Uravnavanje acetilholinesteraze med ponovnim oživčenjem skeletne mišice* Regulation of acetylcholinesterase during reinnervation of skeletal muscle Janez Toplišek** Deskriptorji mišična danervaclja živec regeneracija acetllholinesteraza Izvleček. V mišičnem vlaknu se uravnavanje tvorbe makromolekul motorične ploščice spreminja med ontogenetskim razvojem. Za nezrele postnatalne mišice podgane je značilno, da se nesimetrične molekularne oblike acetilholinesteraze (AChE) in molekule acetilholinskega receptorja (AChR) sintetizirajo tudi izven motoričnih ploščic. Izven ploščic se sinteza AChR zavre v prvem tednu, sinteza nesimetričnih oblik AChE pa v četrtem tednu postnatalnega razvoja. Po denervaciji zrele mišice pride v izvenploš-čičnih predelih do ponovne tvorbe in vgrajevanja AChR, ne pa tudi nesimetričnih oblik AChE. Domnevali smo, da mišica za to morda potrebuje ponovno oživčenje. Molekularne oblike AChE smo ločevali po hitrosti sedimentacije v linearnem saharoznem gradientu. Prehodno denervacijo smo dosegli s pretisnjenjem ishia-dičnega živca. Nerabo mišice smo povzročili z imobilizacijo sklepov na zadnji okončini, začasno paralizo pa z a-bungarotoksinom. Reiner-vacija počasne mišice soleus povzroči prehodno močno povečanje aktivnosti nesimetrične oblike AChE 16S v izvenploščičnih predelih, kar ustreza vrnitvi mišice v nezrelo postnatalno stanje. Začasna paraliza zaradi blokade AChR, ki ji sledi reaktivacija mišice, ne sproži takega dogajanja. Za vzdrževanje nezrelega stanja je nujna stalna prisotnost oživčenja mišice. To-nični vzorec proženja motoričnega živca ni odločilen za ta pojav. Hitra mišica ekstenzor digi-torum longus se med reinervacijo ne vrne v nezrelo stanje. Opažena razlika med hitro in počasno mišico verjetno temelji na genetsko pogojeni, intrinzični razliki med mišicama. Descriptors muscle denervation nerve regeneration acetylcholinesterase Abstract. In a muscle fibre, regulation of synthesis of motor endplate macromolecules changes during ontogenetic development. Immature early postnatal muscles of rat can synthesize the asymmetric forms of acetylcholinesterase (AChE) and the molecules of acetylcholine receptor (AChR) also in the endplate free regions. Synthesis of AChR in the endplate free regions is suppressed by the end of the first week, and synthesis of the asymmetric forms of AChE by the fourth week of postnatal development. After denervation of a mature muscle, synthesis of AChR, but not of the asymmetric forms of AChE, is restored in its endplate free regions. Therefore, we assumed that the muscle must be reinner-vated. Molecular forms of AChE were separated by velocity sedimentation in linear sucrose gradients. Temporary denervation was achieved by crush lesion to the sciatic nerve. Disuse of the muscle was produced by immobilisation of hind leg joints, while transitory paralysis was induced by a-bungarotoxin administrating. Activity of the asymmetric AChE forms in the endplate free regions was transiently greatly increased by reinnervation of the slow soleus muscle - the muscle reverted to immature postnatal-like state. Transient paralysis of solens muscle due to AChR blockade, followed by reactivation of the muscle, did not trigger that event. The maintenance of immature state requires permanent innervation. Tonic pattern of motor nerve firing is not crucial for this phenomenon to occur. The fast extensor digitorum longus muscle did not return to immature state after reinnervation. The observed difference between fast and slow muscles is probably based on the intrinsic, i.e. genetic, difference between the two types of muscles. "Objavljeno je delo, ki je bilo nagrajeno s Prešernovo nagrado v letu 1993. **Janez Toplišek, štud. med., Inštitut za patološko fiziologijo, Zaloška 4, 61105 Ljubljana Uvod Živčno-mišični stik (motorična ploščica) je visoko specializirana struktura, ki jo sestavljajo presinaptični končič motoričnega nevrona, postsinaptična membrana mišične celice in sinaptična špranja (20-50 nm) z bazalno lamino (1). Delovanje živčno-mišične-ga stika - hiter in zanesljiv prenos vzburjenja z živca na mišico - omogočajo številne makromolekule (acetilholinski receptor (AChR), acetilholinesteraza (AChE), holin-ace-tiltrasferaza in druge), ki so nakopičene v posameznih strukturah živčno-mišičnega stika. AChE je ključen encim pri prenosu vzburjenja v živčno-mišičnem stiku, ker s hitro razgradnjo acetilholine ACh pospeši repolarizacijo postsinaptične membrane, s čimer omogoči prenos novega impulza takoj za predhodnim in tako visoko frekvenco draženja mišičnega vlakna (2). AChE se v živčno-mišičnem stiku nahaja v bazalni lamini v primarni in sekundarnih sinaptičnih špranjah, na postsinaptični membrani, nekaj pa je je tudi pre-sinaptično ob živčnem končiču (3, 4). V zreli skeletni mišici je AChE izredno skon-centrirana v živčno-mišičnem stiku, kjer je njena koncentracija 10.000 do 20.000-krat večja kot v mišičnem vlaknu zunaj stika. Ker pa je prostornina sinaptične reže zelo majhna v primerjavi s prostornino celotnega mišičnega vlakna, je količinsko več AChE zunaj motoričnih ploščic kot v njih (5). AChE je molekularno polimorfen encim (6, 7): v istem tkivu nastopa v več molekularnih oblikah. Le-te delimo v dve veliki skupini (glej tudi sliko 1): - oblike G - globularne oblike, ki so razširjene vzdolž celotnega mišičnega vlakna (G1 monomer, G2 dimer, G4 tetramer) in - oblike A - nesimetrične oblike (1, 2 ali 3 globularni tetrameri + kolagenski rep) v zrelih mišicah večine sesalcev so posebej značilne za živčno-mišični stik (8, 9) (A12, A8, A4 - številka pove število katalitičnih podenot na eni molekuli AChE). Čeprav so nesimetrične oblike AChE močno skoncentrirane v motoričnih ploščicah, pa niso specifične za živčno-mišični stik. Pri podgani v zgodnjem postnatalnem razvoju najdemo visoko aktivnost teh oblik tudi v izvenploščičnih predelih mišic, v živčno-mišični stik pa se osredotočijo šele en mesec po rojstvu (10). Pri človeku je visoka aktivnost teh oblik ohranjena izven ploščic tudi v zrelih mišicah, kar je sicer izjema glede na druge proučevane sesalce (9, 11). Slika 1. Shematičen prikaz molekularnih oblik AChE v tkivih vretenčarjev. Vsako molekularno obliko AChE lahko označimo tudi z njenim sedimentacijskim koeficientom: G1 = 4S, G2 = 6S, G4 = 10S; A4 = 8S, A8 = 13S, A12=16S; (vse vrednosti veljajo za podgano). AChE v normalnih mišicah odrasle podgane - hitre in počasne mišice Mišična vlakna sesalcev kažejo precejšnjo raznovrstnost glede fizioloških in biokemičnih lastnosti (12, 13). Grobo jih lahko razdelimo v dve skupini: hitra (»fast twiching«, bela, tip II, večinoma glikolitična) in počasna (»slow twiching«, rdeča, tip I, večinoma ok-sidativna). Večina mišic vsebuje mešane populacije obeh vrst vlaken, nekatere mišice pa so glede tega bolj enotne. Pri podgani v mišici EDL (m. extensor digitorum longus) prevladujejo hitra vlakna tipa II, v mišici SOL (m. soleus) pa počasna tipa I (14). V počasni mišici SOL so motorične enote spodbujene tonično z dolgimi vlaki nizkofrekvent-nih impulzov, v hitri mišici EDL pa vzburjenje poteka fazično, s kratkotrajnimi izbruhi vi-sokofrekventnih impulzov. Le-ti se pojavljajo redkeje kot pri mišici SOL, zato je celotno število impulzov na dan pri mišici SOL veliko večje kot pri EDL (15). Vzorca molekularnih oblik AChE v normalnih zrelih mišicah EDL in SOL pri podgani se pomembno razlikujeta (16, 17). Posamezne molekularne oblike AChE lahko označimo tudi s sedimentacijskim koeficientom (S). Pri hitri mišici EDL močno prevladujejo glo-bularne oblike (predvsem 4S, zelo izražena je tudi oblika 10S), pri počasni mišici SOL pa kažejo nesimetrične oblike AChE (16S in 13S) približno enako aktivnost kot globu-larne oblike. Posebej očitna je razlika, če primerjamo razmerje med nesimetrično obliko 13S in globularnim tetramerom 10S. Razmerje je pri SOL močno v prid obliki 13S, pri EDL pa v prid obliki AChE 10S (18). Glede AChE v motoričnih ploščicah med obema mišicama ni kakovostnih razlik. Nesimetrične oblike AChE se tam kopičijo pri obeh mišicah. Pomembne razlike pa so opazili v izvenploščičnih predelih. Nesimetrične oblike so v teh predelih prisotne v mišici SOL (oblika 13S prevlada nad 16S), v mišici EDL pa jih izven motoričnih ploščic praktično ni (17). AChE v denervirani in embrionalni mišici Razlike glede uravnavanja AChE med hitrimi in počasnimi mišicami ostanejo tudi po de-nervaciji. V SOL v izvenploščičnih predelih aktivnosti vseh molekularnih oblik AChE enakomerno pade, v EDL pa ostane aktivnost oblik 10S sprva še visoka. Po sedmih tednih denervacije se v SOL izven ploščic aktivnost nesimetričnih oblik AChE zopet dvigne, v EDL pa ostane nepomembna. V ploščičnih predelih obeh mišic aktivnost nesimetrične oblike AChE 16S po denervaciji hitro pade (19). Odvisnost mišične AChE od motoričnega živca se vzpostavi že v embrionalnem obdobju. AChE se sicer pojavlja v mioblastih in mišičnih cevkah že pred vraščanjem živčnih končičev v mišične mase (20), za njeno kopičenje na ozkem področju sarkoleme pa je nujno oživčenje mišice (21,22, 23). Ob rojstvu so si vzorci molekularnih oblik AChE pri hitrih in počasnih mišicah podgane podobni (24). Med 4. in 10. dnevom po rojstvu pa se kljub podobnemu, tedaj še fazičnemu vzorcu živčnega draženja (25) v obeh vrstah nezrelih mišic že pojavijo razlike v uravnavanju AChE: nesimetrični obliki AChE 13S in 16S v SOL porasteta mnogo bolj kot v EDL. Do konca prvega meseca po rojstvu aktivnost nesimetričnih oblik AChE v SOL sicer pade, vendar pa ostane delno prisotna tudi izven ploščic. V EDL pa nesimetrične oblike AChE v področjih izven ploščic v tem obdobju izginejo (17). AChR in denervacija mišice - vrnitev v nezrelo postnatalno stanje Med embrionalnim razvojem so še pred oživčenjem v nezrelih mišičnih celicah prisotni tudi AChR (26). V prvem tednu postnatalnega razvoja se na mestih živčno-mišične-ga stika konča kopičenje AChR (27). Vpliv živca na ta proces skušata razložiti dve hipotezi: - agregacijo postsinaptičnih molekul naj bi sprožil »trofični dejavnik«, ki se izloča iz motonevrona. Eden od kandidatov za tak dejavnik je agrin. Agrin je protein zunajcelič-nega matriksa, natančneje bazalne lamine. Agrin izločajo mišične celice (28), najdemo pa ga tudi v motonevronih, ki ga verjetno izločajo na živčnih končičih (29). Analiza aminokislinskega zaporedja agrina je pokazala, da se njegov C terminal veže na agrinski receptor sarkoleme in sproži agregacijo agrinskega receptorja, AChR in AChE. Sinteza beljakovin za samo agregacijo ni potrebna, pač pa je nujna v fazi preoblikovanja citoskeleta in zunajceličnega matriksa. Drugi konec agrina - N terminal - služi za vezavo oz. rezervoar rastnih dejavnikov, ki lahko prispevajo k tvorbi in ohranjanju arhitekture sinapse na omejenem mestu stika živca in mišice (30, 31). V prid tej domnevi govori tudi ugotovitev, da pride v nezreli motorični ploščici po denervaciji do disperzije celotnega postsinaptičnega aparata (gube sarkoleme, AChR, AChE) v 2 do 3-kratni dolžini prvotne sinapse. V zreli mišici tega pojava ni opaziti, ker se je postsi-naptična struktura očitno ustalila (32); - hipoteza »stika in adhezije« predvideva, da zadošča sam stik živca in mišice, drugi dejavniki niso nujni (33). V kulturi mišičnih celic so agregacijo AChR povzročile celo nefiziološke pozitivno nabite kroglice lateksa (34). Tudi po oživčenju embrionalnih mišic so AChR nekaj časa še vedno razporejeni v sarkolemi vzdolž vsega mišičnega vlakna, v prvem tednu po rojstvu (pri podgani) pa v iz-venploščičnih predelih izginejo; ostanejo torej osredotočeni le v motorični ploščici (23, 27). Pri tej supresiji sinteze AChR izven motoričnih ploščic je odločilnega pomena živčno prožena mišična aktivnost (35). Po denervaciji zrele mišice odrasle živali se ta aktivnost prekine in AChR se zopet sintetizirajo in vgrajujejo v sarkolemo na področjih izven motoričnih ploščic (36). Mišica se na nek način povrne v »nezrelo embrionalno oz. postnatalno stanje«. AChE v mišici med reinervacijo Za podganje mišice je značilno, da po denervaciji aktivnost AChE v teh mišicah hitro pade, še posebej pa aktivnost nesimetričnih oblik AChE (8, 37). Aktivnost AchE (posebno nesimetričnih oblik) pa je v nezrelih mišicah embrionalnih in postnatalnih mišicah visoka. Zrela mišica se torej po denervaciji glede uravnavanja ne vrne v nezrelo postnatalno stanje, kot je to vidno pri uravnavanju AchR. Zanimive spremembe v uravnavanju AChE pa nastanejo, če predhodni denervaciji sledi reinervacija mišice. V mišici SOL se od začetka reinervacije aktivnost vseh molekularnih oblik AChE hitro povečuje. Sprva je največji porast oblike 4S, po dveh tednih re- inervacije pa prevladata obliki 16 in 13S. Celotna aktivnost AChE je 2,5-krat večja kot v kontrolni skupini. V naslednjih tednih aktivnost AChE pada. V mišici EDL je med re-inervacijo porast oblike AChE 16S petkrat manjši kot pri mišici SOL, tudi aktivnost ostalih molekularnih oblik AChE se le počasi poveča (38). Avtorja sta pri raziskavi preučevala mišico kot celoto, torej nista ločila predelov z motoričnimi ploščicami od predelov brez njih, zato se nam je zdelo, da bi bilo prav to zanimivo podrobneje proučiti s stališča morebitne vrnitve mišice v nezrelo postnatalno stanje med reinervacijo. Namen dela Pričujoča raziskava ima namen z modelom reinervacije po začasni denervaciji (pretis-njenje perifernega živca) opazovati učinek oživčenja na uravnavanje AChE, predvsem njenih nesimetričnih oblik, v izvenploščičnih predelih hitrih in počasnih mišic. Hipoteza: med procesom reinervacije po kratkotrajni denervaciji se mišica glede uravnavanja AChE povrne v nezrelo (embrionalno, postnatalno) stanje, v katerem se obnovi velika aktivnost nesimetričnih oblik AChE v izvenploščičnih predelih. Če bi se izkazalo, da je hipoteza pravilna, bi nas posebej zanimalo, kako je uravnavanje nesimetričnih oblik acetilholinesteraze v izvenploščičnih predelih med obdobjem reinervacije odvisno od trajanja predhodne denervacije in od vzorca živčnega draženja mišice med reinervacijo, ki ga je mogoče spremeniti v razmerah mišične nerabe (disu- Pomembno bi bilo tudi vedeti, ali so spremembe uravnavanja AChE, ki nastajajo med reinervacijo mišice, neposredno odvisne od stalne prisotnosti živca ali pa jih živec samo sproži in nato tečejo neodvisno. Prav tako bi bilo zanimivo dognati, ali je sprememba uravnavanja nesimetričnih oblik AChE po začasni paralizi mišice (blokada AChR z a-bungarotoksinom) enaka kot po prehodni denervaciji. Materiali in metode Poskuse smo delali na belih podganah soja Wistar. Živali smo pred začetkom operacije omamili bodisi s pentobarbitalom (50 mg/kg i. p.) bodisi z mešanico Ketalarja® (60 mg/kg) in Rompuna® (8 mg/kg). Proučevali smo počasno mišico SOL in hitro mišico EDL iz odraslih živali (stare 2-3 mesece, težke 180-250 g) ter iz živali v postnatal-nem obdobju (16 dni po rojstvu). Kirurški postopki Odrasle podgane smo razdelili v več skupin po 3 do 6 živali. Proksimalna aksonotmeza (pretisnjenje živca) Na eni strani smo na stegnu podgane izpreparirali ishiadični živec in ga za 30 sekund stisnili s šivalnikom z gladkimi prijemalnimi površinami. Kožno rano smo zaprli s sponkami in pustili žival okrevati. Eno skupino živali smo žrtvovali po 21 dneh, drugo pa po 35 dneh po pretisnjenju živca. Distalno pretisnjenje živca Izpreparirali smo mišico SOL in prikazali njen motorični živec. Le-tega smo s fino oku-listično pinceto za 30 sekund stisnili tik ob vstopu živca v mišico. Rano smo oskrbeli kot zgoraj. Eno skupino živali smo žrtvovali 8. dan, drugo pa 15. dan po pretisnjenju živca. Denervacija po reinervaciji Tri tedne po proksimalnem pretisnjenju ishiadičnega živca smo le-tega ponovno izpreparirali in iz njega izrezali 5 mm dolg košček. Živali smo žrtvovali četrti dan po prereza-nju ishiadičnega živca. Kot kontrola so nam služile živali, ki smo jih žrtvovali 25. dan po pretisnjenju ishiadičnega živca. Imobilizacija Pri kontrolni skupini smo živalim na eni strani imobilizirali skočni in kolenski sklep v srednjem položaju tako, da smo zabodli dve tanki podkožni injekcijski igli - spodnjo skozi petnico, zgornjo skozi distalno epifizo stegnenice- v golenico. Živali so po tej imobilizaciji okončino pri hoji uporabljale samo občasno in se pri tem opirale le na prste. Žrtvovali smo jih 8. dne po imobilizaciji okončin. Pri drugi skupini živali smo najprej proksimalno pretisnili ishiadični živec, kot je zgoraj opisano, 11 dni kasneje smo imobilizirali skočni in golenski sklep z notranjo zatrditvijo, tako da je reinervacija mišice SOL potekala v imobilizirani okončini. Živali smo žrtvovali 21. dan po pretisnjenju živca. Mišična paraliza Od dr. G. Vrbove (University College, London) smo dobili silikonske trakce, v katerih je bil zamešan a-bungarotoksin (20 ^g/mg). Izpreparirali smo mišico SOL in omenjeni tra-kec vstavili tik ob to mišico na nasprotni strani vstopa živca, da le-tega ne bi poškodovali. S šivom smo zašili fascijo in površinske mišice goleni, da se trakec ni mogel več premikati, ter rano zaprli. V naslednjih 24-ih urah se je razvila paraliza mišic goleni, kar smo lahko opazili, ko je izginil refleks razpiranja prstov zadnje tačke. Prvi znaki obnavljanja refleksa so se pokazali 4. dan po vstavitvi trakca, 6. dan pa se ni več razlikoval od refleksa na zdravi strani. Takrat smo trakec odstranili, da ne bi povzročal mehaničnih okvar mišice. Živali smo žrtvovali 15. oz. 25. dan po vstavitvi trakca z a-bungaro-toksinom. Priprava mišičnih vzorcev Živali smo žrtvovali z izkrvavitvijo v etrovi omami. Obravnavane mišice smo izolirali, prerezali vzdolžno na pol in jih inkubirali 35 minut v Koellejevem histokemičnem mediju za prikaz AChE (pH 7) (39). Po tem času so se zaradi histokemične reakcije prikazale motorične ploščice v mišicah, tako da smo pod preparirnim mikroskopom lahko ločili predel brez motoričnih ploščic od predelov z njimi. Za analizo molekularnih oblik AChE smo izvenploščične predele iz 4-6 mišic združili v en vzorec. Molekularne oblike smo določili vsaj dvakrat, rezultati so bili dobro ponovljivi. Analiza molekularnih oblik AChE Molekularne oblike AChE smo določili z metodo ločevanja po hitrosti sedimentacije v linearnem saharoznem gradientu (40). Vzorce izvenploščičnih predelov mišic smo ročno homogenizirali v ledeni ekstrakcijski raztopini. Homogenate smo 30 minut centrifu-girali pri 17000 obratih/min. Supernatantu smo dodali očiščeno katalazo (11,3S) za določanje sedimentacijskih koeficientov in ga nanesli na vrh saharoznega gradienta (5-20%). Gradiente smo nato 18,5 ur centrifugirali pri 36000 obratih/min pri 4°C. Po cen-trifugiranju smo prebodli dno kivete in s frakcioniranjem po kapljicah razdelili vsak gradient na 30 frakcij. Aktivnosti AChE v frakcijah smo določali po metodi Ellmana in sod. (41). Vzorce smo predinkubirali z inhibitorjem nespecifične holinesteraze (iso-OMPA) in dodali substrat - acetiltioholinov jodid (1 mM). Vzorce smo inkubirali 3,5 ure pri 25°C. Slepe vzorce smo pripravili s 5 in z 20% raztopino saharoze v ekstrakcijski raztopini. Spektrofotometrično izmerjenim vrednostim aktivnosti v vzorcih smo grafično odšteli vmesne aktivnosti slepih vzorcev in tako dobili aktivnosti, ki so posledica čiste hidrolize z AChE. S primerjavo položaja katalaze in vrhov aktivnosti ACHE v gradientih smo določili sedi-mentacijske koeficiente posameznih oblik AChE in jih tako identificirali. Množino nesimetrične oblike AChE 16S smo določili kot površino pod ustreznim vrhom aktivnosti AChE v vzorcu molekularnih oblik AChE. Pri tem smo uporabili računalniško analizo s programom, ki je bil izdelan na Inštitutu za patološko fiziologijo in Inštitutu za fiziologijo Medicinske fakultete. Rezultati Uravnavanje AChE v počasni mišici soleus med reinervacijo Molekularne oblike AChE smo analizirali le v tistih področjih mišice SOL, kjer ni motoričnih ploščic (t. j. izvenploščična AChE). V nezreli postnatalni mišici SOL je celotna aktivnost AChE višja kot v normalni, zreli mišici SOL. Med vsemi molekularnimi oblikami prevladuje oblika AChE 16S (slika 2a). Med dozorevanjem aktivnost vseh molekularnih oblik pade, še posebej aktivnost oblike 16S, ki pa še vedno ostaja jasno razvidna tudi v zreli mišici odraslih živali (slika 2b). 21. dan po pretisnjenju ishiadičnega živca (torej po prehodni denervaciji in reinervaci-ji) je bila celotna aktivnost AChE v mišici SOL izven motoričnih ploščic veliko večja kot v normalni mišici, še posebej pa aktivnost oblik 16S in 13S (slika 2c), tako da je bil vzorec molekularnih oblik precej podoben tistemu v postnatalnem obdobju (slika 2a). Dvig aktivnosti AChE po reinervaciji pa je bil le prehoden, saj se je 14 dni pozneje aktivnost vseh molekularnih oblik, vključno z obliko 16S, približala vrednostim v normalni zreli mišici (slika 2č). Uravnavanje AChE v hitri mišici ekstenzor digitorum longus med reinervacijo V nezreli mišici EDL po rojstvu je oblika AChE 16S jasno prisotna vzunajploščičnih predelih, vendar je njena aktivnost precej nižja kot pri SOL, tako da prevladuje globularna oblika 4S (slika 3a). Z zorenjem mišice EDL aktivnost oblike 16S izven motoričnih ploščic praktično izgine, aktivnost globularnih oblik pa se poveča (slika 3b). -iS LLI O <