3 receptorjev. Prva generacija antagonistov 5-HT3 recep-torjev (ondansetron, dolasetron, granisetron in tropisetron) se uporablja predvsem pri zdravljenjih, ki povzroœajo srednje moœno akutno emezo (slabost in bruhanje se pojavita v 24 urah po kemoterapiji). V primeru zakasnjene emeze, pa je njihova uœinkovitost niæja. Palonosetron se razlikuje od do sedaj dosegljivih antagonistov 5-HT3 receptorjev prav v dolæini delovanja, saj je njegov razpolovni œas 40 h, in v kar 30-krat veœji afiniteti do receptorjev. V dosedanjih kliniœnih øtudijah so bolniki palonosetron zelo dobro prenaøali, kot glavna neæelena uœinka sta se pojavljala glavobol (10 %) in zaprtje (5 %). Nadaljnje øtudije so usmerjene v soœasno jemanje palonosetrona s kortikosteroidi, ki se uporabljajo v profilaksi emeze pri srednjih in visokih emetogenih oblikah kemoterapije. V proces nastanka slabosti in bruhanja so vpleteni øtevilni procesi. Do nedavnega so ta proces povezovali s tremi tipi nevrotrans-mitrskih povezav oziroma receptorjev, in sicer z D2, 5-HT3 in kanabioidnimi receptorji tipa 1. Leta 2003 pa se je pojavila tudi prva uœinkovina, ki deluje kot antagonist substance P na NK-1 receptorjih. Aprepitant, pravkar registriran tudi v Sloveniji, je selektivni zaviralec NK-1 receptorjev. Uporablja se predvsem za zaviranje slabosti in bruhanja v primeru visoko emetogenih oblik kemoterapije. Poleg samega jemanja aprepitanta potekajo øtudije tudi o uœinkih soœasnega jemanja aprepitanta z antagonisti 5-HT3 in deksometazonom. Glede na dosedanje rezultate naj bi se tovrstni reæim zdravljenja uporabljal predvsem za nadzor slabosti in CF3 aprepitant bruhanja pri daljøem zdravljenju oziroma pri ponavljajoœem zdravljenju v veœ krogih. Kljub oœitnemu napredku pri prepreœevanju slabosti in bruhanja, povzroœenima s strani kemoterapije, bo potrebno opraviti øe øtevilne kliniœne øtudije, ki bodo odgovorile na mnoga vpraøanja, kot so na primer reæim jemanja ter soœasna uporaba drugih antiemetikov. Viri: Nature clinical practice 2, 2005: 196-201 http://www.emend.com/emend/shared/docu-ments/pi.pdf http://www.aloxi.com/images/downloads/pi.pdf 136 farm vestn 2005; 56 Iz druøtvenega æivljenja Simpozij ob 30. skupøœini SFD 12. - 14. maj 2005, Portoroæ Jelka Dolinar Prvi dan tradicionalnega simpozija Slovenskega farmacevtskega druøtva ob redni letni skupøœini je bil letos namenjen temi o pomenu farmacevtskih informacijskih centrov. Predstavljene so bile izkuønje iz Velike Britanije in vizija delovanja takega centra v Sloveniji. Farmakoterapevtska tema, ki je potekala v petek cel dan, je obravnavala problematiko zdravljenja starostnikov. Simpozija se je udeleæilo preko 300 œlanov Druøtva in drugih strokovnjakov. Delegati 30. skupøœine so potrdili poroœilo predsednika Druøtva o delu, poroœilo o poslovanju in poroœilo nadzornega odbora. Poroœevalci so izpostavili pomen druøtva pri organizaciji razliœnih oblik izobraæevanj œlanov tako doma kot v tujini. Razveseljuje ugotovitev, da se je s tem zelo poveœal pretok informacij in prenos novih spoznanj v prakso. Udeleæenci kongresov posredujejo informacije bodisi s predavanji v podruænicah ali pa s pisnimi prispevki, kar utemeljuje øtevilno udeleæbo na razliœnih strokovnih prireditvah doma in v tujini. Posebna pozornost je bila namenjena porabi letne œlanarine Druøtva. Deleæ œlanarine se v strukturi prihodkov niæa, œeprav øtevilo œlanov rahlo naraøœa. Konec leta 2004 je imelo Druøtvo 2751 œlanov. Dejstvo je, da Druøtvo samo s œlanarino ne bi zmoglo nuditi œlanom vseh realiziranih programov. Œlani se lahko udeleæijo razliœnih druæabnih sreœanj, za katera samo izjemoma prispevajo minimalni znesek (smuœarsko tekmovanje, Martinovanje, øportne igre), brezplaœna je udeleæba na strokovnih predavanjih po podruænicah in sekcijah. Tudi udeleæba na drugih strokovnih sreœanjih, kongresih in delavnicah doma in v tujini, ki jo financira Druøtvo svojim œlanom s podporo sponzorjev in ni dohodninsko obremenjena, predstavlja ugodnost, ki jo imajo samo œlani Druøtva. Od œlanarine pripada 30 % podruænicam, 10 % sekcijam, preostali del œlanarine pa matiœno druøtvo nameni sofinanciranju Farmacevtskega vestnika. Veliko novost in za œlane veliko ugodnost predstavljajo tudi storitve Farmacevtskega informacijskega centra, ki je svoje delo zaœel maja 2005. Œlanom SFD, ki bodo iskali odgovore na strokovna vpraøanja, bo Center preko medm-reæja nudil brezplaœne informacije. Delegati so potrdili viøino druøtvene œlanarine za leto 2005: zaposleni farmacevti 7.000 SIT tehniki 5.500 SIT seniorji in øtudenti 3.500 SIT vpisnina 1.000 SIT Poslovni rezultat druøtva v letu 2004 je bil zelo dober in ga bo Druøtvo namenilo za izvedbo naœrtovanih aktivnosti, ki nimajo druge materialne podlage, med drugim za izvajanje storitev informacijskega centra, ki bodo namenjene tudi promocijskim aktivnostim, da bi zagotovil veœjo prepoznavnost farmacevtske stroke in njeno vrednotenje. Delegati 30. skupøœine so potrdili spremembo temeljnega akta druøtva, ki jo je predlagal izvrøni odbor glede mandatov organov Druøtva. IZVRØNI ODBOR SFD S to spremembo ohranimo dveletne mandate, poveœamo pa øtevilo njihovih ponovitev. Doslej so Pravila dopuøœala moænost ene ponovne izvolitve, po novem bodo œlani lahko isto funkcijo opravljali 4 zaporedne mandate oziroma 8 let skupaj. 30. skupøœina druøtva je sprejela tudi sploøni Pravilnik o delovanju podruænic in sekcij druøtva. Æe aprila pa je izvrøni odbor potrdil Pravilnik o izplaœilih fiziœnim osebam, v katerem je Druøtvo natanœno opredelilo sistem izplaœil potnih stroøkov fiziœnim osebam, financiranje izobraæevanja œlanov druøtva na drugih prireditvah doma in v tujini ter izplaœila honorarjev in nagrad. Delegati 30. skupøœine so izvolili nove organe druøtva za obdobje 2005 - 2007. Predsednik druøtva Matjaæ Jeras Podruænica, Sekcija Podruænica - Celjska Mirjam Hoœevar Koroøec Podruænica - Dolenjska Marjan Balkovec Podruænica - Gorenjska Tina Bukovec Kosmaœ Podruænica - Ljubljanska Gaøper Marc Podruænica - Mariborska Matejka Kumperøœak - Duh Podruænica - Pomurska Marija Balaæiœ Podruænica - Posavska Ana Dolinøek Weiss Podruænica - Primorska Andrej Fister Podruænica - Zasavska Tjaøa Abram Lekarniøka zbornica Slovenije Andreja Œufar Homeopatska sekcija Linda Œiœigoj Sekcija bolniøniœnih farmacevtov œlan bo javljen naknadno Sekcija farmacevtskih tehnologov Saøa Baumgartner Sekcija farmacevtskih tehnikov Zdenko Tauøiœ Sekcija farmacevtskih znanosti Julijana Kristl Sekcija kliniœnih farmacevtov œlan bo javljen naknadno Sekcija farmacevtov javnih lekarn Lidija Pavloviœ Sekcija seniorjev Marija Brenœiœ Sekcija øtudentov Nada Œebron Lipovec Sekcija za farmacevtsko kemijo Lucija Peterlin Maøiœ Regulatorna sekcija Simona Cencelj farm vestn 2005; 56 137 Iz druøtvenega æivljenja Prejemniki druøtvenih priznanj v letu 2005 (z desne predsednik Druøtva M. Jeras, N. Bernat, M. Klanjøœek, B. Korpar, D. Obersnel, I. Maleøiœ, L. Pavloviœ, Z. Tauøiœ, A. Tuøar, predsednik Odbora za podeljevanje druøtvenih priznanj S. Primoæiœ) Nadzorni odbor Janez Kerœ Lili Grosek Jasna Majdiœ Disciplinsko sodiøœe Jana Fortuna Nada Jazbec Aleø Krbavœiœ Odbor za podeljevanje druøtvenih priznanj Aleø Mrhar Nada Ajdiøek Mila Boæiœ Lovro Dermota Martina Klanjøœek Silva Smolej Slavko Rataj Odgovorni urednik Farmakona Aleø Mlinariœ Izvrøni odbor je na 30. skupøœini podeli naslednja druøtvena priznanja: Minarikovo odliœje doc. dr. Ivanu Maleøiœu Minarikova priznanja mag. Nadi Bernat, mag. farm. Martini Klanjøœek, mag. farm. Brigiti Korpar, mag. farm Dalji Obersnel, mag. farm., spec Lidiji Pavloviœ, mag. farm Zdenku Tauøiœu Anici Tuøar, mag. farm Utemeljitev za Minarikovo odliœje Doc. dr. Ivan Maleøiœ je s svojim delom moœno zaznamoval pedagoøko, znanstvenoraziskovalno in strokovno dejavnost na podroœju kliniœne biokemije Preteæni del delovne dobe je preæivel v diagnostiœnem laboratoriju sploøne bolnice na Ptuju, kjer si je vseskozi prizadeval za razvoj diagnostiœne laboratorijske sluæbe v regiji Svoje delo je namenil tudi vzgoji in izobraæevanju kadrov, kjer je od leta 1978 deloval kot docent na katedri za kliniœno biokemijo na dodiplomski in podiplomski ravni. O doseækih pri znanstveno-raziskovalnem delu priœa 78 objav v domaœih in tujih strokovnih revijah od tega je objavil kar 8 izvirnih raziskovalnih œlankov, 4 œlanke vabljenih predavanj ter œlanke in povzetke, s katerimi je sodeloval na znanstvenih sestankih in konferencah doma in v tujini Veœ mandatov je bil œlan uredniøkega odbora Farmacevtskega vestnika in prvi predsednik strokovne revije Jugoslovanska medicinska biokemija. V okviru Druøtva medicinskih biokemikov Jugoslavije so mu zaupal øtevilne odgovorne funkcije. Zelo aktivno je sodeloval tudi na mednarodnem nivoju: pri Izdajateljski svet Mojca Kerec Tatjana Kogovøek Vidmar Mateja Maleøiœ Stane Srœiœ Zofija Vitkoviœ Anamarija Zega Magda Zimic Odgovorni urednik Farmacevtskega vestnika Borut Øtrukelj Predsednik Odbora za podeljevanje druøtvenih priznanj prof. dr. Stanislav Primoæiœ in predsednik Druøtva doc. dr. Matjaæ Jeras sta podelila Minarikovo odliœje doc. dr. Ivanu Maleøiœu 138 farm vestn 2005; 56 Iz druøtvenega æivljenja mednarodni zvezi za kliniœno kemijo je bi œlan odbora izvedencev za uœinke zdravil v kliniœni kemiji, bil je pridruæeni œlan komiteja za spremljanje koncentracij zdravil v krvi. Kot œlan strokovnih odborov je veliko prispeval k uspeøni organizaciji strokovnih sestankov. Delo doc. Maleøiœa poznajo in cenijo strokovnjaki v Sloveniji in tujini, o œemer priœajo øtevilne objave, vabljena predavanja in œlanstvo v uredniøkih odborih strokovnih revij. Navezal je stike s sorodnimi inøtitucijami v tujini in doma. Prek znastveno-razisko-valnih nalog, s predavanji, delom v organih Slovenskega farmacevtskega druøtva in Slovenskega zdruæenja za kliniœno kemijo, je poskrbel za implementacijo svojega znanja in izkuøenj v laboratorijsko medicino in s tem veliko prispeval k njenemu razvoju Za doseæke na raziskovalnem podroœju in za zasluge za razvoj slovenske farmacije podeljuje izvrøni odbor doc dr. Ivanu Maleøiœu Minar?ikovo odliœje. Utemeljitve za Minarikova priznanja Strokovno delo magistre Nade Bernat je bilo vedno odmevno in priznano zlasti v Pomurski regiji. S posebno zavzetostjo si je prizadevala za ustrezno vrednotenje farmacevtove-ga dela v druæbi. Za njeno predano delo za Sekcijo bolniøniœnih farmacevtov ji izvrøn odbor podeljuje Minar?ikovo priznanje Magistra Martina Klanjøœek ima izredne zasluge za popularizacijo farmacevtske stroke na Primorskem in øe posebej v Posoœju Naredila je izjemo v pravilu, da so lekarne razvite samo tam, kjer gospodarske razmere to omogoœajo. Za njeno publicistiœno delo, zavzeto mentorsko delo in pomemben prispevek pri uveljavljanju lekarniøke farmacije, podeljuje izvrøni odbor magistri Martini Klanjøœek Minar?ikovo priznanje. Motiviranost za delo in komukativnost so usmerjali magistro Brigito Korpar pri vodenju Mariborske podruænice. Profesionalnost in sposobnost koordiniranja so ji omogoœil izvedbo øtevilnih strokovnih in druæabnih sreœanj na regijskem in nacionalnem nivoju Za njeno predano delo ji izvrøni odbor podeljuje Minar?ikovo priznanje Magistra Dalja Obersnel je s svojim delom veliko prispevala k ugledu bolniøniœne ekarne. Med prvimi v Sloveniji je zakljuœila specializacijo iz farmacevtske tehnologije, mnoge generacije tehnikov in farmacevtov Vabljeni gostje in prejemniki druøtvenih priznanj v prvi vrsti Tartinijevega gledaliøœa v Piranu se je spominjajo kot predane in dosledne mentorice. Za njen prispevek k bogatitvi bol-niøniœne farmacije ji izvrøni odbor podeljuje Minar?ikovo priznanje. Za zavzeto strokovno in raziskovalno delo na podroœju lekarniøke farmacije, ki ga je veœkrat predstavila v obliki vabljenih predavanj in posterjev na kongresih doma in v tujini ter za njen prispevek k razvoju Sekcije farmacevtov javnih lekarn podeljuje izvrøni odbor Minar?ikovo priznanje magistri Lidiji Pavloviœ. Velika delovna vnema, kreativnost in posluh za stroko so lastnosti, ki odlikujejo Zdenka Tauøiœa. Vseskozi si prizadeva za sodelovanje vseh poklicev znotraj zdravstvenega teama in ustrezno umestitev farmacevtskega tehnika v njem ter njegov strokovni in osebnostni razvoj. Za zavzeto delo mu izvrøn odbor podeljuje Minar?ikovo priznanje. Magistra Anica Tuøar æe dolga leta aktivno deluje v Primorski podruænici, v kateri je uspela povezati razliœne regijske interese pri doseganju strokovnih ciljev. Za njeno predanost stroki ji izvrøni odbor podeljuje Minar?ikovo priznanje j^faL * ¦»¦ , ^-k^^L jtL .1 nBoB^^jD ^H ^W^H Ji W •¦jI ^Lv^V^^^sflR ^pv [\XM L • ^H ^B ^^^k Vabljeni gostje na slavnostni podelitvi druøtvenih priznanj (tretji z leve, predsednik strokovno-organizacijskega odbora prof. dr. Aleø Mrhar) farm vestn 2005; 56 139 Iz druøtvenega æivljenja Poroœilo z 10. kongresa Evropskega zdruæenja bolniøniœnih farmacevtov (EAHP) Deseti kongres EAHP se je letos odvijal v Palexpo kongresnem centru v Lizboni, od 16. do 18. marca 2005. Ob 10. jubileju so organizatorji na kratko predstavili v sliki in besedi vseh devet dosedanjih kongresov. Predsednik organizacijskega odbora Nizozemec prof. Arnold G. Vulto je v uvodnem nagovoru ob otvoritvi posebej pozdravil novi œlanici Latvijo in Estonijo ter zaæelel dobrodoølico Poljski, Litvi, Cipru in Malti, ki se bodo prikljuœile Zdruæenju letos. Predsednica EAHP, Francozinja Jacqueline Surugue je orisala delo zdruæenja v œasu svojega predsedovanja, ko si je prizadevala za prepoznavnost bolniøniœnega farmacevta – specialista in njegovo umestitev v sistem varne uporabe zdravil v bolniønicah vseh dræav EU, s œimer je prepriœala tudi evropski parlament. Na letoønji razstavi, ki je spremljala kongres, je sodelovalo kar 41 razliœnih proizvajalcev zdravil, opreme za avtomatizacijo distribucije zdravil, individualno odmerjanje, za popolno parenteralno prehrano in opreme za pripravo citostatikov. Vzdolæ razstavnih prostorov je potekala poster sekcija. Na kongresu je bila velika pozornost namenjena farmakoekonomiki. Kljuœno predavanje na to temo je imel dr. Vassilis Kontozamanis iz Grœije, ki je poroœal o povraœilih stroøkov zdravljena s strani dræave. Poudaril je pomen restrikcij in strokovnih priporoœil pri predpisovanju, pri œemer bi morala vsaka dræava uravnoteæiti novosti na farmacevtskem trgu in koristnost le-teh za skupnost. Praktiœne izkuønje sta predstavila dr. Kramer iz Nemœije in dr. Jenzer iz Øvice. Dr. Kramer je predstavil formularium njihove bolniønice z listo zdravil, ki jo lahko predpisujejo v njihovi bolniønici in je v pisni in elektronski obliki dostopna vsem zdravnikom v bolniønici. Formularium pripravlja »Pharmacy and Therapeutics Commitee«, ki mu obiœajno predseduje farmacevt. Preden uvrstijo neko zdravilo na listo, natanœno pregledajo podatke o zdravilu v neodvisnih virih, moæne stranske uœinke, interakcije primerjajo z analognimi zdravili iz te indikacijske skupine, komlianco, hkrati ugotavljajo moænost zamenjave z generiœnimi zdravili, ocenijo kvaliteto proizvajalca v primeru generiœne zamenjave. Generiœna zamenjava poteka na prvem nivoju, na drugem nivoju poteka zamenjava s podobnim zdravilom. Zdravnik ima vedno moænost izbire draæjega zdravila, vendar mora to zahtevo pisno utemeljiti in posredovati v potrditev komisiji. Dr. Jenzer iz Øvice je predstavil far-makoekonomsko øtudijo o porabi medicinskega potroønega materiala, ki so jo izvajali na primeru oskrbe rane. Prikazal je vpliv farmacevta v kliniœni praksi na zniæevanje stroøkov. V okviru seminarja s podroœja far-makoekonomike je dr. Louis Niessen iz Rotterdama govoril o nujnosti far- makoekonomskih priporoœil, ki naj bi jih imela vsaka ustanova. Enostavno zmanjøanje stroøkov je moœ doseœi z zmanjøanjem celotnega proraœuna, vendar s tem ukrepom moœno prizadenejo kakovost storitve. Drugi model je t.i. »cost efectiveness«, ki ga uporablja veœina dræav. Pri tem je kljuœni problem cenovna meja za øe dovolj dobro zdravilo glede na resnost bolezni. Uœinkovitost modela pogosto zavisi od deleæa sredstev, ki jih dræava namenja za zdravila. Precej pozornosti je bilo na kongresu namenjene zdravljenju onkoloøkih bolnikov, saj je v onkologiji poraba zdravil najbolj v porastu, tako finanaœno kot koliœinsko. EAHP si prizadeva oblikovati smernice glede generiœne zamenjave zdravil za zdravljenju novotvorb. Za mnoge dræave je generiœna zamenjava zdravil edina moænost, ki jim omogoœa zdravljenje po zadnji doktrini. Druge dræave dobijo s tem moænost, da lahko preizkuøajo vsa nova zdravila, ki so na razpolago na podroœju onkologije. Profesor Mike Allwood je poudaril pomen stabilnosti onkoloøkih pripravkov, ki jo lahko zagotovijo edino bolniøniœni farmacevti z ustrezno pripravo in distribucijo pripravka. Opozoril je tudi na problem far-makogenomike, ki jo mnoæiœno uvajajo v onkoloøko prakso, kljub temu, da se vœasih veœ kot 30 procentov bolnikov ne odzove na zdravljene. Zdravljenje bi lahko racionalizirali tako, da bi potekalo ciljano na podlagi izsledkov genetskih analiz tumorjev. farm vestn 2005; 56 Iz druøtvenega æivljenja Poroœilo z generalne skupøœine Evropskega zdruæenja bolniøniœnih farmacevtov (EAHP) Tajda Gala Miharija Generalna skupøœina EAHP je bila v Parizu od 9. do 12. junija 2005. Prvi dan so bila na skupøœini predstavljena poroœila œlanov odbora in poroœila o aktivnostih v zvezi s projekti, ki teœejo v okviru EAHP ter poroœila delegacij dræav œlanic EAHP; drugi dan je bil namenjen strokovni temi, delo pa je potekalo v delovnih skupinah. Projekti EAHP: 1. Kongresna dejavnost Kongres EAHP 2005 je potekal v Lizboni na Portugalskem z glavno temo: Bolniøniœna farmacija in ekonomija. Leta 2006 bo kongres v Genevi v Øvici z glavno temo Kakovost in varnost zdravljenja. Glavna predavanja so izdali na zgoøœenki, ki so jo prejeli vsi œlani EAHP skupaj z glasilom EJHP. 2. Publicistiœna dejavnost EAHP EAHP izdaja uradno glasilo æe 10 let. Glasilo prejemajo vsi œlani nacionalnih zdruæenj bol-niøniœnih farmacevtov, ki so vœlanjena v EAHP. Zadnja 4 leta je œasopis izhajal v treh jezikih: angleøœini, nemøœini in francoøœini, od letos dalje bo izhajal samo v angleøœini. Slovenija se je v letu 2004 predstavila v poglavju Focus Slovenia, v jubilejni øtevilki EJHP pa so bili objavljeni rezultati raziskave iz leta 2004 o izobraæevalnih programih za kadre v bolniøniœnih lekarnah po Evropi, ki jo je vodila slovenska predstavnica v odboru EAHP. Œasopis EJHP se z letoønjim letom deli v dva dela: EJHP Practice in EJHP Science, vsak bo izøel 6 krat letno. EJHP Science ima v mednarodnem odboru tudi slovensko predstavnico, prof. dr. Mirjano Gaøperlin, mag.farm. 3. Raziskave EAHP 2005 EAHP æe tretjiœ izvaja raziskovalni projekt. Pri slednjem je sodelovala tudi Slovenija. V projekt je vkljuœenih 28 evropskih dræav in prviœ poteka elektronsko. Vpraøalnik vsebuje 90 vpraøanj s podroœja bolniøniœne farmacije. Zbiranje odgovorov bo zakljuœeno 31. oktobra 2005. Za izvedbo raziskave, ki obsega elektronsko distribucijo vpraøalnikov in statistiœno obdelavo podatkov, je EAHP sklenilo pogodbo s slovenskim podjetjem. 4. Spletna stran Prenovljena spletna stran EAHP bo omogoœala: prijavo za kongres in plaœilo kotizacije, nakup knjig , izpolnjevanje vpraøalni-ka raziskave EAHP 2005 ter povezavo z drugimi sorodnimi organizacijami. Strokovna tema je obravnavala Varnost bolnika. Za varnost zdravljenja bi moral biti v vsaki bol-niønici vzpostavljen sistem, ki bi temeljil na skupinskem delu teama: zdravnik - medicinska sestra - bolniøniœni farmacevt. Bolniøniœni farmacevt bi imel pomembno vlogo pri zagotavljanju veœje varnosti zdravljenja in zmanjøe-vanju napak pri zdravljenju z zdravili. S prof. Arnoldom Vultom iz Nizozemske sva predstavila rezultate raziskave o varnosti bol-niøniœnega zdravljenja (EAHP Survey: Patient Safety, maj 2005), ki sem jo izvedla v 25 evropskih dræavah. Prikazala je aktivnosti bol-niøniœnih farmacevtov pri zagotavljaju varnega zdravljenja z zdravili, pri razvoju sistema varnega zdravljenja in pri evidentiranju napak. Raziskava je pokazala tudi sistem in oblike izobraæevanja o varnosti zdravljenja z zdravili v razliœnih evropskih dræavah. Posebej sem poroœala o raziskavi, ki jo je pod okriljem Ministrstva za zdravje RS izvedla Komisija za zdravila iz Kliniœnega centra v Ljubljani v vseh slovenskih bolniønicah. Sporoœilo Evropske komisije generalni skupøœini, ki ga je posredoval dr. Fernand Sauer, direktor javnega zdravja in zaøœite potroønika pri Evropski komisiji, da je varnost bolnika prva skrb zdravstvenih delavcev, usmerja vse aktivnosti bolniøniœnih farmacevtov k vzpostavljanju in zagotavljanju pogojev za varno zdravljenje z zdravili v bolniønicah Cilj EAHP je vkljuœiti v evropsko organizacijo vse evropske dræave œlanice Sveta Evrope. Slovenija je œlanica æe od leta 1996, za nami so vstopile øe Œeøka in Hrvaøka, leta 2004 Latvija in Estonija, v letu 2005 pa Poljska in Litva. Po novem statutu predstavljajo upravni odbor Zdruæenja, poleg predsednika in podpredsednika, øe direktorji podroœij za znanost in raziskovanje, za strokovna podroœja, za organizacijo, za finance in za zunanje zadeve. Slovenija ima v odboru od leta 2000 svojo predstavnico s funkcijo direktorice za strokovno podroœje Fondacija EAHP je bila ustanovljena leta 2002 z namenom pospeøevati strokovn razvoj dræav œlanic, ki na podroœju bolniøniœne farmacije øe ne dosegajo ravn stroke razvitejøih zahodnoevropskih dræav. Fondacija bo v bodoœe pokrovitelj in organizator mednarodnih uœnih delavnic za posamezna podroœja bolniøniœne farmacije z namenom izobraæevanja bolniøniœnih farmacevtov centralne in vzhodne Evrope ter vezn œlen med evropskimi dræavami pri izmenjavah za pridobivanje izkuøenj v praksi v pomembnejøih evropskih bolniønicah oziroma bolniøniœnih lekarnah. Glavni projekt Fondacije EAHP pa je priprava standardov za posamezna podroœja bolniøniœne farmacije. Tajda Gala Miharija, mag. farm., spec. (predstavnica Sekcije bolniøniœnih farmacevtov pri SFD v upravnem odboru EAHP, direktorica za strokovno podroœje EAHP) farm vestn 2005; 56 141 Iz druøtvenega æivljenja Poroœilo o 1st PharmSciFair & Exhibition Julijana Kristl 1st PharmSciFair (Pharmaceutical Sciences Fair & Exhibition) je organiziralo 26 razliœnih strokovnih zdruæenj iz trinajstih evropskih dræav, med katerimi je bilo tudi Slovensko farmacevtsko druøtvo. Simpozij, ki je potekal v Nici od 12. do 17. junija 2005, se je priœel v nedeljo z otvoritvijo in predstavitvijo posameznih organizatorjev. SFD je bilo prikazano izvrstno! Med vabljenimi predavatelji velja izpostaviti Nobelovega nagrajenca iz leta 2002 prof. dr. Kurta Wüthrichta iz ETH v Zürichu ter predstavnika iz DG Research European Commission. Simpozij je potekal v øestih ali sedmih sekcijah hkrati iz razliœnih podroœij farmacevtskih znanosti v obliki vabljenih predavanj, kratkih ustnih predstavitev in posterjev. Simpozija se je udeleæilo veœ kot 1000 raziskovalcev in znanstvenikov v glavnem iz evropskega prostora. Predavanja udele-æencev so bila iz vseh podroœij farmacevtskih znanosti na visoki znanstveni ravni, predvsem pa s poudarkom na novostih, ki jih uvajajo v vsakdanje raziskovalno in razvojno delo. Zanimiva je bila tudi razstava razliœnih proizvajalcev, predvsem manjøe tehnoloøke opreme, analiznih naprav in znanstvene literature. Med razstavljalci so bili tudi eksperti za øiroko podroœje farmacevtskih dejavnosti, ki so ponujali celovite reøitive doloœenih projektov. Iz Slovenije je bilo prijavljenih 14 udeleæencev. Na 1st PharmSciFair smo predstavili naøe raziskovalno delo z 12 prispevki (ustno in s plakati), bili moderatorji treh sekcij in se neposredno pogovarjali ter izmenjali izkuøenje z raziskovalci renomiranih inøtitutov in tovarn. Glede na øtevilne œestitke po dveh predavanjih in velik interes za vsebino naøih posterjev ocenjujemo, da je bila predstavitev raziskovalnega dela raziskovalcev iz Slovenije izredno uspeøna. Izlet seniorjev v Furlanijo Julijsko krajino Brenœiœ Marija Seniorska sekcija pri SFD je organizirala tridnevni izlet na Goriøko in v Furlanijo - Julijsko krajino. Spoznali smo zgodovino krajev, ki so bili nekoœ sestavni deli avstroogrske monarhije, z Rapalsko pogodbo leta 1920 pa so jih prikljuœili Italiji Oglede smo zaœeli v Vipavskem Kriæu, kjer je æivel in pridigal Janez Svetokriøki s pravim menom Tobia Lionelli. Njegov skoraj 3000 strani obsegajoœ zbornik pridig, ki je izøel v 5 knjigah, je shranjen v znamenitem kapucinskem samostanu. Samostan, ki je bi ustanovljenim z namenom øirjenja krøœanstva kot protiuteæ protestantizma, se ponaøa z bogato knjiænico in samostansko cerkvijo, ki se je ohranila do danaønjih dni. Grad z obzidjem je æal samo delno obnovljen. Tud Primoæ Trubar je obiskal Vipavski Kriæ in na mestu, kjer je pridigal, stoji spominska ploøœa. Na Stari gori nad Œedadom Pot nas je vodila dalje na Kostanjevico pri Novi Gorici, ki jo domaœini poznajo pod imenom Kapela. Leta 1985 je bilo celotno obmoœje Kostanjevice razglaøeno za umetnostni in arhitekturni spomenik. Obsega cerkev in franœiøkanski samostan z bogato økrabœevo knjiænico, ki so jo leta 2004 odprli tudi za javnost. Knjiænica nosi ime po patru Stanislavu Økrabcu (1844 -1918), najveœjem slovenskem jezikoslovcu - slovenistu 19. stoletja, ki je na Kostanjevici æivel nad øtirideset let. Knjiænica ima nad 10.000 knjig, med njimi predstavljajo posebno dragocenost okrog 30 inkunabul ter Bohoriœeva slovnica iz leta 1584 Arcticae horule (Zimske urice) z avtorjevim lastnoroœn-im posvetilom. Grobnica Burbonov, ki leæi v prostorih pod cerkvijo, daje temu spomeniku dodatno zgodovinsko vrednost. Æe deset let deluje na Kostanjevici Don Pierinova komuna za zdravljenje odvisnikov od drog. 142 farm vestn 2005; 56 Iz druøtvenega æivljenja Pred najstarejøo hiøo v Œedadu Dan smo zakljuœili v Solkanu z ogledom solkanskih mostov - kamnitega æelezniøkega mostu iz leta 1906, ki se ponaøa z najdaljøim kamnitim lokom v Evropi ter betonskega mostu iz leta 1986, po katerem teœe ozimska cesta, ki povezuje Gorico z Goriøkimi Brdi Naslednji dan nas je pot vodila po Italiji. V Sredipolju (Redipuglia) smo si ogledal najveœji italijanski spomenik 1. svetovne vojne, na katerem je pokopanih 100.000 padlih vojakov. Razprostira se na meji med kraøko planoto in Furlansko niæino. Na 22-tih terasah so pokopani znani vojaki (40.000), v kapeli pa sta urejeni dve kostnici z neznanim padlimi vojaki (60.000), muzej in maketa bojiøœa. Povzpeli smo se tudi do ene od pomembnejøih toœk frontne œrte v 1. svetovn vojni, vzpetine Sveti Mihael in si ogledal podzemne vojaøke rove Voænja z ladjico do romarske cerkve na otoœku Barbana v bliæini letoviøkega kraja Gradeæ je bilo posebno doæivetje Dan smo zakljuœili z ogledom znamenite bazi-ike v Ogleju (Aquilea). Mesto so ustanovil Rimljani leta 181 pr. n. øt. kot vojaøko naselbino. Tolminski zgodovinar Simon Rutar v svoj knjigi: Pokneæena grofija Goriøka in Gradiøœanska (1893) navaja, da so iz Ogleja, ki je bil pomembno trgovsko in vojaøko srediøœe, rimske legije izvajale kontrolo nad mesti, ki so jih osvojile vse do Donave. V œasu rimskega cesarja Avgusta je mesto doæivelo svoj najveœji razcvet in je imelo okrog 200.000 prebivalcev. Prve stavbe, namenjene bogosluæju, so bile zgrajene v zaœetku 4. stoletja, ko se je tu pojavilo krøœanstvo. V letih od 167 do 169 je v Ogleju deloval tudi rimski zdravnik in farmacevt Galenos. Priøel je na proønjo rimskih cesarjev Verusa in Aureliusa, da bi pomagal zatreti epidemijo kuge. Kasneje so Huni in druga plemena mesto popolnoma uniœili. Sedanja bazilika je bila zgrajena na zemljiøœu, kjer je nekoœ stala juæna bogosluæna dvorana, le da so temelje zgradili precej viøje kot so bili prvotni. Leta 1031 je oglejski patriarh Popo dal zgraditi zvonik, ki stoji øe danes. Ob vstopu v baziliko nas prevzame ogromna mozaiœna preproga (37 m x 20 m), ki se je ohranila iz 4. stoletja. Debela plast blata in gramoza, ki je prekrivala mozaik, ga je øœitila celih 1600 let. Naporen in zanimiv dan smo zakljuœili z ogledom igralnice Perla. Tretji dan smo se ponovno odpeljali v Furlanijo in obiskali upravno in kulturno srediøœe Beneœije, mesto Œedad (Cividale). Tu je potekala stara trgovska pot, kjer je na stiœiøœu Nadiøkih dolin nastalo trgovsko srediøœe venetsko - ilirskega izvora. Podroœje so v 3. stoletju zavzeli Kelti, kasneje so se na oblasti zvrstili Rimljani, Langobardi, frankovsko-germanska oblast, celih 350 let je bila posvetna in cerkvena oblast v rokah oglejskih patriarhov, od 15. do 18. stoletja so krajem vladali Beneœani, pod katerimi so prebivalci Nadiøke doline imeli precejønjo avtonomijo. Po razliœnih virih so se v teh krajih med 6. in 7. stoletjem pojavili Slovenci, ki so priøli na Goriøko œez Kranjsko, v severnem delu œez Predel. Silili so proti Italiji, a Langobardi so jim branili vhod in so jih potiskali nazaj. Kljub temu se je veliko Slovencev naselilo zlasti po hribovith predelih v okolici Œedada in v niæinskem delu ob reki Taljamento. V 7. stoletju so se juæni Slovani, kasneje Slovenci, umikali pred Obri. Naseljevanje naj bi se nadaljevalo vse do 10. stoletja na pobudo samih patriarhov, ker so hoteli ponovno naseliti izpraznjene dele, da bi tako zavarovali in utrdili obrambo Nadiøke doline. Izseljevanje ljudi iz teh krajev je potekala æe od 15. stoletja dalje in je doseglo svoj viøek po 1. svetovni vojni, v œasu gospodarske krize in zaradi faøistiœnega pritiska na Slovence. Œedad kot trgovski in kulturni center s øtevil-nimi dobro ohranjenimi zgradbami iz œasov beneøke republike, je vreden ogleda. Ob obisku Œedada smo se sprehodili œez Nadiæo po hudiœevem mostu, od koder je prekrasen pogled na najstarejøi del mesta, ki ga krasijo stare kamnite stavbe, med katerimi najstare-jøa izvira iz 13. stoletja. Pot nas je vodila naprej na Staro goro, k Marijini cerkvi, najveœjemu romarskemu svetiøœu beneøkih Slovencev, h kateremu so verniki romali æe v 13. stoletju. Izlet smo popestrili z degustacijo vin v zaselku Jazbine. Øtevilni slavni umetniki so bili gostje na gradu Devin, ki smo si ga izbrali za zadnjo izletniøko toœko, od koder smo se potem odpravili domov. Gotovo je vsak udeleæenec odnesel s seboj veliko lepih vtisov iz pokrajine, ki je tekom stoletij doæivljala velike politiœne spremembe. farm vestn 2005; 56 143 Iz druøtvenega æivljenja macevtsko-botaniœna ekskurzija na Slavnik Zdenko Sekcija farmacevtskih tehnikov pri SFD je 11. junija v sodelovanju s Farmedico d.o.o. organizirala farmacevtsko-botaniœno ekskurzijo na Slavnik, ki jo je vodil prof. dr. Samo Kreft. Ekskurzije se je udeleæilo 50 œlanov Sekcije iz razliœnih delov Slovenije. Z avtobusom smo Prof. dr. Kreft razlaga znaœilnosti vegetacije na Slavniku se pripeljali do nadmorske viøine 518 m v kraøko vasico Podgorje, ki leæi v zavetrju stisnjena ob vznoæju Slavnika. Kraøkoistrska arhitektura, z znaœilnimi hiøami iz belega kamna daje vasi znaœilen kraøki videz. Iz vas vodi na Slavnik veœ poti. Naøa skupina se je odpravila po poloæni poti proti poboœju Slavnika, ki je s svojimi 1028 m nadmorske viøine zadnji tisoœak na poti iz notranjosti Slovenije proti morju. Do vrha Slavnika smo morali premagati 500 m viøinske razlike Vreme nam je bilo naklonjeno in ne prevroœe. Do vrha je poldruga ura hoda, zaradi spoznavanja tamkajønjih rastlin pa smo potrebovali dobro uro veœ. Spodnji del Slavnika je poraøœen z redkim gozdom œrnega gabra, travnato poboœje pa se ponaøa z zelo raznoliko in bogato floro, s katero nas je seznanil prof. dr. Kreft. Spoznal smo veliko rastlin, njihovih imen in izvedel mnogo o njihovi uporabi. Med njimi so se nam posebej vtisnile v spomin: medenika (Melittis melissophyllum), navadni kokoøevec (Vincetoxicum hirundinaria), cipresast mleœek (Euphorbia cyparissias), rumen podraøœec (Aristolochia lutea)… Zgornje del Slavnika je zelo poloæen, zato so ga okoliøki kmetje kmalu posekali in se danes uporablja kot senoæet. Na poboœju pod vrhom se odpre œudovit pogled proti morju, na Piranski in Træaøki zaliv ter Istro. Ta del poboœja daje vtis, da gre za skrbno urejen cvetliœni vrt. Tu smo lahko obœudovali navadno potoniko (Paeonia officinalis), jagodasto hruøico (Muscari botryoides), bledorumeni uøivec (Pedicularis friderici-augusti), gorskega kosmatinca (Pulsatilla montana), trebuøasti øviøœ (Gentiana utriculosa)… Vmes smo opazil tudi veliko zdravilnih rastlin: koøutnik, materino duøico, vinsko rutico, øentjanæevko baldrijan, glog… V koœi smo se malo odpoœili, potem pa se vrnili po poloænejøi poti proti Kozini. Pot je bila precej daljøa, vendar smo kljub utrujenosti uæivali v naravi Strokovna ekskurzija je bila zelo dobrodoøla za osveæitev naøega znanja iz botanike in far-makognozije. Na zanimiv in sproøœen naœin nam je to znanje posredoval prof. dr. Kreft, ki nas je spremljal Izlet smo zakljuœili s popoldanskim kosilom v gostilni Mahniœ, kjer smo ob prijetnem klepetu æe kovali naœrte za prihodnje leto Polni navduøenja smo se s predstavniki Farmedice d.o.o. in direktorjem g. Robertom Terœeljem æe dogovorili, da bodo naøa sreœanja postala tradicionalna. Udeleæenke ekskurzije med predavanjem v naravi 144 farm vestn 2005; 56